KR20160103024A - 형질감염을 개선하는 막 투과 펩타이드 및 조성물 그리고 이들을 사용하는 방법 - Google Patents

형질감염을 개선하는 막 투과 펩타이드 및 조성물 그리고 이들을 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 막 투과 아미노산 서열 및 추가로 적어도 하나의 다중양이온성 모이어티 또는 펩타이드 서열을 함유하는 비천연 발생 펩타이드에 관한 것이다. 펩타이드는 카고를 세포 내부로 전달하는 용도로 적합하다. 적합한 카고는 핵산 분자(DNA, RNA 또는 PNA 포함), 폴리펩타이드, 또는 기타 생물학적 활성 분자를 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 비천연 발생 펩타이드를 적어도 하나의 양이온성 지질 및 세포 내부로 전달되는 카고와 비공유적 회합으로 함유하는 형질감염 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 형질감염 복합체의 형성 및 배양, 동물 또는 인간의 세포의 내부로의 카고 전달을 위한, 비천연 발생 펩타이드의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포를 형질감염시키는데 유용한 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

형질감염을 개선하는 막 투과 펩타이드 및 조성물 그리고 이들을 사용하는 방법{MEMBRANE-PENETRATING PEPTIDES TO ENHANCE TRANSFECTION AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING SAME}
본 발명은 일반적으로 형질감염(transfection) 및 세포 배양 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 투과 펩타이드로서 사용에 적합한 펩타이드, 펩타이드를 함유하는 형질감염 복합체 및 카고(cargo)의 세포내 전달을 위한 이의 사용을 제공한다.
참조 인용
당해 명세서에서 언급된 모든 문헌, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별적인 문헌, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 인용되는 것으로 특정하게 개별적으로 지시되는 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다.
리포솜과 같은 지질 응집체는 실험실 및 임상 연구 현장에서 거대분자, 예를 들면, DNA, RNA, 단백질, 및 작은 화학 화합물, 예를 들면, 소분자 또는 약제학적 활성 분자를 세포 및 조직에 도입하는 전달제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 특히, 양이온성 지질 구성분을 포함하는 지질 응집체는 음이온성 분자를 세포로 전달하는데 특히 효과적인 것으로 나타났다. 부분적으로, 양이온성 지질의 유효성, 및 양이온성 지질과 함께 형성된 양으로 하전된 복합체는, 다수가 알짜(net) 음전하를 갖는 세포에 대한 개선된 친화력의 결과로 여겨진다. 또한 부분적으로, 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집체의 알짜 양전하는 응집체가 다중음이온, 예를 들면, 핵산에 결합할 수 있게 한다. DNA 및 RNA를 함유하는 지질 응집체는 표적 세포의 효율적인 형질감염을 위한 유효한 제제로 알려져 있다.
다양한 유형의 지질 응집체의 구조는 응집체의 조성 및 형성 방법에 따라 다양하다. 이러한 응집체는 나노미터 내지 마이크로미터 범위의 특정 크기를 갖는 리포솜, 단층판 소포, 다층판 소포, 마이셀 등을 포함한다. 지질 응집체의 제조 방법은 일반적으로 당해 분야에 알려져 있다. 전달을 위한 통상적인 인지질 함유 리포솜 사용의 주요 문제점은 리포솜 조성물이 알짜 음전하를 갖고, 이는 음으로 하전된 세포 표면에 끌리지 않는다는 것이다. 양이온성 지질 화합물을 인지질과 조합함으로써, 양으로 하전된 소포 및 기타 유형의 지질 응집체는 음으로 하전된 핵산에 결합할 수 있고, 표적 세포에 의해 흡입될 수 있으며, 표적 세포를 형질감염시킬 수 있다(Felgner, P.L. et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417; Eppstein, D. et al., 미국 특허 제4,897,355호).
양이온성 지질을 지질 응집체 내로 도입하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 방법은 문헌[Felgner et al., 상기 참조]; [Eppstein et al. 상기 참조]; [Behr et al. 상기 참조]; [Bangham, A. et al.(1965) M. Mol. Biol. 23:238-252]; [Olson, F. et al.(1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9-23]; [Szoka, F. et al.(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198]; [Mayhew, E. et al.(1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-175]; [Kim, S. et al.(1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339-348]; 및 [Fukunaga, M. et al.(1984) Endocrinol. 115:757-761]에 기재되어 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 적절한 크기의 지질 응집체를 제조하는데 통상적으로 사용되는 기술은 초음파처리 및 동결-융해에 압출을 더한 것을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Mayer, L. et al.(1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161-168]을 참조한다. 일관되게 작고(50㎚ 내지 200㎚) 상대적으로 균일한 응집체가 바람직한 경우, 미세유동화가 사용된다(Mayhew, E., 상기 참조). 양이온성 지질은 또한 과거에 간섭 RNA(RNAi) 분자를 세포에 전달하는데 사용되었다(Yu et al.(2002) PNAS 99: 6047-6052; Harborth et al.(2001) Journal of Cell Science 114:4557-4565).
양이온성 지질의 사용은 15년전 도입된 이후로 점점 대중적인 것이 되어왔다. 몇몇 양이온성 지질은 문헌에 기재되어 있고, 이들 중 일부는 상업적으로 입수가능하다. DOTMA(N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드)는 핵산 형질감염의 목적으로 합성된 첫번째 양이온성 지질이었다. 문헌[Felgner et al.(Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413(1987); 미국 특허 제4,897,355호)]을 참조한다. DOTMA는 단독으로 제형화될 수 있거나 DOPE(다이올레오일포스파티딜에탄올아민)와 리포솜 내로 조합될 수 있고, 이러한 리포솜은 플라스미드를 일부 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 기타 부류의 지질은 후속적으로 다양한 그룹에 의해 합성되었다. 예를 들면, DOGS(5-카복시스퍼밀글리신다이옥타데실아마이드)는 첫번째로 제조된 다중양이온성 지질이었고(Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982(1989); 미국 특허 제5,171,678호), 그 후 다른 다중양이온성 지질들이 제조되었다. 지질 DOSPA(2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄)는 효과적인 전달제로서 기재되어 있다(미국 특허 제5,334,761호).
다른 예에서, 콜레스테롤계 양이온성 지질, 예를 들면, DC-Chol(N,N-다이메틸-N-에틸카복스아미도콜레스테롤)이 제조되었고, 형질감염에 사용되었다(Gao et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280(1991)). 또 다른 예에서, 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진이 제조되었고, 히스톤 H1과 조합되어 다른 시약보다 덜 독성인 것으로 보고된 전달 시약이 생성되었다(Wolf et al. BioTechniques 23, 139(1997); 미국 특허 제5,744,335호). 몇몇 시약은 상업적으로 입수가능하다. 일부예는 리포펙틴(LIPOFECTIN)(등록상표)(DOTMA:DOPE)(인비트로젠(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)), 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)(등록상표)(DOSPA:DOPE)(인비트로젠), 리포펙타민(등록상표) 2000(인비트로젠), 퓨진(FUGENE)(등록상표), 트랜스펙탐(TRANSFECTAM)(등록상표)(DOGS), 이펙텐(EFFECTENE)(등록상표), 및 DC-Chol을 포함한다.
이들 시약 중 어느 것도 모든 세포에 보편적으로 사용될 수 있는 것은 없다. 아마도 이는 상이한 유형의 세포의 막의 조성뿐만 아니라 세포외 물질의 세포 내로의 도입을 제한할 수 있는 장벽에서의 차이를 고려하면 놀라운 일이 아니다. 게다가, 양이온성 지질이 핵산을 세로 내로 전달하는 메커니즘은 명백하게 이해되지 않는다. 시약은 바이러스 전달 방법보다 덜 효율적이고, 시약 간 독성 차이가 있지만 세포에 독성이다.
그러나, 양이온성 지질을 포함하는 형질감염 제제는 모든 세포 유형에 보편적으로 효과적인 것은 아니다. 상이한 세포의 형질감염의 유효성은 특정 형질감염 제제 조성에 따라 좌우된다. 일반적으로, 다중양이온성 지질은 진핵 세포의 형질감염에 있어서 단일양이온성 지질보다 효율적이다. 많은 경우에, 양이온성 지질은 단독으로는 형질감염에 효과적이지 않거나, 부분적으로만 효과적이다.
외인성 화합물을 세포 내로 도입(당해 분야에서 "형질감염"으로 알려진 공정)하는데 지질 응집체를 사용하는 것은 많은 실험실에서 일상적인 공정이 되었고, 광범위하게 다양한 세포 유형 및 계통에서 사용을 위하여 조정되었지만, 당해 기술 연구 및 임상 현장에서 일상적으로 사용하는 세포 및 세포주의 약 60%는 형질감염이 어려운 것으로 여겨지는 것으로 추정되고, 이는 이들이 전형적으로 60% 미만의 형질감염 효율을 나타내는 것을 의미한다. 형질감염이 어려운 것으로 정의된 세포는 일차 세포, 예를 들면, 줄기 세포, 전구 세포, 신경 세포 및 신경 조직으로부터 유래된 기타 세포 유형, 일차 혈액 세포("PBMC"), HUVEC 등뿐만 아니라, 확립되는 동안, 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약을 사용하여 효율적으로 형질감염시키기 어려운 특정한 세포주를 포함한다. 형질감염이 어려운 세포주의 예는, 그 중에서도, PC12, HepG2, 3T3, LNCaP, A549, Jukat, 및 PC3을 포함한다.
지난 수십년간, 세포막을 통과함으로써 세포 내로의 물질의 자리옮김을 촉진할 수 있는 다수의 천연 발생 펩타이드. 이들 소위 "막 투과 펩타이드"("MPP") 또는 "세포 투과 펩타이드"("CPP")는 단백질, 핵산, 중합체, 또는 기타 작용성 분자를 세포 내로 수송하는 것을 촉진하는데 사용되어 왔다.
막/세포 투과 펩타이드(CPP), 예를 들면, 안테나페디아 유래된 페네트라틴(Derossi et al., J. Biol. Chem., 269, 10444-10450, 1994) 및 Tat 펩타이드(Vives et al., J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, 1997)는 카고 분자, 예를 들면, 펩타이드, 단백질 및 올리고뉴클레오타이드(Fischer et al., Bioconjug. Chem., 12, 825-841, 2001)를 세포 내로 전달하는데 사용되었다. 적용 분야는 순수한 세포 생물학부터 생물의학 연구까지 포괄한다(Dietz and Bahr, Mol. Cell., Neurosci, 27, 85-131, 2004). 처음에, 세포내 흡입은 원형질막의 직접적인 침투에 의해 발생하는 것으로 여겨졌다(Prochiantz, Cuff. Opin. Cell Biol., 12, 400-406, 2000). 최근 몇년간, 적어도 일부 CPP가 내포작용을 촉진함으로써 카고의 세포내 흡입을 증가시키는 것을 나타내는 증거가 증가하였다(리뷰를 위하여, 문헌[Fotin-Mleczek et al., Curr. Pharm. Design, 11, 3613-3628, 2005]을 참조한다). 이들 최근 결과에 따르면, CPP/MPP로서 명시된 펩타이드는 따라서 반드시 특이적인 세포 들여오기 메커니즘을 의미하지 않지만, 카고 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로(non-covalently) 회합시, 카고 분자의 세포내 흡입을 개선시키는 펩타이드로서의 역할을 하는 것을 의미한다.
연구 및 임상 현장 둘 다에서 모든 세포, 특히 "형질감염이 어려운" 것으로 여겨지는 세포(즉, 형질감염에 내성이 있거나, 실험실 현장에서 일상적으로 사용되는 표준 형질전환된 세포주보다 실질적으로 낮은 형질감염 효율을 나타내는 세포)이지만, 최근 입수가능한 다양한 양이온성 지질계 형질감염 시약을 사용하고 제조하고 이용하는데 용이한 세포의 형질감염 효율을 개선시킴으로써 카고 및 거대분자의 세포 내로의 전달을 개선시키는 추가의 시약에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 세포 투과 작용을 갖고 카고 분자 및 하나 이상의 양이온성 지질과 형질감염 복합체를 형성할 수 있는 신규한 비천연 발생 펩타이드(non-naturally occurring peptide)를 제공한다.
거대분자, 예를 들면, 핵산을 배양 또는 생체내 조직의 세포 내로 도입하는 개선된 효율을 제공하는 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 특정 실시형태는 본원에서 비공유적 회합으로, 카고 분자, 예를 들면, 핵산 분자, 형질감염 제제 및 비천연 발생 펩타이드를 함유하는 복합체를 제공하고, 여기서 비천연 발생 펩타이드는 막 투과 펩타이드 서열을 함유한다. 특정 양상에서, 복합체는 세포 내로 도입되는 거대분자, 예를 들면, 펩타이드, 단백질, 또는 핵산을 함유한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
, 또는
Figure pct00002
여기서, A는 막 투과 펩타이드이고, L은 결합 또는 링커 펩타이드이고, B는 양이온성 모이어티(moiety) 또는 양이온성 폴리펩타이드이다. 비제한적이지만 일부 바람직한 실시형태에서, A는 표 1에 기재된 것들로부터 선택된 펩타이드 서열 또는 적어도 형질감염 효율을 개선시키는 이의 능력의 일부분을 보유하는 이의 변이체이다. 몇몇 실시형태에서, A의 펩타이드 서열은 5 내지 약 50개의 아미노산이고, A는 세포 내로의 분자 전달을 적어도 50% 이상 개선시키는 것을 특징으로 한다.
몇몇 실시형태에서, A의 펩타이드 서열은 5 내지 약 50개의 아미노산이고, A는 세포 내로의 분자 전달을 적어도 75% 이상 개선시키는 것을 특징으로 한다.
몇몇 실시형태에서, A는 표 1에 기재된 펩타이드 중 어느 하나, 또는 적어도 형질감염 효율을 개선시키는 이의 능력의 일부분을 보유하는 이의 변이체와 적어도 75% 유사하고, 여기서 A는 세포 내로의 분자 전달을 적어도 10% 이상 개선시키는 것을 특징으로 한다. 몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 1 내지 서열 번호 68 중 어느 하나, 또는 이의 변이체로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 양상에서, 비천연 발생 펩타이드는 표 4에 기재된 펩타이드 중 어느 하나로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 실시형태는 하나 이상의 형질감염 시약과 조합으로서 상기 기재된 비천연 발생 펩타이드를 함유하는 형질감염 복합체에 관한 것이고, 형질감염 시약은 하나 이상의 양이온성 지질, 및 임의로 하나 이상의 헬퍼(helper) 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 형질감염 복합체는 세포 내부로 전달되는 카고를 포함할 수 있거나, 임의로 이의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 동물 또는 인간 환자에게 투여될 수 있다. 비제한적이지만 일부 예시적인 실시형태에서, 본 발명과 사용하기에 적합한 바람직한 카고 분자는 핵산 분자, 예를 들면, DNA 분자 또는 RNA 분자를 포함한다. 적합한 DNA 분자는 발현가능한 핵산 서열을 갖는 DNA 분자, 예를 들면, 단백질을 인코딩하는 개방 판독 프레임을 포함하는 발현 벡터 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 적합한 카고로서 작용할 수 있는 다른 적합한 분자는 RNA 분자, 예를 들면, mRNA 분자 또는 RNAi 분자를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시형태는 형질감염 복합체의 제조 방법 및 카고 분자를 세포 내부로 전달하는 이의 사용 방법에 관한 것이다. 형질감염 복합체의 제조 방법은, 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질 및/또는 하나 이상의 중성 지질의 존재 하에, 카고를 세포 내부로 이송시킬 수 있는 형질감염 복합체의 형성을 촉진하는 조건하에, 카고 분자를 적어도 하나의 양이온성 지질 또는 형질감염 시약 및 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 적어도 하나의 카고 분자, 적어도 하나의 양이온성 지질 또는 형질감염 시약, 및 본 발명에 따른 비천연 발생 펩타이드를 포함하고, 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질 및/또는 하나 이상의 중성 지질을 갖는 형질감염 복합체를 형성하는 단계, 및 세포의 형질감염을 촉진시키는 조건하에 형질감염 복합체를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 형질감염 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 실시형태는 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질 및/또는 하나 이상의 중성 지질의 존재 하에, 동물 또는 인간 대상에 전달되는 카고 또는 약물, 적어도 양이온성 지질 또는 형질감염 시약 및 본 발명의 비천연 발생 펩타이드를 포함하여 생리학적 상태 또는 질병의 치료가 필요한 동물 또는 인간 대상에게 약물 또는 생물학적 활성 화합물을 전달하기에 적합한 약제학적 활성 복합체를 형성하는 약제학적 제형에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시형태는 하기 도면 및 발명의 설명, 및 청구항을 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구항에서 특정하게 기재된다. 본 발명의 특징 및 장점을 더 잘 이해하는 것은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시형태를 설명하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 수득될 것이다:
도 1A는 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 10종의 상이한 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 암 세포주의 패널을 나타내고;
도 1B는 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 2종의 상이한 GFP 발현 신경 세포주를 나타내고;
도 1C는 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 2종의 상이한 GFP 발현 근원세포 세포주를 나타내고;
도 1D는 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 GFP 발현 신장 섬유아세포 세포주를 나타내고;
도 2는 지시된 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약; 퓨진(등록상표) HD(첫번째 열), 리포펙타민(등록상표) 2000(중앙 열); 및 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(마지막 열)을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 6종의 상이한 GFP 발현 세포주의 패널을 나타내고;
도 3A는 3종의 상이한 상업적으로 입수가능한 지질 응집체 제형, 리포펙타민(등록상표) 2000(흰 원형), 리포펙타민(등록상표) LTX(흰 사각형), 및 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(흰 삼각형)의 증가하는 투여량을 사용하여, 배양된 HeLa 세포 내로 형질감염된 GFP를 인코딩하는 발현 벡터에 대하여 상대적인 형질감염 효율을 비교하는 그래프이고;
도 3B는 3종의 상이한 상업적으로 입수가능한 지질 응집체 제형, 리포펙타민(등록상표) 2000(흰 원형), 리포펙타민(등록상표) LTX(흰 사각형), 및 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(흰 삼각형)의 증가하는 투여량을 사용하여, GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 HeLa에서 GFP 발현의 강도를 비교하는 그래프이고;
도 4는 하기 상업적으로 입수가능한 지질 응집체 제형을 사용하여, GST-STAT 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 HepG2 세포에서 GST-STAT 융합 단백질의 발현량(상부 패널)을 비교하는 웨스턴 블롯이다: 리포펙타민(등록상표) 2000(제1 레인), 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(제2 레인), 퓨진(등록상표) HD(제3 레인), 및 X-트림진(X-TREMEGENE)(상표명) HP(마지막 레인). 하부 패널은 각각의 레인에서 사이토졸 추출물의 동일한 로딩이 확인된 내인성 β-액틴의 웨스턴 블롯을 나타내고;
도 5A는 리포펙타민(등록상표) 2000(흰 삼각형) 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 웰당 0.1 내지 0.6㎕를 사용하여, GFP 발현 벡터의 증가하는 용량(좌측 패널 50㎍; 중앙 패널 100㎍, 및 우측 패널 200㎍)으로 형질감염된 H9 인간 배아 줄기 세포주(96 웰 플레이트의 웰당 37,500 세포)의 상대적인 형질감염 효율을 비교하는 그래프이고;
도 5B는 리포펙타민(등록상표) 2000(좌측 패널, H9 세포의 18% 형질감염 효율을 입증함) 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(우측 패널) 200㎕를 사용하여, 100㎍/웰로 형질감염된 96 웰 플레이트에서 배양된 H9 세포에서 GFP 발현의 대표적인 형광 이미지이고;
도 6A는 지시된 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 변형된 U2OS 세포에서 평균 등색 형광 단백질(OFP) 강도(막대 그래프, 상부 패널) 및 OFP 발현의 대표적인 형광 이미지(하부 패널)에 의해 측정된, 상업적으로 입수가능한 시스템을 사용하는 U2OS 세포의 게놈 변형 효율을 나타내고;
도 6B는 지시된 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 변형된 HepG2 세포에서 평균 OFP 강도(막대 그래프, 상부 패널) 및 OFP 발현의 대표적인 형광 이미지(하부 패널)에 의해 측정된, 상업적으로 입수가능한 시스템을 사용하는 HepG2 세포의 게놈 변형 효율을 나타내고;
도 7A는 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하는, U2OS 세포에서 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 TALEN 및 CRISPR에 대한 절단 효율을 나타내고;
도 7B는 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하는, HepG2 세포에서 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 TALEN 및 CRISPR에 대한 절단 효율을 나타내고;
도 8은 리포펙타민(등록상표) 3000 단독(LF3K), 리포펙타민(등록상표) 2000(LF2K), 실시형태에 따른 펩타이드(펩타이드 1) 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(LF3K + 펩타이드 1)의 지시된 용량(㎕)을 사용하여 GFP 발현 벡터로 형질감염된 HeLa 세포의 상대적인 형질감염 효율(상부 그래프, 단세포 단독의 %로서 GFP+) 또는 세포당 상대적인 발현량(하부 그래프; 단세포 단독 평균 FL-1)을 도시하는 막대 그래프이고;
도 9a는 HepG2 세포에서 도 9b 및 도 9c에 도시된 실험에서 사용된 다양한 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 펩타이드 맵을 도시한 것이고, 여기서 펩타이드 A는 MPP 펩타이드 단독이고, 펩타이드 B는 링커 펩타이드 단독이고, 펩타이드 C는 양이온성 펩타이드 단독이고, 펩타이드 D는 양이온성 펩타이드에 융합된 링커 펩타이드이고, 펩타이드 E는 펩타이드 D에 융합된 펩타이드 A를 갖는 전체 길이의 펩타이드이고;
도 9b는 지시된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합(도 9a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 배양된 HepG2 세포에서 GFP 발현을 검출하는 일련의 형광 이미지를 도시하고;
도 9c는 지시된 펩타이드 A 내지 E 중 하나 또는 지시된 펩타이드의 조합(도 9a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 HepG2 세포에서 세포당 평균 형광(상부 그래프) 및 형질감염 효율(%GFP + 세포)을 나타내는 2개의 막대 그래프를 도시하고;
도 10a는 A549 세포에서 도 10b 및 도 10c에 도시된 실험에서 사용된 다양한 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 펩타이드 맵을 도시한 것이고, 여기서 펩타이드 A는 MPP 펩타이드 단독이고, 펩타이드 B는 링커 펩타이드 단독이고, 펩타이드 C는 양이온성 펩타이드 단독이고, 펩타이드 D는 양이온성 펩타이드에 융합된 링커 펩타이드이고, 펩타이드 E는 펩타이드 D에 융합된 펩타이드 A를 갖는 전체 길이의 펩타이드이고;
도 10b는 지시된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합(도 10a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 배양된 A549 세포에서 GFP 발현을 검출하는 일련의 형광 이미지를 도시하고;
도 10c는 지시된 펩타이드 A 내지 E 중 하나 또는 지시된 펩타이드의 조합(도 10a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 A549 세포에서 세포당 평균 형광(상부 그래프) 및 형질감염 효율(%GFP + 세포)을 나타내는 2개의 막대 그래프를 도시하고;
도 11a는 MDA-MB-231 세포에서 도 11b 및 도 11c에 도시된 실험에서 사용된 다양한 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 펩타이드 맵을 도시한 것이고, 여기서 펩타이드 A는 MPP 펩타이드 단독이고, 펩타이드 B는 링커 펩타이드 단독이고, 펩타이드 C는 양이온성 펩타이드 단독이고, 펩타이드 D는 양이온성 펩타이드에 융합된 링커 펩타이드이고, 펩타이드 E는 펩타이드 D에 융합된 펩타이드 A를 갖는 전체 길이의 펩타이드이고;
도 11b는 지시된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합(도 11a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 배양된 MDA-MB-231 세포에서 GFP 발현을 검출하는 일련의 형광 이미지를 도시하고;
도 11c는 지시된 펩타이드 A 내지 E 중 하나 또는 지시된 펩타이드의 조합(도 11a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 MDA-MB-231 세포에서 세포당 평균 형광(상부 그래프) 및 형질감염 효율(%GFP + 세포)을 나타내는 2개의 막대 그래프를 도시한다.
본 발명은 세포의 형질감염에 적합한 개선된 시약 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 전형적으로 형질감염이 어려운 것으로 여겨지는 세포 유형을 포함하여 모든 세포의 형질감염 효율을 개선시키는 조성물 및 시약을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 시약은, 본원에 기재된 방법뿐만 아니라 당해 분야의 숙련가의 범위 내의 일반적인 지식 및 전문지식에 따라 사용되는 경우, 전형적으로 형질감염 효율을 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 65% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하, 100% 이하 또는 100% 초과로 증가시킬 수 있다. 본 발명은 하기 보다 상세히 기재된 바와 같은 하나 이상의 형질감염 지질과 조합으로서 사용되는 세포/막 투과 펩타이드 서열을 포함하는 신규한 펩타이드를 제공함으로써 이를 달성한다.
정의
당해 명세서 전체에서 사용되는 용어는 일반적으로 당해 분야, 본 발명의 내용 및 각각의 용어가 사용되는 특정한 내용에서 이들의 통상적인 의미를 갖는다. 특정한 용어는 하기, 또는 명세서의 다른 곳에서 논의되고, 이는 본 발명의 다양한 실시형태의 설명에서 실시자에게 추가의 지침 및 이들을 제조하고 사용하는 방식을 제공한다. 동일한 개념이 하나 이상의 방식으로 표현될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 그 결과, 대안적인 언어 및 동의어가 본원에서 논의된 임의의 하나 이상의 용어에 대하여 사용될 수 있고, 용어는 본원에서 더 상세하게 상술되거나 논의되는지 여부에 따라 임의의 특별한 중요성을 갖지 않는다. 특정한 용어에 대한 동의어가 제공될 수 있다. 하나 이상이 동의어에 대한 설명은 다른 동의어의 사용을 배제시키지 않는다. 본원에서 논의된 임의의 용어의 예를 포함하여 당해 명세서의 어디에서든 예의 사용은 오직 예시를 위한 것이고, 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범위 및 의미를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
거대분자를 세포 배양으로 도입하는 내용에서 사용되는 용어 "도입"은 배양 배지 내로의 거대분자 또는 화합물의 제공을 나타내고, 거대분자의 도입 목적이 세포외 구획으로부터 배양된 세포의 세포질 구획으로 거대 분자의 수송을 가능하게 하는 것임이 이해된다.
적어도 하나의 세포 내로의 거대분자 또는 화합물의 "도입"이라는 용어는 거대분자 또는 화합물이 세포 내에 내재화되는, 세포로의 거대분자 또는 화합물의 제공을 나타낸다. 예를 들면, 거대분자 또는 화합물은 형질감염, 형질전환, 주입, 및/또는 리포솜 도입을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있고, 또한 당해 분야의 숙련가에게 알려진 다른 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 거대분자 또는 화합물은 리포솜 도입에 의해 세포 내로 도입된다. 거대분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 핵산이다. 거대분자는 단백질일 수 있다. 대안적으로, 거대분자는 펩타이드일 수 있다. 대안적으로, 거대분자는 폴리펩타이드일 수 있다. 거대분자는 또한 핵산일 수 있다.
형질감염과 같은 수단에 의해 세포 내부 내로 카고가 전달되는 내용에서 본원에서 사용되는 용어 "카고"는 일반적으로 실험실 배양 또는 동물 또는 인간의 조직의 세포 내부로 이송되는 임의의 성분을 나타낸다. 카고는 적용에 따라 거대분자, 예를 들면, 핵산, 단백질, 또는 펩타이드일 수 있거나, 약물 또는 기타 유기 소분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "거대분자"는 생분자를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 용어 거대분자는 핵산을 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 용어 거대분자는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 용어 거대분자는 DNA를 의미한다. DNA는 선형 DNA 또는 환형 DNA, 예를 들면, 원형 플라스미드, 에피솜 또는 발현 벡터 형태의 DNA일 수 있다. 비제한적이지만 특정한 바람직한 실시형태에서, 용어 거대분자는 발현가능한 핵산 서열로부터의 mRNA 전사에 필요한 하나 이상의 핵산 서열에 실시가능하게 연결된 적어도 하나의 개방 판독 프레임을 포함하는, 발현가능한 핵산 서열을 갖는 상보적 DNA(cDNA)를 나타낸다. 거대분자는 하전되거나 하전되지 않을 수 있다. DNA 분자는 하전된 거대분자의 예이다. 일부 예에서, 본원에서 사용되는 용어 "거대분자"는 용어 "발현가능한 핵산" 및 "발현 벡터"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 용어 "거대분자"는 RNA 분자를 나타낸다. RNA 분자는 세포 내부로 전달되는 것이 추구되는 mRNA, siRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 제한 없이 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 RNA 분자의 임의의 다른 유형 또는 종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 RNA 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "형질감염"은 핵산, 단백질 또는 기타 거대분자가 표적 세포에 전달되어 핵산, 단백질 또는 기타 거대분자가 세포에서 발현되거나 생물학적 작용을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현가능한 핵산"은 분자량과 관계없이 DNA 및 RNA 둘 다를 포함하고, 용어 "발현"은 제한 없이 일시적인 발현 및 안정한 발현 둘 다를 포함하는 세포 내의 핵산의 작용적 존재의 임의의 징후를 의미한다. 작용적 양상은 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 전달에 의한 발현의 억제를 포함한다.
용어 "핵산의 발현" 및 이의 등가물은 세포에서 핵산의 복제, 메신저 RNA로의 DNA의 전사, 단백질로의 RNA의 번역, 단백질의 번역후 변형, 및/또는 세포에서 단백질의 트래픽킹(trafficking), 이의 변이 또는 조합을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포"는 모든 유형의 진핵 및 원핵 세포를 포함하는 것을 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 용어는 진핵 세포, 특히 배양으로 성장한 세포, 동물 또는 인간의 조직에서 발견된 세포를 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포를 나타낸다. 비제한적이지만 특정한 예시적인 실시형태에서, 용어 "세포"는 연구 및 임상 현장에서 일상적으로 사용되는 임의의 세포 및 세포주를 나타내는 것을 의미하고, 제한 없이 불멸화된 세포주, 형질전환된 세포주, 또는 일차 세포를 포함할 수 있다.
형질감염 과정 및 시약의 내용에서 사용되는 "형질감염이 어려운"이라는 구, 또는 이러한 구의 유사한 변이체는 표준 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약, 예를 들면, 양이온성 지질(이의 예는 리포펙타민(등록상표) 2000, 리포펙타민(등록상표) LTX, 리포펙타민(등록상표), 리포펙틴(등록상표), 퓨진(등록상표) HD, X-트림진(상표명) HP 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 사용하여 형질감염되는 경우, 전형적으로 60% 미만의 형질감염 효율을 나타내는 임의의 세포 또는 세포주를 일반적으로 나타내는 상대적인 용어이다. 전형적으로 "형질감염이 어려운" 것으로 간주되는 세포는 일차 세포, 예를 들면, 줄기 세포, 전구 세포, 신경 세포 및 신경 조직으로부터 유래된 기타 세포 유형, 일차 혈액 세포("PBMC"), HUVEC 등뿐만 아니라, 확립되는 동안, 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약을 사용하여 효율적으로 형질감염시키기 어려운 특정한 세포주를 포함한다. 형질감염이 어려운 세포주의 예는 그 중에서도 PC12, HepG2, 3T3, LNCaP, A549, Jurkat, 일차 세포, H9 배아 줄기 세포, 배양된 배아 줄기 세포, 배양 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포), K-562, L6, L929, MCF-7, RAW 264.7, HT29, U937, Vero, HCT116, C6, C2C12, HL60, THP1, BHK, PC3, P19, SH-SY5Y, U2OS, HUH7, 및 PC3을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 당해 분야의 것으로 여겨지는 다양한 특정한 세포 유형 및 세포주의 본원에서의 열거는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 이들 세포주 또는 이의 가까운 유도체만으로 한정하는 것을 의도하지 않으며, 단지 일반적으로 입수가능한 양이온성 지질계 형질감염 시약을 사용하여 전형적으로 60% 미만의 형질감염 효율을 나타내는 실험실 현장에서 일반적으로 사용되는 세포주 및 유형의 우세함을 설명함을 의도하고, 이는 상대적인 형질감염 효율을 적어도 5% 이상 개선시키는 본원에 기재된 신규한 조성물 및 제형으로부터 이득을 얻을 것이다.
"세포 배양" 또는 "배양"은 인공, 시험관내 환경에서 세포의 유지를 의미한다.
"재조합 단백질"은 호스트 세포 내로 도입되는 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 나타낸다. 호스트 세포는 핵산을 발현한다. 용어 "핵산을 발현하는 것"은 "핵산에 의해 인코딩된 RNA로부터 단백질을 발현하는 것"과 동의어이다. 본원에서 사용되는 "단백질"은 포괄적으로 임의의 아미노산의 천연 발생 또는 합성 중합체, 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 지질단백질, 당단백질 등을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 일반적으로 길이 또는 번역후 변형(예를 들면, 절단, 인산화, 글리코실화, 아세틸화, 메틸화, 이성질화, 환원, 파르네실화 등)과 상관없이, 순차적인 펩타이드 결합에 의하여 서로 공유적으로 커플링되는 아미노산의 천연 발생, 재조합 또는 합성 중합체를 나타낸다. "대형" 폴리펩타이드가 당해 분야에서 전형적으로 "단백질"을 나타냄에도 불구하고, 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 폴리펩타이드에서 첫번째 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 그룹은 폴리펩타이드의 "아미노-말단" 또는 "N-말단"으로 지칭된다. 유사하게, 폴리펩타이드에서 마지막 아미노산 잔기, 또는 아미노산 잔기의 그룹은 "카복시-말단" 또는 "C-말단"으로 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 짧은 펩타이드(전형적으로 100개 미만의 아미노산), 폴리펩타이드(전형적으로 100개 이상의 아미노산), 및 단백질(하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 함유함)을 광범위하게 포함하는 총칭을 의도한다. 본 발명의 펩타이드는 전형적으로 2개 이상의 아미노산을 갖고; 바람직한 펩타이드는 4개 이상의 아미노산을 갖는다.
본원에 기재된 폴리펩타이드의 내용에서 사용되는 경우, 용어 "변이체", "변이체들" 등은 일반적으로, 하나 이상의 생화학적 변형(예를 들면, 번역후 변형, 치환, 부가물 첨가 등)의 존재 또는 부재하에, 폴리펩타이드와 참조 폴리펩타이드 사이의 아미노산 서열에서의 차이(예를 들면, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 적어도 95% 서열 동일성를 갖음)를 특징으로 하는 참조 폴리펩타이드와 구조적으로 유사한 폴리펩타이드(들)를 나타낸다. 특정한 변이체의 일반적인 활성의 부분집합은 유사할 수 있지만, 변이체들 사이에서 발생하는 구조적 차이는 이들 활성의 적어도 일부분이 겹치지 않는 것을 야기할 수 있다. "변이체"는 서열에서 인접한 아미노산 하나 이상의 추가, 결실, 치환뿐만 아니라 폴리펩타이드 분자에 대하여 분자의 공유적 변형을 포함하는 폴리펩타이드 서열에서 하나 이상의 위치에서 변경되는 폴리펩타이드 분자를 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 용어 "변이체" 및 "이형체"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 변이체의 예시적인 예는, 오직 예의 방식으로, 하나 이상의 아미노산 잔기에서 수소기가 알킬, 아실, 티올, 아마이드 또는 기타 이러한 작용기로 대체된 폴리펩타이드를 포함할 것이다. 변이체는 "보존적" 변화를 지닐 수 있고, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 지닐 수 있다(예를 들면, 비극성 아미노산 잔기의 상이한 비극성 아미노산 잔기로의 대체). 변이체는 또한 "비보존적" 변화를 지닐 수 있다(예를 들면, 극성 아미노산 잔기의 비극성 또는 하전된 아미노산 잔기로의 대체). 변이체는 또한 결실, 절단, 삽입, 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 아미노산 서열의 유사한 작은 변이를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 실질적으로 생물할적 활성을 제거하거나 이에 영향을 미치지 않고 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 지침은 당해 분야에서 넓게 이용 가능하다. 추가의 지침은 당해 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, DNASTAR 소프트웨어를 사용하여 확인할 수 있다. 일반적으로 본 발명의 내용에서, 변이체는 공지된 막 투과 펩타이드와 전형적으로 연관된 생물학적 작용의 부분집합, 예를 들면, 카고 분자, 예를 들면, 핵산 분자를 세포막을 통과하여 이의 사이토졸 구획으로 자리이동시키는 것을 촉진하는 능력을 적어도 보유할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 일반적으로 천연 발생 또는 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 동족체 및 아미노산 유사체를 나타낸다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩되는 것들, 뿐만 아니라 나중에 변형되는 이러한 아미노산, 예를 들면, 하이드록시프롤린, 카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 동족체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물, 즉 α-탄소가 수소, 카복실 기, 아미노 기, 및 R 기에 결합된 화합물, 예를 들면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌, 및 메틸 설포늄을 나타낸다. 이러한 동족체는 변형된 R 기(예를 들면, 노르류신 또는 노르발린) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 유사체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학 화합물을 나타낸다. 용어 "아미노산"은 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들면, 아미노산 동족체), 뿐만 아니라 이의 D- 및 L-형을 나타낼 수 있다. 이러한 아미노산의 예는 글리신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-리신, L-류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 L-발린, N-아세틸 시스테인을 포함한다.
"키트"는 본 발명의 하나 이상의 시약 또는 이의 혼합물을 포함하는 형질감염, DNA, RNAi, 또는 기타 카고(예를 들면, 단백질 또는 음이온성 분자) 전달 또는 단백질 발현 또는 녹다운(knockdown) 키트를 나타낸다. 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 비천연 발생 펩타이드를 임의로 하나 이상의 양이온성 지질 또는 형질감염 시약과 함께 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 및 지질 시약은 단일 제형으로 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 지질 및 펩타이드는 사용시 시약을 조합하도록 사용자에게 지시되면서 개별적으로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 컨테이너 수단, 예를 들면, 바이알, 시험 튜브 등을 닫힌 공간에 수용하도록 구획화된 운반 수단을 포함할 수 있다. 각각의 이러한 컨테이너는 형질감염을 수행하는데 필요한 구성분 또는 구성분의 혼합물을 포함한다. 이러한 키트는 임의의 카고 분자, 예를 들면, 핵산(바람직하게는 하나 이상의 발현 벡터, DNA 분자, RNA 분자 또는 RNAi 분자), 세포, 본 발명의 하나 이상의 화합물, 지질-응집체 형성 화합물, 형질감염 인핸서, 생물학적 활성 성분 등으로부터 선택된 하나 이상의 구성분을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 단일층 또는 현탁 배양, 형질감염, 및 세포의 재배, 및 단일층 또는 현탁 배양에서 세포의 단백질 발현에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 현탁 배양, 형질감염, 및 세포의 재배, 및 현탁 배양에서 세포의 단백질 생성물 발현에 적합하다.
"배양 용기"는 세포를 배양하기 위하여 무균 환경을 제공할 수 있는 임의의 컨테이너, 예를 들면, 유리, 플라스틱, 또는 금속 컨테이너를 의미한다.
용어 "조합"은 성분들의 혼합 또는 혼화를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 나타내는 것을 의도한다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 나타내는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 파지 벡터이다. 벡터의 또 다른 유형은 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정한 벡터는 이들이 도입되는 호스트 세포에서 자율 증식이 가능하다(예를 들면, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비에피솜 포유동물 벡터)는 호스트 세포 내로 도입되면 호스트 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 따라서 호스트 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정한 벡터는 이들이 실시적으로 연결되는 유전자의 발현을 직접적으로 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순하게, "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 이용 가능한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드는 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시에 따라 사용되는 특정한 벡터는 당해 분야에서 사용되는 잘 알려진 벡터, 예를 들면, pCDNA 3.3, 또는 이의 변형된 형태일 수 있다. 본 발명의 실시에 적합할 수 있는 벡터의 변형 유형의 비제한적인 예는 하나 이상의 인핸서, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 리포솜 결합 사이트, 하나 이상의 복제 기점 등의 변형의 추가와 같은 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 비제한적이지만 특정한 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 실시에 사용되는 발현 벡터는 본 발명의 일시적인 발현 시스템에서 관심 대상 단백질의 발현을 개선시키도록 선택된 하나 이상의 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 선택된 인핸서 요소는 관심 대상 단백질을 발현하는데 사용되는 발현가능한 핵산 서열에 5' 또는 3'에 위치할 수 있다.
본원에서 사용되는 구 "발현가능한 핵산을 함유하는 발현 벡터"는 일반적으로 세포 또는 무세포(cell-free) 발현 시스템에서 이의 발현을 지지하는데 필요한 하나 이상의 핵산 서열 또는 요소 이외에, 관심 대상 목적 단백질(상기 관심 대상 단백질은 본 발명의 사용자에 의해 선택됨)의 적어도 하나의 개방 판독 프레임을 갖는 발현가능한 핵산 서열을 수용할 수 있는 상기 정의된 바와 같은 벡터를 나타낸다. 본원에서 정의된 바와 같은 발현 벡터에서 존재할 수 있는 이러한 추가의 핵산 서열 또는 요소는 하나 이상의 프로모터 서열, 하나 이상의 인핸서 요소, 하나 이상의 리보솜 결합 사이트, 하나 이상의 번역 개시 서열, 하나 이상의 복제 기점, 또는 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 이러한 목적으로 제공되는 다양한 핵산 서열 또는 요소는 당해 분야의 숙련가에게 익숙하고, 본 발명의 실시에서 사용을 위한 이의 하나 이상의 선택은 숙련된 전문가의 범위 내에 잘 포함된다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하여 임의의 핵산을 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, "핵산"은 게놈 DNA를 포함하는 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 및 올리고 DNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 비제한적이지만 특정한 바람직한 실시형태에서, "핵산"은 게놈 DNA 및/또는 cDNA를 나타낸다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 동족체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들면, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 동족체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비뉴클레오타이드(non-nucleotide) 구성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 후 만들어진 변형(들), 예를 들면, 표지에 대한 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들면, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오타이드의 동족체에 의한 "캡스(caps)" 치환, 뉴클레오타이드내 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결기(예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결기(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)에 의한 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들면, 단백질(예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등)에 의한 변형, 인터칼레이터(예를 들면, 아크리딘, 소랄렌 등)에 의한 변형, 킬레이터(예를 들면, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유한 변형, 알킬레이터를 함유한 변형, 변형된 연결기(예를 들면, 알파 아노머 핵산 등)에 의한 변형뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 추가로, 당에 일반적으로 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들면, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 활성화되어 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가의 연결기를 제조할 수 있거나, 고체 또는 반고체 지지체에 컨쥬게이트될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 유기 캡핑 그룹 모이어티로 인산화되거나 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한, 예를 들면, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 동족체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들면, 아라비노스, 자일로스, 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 동족체, 및 기본 뉴클레오사이드 동족체, 예를 들면, 메틸 리보사이드를 포함하여 당해 분야에서 일반적으로 알려진 리보스 또는 데옥시리보스 당의 동족체 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결기는 대안적인 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO, 또는 CH2("포름아세탈")로 대체되는 실시형태를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에터(--O--) 연결기, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬을 임의로 함유하는 치환된 또는 치환되지 않은 알킬(1-20 C)이다. 폴리뉴클레오타이드의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 일반적으로 서열 특이적 전사후 유전자 사일런싱의 과정을 나타낸다. RNAi는 특이적인 mRNA가 짧은 RNA로 분해됨에 의한 과정이다. RNAi를 매개하기 위하여, 표적 mRNA에 실질적인 서열 동일성을 갖는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 세포 내로 도입한다. 그 다음, 표적 mRNA를 세포 내에서 분해하여 mRNA 및 이것이 인코딩하는 단백질의 감소된 양을 수득한다.
본원에서 사용되는 용어 "RNAi 구조물"은 일반적으로 작은 간섭 RNA(siRNA), 헤어핀 RNA, 및 생체내 절단되어 siRNA를 형성할 수 있는 기타 RNA 종을 나타낸다. 용어는 또한 세포에서 dsRNA 또는 헤어핀 RNA를 형성하는 전사물 및/또는 생체내에서 siRNA를 생성할 수 있는 전사물을 증가시킬 수 있는 발현 벡터를 포함한다. 용어 "RNAi 발현 벡터"는 그 안에서 구조물이 발현되는 호스트 세포에서 siRNA 이중나선을 생성하는 RNA를 발현하는데(전사하는데) 사용되는 복제가능한 핵산 구조물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 일반적으로 RNAi를 매개할 수 있는 정의된 뉴클레오타이드 서열의 짧은(길이 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오타이드), 이중 가닥 RNA 분자를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "복합체화 반응", "복합체화 배지" 등은 일반적으로 핵산이 형질감염 시약 제형으로 복합체화되는 생리학적으로 허용되는 배양 배지 또는 반응을 나타낸다. 전형적으로, 단백질 발현을 목적으로 세포 내로 도입되는 핵산을 먼저 적합한 형질감염 시약(예를 들면, 양이온성 지질 제형)으로 지질/핵산 복합체 또는 응집체로 복합체화시킨다.
약물은 인간 또는 동물에서 질환의 예방, 진단, 완화, 치료 또는 치유에 사용되는, 음식 이외의 임의의 치료학적 또는 예방학적 제제를 나타낸다.
다양한 기술 및 시약은 "형질감염"으로 알려진 과정에서 거대분자를 표적 세포 내로 도입하는 것을 가능하게 한다. 일반적으로 사용되는 시약은, 예를 들면, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 및 지질을 포함한다. 이러한 유형의 사용을 위한 상세한 프로토콜의 예를 들면, 많은 참조 문헌, 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Ausubel, et al. Eds., John Wiley and Sons, 1998]이 이용 가능하다. 세포를 형질감염시키는 추가의 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 전기천공법(유전자 전기이동), 초음파천공법(sono-poration), 광학 형질감염, 원형질 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다.
세포 내로 "거대분자의 도입을 위한 시약" 또는 "형질감염 시약"은 세포 내로 거대분자가 들어가는 것을 촉진하는 당해 분야의 숙련가에게 알려진 임의의 물질, 제형 또는 조성물이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,279,833호를 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 시약은 "형질감염 시약"일 수 있고, 하나 이상의 표적 세포 내로 하나 이상의 핵산의 흡입을 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다. 다양한 형질감염 시약이 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 적합한 형질감염 시약은 양이온성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌이민(PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예를 들면, 폴리리신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 분절된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체(CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 세포 내로의 거대분자 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPE), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트라이메틸암모니오)프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-(4'-트라이메틸암모니오)부타노일-sn-글리세롤(DOTB), 1,2-다이올레오일-3-석시닐-sn-글리세롤 콜린 에스터(DOSC), 콜레스테릴(4'-트라이메틸암모니오)부타노에이트(ChoTB), 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), O,O'-다이도데실-N-[p(2-트라이메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 컨쥬게이트된 스퍼민(예를 들면, 5-카복시스퍼밀글리신 다이옥타데실아마이드(DOGS), N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스퍼민(TM-TPS) 및 다이팔미토일파스페이티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아민(DPPES)), 리포폴리리신(DOPE에 컨쥬게이트된 폴리리신), TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 컨쥬게이트된 지방산(TFA) 및/또는 펩타이드, 예를 들면, 트릴리실-알라닐-TRIS 모노-, 다이- 및 트라이-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), N-(α-트라이메틸암모니오아세틸)-다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 다이메틸 다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미니늄트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
당해 분야의 숙련가는 상기 언급된 지질의 특정한 조합이 세포 내로 핵산의 도입에 특히 적합하다는 것을 인식할 것이고, 예를 들면, DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙타민(상표명)하에 이용 가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙틴(등록상표)하에 입수가능하고, DMRIE 및 콜레스테롤의 1:1(M/M) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 DMRIE-C 시약하에 입수가능하고, TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 셀펙틴(CELLFECTIN)(등록상표)하에 입수가능하고, DDAB 및 DOPE의 1:2.5(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙테이스(LIPOFECTACE)(등록상표)하에 입수가능하다. 상기 언급된 지질 조합 이외에, 다른 화합물과 혼화물로서, 특히 펩타이드 및 핵 국재화 서열을 포함하는 단백질과의 혼화물로서 지질을 포함하는 기타 제형이 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 예를 들면, 제WO 00/27795호로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/US99/26825호를 참조하고, 상기 둘 다는 본원에 참고로 인용된다.
지질 응집체, 예를 들면, 리포솜은 세포 내로의 거대분자 전달에 위한 제제로서 유용한 것으로 확인되었다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집체는 세포 내로의 음이온성 거대분자(예를 들면, 핵산)의 전달에서 극도로 효율적인 것으로 입증되었다. 하나의 일반적으로 사용되는 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)이다. 단독 또는 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과의 1:1 혼합물로서 DOTMA를 포함하는 리포솜은 세포 내로 핵산을 도입하는데 사용되었다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙틴(상표명)하에 입수가능하다. 세포 내로 핵산을 도입하는데 사용된 또 다른 양이온성 지질은 1,2-비스(올레오일-옥시)-3-3-(트라이메틸암모니아)프로판(DOTAP)이다. DOTAP에서 올레오일 모이어티가 에터 결합을 통해 프로필아민 골격에 연결되지만, DOTMA에서 이들은 에스터 결합을 통해 연결된다는 점에서 DOTAP는 DOTMA와 상이하다. DOTAP는 표적 세포에 의해 보다 용이하게 분해되는 것으로 여겨진다. 트라이메틸암모늄 모이어티의 메틸 기 중 하나가 하이드록시에틸 기로 대체되는 화합물의 구조적 관련 기는 포스포리파제 A의 로젠탈 억제제(RI)와 구조적으로 유사하다(참조: Rosenthal, et al.,(1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206). RI는 프로필아민 코어에 연결된 스테아로일 에스터를 갖는다. RI의 다이올레오일 동족체는 프로필아민 코어에 대한 지질 모이어티의 연결기에 따라 일반적으로 약칭된 DOR1-에터 및 DOR1-에스터이다. 하이드록시에틸 모이어티의 하이드록실기는 추가로, 예를 들면, 카복시스퍼민에 대한 에스터화에 의해 유도체화될 수 있다.
세포 내로의 거대분자의 도입에 사용된 화합물의 또 다른 부류는 지질에 부착된 카복시스퍼민 모이어티를 포함한다(참조: Behr, et al.,(1989) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86:6982-6986 and EPO 0 394 111). 이러한 유형의 화합물의 예는 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아마이드(DPPES) 및 5-카복시스퍼밀글리신 다이옥타데실아마이드(DOGS)를 포함한다. DOGS는 프로메가(Promega, Madison, Wis.)로부터 상표명 트랜스펙탐(상표명)하에 상업적으로 입수가능하다.
콜레스테롤의 양이온성 유도체(3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤, DC-Chol)는 합성되고 DOPE와 리포솜 내로 제형화되고(참조: Gao, et al.,(1991) BBRC 179(1):280-285.), DNA를 세포 내로 도입하는데 사용된다. 이로써 제형화된 리포솜은 낮은 수준의 세포 독성으로 세포 내로 DNA를 효율적으로 도입하는 것으로 보고되었다. 폴리리신을 DOPE로 컨쥬게이트함으로써 형성된 리포폴리리신(참조: Zhou, et al.,(1991) BBA 1065:8-14)은 혈청의 존재 하에 세포 내로 핵산을 효율적으로 도입하는 것으로 보고되었다.
세포 내로 핵산을 도입하는데 사용된 양이온성 지질의 다른 유형은 고도로 팩킹된 다중양이온성 암모늄, 설포늄 및 포스포늄 지질, 예를 들면, 미국 특허 제5,674,908호 및 제5,834,439호, 및 제WO 00/27795호로 공개된 국제 특허 출원 제PCT/US99/26825호에 기재된 것을 포함한다. 비제한적이지만 하나의 특히 바람직한, 본 발명에 따른 거대분자 전달용 형질감염 시약은 라이프 테크놀로지스(Life technologies)로부터 입수가능한 리포펙타민 2000(상표명)이다(참조: 제WO 00/27795호로서 공개된 미국 국제 특허 제PCT/US99/26825호). 비제한적이지만 또 다른 바람직한, 세포로의 거대분자 전달에 적합한 형질감염 시약은 엑스피펙타민(EXPIFECTAMINE)(상표명)이다. 다른 적합한 형질감염 시약은 리오펙타민(LIOFECTAMINE)(상표명) RNAiMAX, 리포펙타민(상표명) LTX, 올리고펙타민(OLIGOFECTAMINE)(상표명), 셀펙틴(상표명), 인비보펙타민(INVIVOFECTAMINE)(상표명), 인비보펙타민(상표명) 2.0, 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0136073호(Yang et al., 본원에 참고로 인용됨)에 기재된 임의의 지질 시약 또는 제형을 포함한다. 다양한 다른 형질감염 시약이 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있고, 이는 본원에 기재된 일시적인 형질감염 시스템 및 방법에 대한 이의 적합성에 대해 평가될 수 있다.
본 발명은 세포의 형질감염에 적합한 개선된 시약 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 전형적으로 형질감염이 어려운 것으로 여겨지는 세포 유형을 포함하여 모든 세포의 형질감염 효율을 개선시키는 조성물 및 시약을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 시약은, 본원에 기재된 방법뿐만 아니라 당해 분야의 숙련가의 범위 내의 일반적인 지식 및 전문지식에 따라 사용되는 경우, 전형적으로 형질감염 효율을 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 65% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하, 100% 이하 또는 100% 초과로 증가시킬 수 있다. 하기 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 카고 분자, 특히, 이로써 한정되지 않지만, 핵산 분자, 예를 들면, DNA 분자 또는 RNA 분자를 배양에서 세포 또는 생체 내에서 세포 또는 조직, 특히, 이로써 한정되지는 않지만, "형질감염이 어려운" 것으로 여겨지는 세포의 내부 또는 세포질 구획으로의 전달하기 위하여 하나 이상의 형질감염 지질과 조합으로서 사용되는 세포/막 투과 펩타이드 서열을 포함하는 신규한 펩타이드를 제공함으로써 이를 달성한다.
막/세포 투과 펩타이드
본 발명은 형질감염 시약과 조합으로서 사용되는 비천연 발생, 합성 펩타이드에 관한 것이고, 형질감염 시약은 바람직하게는 지질계 형질감염 시약, 특히 양이온성 지질계 형질감염 시약을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않고, 형질감염 복합체의 내포물은 카고 분자, 예를 들면, 핵산 분자 또는 당해 분야의 숙련가에게 매우 명백할 것인 임의의 다른 적합한 카고 분자를 세포막을 통과하여 수송하여 카고 분자가 배양 또는 생체내 조직에서 세포의 사이토졸 구획으로 전달되는 것을 개선시킴으로써 부분적으로 세포의 형질감염 효율을 개선시킨다.
이상적으로, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드는 지질 응집체 조성물 및 카고 분자와 다중구성분 복합체를 형성하는데 사용될 것이고, 여기서 복합체는 세포 또는 조직의 사이토졸 구획으로의 카고 분자의 전달을 개선시킨다.
본 발명의 하나의 양상에서, 비천연 발생 펩타이드는 적어도 하나의 형질감염 시약 및 적어도 하나의 카고 분자와 접촉하여, 형질감염 시약, 카고, 및 펩타이드를 포함하는 형질감염 복합체로서, 비천연 발생 펩타이드가 결핍된 동일한 형질감염 복합체와 비교하여 복합체의 형질감염 효율(배양에서 또는 생체내 조직에서 세포 내부로의 카보의 개선된 수송으로서 측정됨)을 개선시키는 것을 특징으로 하는 형질감염 복합체를 형성한다.
본 발명에 따라 사용되는 최적의 형질감염 시약을 구성하기 위한 선택은 전달되는 카고의 동일성 및 성질, 형질감염되는 세포의 동일성 및 특징, 형질감염이 배양에서 또는 동물 또는 인간 생체내에서 조직에서 단리된 세포에서 발생하는지 여부, 및 비천연 발생 펩타이드의 동일성에 따라 좌우된다. 모든 이들 특징들은 당해 분야의 숙련된 기술을 갖는 전문가에게 잘 알려져 있고, 특정한 적용의 특정한 맥락에서 최적의 형질감염 시약의 선택, 뿐만 아니라 구성분의 최적의 농도 및 제형을 구성하는 것을 결정하는 방식은 과도한 실험 없이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이러한 사람들에게 매우 명백하다.
비제한적이지만 특정한 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 실시형태에 따라 형질감염 복합체의 형성에서 사용을 위하여 선택된 형질감염 시약은 양이온성 지질, 특히 지질 응집체를 형성할 수 있는 양이온성 지질일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 형질감염 복합체는 지질 응집체 조성물을 포함할 수 있고, 지질 응집체 조성물은 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하고, 임의로 하나 이상의 양이온성 지질은, 임의로 적어도 하나의 헬퍼 지질의 존재 하에, 카고 분자 및 하기 구조를 갖는 적어도 하나의 비천연 발생 펩타이드와 접촉된다:
Figure pct00003
, 또는
Figure pct00004
여기서, A는 막 투과 펩타이드(MPP)이고, L은 A와 B를 연결하는 공유 결합 또는 링커 펩타이드이고, B는 양이온성 폴리펩타이드, 양이온성 모이어티, 또는 양이온성 모이어티에 공유적으로 연결된 양이온성 펩타이드이고, 비천연 발생 펩타이드는 형질감염 복합체의 구성분으로서 비천연 발생 펩타이드의 존재가 비천연 발생 펩타이드가 결핍된 동일한 형질감염 복합체의 것의 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 65% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하, 100% 이하, 150% 이하, 200% 이하, 250% 이하, 300% 이하, 350% 이하, 400% 이하, 500% 이하 또는 500% 초과로 형질감염 복합체의 형질감염 효율을 개선시키거나 증가시키는 것을 특징으로 한다.
A는, 제한 없이 펩타이드가 이의 작용을 수행하는 메커니즘과 독립적으로, 세포외 구획, 예를 들면, 세포 배양 배지 또는 세포간 또는 체액으로부터 세포막을 통과하는 분자, 예를 들면, 상기 정의된 바와 같은 카고 분자, 특히 핵산 분자, 예를 들면, DNA 또는 RNA 분자의 수송을 개선시키거나 촉진하여 카고 분자가 세포의 세포질 구획으로 이송되어 적어도 하나의 측정가능한 생물학적 반응 또는 작용에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려지거나 입증될 수 있는 임의의 펩타이드일 수 있다. 세포막을 통과하는 수송의 "개선"을 구성하는 것의 결정은 당해 분야의 숙련가의 기술 수준에 잘 포함되고, 이러한 방식으로 카고 분자의 수송을 개선시키거나 촉진하는 작용을 하는 적합한 펩타이드 또는 공지된 펩타이드의 변이체의 확인은 광범위한 공지된 기술을 사용하여 이러한 숙련가에게 매우 명백하다.
일부 비제한적인 예에서, A의 펩타이드 서열은 약 5 내지 약 75개의 아미노산, 약 5 내지 약 60개의 아미노산, 약 5 내지 약 50개의 아미노산, 약 5 내지 약 40개의 아미노산, 약 5 내지 약 30개의 아미노산, 약 5 내지 약 20 아미노산 또는 약 5 내지 약 15개의 아미노산, 약 10 내지 약 75개의 아미노산, 약 10 내지 약 60개의 아미노산, 약 10 내지 약 50개의 아미노산, 약 10 내지 약 40개의 아미노산, 약 10 내지 약 30개의 아미노산, 약 10 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 15개의 아미노산일 수 있고, 여기서 A는 형질감염 복합체의 구성분으로서 비천연 발생 펩타이드의 존재가 비천연 발생 펩타이드가 결핍된 동일한 형질감염 복합체의 것의 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 65% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하, 100% 이하, 150% 이하, 200% 이하, 250% 이하, 300% 이하, 350% 이하, 400% 이하, 500% 이하 또는 500% 초과로 형질감염 복합체의 형질감염 효율을 개선시키는 것을 특징으로 한다.
본원에 기재된 바와 같은 비천연 발생 펩타이드에서 MPP(즉, 상기 나타낸 구조 A-L-B 또는 B-L-A의 영역 A)로서 사용에 적합한 다양한 펩타이드 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, 이중 임의의 것은 제한 없이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. MPP로서 작용하는 것으로 알려진 펩타이드의 비제한적이지만 대표적인 세트는 표 1에 나타낸다.
일부 비제한적인 실시형태에서, A는 서열 번호 1 내지 68 중 어느 하나로부터 선택된 펩타이드 서열, 또는 서열 번호 1 내지 68 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 유사성을 갖고 세포 내부로의 카고 분자 전달을 개선시키는 이의 작용의 적어도 50% 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 155%, 100% 이상, 115% 이하, 120% 이하, 130% 이하, 140% 이하, 150% 이하, 160% 이하, 170% 이하, 180% 이하를 보유하는 이의 변이체를 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, L은 A와 B를 연결하는 공유 결합일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, L은 중성(생리학적 pH에서 하전되지 않음) 아미노산의 다이펩타이드를 포함할 수 있고, 여기서 임의로 다이펩타이드의 두 아미노산 중 하나는 적어도 하나의 극성 측쇄를 포함한다. 실시형태에서, L은 적어도 하나의 극성 측쇄 또는 적어도 하나의 소수성 측쇄를 포함하는 다이펩타이드를 포함할 수 있고, 여기서 상기 극성 또는 소수성 측쇄는 바람직하게는 부피가 큰 측쇄가 아니다. 실시형태에서, L은 적어도 하나의 글리신, 적어도 하나의 발린, 적어도 하나의 알라닌, 적어도 하나의 세린 또는 적어도 하나의 트레오닌을 포함하는 다이펩타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, L은 GG, AA, GA, AG, AS, AY, GS, GT, GV, AV, SV, TV, VG, VA, 및 VT로 이루어진 목록으로부터 선택된 다이펩타이드를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, L은 약 3 내지 약 50개, 약 45개, 약 40개, 약 35개, 약 30개, 약 25개, 약 20개, 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개, 약 5개, 약 4개의 아미노산을 갖는 링커 펩타이드일 수 있고, 여기서 아미노산의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 90% 이상은 중성이다.
몇몇 실시형태에서, L은 약 3 내지 약 50개, 약 5 내지 약 25개, 약 6 내지 약 20개, 약 8 내지 약 15개 아미노산, 또는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산을 갖는 링커 펩타이드일 수 있고, 여기서 아미노산의 약 35% 이하는 중성 극성 측쇄를 함유하고/함유하거나 아미노산의 적어도 35%는 소수성 측쇄를 포함하고, 여기서 극성 및 소수성 측쇄는 부피가 큰 측쇄가 아니다.
몇몇 실시형태에서, L은 약 3 내지 약 50개, 약 5 내지 약 25개, 약 6 내지 약 20개, 약 8 내지 약 15개의 아미노산, 또는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산을 갖는 링커 펩타이드일 수 있고, 여기서 아미노산의 약 35% 이하는 세린, 트레오닌, 발린, 이소류신 및 류신으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, L은 약 3 내지 약 50개, 약 5 내지 약 25개, 약 6 내지 약 20개, 약 8 내지 약 15개의 아미노산, 또는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산을 갖는 링커 펩타이드일 수 있고, 여기서 아미노산의 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80% 이상은 글리신 또는 알라닌이다.
몇몇 실시형태에서, L은 하기 구조를 갖는 링커 펩타이드일 수 있다:
Figure pct00005
또는
Figure pct00006
여기서, 각각의 X는 독립적으로 비극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산이고, 각각의 Y는 독립적으로 극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산이고, m은 3 내지 10의 정수이고, n은 1 내지 5의 정수이고, L이 결합이 아닌 경우, p는 1 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, m > n이다. 몇몇 실시형태에서, m은 2이고 n은 1이거나, m은 3이고 n은 1 또는 2이다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 X는 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신이다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 Y는 독립적으로 세린 또는 트레오닌이다.
본원에 기재된 바와 같은 비천연 발생 펩타이드에서 링커(즉, 상기 나타낸 구조 A-L-B 또는 B-L-A의 영역 L)로서 사용에 적합한 다양한 펩타이드 서열은 본 발명의 실시에서 사용될 수 있고, 이중 임의의 것은 제한 없이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 실시형태에 따른 사용을 위해 고려되는 링커 펩타이드의 비제한적이지만 대표적인 세트는 표 2에 기재된다.
일부 비제한적인 실시형태에서, L은 서열 번호 69 내지 81 중 어느 하나, 또는 서열 번호 69 내지 81 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 유사성을 갖고 세포 내부로의 카고 분자의 전달을 개선시키는 이의 작용의 적어도 50% 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 155%, 100% 이상, 115% 이하, 120% 이하, 130% 이하, 140% 이하, 150% 이하, 160% 이하, 170% 이하, 180% 이하를 보유하는 이의 변이체로부터 선택된 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, B는 양이온성 폴리펩타이드, 양이온성 모이어티, 또는 양이온성 모이어티에 공유적으로 연결된 양이온성 펩타이드일 수 있다. 분자, 특히 펩타이드에 양이온성 전하를 부여하는 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 양이온성 모이어티는 제한 없이 본 발명에서 사용을 위해 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 양이온성 모이어티의 비제한적이지만 바람직한 예는 폴리아민, 예를 들면, 하나 이상의 푸트레신, 카다베린, 스퍼민, 스퍼미딘을 포함한다. 추가의 양이온성 모이어티는 폴리-L-리신을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, B는 약 3 내지 약 50개의 아미노산, 약 5 내지 약 25개, 약 6 내지 약 20개, 약 8 내지 약 15개의 아미노산, 또는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산의 펩타이드 서열을 갖는 펩타이드일 수 있고, 여기서 아미노산의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 생리학적 pH에서 양으로 하전된다.
본원에 기재된 바와 같은 비천연 발생 펩타이드에서 양이온성 영역(즉, 상기 나타낸 구조 A-L-B 또는 B-L-A의 영역 B)으로서 사용에 적합한 다양한 펩타이드 서열은 본 발명의 실시에서 사용될 수 있고, 이중 임의의 것은 제한 없이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 실시형태에 따른 사용을 위해 고려되는 링커 펩타이드의 비제한적이지만 대표적인 세트는 표 3에 기재된다.
표 1. 예시적인 막 투과 펩타이드(MPP) 서열
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
표 2. 예시적인 링커(L) 펩타이드 서열
Figure pct00010
표 3. 예시적인 양이온성 폴리펩타이드(CP) 서열
Figure pct00011
표 4의 펩타이드 서열의 목록은 오직 예의 방식으로만 제공될 뿐, 본 발명의 범위를 분명하게 기재된 서열로만 한정하는 것을 의도하지 않다는 것을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이지만, 표 4에는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 다양한 펩타이드 서열이 기재된다. 그와는 반대로, 본 발명의 펩타이드의 A, L 및 B 영역과 관련하여 상기 기재된 교시를 기반으로, 본원에 기재된 본 발명의 실시에 잠재적으로 유용한 다수의 펩타이드가 가능하다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 게다가, 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 제공된 펩타이드 서열이 당해 분야의 표준 기술을 사용하여 본 발명의 범위에 속하는지 여부를 측정하는 것은 숙련가의 범위에 잘 포함된다. 게다가, 표 4에 기재된 펩타이드 서열의 다양한 변이체는 또한 이러한 변이체가 상기 기재된 구조적 및 작용적 특징을 만족시키는 한, 본 발명의 범위에 속한다는 것이 인식될 것이다. 표 4에 기재된 펩타이드 서열 또는 표 4에 분명하게 기재되지 않았지만 상기 기재된 구조적 및 작용적 요구사항을 만족시키는 임의의 다른 후보 펩타이드의 변이체는 천연 발생 또는 비단백질원 아미노산에 의한 결실, 삽입, 치환을 포함할 수 있다.
표 4. 예시적인 비천연 발생 펩타이드
Figure pct00012
Figure pct00013
몇몇 실시형태에서, A의 펩타이드 서열은 5 내지 약 50개의 아미노산이고, A는 양이온성 지질계 형질감염 시약의 존재 하에 세포 내로의 분자 전달을 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상 개선시키는 것을 특징으로 한다.
몇몇 실시형태에서, A는 표 1에 기재된 펩타이드 서열 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고, A는 세포 내로의 분자 전달을 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상 개선시키는 것을 특징으로 한다.
몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 1 내지 68에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 14 내지 35에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 37 내지 43에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 44, 45, 46에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 52 내지 68에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, A는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 13, 및 서열 번호 14에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 비천연 발생 펩타이드 A는 표 4에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 비천연 발생 펩타이드 A는 서열 번호 89 내지 107에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 비천연 발생 펩타이드 A는 서열 번호 89 내지 96에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 비천연 발생 펩타이드 A는 서열 번호 89, 92, 98, 103 또는 106에 기재된 펩타이드 서열 중 하나 이상, 또는 이와 적어도 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 유사하고 이의 활성의 적어도 10% 이상, 적어도 15% 이상, 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 100%, 적어도 200% 이상, 적어도 250% 이상, 적어도 300% 이상, 적어도 350% 이상, 적어도 400% 이상, 적어도 500% 이상, 적어도 600% 이상, 적어도 700% 이상, 적어도 800% 이상, 적어도 900% 이상, 적어도 1000% 이상 적어도 1500% 이상 또는 적어도 2000% 이상을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
형질감염 개선제
비천연 발생 펩타이드, 핵산 및 형질감염제 사이에서 형성된 복합체는 추가로 모이어티의 내포물, 예를 들면, 핵 또는 다른 세포내 국재화를 위하여 작용하거나, 수송 또는 트래픽킹을 위하여 작용하거나, 수용체 리간드이거나, 세포 접착 신호, 세포 표적화 신호, 세포 내재화 신호 또는 내포작용 신호을 포함하는 단백질 또는 펩타이드, 뿐만 아니라 외피 바이러스의 바이러스성 융합성 단백질, 바이러스성 핵 국재화 신호, 수용체-리간드, 세포 접착 신호, 세포 표적화 신호 또는 내재화- 또는 내포작용-촉발 신호의 펩타이드 또는 이의 작용 부분에 의해 개선될 수 있다.
복합체는 또한 임의로 형질감염 개선제, 예를 들면, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와 아미노산 서열에서 구별되는 핵 국재화 단백질 또는 펩타이드, 융합성 펩타이드 또는 단백질, 수용체-리간드 펩타이드 또는 단백질, 수송 펩타이드 또는 단백질, 또는 바이러스성 펩타이드 또는 단백질을 함유할 수 있다. 적합한 바이러스성 펩타이드는 바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, HIV 바이러스, 또는 유인원 바이러스로부터 유래될 수 있다. 형질감염 개선제는 또한, 예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 세포 표적화 항체, 락토페린, 피브로넥틴, 아데노바이러스 펜톤 베이스, 놉(Knob), 헥손 단백질, 수포성 구내염 바이러스 당단백질, 셈리키 삼림열 바이러스 코어 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌, B형 간염 코어 단백질, HIV Tat 단백질, 단순 헤르페스 바이러스 VP22 단백질, 히스톤 단백질, 아르기닌 풍부 세포 침투 단백질, 고이동도 그룹 단백질, 및 인바신 단백질, 및 인터날린 단백질, 내독소, 디프테리아 독소, 시겔라 독소, 멜리틴, 마가이닌, 그라미시딘, 세크로핀, 데펜신, 프로테그린, 타키플레신, 티오닌, 인돌리시딘, 박테네신, 드로소마이신, 아피다에신, 카텔리시딘, 살박테리아성-침투성-증가 단백질, 니신, 부포린, 또는 이의 단편일 수 있다. 형질감염 개선제는 클로로퀸, 라이소조모트로픽 화합물 또는 임의의 유도체, 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. 형질감염제는 동일하거나 상이한 펩타이드 또는 단백질의 다량체를 함유할 수 있다.
본 발명의 임의의 단백질 또는 펩타이드(또는 이의 단편 또는 부분)는 본 발명에 따라 단독으로 또는 다른 단백질 또는 펩타이드와 조합으로 사용될 수 있다. 바람직한 양상에서, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상 등의 단백질 및/또는 펩타이드가 본 발명에서 사용된다. 추가로, 이러한 단일 또는 다중 단백질 및/또는 펩타이드는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상 등의 형질감염제와 조합으로 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 양상에서, 적어도 2종의 펩타이드 및/또는 단백질이 형질감염제, 바람직하게는 적어도 2종의 형질감염제, 예를 들면, 지질, 및/또는 다중양이온, 예를 들면, 덴드리머 또는 PEI와 조합으로 사용된다.
본 발명의 추가의 실시형태는 상기 기재된 비천연 발생 펩타이드를 하나 이상의 형질감염 시약과 조합으로 함유하는 형질감염 복합체에 관한 것이고, 이러한 형질감염 시약은 하나 이상의 양이온성 지질, 및 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형질감염 복합체는 세포 내부로 전달되는 카고를 포함할 수 있거나, 임의로 이의 투여로부터 이익을 얻는 동물 또는 인간 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한, 비제한적이지만 바람직한 카고 분자는 핵산 분자, 예를 들면, DNA 분자 또는 RNA 분자를 포함한다. 적합한 DNA 분자는 발현가능한 핵산 서열을 포함하는 DNA 분자, 예를 들면, 단백질을 인코딩하는 개방 판독 프레임을 포함하는 발현 벡터 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에서 적합한 카고로서 작용할 수 있는 다른 적합한 분자는 RNA 분자, 예를 들면, mRNA 분자 또는 RNAi 분자를 포함한다.
펩타이드의 제조 방법:
본 발명의 비천연 발생 펩타이드는 제한 없이, 재조합 방법 또는 펩타이드 합성 화학, 예를 들면, 고체상 펩타이드 합성을 포함하여 당해 분야의 숙련가에게 이전에 공지된 임의의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 고체상 합성 방법(Marrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154, 1963)은 이러한 펩타이드 합성 방법의 단지 예로서 기재될 수 있다. 현재 펩타이드는 이들의 원리를 기반으로 한 자동화된, 다용도 펩타이드 합성기를 사용하여 상대적으로 단기간의 시간 동안 단순하게 제조될 수 있다. 추가로, 펩타이드는 잘 알려진 재조합 단백질 제조 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이러한 기술은 숙련가에게 광범위하게 알려져 있다.
형질감염 시약
본 발명은 또한 상기 기재되고 본원에 포함되는 본 발명에 따른 비천연 발생 펩타이드, 상기 정의되고 본원에 포함되는 적어도 하나의 카고 분자, 상기 정의되고 본원에 포함되는 적어도 하나의 형질감염 시약을 비공유적 회합으로 포함하는 형질감염 복합체를 제공한다.
비제한적이지만 특정한 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 실시에서 사용을 위하여 선택된 형질감염 시약은 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 임의로 적어도 하나의, 임의로 하나 이상의 중성 지질 또는 헬퍼 지질을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 형질감염 시약은 하나 이상의 지질을 포함할 수 있고, 이 중 하나 이상은 양이온성 지질일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형질감염 시약은 중성 및 양이온성 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형질감염 시약은 하나 이상의 펩타이드 및/또는 단백질을 포함할 수 있고, 이는 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와 구별되고, 단독으로 또는 하나 이상의 지질과 혼화물로서 제공될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 하나의 이러한 펩타이드는 시약, 예를 들면, 플러스(PLUS)(상표명) 시약(라이프 테크놀로지스(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재))을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 형질감염 시약은 세포 내부로 전달되는 거대분자/카고, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드, 및 임의로 하나 이상의 헬퍼 또는 중성 지질과 함께 비공유적 복합체를 형성한다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 형질감염 복합체는 알짜 양전하를 지닐 수 있고, 이로써 형질감염 복합체와 세포막의 상호작용을 촉진한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따른 사용에 적합한 형질감염 시약은 거대분자가 세포 내로 들어가는 것을 촉진하는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 물질, 제형 또는 조성물일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형질감염 시약은 하나 이상의 표적 세포 내로의 하나 이상의 핵산 또는 다른 카고 분자의 흡입을 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다.
다양한 형질감염 시약은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 적합한 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온성 중합체, 폴리리신 및 폴리아르기닌과 같은 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 양으로 하전된 덴드리머 및 분절된 덴드리머, 양이온성 β-사이클로덱스트린 함유 중합체(CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 세포 내로의 거대분자의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPE), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트라이메틸암모니오)프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-(4'-트라이메틸암모니오)부타노일-sn-글리세롤(DOTB), 1,2-다이올레오일-3-석시닐-sn-글리세롤 콜린 에스터(DOSC), 콜레스테릴(4'-트라이메틸암모니오)부타노에이트(ChoTB), 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), O,O'-다이도데실-N-[p(2-트라이메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 컨쥬게이트된 스퍼민(예를 들면, 5-카복시스퍼밀글리신 다이옥타데실아마이드(DOGS), N,NI,NII,NIII-테트라메틸-N,NI,NII,NIII-테트라팔미틸스퍼민(TM-TPS) 및 다이팔미토일파스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아민(DPPES)), 리포폴리리신(DOPE에 컨쥬게이트된 폴리리신), TRIS(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 컨쥬게이트된 지방산(TFA) 및/또는 펩타이드, 예를 들면, 트릴리실-알라닐-TRIS 모노-, 다이- 및 트라이-팔미테이트, (3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤(DC-Chol), N-(α-트라이메틸암모니오아세틸)-다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 다이메틸 다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미니늄트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
당해 분야의 숙련가는 상기 언급된 지질의 특정한 조합이 세포 내로의 핵산의 도입에 특히 적합한 것으로 나타났음을 인식할 것이고, 예를 들면, DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙타민(상표명)하에 상업적으로 입수가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙틴(등록상표)하에 상업적으로 입수가능하고, DMRIE 및 콜레스테롤의 1:1(M/M) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 DMRIE-C 시약하에 상업적으로 입수가능하고, TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 셀펙틴(등록상표)하에 상업적으로 입수가능하고, DDAB 및 DOPE의 1:2.5(w/w) 조합이 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙테이스(등록상표)하에 상업적으로 입수가능하다. 상기 언급된 지질 조합 이외에, 기타 화합물과의 혼화물로서, 특히, 핵 국재화 서열을 포함하는 펩타이드 및 단백질과의 혼화물로서 지질을 포함하는 기타 제형이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 제WO 00/27795호로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/US99/26825호를 참조하고, 이는 둘 다 본원에 참고로 인용된다.
지질 응집체, 예를 들면, 리포솜은 세포 내로의 거대분자의 전달을 위한 제제로서 유용한 것으로 확인되었다. 특히, 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 응집체는 세포 내로 음이온성 거대분자(예를 들면, 핵산)를 전달하는데 극도로 효율적인 것으로 입증되었다. 하나의 일반적으로 사용되는 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)이다. DOTMA를 단독으로 또는 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)과의 1:1 혼합물로서 포함하는 리포솜은 세포 내로 핵산을 도입하는데 사용되었다. DOTMA:DOPE의 1:1 혼합물은 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 상표명 리포펙틴(상표명)하에 상업적으로 입수가능하다. 세포 내로 핵산을 도입하는데 사용된 또 다른 양이온성 지질은 1,2-비스(올레오일-옥시)-3-3-(트라이메틸암모니아) 프로판(DOTAP)이다. DOTAP에서 올레오일 모이어티가 에터 결합을 통해 프로필아민 골격에 연결되지만, DOTMA에서 이들은 에스터 결합을 통해 연결된다는 점에서 DOTAP는 DOTMA와 상이하다. DOTAP는 표적 세포에 의해 보다 용이하게 분해되는 것으로 여겨진다. 트라이메틸암모늄 모이어티의 메틸 기 중 하나가 하이드록시에틸 기로 대체되는 화합물의 구조적 관련 기는 포스포리파제 A의 로젠탈 억제제(RI)와 구조적으로 유사하다(참조: Rosenthal, et al.,(1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206). RI는 프로필아민 코어에 연결된 스테아로일 에스터를 갖는다. RI의 다이올레오일 동족체는 프로필아민 코어에 대한 지질 모이어티의 연결기에 따라 일반적으로 약칭된 DOR1-에터 및 DOR1-에스터이다. 하이드록시에틸 모이어티의 하이드록실기는 추가로, 예를 들면, 카복시스퍼민에 대한 에스터화에 의해 유도체화될 수 있다.
세포 내로의 거대분자의 도입에 사용된 화합물의 또 다른 부류는 지질에 부착된 카복시스퍼민 모이어티를 포함한다(참조: Behr, et al.,(1989) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86:6982-6986 and EPO 0 394 111). 이러한 유형의 화합물의 예는 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아마이드(DPPES) 및 5-카복시스퍼밀글리신 다이옥타데실아마이드(DOGS)를 포함한다. DOGS는 프로메가(상표명)(Madison, Wis.)로부터 상표명 트랜스펙탐(상표명)하에 상업적으로 입수가능하다.
콜레스테롤의 양이온성 유도체(3β-[N--(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤, DC-Chol)는 합성되고 DOPE와 리포솜 내로 제형화되고(참조: Gao, et al.,(1991) BBRC 179(1):280-285.), DNA를 세포 내로 도입하는데 사용된다. 이로써 제형화된 리포솜은 낮은 수준의 세포 독성으로 세포 내로 DNA를 효율적으로 도입하는 것으로 보고되었다. 폴리리신을 DOPE로 컨쥬게이트함으로써 형성된 리포폴리리신(참조: Zhou, et al.,(1991) BBA 1065:8-14)은 혈청의 존재 하에 세포 내로 핵산을 효율적으로 도입하는 것으로 보고되었다.
세포 내로 핵산을 도입하는데 사용된 양이온성 지질의 다른 유형은 고도로 팩킹된 다중양이온성 암모늄, 설포늄 및 포스포늄 지질, 예를 들면, 미국 특허 제5,674,908호 및 제5,834,439호, 및 제WO 00/27795호로 공개된 국제 특허 출원 제PCT/US99/26825호에 기재된 것을 포함한다.
비제한적이지만 하나의 특히 바람직한, 본 발명에 따른 거대분자 전달용 형질감염 시약은 라이프 테크놀로지스로부터 입수가능한 리포펙타민 2000(상표명)이다(참조: 제WO 00/27795호로서 공개된 미국 국제 특허 제PCT/US99/26825호).
비제한적이지만 또 다른 바람직한, 세포로의 거대분자 전달에 적합한 형질감염 시약은 엑스피펙타민(상표명) 또는 이의 유도체이다.
다른 적합한 형질감염 시약은 리포펙타민(등록상표) RNAiMAX, 리포펙타민(등록상표) LTX, 올리고펙타민(등록상표) 셀펙틴(상표명), 인비보펙타민(등록상표), 인비보펙타민(등록상표) 2.0, 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0136073호(Yang et al., 본원에 참고로 인용됨)에 기재된 임의의 지질 시약 또는 제형을 포함한다. 다양한 다른 형질감염 시약이 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있고, 이는 본원에 기재된 일시적인 형질감염 시스템 및 방법에 대한 이의 적합성에 대해 평가될 수 있다.
비제한적이지만 다양한 바람직한, 본 발명의 사용에 적합한 양이온성 지질 및 형질감염 시약은 이제 하기에 보다 상세히 기재될 것이다. 그러나 하나 이상의 특이적인 양이온성 지질, 또는 1종 이상의 양이온성 지질의 분명한 기재가 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와 컨쥬게이트로서 사용될 수 있는 다른 시약 또는 지질의 사용을 배제하는 것을 의미하는 것이 아니라는 것, 대안적인 양이온성 지질 또는 형질감염 시약의 선택, 및 본 발명의 내용에서 이의 사용이 당해 분야의 숙련가의 범위에 잘 포함된다는 것, 및 이러한 사람은 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이러한 시약을 용이하게 사용할 수 있다는 것을 주의하여야 한다.
본 발명의 몇몇 실시형태는 하나 이상의 비천연 발생 펩타이드를 하나 이상의 양이온성 지질과 조합으로서 포함하는 지질 응집체를 제공한다. 본 발명의 기본을 형성하는 조성물의 성능에 대한 어떠한 이론 또는 기계론적 설명으로 한정되거나 이와 결부되지 않고, 오직 이의 완전한 설명을 제공하기 위하여, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드는, 하나 이상의 형질감염 시약, 특히 하나 이상의 양이온성 형질감염 지질과 조합으로서 사용되는 경우, 지질 응집체 및 카고 분자를 포함하는 형질감염 복합체의 세포 내부로 전달되는 능력을 개선시키는 것으로 여겨진다. 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질 또는 하나 이상의 중성 지질과 함께 양이온성 지질을 사용하는 것은 지질 응집체에 의한 카고 분자의 더 큰 캡슐화를 가능하게 할 수 있고, 추가로 리포솜 지질 응집체의 표적 세포막과의 융합을 보조함으로써 카고 분자의 전달을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 형질감염 복합체의 형성에서 사용하기에 유용한 양이온성 지질은 1가 또는 다가 양이온성 지질 또는 양이온성 지질의 혼합물일 수 있다. DOTMA, DOTAP, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOSPER, TMTPS, DHMS, DHDMS 및 이의 동족체 또는 호몰로그(homolog)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 형질감염 방법에서 유용한 것으로 당해 분야에 인식된 양이온성 지질이 특히 흥미롭다. 임의로, 지질 응집체는 추가로 적어도 하나의 추가의 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 헬퍼 지질은 당해 분야에 공지되어 있고, 중성 지질, 바람직하게는 DOPE, DOPC 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 중성 지질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 임의로, 본 발명의 형질감염 복합체는 양이온성 지질을 함유하는 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약, 예를 들면, 리포펙틴(등록상표), 리포펙타민(상표명) RNAiMAX 및 리포펙타민(상표명) 2000, 리포펙타민(등록상표) 3000, 리포펙타민(등록상표) LTX(라이프 테크놀로지스 코포레이션, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 하나 이상의 양이온성 지질, 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질, 및 상기 기재된 하나 이상의 비천연 발생 펩타이드와 복합체화된 하나 이상의 카고 분자를 포함하는 양이온성 지질 응집체를 제공한다. 카고 분자는 실험실의 배양 또는 동물 또는 인간의 조직에서 세포 내부로 이송되는 임의의 성분일 수 있다. 카고는, 적용에 따라, 거대분자, 예를 들면, 핵산, 단백질, 또는 펩타이드일 수 있거나, 또는 약물 또는 다른 유기 소분자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형질감염 복합체의 형성에 바람직한 카고는 핵산, 예를 들면, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)이다. 몇몇 실시형태에서, 바람직한 카고는 DNA 분자일 수 있다. DNA는 선형 DNA 또는 환형 DNA, 예를 들면, 환형 플라스미드, 에피솜 또는 발현 벡터의 형태인 DNA일 수 있다. 비제한적이지만 특정한 바람직한 실시형태에서, 용어 거대분자는 발현가능한 핵산 서열로부터의 mRNA의 전사에 필요한 하나 이상의 핵산 서열에 실시가능하게 연결된 적어도 하나의 개방 판독 프레임을 포함하는, 발현가능한 핵산 서열을 갖는 상보적 DNA(cDNA)를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 바람직한 카고는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 제한 없이, mRNA, siRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 세포 내부로 전달되는 것이 추구되는, 제한 없이, 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 임의의 다른 유형 또는 종의 RNA 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 RNA 분자의 임의의 유형일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 형질감염 복합체는 상기 기재된 바와 같은 비천연 발생 펩타이드, 적어도 하나의 카고, 적어도 하나의 양이온성 지질, 및 임의로 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 형질감염 복합체는, 일단 형성되면, 수성 용액 중에서 안정하며, 형성된 직후에, 인간 또는 동물의 세포 또는 조직과 접촉할 수 있거나, 세포 또는 조직과 접촉하기 전 기간 동안 저장될 수 있다. 형질감염 복합체는 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1 년의 기간 동안 안정하며 저장될 수 있다. 저장 기간은 이러한 임의의 기간 사이, 예를 들면, 31분 내지 1시간 또는 1시간 내지 24시간일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 형질감염 복합체는 공지된 이러한 형질감염 시약(표 5 참조)을 포함하여 1가 또는 다가의 임의의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 양이온성 지질은 포화 및 불포화 알킬 및 아민, 아마이드 또는 이의 유도체의 지환식 에터 및 에스터를 포함한다. 양이온성 지질의 직쇄 및 분지형 알킬 및 알켄기는 1 내지 약 25개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 바람직한 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알켄기는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는다. 보다 바람직한 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알켄기는 8 내지 약 20개의 탄소 원자를 갖는다. 지환식 기는 약 6 내지 30개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 8 내지 20개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 바람직한 지환식 기는 콜레스테롤 및 다른 스테로이드기를 포함한다. 양이온성 지질은 그 중에서도 Cl-, Br-, I-, F-, 아세테이트, 트라이플루오로아세테이트, 설페이트, 나이트라이트, 트리플레이트, 및 나이트레가트를 포함하는 다양한 반대 이온(음이온)과 함께 제조될 수 있다.
본 발명의 지질 응집체에서, 양이온성 지질은 임의로 비양이온성 지질, 바람직하게는 중성 지질과 조합되어 변형된-펩타이드-핵산 복합체에 결합하는 지질 응집체를 형성할 수 있다. 헬퍼 지질로서 본 발명에서 유용한 중성 지질은 그 중에서도 레시틴(및 이의 유도체); 포스포티딜에탄올아민(및 이의 유도체); 포스파티딜에탄올아민, 예를 들면, DOPE(다이올레오일포스파티딜에탄올아민), DphPE(다이피타노일포스파티딜-에탄올아민), DPPE(다이팔미토일포스파티딜에탄올아민), 다이팔미테오일포스파티딜-에탄올아민, POPE(팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민) 및 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민; 포스포티딜콜린; 포스파티딜콜린, 예를 들면, DOPC(다이올레오일포스피딜콜린), DPPC(다이팔미토일포스파티딜콜린) POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린) 및 다이스테아로일포스파티딜콜린; 포스파티딜-글리세롤; 포스파티딜글리세롤, 예를 들면, DOPG(다이올레오일포스파티딜글리세롤), DPPG(다이팔미토일포스파티딜글리세롤), 및 다이스테아로일포스파티딜글리세롤; 포스파티딜-세린(및 이의 유도체); 포스파티딜세린, 예를 들면, 다이올레오일- 또는 다이팔미토일포스파티딜세린; 다이포스파티딜글리세롤; 지방산 에스터; 글리세롤 에스터; 스핑고지질(sphingolipid); 카돌리핀; 세레브로사이드; 및 세라마이드; 및 이의 혼합물을 포함한다. 중성 지질은 또한 콜레스테롤 및 기타 3βOH-스테롤뿐만 아니라 이의 유도체를 포함한다.
하기 특허 문서, 특허 출원, 또는 문헌은 이의 전문 및 특히 본 발명의 지질 응집체를 양이온성 지질과 함께 포함하는데 사용될 수 있는 양이온성 및 중성(헬퍼) 지질을 함유하는 형질감염제에 대한 기재내용이 본원에 참고로 인용된다: 미국 특허 제6,075,012호; 제6,020,202호; 제5,578,475호; 제5,736,392호; 제6,051,429호; 제6,376,248호; 제5,334,761호; 제5,316,948호; 제5,674,908호; 제5,834,439호; 제6,110,916호; 제6,399,663호; 제6,716,882호; 제5,627,159호; 제WO 04063342 A2호로서 공개된 제PCT/US/2004/000430호; 제WO 0027795 A1호로서 공개된 제PCT/US/9926825호; 제WO 04105697호로서 공개된 제PCT/US/04016406호; 및 제WO 07130073 A2호로서 공개된 제PCT/US2006/019356호. 표 5에 또한 본 발명의 지질 응집체를 양이온성 지질과 함께 포함하는데 사용될 수 있는 양이온성 지질 및 중성 지질을 포함하는 형질감염제가 열거된다.
표 5. 형질감염 시약의 비제한적인 예
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
비제한적이지만 일부 바람직한 실시형태에서, 지질 응집체는 적어도 제1 양이온성 지질 및 임의로 적어도 제1 중성 지질을 포함할 수 있고, 여기서 상기 지질 응집체는 수성 조건하에 핵산과 양이온성 복합체를 형성하는데 적합하고, 상기 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00021
(화학식 I) 및 이의 염.
여기서, R1 및 R2는, 독립적으로, 8 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고;
알킬, 알케닐 또는 알키닐기는 8 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 임의로 하나 이상의 알코올, 아미노알코올, 아민, 아마이드, 에터, 폴리에터, 에스터, 머캅탄, 알킬티오, 또는 카바모일기에 의해 치환되고, 또는 R1은 -(CH2)q-N(R6)tR7R8이며;
R3 및 R4는, 독립적으로, 수소, 또는 8 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 임의로 하나 이상의 알코올, 아미노알코올, 아민, 아마이드, 에터, 폴리에터, 에스터, 머캅탄, 알킬티오, 또는 카바모일기로 치환되는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고;
R5-R8은, 독립적으로, 수소, 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이며;
R9는 수소, 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기, 탄수화물 또는 펩타이드이고;
r, s 및 t는 지시된 R 기의 존재 또는 부재를 나타내는 1 또는 0이고, r, s 또는 t 중 어느 하나가 1인 경우, 지시된 R 기가 연결된 질소는 양으로 하전되고, 여기서 r, s 또는 t 중 적어도 하나는 1이고;
q는 1 내지 6을 포함하는 범위의 정수이고;
Xv-는 음이온이고, v는 음이온의 원자가이고, A는 음이온의 수이고;
L은 하기로부터 선택된 2개의 질소를 공유적으로 연결할 수 있는 2가 유기 라디칼이고: (CH2)n, 여기서 n은 1 내지 10을 포함하는 범위의 정수이고, 이는 임의로 하나 이상의 ZR10 기로 치환되고, 여기서 Z는 O 또는 S이고, R10은 수소 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고; 또는
{-(CH2)k-Y-(CH2)m}p-, 여기서 k 및 m은, 독립적으로, 1 내지 10을 포함하는 범위의 정수이고, p는 1 내지 6을 포함하는 범위의 정수이고, Y는 O, S, CO, COO, CONR11, NR11CO, 또는 NR11COR11N이고, 여기서 R11은, 임의의 다른 R11과 독립적으로, 수소 또는 알킬 기이고;
여기서, R1 내지 R10의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기의 하나 이상의 CH2기는 O, S, S-S, CO, COO, NR12CO, NR12COO, 또는 NR12CONR12으로 대체될 수 있고, 여기서 R12는, 임의의 다른 R12와 독립적으로, 수소 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고;
여기서, R1 내지 R12의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기는 임의로 하나 이상의 OR13, CN, 할로겐, N(R13)2, 펩타이드, 또는 탄수화물 기로 치환되고, 여기서 R13은, 다른 R13과 독립적으로, 수소 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고,
여기서, R3 및 R4 중 적어도 하나는, 알킬 기로서 존재하는 경우, OR13 및 N(R13)2 기 둘 다로 치환된다.
이들 화합물의 합성 및 이를 도입하는 지질 응집체의 제조 방법은 제한 없이 당해 분야의 숙련가에게 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 화합물을 합성하는 비제한적이지만 예시적인 방법, 및 이를 도입하는 지질 응집체의 형성 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제7,166,745호 및 PCT 공개 제WO 00/27795호에서 확인할 수 있고, 둘 다는 본원에 완전히 기재된 바와 같이 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 기본을 형성하는 지질 응집체는 추가로 임의로 TMTPS, DOGS, DPPES, DOTMA, DOTAP, DDAB, DMRIE, DOSPA, 및 DOSPER로 이루어진 목록으로부터 선택된 추가의 하나의, 임의로 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
본 발명의 지질 응집체의 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 형질감염 복합체의 형성에서 사용되는 비제한적이지만 특히 바람직한 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 다이하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드(이하 "DHDMS"로서 지칭함)일 수 있다:
Figure pct00022
본 발명의 지질 응집체의 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 형질감염 복합체의 형성에서 사용되는 비제한적이지만 특히 바람직한 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드(이하 "HDMS"로서 지칭함)일 수 있다:
Figure pct00023
몇몇 실시형태에서, 중성 지질은 하기로부터 선택될 수 있다: DOPE, 콜레스테롤 또는 DOPC. 하나의 실시형태에서, 중성 지질은 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC 중 하나일 수 있다. 실시형태에서, 지질은 콜레스테롤이다. 실시형태에서, 중성 지질은 DOPE이다. 실시형태에서, 지질은 DOPC이다.
하나의 실시형태에서, 임의의 제2 중성 지질은 제2 중성 지질 및 상기 기재된 제1 중성 지질이 동일하지 않다는 것을 제외하고, 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC 중 하나일 수 있다. 실시형태에서, 임의의 제2 중성 지질은 콜레스테롤이다. 실시형태에서, 임의의 제2 중성 지질은 DOPE이다. 실시형태에서, 임의의 제2 중성 지질은 DOPC이다.
몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 양이온성 지질의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.8의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 양이온성 지질의 몰비는 0.1 내지 약 0.2, 약 0.15 내지 약 0.25, 약 0.2 내지 약 0.3, 약 0.25 내지 약 0.35, 약 0.3 내지 약 0.4, 약 0.35 내지 약 0.45, 약 0.4 내지 약 0.5, 약 0.45 내지 약 0.55, 약 0.5 내지 약 0.6, 약 0.55 내지 약 0.65, 약 0.6 내지 약 0.7, 약 0.65 내지 약 0.75, 약 0.7 내지 약 0.8, 또는 약 0.75 내지 약 0.85일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 DHDMS의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.7 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 양이온성 지질의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3 또는 약 0.4, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, DHDMS의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.4이다. 몇몇 실시형태에서, DHDMS의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.4, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 HDMS의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.4 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 제2 양이온성 지질의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3 또는 약 0.4, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, HDMS의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.4이다. 몇몇 실시형태에서, HDMS의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.4, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 중성 지질의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.8 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 양이온성 지질의 몰비는 0.1 내지 약 0.2, 약 0.15 내지 약 0.25, 약 0.2 내지 약 0.3, 약 0.25 내지 약 0.35, 약 0.3 내지 약 0.4, 약 0.35 내지 약 0.45, 약 0.4 내지 약 0.5, 약 0.45 내지 약 0.55, 약 0.5 내지 약 0.6, 약 0.55 내지 약 0.65, 약 0.6 내지 약 0.7, 약 0.65 내지 약 0.75, 약 0.7 내지 약 0.8, 또는 약 0.75 내지 약 0.85, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 콜레스테롤의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.8이다. 몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 양이온성 지질의 몰비는 0.1 내지 약 0.2, 약 0.15 내지 약 0.25, 약 0.2 내지 약 0.3, 약 0.25 내지 약 0.35, 약 0.3 내지 약 0.4, 약 0.35 내지 약 0.45, 약 0.4 내지 약 0.5, 약 0.45 내지 약 0.55, 약 0.5 내지 약 0.6, 약 0.55 내지 약 0.65, 약 0.6 내지 약 0.7, 약 0.65 내지 약 0.75, 약 0.7 내지 약 0.8, 또는 약 0.75 내지 약 0.85, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, DOPE의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.8이다. 몇몇 실시형태에서, 지질 응집체 중의 양이온성 지질의 몰비는 0.1 내지 약 0.2, 약 0.15 내지 약 0.25, 약 0.2 내지 약 0.3, 약 0.25 내지 약 0.35, 약 0.3 내지 약 0.4, 약 0.35 내지 약 0.45, 약 0.4 내지 약 0.5, 약 0.45 내지 약 0.55, 약 0.5 내지 약 0.6, 약 0.55 내지 약 0.65, 약 0.6 내지 약 0.7, 약 0.65 내지 약 0.75, 약 0.7 내지 약 0.8, 또는 약 0.75 내지 약 0.85, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, DOPC의 몰비는 약 0.1 내지 약 0.4이다. 몇몇 실시형태에서, DOPC의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.4, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, 콜레스테롤의 몰비는 약 0.2 내지 약 0.8이다. 몇몇 실시형태에서, 콜레스테롤의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.35, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.55, 약 0.6, 약 0.65, 약 0.7, 약 0.75, 약 0.8, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, DOPE의 몰비는 약 0.2 내지 약 0.8이다. 몇몇 실시형태에서, DOPE의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.35, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.55, 약 0.6, 약 0.65, 약 0.7, 약 0.75, 약 0.8, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, DOPC의 몰비는 약 0.2 내지 약 0.8이다. 몇몇 실시형태에서, DOPC의 몰비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.35, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.55, 약 0.6, 약 0.65, 약 0.7, 약 0.75, 약 0.8, 또는 이들 사이에 속하는 임의의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, DHDMS의 몰비는 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 또는 0.5이고, 중성 지질의 몰비는 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 또는 0.5이다.
몇몇 실시형태에서, HDMS의 몰비는 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 또는 0.5이고, 중성 지질의 몰비는 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 또는 0.5이다.
본 발명의 몇몇 비제한적인 실시형태에 따른 다양한 지질 제형의 조성물이 표 I에 제공된다. 이들 예시적인 실시형태의 제공은 본 발명의 범위를 기재된 이들 제형으로만 한정하는 것을 어떠한 방식으로도 의도하지 않는다. 이와 반대로, 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 다양한 가능한 지질 응집체 제형을 단지 제공하는 것을 의도한다. 그럼에도 불구하고, 당해 분야의 숙련가는 제형이 변하거나 변경될 수 있으며, 추가의 구성분(예를 들면, 추가의 양이온성 또는 중성 지질, 펩타이드 표적화 모이어티 등)이 첨가될 수 있거나, 표 I에 기재된 중성 지질 중 하나가 임의로 제거될 수 있고, 수득된 제형이 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위에 속할 것임을 인식할 것이다.
비천연 발생 펩타이드를 함유하는 복합체의 제조 및 사용
본 발명의 또 다른 실시형태는 세포 또는 세포들 내로 다중음이온, 예를 들면, 핵산 분자를 전달하는 방법을 제공하고, 여기서 방법은 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 중성 지질을 포함하는 지질 응집체, 바람직하게는 리포솜을 형성하는 단계, 그 안의 양이온성 영역 B의 존재에 의하여 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와 이미 복합체화된 다중음이온과 지질 응집체를 접촉시켜 중성 또는 양으로 하전된 다중음이온-펩타이드-지질 응집체 복합체를 형성하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 복합체와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 유용한 음이온은 단백질, 펩타이드 및 핵산, 바람직하게는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 바람직하게는, 지질 응집체는 추가로 적어도 하나의 추가의 헬퍼 지질을 포함한다. 임의로, 다중음이온-지질 응집체 복합체는 세포 또는 세포들과 접촉되기 전 기간 동안 저장된다. 다중음이온-지질 응집체 복합체는 적어도 45분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년의 기간, 또는 임의의 이들 기간 사이의 기간 동안 안정적이며 저장될 수 있다. 본 발명은 siRNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 작은 일시적으로 조절된 RNA(stRNA)를 포함하는 RNAi를 전달하는데 특히 유용하고, 이는 임의로 화학적으로 변형된다.
본 발명의 방법은 임의의 세포, 바람직하게는 진핵 세포를 상기 기재된 바와 같은 적어도 비천연 발생 펩타이드, 형질감염제 및 핵산을 포함하는 형질감염 복합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 복합체는 임의로 또한 하나 이상의 추가의 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면, 융합성, 막 투과화, 수송 또는 트래픽킹 세포내 국재화, 또는 수용체-리간드 펩타이드 또는 단백질을 함유할 수 있다. 이들 추가의 펩타이드 또는 단백질은 임의로 핵산 결합 기에 컨쥬게이트되거나, 임의로 형질감염제(지질 또는 다중양이온성 중합체)에 컨쥬게이트될 수 있고, 여기서 펩타이드 또는 단백질 또는 변형된 펩타이드 또는 단백질은 핵산과 비공유적으로 회합된다. 임의의 이론과 결부되지 않고, 이들 구조의 정확한 본질이 현재 알려지지 않았음에도 불구하고, 출원인은 본 발명의 복합체가 전형적으로 리포솜을 함유하는 지질 응집체 또는 지질 응집체 구조인 것으로 생각한다. 따라서, 특정한 예시적인 예에서, 본 발명의 복합체는 리포솜 복합체이다. 전체 복합체, 또는 복합체의 일부분, 예를 들면, 지질 부분, 예를 들면, 화학식 I의 지질은 당해 분야에 잘 알려진, 예를 들면, 역 증발 방법을 사용하여, 리포솜 내로 제형화될 수 있다. 대안적으로 복합체의 지질 부분 또는 전체 복합체는 다른 잘 알려진 리포솜 형성 방법, 예를 들면, 초음파처리 또는 미세유동화에 의해 제형화될 수 있다. 이들 리포솜 제형은 배양된 세포 내로 DNA를 형질감염시키는데 효과적이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드 또는 단백질 및 핵산을 함유하는 복합체(여기서, 비천연 발생 펩타이드 또는 단백질은 임의로 핵산 결합 기에 컨쥬게이트될 수 있음)를 먼저 형성한 다음, 형질감염을 위한 양이온성 지질, 예를 들면, 화학식 I의 지질과 조합한다. 관련 실시형태에서, 펩타이드- 또는 단백질-지질 컨쥬게이트를 임의의 적절한 양이온성 지질을 포함하는 다른 지질과 임의로 조합한 다음, 형질감염을 위한 핵산과 조합한다. 또 다른 관련 실시형태에서, 핵산-지질 복합체를 형성한 다음, 형질감염을 위한 비천연 발생 펩타이드 또는 단백질과 조합한다. 상기 논의된 바와 같이, 임의의 이들 실시형태의 지질 함유 복합체는 리포솜 또는 비리포솜 제형일 수 있다. 추가로, 이들 실시형태에서 형성된 임의의 복합체를 세포의 형질감염 전에, 예를 들면, 5분 내지 1년, 또는 15분 내지 6개월, 또는 1시간 내지 3개월 동안 저장할 수 있다. 펩타이드 또는 단백질-지질 컨쥬게이트의 경우, 이러한 컨쥬게이트를 핵산과 조합 전에, 예를 들면, 5분 내지 1년, 또는 15분 내지 6개월, 또는 1시간 내지 3개월 동안 저장할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 비천연 발생 펩타이드 또는 단백질 및 핵산을 함유하는 복합체(여기서, 비천연 발생 펩타이드 또는 단백질은 핵산 결합 기에 컨쥬게이트될 수 있음)를 형성한 다음, 형질감염을 위한 다중양이온성 중합체와 조합한다. 관련 실시형태에서, 펩타이드-다중양이온성 중합체 컨쥬게이트를 임의로 또 다른 다중양이온성 중합체와 조합한 다음, 형질감염을 위한 핵산과 조합한다. 또 다른 관련 실시형태에서, 핵산-다중양이온성 중합체 복합체를 형성한 다음, 형질감염을 위한 펩타이드 또는 단백질과 조합한다. 다중양이온성 중합체 및/또는 펩타이드-컨쥬게이트된 다중양이온성 중합체를 양이온성 지질 및 양이온성 지질 조성물과 조합하여 개선된 핵산 형질감염 조성물을 수득할 수 있다. 본 발명에 따라, 다중 펩타이드 및/또는 단백질을 가하여 형질감염을 달성할 수 있다.
펩타이드- 또는 단백질-지질 컨쥬게이트 및 핵산을 포함하는 본 발명의 형질감염 조성물은 형질감염을 추가로 개선시키는 다른 비펩타이드 또는 비단백질 제제를 추가로 포함할 수 있다.
펩타이드- 또는 단백질-다중양이온성 중합체 컨쥬게이트 및 핵산을 포함하는 본 발명의 형질감염 조성물은 다중양이온성 중합체 형질감염을 추가로 개선시키는 것으로 알려진 다른 비펩타이드 제제를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들면, 다중양이온성 중합체 형질감염은 DEAE-덱스트란 및/또는 클로로퀸의 첨가에 의하여 개선될 수 있다.
비제한적이지만 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드를 세포 내로 도입되는 핵산 또는 다른 카고에 비공유적 회합으로 먼저 결합시킬 수 있다. 그 다음, 펩타이드-핵산 복합체를 형질감염제(또는 제제의 혼합물)와 혼화하고, 수득된 혼합물을 사용하여 세포를 형질감염시킨다. 바람직한 형질감염제는, 예를 들면, 화학식 I의 지질, 특히 1가 및 다가 양이온성 지질 조성물, 보다 특히 양이온성 지질 및 DOPE의 1:1 내지 4:1 혼합물 및 양이온성 지질 및 콜레스테롤의 1:1 내지 4:1 혼합물, 뿐만 아니라 양이온성 지질 및 DOPC의 1:1 내지 4:1 혼합물로 이루어진 양이온성 지질 조성물, 보다 특히 다이하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드 및 DOPE의 1:1 내지 4:1 혼합물 및 다이하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드 및 콜레스테롤의 1:1 내지 4:1 혼합물, 뿐만 아니라 다이하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드 및 DOPC의 1:1 내지 4:1 혼합물뿐만 아니라 하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드 및 DOPE의 1:1 내지 4:1 혼합물 및 하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드 및 콜레스테롤의 1:1 내지 4:1 혼합물, 뿐만 아니라 하이드록실-다이미리스틸스퍼민 테트라하이드로클로라이드 및 DOPC의 1:1 내지 4:1 혼합물로 이루어진 양이온성 지질 조성물을 함유하지만 이에 한정되지 않는 양이온성 지질 조성물이다.
또 다른 임의의 실시형태에서, 융합성 펩타이드 또는 단백질, 수송 또는 트래픽킹 펩타이드 또는 단백질, 수용체-리간드 펩타이드 또는 단백질, 또는 핵 국재화 펩타이드 또는 단백질 및/또는 이의 변형된 동족체(예를 들면, 스퍼민 변형된 펩타이드 또는 단백질)를 포함하는 하나 이상의 형질감염 개선 펩타이드, 단백질, 또는 단백질 단편의 혼합물을, 세포 내로 도입되는 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와 핵산의 복합체화와 동시에 또는 직후에, 핵산과 복합체화시킬 수 있다. 그 다음, 펩타이드-핵산 복합체를 형질감염제와 혼화하고, 수득된 혼합물을 사용하여 세포를 형질감염시킨다. 특정한 실시형태에서, 형질감염 개선 펩타이드, 단백질, 또는 단백질 단편의 혼합물은 핵산과 복합체화되기 전에 저장된다.
또 다른 임의의 실시형태에서, 형질감염제의 구성분(지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 양이온성 지질, 덴드리머, 또는 PEI)은 직접적으로 또는 연결 또는 스페이서 기를 통해 선택된 펩타이드, 단백질, 또는 단백질 단편에 공유적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 당해 실시형태에서 당해 분야에 알려진 바와 같은 비외피 바이러스(non-enveloped virus)로부터의 비천연 발생 융합성 단백질인 펩타이드 또는 단백질이 특히 흥미롭다.
비외피 바이러스의 비천연 발생 펩타이드를 함유하는 복합체의 예시적인 사용
본 발명의 지질 응집체 또는 이의 혼합물을 사용하는 전달 방법은, 특히 동물 세포, 인간 세포, 비인간 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 조류 세포, 어류 세포, 포유동물 세포 등을 포함하는 진핵 세포 또는 조직의 형질감염을 위하여, 시험관내, 생체외, 및 생체내에서 세포에 적용될 수 있다. 세포 내로 전달되는 다중음이온을 상기 기재된 바와 같은 비천연 발생 펩타이드의 존재 하에 지질 응집체와 접촉시켜 다중음이온-지질-폴리펩타이드 응집체 복합체를 형성한다. 그 다음, 표적 세포 또는 세포들을 복합체와 함께 배양하거나, 생체내 적용을 위하여, 복합체를 유기체에 투여하여 복합체가 표적 세포 또는 조직에 접촉한다. 본 발명의 화합물은 또한 세포 표적화, 흡입, 내재화, 핵 표적화 및 발현을 개선시키는 단백질, 펩타이드, 성장 인자 등과 같이 형질감염 헬퍼로도 지칭되는 다양한 유용한 분자 및 성분과 컨쥬게이트 또는 혼합되거나 이와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 복합체 및 방법, 특히 본원에 제공되는 복합체를 포함하는 형질감염 조성물을 포함하는 것은 세포, 특히 진핵 세포의 시험관내 및 생체내 형질감염, 보다 특히 동물 세포를 고등 진핵 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 유용한 유전자 산물을 발현하는 형질감염된 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 형질전환 동물의 생성에서 하나의 단계로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 유전자 치료 및 바이러스성 억제 방법을 포함하는 세포 내로의 핵산의 도입이 필요한 치료학적 방법에서 하나의 단계로서, 및 세포 내로의 안티센스 또는 항원 핵산, 리보자임, RNA 조절 서열, siRNA, RNAi, 스텔스(Stealth)(등록상표) RNAi(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation, Carlsbad Calif.)) 또는 관련 억제 또는 조절 핵산의 도입을 위하여 사용될 수 있다. 특히, 이들 방법은 암 치료, 생체내 및 생체외 유전자 치료 및 진단학적 방법에 유용할 수 있다.
펩타이드, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 단편 또는 변형된 펩타이드 또는 변형된 단백질을 포함하는 본 발명의 형질감염 조성물 및 방법은 또한 연구 목적을 위하여 수행된 진핵 세포의 임의의 형질감염에서 연구 제제로서 사용될 수 있다.
따라서, 형질감염제 및 융합제를 포함하는 복합체 및 핵산을 포함하는 형질감염 조성물을 형성하는 단계로서, 여기서 융합제는 비외피 바이러스의 융합 단백질로부터 유래된 융합 촉진 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 진핵 세포를 형질감염 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세로 내로의 거대분자의 도입 방법이 본원에 제공된다. 본 발명의 조성물을 사용하여 진핵 세포를 형질감염시키는 예시적인 프로토콜이 본원의 실시예 부문에서 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 예시적인 예에서, 융합제는 막 융합 펩타이드(MPP), 유리하게는 길이가 5 내지 50개의 아미노산이고, 융합 펩타이드의 적어도 5개의 인접한 아미노산이 표 1에 기재된 임의의 펩타이드와 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 유사한 융합 펩타이드이다.
추가의 실시형태는 생체내에서 핵산으로 세포 또는 조직을 형질감염시키는 방법을 제공하고, 여기서 방법은 하나 이상의 양이온성 지질, 임의로 하나 이상의 중성 지질 및 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 지질 응집체, 바람직하게는 리포솜을 형성하는 단계, 펩타이드와 핵산 사이의 안정한 비공유적 상호작용을 촉진시키는데 충분한 조건하에 본 발명의 비천연 발생 펩타이드에 핵산을 접촉시킴으로써 형성된 핵산-펩타이드 복합체를 지질 응집체와 접촉시켜, 중성 또는 양으로 하전된 지질 응집체-핵산 복합체를 형성하는 단계, 및 지질 응집체-핵산 복합체를 유기체에 투여하여 복합체를 표적 세포 또는 조직에 접촉시키는 단계를 포함한다.
지질 응집체-펩타이드-핵산 복합체의 투여는 실험실 현장에서 배양 중인 조직 또는 세포에 경구적으로, 정맥내로, 또는 피하 또는 근육내 주사로 달성되거나 국소적으로 적용될 수 있다.
임의로, 다중음이온-펩타이드-지질 응집체 복합체는 형질감염을 위하여 세포 또는 세포들에 접촉되기 전 기간 동안 저장된다. 다중음이온-펩타이드-지질 응집체 복합체는 적어도 30 분, 적어도 45 분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 14일, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년의 기간 동안, 또는 이들 임의의 기간 중 어느 한 기간 동안 안정하며 저장될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 지질 응집체(약 1㎕ 내지 2000㎕)를 멀티웰 플레이트의 웰 내에 제공한다. 표적 세포로 전달되는 표적 다중음이온 분자를 선택하고 웰에 가하여 다중음이온-펩타이드-지질 응집체 복합체를 형성하고, 이를 후속적으로 표적 세포와 접촉시킨다. 지질 응집체는 각각의 웰에서 동일한 조성물 및 농도를 지닐 수 있거나, 지질 응집체 조성물 및/또는 농도는 웰마다 다를 수 있다. 다중음이온이 핵산, 예를 들면, DNA 또는 RNA인 경우, 핵산을 웰에 가하고, 임의로 표적 세포와 접촉 전에 저장할 수 있다.
본 발명의 방법은 임의로 핵산-펩타이드 복합체를 하나 이상의 양이온성 지질과 접촉시켜 핵산-펩타이드를 캡슐화하는 지질 응집체를 형성하기 전에 또는 이와 동시에, 하나 이상의 양이온성 지질을 하나 이상의 헬퍼 또는 중성 지질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 방법은 또한 임의로 핵산과 접촉시키기 전에 지질 응집체를 리포솜 내에 형성하는 단계를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 리포솜은 미세유동화, 압출 또는 당해 분야에 공지된 다른 수단에 의해 형성된다. 핵산은 바람직하게는 표적 유전자의 발현을 억제하는 DNA 또는 RNA이다. 바람직하게는 핵산은 유전자의 전사물과 회합하여 억제를 야기한다. 바람직하게는, 핵산은 RNAi, siRNA, shRNA, 또는 stRNA이고, 임의로 화학적으로 변형된다.
핵산 또는 기타 거대분자의 용적 및 농도, 본원에 제공된 형질감염 복합체의 용적 및 농도, 희석제의 용적 및 조성, 및 세포의 용적 및 농도는, 예를 들면, 세포독성 검정을 이용하는 방법 및/또는 베타 갈락토시다제, 루시페라제, 및/또는 형광 단백질과 같은 리포터 유전자를 발현하는 헥산 발현 벡터를 사용하는 형질감염 이용 방법을 포함하는 이러한 최적화 및 적정에 대한 표준 실험 접근법을 사용하여 측정될 수 있다. 추가로, 세포 밀도는 표준 방법을 사용하여 최적화될 수 있고, 본원에 제공된 형질감염 복합체를 사용하는 형질감염을 위한 세포 밀도는, 예를 들면, 고밀도 > 75% 내지 저밀도 < 50%의 범위일 수 있다.
복합체화 반응을 위한 예시적인 희석제는, 예를 들면, 감소된 혈청, 또는 무혈청(serum-free) 배지, 예를 들면, D-MEM 및 RPMI 1640 및 OptiPro(상표명), Opti-MEM(등록상표)(인비트로젠 코포레이션)을 포함한다. 전형적인 배양 시간은 5 내지 240 분이지만, 복합체를 형성하기 위한 배양 시간은 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 추가로, 형질감염되는 세포주 및 특정한 적용 방법을 기반으로 형질감염 전후에 세포 배양을 위한 배지를 선택할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들면, 현탁액 세포 중의 단백질의 제조에 있어서, 예시적인 실시형태에서, 감소된 혈청, 또는 유리하게는 무혈청 배지가 사용될 수 있다. 특정한 예시적인 실시형태에서, 동물 기원 무함유 배지, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 293 발현 배지(인비트로젠 코포레이션) 및 CD-CHO 배지(인비트로젠 코포레이션)가 사용된다. 형질감염되는 세포 유형에 따라 특정 양상에서, 항생제가 형질감염후 배지로부터 제외될 수 있다. 세포의 형질감염후 배양을 위한 배양 시간은 세포 유형 및 형질감염의 목적되는 결과에 따라 다양하지만, 전형적으로 2시간 내지 7일 범위이다. 대규모 단백질 제조를 위하여, 세포는 비제한적인 예로서 1일 내지 7일 동안 배양될 수 있다.
형질감염제 및 융합제의 광범위한 농도가 본원에 제공된 복합체, 조성물 및 방법에서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, 양이온성 지질 및 비천연 발생 펩타이드의 복합체를 포함하는 조성물의 예시적이고 비제한적인 예에서, 조성물 중의 양이온성 지질 및 비천연 발생 펩타이드의 총 예시적이고 비제한적인 조합된 농도는 1 ㎎/㎖ 내지 4 ㎎/㎖일 수 있다. 1 ㎎/㎖의 지질에 첨가되는 펩타이드의 범위는 100 ㎍/㎖ 내지 3 ㎎/㎖일 수 있다. 헬퍼 지질에 대한 양이온성 지질의 비율은 0.5/1.0(몰) 내지 순수한 화합물일 수 있다.
본 발명에 따라 형질감염될 수 있는 세포는, 예를 들면, 사실상 일차 세포를 포함하는 임의의 진핵 세포, 배양 중의 세포, 및 배양된 조직의 세포, 특히 형질감염이 어려운 것으로 여겨지는 세포를 포함한다. 세포는 현탁액 중에서 세포 또는 세포들에 부착될 수 있다. 특정한 예시적인 양상에서, 세포는 현탁액 CHO-S 세포 및 현탁액 293-F 세포이다. 현탁액 세포 배양은 본원에 제공된 단백질 제조 방법에 특히 적합하다. 본 발명의 제제 및 방법을 사용하여 형질감염될 수 있는 기타 세포는 293, 예를 들면, 그립타이트(GripTite) 293 MSR(인비트로젠 코포레이션), CHO, Cos7, NIH3T3, Hela, 일차 섬유아세포, A549, Be2C, SW480, Caco2, 일차 신경세포, Jurkat, C6, THP1, IMR90, HeLa, ChoK1, GT293, MCF7, HT1080, LnCap, HepG2, PC12, SKBR3, 및 K562 세포, 또는 표 6에 열거된 임의의 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 특정한 실시형태에서, 형질감염 개선제는 세포를 형질감염시키는데 사용되는 복합체에 포함된다. 예를 들면, 형질감염 개선제는 핵 국재화 펩타이드일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 형질감염 개선제는 플러스(상표명) 시약(인비트로젠 코포레이션)이다. 플러스(상표명) 시약의 첨가가 본원에 제공되는 바와 같은 형질감염 조성물과 함께 사용되는 경우, 단백질 발현을 개선시키는 것으로 나타났다. 세포독성은 플러스(상표명) 시약의 사용에 의해 영향을 받지 않았다.
또 다른 실시형태에서, 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 세포를 형질감염시키는 단계, 세포를 배양하여 단백질을 생성하는 단계, 및 단백질을 수집하는 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법이 본원에서 제공되고, 여기서 형질감염은 세포를 본 발명의 비천연 발생 펩타이드를 포함하는 형질감염 조성물과 접촉시킴으로써 수행된다. 세포를 형질감염시키기 위한 조성물은 본원에 제공되는 바와 같은 임의의 조성물일 수 있다. 예시적인 조성물은 관심 대상 단백질을 인코딩하는 핵산 분자, 본 발명의 비천연 발생 펩타이드와의 복합체, 임의로 융합제, 및 형질감염제를 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 인코딩된 단백질은 항체 분자, 또는 항원 결합 단편 또는 이의 유도체 부분, 예를 들면, 단일쇄 Fv 단편이다. 이들 실시형태에서, 방법은 예를 들면, 항체 결합 칼럼에서 친화력 정제를 사용함으로써 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 항체의 두 쇄를 인코딩하는 핵산은 본원에 제공된 형질감염 조성물을 사용하여 세포 내로 형질감염된다.
단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 벡터일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 발현 벡터는 전형적으로 하나 이상의 단백질 쇄를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열에 실시가능하게 연결된 프로모터를 갖는다. 생성된 단백질이 약제학적 생성물인 경우, 단백질은, 예를 들면, 생리학적 배지의 적절한 선택에 따라 제형화될 수 있다.
본원에 제공된 형질감염 조성물은 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 펩타이드 및 단백질 등을 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 펩타이드 및 단백질 전달을 위하여 양이온성 지질을 사용하는 방법은 이전에 기재되었다. 추가로, 형질감염 조성물은 핵산, 펩타이드 및 단백질 등을 생체내 조직 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 화합물을 생체내 조직으로 전달하기 위한 지질의 사용 방법은 이전에 기재되어 있다. 형질감염 조성물은 생리학적 배지의 적절한 선택과 함께 치료학적 및 진단학적 적용으로 사용될 수 있다.
시약 키트:
본 발명은 추가로 적어도 하나의 제1 적합한 컨테이너에 본 발명에 따른 적어도 하나의 비천연 발생 펩타이드를 함유하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 적어도 하나의 거대분자의 도입을 촉진하는 시약, 예를 들면, 양이온성 형질감염 시약, 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질 또는 중성 지질을 포함하는 하나 이상의 컨테이너를 추가로 포함할 수 있고, 임의로 카고, 예를 들면, 핵산 또는 상기 정의된 바와 같은 다른 카고와 함께 제공될 수 있다. 바람직한 형질감염 시약은 양이온성 지질 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 형질감염 조성물의 구성분은 시약 키트로 제공될 수 있다. 키트는 형질감염제 및 본 발명의 비천연 발생 펩타이드를 함유할 수 있다. 당해 키트는 또한 임의로 형질감염 개선제, 예를 들면, 형질감염 개선 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편 또는 형질감염 개선 화합물을 포함할 수 있다. 형질감염제, 비천연 발생 펩타이드, 및 임의의 형질감염 개선제는, 존재하는 경우, 각각은 혼합물로서(즉, 단일 컨테이너, 전형적으로 튜브 및/또는 바이알로) 포함될 수 있거나, 개별적인 부분으로서(즉, 개별적인 컨테이너, 예를 들면, 개별적인 바이알 및/또는 튜브로) 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로, 예를 들면, 판지 상자 또는 다른 포장재에 함께 포장되는 용기, 예를 들면, 바이알 및/또는 튜브를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 키트는 제공자로부터 고객에게 발송될 수 있다. 예를 들면, 하나의 예에서 형질감염제 및 형질감염 개선 펩타이드를 포함하는 리포솜 제형을 포함하는 바이알을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 키트는 또한, 예를 들면, 형질감염 개선제, 예를 들면, 형질감염 개선 펩타이드, 예를 들면, 플러스 시약(상표명)(인비트로젠 코포레이션, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 포함하는 개별적인 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 개별적인 컨테이너에 세포, 세포 배양 배지, 및 리포터 핵산 서열, 예를 들면, 리포터 유전자를 발현하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 배양 배지는 감소된 혈청 배지 및/또는 단백질 발현 배지일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 키트는 양이온성 지질, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 화학식 I의 지질의 개별적인 부분 또는 이의 혼합물을 임의로 하나 이상의 헬퍼 지질 및/또는 하나 이상의 중성지질, 및 본 발명의 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편 또는 변형된 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편과 조합으로서 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 다중양이온성 중합체 및 본 발명의 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편 또는 변형된 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편의 개별적인 부분 또는 혼합물을 포함한다. 양이온성 지질 형질감염 키트는 임의로 중성 지질뿐만 아니라 다른 형질감염 개선제 또는 다른 첨가제를 포함할 수 있고, 키트 내의 구성분의 상대적인 양은 형질감염 조성물의 제조를 촉진하기 위하여 조절될 수 있다. 키트 구성분은 다른 키트 구성분을 위한 적절한 배지 또는 용매를 포함할 수 있다.
단일양이온성 또는 다중양이온성 지질 조성물, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 화학식 I의 지질을 포함하고, 추가로 중성 지질 및 본 발명의 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 양이온성 지질 형질감염 키트가 바람직하다.
덴드리머 형질감염 키트는 임의로 다른 형질감염 개선제, 예를 들면, DEAE-덱스트란 및/또는 클로로퀸, 뿐만 아니라 다른 첨가제를 포함할 수 있고, 키트 내의 구성분의 상대적인 양은 형질감염 조성물의 제조를 촉진하도록 조절될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 키트는 DOSPA 및 DOPE를 포함하는 다중양이온성 지질 조성물의 개별적인 부분 또는 DOTMA 및 DOPE를 포함하는 단일양이온성 지질 조성물 및 변형된 펩타이드, 임의로 스퍼민- 또는 스퍼미딘-변형된 펩타이드의 일부분을 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 키트는 다중양이온성 중합체의 개별적인 부분 및 스퍼민-변형된 펩타이드의 일부분을 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명의 키트는 펩타이드- 또는 단백질-지질 컨쥬게이트 또는 펩타이드- 또는 단백질-다중양이온성 중합체 컨쥬게이트를 컨쥬게이트되지 않은 지질, 컨쥬게이트되지 않은 다중양이온성 중합체 및 형질감염을 촉진하는 기타 제제와 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 진단학적 방법에서 유용한 것들을 포함할 수 있고, 예를 들면, 진단학적 키트는 형질감염제 및 형질감염 개선제(예를 들면, 단백질, 펩타이드 및 단편, 및 펩타이드 및 단백질의 변형) 이외에 진단학적 핵산을 함유할 수 있다. 진단학적 핵산은 세포에서 또 다른 성분(가장 일반적으로는 분해물질)의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 임의의 핵산에 대한 일반적인 용어이다. 예를 들면, 세포 내로 형질감염되는 경우, 진단학적 핵산은 세포 내의 또 다른 성분(예를 들면, 단백질, 소분자, 스테로이드, 호르몬, 또는 또 다른 핵산)의 존재에 반응하여 그 안의 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 진단학적 핵산은 또한 표적 세포 또는 조직의 검출 또는 표적 세포 또는 조직에서의 성분 검출을 위한 특정한 표적 세포 또는 표적 조직에 대한 일부 표지 또는 그 외 검출가능한 마커를 갖는 핵산을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 형질감염될 수 있는 핵산은 천연 염기 또는 비천연 염기를 포함하는 임의의 공급원으로부터의 임의의 크기의 DNA 및 RNA를 포함하고, 세포에서 치료학적 또는 그 외 유용한 단백질을 인코팅하고 발현할 수 있는 것, 세포에서 핵산의 목적하지 않는 발현을 억제하는 것, 목적하지 않은 효소 활성을 억제하거나 목적하는 효소를 활성화시키는 것, 반응을 촉매하는 것(리보자임), 및 진단학적 검정에서 작용하는 것(예를 들면, 진단학적 핵산)을 포함한다. 치료학적 핵산은 세포에서 치료학적으로 유용한 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하거나 발현할 수 있는 핵산, 세포에서 핵산의 목적하지 않은 발현을 억제하는 것, 및 세포에서 목적하는 효소 활성을 억제하거나 목적하는 효소를 활성화시키는 것을 포함한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법은 또한 본원의 기재내용을 고려하여 그 중에서도, 폴리아민, 폴리아민산, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함하는, 핵산 이외의 생물학적 활성 거대분자를 진핵 세포 내로 도입하는데 용이하게 조정될 수 있다. 예를 들면, 치료학적 제제, 진단학적 물질, 연구 시약으로서 유용한 다른 물질은 펩타이드 및 변형된 펩타이드에 결합될 수 있고 본 발명의 방법에 의해 진핵 세포 내로 도입될 수 있다.
화학식 I의 지질은 상기 기재된 키트의 양이온성 지질(들)로서 사용될 수 있고, 독립적으로 시약 키트 내에 제공될 수 있다. 일반적으로, 키트는 적합한 컨테이너 내에 화학식 I의 지질을 함유한다. 지질은, 예를 들면, 유기 용매 용액, 예를 들면, 에탄올, 버퍼, 또는 용매/버퍼 혼합물 중에 있을 수 있다. 추가로, 키트는 화학식 I의 지질, 및 적합한 용매 또는 버퍼 중에서 세포막과 리포솜 캐리어의 막 융합을 개선시키거나 촉진하는 비천연 발생 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시형태에서, 키트는, 예를 들면, 화학식 I의 지질 또는 기타 양이온성 지질 및 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편 또는 변형된 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편의 개별적인 부분 또는 혼합물을 포함할 수 있다. 화학식 I의 지질 또는 기타 양이온성 지질을 포함하는 키트는 임의로 중성 지질뿐만 아니라 기타 형질감염 개선제 또는 기타 첨가제를 포함할 수 있고, 키트 내의 구성분의 상대적인 양은 형질감염 조성물의 제조를 촉진하기 위하여 조절될 수 있다. 키트 구성분은 기타 카트 구성을 위한 적절한 배지 또는 용매를 포함할 수 있다.
화학식 I의 지질 또는 기타 양이온성 지질, 중성 지질 및 변형된 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 키트가 바람직하다. 본 발명에 의해 제공된 키트는 화학식 I의 지질의 개별적인 부분, DOPE 및 펩타이드의 일부분, 특히 스퍼민-변형된 펩타이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 키트는 화학식 I의 지질의 개별적인 부분, 및 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 스트레치(stretch)를 함유하는 변형된 펩타이드의 일부분을 포함하는 것을 포함한다.
판매 방법
또한 본원에 제공된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 복합체 및/또는 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 확인하는 식별자(identifier)를 고객에게 제시하는 것, 및 식별자를 사용하여 본원에 제공된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 구입하기 위하여 고객에게 구입 기능에 대한 액세스(access)를 제공하는 것을 포함하는, 본원에 제공된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 판매하는 방법이 제공된다. 식별자는 전형적으로 주문 시스템의 부분으로서 고객에게 제시된다. 주문 시스템은 목적하는 제품을 확인하기 위한 입력 기능, 및 확인된 목적하는 제품을 구입하기 위한 구입 기능을 포함할 수 있다. 주문 시스템은 전형적으로 제공자의 직접적 또는 간접적 제어하에 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 고객은 생물학적 연구 제품 및 서비스를 얻는 것을 추구하는 임의의 개인, 기관, 회사, 대학, 또는 단체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같은 제공자는 생물학적 연구 제품 및 서비스를 제공하는 것을 추구하는 임의의 개인, 기관, 회사, 대학, 또는 단체를 나타낸다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 본원에서 제공된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 판매하는 방법을 제공한다: 고객에게 전화 주문 시스템의 입력 기능을 제시하는 것, 및/또는 컴퓨터 시스템의 부분으로서 데이타 입력 필드 또는 선택 가능한 입력 목록을 제시하는 것, 여기서 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물 및/또는 키트는 입력 기능을 사용하여 확인된다. 입력 기능이 컴퓨터 시스템의 부분인 경우, 예를 들면, 인터넷 사이트의 하나 이상의 페이지에 표시되는 경우, 고객에게 전형적으로 온라인 구입 기능, 예를 들면, 온라인 쇼핑 카트가 제시되고, 여기서 고객은 확인된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 구입하는데 구입 기능을 사용한다. 하나의 양상에서, 복수의 식별자가 고객에게 제공되고, 각각은 본원에 제공된 상이한 비천연 발생 펩타이드, 지질, 복합체 및/또는 형질감염 조성물, 및/또는 키트, 또는 본원에 제공된 상이한 용적 또는 중량의 비천연 발생 펩타이드, 지질, 복합체 및/또는 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 확인한다. 방법은 추가로 본원에 제공된 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 구입하는 구입 기능을 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 또한 추가로 구입된 본원에 제공된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 고객에게 발송하는 것을 포함할 수 있다. 비천연 발생 펩타이드, 지질, 형질감염 복합체, 형질감염 조성물, 및/또는 키트는 제공자에 의해 고객에게 발송될 수 있다. 제공자는 전형적으로 입력 기능을 제어하고, 본원에 제공된 비천연 발생 펩타이드, 지질, 복합체 및/또는 형질감염 조성물, 및/또는 키트를 구입하는 입력 기능을 액세스하는 웹 사이트를 제어할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 형질감염제 및 형질감염 개선제는 치료학적 적용을 위하여 다양한 약제학적 조성물 및 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이러한 복합체를 함유하는 주사가능한 제형, 비강내 제형 및 정맥내 및/또는 병소내 투여를 위한 제형이 치료에 사용될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 약제학적 조성물은 핵산이 그 안에서 목적하는 치료학적 효과를 갖도록 표적 세포 또는 표적 조직 내로 핵산의 충분하게 높은 충분한 수준의 도입을 제공하는데 충분한 형질감염제 및 임의의 개선제(펩타이드, 단백질 등)를 함유하여야 한다. 치료학적으로 효과적일 것인 표적 세포 또는 조직 중의 핵산의 수준은 억제 또는 다른 생물학적 작용의 효율 및 핵산이 반드시 영향을 미치는 사이트의 수에 따라 좌우될 것이다.
환자에게 투여되는 본원에 기재된 형질감염 조성물의 투여량은 투여 방법 및 사이트, 환자 연령, 체중 및 상태를 포함하는 다수의 다른 인자에 따라 좌우될 것이다. 당해 분야의 숙련가는 정해진 투여 유형, 정해진 환자 및 정해진 치료학적 적용을 위하여 투여량을 용이하게 조절할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 형질감염 조성물이 세포 내로의 핵산 도입을 억제할 수 있거나, 그렇지 않으면 형질감염 또는 핵산 복합체화를 방해할 수 있는 억제성 구성분, 예를 들면, 혈청 또는 높은 염분 농도를 최소량으로 함유하여야 한다는 것을 인식할 것이다. 또한 특정한 적용에 따른 임의의 약제학적 또는 치료학적 조성물이 환자에게 해로운 부작용을 유발할 수 있는 구성분의 최소량을 함유하여야 하는 것이 인식될 것이다.
본원에 기재된 형질감염 조성물은 약제학적 활성제 및 이를 위한 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 캐리어를 포함하는 조성물 내로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 경구, 비경구(예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 피하), 비강내, 설하 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 흡기에 의한 투여를 위하여, 단위 제형, 예를 들면, 정제, 필, 캡슐(지속형 또는 서방형 제형 포함), 분말, 과립, 엘릭서제, 팅크제, 시럽 및 에멀젼, 무균 주사액 또는 현탁액, 에어로졸 또는 액체 스프레이, 드롭, 앰플, 자동 주사기 장치 또는 좌제일 수 있고, 적절한 방식으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton Pa., 1990, 본원에 참고로 인용됨]에 기재된 바와 같은 허용되는 관례에 따라 제형화될 수 있다.
적합한 캐리어, 부형제 및 희석제의 일부 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 녹말, 아카시아 검, 인산칼슘, 알지네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸- 및 프로필-하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 및 광유를 포함한다. 제형은 추가로 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 보존제, 감미제 또는 향미제를 포함할 수 있다. 캐리어가 희석제의 역할을 하는 경우, 이는 활성 성분을 위하여 비히클, 부형제 또는 배지로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 것이다. 주사의 경우에, 약제학적으로 허용되는 캐리어, 예를 들면, 수성 또는 비수성 용매 중에 본 발명의 하나 이상의 지질의 용액 또는 리포솜을 제조하는 것이 가능하다. 사용될 수 있는 용매의 예는 주사용 증류수, 생리 식염수, 링거액, 식물성유, 합성 지방산 글리세라이드, 고급 지방산 에스터, 프로필렌 글리콜 등이다.
실시예
하기 실시예는 기재내용의 특정 양상을 설명하고 기재내용을 실시하는 분야의 숙련가를 보조하기 위하여 제공된다. 이들 실시예는 기재내용의 범위를 어떠한 방식으로도 제한함을 의도하지 않는다.
실시예 1. 지질 응집체/폴리펩타이드 복합체의 제조 및 배양된 세포의 형질감염
모든 세포를 미국 미생물 보존 센터(ATCC: American Type Culture Collection)에 의하여 각각의 세포주에 대하여 권고되는 표준 배양 조건하에 배양하였다. 형질감염 약 24시간 전에, 세포를 형질감염일에 70 내지 90% 융합하도록 접종하였다. 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이 적은 변이가 존재하지만, 하기 지침이 일반적으로 적용가능하고, 세포주의 동일성, 이의 성장 특성 및 요구, 및 접착 배양에서 이의 형태학에 따라 좌우된다. 일반적으로, 96-웰 플레이트의 경우, 웰당 1-4x104 세포를 접종하고, 24-웰 플레이트의 경우, 웰당 0.5-2x105 세포를 접종하고, 6-웰 플레이트의 경우, 0.25-1x106 세포를 접종하였다.
배양 중의 세포 내로 DNA를 형질감염시키기 위한 형질감염 복합체를 제작사 프로토콜에 따라 제조하였다. 리포펙타민(등록상표) 2000 및 리피펙타민(LIPIFECTAMINE)(등록상표) LTX는 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)으로부터 구입하고, 퓨진(등록상표) HD는 프로메가 코포레이션(Fitchburg, WI)으로부터 구입하고, X-트림진(상표명) HP는 로슈 다이아그노스틱스(Roche diagnostics)(스위스 바젤시에 소재)로부터 구입하였다.
상기 기재된 비천연 발생 펩타이드를 함유하는 형질감염 복합체를 제조하기 위하여, 하기 서열 SRRARRSPRESGKKRKRKRGGGSGGGSGGGSRRRRRRRRRRR(서열 번호 89)을 갖는 펩타이드 1을 합성하고, 건조 분말로서 제공하였다. 건조 분말을 무균 초순수 중에서 4.35 ㎎/㎖의 최종 농도로 재구성하고, 완전히 용해되도록 하였다. 당해 스톡 펩타이드 용액을 다음 단계에서 사용하기 위하여 따로 챙겨두었다.
지질 응집체-DNA-펩타이드 복합체를 제조하기 위하여, 리포펙타민(등록상표) 3000 시약(라이프 테크놀로지스 코포레이션, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)을 입수하였다. 5㎕, 25㎕, 및 125㎕로 형질감염되는 세포의 96-, 24- 또는 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 있어서, 깁코(Gibco)(등록상표) Opti-MEM(등록상표) 배지의 분취량을 분리된 1회용 플라스틱 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 넣었다. 96-웰 플레이트의 경우, 0.1㎕ 내지 0.6㎕, 24-웰 플레이트의 경우, 0.5㎕ 내지 3.0㎕, 또는 6-웰 플레이트의 경우, 2.0㎕ 내지 15㎕의 리포펙타민(등록상표) 3000 시약을 분취된 Opti-MEM(등록상표)에 가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 배양하였다.
분리된 에펜도르프 튜브에서, 형질감염되는 배양된 세포의 각각의 웰에 대하여 깁코(등록상표) Opti-MEM(등록상표) 배지 5㎕(96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여), 25㎕(24-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여), 또는 125㎕(6-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여)를 튜브 내로 분취하고, 그 안에서 이를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 pcDNAEF1a/emGFP 또는 GST-STAT 발현 벡터 DNA 0.1㎍. 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 pcDNAEF1a/emGFP 또는 GST-STAT 발현 벡터 DNA 0.5㎍, 및 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 pcDNAEF1a/emGFP 또는 GST-STAT 발현 벡터 DNA 2.5㎍과 혼합하였다.
희석된 DNA 혼합물에 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 스톡 펩타이드 0.2㎕, 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 스톡 펩타이드 1㎕, 및 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 스톡 펩타이드 5㎕를 가하고, 펩타이드/DNA 혼합물을 잘 혼합하고 약 1분 동안 실온에서 배양하였다.
96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여, 희석된 DNA/펩타이드 혼합물 5㎕를 희석된 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 5㎕와 혼합하고, 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여, 희석된 DNA/펩타이드 혼합물 25㎕를 희석된 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 25㎕와 혼합하고, 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여, 희석된 DNA/펩타이드 혼합물 125㎕를 희석된 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 125㎕와 혼합하고, 수득된 혼합물을 약 5분 동안 실온에서 배양함으로써 지질-펩타이드-DNA 복합체를 형성하였다.
배양 후, 지질-펩타이드-DNA 복합체를 전날 신선한 성장 배지에 접종된 세포에 가하고; 96-웰 플레이트의 경우, 지질-펩타이드-DNA 10㎕를 세포에 가하고, 24-웰 플레이트의 경우, 지질-펩타이드-DNA 혼합물 50㎕를 세포에 가하고, 6-웰 플레이트의 경우, 지질-펩타이드-DNA 250㎕를 세포에 가하였다. 세포를 지질-펩타이드-DNA의 존재 하에 약 24-48시간 동안 배양하고, 분석하였다.
실시예 2. 다양한 세포주의 형질감염.
10종의 형질감염이 어려운 암 세포주(HepG2, Hepa1-6, Hep3B, HUH7, MCF-7, MDA-MB-23, SKBR3, LNCaP, Bend3, 및 T986)의 패널, 2종의 형질감염이 어려운 신경 세포주(PC12 및 Neuro2A), 2종의 형질감염이 어려운 근원세포 세포주(H9C2 및 C2C12) 및 1종의 형질감염이 어려운 신장 섬유아세포 세포주(Vero)를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 GFP를 인코딩하는 발현 벡터인 pcDNAEF1a/emGFP로 형질감염시켰다. 형질감염 복합체의 존재 하에 24시간 후, 적절한 파장에서 형광 현미경법을 사용하여 세포를 시각화하였다.
GFP 발현을 암 세포주의 경우 도 1A에 도시하고, 신경 세포의 경우 도 1B에 도시하고, 근원세포 세포의 경우 도 1C에 도시하고, 신장 섬유아세포 세포의 경우 도 1D에 도시한다.
실시예 3. 다양한 형질감염 시약의 비교.
6종의 상이한 세포주(HEK293, HeLa, COS-7, LNCaP, A549 및 HepG2)의 패널을 퓨진(등록상표) HD, 리포펙타민(등록상표) 2000, 또는 실시예 1에 기재된 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 pcDNAEF1a/emGFP로 형질감염시켰다. 48시간 동안 세포가 형질감염되도록 두었다. 도 2에 도시된 결과는 퓨진(등록상표) HD 및 LIPOFECTAMINR(등록상표) 2000은 둘 다 각각의 세포의 작은 부분을 형질감염시킬 수 있었지만(도 2, 첫번째 2개의 열), 형질감염 복합체 중의 펩타이드 1의 존재가 형질감염 효율을 실질적으로 개선시켰음(도 2, 마지막 열)을 보여준다.
당해 연구를 확장시키기 위하여, 61종의 상이한 세포주의 패널을 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시예 1에 기재된 바와 같은 펩타이드 1과 조합으로서의 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 상기와 같이 형질감염시켰다. 형질감염 약 48시간 후, 형질감염된 세포를 형광 현미경법으로 시험하여 상대적인 형질감염 효율을 측정하고, 세포 추출물을 제조하고, FL600 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 분석하여, 리포펙타민(등록상표) 2000에 대하여 펩타이드 1을 갖는 리포펙타민(등록상표) 3000의 GFP 발현의 배수 개선을 측정하였다. 결과를 표 6에 나타낸다. 보다시피, 다양한 세포주에서 시험한 경우, 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 시약의 사용은 리포펙타민(등록상표) 2000 시약보다 높은 형질감염 효율 및 단백질 발현을 야기한다.
표 6. 리포펙타민(등록상표) 2000 형질감염과 비교하여 상대적인 형질감염 효율 및 형질감염 효율의 배수 개선에 의하여 측정된, 시험관내 다양한 세포주에서 리포펙타민(등록상표) 3000 및 펩타이드 1 지질 응집체 제형의 성능.
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예 4. 형질감염 효율 및 단백질 발현에 대한 형질감염 시약 투여의 효과
HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 놓고, 리포펙타민(등록상표) 2000, 리포펙타민(등록상표) LTX, 또는 실시예 1에 기재된 바와 같은 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 0.1㎕, 0.2㎕, 0.3㎕ 또는 0.4㎕를 사용하여 pcDNAEF1a/emGFP로 형질감염시켰다. 형질감염 효율 및 상대적인 발광에 의해 측정된 상대적인 단백질 발현을 각각의 조건에 대하여 시험하였다. 그 결과는 도 3에 도시되어 있다.
도 3A는 3종의 상이한 상업적으로 입수가능한 지질 응집체 제형, 리포펙타민(등록상표) 2000(흰 원형), 리포펙타민(등록상표) LTX(흰 사각형), 및 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(흰 삼각형)의 증가하는 투여량을 사용하여, 배양된 HeLa 세포 내로 형질감염된 GFP를 인코딩하는 발현 벡터에 대하여 상대적인 형질감염 효율을 비교하는 그래프이다. 형질감염 복합체 중의 펩타이드 1의 존재는 시험된 형질감염 시약 투여량의 전체 범위에서 세포의 형질감염 효율을 개선시킨다. 형질감염 효율에 대한 개선은 시험된 가장 낮은 투여량에서 특히 확연하다.
도 3B는 3종의 상이한 상업적으로 입수가능한 지질 응집체 제형, 리포펙타민(등록상표) 2000(흰 원형), 리포펙타민(등록상표) LTX(흰 사각형), 및 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(흰 삼각형)의 증가하는 투여량을 사용하여, GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 HeLa에서 GFP 발현의 강도를 비교하는 그래프이다. 형질감염 복합체 중의 펩타이드 1의 존재는 시험된 형질감염 시약 투여량의 전체 범위에서 세포에서 GFP의 상대적인 형질감염을 개선시킨다. 단백질 발현에서 개선은 시험된 가장 낮은 투여량에서 특히 확연하다.
실시예 5. 3종의 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약과 비교된 단백질 발현에서의 개선.
리포펙타민(등록상표) 2000, 퓨진(등록상표) HD, X-트림진(상표명) HP 또는 실시예 1에 기재된 바와 같은 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GST-STAT 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터로 HepG2 세포를 24-웰 플레이트에서 형질감염시켰다. 형질감염 약 24시간 후, 노벡스(NOVEX)(등록상표) 세포 추출 버퍼(라이프 테크놀로지스사, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)를 사용하여 세포 용해물을 제조하고, 용해물을 SDS-PAGE 전기영동으로 분해하고, PVDF 막으로 수송하고, 항-GST HRP-표지된 다클론 항체로 면역블롯팅하고, 피어스(Pierce)(상표명) ECL 웨스턴 블롯팅 기판(피어스 바이오테크놀로지사(Pierce Biotechnology), 일리노이주의 록퍼드시에 소재)으로 검출하였다.
도 4는 하기 상업적으로 입수가능한 지질 응집체 제형을 사용하여, GST-STAT 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 HepG2 세포에서 GST-STAT 융합 단백질의 발현량(상부 패널)을 비교하는 웨스턴 블롯이다: 리포펙타민(등록상표) 2000(제1 레인), 하나의 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(제2 레인), 퓨진(등록상표) HD(제3 레인), 및 X-트림진(상표명) HP(마지막 레인). 하부 패널은 각각의 레인에서 사이토졸 추출물의 동일한 로딩이 확인된 내인성 β-액틴의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 6. H9 인간 배아 줄기 세포주의 형질감염.
H9 인간 배아 줄기 세포주를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에서 37500 세포/웰의 밀도로 접종하고, 웰당 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시예 1에 기재된 바와 같은 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 0.1㎕ 내지 0.6㎕를 사용하여 pcDNAEF1a/emGFP 50㎍, 100㎍ 또는 200㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 형질감염 효율을 측정하였다.
도 5A는 리포펙타민(등록상표) 2000(흰 삼각형) 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 웰당 0.1 내지 0.6㎕를 사용하여, GFP 발현 벡터의 증가하는 용량(좌측 패널 50㎍; 중앙 패널 100㎍, 및 우측 패널 200㎍)으로 형질감염된 H9 인간 배아 줄기 세포주(96 웰 플레이트의 웰당 37,500 세포)의 상대적인 형질감염 효율을 비교하는 그래프이다.
도 5B는 리포펙타민(등록상표) 2000(좌측 패널, H9 세포의 18% 형질감염 효율을 입증함) 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(우측 패널, H9 세포의 52% 형질감염 효율을 입증함) 200㎕를 사용하여, 100 ㎍/웰로 형질감염된 96 웰 플레이트에서 배양된 H9 세포에서 GFP 발현의 대표적인 형광 이미지이다.
실시예 7. CRISPR 뉴클레아제 벡터 시스템을 사용하는 세포의 게놈 변형.
플라스미드 디자인 및 제조: 라이프 테크놀로지스 진아트(GENEART)(등록상표) 웹 디자인 툴(lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-precision-tals.html)을 사용하여 진아트(등록상표) 프리시젼 TAL 및 진아트(등록상표) CRISPR 뉴클레아제 벡터를 디자인하였다. 정방향 및 역방향 TALEN은 FokI 뉴클레아제를 함유하고, AAVS1 세이프 하버 유전자좌를 표적으로 한다. 일체형 CRISPR 벡터 시스템은 다운스트림 등색 형광 단백질(OFP) 리포터와 조합된, AAVS1 세이프 하버(safe harbor) 유전자좌를 표적으로 하는 Cas9 뉴클레아제 발현 카세트 및 가이드 RNA 클로닝 카세트를 함유한다. 음성 대조군 플라스미드, PCDNA(상표명) 3.3을 또한 검정 전체에서 사용하였다. 플라스미드를 컴피턴트(competent) 이콜라이(E. coli) 세포 내로 형질전환시켰다. 클론을 분석하고, 특이성에 대하여 서열분석한 다음, 퓨어링크(PURELINK)(등록상표) 하이퓨어 플라스미드 필터 맥시프렙 키트(HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit)를 사용하여 정제하여 낮은 내독소 활성 및 고품질 DNA를 보장하였다.
글루타맥스(GLUTAMAX)(상표명) 보충물 및 10% 소태아 혈청을 갖는 깁코(등록상표) DMEM, 고-글루코스를 사용하여 융해 후 4-5 통로 동안 U2OS 및 HepG2 세포를 배양하고; 세포를 트라이플(TRYPLE)(상표명) 익스프레스(Express) 해리 효소를 사용하여 해리시키고, 완전 배지 1 mL에서 웰당 2 x 105 세포로 12-웰 플레이트에 접종하여 형질감염 일에 70 내지 90% 융합을 보장하였다.
펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 및 리포펙타민(등록상표) 2000 시약에 의한 형질감염을 각각의 세포 유형에서 비교하였다. 리포펙타민(등록상표) 3000 시약의 형질감염을 위하여, 분리된 튜브에서, 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 1.5㎕ 및 플라스미드 DNA 1㎍을 Opti-MEM(등록상표) 감소된 혈청 배지 50㎕ 중에 각각 희석시킨 다음; 펩타이드 1(실시예 1 참조) 2㎕를 희석된 DNA에 가하였다. 펩타이드 1을 갖는 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민(등록상표) 3000 시약에 가하고, 실온에서 5분 동안 배양하였다. 그 다음, 수득된 복합체 100㎕를 완전 배지 중의 세포에 가하였다. 형질감염 시약의 양을 3㎕로 증가시키고, 희석된 리포펙타민(등록상표) 2000 시약에 이를 가하기 전에 펩타이드 1을 희석된 DNA에 가하지 않는다는 것을 제외하고 리포펙타민(등록상표) 2000 시약에 대한 과정은 동일하다. 모든 다운스트림 분석을 형질감염후 72시간에 수행하였다.
CRISPR 벡터로부터의 OFP 발현을 유세포분석 및 현미경법에 의해 측정하였다. 이보스(EVOS)(등록상표) FL 영상 시스템을 사용하여 RFP 필터로 이미지를 수득하였다. 그 다음, 세포를 형질감염후 72시간에 트라이플(상표명) 익스프레스 효소로 해리시키고, FL-2 필터 및 블루 레이저가 있는 BD 아큐리(ACCURI)(상표명) C6 유세포분석기를 사용하여 분석하였다.
도 6은 U2OS 세포(도 6A) 및 HepG2 세포(도 6B)에서 CRISPR 벡터를 사용하는 형질감염 효율 및 단백질 발현을 도시한다. 벡터는 OFP 리포터 유전자를 함유하였고, 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 시약으로 형질감염되었다. 막대 그래프는 상대적인 OFP 유전자 발현(형광 강도에 의해 측정됨)을 나타내고, 막대 그래프 아래의 형광 이미지는 상응하는 OFP 발현 세포의 정량된 형광 강도를 나타낸다.
게놈 절단 검출: 진아트(등록상표) 게놈 절단 검출 키트는 유전자좌-특이적 절단의 검출을 위한 신뢰성 있고 신속한 방법을 제공한다. 형질감염된 세포를 트라이플(상표명) 익스프레스로 해리시키고, 둘베코 인산염 식염 버퍼로 세척하고, 원심분리로 펠렛화시켰다. 세포를 진아트(등록상표) 게놈 절단 검출 키트로부터의 세포 용해 버퍼 및 단백질 분해자 믹스로 용해시켰다. DNA를 추출한 다음, 정방향 및 역방향 프라이머로 PCR-증폭시켰다. 그 다음, 변성 및 재어닐링(re-annealing) 반응을 수행하여 돌이변이된 PCR 단편 및 돌연변이되지 않은 PCR 단편을 무작위로 어닐링하였다. 검출 효소(1㎕)를 가하고, 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 전체 혼합물을 E-Gel(등록상표) EX 2% 아가로스 겔에서 전기영동시켜 게놈 변형 백분율을 측정하였다. 하기 화학식을 사용하여 절단 효율을 측정하는데 알파뷰(ALPHAVIEW)(상표명) 소프트웨어를 사용하였다: 절단 효율 = 1 - [(1 - 절단된 분획)1/2].
도 7A는 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시형태에 따른 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하는, U2OS 세포에서 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 TALEN 및 CRISPR에 대한 절단 효율을 나타낸다.
도 7B는 리포펙타민(등록상표) 2000 또는 실시형태에 따른 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하는, HepG2 세포에서 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 TALEN 및 CRISPR에 대한 절단 효율을 나타낸다.
결론: 인간 뼈 골육종으로부터 유래된 U2OS 세포, 및 인간 간세포 암종으로부터 유래된 HepG2 세포를 리포펙타민(등록상표) 3000 및 펩타이드 1로 형질감염시켰다. 두 세포주는 모두 리포펙타민(등록상표) 2000 매개된 형질감염에 비하여 개선된 형질감염 효율 및 단백질 발현을 나타냈다. OFP 리포터 유전자를 함유하는 CRISPR 구조물을 사용하여 형질감염 효율 및 단백질 발현을 평가하였다. 리포펙타민(등록상표) 3000 및 펩타이드 1로 형질감염된 U2OS 세포는 2배 개선된 형질감염 효율(데이타 도시되지 않음) 및 4배 개선된 형광 강도(도 6A)를 가졌다. HepG2 세포는 형질감염 효율에서 20배 개선(데이타 도시되지 않음) 및 80배 높은 형광 강도(도 6B)를 나타냈다. 유의미하게, 증가된 TALEN 및 CRISPR 매개된 절단은 리포펙타민(등록상표) 3000 및 펩타이드 1로 형질감염된 두 세포주 모두에서 AAVS1 표적 유전자좌에 대하여 나타났고, 이는 형질감염 효율 및, 함축적으로, 단백질 발현의 증가가 TALEN 및 CRISPR의 절단율을 증가시킬 것임을 입증한다. 리포펙타민(등록상표) 3000 및 펩타이드 1로 형질감염딘 U2OS 세포는 1.5배 개선된 TALEN 절단 효율 및 약간 개선된 CRISPR 절단을 나타냈다(도 7A). HepG2 세포는 TALEN에 대하여 3배 높고 CRISPR에 대하여 8배 높은 절단 효율을 가졌다(도 7B).
실시예 8. 지질 형질감염 시약 및 펩타이드는 형질감염을 개선시키기 위해 필요하다.
HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, 리포펙타민(등록상표) 3000 시약 단독(LF3K), 리포펙타민(등록상표) 2000(LF2K), 펩타이드 1 단독(펩타이드 1), 또는 실시예 1에 기재된 바와 같은 펩타이드 1과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(LF3K + 펩타이드 1) 0.05㎕, 0.1㎕, 0.2㎕, 0.3㎕, 0.4㎕ 또는 0.5㎕를 사용하여 pcDNAEF1a/emGFP 0.2 ㎍/웰로 48시간 동안 형질감염시켰다. 형광 강도(FL1-H)에 의해 측정되는 형질감염 효율 및 단백질 발현을 측정하였다. 결과를 도 8에 도시한다.
도 8은 리포펙타민(등록상표) 3000 단독(LF3K), 리포펙타민(등록상표) 2000(LF2K), 실시형태에 따른 펩타이드(p4) 또는 실시형태에 따른 펩타이드와 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000(LF3K+ 펩타이드)의 지시된 용량(㎕)을 사용하여 GFP 발현 벡터로 형질감염된 HeLa 세포의 상대적인 형질감염 효율(상부 그래프, 단세포 단독의 %로서 GFP+) 또는 세포당 상대적인 발현량(하부 그래프; 단세포 단독 평균 FL1-H)을 도시하는 2개의 막대 그래프를 나타낸다. 양이온성 지질 응집체 제형(예를 들면, 리포펙타민(등록상표) 3000)의 존재 하에 펩타이드 1의 존재는 형질감염 효율 및 단백질 발현을 상당히 개선시킨다.
실시예 9. 전체 길이 펩타이드는 최적의 형질감염에 필요하다
도 9a, 도 10a 및 도 11a에 도식적으로 기재된 하기 펩타이드를 합성하고, 펩타이드 1에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 초순수에 용해시켰다. 펩타이드 서열 SRRARRSPRESGKKRKRKR(서열 번호 1)을 갖는 펩타이드 A(본 발명의 비천연 발생 펩타이드의 MPP 영역에 상응함); 펩타이드 서열 GGGSGGGSGGGS(서열 번호 69)를 갖는 펩타이드 B(본 발명의 비천연 발생 펩타이드의 링커 영역에 상응함); CP1 RRRRRRRRRRR의 펩타이드 서열(서열 번호 82)을 갖는 펩타이드 C(본 발명의 비천연 발생 펩타이드의 양이온성 영역에 상응함); 펩타이드 서열 GGGSGGGSGGGSRRRRRRRRRRR(서열 번호 108)을 갖는 펩타이드 D(본 발명의 비천연 발생 펩타이드의 양이온성 영역에 융합된 링커 영역에 상응함); 및 펩타이드 1에 상응하고 서열 SRRARRSPRESGKKRKRKRGGGSGGGSGGGSRRRRRRRRRRR(서열 번호 89)을 갖는 펩타이드 E.
HepG2, A549 및 MDA-MB-231 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고, 지질 형질감염 시약없이 펩타이드 A, 펩타이드 B, 펩타이드 C, 펩타이드 D, 펩타이드 A 및 B 함께, 펩타이드 A 및 C 함께, 펩타이드 A 및 D 함께, 펩타이드 B 및 C 함께 또는 펩타이드 E 또는 펩타이드 A, 펩타이드 B, 펩타이드 C, 펩타이드 D, 펩타이드 A 및 B 함께, 펩타이드 A 및 C 함께, 펩타이드 A 및 D 함께, 펩타이드 B 및 C 함께 또는 펩타이드 E 단독과 조합으로서 리포펙타민(등록상표) 3000 시약을 사용하여 pcDNAEF1a/emGFP 1㎍으로 48시간 동안 형질감염시켰다. 형광 현미경법을 사용하여 세포를 시각화하고, GFP+ 세포의 백분율에 의해 측정되는 형질감염 효율 및 세포당 평균 형광에 의해 측정되는 단백질 발현을 상기와 같이 측정하였다. 결과를 도 9b, 도 9c, 도 10b, 도 10c, 도 11b 및 도 11c에 요약한다.
도 9b는 지시된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합(도 9a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 배양된 HepG2 세포에서 GFP 발현을 검출하는 일련의 형광 이미지를 도시한다.
도 9c는 지시된 펩타이드 A 내지 E 중 하나 또는 지시된 펩타이드의 조합(도 9a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 HepG2 세포에서 세포당 평균 형광(상부 그래프) 및 형질감염 효율(%GFP + 세포)을 나타내는 2개의 막대 그래프를 도시한다.
도 10a는 A549 세포에서 도 10b 및 도 10c에 도시된 실험에서 사용된 다양한 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 펩타이드 맵을 도시한 것이고, 여기서 펩타이드 A는 MPP 펩타이드 단독이고, 펩타이드 B는 링커 펩타이드 단독이고, 펩타이드 C는 양이온성 펩타이드 단독이고, 펩타이드 D는 양이온성 펩타이드에 융합된 링커 펩타이드이고, 펩타이드 E는 펩타이드 D에 융합된 펩타이드 A를 갖는 전체 길이의 펩타이드이다.
도 10b는 지시된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합(도 10a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 배양된 A549 세포에서 GFP 발현을 검출하는 일련의 형광 이미지를 도시한다.
도 10c는 지시된 펩타이드 A 내지 E 중 하나 또는 지시된 펩타이드의 조합(도 10a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 A549 세포에서 세포당 평균 형광(상부 그래프) 및 형질감염 효율(%GFP + 세포)을 나타내는 2개의 막대 그래프를 도시하고;
도 11a는 MDA-MB-231 세포에서 도 11b 및 도 11c에 도시된 실험에서 사용된 다양한 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 펩타이드 맵을 도시한 것이고, 여기서 펩타이드 A는 MPP 펩타이드 단독이고, 펩타이드 B는 링커 펩타이드 단독이고, 펩타이드 C는 양이온성 펩타이드 단독이고, 펩타이드 D는 양이온성 펩타이드에 융합된 링커 펩타이드이고, 펩타이드 E는 펩타이드 D에 융합된 펩타이드 A를 갖는 전체 길이의 펩타이드이다.
도 11b는 지시된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합(도 11a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 배양된 MDA-MB-231 세포에서 GFP 발현을 검출하는 일련의 형광 이미지를 도시한다.
도 11c는 지시된 펩타이드 A 내지 E 중 하나 또는 지시된 펩타이드의 조합(도 11a에 도시됨)의 존재 하에 리포펙타민(등록상표) 3000을 사용하여 GFP를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 MDA-MB-231 세포에서 세포당 평균 형광(상부 그래프) 및 형질감염 효율(%GFP + 세포)을 나타내는 2개의 막대 그래프를 도시한다.
본원에 기재된 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 조정이 명백하고, 본 발명 또는 이의 임의의 실시형태의 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것이 관련 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 지금 본 발명을 상세하게 설명한 바와 같이, 동일한 것이 하기 실시예를 참조로 하여 더 분명하게 이해될 것이고, 이는 오직 예시의 목적으로 본원에 포함되고 본 발명의 제한을 의도하지 않는다.
당해 명세서에서 언급된 모든 문헌, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별적인 문헌, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 인용되는 것으로 특정하게 개별적으로 지시되는 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함하여 본원 명세서가 지배할 것이다. 당해 출원에서 임의의 참조의 인용 또는 확인은 이러한 참조가 본 발명의 선행 기술로서 이용 가능하다는 인정으로서 해석되어서는 안 된다.
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Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: bLF exemplary membrane penetrating peptide" <400> 47 Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 48 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: bLF2 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 48 Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser 1 5 10 15 Ile Thr Cys Val Arg Arg 20 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: bLF3 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 49 Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile 1 5 10 15 Thr Cys <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: LF1 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 50 Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser 1 5 10 15 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: LF2 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 51 Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg 1 5 10 <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: SynB1 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 52 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Penetratin PTD exemplary membrane penetrating peptide" <400> 53 Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: PTD-4 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 54 Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: PTD-5 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 55 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: FHV Coat-(35-49) exemplary membrane penetrating peptide" <400> 56 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: BMV Gag-(7-25) exemplary membrane penetrating peptide" <400> 57 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: HTLV-II Rex-(4-16) exemplary membrane penetrating peptide" <400> 58 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: D-Tat exemplary membrane penetrating peptide" <400> 59 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: R9-Tat exemplary membrane penetrating peptide" <400> 60 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 61 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Transportan exemplary membrane penetrating peptide" <400> 61 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: MAP exemplary membrane penetrating peptide" <400> 62 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 63 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: SBP exemplary membrane penetrating peptide" <400> 63 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 64 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: FBP exemplary membrane penetrating peptide" <400> 64 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 65 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: MPG exemplary membrane penetrating peptide" <400> 65 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 66 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: MPG(deltaNLS) exemplary membrane penetrating peptide" <400> 66 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 67 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pep-1 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 67 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 68 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pep-2 exemplary membrane penetrating peptide" <400> 68 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 69 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 70 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 71 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 72 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 73 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala 1 5 10 15 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser 1 5 10 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Ala Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser 1 5 10 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 81 Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 82 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 83 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 84 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 84 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 85 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 10 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 86 Arg Arg Arg Arg His Arg Arg Arg Arg His Arg Arg Arg Arg His 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 87 Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg Arg Lys 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 88 Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 <210> 89 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 89 Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Lys Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 90 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 90 Cys Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 <210> 91 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 91 Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gly Arg Arg Arg Thr His Arg Leu 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 92 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 92 Ile Gly Cys Arg His Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 93 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 93 Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Gly Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 94 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 94 Cys Ala Gly Arg Arg Ser Ala Tyr Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 95 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 95 Gly Ser Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys His Cys Gln Lys Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 96 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 96 Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 97 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 97 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg Gly Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 98 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 98 Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys Arg Ser Arg His His Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 99 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 99 Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro 1 5 10 15 Val Ser Cys Ile Lys Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 <210> 100 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 100 Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 101 <400> 101 000 <210> 102 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 102 Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Val Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro 1 5 10 15 Val Ser Cys Ile Lys Arg Ala Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Ala Ala 20 25 30 Gly Ser Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Lys 35 40 45 Arg <210> 103 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 103 Gly Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys Arg Ser Arg His His 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 104 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 104 Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Lys <210> 105 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 105 Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser 1 5 10 15 Ile Thr Cys Val Arg Arg 20 <210> 106 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 106 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 107 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 107 Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Arg Arg Arg Lys Lys 20 25 30 Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys 35 <210> 108 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 108 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 109 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> /note="This sequence may encompass 5 to 20 'Arg' residues, wherein some positions may be absent" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(20) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 109 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg 20

Claims (32)

  1. 하기 구조를 갖는 펩타이드:
    Figure pct00026
    , 또는
    Figure pct00027

    상기 구조 중,
    A는 막 투과 펩타이드이고;
    L은 결합 또는 링커 펩타이드이며; 그리고
    B는 양이온성 모이어티(moiety) 또는 양이온성 폴리펩타이드이다.
  2. 제1항에 있어서, A가 표 1로부터 선택된 펩타이드 서열을 포함하는, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, A가 5 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이고, A가 세포 내로의 분자 전달을 적어도 10% 개선시키는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, A가 5 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이고, A가 세포 내로의 분자 전달을 약 50% 내지 약 100% 개선시키는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, A가 5 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이고, A가 세포 내로의 분자 전달을 약 75% 내지 약 500% 개선시키는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, A가 서열 번호 1 내지 68 중 어느 하나와 적어도 50% 유사하고, A가 세포 내로의 분자 전달을 적어도 20% 개선시키는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, A가 서열 번호 1 내지 68 중 어느 하나와 적어도 75% 유사하고, A가 세포 내로의 분자 전달을 적어도 50% 개선시키는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, A가 서열 번호 1 내지 68 중 어느 하나와 적어도 90% 유사하고, A가 세포 내로의 분자 전달을 적어도 100% 개선시키는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  9. 제1항에 있어서, A가 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 67 및 서열 번호 68 중 어느 하나와 적어도 90% 유사한 펩타이드.
  10. 제1항에 있어서, L이 3 내지 50개의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열에서 상기 아미노산의 적어도 50%가 중성인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  11. 제1항에 있어서, L이 3 내지 50개의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열에서 상기 아미노산의 적어도 60%가 중성인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  12. 제1항에 있어서, L이 3 내지 50개의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열에서 상기 아미노산의 적어도 75%가 중성인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  13. 제1항에 있어서, L이 3 내지 50개의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열에서 상기 아미노산의 적어도 30%가 중성 및 극성인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  14. 제1항에 있어서, L이 6 내지 60개의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열에서 상기 아미노산의 적어도 30%가 중성 및 극성인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  15. 제1항에 있어서, L이 10 내지 25개의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열에서 상기 아미노산의 적어도 30%가 중성 및 극성인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  16. 제1항에 있어서, L이 하기 구조를 갖는 펩타이드:
    Figure pct00028
    또는
    Figure pct00029

    상기 구조 중,
    각각의 X는 독립적으로 중성 아미노산이고,
    각각의 Y는 독립적으로 중성 극성 아미노산이며,
    m은 3 내지 50의 정수이고,
    n은 1 내지 40의 정수이며, 그리고
    L이 결합이 아닌 경우, p는 1 내지 20의 정수이다.
  17. 제16항에 있어서, m > n인, 펩타이드.
  18. 제16항에 있어서, 각각의 X가 독립적으로 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신인, 펩타이드.
  19. 제16항에 있어서, X가 Gly이고, Y가 Ser인, 펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, m이 3이고, n이 1이며, 그리고 p가 3인, 펩타이드.
  21. 제1항에 있어서, B가 생리학적 pH에서 알짜(net) 양전하를 갖는 아미노산 서열인, 펩타이드.
  22. 제1항에 있어서, B가 5 내지 20개의 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 펩타이드 서열인, 펩타이드.
  23. 제1항에 있어서, B가 5 내지 20개의 Arg 잔기를 포함하는 양으로 하전된 아미노산 서열인, 펩타이드.
  24. 제1항에 있어서, B가 Arg5 내지 Arg20인, 펩타이드.
  25. 표 4의 펩타이드와 적어도 75% 유사하고, 세포 내로의 분자 전달을 약 50% 내지 약 100% 개선시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드 서열을 포함하는, 펩타이드.
  26. 제1항의 펩타이드를 포함하는 형질감염 복합체(transfection complex).
  27. 제26항에 있어서, 양이온성 지질을 추가로 포함하는 형질감염 복합체.
  28. 제27항에 있어서, 중성 지질을 추가로 포함하는 형질감염 복합체.
  29. 서열 번호 89 내지 서열 번호 107로 이루어진 상기 목록으로부터 선택된 펩타이드 서열과 적어도 75% 유사한 펩타이드, 적어도 하나의 양이온성 지질, 및 적어도 하나의 헬퍼(helper) 지질을 포함하는 형질감염 복합체.
  30. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 카고 분자(cargo molecule)를 추가로 포함하는 형질감염 복합체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 카고 분자가 핵산인 형질감염 복합체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 카고 분자가 DNA 또는 RNA 분자인 형질감염 복합체.
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