JP4846588B2 - 核酸のトランスフェクションのための新規脂質 - Google Patents
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Description
本発明のさらなる目的は、核酸などの高分子を細胞へ送達するためにこれらの組成物を使用する方法を提供することである。
YおよびZは、アルコキシ、アルカノイルオキシ、アルキルアミン、アルキルウレタンおよびアルキルグアニジンからなる群から独立に選択され、
R1およびR2は、水素、C1−C6アルキル、アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、スペルミイル、スペルミジルおよびカルボキシスペルミイルからなる群から独立に選択され、
R3は、HまたはC1−C4アルキルであり、
R4、R5、およびR6は、水素、アルキル、アルケニル、アリールおよびアルキルアリールからなる群から独立に選択され(ただし、R4、R5およびR6のうち少なくとも1つは長鎖アルキルまたはアルケニルである)、
Wは、短鎖アルキルまたはアルキルアミノであり、かつ、
R7は、負電荷または短鎖アルキルである]。
Y1は、(CH2)n、ポリエーテル、−CO−、NHCOおよびポリアミドからなる群から選択され、
Y2は、(CH2)n、−NH−、−O−、ポリエーテル、エステル結合、−S−、CONH、NHCO、ポリアミド−NHCONH−、およびNHC(=NH)NHからなる群から選択され、
Z1およびZ2は、水素、第一級アルキルアミン、第二級アルキルアミン、第三級アルキルアミン、第四級アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、アルキルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウムアミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質〜からなる群から独立に選択され、
R8、R9、R10、およびR11は独立に、存在しないか、または水素、直鎖C1−C20アルキル、分枝アルキル、シクロアルキル(cyclalkyl)、直鎖アルケニル、分枝アルケニル、シクロアルケニル、および所望により置換されていてもよいアリールからなる群から選択され、この任意の置換は、存在する場合、−OH、NH2、−COOH、エステル、アミド、アルキルアミノ、−NHCONH−、およびNHC(=NH)NHからなる群から選択される少なくとも1つの官能基を含んでなり、
n=1〜12である]。
陽イオン糖脂質(II)の合成は、スキーム1に示されている方法によって行うことができる。2,無水酒石酸3−イソプロピリジンは、オレオイルアミンなどのアルキルアミンで処理して無水物を開環し、対応するアミドとカルボン酸を生成する。このアミドを酸性メタノールで処理すると、イソプロピリジン基が除去され、酸のエステル化が起こる。このエステルをメチルアミンなどのアルキルアミンで処理して対応するジアミドを得る。このジアミドを水素化リチウムアルミニウムなどの還元剤でジアミンへと還元し、ブロモプロピルフタルイミドなどのアルキル化剤でアルキル化する。このフタルイミド基をヒドラジンで除去し、このアミン基をHClでプロトン化して目的のカチオン性脂質を得る。このスキームは、一般構造1−[(3−アミノプロピル)−アルキル1アミノ]−4−[(3−アミノプロピル)−アルキル2アミノ]−ブタン−2,3−ジオール(アルキル化剤としてブロモプロピルフタルアミドを用いる場合)または1−[(3−アミノ−2−ヒドロキシプロピル)−アルキル1アミノ]−4−[(3−アミノ−2−ヒドロキシプロピル)−アルキル2アミノ]−ブタン−2,3−ジオールの特定の化合物を合成するために有効に用いることができる。アルキル1はメチル、エチル、プロピル、C10−C20アルキル鎖であることができ、アルキル2はC10−C20アルキル鎖であることができる。
本明細書に記載の新規な脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)またはコレステロールなどの補助脂質の存在下または不在下で、1以上の核酸とともに、リポソームまたはリポソーム様ビヒクル中に処方することができる。これらの脂質は、当技術分野で公知の逆相蒸発法によってリポソーム中に処方することができる。あるいは、これらの脂質は、音波処理、顕微溶液化などのリポソーム形成に関する他の周知の方法により処方することもできる。これらのリポソーム処方物はDNを培養細胞へトランスフェクトするのに有効である。
N−1−ジメチル−N−1−(2,3−ジテトラデシルオキシプロピル)−2−ヒドロキシプロパン−1,3−ジアミン(13)の合成
3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール(10.19g,85ミリモル)をテトラヒドロフラン中2.5当量の水素化ナトリウムで、70℃±5℃にて18〜24時間処理した。18〜24時間後、3当量のスルホン酸テトラデシルメタン(75.0g,256ミリモル)を反応物に加え、さらに40〜48時間還流させた(70℃±15℃)。この反応混合物を濃縮乾固し、ジクロロメタンおよび水を用いて抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して油状物を得た。得られた残渣を順相フラッシュクロマトグラフィーカラムに流し、溶離剤として酢酸エチル/ヘキサンを用いて目的生成物1−ジメチルアミノ−2,3−ジテトラデシルオキシプロパンを精製した。最終生成物をTLCにより分析した。
1−[(3−アミノ−2−ヒドロキシプロピル)−アルキルアミノ]−4−[(3−アミノ−2−ヒドロキシプロピル)−アルキルアミノ]−ブタン−2,3−ジオールまたはN−1,4−ビス[(3−アミノ−2−ヒドロキシプロピル)−アルキルアミノ]−ブタン−2, 3−ジオールの合成
酒石酸ジメチル(8.2g,46.6ミリモル)を150mlのメタノールに溶解し、1− アルキルアミン(0.11モル)を加えた。この溶液を一晩(>22時間)過熱還流した。この反応混合物を室温まで冷却し、4℃で約1時間維持した。沈殿を濾過し、50mlの冷メタノール(<4℃)で2回洗浄し、ジアルキルタルタルアミドを白色の結晶質として得た(>80%)。
カチオン性脂質のリポソームへの処方
一般に、必要量のカチオン性脂質および補助脂質を秤量し、丸底フラスコに移した。脂質を溶解させるのに十分な量のクロロホルムを加えた後、分子生物学級の十分な水を加え、所望の濃度の全脂質/容量(例えば、2mg/ml)とした。この溶液をロータリーエバポレーターに入れ、クロロホルムを真空下で除去した。クロロホルムを除去すると、水性媒質中でリポソームが形成される。この溶液は乳光性となり、処方されたカチオン性脂質および補助脂質によってその濁度が異なる。例えば、10.4mgの1,4−ビス[(3−アミノ−2−ヒドロキシ−プロピル)−テトラデシル−アミノ]−ブタン−2,3−ジオールおよび9.6mgのDOPE(1:1モル比)を合わせ、丸底フラスコに入れた。この脂質混合物を2mlのクロロホルムに溶解した。このクロロホルム溶液に10mlの水を加えた。クロロホルムをロータリーエバポレーターで真空除去し、2mg/ml(MT−R1)のリポソーム溶液を得た。同様に、N−1−ジメチル−N−1−(2,3−ジテトラデシルオキシプロピル)−2−ヒドロキシプロパン−1,3−ジアミンがDOPE(1:1)とともに処方され(MT−R2)、N−1−ジメチル−N−1−(2,3−ジテトラデシルオキシプロピル)−2−(3−アミノ−2−ヒドロキシプロピルオキシ)−プロパン−1,3−ジアミンが、DOPEを伴うだけでなく、それ自体リポソーム中に処方された(MT−R3)。
トランスフェクションプロトコール
BHK−21、HeLa、COS−7、CHO−K1、VEROおよび293の、β−ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT−β−galでのトランスフェクションを次のようにして行った。
代表的な結果を下記の図1〜3に示す。
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