KR102581578B1 - 렌티바이러스 생산을 위한 무-혈청 현탁 시스템 - Google Patents

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Abstract

렌티바이러스 벡터 생산 시스템은 (a) 세포 성장을 조절하기 위한 렌티바이러스 배양 보충물, (b) 트랜스펙션 효율을 증가시키기 위한 DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤을 포함하는 트랜스펙션 시약, (c) 프로피온산 나트륨, 부틸산 나트륨, 렌티바이러스 생산을 촉진시키는 카페인을 포함하며, 여기서 렌티바이러스 벡터 생산 시스템은 무-혈청이다. 렌티바이러스 벡터 생산 방법은 렌티바이러스 생산 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 렌티바이러스 벡터 생산을 위한 또 다른 방법은 (a) 무-혈청 배지에서 진핵 세포를 배양하는 단계, (b) 세포 성장을 조절하기 위해 렌티바이러스 배양 보충물을 제공하는 단계, (c) 트랜스펙션효율을 증가시키기 위하여 DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤을 포함하는 트랜스펙션 시약을 사용하여 세포를 렌티바이러스 벡터로 트랜스펙션하는 단계, 및 (d) 렌티바이러스 생산을 촉진시킬 수 있는 프로피온산 나트륨, 부틸산 나트륨을 포함하는 렌티바이러스 생산 인핸서를 사용하여 렌티바이러스 생산을 제공하는 단계를 포함한다.

Description

렌티바이러스 생산을 위한 무-혈청 현탁 시스템
대규모의 무-혈청 현탁액에서의 새로운 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
최근에, 렌티바이러스 벡터는 유전자 요법에서 유전자 전달 벡터로 사용하는데 집중 관심대상이 되었다. 현재, 하나의 신세대 요법인 CAR-T 세포 요법은 암세포를 인식하고 죽이기 위해 T 세포의 표면에 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키는 효과적인 유전자 전달 도구로서 렌티바이러스 벡터를 사용한다. 따라서 전임상학자 및 임상 연구자들은 훨씬 더 큰 규모, 고-역가 및 동물-무-혈청 배지에서 렌티바이러스 생산을 요구했다. 렌티바이러스 생산은 CAR-T 세포 요법을 개발하는데 있어서 높은 비용을 초래한다.
현재 렌티바이러스 생산 시스템은 주로 플라스크 또는 세포 공장에서 세포 성장을 지원하기 위해 태아 소 혈청이 필요한 부착 세포를 사용한다. 이 시스템은 대형 인큐베이터 및 대형 세포 배양기가 필요한 대규모 연구 목적에는 적합하지 않고, 소규모의 연구 목적에 적합하다. 접착 세포를 배양하는 것은 조작자에게 더 어려우며, 렌티바이러스 벡터의 대량 생산에 더 많은 노력이 필요하게 되고, 따라서 비용이 증가된다.
카페인은 기존 혈청-기반 배양 시스템에서 렌티바이러스 생산을 향상시키는 데 사용되었지만, 카페인 뿐만 아니라 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제인 부틸산 나트륨은 약 50% 만 효과가 있는 것으로 나타났다. Ellis 등., Creating Higher Titer Lentivirus with Caffeine, Human Gene Therapy 22:93-100 (2011).
우리는 무-혈청 현탁 플랫폼에서 고-역가의 벡터를 생산하는 새로운 렌티바이러스 시스템을 개발했다. 이 기술은 새로운 배지, 새로운 세포, 새로운 형질감염 시약, 새로운 렌티바이러스 인핸서 및 24 시간 -48시간 동안 4 ℃ 조건에서 정제되지 않은 렌티바이러스 벡터를 안정화시키기 위한 선택적인 안정제로 구성된 새로 개발된 적절한 제조 공정 (GMP) 시약 세트를 사용한다. 이 새로운 시스템으로 우리는 ~ 1.5E+08 (TU/ml)의 비-농축된 렌티바이러스 벡터를 전달할 수 있다.
요약
본 명세서에 따르면, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템은 다음을 포함한다:
세포 성장을 조절하는 렌티바이러스 배양 보충물,
DHDMS 및 하나 이상의 헬퍼 및/또는 중성 지질을 포함하는 트랜스펙션 시약,
프로피온산 나트륨, 부틸산 나트륨 및 카페인을 포함하는 렌티바이러스 생산 인핸서,
이때, 상기 렌티바이러스 벡터 생산 시스템은 무-혈청이다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 헬퍼 및/또는 중성 지질은 DOPE를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 헬퍼 및/또는 중성 지질은 DOPE 및 콜레스테롤을 포함한다.
일부 구체예에서, 시스템은 현탁 293 세포, 293F 세포 또는 이의 유도체에서 렌티 바이러스의 생산을 위해 고안되었다.
일부 구체예에서, 293F 세포 또는 그로부터 유래된 세포를 약 1 Х106 내지 약 20x106의 밀도로 성장시킬 수 있고, 이들중 5 일 후에 20% 이하의 세포가 사멸된다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 아미노산 및/또는 디펩티드 및 당원, 당 알코올 및/또는 탄소원을 포함한다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 아미노산 및 글루코스를 포함한다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1% 내지 약 10%로 첨가된다. 일부 구체예에서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물내 전술한 글루코스의 삼투질 농도는 약 500 mOsm/㎏ 내지 약 700 mOsm/㎏, 약 550 mOsm/㎏ 내지 약 650 mOsm/㎏, 약 575 mOsm/㎏ 내지 약 625 mOsm/㎏이다. 일부 구체예에서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물내 전술한 글루코스의 농도는 약 85mg/ml 내지 약 115mg/ml, 약 90mg/ml 내지 약 110mg/ml, 약 95mg/ml 내지 약 105mg/ml이다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1100 mOsm/㎏ 내지 약 1400 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏ 내지 약 1300 mOsm/㎏의 삼투질 농도, 또는 임의의 삼투질 농도 또는 이들 사이의 범위를 가진다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1100 mOsm/㎏, 약 1150 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏, 약 1250 mOsm/㎏, 약 1300 mOsm/㎏, 약 1350 mOsm/㎏, 약 1400 mOsm/㎏, 약 1450 mOsm/㎏, 약 1500 mOsm/㎏의 삼투질 농도를 가진다.
일부 구체예에서, DHDMS는 약 0.4 내지 0.6 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, DOPE는 약 0.2 내지 0.5 mM/mL로 포함된다. 일부 구체예에서, 콜레스테롤은 0.1 내지 0.6 mM/mL로 포함된다. 일부 구체예에서, 유일한 헬퍼 및/또는 중성 지질은 DOPE이다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 인핸서는 발프로산을 포함한다. 일부 구체예에서, 프로피온산 나트륨 및/또는 부틸산 나트륨은 수용액으로 제공된다. 일부 구체예에서, 카페인은 렌티바이러스 발현 배지에서 제공된다. 일부 구체예에서, 프로피온산 나트륨은 약 3 내지 15 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 부틸산 나트륨은 약 1.5 내지 3 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 카페인은 약 0.75 내지 3 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 발프로산은 약 0.5 내지 1 mM로 포함된다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 벡터 생산 방법은 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터 생산 시스템 중 임의의 것을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 벡터 생산을 위한 방법은 무-혈청 배지에서 진핵 세포를 배양하고, 세포 성장을 조절하기 위해 렌티바이러스 배양 보충물을 제공하고, DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤을 포함하는 트랜스펙션 시약을 사용하여 렌티바이러스 벡터로 세포를 트랜스펙션하여 트랜스펙션 효율을 증가시키고, 렌티바이러스 생산을 촉진할 수 있는 프로피온산 나트륨, 부틸산 나트륨 및 카페인을 포함하는 렌티바이러스 생산 인핸서를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 배양된 진핵 세포는 고밀도 조건 하에서의 성장에 적합한 현탁 배양물 안에 있다. 일부 구체예에서, 세포는 적어도 약 1x106 내지 20x106 세포/mL의 세포 밀도를 갖는 현탁 세포 배양물에서 성장된다
일부 구체예에서, 상기 방법은 293 세포, 293 세포의 유도체, 293F 세포 또는 293F 세포의 유도체의 배양을 위한 것이다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 웰당 2.5x108 TU/mL의 농축안된 렌티바이러스 벡터를 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, 현탁 세포 배양물의 부피는 약 10 mL 내지 약 5 L이다. 일부 구체예에서, 세포 생존률은 5 일 후에 적어도 80%이다.
본 개시 내용의 추가 목적 및 장점은 다음에 따르는 상세한 설명에서 부분적으로 설명될 것이며, 상세한 설명으로부터 부분적으로 명백할 것이며, 또는 개시 내용의 실시에 의해 교시될 수 있다. 본 개시 내용의 목적 및 이점은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 기재된 요소들과 조합들에 의해 실현되고 달성될 것이다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명들은 모두 오직 예시적이고 설명을 위한 것이며, 본 교시내용을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 통합되어 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 개시 내용을 예시하고 상세한 설명과 함께 본 개시의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a 및 1b 렌티바이러스 생산에 배양 보충물의 영향을 보여준다.
도 1a: 바이러스 생산시, 배양 배지에는 1%, 5% 및 10%의 ExpiCHO™-Feed 배양 보충물과 함께 다양한 밀도의 세포가 제공되었다. 트랜스펙션 후 48 시간에, 렌티바이러스 벡터를 수집하고 역가를 측정하였다.
도 1b:다양한 양의 ExpiCHO™-Feed 보충물의 존재하에서 현탁 세포의 생존 가능성을 모니터링했다.
도 2a-b는 신규 트랜스펙션 시약의 스크리닝을 나타낸다.
도 2a: 이 실험에서 JMP® Design of Experiments(DoE) 기획된 새로운 트랜스펙션 시약이 스크리닝되었다. 총 12 명의 후보자가 기획되었으며, 12 개의 새로운 트랜스펙션 시약 중 8 개가 다음 DoE 실행을 위해 선택되었다.
도 2b:JMP® 기획된 DoE 실험이 몇 가지 더 수행되었다 (데이터는 표시되지 않음). 성능 및 제제 조성물을 기준으로 12 가지 시약이 선택되었다.
도 3a-3c는 렌티바이러스 인핸서의 동정을 나타낸다. 새로운 렌티바이러스 인핸서를 확인하기 위한 베이크 오프(bake-off) 실험은 DoE 용 JMP® 소프트웨어를 사용하여 설계되었다.
도 3a: 대조군 렌티바이러스 인핸서를 포함하여 32 개의 후보가 테스트되었다.
도 3b 및 도 3c는 JMP®에 의한 분석 및 두 DoE 인핸서 실험 예측 프로파일 그래프를 나타낸다.
도 4는 렌티바이러스 생산 시스템 비교 결과다. 구체적으로, 그것은 상이한 트랜스펙션 시약, 렌티바이러스 배양 보충물의 유무, 렌티바이러스 인핸서의 유무, 그리고 부틸산 나트륨의 존재 여부에 따라 렌티바이러스 벡터 ml 당 역가를 나타낸다.
도 5는 무-혈청 현탁 렌티바이러스 생산의 대규모 프로토콜의 한 구체예를 제공한다.
도 6은 실시예 8의 렌티바이러스 역가 측정에 사용하기 위한 4-웰 X 4-웰 패턴을 제공한다.
도 7은 실시예 7에 상응하는 렌티바이러스 현탁 세포 배양 순서도를 제공한다.
I. 렌티바이러스 생산 시스템
A. 세포
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 모든 유형의 진핵생물 및 원핵생물 세포를 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 진핵 세포, 특히 포유류 세포를 지칭한다. 특정의 예시적인 비-한정적 구체예에서, 용어 "세포"는 인간 배아 신장 (HEK) 또는 인간 293 세포, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 현탁액에서 성장할 수 있는 293 변이체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 현탁 배양에서 성장, 증식 및 트랜스펙션될 수 있는 293 세포의 변이체, 특히, 고밀도 (예를 들어, ≥ 약 2x106 세포/mL, ≥ 약 3x106 세포/mL, 또는 선택적으로 내지 ≥ 약 4 Х 106 세포/mL, 또는 약 20x106 세포/mL)에서 배양될 수 있는 변이체. 이러한 변이체의 예로는 EXPI293TM F 세포와 같은 293F 세포가 있다.
일부 구체예에서, 용어 "고밀도"는 세포 배양 및 트랜스펙션 작업 수행의 맥락에서 사용되는 경우, 일반적으로 적절한 세포에서 ≥약 1x106 세포/mL, ≥약 2x106 세포/mL, ≥약 3x106 세포/mL, 또는 선택적으로 ≥약 4x106 세포/mL 이상, 또는 ≥약 20x106 세포/mL의 밀도로 배양되거나 배양될 수 있고, 한편 고효율로 트랜스펙션되고, 높은 수준(예를 들어, 200 ㎍/mL에서 또는 이를 초과하여, 최대 약 1 mg/mL 또는 그 이상까지)으로 표적 단백질을 발현시키는 능력을 유지하는 공지된 세포주 또는 공지된 세포주의 변이체를 지칭한다.
일부 구체예에서, 세포는 고밀도 세포 배양에 적합하다. 이것은 약 80% 이상의 세포 생존율을 유지하면서, 고밀도 배양 배지에서 고밀도로 자라도록 적응된 동일한 부모 세포 계통에서 유래된 세포 계통 또는 세포의 비-클론 (non-clonal) 집단을 지칭한다. 이러한 세포는 세포를 고밀도에서 ≥약 40, 50, 60, 70 또는 80회의 순차적인 계대에서 유지시키고, 점차적으로 성장 배지를 고밀도 배양 배지로 대체함으로써, 부모 세포 집단으로부터 단리시키거나 선별시킬 수 있다. 상기 과정 동안에, 임의선택적으로 세포의 상이한 풀(pool)은 개별적으로 증식될 수 있고, 동시에 트랜스펙션 효율 및 또는 렌티바이러스 벡터 생산 효율을 평가하면서 선별 과정을 수행할 수 있어서, 고밀도에서 유지 및 성장할 수 있고, 높은 효율로 트랜스펙션될 수 있고, 원하는 수준의 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 비-클론성 세포 집단이 선택될 수 있다. 다양한 세포 유형 및 계통이 이 선별 절차로 처리될 수 있다는 것은 숙련자에게 용이하게 명확할 것이지만, 293 섬유아세포로부터 유래한 세포 계통은 고밀도 성장 조건에 적응하도록 선별 과정에 특히 적합하다고 판단되었다. 일부 시나리오에서, 고밀도 성장 배양에 적응되고, 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포는 또한 고-효율로 트랜스펙션될 수 있고 및/또는, 재조합 단백질을 적어도 세포 배양물의 1mL당 약 200㎍ 내지 세포 배양물의 1mL당 최대 약 2㎎, 더 통상적으로 세포 배양물의 1mL당 약 500㎍ 내지 세포 배양물의 1mL당 약 1mg의 수율로 발현할 수 있을 것이다. 일부 시나리오에서, 사용된 고밀도 배양에 적합한 세포는 약 1x106 내지 약 20x106 세포/mL, 약 2x106 내지 약 2x106 세포/mL, 또는 약 2.5x106 내지 약 6x106 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 세포는 고밀도 배양에 적합하고, 1x106 내지 약 20x106, 약 1x106 내지 약 4x106, 약 1x106 내지 약 3x106, 약 1x106 내지 약 2x106의 범위 밀도에서 트랜스펙션된다.
일부 구체예에서, 세포는 현탁 배양에서 성장한다. 현탁 배양에는 배양 용기 내의 다수 또는 모든 세포는 현탁액 안에 존재하고, 배양 용기 내의 소수 세포 또는 어떠한 세포도 용기 표면 또는 용기 내의 다른 표면에 부착되지 않는, 세포 배양이 포함된다. 일부 구체 예에서, 현탁 배양물은 배양 용기 내의 세포의 약 ≥ 75%는 현탁 상태로 존재하며, 배양 용기 표면 또는 안에 부착되지 않는다. 일부 구체 예에서, 현탁 배양물은 배양 용기 내의 세포의 약 ≥ 85%는 현탁 상태로 존재하며, 배양 용기 표면 또는 안에 부착되지 않는다. 일부 구체 예에서, 현탁 배양물은 배양 용기 내의 세포의 약 ≥ 95%는 현탁 상태로 존재하며, 배양 용기 표면 또는 안에 부착되지 않는다.
렌티바이러스 벡터의 생산 시스템은 293F 세포 또는 그로부터 유래된 세포가 약 1x106 내지 약 20x106의 밀도로 성장 가능하고, 5일 후 20% 미만의 세포는 사멸하게 되는 것을 허용한다.
B. 렌티바이러스 배양 보충물
렌티바이러스 생산 시스템은 렌티바이러스 배양 보충물을 포함한다. 렌티바이러스 배양 보충물은 세포 성장을 조절하고, 생산 시간 동안 세포 성장을 둔화시키며, 렌티바이러스 생산의 최대 생산을 허용하고, 트랜스펙션되지 않은 세포가 바이러스를 "먹어 치우는(devoured)"것을 최소화한다. 도 1a 및 1b 참조.
특정 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 임의로 선택적으로 글루코스 및 아미노산을 포함하는, 세포 배양 사료를 포함한다. 하나의 예시적인 세포 배양 보충물 또는 사료는 CTS™ LV-MAX™이며, 또 다른 예시적인 세포 배양 보충물 또는 사료는 ExpiCHO™ Feed(ExpiCHO™ 발현 시스템의 Thermo Fisher Scientific 제품)이다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 아미노산, 디펩티드, 당원, 당 알코올 및 탄소원을 포함한다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 미네랄 및/또는 미량 금속 및/또는 비타민 및/또는 비타민 전구체를 추가로 포함한다 .
일부 구체예에서, 디펩티드는 L-알라닐-L-시스테인 및 L-알라닐-L-티로신을 포함한다. 일부 구체예에서, 아미노산은 임의의 아미노산 또는 임의의 필수 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 용어 "아미노산"은 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들어, 아미노산 유사체), 뿐만 아니라 이의 D-및 L-형태를 의미한다. 이러한 아미노산의 예는 글라이신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-리신, L-류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신 및 L-발린, N-아세틸 시스테인을 포함한다. 일부 구체예에서, 배양 보충물에 포함된 아미노산은 글리신, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 하이드 록시 프롤린, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및/또는 발린을 포함한다. 일부 구체예에서, 당원, 당 알코올 및 탄소원은 D-글루코스, i-이노시톨 및 피루브산 나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 보충물은 글루코스를 포함한다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 표 1에 열거된 성분을 포함한다.
표 1:렌티바이러스 배양 보충물
카탈로그 # 성분 범위 (g/L)
100009922 AOF-L-알라닐-L-시스테인 이량체 .1 ~ 10
100009921 AOF-L-알라닐-L-티로신 이수화물 .1 ~ 10
8205023 D-글루코스 50 ~ 200
8101006 글리신 .01 ~ 1
8101002 L-알라닌 .1 ~ 1
8101009 L-아르기닌 HCl 1 ~ 10
8101014 L 아스파라긴 H2O 1 ~ 10
8101016 L-아스파라긴산 .1 ~ 10
8101048 L-글루탐산 .1 ~ 10
8101062 L 염산 히스티딘 H2O .1 ~ 10
8101097 L-하이드 록시 프롤린 .1 ~ 10
8101072 L-이소류신 .1 ~ 10
8101077 L-류신 .1 ~ 10
8101083 L-리신 HCL .1 ~ 10
8101086 L-메티오닌 .1 ~ 10
8101095 L-페닐알라닌 .1 ~ 10
8101096 L-프롤린 .1 ~ 10
8101101 L-세린 .1 ~ 10
8101104 L-트레오닌 .1 ~ 10
8101110 L-트립토판 .1 ~ 10
8101116 L-발린 .1 ~ 10
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1% 내지 약 10%로 첨가된다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1%, 3.5%, 5% 또는 10%로 첨가된다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 3.5%로 첨가된다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 글루코스를 포함할 수있다. 일부 구체예에서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물의 글루코스의 삼투질 농도는 약 500 mOsm/㎏ 내지 약 700 mOsm/㎏, 약 550 mOsm/㎏ 내지 약 650 mOsm/㎏, 약 575 mOsm/㎏ 내지 약 625 mOsm/㎏일 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 보충물에서 글루코스의 농도는 약 85mg/mL 내지 약 115mg/mL, 약 90mg/mL 내지 약 110mg/mL, 약 95mg/mL 내지 약 105mg/mL의 범위일 수 있다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 다수의 아미노산을 포함할 수 있고, 각각의 아미노산은 약 0.1mg/mL 내지 약 8mg/mL의 범위의 농도를 가진다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1100 mOsm/㎏ 내지 약 1400 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏ 내지 약 1300 mOsm/㎏의 삼투질 농도, 또는 임의의 삼투질 농도 또는 이들 사이의 범위를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1100 mOsm/㎏, 약 1150 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏, 약 1250 mOsm/㎏, 약 1300 mOsm/㎏, 약 1350 mOsm/㎏, 약 1400 mOsm/㎏, 약 1450 mOsm/㎏, 약 1500 mOsm/㎏의 삼투질 농도를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1100 mOsm/㎏ 내지 약 1400 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏ 내지 약 1300 mOsm/㎏의 삼투질 농도, 또는 임의의 삼투질 농도 또는 이들 사이의 범위를 가진다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 배양 보충물은 약 1100 mOsm/㎏, 약 1150 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏, 약 1250 mOsm/㎏, 약 1300 mOsm/㎏, 약 1350 mOsm/㎏, 약 1400 mOsm/㎏, 약 1450 mOsm/㎏, 약 1500 mOsm/㎏의 삼투질 농도를 가진다.
C. 트랜스펙션 시약
렌티바이러스 생산 시스템은 또한 거대 분자의 세포로의 도입을 용이하게 하는 트랜스펙션 시약 또는 조성물을 포함한다. 한 구체예에서, 트랜스펙션 시약은 "지질 응집체"로서 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성/헬퍼 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 지질 응집체는 적어도 제1 양이온성 지질 및 임의선택적으로 적어도 제1 중성 지질을 포함할 수 있고, 여기서 전술한 지질 응집체는 수성 조건하에 핵산과 함께 양이온성 복합체를 형성하는데 적합하고, 여기서 전술한 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는다:
(구조식 (I)) 및 이들의 염;
여기서, R1 및 R2는 독립적으로, 8 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고;
알킬, 알케닐 또는 알키닐기는 8 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 알코올, 아미노알코올, 아민, 아마이드, 에테르, 폴리에테르, 에스테르, 머캅탄, 알킬티오, 또는 카바모일기에 의해 치환되거나, 또는 R1은 -(CH2)q-N(R6)tR7R8이며;
R3 및 R4는 독립적으로, 수소, 또는 8 내지 30개의 탄소 원자를 갖고, 임의로 하나 또는 이상의 알코올, 아미노알코올, 아민, 아마이드, 에테르, 폴리에테르, 에스테르, 머캅탄, 알킬티오, 또는 카바모일기로 치환되는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고;
R5-R8은 독립적으로, 수소, 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이며;
R9는 수소, 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기, 탄수화물 또는 펩티드고;
r, s 및 t는 지시된 R 기의 존재 또는 부재를 나타내는 1 또는 0이고, 이때 r, s 또는 t중 어느 하나가 1인 경우, 표시된 R 기에 연결된 질소는 양으로 하전되고, 여기서 r, s 또는 t중 적어도 하나는 1이고;
q는 1 내지 6을 포함하는 범위의 정수이고;
Xv-는 음이온이고, 이때 v는 음이온의 원자가이고, A는 음이온의 수이고;
L은 (CH2)n이며, 이때 n은 1 내지 10을 포함하는 범위의 정수이고, 임의선택적으로 하나 또는 이상의 ZR10 기로 치환되고, 여기서 Z는 O 또는 S이고, R10은 수소 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고; 또는
{-(CH2)k-Y-(CH2)m}p-, 여기서 k 및 m은 독립적으로, 1 내지 10을 포함하는 범위의 정수이고, p는 1 내지 6을 포함하는 범위의 정수이고, Y는 O, S, CO, COO, CONR11, NR11CO, 또는 NR11COR11N이고, 여기서 R11은 임의의 다른 R11과 독립적으로, 수소 또는 알킬 기이고;
R1-R10의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기의 하나 또는 그 이상의 CH2 기는 O, S, SS, CO, COO, NR12CO, COONR12 또는 NR12CONR12로 치환될 수 있고, 이때 R12는 임의의 다른 R12와 독립적으로, 수소, 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기이고; 그리고
여기서, R1-R12의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기는 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 OR13, CN, 할로겐, N(R13)2, 펩티드, 또는 탄수화물기로 치환되고, 여기서 R13은 다른 R13과 독립적으로, 수소 또는 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이고, 그리고
여기서 R3 및 R4 중 적어도 하나는 알킬기로서 존재하는 경우 OR13 및 N(R13)2 기 모두로 치환된다.
한 구체예에서, 양이온성 지질은 하기 구조에 따른 DHDMS (디하이드록시-디미리스틸스페르민 테트라하이드로클로라이드 염)이다:
일부 구체예에서, 중성 지질(또는 헬퍼)은 하기로부터 선택될 수 있다: DOPE, 콜레스테롤 또는 DOPC. 하나의 구체예에서, 중성 지질은 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC 중 하나일 수 있다. 한 구체예에서, 중성 지질은 콜레스테롤이다. 구체예에서, 중성 지질은 DOPE이다. 일부 구체예에서, 중성 지질은 DOPC이다. 일부 구체예에서, 2 개의 중성 지질, 예를 들어, DOPE 및 콜레스테롤이 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 하나의 중성 지질이 사용된다.
일부 구체예에서, 트랜스펙션 시약은 DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구체예에서, 트랜스펙션 시약 DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰 비는 약 0.4 내지 0.65 mM의 DHDMS, 약 0.1 또는 0.125 내지 0.25의 DOPE, 및 약 0.2 내지 0.4 또는 0.375의 콜레스테롤의 범위이다. 일부 구체예에서, 트랜스펙션 시약 DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰 비는 약 0.45 내지 0.55 mM의 DHDMS, 약 0.1 내지 0.25의 DOPE, 및 약 0.3 내지 0.4의 콜레스테롤의 범위이다. 일부 구체예에서, 트랜스펙션 시약 DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰 비는 약 0.475 내지 0.5 mM의 DHDMS, 약 0.1 내지 0.125의 DOPE 및 약 0.325 내지 0.35의 콜레스테롤의 범위이다. 일부 구체예에서, 트랜스펙션 시약 DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰 비는 약 0.5 내지 0.525 mM의 DHDMS, 약 0.125 내지 0.15의 DOPE 및 약 0.35 내지 0.375의 콜레스테롤의 범위이다. 트랜스펙션 시약은 높은 세포 밀도에서 여러 플라스미드의 전달에 적합합니다. 도 2a-d 참조.
일부 구체예에서, DHDMS는 약 0.4 내지 0.65 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, DOPE는 약 0.05 내지 0.5 mM/mL로 포함된다. 일부 구체예에서, 콜레스테롤은 0.1 내지 0.6 mM/mL로 포함된다.
일부 실시예에서, DHDMS 및 DOPE가 포함된다. 일부 구체예에서, DHDMS:DOPE의 비율은 약 0.6:0.4 내지 0.7:0.3 범위이다. 일부 구체예에서, DHDMS:DOPE의 비율은 약 0.625:0.375 내지 0.675 내지 0.325의 범위이다. 일부 구체예에서, DHDMS:DOPE의 비율은 약 0.6 내지 0.4 내지 0.625 내지 0.375 범위이다.
일부 구체예에서, DHDMS:DOPE:콜레스테롤 (임의의 제로 양 포함)의 비는 표 2에서 선택될 수 있으며, 모든 숫자는 "약(about)"이라는 단어에 의해 수정이 고려된다. 다른 헬퍼 및/또는 중성 지질은 DOPE 및/또는 콜레스테롤을 대체할 수 있다.
표 2:DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤의 일부 구체예 :
DHDMS DOPE 콜레스테롤
0.4000 0.2575 0.3425
0.4000 0.2616 0.3384
0.4965 0.2386 0.2649
0.5200 0 0.4800
0.6000 0 0.4000
0.6000 0.2000 0.2000
0.6000 0.4000 0
0.650 0.350 0
0.473 0.228 0.299
0.512 0.208 0.279
0.519 0.126 0.355
일부 구체예에서, DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰 비 (임의의 제로 함량 포함)는 표 2, 표 5 또는 표 6에서 선택되며, 모든 수치는 "약(about)"이라는 단어에 의해 수정이 고려된다.
일부 구체예에서, DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰 비는 표 5의 운용 번호 1xR3, 1xR4, 1xR6, 1xR7, 1xR9, 1xR10, 1xR11, 1xR12 또는 표 6의 2bxR13 또는 2bxR14로부터 선택된다.
일부 양태에서, 그리고 선택적으로 이 단락의 이전 단락들에서 논의된 임의의 비율들에 적용되는 양태에서, DHDMS:DOPE:콜레스테롤의 몰비가 1.0으로 첨가되고, DHDMS 몰비가 약 0.4 내지 0.6의 범위인 경우, DOPE 몰비는 약 0.2 내지 0.5이고, 콜레스테롤 몰비는 약 0.1 내지 0.6이다. 예를 들어, DHDMS가 0.5의 몰비이고 DOPE가 0.2의 몰비인 경우, 몰비가 1.0이 되도록 콜레스테롤 몰비는 0.3이다.
D. 렌티바이러스 생산 인핸서
렌티바이러스 생산 시스템은 또한 렌티바이러스 생산 인핸서를 포함한다. 렌티바이러스 생산 인핸서는 프로피온산 나트륨, 부틸산 나트륨 및 카페인을 포함한다.
일부 구체예에서, 프로피온산 나트륨 및/또는 부틸산 나트륨은 물에 제공된다. 일부 구체예에서, 카페인은 Expi293™ 발현 배지와 같은 세포 배양 발현 배지에서 제공된다. 일부 구체예에서, 카페인은 배지 중에 40 mM의 최종 농도로 용해될 수 있다.
일부 구체예에서, 프로피온산 나트륨은 약 7.5 내지 15 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 부틸산 나트륨은 약 1.5 내지 3 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 카페인은 약 0.75 내지 3 mM로 포함된다.
일부 구체예에서, 프로피온산 나트륨은 약 3 내지 약 5 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 프로피온산 나트륨은 약 5 내지 8 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 부틸산 나트륨은 약 1.5 내지 2.5 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 부틸산 나트륨은 약 2.5 내지 3 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 카페인은 약 2 내지 3 mM로 포함된다. 일부 구체예에서, 카페인은 약 1 내지 2 mM로 포함된다.
일부 구체예에서, 발프로산, 프로피온산 나트륨, 부틸산 나트륨 및 카페인의 양은 표 3에 제공된 것들로부터 선택될 수 있으며, 모든 숫자는 "약(about)"이란 용어에 의해 수정이 고려된다.
표 3:렌티바이러스 생산 인핸서의 일부 구체예
발프로산 (mM) 프로피온산 나트륨 (mM) 부틸산 나트륨 (mM) 카페인 (mM)
0 7.5 3 0.75
0 7.5 3 1.5
0 15 3 1.5
0.5 7.5 1.5 0
0.5 11.25 1.5 0.75
0.5 11.25 1.5 0.75
0.5 11.25 3 1.5
0.5 15 0 1.5
0 4.53 2 1.5
0.5 15 3 0.75
1 7.5 3 0
1 11.25 3 0
1 15 0 0
1 15 1.515 1.5
1 15 3 0
1 15 3 1.5
일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서 성분은 표 3, 표 7 또는 표 8 중 임의의 것에서 선택되며, 모든 숫자는 "약"이란 단어에 의해 수정이 고려된다. 일부 구체예에서, 인핸서 성분은 표 7에서 1xR5, 1xR6, 1xR13, 1xR14, 1xR15, 1xR16, 1xR17, 1xR18, 1xR19, 1xR22, 1xR26, 1xR27, 1xR29, 1xR30 또는 1xR31로부터 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서는 선택적으로 발프로산을 포함한다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서는 발프로산을 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 발프로산은 약 0.5 내지 1 mM로 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서는 가령, 트랜스펙션 시점 (약 0 시간)으로부터 트랜스펙션 후 약 48 시간까지의 하나 이상의 시점에서 첨가된다. 렌티바이러스 생산 인핸서는 렌티바이러스 벡터의 세포 포장을 증가시키기 위해 트랜스펙션 후 약 16 시간 후에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서는 트랜스펙션시에 첨가될 수있다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서는 트랜스펙션시 그리고 트랜스펙션 후 약 16 시간에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 렌티바이러스 생산 인핸서는 트랜스펙션 후 약 10 내지 16 시간에서 첨가될 수있다.
E. 세포 배양 배지
다양한 세포 배양 배지가 렌티바이러스 생산 시스템 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 대개 연구자들은 혈청없는 배지를 선호한다. 상기 섹션 I.A에서 기술한 세포의 성장을 지원하는 무-혈청 배지가 사용될 수 있다. 이 배지는 또한 단백질이 없을 수도 있다.
"무-혈청 배지"(때때로 "SFM 배지"라 칭함)는 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청(FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 인간 혈청 등)을 함유하지 않는 배지이고, 일반적으로 SFM으로 지칭된다. 구절 "단백질-비함유" 배양 배지는 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 또는 부착 인자와 같은 혈청 단백질, 가령, 성장 인자와 같은 영양 단백질, 또는 가령, 트랜스페린, 셀룰로플라스민과 같은 금속 이온 운반 단백질, 등이 없다)을 함유하지 않는 배양 배지를 의미한다. 일부 구체예에서, 펩티드가 존재하는 경우, 펩티드는 더 작은 펩티드, 예를 들어 디-펩티드 또는 트리-펩티드이다. 일부 구체예에있어서, 데카-펩티드 길이 또는 그 이상의 펩티드는 단백질 없는 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 이하, 약 0.1% 이하 및 약 0.01% 이하이다.
일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 Expi293TM 발현 배지 (Thermo Fisher Scientific Cat # A14351-01)이다. 이 배지는 293 세포의 고밀도 현탁 배양 및 트랜스펙션을 위해 특별히 개발된 화학물질-특정된 특수 배지이며, 인간 또는 동물-기원 제품을 포함하지 않는다. ExpiCHO TM 발현 배지는 GlutaMAX™-I 시약과 함께 제제화된다. 현탁 성장과 트랜스펙션의 경우, 이 배지는 보충물없이 사용할 수 있다. 또한, 항생제가 필요하지 않지만; 그러나 유익할 경우, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 암포테리신 B가 함유된 5 mL/L의 항생제-항균제 (Thermo Fisher Scientific Cat # 15240)를 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 포유 동물 세포의 생장을 유지할 수 있고, 일부 구체예에서, 최대 2x107 세포/mL의 밀도로 현탁액에서 세포가 성장하며, 동시에 전술한 세포의 생존율을 약 80% 이상으로 유지시키고, 나아가 전술한 현탁 세포가 효과적으로 트랜스펙션되고, 다량의 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 능력을 유지시킬 수 있는 임의의 배양 배지를 포함한, 고-밀도 배양 배지가 이용될 수 있다. 사용되는 고밀도 배양 배지는 상이한 용도 및 용도에 따라 다를 수 있으며, 사용되는 세포주의 성질, 일시적으로 발현되는 목적 단백질, 발현 벡터의 세포로의 전달을 위해 선택된 트랜스펙션 양식의 특성, 그리고 하기 기술된 바와 같이 시스템에 첨가된 임의의 발현 인핸서의 양 및 성질에 따라 달라질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 일시적 발현 시스템에서의 사용을 고려한 고밀도 배양 배지는 전형적으로 무-혈청, 무-단백질이며, 약 2x107개의 세포/mL 이하, 더 통상적으로 약 2x106개의 세포/mL 내지 약 1x107개의 세포/mL의 밀도로 현탁 세포의 배양 및 성장을 허용하고, 추가로 일시적 발현 시스템에서 생성된 단백질의 수율이 세포 배양물의 1mL당 적어도 200㎍ 내지 세포 배양물의 1mL당 2㎎, 더 통상적으로 세포 배양물의 1mL당 약 500㎍ 내지 세포 배양물의 1mL당 약 1㎎을 초과하게끔 할 수 있다. 일부 구체예에서, 사용되는 고밀도 배양 배지는 약 1x106개 내지 약 20x106개의 세포/mL, 약 2x106개 내지 약 2x106개의 세포/mL, 또는 약 2.5x106개 내지 약 6x106개의 세포/mL 범위의 밀도로 세포의 트랜스펙션을 촉진할 수 있다.
본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 예시적인 고밀도 배양 배지는 HuMEC 기초 무-혈청 배지, KNOCKOUT™ CTS™ XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPRO™-34 SFM 배지, STEMPRO™ NSC 배지, ESSENTIAL™-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO® FREESTYLE™ 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, Essential™-6 배지, STEMPRO™-34 배지, Gibco® Astrocyte 배지, AIM V® 배지 CTS™, AMINOMAX™ C-100 기초 배지, AMINOMAX™-II 완전 배지, CD FORTICHO™ 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO® FREESTYLE™ CHO 발현 배지, CD OPTICHO™ 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900™ 배지, EXPI293™ 발현 배지, LHC 기초 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER. C6® Cell 배지, AIM V® 배지, EXPILIFE® 배지, 케라티노사이트-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 이의 임의의 유도물질 또는 수정물질을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 특정 비-제한적 구체예에서, 고밀도 배양 배지는 CD FORTICHO™ 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO® FREESTYLE™ CHO 발현 배지, CD OPTICHO™ 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, GIBCO® FREESTYLE™ 293 발현 배지, EXPI293™ 발현 배지, 또는 유사 배지, 또는 이의 변형된 형태일 수 있다. 상기 기재된 예시적인 고밀도 배양 배지는 293 세포, 293 세포 변이체 또는 고밀도 배양 시스템에 적응된 임의의 다른 세포의 고밀도 성장, 전파, 트랜스펙션 및 유지에 특히 적합할 수 있다.
F. 렌티바이러스 플라스미드
다양한 렌티바이러스 플라스미드가 본 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 렌티 발현 (전달) 플라스미드, pLenti6.3/V5-GW/EmGFP 및 렌티 패키징 플라스미드인 ViraPower™ 렌티바이러스 패키징 믹스 중 하나 이상을 사용할 수 있다. # 277.pCCLsin.cPT.hPGK.eGFP,Wpre (277-eGFP)를 포함한 다른 렌티바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 다른 비-제한적 렌티바이러스 플라스미드가 또한 사용될 수 있다.
통합 능숙- 및 통합 결함-렌티바이러스 벡터 모두 사용할 수 있다 (각각 ICLV 및 IDLV).
무-혈청 현탁 렌티바이러스의 대규모 생산 프로토콜은 도 5에 표시된다. 이것은 본원에 기술된 렌티바이러스 생산 시스템을 사용하는 방법의 한 구체예다.
현재 무-혈청 현탁액 LV 생산 시스템은 사용하기 쉽고, 확장성이 있으며, 고효율이다. 이 시스템은 이전 방법보다 10 배 더 많은 렌티바이러스 벡터를 생산할 수 있다. 현재 시스템 및 트랜스펙션 시약은 높은 세포 밀도에서 무-혈청 현탁 배양 세포에 렌티바이러스 발현 및 패키지 벡터를 효율적으로 전달할 수 있다. 그리고 배양 보충물은 렌티바이러스 입자의 최대 양을 산출하기 위해 중간 로그 단계에서 세포를 유지시킨다. 따라서, 이 시스템과 그 구성 요소의 장점으로는 단순성, 배양 균질성, 높은 렌티바이러스 역가 생산, 용이한 스케일 업 및 렌티바이러스 생산 시스템의 밀폐 자동화에 대한 실현성 등이 있다.
II. 렌티바이러스 생산 시스템에서의 사용 방법
A. 제 1 렌티바이러스 생산 시스템
렌티바이러스 현탁 세포의 배양에 대한 다음 지침을 따를 수 있다. 세포는 렌티바이러스 현탁 세포 배양 표준 프로토콜에 따라 성장할 수 있다. 세포는 배양 후 약 매 3일 또는 4일 후 약 4x106 내지 5x106 생존 세포/mL의 밀도가 되면 세포를 계대 배양할 수 있다. 상기 세포는 배양 약 3 또는 4 일 후에, 0.3x106 개 세포 내지 0.6x106 세포로 분할될 수 있다. 매일 같은 시간에 매일 세포를 계수하여 세포 성장을 모니터할 수 있다. 세포 배증 시간은 약 24 시간이다. 해동 날짜로부터 2 주가 지나면 세포는 렌티바이러스 생산 준비가 완료된다. 세포 배양 중에 궤도 진탕기는 125mL 내지 1L의 쉐이크 플라스크에서 약 125rpm로 사용할 수 있다. 배양기는 약 37 ℃, 약 8%의 CO2, 75-80% 습도로 설정될 수 있다. 배양 배지는 사용하기 전에 약 37 ℃ 수조에서 가온될 수 있다.
시약 및 방법 :
● 125mL 폴리카보네이트, 일회용, 무균, Vent-up Erlenmeyer 쉐이크 플라스크;
● 15mL 살균된 원뿔 튜브;
● 50 mL 살균된 원뿔 튜브;
● Opti-MEM® I 배지;
● 렌티 발현 (전송) 벡터:pLENTI6.3/V5-GW-EmGFP;
● 렌티 패키징 믹스:ViraPower 렌티바이러스 패키징 믹스;
● 렌티바이러스 현탁 세포;
● 렌티바이러스 배양 보충물;
● 렌티바이러스 트랜스펙션 시약;
● 렌티바이러스 인핸서
예를 들어, 금요일 아침 세포가 0.6x106 세포/mL의 세포 수로 나뉘어지면, 1L 플라스크내 약 250 mL 배양 배지에서 3 일 동안 배양될 수 있다. 월요일 아침 오전 10:00 시에, 예를 들면, 세포를 계수함으로써 세포를 준비하고, 약 4.5x106 개 세포/mL를 기대할 수 있다. 새로 가온된 배양 배지에서 상기 세포를 3.0x106 개의 세포/mL로 희석하고, 추가 30분 동안 배양될 수 있다.
트랜스펙션은 예를 들면, 화요일 오후 4시에 실시할 수 있다. 상기 세포는 예상된 약 5.5 내지 6.0x106 개의 세포/mL로 계수될 수 있다 표 4는 추가적인 트랜스펙션 지침을 제공한다.
표 4:세포의 트랜스펙션
1mL 30mL
세포 밀도 (1x106 세포/mL) 3.5x106 세포/mL 105x106 세포/mL
% LV 배양 보충물 3.5% (350 ㎕) 3.5% (1.05mL)
총 DNA(㎍)
ViraPower™:pLenti = 3:2 (㎍: ㎍)		 2.5 ㎍ (1.5㎍ + 1 ㎍) 75㎍ (45 ㎍ + 30 ㎍)
LV 트랜스펙션 시약 5㎕ 150㎕
Opti-MEM®I(복합체 형성용) 2x75 ㎕ 2x2.25mL
LV 인핸서 40㎕ 1.2mL
LV 안정화제 10㎕ 300㎕
화요일 오후에 상기 세포에 렌티바이러스 보충물를 뿌릴 수 있다. 30 mL 트랜스펙션이 선택되면, 그것은 17.5 mL에 105x106 세포/mL과 같은 고밀도 세포로 실시할 수 있다. 3.5%의 렌티바이러스 배양 보충물를 첨가할 수 있으며, 이는 30 mL의 트랜스펙션에서 1.5 mL가 될 것이다. 신선한 가온된 배양 배지는 총 25.5 mL (렌티바이러스 배양액 1.05 mL와 세포 현탁액 17.5 mL가 사용되었기 때문에, 신선한 배지 6.95 mL)까지 사용할 수 있다. 30 mL의 총 용적을 얻기 위하여 다른 4.5 mL는 DNA/시약 복합체로부터 첨가될 수 있다.
DNA/트랜스펙션 시약은 다음과 같이 제조될 수 있다. 두 개의 튜브는 Tube-1과 Tube-2로 표시될 수 있다. Tube-1:Opti-MEM® I 배지 2.25와 150㎕의 렌티바이러스 트랜스펙션 시약은 혼합될 수 있고, 상온에서 약 5 분 동안 배양하였다. Tube-2:Opti-MEM® I의 2.25 mL의 배지를 45 ㎍(㎕) ViraPower™ 렌티바이러스 패키징 믹스 (ViraPower 1㎍/㎕)와 30 ㎍(㎕)의 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP 플라스미드 (pLenti 발현 벡터 ㎍/㎕)와 함께 혼합될 수 있다. Tube-1과 Tube-2는 Tube-1 용액에 Tube-2 용액을 첨가하여 혼합함으로써, 복합될 수 있다.
복합 용액은 실온에서 10 분 동안 배양될 수 있다. 배양 10 분 후, 4.5 mL의 DNA/시약 복합체를 준비된 세포에 첨가할 수 있다.
다음날 (수요일 오전 9시에) 플라스크에 1.2 mL의 LV 인핸서를 플라스크에 추가한다.
트랜스펙션 48 시간 후 (목요일 오후, 오후 4시) 50 mL의 멸균 원뿔형 튜브에 LVVs를 수확하고, 실온에서 10 분 동안 3000rpm으로 세포를 스핀다운한다. 상청액을 수집하고 10 분 동안 3000rmp에서 다시 스핀시킨다. 상청액을 수집하고, 0.45 μM 필터를 통해 이동시킨다.
선택적으로 바이러스를 수확한 후, pH를 조절하기 위해 수집된 상청액에 렌티바이러스 안정화제를 첨가한다. 렌티바이러스 안정화제는 임의선택적으로로 수집된 상청액의 1%(~ 300 ㎕)로 첨가될 수 있다. 일부 상황에서, 바이러스를 안정화시키기 위해 생산 시스템의 pH를 약 5에서 8로 조정한다.
다음날 정제를 위해 4℃에 렌티바이러스 벡터를 저장하고, 다음과 같이 렌티바이러스 벡터의 일련 희석액에서 Ht1080 세포를 감염시켜 바이러스 역가를 측정한다.
렌티바이러스 역가(GFP+)의 측정은 다음과 같이 수행할 수 있다.
재료:
● 렌티바이러스: 세포 상층 액 또는 농축 렌티바이러스 백신 수집;
● 세포주:HT1080;
● 배양 배지:Gibco® DMEM 높은 글루코스, GlutaMAX™ 보충물, 피루베이트+ 10% FBS;
● Polybrene® (원액):멸균 H2O에서 100 ㎎/mL (Fisher Scientific NCO663391); 그리고
● 희석을 위하여 Costar 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Fisher Scientific 05539200).
1 일차(아침)에, 고-처리량 유동 분석을 위하여 96-웰 플레이트 포멧을 사용하여 렌티바이러스 역가 측정을 시작한다. 아침 11시에, 100 ㎕의 배양 배지에 7000개 세포/웰의 밀도로 HT1080 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩한다(감염시 ~ 30% 합류).
오후 4시에 다음과 같이 새로운 바이러스 희석액을 준비한다. (A) 15 mL의 새로운 배지와 10 ㎎/mL Polybrene® (8 ㎍/mL의 최종 농도) 12 ㎕를 복합시킨다. 복합되도록 볼텍스를 잘 시킨다. (B) 바이러스 샘플 당 (A)에서 준비한 배지 135 ㎕를 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 16 개 웰에 4-웰 X 4-웰 패턴으로 첨가한다 (도 6 참조). (C) 렌티바이러스 상청액 (또는 농축된 바이러스 분액)의 한 샘플 15㎕ 를 1 열의 각 웰 (각 웰의 총 부피 150㎕)에 첨가한다. (D) 피펫을 사용하여 잘 섞는다 (1:10). (E) 1열에서 2열로 15 ㎕를 옮기고, 잘 혼합시키고(1:100), 2열에서 3열로 15 ㎕를 옮기고, 잘 혼합시키고(1:1000), 3열에서 4열로 15 ㎕를 옮기고, 잘 혼합시킨다(1:10,000). 바이러스가 농축되면 더 많은 희석이 필요할 수 있다.
세포를 감염시키기 위하여, HT1080 세포로부터 플레이팅 배지를 제거하고, (가능하다면 다중채널 피펫을 사용하여) 각 웰에 대응하는 준비된 희석 100㎕를 이동시킴으로써 감염시킨다. 96-웰 감염된 세포 플레이트를 실온에서 2000rpm으로 30 분간 회전시키고, 하룻밤 동안 감염된 세포 플레이트를 배양한다.
2 일차(아침)에, 바이러스가 포함된 배지를 제거하고, 새로운 HT1080 배양 배지(Polybrene®이 없는)로 교체하고, 세포를 추가로 3 일 동안 배양하고, GFP 양성 세포의%를 분석한다 (유동 세포 계측법 분석을 사용할 수 있다).
TU/mL 단위로 역가를 산출하려면, GFP 양성%에 근거하여 사용할 적절한 희석 배수를 결정한다. 1 ~ 20% 범위의 원하는 감염 범위를 사용할 수 있다.
역가는 다음 공식으로 계산할 수 있다 :
역가 = [F * C/V] * D
F = GFP+ 세포의 빈도 (% GFP+ 세포/100)
C = 형질 도입시 웰 당 세포 수 (7000개 세포)
V = 접종물의 부피 (mL) (0.1 mL)
D = 렌티바이러스 희석 배수.
A. 제2 렌티바이러스 생산 시스템 프로토콜
제2 렌티바이러스 생산 시스템 프로토콜은 다음과 같이 수행될 수 있다.
재료
● 125mL, 250mL, 500mL 및 1L 폴리카보네이트, 일회용, 멸균, Vent-up 쉐이커 플라스크
● 온도 37℃에서 진탕, 8% CO2 및 75-80% 습도 제어된 배양기
● 세포 생존력을 결정하기 위한 장비 및 시약
프로토콜 개요
● □해동 및 회복:매 3-4 일
● □계대배양:매 3-4 일
● □사용전 배양 배지는 37℃로 가온
● □진탕 배양 속도:125mL 내지 1L 쉐이크 플라스크의 경우 125rpm
성장 특성:특수 배지에서 고농도 현탁 성장.
세포 증배 시간:
● 증배 시간 (DT):~ 24 시간
● 산출 공식:DT = T * LN (2)/LN (Xe/Xb)
● T:세포 배양 시간 -시간(hr)
● Xe:마지막 세포 밀도
● Xb:시작 세포 밀도
생존력을 보장하려면 세포가 손상되지 않도록 처음 3-4 일 동안 세포 성장과 생존력을 모니터링한다. 해동 후 24 시간에 생존율이 80%로 떨어지지만, 70% 미만으로 떨어지지 않아야 한다. 해동 후 3-4 일까지 생존율은 90-95%가 되어야 한다.
계대배양 조건. 도 7은 배양 세포를 이어지는 렌티바이러스 현탁 세포 배양 순서도를 제공한다. 계대 배양을 위해, 일부 구체예에서, 세포는 5x106 세포/mL 이상으로 성장되어서는 안된다. 세포는 계대 번호 40 이후에 폐기될 수 있다.
세포 배양을 확대. 세포는 쉐이커, 스피너 플라스크 또는 생물 반응기에서 확장될 수 있다. 해당 배양 시스템에 있어서 최적의 쉐이커, 스피너 또는 임펠러 속도 및 씨딩 밀도를 결정한다. 일부 구체예에서, 계대배양을 위하여 0.3x106 내지 6x106개의 생존 세포/mL로 씨딩한다. 최적의 진탕기 속도는 125mL내지 1L 쉐이커 플라스크에 대해 약 125 rpm이며, Celligen® 교반 탱크 바이오리액터의 최적 임펠러 속도는 70-100 rpm이다.
고려해야 할 지침. 트랜스펙션 실험에서 세포들을 사용하기 전에, 해동으로부터 세포들이 복구될 수 있도록 최소한 세 번 세포를 계대배양한다. 최상의 성능을 위해서는 세포 밀도를 3-5 x 106 세포/mL 사이로 유지시킨다. 우리는 250mL 또는 500mL 폴리카보네이트, 일회용, 멸균 삼각 플라스크에 세포를 유지하는 것이 좋다. 세포 현탁액의 작업 용적은 쉐이크 플라스크 크기의 30-40%이다. 예를 들어, 500mL의 쉐이커 플라스크, 작업량은 150mL ~ 200mL이다. 유리 플라스크를 사용할 수도 있지만, 잠재적인 독성을 피하기 위해 사용 후 철저하게 세척한다.
실시예
실시예 1. 세포 배양
LV 현탁 세포를 세포 배양 배양기 (37℃, 8% CO2, 70-80% 습도)에서 125 rpm으로 궤도 진탕기의 30-40% 쉐이크 플라스크 크기 부피에서 폴리카보네이트, 일회용 멸균 Vent-up 쉐이커 플라스크 (125 mL 내지 1 L)에서 배양시켰다. 세포는 매 3 ~ 4 일 간격으로 4 ~ 5x106/mL의 밀도로 분할하였다.
실시예 2. 렌티바이러스 생산 실험
개발 필요성에 따라, 렌티바이러스 (LV) 생산 실험은 두 가지 형식으로 진행되었다: 96-심부 웰 플레이트와 125mL 쉐이크 플라스크, 각각 1mL 및 30mL 배양 용적. 세포 밀도는 4x106/mL이었다. 렌티바이러스 벡터 (LVVs)는 공동-트랜스펙션 렌티 발현 (전달) 플라스미드 -pLenti6.3/V5-GW/EmGFP 및 렌티 패키징 플라스미드 -ViraPower 렌티바이러스 패키징 믹스에 의해 포장되며, 총 DNA는 3㎍/mL이었다. Opti-MEM® I은 트랜스펙션 시약과 DNA 희석액 모두의 경우 75㎕/mL의 DNA/시약 복합 배지였다; 총 복합체 용적은 150㎕/mL이었다. 복합화 시간은 10-20 분이었다. Expifectamine™ 293은 LV 배양 보충물 및 LV 인핸서 개발시 트랜스펙션 시약으로, 양은 5-8㎕/mL에서 가변적이었다. 5% LV 배양 보충물은 모든 발달 실험에 포함되었다. 본원에 기술된 전개 이전에, 5 mM 카페인을 LV 인핸서로서 사용하였고, 트랜스펙션 후 16-18 시간에 첨가하였다. 트랜스펙션 후 48 시간에, LVVs를 함유하는 세포 상청액은 세포를 회전시켜 수집하고, 바이러스 역가를 측정 하였다.
실시예 3: 렌티바이러스 역가 측정
렌티바이러스 역가는 Ht1080 세포를 감염시켜 측정하였다. 감염 4 시간 전에 96-웰 플레이트에서 웰당 7000개 세포를 씨딩한다. 감염시, 세포는 ~ 30%의 합류점에서 배양 용기에 부착하였다. 8㎍/mL의 Polybrene®을 함유한 배지에서 101로부터 105 까지 LVVs의 연속 희석을 수행 하였다. 세포를 104 및 105 바이러스 희석액으로 감염시켰다. 세포 감염 후, 감염된 Ht1080 플레이트를 실온에서 2000 rpm으로 30 분 동안 회전시켰다. 감염 후-18 시간에 배지를 Polybrene®이 함유되지 않은 새로운 배지로 교체했다. 세포를 추가로 72 시간 동안 배양하였고, Attune 유동 세포측정기로 GFP 양성 세포를 측정하였다. 역가는 1-20% 웰 사이에서 GFP 세포 백분율을 기준으로 산출되었다.
트랜스펙션 당일에, 3 가지 상이한 세포 밀도의 배양물 30mL를 준비하였다:125mL 쉐이크 플라스크에서 웰당 2.5x106/mL, 4x106/mL 및 5x106/mL. 각 밀도의 세포는 상이한 양의 LV 배양 보충물을 담고 있는데, 각각 30mL 당 0%, 1%, 5% 및 10%인 4 개의 플라스크가 있었다. 2.25 mL의 Opti-MEM® I 배지에 210 ㎕의 Expifectamine™ 293 (7 ㎕/mL)를 희석하고, 2.25 mL의 Opti-MEM® I 배지에 54 ㎍의 ViraPower™ 렌티바이러스 패키징 믹스와 36㎍의 pLenti/V5-GW/EmGFP 발현 벡터를 희석시키고, 이들 두 용액을 복합시키고-총 4.5mL-, 실온에서 10 분간 배양한 다음, 세포를 트랜스펙션함으로써, 배양 세포의 각 30mL은 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 48 시간 후, 세포 배양 상청액은 세포를 회전시켜 수확하였다.
렌티바이러스 생산에서 배양 보충물의 양에 대한 영향을 보여주는 결과는 도 1a에 제공된다.
다음으로, 렌티바이러스 현탁 세포를 0%에서 10% (0%, 1%, 5% 및 10%) 함유한 상이한 양의 LV 배양 보충물로 배양하고, 6 일 동안 매일 세포 밀도를 측정하였다. 결과는 도 1b에 나와 있다.
실시예 4: 새로운 트랜스펙션 시약의 스크리닝
JMP® Design of Experiments(DOE) 플랫폼을 사용하여, 세 가지 핵심 화학 물질 DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤과 같은 잠재적 트랜스펙션 시약을 사용하여 스크리닝 실험을 설계했다.
DOE 플랫폼을 사용하면 조사자가 각 매개변수를 개별적으로 가변화시키는 대신 다중 매개변수를 동시에 가변화시킴으로써, 전체적으로 최적화된 제제를 위하여 각 최적화된 매개 변수를 고려할 수 있도록 한다. 매개 변수 사이의 2 차 효과가 결과에 영향을 줄 수 있는 경우, DOE 플랫폼은 모든 후보 매개 변수를 동시에 변경함으로써, 보다 효율적이고 정확한 결과를 얻을 수 있다. DOE 플랫폼을 사용하는 실험은 실험 횟수가 적고, 기존의 실험 방법보다 경제적이다. Kauffman 등., Optimization of Lipid Nanoparticle Form㎕ations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs, NanoLetters 15:7300-7306 (2015) and supplemental materials for a theoretical discussion on DOE platforms.
DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤은 상이한 몰비로 평가하였으며, 표 5의 모든 열에서 1의 값을 갖는 성분의 합계를 사용하였다. 이 표에서 소프트웨어는 실험의 정확성을 제어하기 위하여, 1xR1 및 1xR2, 1xR6 및 1xR7 반복 운용을 실행하도록 설계되어 있다.
표 5:렌티바이러스 트랜스펙션 시약 DoE 설계
운영# DHDMS DOPE CHOL
1xR1 0.4000 0.0000 0.6000
1xR2 0.4000 0.0000 0.6000
1xR3 0.4000 0.2575 0.3425
1xR4 0.4000 0.2616 0.3384
1xR5 0.4000 0.5000 0.1000
1xR6 0.4965 0.2386 0.2649
1xR7 0.4965 0.2386 0.2649
1xR8 0.5000 0.5000 0.0000
1xR9 0.5200 0.0000 0.4800
1xR10 0.6000 0.0000 0.4000
1xR11 0.6000 0.2000 0.2000
1xR12 0.6000 0.4000 0.0000
표 5에 기초하여, 새로운 트랜스펙션 시약이 제조되었다. 이 새로운 제형화된 시약은 96-심부 웰 블록, 1mL의 배양 용적, 총 3㎍의 DNA(pLenti 발현 벡터+ ViraPower™ 패키지 믹스, 두 벡터는 2:3(중량:중량) 비율)에서 pLenti/V5-GW/EmGFP 발현 벡터 및 ViraPower™ 렌티바이러스 패키지 믹스를 공동-트랜스펙션시킴으로써, GFP LVVs를 패키지하는데 사용되었고, 5㎕/mL 및 6㎕/mL 양의 트랜스펙션 시약이 4x106/mL의 세포 밀도 및 5%의 LV 배양 보충물과 함께 연구되었다. 도 2a에 도시된 결과는 이들 두 양에서의 평균이며, TU/mL로 판독되었다.
이 DoE 결과를 바탕으로, DOPE가 포함된 DHDMS, 콜레스테롤이 첨가된 DHDMS, DOPE 및 콜레스테롤이 첨가된 DHDMS와 같은 다양한 조합의 시험 화합물을 더 만듦으로써 더 많은 시약을 설계했다. 각 시약 그룹을 30 mL 생산 형식으로 시험하고, 대조군 시약으로 리포팩타민을 사용했다. 우리는 트랜스펙션의 다른 두 조합과 비교하였을 때, DOPE와 DHDMS의 조합, 구체적으로 0.65의 DHDMS와 0.35의 DOPE의 몰비에서 가장 높은 성능을 나타냄을 발견했다.
성능 및 제제 조성물에 기초하여, 12 개의 시약을 선택하였고, 이 베이크-오프 작업에서의 렌티바이러스 트랜스펙션 시약을 표 6에 나타내었다. 결과를 도 2b에 나타내었다.
표 6:렌티바이러스 트랜스펙션 시약 베이크-오프 조합
운영# DHDMS DOPE CHOL
2bxR5 0.406 0.131 0.463
2bxR8 0.413 0.077 0.510
2bxR13 0.473 0.228 0.299
2bxR14 0.512 0.208 0.279
2bxR15 0.519 0.126 0.355
mxR2 0.483 0.231 0.285
mxR4 0.497 0.239 0.265
mxR5 0.519 0.279 0.201
mxR7 0.550 0.450 0.000
mxR10 0.577 0.294 0.129
mxR11 0.600 0.000 0.400
mxR16 0.650 0.350 0.000
실시예 5: 렌티바이러스 인핸서의 동정
렌티바이러스 인핸서는 다음 실험을 사용하여 동정되었다. 두 개의 96-심부 블록은 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP 및 ViraPower Lentivirus 패키징 믹스와 복합된 Expifectamine™ 293 트랜스펙션 시약으로 트랜스펙션하였다. 각 웰 (1 mL 반응)의 경우, 두 용액을 합하였다: 총 150㎕ 컴플렉스의 경우, 75 ㎕의 Opti-MEM® I 배지에서 7 ㎕의 Expifectamine™ 293과 Opti-I MEM® 75 ㎕에서 3 ㎍ 총 DNA (1.2ug pLenti 발현 벡터와 1.8 ㎍ ViraPower™ 믹스). 세포를 5% LV 배양 보충물과 함께, 4 Х 106/mL로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 16 시간 후, JMP®의해 설계 제조된 렌티바이러스 인핸서는 표 7에 따른 각 렌티바이러스 인핸서에 대하여 삼중으로 첨가하였다.
표 7:렌티바이러스 인핸서 DoE
운영# 발프로산 프로피온산 나트륨 부틸산 나트륨 카페인
1xR1 0 7.5 0 0
1xR2 0 7.5 0 1.5
1xR3 0 7.5 0 1.5
1xR4 0 7.5 3 0
1xR5 0 7.5 3 0.75
1xR6 0 7.5 3 1.5
1xR7 0 11.25 3 0
1xR8 0 15 0 0
1xR9 0 15 0 0
1xR10 0 15 0 1.5
1xR11 0 15 1.5 1.5
1xR12 0 15 3 0
1xR13 0 15 3 1.5
1xR14 0.5 7.5 1.5 0
1xR15 0.5 11.25 1.5 0.75
1xR16 0.5 11.25 1.5 0.75
1xR17 0.5 11.25 3 1.5
1xR18 0.5 15 0 1.5
1xR19 0.5 15 3 0.75
1xR20 1 7.5 0 0
1xR21 1 7.5 0 1.5
1xR22 1 7.5 3 0
1xR23 1 7.5 3 0.75
1xR24 1 7.5 3 1.5
1xR25 1 11.25 0 0.75
1xR26 1 11.25 3 0
1xR27 1 15 0 0
1xR28 1 15 0 1.5
1xR29 1 15 1.515 1.5
1xR30 1 15 3 0
1xR31 1 15 3 1.5
R_ctrl 0 0 0 5
트랜스펙션 48시간 후, 렌티바이러스 역가 분석이 수행되었다. 결과를 도 3a에 나타내었다.
결과는 jmp로 분석되었고, 예측 프로파일러는 도 3b에 그래프로 나타냈다. 2 차 DoE가 최적화된 조건으로 아래와 같이 설계되고 분석되었다 (표 8 참조).
표 8:인핸서 2차 DoE
운영# 프로피온산 나트륨 부틸산 나트륨 카페인
2xR1 3.00 1.00 0.50
2xR2 3.00 1.00 1.50
2xR3 3.00 1.50 0.50
2xR4 3.00 2.00 0.50
2xR5 3.00 2.00 1.00
2xR6 3.00 2.00 1.50
2xR7 6.50 1.50 1.00
2xR8 6.50 1.50 1.00
2xR9 6.50 2.00 0.50
2xR10 10.00 1.00 0.50
2xR11 10.00 1.00 1.50
2xR12 10.00 1.50 0.50
2xR13 10.00 2.00 0.50
2xR14 10.00 2.00 1.00
2xR15 10.00 2.00 1.50
결과를 jmp 로 분석하였고, 예측 프로파일러를 도 3c에서 그래프로 나타냈다.
실시예 6: 렌티바이러스 생산 시스템 비교
우리는 렌티바이러스 생산을 위한 PEI-매개된 (25KD 선형 중합체) 그리고 Lipofectamine™ 2000-매개된 (L2K) 트랜스펙션 기술과 함께, 트랜스펙션 시약으로 Lentivectamine™, Thermo Fisher (LVR)을 이용하고, 트랜스펙션 시약을 가변화시키고, 생산 공정에 렌티바이러스 배양 보충물, 렌티바이러스 인핸서, 및/또는 부틸산 나트륨을 포함하거나 또는 포함하지 않는 것의 공정을 가변화시킴으로써, 새로 개발된 현탁 렌티바이러스 생산 시스템을 비교했다.
LV293 시스템에서의 트랜스펙션은 다음과 같이 수행 하였다. 이 시스템은 125mL 쉐이크 플라스크였고, 30mL LV 생산량이다. 293F 세포로부터 유래된 LV293 세포는 트랜스펙션 시 3.5M/mL의 밀도로 씨딩하였다. 사용할 때 렌티바이러스 배양 보충물의 최종 농도는 3.5%이었으며, 강화제는 4%이었고, 부틸산 나트륨은 5mM이었다. 배양 보충물은 ExpiCHO™-Feed이고, 렌티바이러스 인핸서는 4.53 mM 프로피온산 나트륨, 2.0 mM 부틸산 나트륨 및 1.5 mM 카페인이다.
간략하게 설명하자면, 세포를 트랜스펙션 당일에 계수하고, 필요할 때마다 배양 보충물과 함께, 최종 25.5mL 시스템으로 희석시켰다. Tube A:트랜스펙션 시약 (LVR 또는 L2K (Lipofectamine 2000))를 2.25mL Gibco™ Opti-MEM™에서 혼합하고, 실온에서 5 분간 배양시킨다. Tube B:DNA 혼합물 (ViraPower™ 렌티바이러스 혼합물 45㎍ 및 30㎍ pLenti6.3/V5-GW/GFP)을 또 다른 2.25mL Gibco™ Opti-MEM™으로 희석했다. 그 다음 Tube B를 Tube A에 넣고 혼합하고, 실온에서 10 분간 배양하였다. 최종 혼합물 (약 4.5 mL)을 준비된 세포에 첨가하였다. 트랜스펙션 16 시간 후1.2mL (생산 용적의 4%) 인핸서를 필요할 때 첨가했다. 시료에서 요구될 때 부틸산 나트륨은 트랜스펙션 24 시간 후에 추가되었다. 트랜스펙션 48 시간 후, 상청액을 수확하고 역가를 기술된 바와 같이 수행하였다.
293F 세포에서의 트랜스펙션을 위해, 최종 세포 밀도는 1M/mL이었다. 총 DNA 양은 1㎍/mL로 감소되었다 (30mL 시스템의 경우 18㎍의 ViraPower ™ 렌티바이러스 혼합물 및 12㎍의 pLenti6.3/V5-GW/GFP). 다른 명시가 없는 한, 트랜스펙션 및 바이러스 수확 절차는 LV293 시스템에서와 동일하다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 우리의 렌티바이러스 생산은 다른 두 시스템보다 우수하다.
실시예 7: 제1 렌티바이러스 생산 프로토콜
렌티바이러스 현탁 세포의 배양은 다음 지침을 따랐다. 상기 세포를 렌티바이러스 현탁 배양 표준 프로토콜에 따라 성장시켰다. 세포는 일반적으로 3-4 일 마다, 약 4x106 ~ 5x106 생존 세포/mL 밀도에 도달될 때 계대 배양했다. 세포 배양은 배양 약 3 또는 4 일 후에, 세포를 0.3x106 내지 0.6x106 로 분할하였다. 세포 성장은 매일 같은 시간에 세포를 계수하여 관찰하였다. 세포 배증 시간은 약 24 시간이었다. 해동 날짜로부터 2 주 후에, 세포는 렌티바이러스 생산 준비가 되었다. 세포 배양 중에 궤도 진탕기는 125mL내지 1L 쉐이커 플라스크의 경우 약 125rpm으로 사용되었다. 배양기는 약 37 ℃, 약 8%의 CO2, 75-80% 습도로 설정 하였다. 배양액을 사용하기 전에 약 37℃ 수조에서 가온하였다.
시약 및 방법 :
● 125mL 폴리카보네이트, 일회용, 무균, Vent-up Erlenmeyer 쉐이크 플라스크;
● 15mL 멸균 원뿔 튜브;
● 50mL 멸균 원뿔 튜브;
● Opti-MEM™ I 배지;
● Lenti 발현 (전송) 벡터:pLENTI6.3/V5-GW-EmGFP;
● Lenti 패키지 믹스:ViraPower™ 렌티바이러스 패키지 믹스;
● 렌티바이러스 현탁 세포;
● 렌티바이러스 배양 보충물;
● 렌티바이러스 트랜스펙션 시약;
● 렌티바이러스 인핸서
● (선택 사항) pH 조절을 위한 렌티바이러스 안정화제
예를 들어, 금요일 아침 세포가 0.6x106 세포/mL의 세포 수로 분할되면, 1L 플라스크내 약 250 mL 배양 배지에서 3 일 동안 배양할 수 있다. 월요일 아침 오전 10:00에, 예를 들면, 세포는 세포를 계수함으로써 준비되고, 약 4.5x106 세포/mL의 세포 밀도를 기대할 수 있다. 세포를 신선한 가온된 배지에서 3.0x106 세포/mL로 희석하고, 추가 30 시간 동안 배양시킬 수 있다.
트랜스펙션은 화요일 오후 4시에 실시할 수 있다. 세포는 예상된 약 5.5 내지 6.0x106 세포를 계수될 수 있다. 표 9는 추가적인 트랜스펙션 지침을 제공한다.
표 9:세포의 트랜스펙션
1mL 30mL
세포 밀도 (1x106 세포/mL) 3.5x106 세포/mL 105x10 6 세포/mL
% LV 배양 보충물 3.5% (350 ㎕ ) 3.5% (1.05mL)
총 DNA (㎍)
ViraPower™:pLenti = 3:2 (㎍: ㎍)		 2.5 ㎍ (1.5 ㎍ + 1 ㎍) 75㎍ (45 ㎍ + 30 ㎍)
LV 트랜스펙션 시약: 5㎕ 150㎕
Opti-MEM™ I (복합체 형성용) 2x75 ㎕ 2x2.25mL
LV 인핸서 40㎕ 1.2mL
LV 안정화제 10㎕ 300㎕
화요일 오후에 세포에 렌티바이러스 보충물를 씨딩하였다. 30 mL 트랜스펙션이 선택되면, 트랜스펙션은 17.5 mL에 105x106 세포/mL의 고밀도 세포와 함께 실시할 수 있다. 3.5% 렌티바이러스 배양 보충물이 첨가되었으며, 이는 30 mL 트랜스펙션에서 1.5 mL가 될 것이다. 새로운 가온 배양 배지를 사용하여 총 체적이 25.5 mL (렌티바이러스 배양액 1.05 mL와 세포 현탁액 17.5 mL를 사용했기 때문에, 새로운 배지는 6.95 mL)되도록 사용했다. 30 mL의 총 용적을 얻기 위한 다른 4.5 mL를 DNA/시약 복합체로부터 첨가하였다.
DNA/트랜스펙션 시약은 다음과 같이 제조 하였다. 2 개의 튜브는 Tube-1 및 Tube-2로 명명되었다. Tube-1:2.25의 Opti-MEM™ I 배지 및 150 ㎕의 렌티바이러스 트랜스펙션 시약을 혼합하고, 실온에서 약 5 분 동안 배양하였다. Tube -2:2.25mL의 Opti-MEM™ I 배지를 45 ㎍ (㎕)의 ViraPower™ 렌티 패키징 믹스(ViraPower™ 1 ㎍/㎕)와 30 ㎍ (㎕)의 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP 플라스미드 (pLenti 발현 벡터 1㎍/㎕)와 함께 혼합하였다. Tube-1과 Tube-2는 Tube-1 용액에 Tube-2 용액을 첨가함으로써 복합되었다.
상기 복합 용액을 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 배양 10 분 후, 4.5 mL의 DNA/시약 복합체를 준비된 세포에 첨가하였다.
다음날 (수요일 아침, 오전 9시), 1.2 mL의 LV 인핸서를 플라스크에 넣었다.
트랜스펙션 48 시간 후 (목요일 오후, 오후 4시), 50 mL 멸균 원뿔 튜브에서 LVV를 수확하고, 실온에서 10 분 동안 3000 rpm으로 세포를 회전시켜 가라앉혔다. 상청액을 모으고, 3000rpm에서 10 분간 다시 회전시켰다. 상청액을 모으고, 0.45μM 필터를 통과시켰다.
바이러스가 수확된 후, pH를 조절하기 위해 수집된 상청액에 렌티바이러스 안정화제를 추가했다. 렌티바이러스 안정화제는 수집된 상청액 (~ 300 ㎕)의 1%로 첨가하였다. 어떤 상황에서는 바이러스를 안정화하기 위해, 생산 시스템 pH를 약 5에서 8로 조정했다.
다음 날의 정제를 위해 4 ℃에서 렌티바이러스 벡터를 저장하고, 실시예 8에 기술된 바와 같이 렌티바이러스 벡터의 연속 희석에서 Ht1080 세포를 감염시킴으로써 바이러스 역가를 측정하였다.
실시예 8: 실시예 7의 생산물로부터의 렌티바이러스 역가 (GFP+)의 측정
렌티바이러스 역가 (GFP+)의 측정은 다음과 같이 실시하였다.
재료:
● 렌티바이러스 (Lentivirus):세포 상층액 또는 농축된 렌티바이러스 백신 수집;
● 세포주:HT1080;
● 배양 배지:Gibco™ DMEM 높은 글루코스, GlutaMAX™ 보충물, 피루베이트 + 10% FBS;
● Polybrene™ (원액):100 ㎎/mL의 멸균 H2O (Fisher Scientific NCO663391); 그리고
● 희석용 Costar® 96-웰 둥근 바닥 판 (Fisher Scientific 05539200).
1 일차 (아침)에, 우리는 고-처리량 유동 분석을 위해 96-웰 플레이트 포맷을 사용하여 렌티바이러스 역가 측정을 시작했다. 아침 11시에 우리는 배양 배지 100 ㎕에 7000 세포/웰의 밀도(감염 시점에서 30% 합류)로 HT1080 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩했다.
오후 4시에 다음과 같이 새로운 바이러스 희석액을 준비했다. (A) 우리는 15mL의 새로운 배양 배지와 10mg/mL Polybrene® (최종 농도 8㎍/mL) 12㎕를 복합시켰다 . 복합되도록 잘 볼텍스하였다. (B) 바이러스 당 샘플은 4-웰 X 4-웰 패턴 (도 6 참조)으로 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 16 개 웰에 (A)에서 제조된 배지 135㎕를 첨가하였다. (C)는 1열 각 웰로 렌티바이러스 상청액(또는 농축 바이러스 분취액)의 한 가지 시료 15㎕를 추가한다 (각 웰의 총 부피가 150 ㎕). (D) 피펫을 사용하여 잘 혼합한다 (1:10). (E) 1열에서 2열로 15 ㎕를 옮기고, 잘 혼합시키고(1:100), 2열에서 3열로 15 ㎕를 옮기고, 잘 혼합시키고(1:1000), 3열에서 4열로 15 ㎕를 옮기고, 잘 혼합시킨다(1:10,000). 바이러스가 농축되면 더 많은 희석이 필요할 수 있다.
세포를 감염시키기 위해, HT1080 세포에서 배양 배지를 제거하고, 준비된 희석액 100 ㎕를 해당 웰로 옮겨 감염시킨다 (가능한 경우 다중채널 피펫을 사용). 96-웰 감염된 세포 플레이트를 실온에서 2000rpm으로 30 분간 회전시키고, 감염된 세포 플레이트를 하룻밤 동안 배양하였다.
2 일째 (아침) 바이러스를 함유한 배지를 제거하고, 새로운 HT1080 배양 배지 (Polybrene®없이)로 대체한 후, 세포를 추가로 3 일 동안 배양하여, GFP 양성 세포의%를 분석하였다 (유동 세포 계측법 분석이 이용될 수 있음).
TU/mL 단위로 역가를 산출하기 위해, % GFP 양성에 근거하여 사용할 적절한 희석 배수를 결정했다. 1 ~ 20%의 원하는 감염 범위가 사용되었다.
역가는 다음 공식으로부터 산출되었다 :
역가 = [F * C/V] * D
F = GFP+ 세포의 빈도 (% GFP+ 세포/100)
C = 형질도입시 웰 당 세포 수 (7000개 세포)
V = 접종물의 용적 (mL) (0.1 mL)
D = 렌티바이러스 희석 인자.
96-웰 프로토콜을 사용하여 하기 계산을 수행하였다 (표 10 참조) :
표 10:렌티바이러스 역가 계산
렌티바이러스 희석 % EmGFP 양성 세포
102 96%
103 65%
104 18%
% EmGFP 양성 세포 값이 원하는 1-20% 범위 내에 있기 때문에 104 가 계산에 선택되었다.
F = 18/100
C = 7000
V = 0.1
D = 104
역가 = (0.18 * 7000/0.1) * 104 = 1.26x108 TU/mL
등가물
전술 한 명세서는 당업자가 실시예를 실시할 수 있도록 하기에 충분하다고 여겨진다. 전술한 설명 및 실시예는 특정 실시예를 상세하게 설명하고 발명자들에 의해 고안된 최상의 모드를 설명한다. 그러나, 전술한 내용이 어느 정도 상세히 기술되어 있더라도, 실시예는 많은 방식으로 실시될 수 있으며, 첨부된 청구 범위 및 그 등가물에 따라 해석되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 명시적으로 표시되는 지의 여부와 상관없이 예를 들어, 정수, 분수 및 백분율을 포함하는 수치를 나타낸다. 용어는 일반적으로 당업자가 열거된 값과 동등한 것으로 생각할 수 있는 수치 범위 (예를 들어, 인용된 범위의 +/-5 내지 10%)를 의미한다 (예를 들어, 동일한 기능 또는 결과 ). 적어도 숫자 값 또는 범위 목록 앞에 오는 용어는 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수정한다. 경우에 따라 "약"이라는 용어에는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 숫자 값이 포함될 수 있다.

Claims (59)

  1. 렌티바이러스 벡터 생산 시스템으로서,
    a. 세포 성장을 조절하는 렌티바이러스 배양 보충물, 여기서 상기 렌티바이러스 배양 보충물은 아미노산 및 당원(sugar sources)을 포함하고 1000 mOsm/kg 내지 1500 mOsm/kg의 삼투압을 가짐;
    b. 양이온성 지질 및 적어도 하나의 헬퍼 및/또는 중성 지질을 포함하는 지질 응집체,
    c. 프로피온산 나트륨, 부티르산 나트륨 및 카페인을 포함하는 렌티바이러스 생산 인핸서; 및
    d. 293 세포를 포함하되,
    상기 렌티바이러스 벡터 생산 시스템은 무-혈청인, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DHDMS를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 헬퍼 및/또는 중성 지질은 DOPE; 또는 DOPE 및 콜레스테롤을 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 항에 있어서, 상기 293 세포는 현탁 배양에서 성장되는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 293 세포는 293F 세포인, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 293F 세포는 1x106 내지 20x106 밀도로 성장할 수 있고, 이들 세포는 5일 후 20% 미만이 사멸하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 렌티바이러스 배양 보충물이
    디펩티드, 당 알코올 및 탄소원으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물은 글루코스를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물은
    a. 미네랄, 또는 미량 금속, 또는 미네랄 및 미량 금속 둘다, 또는
    b. 비타민, 또는 비타민 전구체, 또는 비타민 및 비타민 전구체 둘다를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물은 1% 내지 10%, 또는 1%, 3.5%, 5% 또는 10% 부피/부피로 첨가되는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물 중 상기 글루코스의 삼투압은 500 mOsm/kg 내지 700 mOsm/kg, 550 mOsm/kg 내지 650 mOsm/kg, 또는 575 mOsm/kg 내지 625 mOsm/kg이거나, 또는 상기 렌티바이러스 배양 보충물 중의 상기 글루코스 농도는 85 mg/mL 내지 115 mg/mL, 90 mg/mL 내지 110 mg/mL, 또는 95 mg/mL 내지 105 mg/mL인, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물은 1100 mOsm/kg 내지 1400 mOsm/kg, 또는 1200 mOsm/kg 내지 1300 mOsm/kg의 삼투압, 또는 이들 사이의 임의의 삼투압 또는 범위의 삼투압, 또는 1100 mOsm/kg, 1150 mOsm/kg, 1200 mOsm/kg, 1250 mOsm/kg, 1300 mOsm/kg, 1350 mOsm/kg, 1400 mOsm/kg, 1450 mOsm/kg, 또는 1500 mOsm/kg의 삼투압을 갖는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 인핸서는 발프로산을 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로피온산 나트륨은 3 내지 15 mM, 또는 3 내지 5 mM, 또는 5 내지 8 mM로 포함되고, 또는 부티르산 나트륨은 1.5 내지 3 mM, 또는 1.5 내지 2.5 mM, 또는 2.5 mM 내지 3 mM로 포함되고, 또는 카페인은 0.75 내지 3 mM, 또는 2 내지 3 mM, 또는 1 내지 2 mM로 포함되는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로피온산 나트륨은 3 내지 15 mM로 포함되고 부티르산 나트륨은 1.5 내지 3 mM으로 포함되고 카페인은 0.75 내지 3 mM로 포함되는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물의 각 아미노산은 0.1 mg/ml 내지 8 mg/ml의 농도를 가지는, 렌티바이러스 벡터 생산 시스템.
  17. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 벡터 생산 시스템을 사용함을 포함하는 렌티바이러스 벡터 생산 방법.
  18. 렌티바이러스 벡터 생산 방법으로서,
    무-혈청 배지에서 293 세포를 현탁 배양하는 단계,
    세포 성장을 조절하기 위해 렌티바이러스 배양 보충물을 제공하는 단계로서, 상기 보충물은 아미노산 또는 디펩티드; 및 당원, 당 알코올 및 탄소원으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고, 상기 보충물은 1000 mOsm/kg 내지 1500 mOsm/kg의 삼투압을 갖는, 상기 보충물을 제공하는 단계,
    양이온성 지질 및 적어도 하나의 헬퍼 및/또는 중성 지질을 포함하는 트랜스펙션(transfection) 시약을 사용하여 상기 세포를 렌티바이러스 벡터로 트랜스펙션하는 단계, 및
    렌티바이러스 생성을 촉진할 수 있는 프로피온산 나트륨, 부티르산 나트륨 및 카페인을 포함하는 렌티바이러스 생산 인핸서를 제공하는 단계를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 생산 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 세포는 1x106 내지 20x106 세포/mL의 세포 밀도를 갖는 현탁 세포 배양물에서 성장되는, 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 293 세포는 293F 세포인, 방법.
  21. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물은 1% 내지 10%, 또는 1%, 3.5%, 5% 또는 10% 부피/부피로 첨가되는, 방법.
  22. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DHDMS를 포함하는, 방법.
  23. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 하나 이상의 헬퍼 및/또는 중성 지질은 DOPE; 또는 DOPE 및 콜레스테롤을 포함하는, 방법.
  24. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 배양 보충물은 세포 배양 배지에서 세포 씨딩(seeding) 후 24 내지 36 시간 후에 첨가되는, 방법.
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