CN109890959A - 慢病毒生产用的无血清悬浮液系统 - Google Patents

慢病毒生产用的无血清悬浮液系统 Download PDF

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Abstract

一种慢病毒载体生产系统，其包括(a)控制细胞生长的慢病毒培养补充物，(b)提高转染效率的转染试剂，其包括DHDMS、DOPE和胆固醇，(c)促进慢病毒生产的慢病毒生产增强剂，其包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因，其中所述慢病毒载体生产系统是无血清的。一种慢病毒载体生产方法，其包括使用所述慢病毒生产系统。慢病毒载体生产用的另一种方法包括(a)在无血清培养基中培养真核细胞，(b)提供控制细胞生长的慢病毒培养补充物，(c)使用提高转染效率的包括DHDMS、DOPE和胆固醇的转染试剂用慢病毒载体转染所述细胞，以及(d)使用能够促进慢病毒生产的包括丙酸钠、丁酸钠的慢病毒生产增强剂提供慢病毒生产。

Description

慢病毒生产用的无血清悬浮液系统
技术领域
新型慢病毒载体生产系统采用大规模无血清悬浮液。
背景技术
最近，慢病毒载体已经成为在基因治疗中用作基因转移载体的关注中心。目前的一种新一代疗法，CAR-T细胞疗法使用慢病毒载体作为有效的基因转移工具，在T细胞表面上表达工程化的嵌合抗原受体(CAR)，以识别和杀死癌细胞。因此，临床前和临床研究人员已经要求在更大规模、高效价和无动物血清的培养基中生产慢病毒。慢病毒生产有助于开发CAR-T细胞疗法的高成本。
目前的慢病毒生产系统主要使用贴壁细胞，其需要胎牛血清以支持烧瓶或细胞工厂中的细胞生长。此系统适用于小规模但不是大规模的研究目的，需要大型培养箱和大型细胞培养容器。培养贴壁细胞对于操作者来说更难并且需要更多努力以产生大量的慢病毒载体，从而增加了成本。
咖啡因以前用于增强基于血清的培养系统中的慢病毒载体产生，但示出丁酸钠，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂仅以咖啡因的约50％起作用。Ellis等人，“用咖啡因制造更高效价的慢病毒(Creating Caitine Lentivirus with Caffeine)”，《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》22:93-100(2011)。
我们已经开发了一种新的慢病毒系统，用于在无血清悬浮平台和高效价下生产载体。此技术采用了新开发的一套优良制造工艺(GMP)试剂，所述试剂包括新培养基、新细胞、新转染试剂、新的慢病毒增强剂和任选稳定剂，以在4℃条件下稳定未纯化的慢病毒载体24小时到48小时。使用这种新系统，我们能够递送～1.5E+08(TU/ml)的非浓缩慢病毒载体。
发明内容
根据描述，一种慢病毒载体生产系统，其包括：
慢病毒培养补充物，其用于控制细胞生长，
转染试剂，其包括DHDMS和至少一种辅助剂和/或中性脂质，
慢病毒生产增强剂，其包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因，
其中所述慢病毒载体生产系统是无血清的。
在一些实施例中，其中所述至少一种辅助剂和/或中性脂质包括DOPE。在一些实施例中，所述至少一种辅助剂和/或中性脂质包括DOPE和胆固醇。
在一些实施例中，所述系统被设计用于在悬浮293细胞、293F细胞或其衍生物中生产慢病毒。
在一些实施例中，所述293F细胞或由其衍生的细胞能够以约1×106到约20×106的密度生长，5天之后细胞死亡小于20％。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物包括：氨基酸和/或二肽和糖源、糖醇和/或碳源。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物包括氨基酸和葡萄糖。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约1％到约10％添加。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物中所述葡萄糖的渗透压为约500mOsm/kg到约700mOsm/kg、约550mOsm/kg到约650mOsm/kg、约575mOsm/kg到约625mOsm/kg。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物中所述葡萄糖的浓度为约85mg/ml到约115mg/ml、约90mg/ml到约110mg/ml、约95mg/ml到约105mg/ml。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物的渗透压为约1000mOsm/kg到约1500mOsm/kg、约1100mOsm/kg到约1400mOsm/kg、约1200mOsm/kg到约1300mOsm/kg或其间的任何渗透压或范围。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物的渗透压为约1100mOsm/kg、约1150mOsm/kg、约1200mOsm/kg、约1250mOsm/kg、约1300mOsm/kg、约1350mOsm/kg、约1400mOsm/kg、约1450mOsm/kg、约1500mOsm/kg。
在一些实施例中，包含约0.4mM到0.6mM的DHDMS。在一些实施例中，包含约0.2mM/mL到0.5mM/mL的DOPE。在一些实施例中，包含约0.1mM/mL到0.6mM/mL的胆固醇。在一些实施例中，所述独特的辅助剂和/或中性脂质是DOPE。
在一些实施例中，所述慢病毒增强剂包括丙戊酸。在一些实施例中，丙酸钠和/或丁酸钠以水溶液形式提供。在一些实施例中，咖啡因以慢病毒表达培养基提供。在一些实施例中，包含约3mM到15mM的丙酸钠。在一些实施例中，包含约1.5mM到3mM的丁酸钠。在一些实施例中，包含约0.75mM到3mM的咖啡因。在一些实施例中，包含约0.5mM到1mM的丙戊酸。
在一些实施例中，用于慢病毒载体生产的方法包括使用本文所述的任何慢病毒载体生产系统。
在一些实施例中，用于慢病毒载体生产的方法包括在无血清培养基中培养真核细胞，提供用于控制细胞生长的慢病毒培养补充物，使用包括用于提高转染效率的DHDMS、DOPE和胆固醇的转染试剂用慢病毒载体转染细胞，并提供包括能够促进慢病毒生产的丙酸钠、丁酸钠和咖啡因的慢病毒生产增强剂。
在一些实施例中，所述培养的真核细胞处于适于在高密度条件下生长的悬浮培养物中。在一些实施例中，所述细胞在细胞密度为至少约1×106个到20×106个细胞/mL的悬浮细胞培养物中生长。
在一些实施例中，所述方法用于培养293细胞、293细胞的衍生物、293F细胞或293F细胞的衍生物。
在一些实施例中，所述方法可以产生约2.5×108TU/ml的未浓缩的慢病毒载体。在一些实施例中，所述悬浮细胞培养物的体积为约10mL到约5L。在一些实施例中，5天之后细胞存活率为至少80％。
本公开另外的目的和优势将在下面的说明书中被部分地阐述，且有些在说明书中会是明显的，或可以通过实施被了解。目的和优势将借助于附上的权利要求中特别指出的元素和组合实现和获得。
应当理解前述一般描述和下面详细描述都仅为示例性的和解释性的，并且不限制权利要求。
并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出一个(几个)实施例，并且与描述一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A和1B示出了培养补充物在慢病毒生产中的影响。
图1A：在病毒生产时，向培养基提供具有各种细胞密度的1％、5％和10％的ExpiCHOTM-Feed培养补充物。转染后48小时，收集慢病毒载体并分别测量效价。
图1B：在各种量的ExpiCHOTM-Feed补充物存在下监测悬浮细胞存活率。
图2A到B示出了新转染试剂的筛选。
图2A：在此实验中筛选了实验设计(DoE)设计的新转染试剂。设计了总共12个候选物，并且选择了12个新转染试剂中的8个用于下一次DoE操作。
图2B：进行了几次设计的DoE实验(数据未显示)。基于性能和配制品组成选择12种试剂。
图3A到3C示出了慢病毒增强剂的识别。通过使用软件为DoE设计了用于识别新的慢病毒增强剂前导序列的粘接实验。
图3A：测试了包含对照慢病毒增强剂的32种候选物。
图3B和图3C示出了的分析和来自两个DoE增强剂实验的预测分析图。
图4提供了慢病毒生产系统比较的结果。具体地说，它示出了使用不同转染试剂、存在或不存在慢病毒培养补充物、存在或不存在慢病毒增强剂以及存在或不存在丁酸钠的每ml慢病毒载体的效价。
图5提供了无血清大规模悬浮慢病毒生产方案的一个实施例。
图6提供了用于测量慢病毒效价的4孔×4孔模式实例6。
图7提供了对应于实例7的慢病毒悬浮细胞培养流程图。
具体实施方式
I.慢病毒生产系统
A.细胞
如本文所用，术语“细胞”是指包含所有类型的真核和原核细胞。在一些实施例中，术语是指真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。在某些示例性但非限制性实施例中，术语“细胞”意指人胚胎肾(HEK)或人293细胞或其变体，如例如可以悬浮生长的293变体。在一些实施例中，可以在悬浮培养物中生长、增殖和转染的293细胞的变体，特别是可以以高密度培养的那些变体(例如≥约2×106细胞/ml，≥约3×106细胞/ml，或甚至任选地≥约4×106细胞/ml或约20×106细胞/ml)。这种变体的实例是293F细胞，如EXPI293TM F细胞。
在一些实施例中，当在培养细胞和进行转染工作流程的背景下使用时，术语“高密度”通常是指已知细胞系或已知细胞系的变体，其可以在合适的细胞培养基中生长或培养到密度≥约1×106个细胞/ml，≥约2×106个细胞/ml，≥约3×106个细胞/ml，或者甚至任选地≥约4×106个细胞/ml，或≥约20×106个细胞/ml，同时仍然保持高效转染的能力，并且能够以高水平表达目标蛋白质(例如，水平为或高于200μg/ml到高达约1mg/ml或更高)。
在一些实施例中，细胞适于高密度细胞培养。这是指衍生自相同亲代细胞谱系的细胞谱系或(非克隆)细胞群，其已经适于在高密度培养基中以高密度生长，同时保持细胞存活率为或高于约80％。通过将细胞维持在高密度≥约40次、50次、60次、70次或80次连续传代，并逐渐用所需的高密度培养基替换生长培养基的比例，可以从亲代细胞群分离或选择这种细胞。任选地，在过程期间，不同的细胞池可以个别地繁殖且经历选择程序，同时同步评估转染效率和或慢病毒载体生产效率，使得可以选择非克隆细胞群，其可以以高密度维持并生长、高效转染，并表达高水平的所需重组蛋白。尽管熟练的从业者将容易地显而易见多种细胞类型和谱系可以经历这种选择程序，但已经确定，衍生自293成纤维细胞的细胞谱系特别适合于适应高密度生长条件的选择过程。在一些情况下，适合于高密度生长培养并适合于本文使用的细胞也能够以高效率转染和/或能够以超过至少约200μg/mL细胞培养物到约2mg/mL细胞培养物，更通常约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间的产率表达重组蛋白。在一些情况下，适用于高密度培养的细胞能够以约1×106个到约20×106个细胞/ml、约2×106个到约2×106个细胞/ml或约2.5×106个到约6×106个细胞/mL的密度维持和转染。在一些实施例中，细胞可以适于高密度培养，并以约1×106到约20×106、约1×106到约4×106、约1×106到约3×106、约1×106到约2×106的密度转染。
在一些实施例中，在悬浮培养物中生长细胞。这包含细胞培养物，其中培养容器中的大部分或全部细胞以悬浮液形式存在，并且培养容器中的少数细胞或没有细胞附着于容器表面或容器内的另一个表面。在一些实施例中，悬浮培养物具有≥约75％的培养容器中的细胞处于悬浮状态，未附着于培养容器上或培养容器中的表面。在一些实施例中，悬浮培养物具有≥约85％的培养容器中的细胞以悬浮液形式存在，未附着于培养容器上或培养容器中的表面。在一些实施例中，悬浮培养物具有≥约95％的培养容器中的细胞以悬浮液形式存在，未附着于培养容器上或培养容器中的表面。
慢病毒载体生产系统允许其中293F细胞或由其衍生的细胞能够以约1×106到约20×106的密度生长，5天之后细胞死亡少于20％。
B.慢病毒培养补充物
慢病毒生产系统包含慢病毒培养补充物。慢病毒培养补充物用于控制细胞生长，在生产时间期间减缓细胞生长并允许最大限度地生产慢病毒载体生产并最小化未被转染细胞“吞噬”的病毒。参见图1A和1B。
在某些实施例中，慢病毒培养补充物包括细胞培养饲料，任选地包括葡萄糖和氨基酸。一种示例性细胞培养补充物或饲料是CTSTM LV-MAXTM，而另一种示例性细胞培养补充物或饲料是ExpiCHOTM饲料(ExpiCHOTM表达系统中的Thermo Fisher Scientific产品)。
在一些实施例中，慢病毒培养补充物包括氨基酸、二肽、糖源、糖醇和碳源。在一些实施例中，慢病毒培养补充物进一步包括矿物质和/或痕量金属和/或维生素和/或维生素前体。
在一些实施例中，二肽包含L-丙氨酰-L-半胱氨酸和L-丙氨酰-L-酪氨酸。在一些实施例中，氨基酸包含任何氨基酸或任何必需氨基酸。在一些实施例中，术语“氨基酸”是指氨基酸或其衍生物(例如氨基酸类似物)以及其D-和L-形式。这种氨基酸的实例包含甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸、N-乙酰基半胱氨酸。在一些实施例中，培养补充物中包含的氨基酸包含甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或缬氨酸。在一些实施例中，糖源、糖醇和碳源包含D-葡萄糖、i-肌醇和丙酮酸钠。在一些实施例中，补充物包括葡萄糖。
在一些实施例中，慢病毒培养补充物包括表1中列出的组分。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约1％到约10％添加。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约1％、3.5％、5％、或10％添加。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约3.5％添加。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物可以包含葡萄糖。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物中葡萄糖的渗透压可以为约500mOsm/kg到约700mOsm/kg、约550mOsm/kg到约650mOsm/kg、约575mOsm/kg到约625mOsm/kg。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物中葡萄糖的浓度可以为约85mg/ml到约115mg/ml、约90mg/ml到约110mg/ml、约95mg/ml到约105mg/ml。
在一些实施例中，慢病毒培养补充物可以包含多种氨基酸，每种氨基酸的浓度处于约0.1mg/ml到约8mg/ml。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物的渗透压可以为约1000mOsm/kg到约1500mOsm/kg、约1100mOsm/kg到约1400mOsm/kg、约1200mOsm/kg到约1300mOsm/kg或其间的任何渗透压或范围。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物的渗透压可以为约1100mOsm/kg、约1150mOsm/kg、约1200mOsm/kg、约1250mOsm/kg、约1300mOsm/kg、约1350mOsm/kg、约1400mOsm/kg、约1450mOsm/kg、约1500mOsm/kg。
在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物的渗透压为约1000mOsm/kg到约1500mOsm/kg、约1100mOsm/kg到约1400mOsm/kg、约1200mOsm/kg到约1300mOsm/kg或其间的任何渗透压或范围。在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物的渗透压为约1100mOsm/kg、约1150mOsm/kg、约1200mOsm/kg、约1250mOsm/kg、约1300mOsm/kg、约1350mOsm/kg、约1400mOsm/kg、约1450mOsm/kg、约1500mOsm/kg。
C.转染试剂
慢病毒生产系统还包括转染试剂或促进大分子进入细胞中的组合物。在一个实施例中，转染试剂包括阳离子脂质和一种或多种中性/辅助脂质作为“脂质聚集体”。
在一些实施例中，脂质聚集体可以包含至少第一阳离子脂质和任选地至少第一中性脂质，其中所述脂质聚集体适于在水性条件下与核酸形成阳离子复合物，其中所述阳离子脂质具有结构：
(式(I))和其盐；其中：
R1和R2独立地为具有8个到30个碳原子的烷基、烯基或炔基；
具有8个到30个碳原子的烷基、烯基或炔基并且任选地被醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代或其中R1是-(CH2)q—N(R6)tR7R8；
R3和R4独立地为具有8个到30个碳原子的氢或烷基、烯基或炔基并且任选地被醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代；
R5到R8独立地为氢或烷基、烯基或炔基；
R9为氢或烷基、烯基或炔基、碳水化合物或肽；
r、s和t为1或0以表示所指示R基团的存在或不存在，当r、s或t中的任何一个为1时，所指示的R基团附接的氮带正电，并且其中r、s或t中的至少一个为1；
q是1到6的整数，包含端值；
Xv-是阴离子，其中v是阴离子的化合价，并且A是阴离子的数量；
L是(CH2)n，其中n是1到10的整数，包含端值，其任选地被一个或多个ZR10基团取代，其中Z是O或S，并且R10是氢或烷基、烯基或炔基；或
{—(CH2)k—Y—(CH2)m}p—，其中k和m独立地是1到10的整数，包含端值，并且p是1到6的整数，包含端值，并且Y是O、S、CO、COO、CONR11、NR11CO或NR11COR11N，其中R11独立于任何其他R11，为氢或烷基；
其中R1到R10的烷基、烯基或炔基的一个或多个CH2基团可以被O、S、S-S、CO、COO、NR12CO、NR12COO或NR12CONR12代替，其中R12独立于任何其他R12，为氢或烷基、烯基或炔基；并且
其中R1到R12的烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个OR13、CN、卤素、N(R13)2、肽或碳水化合物基团取代，其中R13独立于其它R13，是氢或烷基、烯基或炔基，并且
其中R3和R4中的至少一个，当作为烷基存在时，被OR13和N(R13)2基团取代。
在一个实施例中，根据以下结构，阳离子脂质是DHDMS(二羟基-二肉豆蔻基精胺四盐酸盐)：
在一些实施例中，中性(或辅助剂)脂质可以选自以下；DOPE、胆固醇或DOPC。在一个实施例中，中性脂质可以是胆固醇、DOPE或DOPC中的一种。在实施例中，中性脂质是胆固醇。在实施例中，中性脂质是DOPE。在实施例中，中性脂质是DOPC。在一些实施例中，使用两种中性脂质，例如DOPE和胆固醇。在一些实施例中，仅使用一种中性脂质。
在一些实施例中，转染试剂包括DHDMS、DOPE和胆固醇。在一些实施例中，转染试剂DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比的范围为约0.4mM到0.65mMDHDMS、约0.1或0.125到0.25DOPE以及约0.2到0.4或0.375胆固醇。在一些实施例中，转染试剂DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比的范围为约0.45mM到0.55mM DHDMS、约0.1到0.25DOPE以及约0.3到0.4胆固醇。在一些实施例中，转染试剂DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比的范围为约0.475mM到0.5mM DHDMS、约0.1到0.125DOPE以及约0.325到0.35胆固醇。在一些实施例中，转染试剂DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比的范围为约0.5mM到0.525mM DHDMS、约0.125到0.15DOPE以及约0.35到0.375胆固醇。转染试剂适用于以高细胞密度递送多种质粒。参见图2A到D。
在一些实施例中，DHDMS的含量为约0.4mM到0.65mM。在一些实施例中，DOPE的含量为约0.05mM/mL到0.5mM/mL。在一些实施例中，胆固醇的含量为约0.1mM/mL到0.6mM/mL。
在一些实施例中，包含DHDMS和DOPE。在一些实施例中，DHDMS:DOPE的比率范围为约0.6:0.4到0.7:0.3。在一些实施例中，DHDMS:DOPE的比率范围为约0.625:0.375到0.675:0.325。在一些实施例中，DHDMS:DOPE的比率为约0.6:0.4到0.625:0.375。
在一些实施例中，DHDMS:DOPE:胆固醇(包含任何零量)的比率可以选自表2中的那些，认为所有数字被“约”修饰。其它辅助和/或中性脂质可以取代DOPE和/或胆固醇。
在一些实施例中，DHDMS:DOPE:胆固醇(包含任何零量)的摩尔比选自表2、4或表5，认为所有数字被“约”修饰。
在一些实施例中，DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比选自来自表4的操作编号1xR3、1xR4、1xR6、1xR7、1xR9、1xR10、1xR11、1xR12或来自表5的2XbR13或2XbR14。
在一些方面并任选地应用于本节前面段落中讨论的任何比率，DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比增加到1.0，并且所述DHDMS摩尔比的范围为约0.4:0.6，所述DOPE摩尔比的范围为约0.2:0.5，并且所述胆固醇摩尔比的范围为约0.1:0.6。例如，如果DHDMS的摩尔比为0.5且DOPE的摩尔比为0.2，则胆固醇摩尔比为0.3，因此摩尔比增加到1.0。
D.慢病毒生产增强剂
慢病毒生产系统还包括慢病毒生产增强剂。慢病毒生产增强剂包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因。
在一些实施例中，丙酸钠和/或丁酸钠以水的形式提供。在一些实施例中，咖啡因在细胞培养表达培养基中提供，如Expi293TM表达培养基。在一些实施例中，咖啡因可以溶解在培养基中到终浓度为40mM。
在一些实施例中，丙酸钠的含量为约7.5mM到15mM。在一些实施例中，包含约1.5mM到3mM的丁酸钠。在一些实施例中，包含约0.75mM到3mM的咖啡因。
在一些实施例中，包含约3mM到约5mM的丙酸钠。在一些实施例中，包含约5mM到8mM的丙酸钠。在一些实施例中，包含约1.5mM到2.5mM的丁酸钠。在一些实施例中，包含约2.5mM到3mM的丁酸钠。在一些实施例中，包含约2mM到3mM的咖啡因。在一些实施例中，包含约1mM到2mM的咖啡因。
在一些实施例中，丙戊酸、丙酸钠、丁酸钠和咖啡因的量可以分别选自表3中提供的那些，认为所有数字被“约”修饰。
在一些实施例中，慢病毒生产增强剂成分选自表3、表6或表7中的任一种，认为所有数字被“约”修饰。在一些实施例中，增强剂成分选自表6中的操作1xR5、1xR6、1xR13、1xR14、1xR15、1xR16、1xR17、1xR18、1xR19、1xR22、1xR26、1xR27、1xR29、1xR30或1xR31中的那些中的任一种。
在一些实施例中，所述慢病毒生产增强剂任选地包括丙戊酸。在一些实施例中，所述慢病毒生产增强剂不包括丙戊酸。在一些实施例中，丙戊酸的含量可以为约0.5mM到1mM。
在一些实施例中，慢病毒生产增强剂在一个或多于一个时间点添加，如在转染时(约0小时)直到转染之后约48小时。可以在转染之后约16小时添加慢病毒生产增强剂，以增强慢病毒载体的细胞包装。在一些实施例中，可以在转染时添加慢病毒生产增强剂。在一些实施例中，可以在转染时和转染之后约16小时添加慢病毒生产增强剂。在一些实施例中，可以在转染之后约10小时到16小时添加慢病毒生产增强剂。
E.细胞培养基
多种细胞培养基可以用于培养慢病毒生产系统细胞。研究者通常需要无血清培养基。可以使用任何支持上文章节I.A中描述的细胞生长的无血清培养基。培养基也可以不含蛋白质。
“无血清培养基”(有时被称为“SFM培养基”)是不含血清(例如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清、山羊血清、人类血清等)的培养基且一般由字母SFM表示。短语“无蛋白质”培养基是指不含蛋白质(例如无血清蛋白，如血清白蛋白或贴附因子，营养蛋白，如生长因子，或金属离子载剂蛋白，如转铁蛋白、铜蓝蛋白等)的培养基。在一些实施例中，如果存在肽，则肽是较小肽，例如二肽或三肽。在一些实施例中，十肽长度或更长的肽不超过无蛋白质培养基中存在的氨基酸的约1％，不超过约0.1％，和不超过约0.01％。
在一些实施例中，细胞培养基是Expi293TM表达培养基(Thermo FisherScientific Cat#A14351-01)。此培养基是化学成分限定的特种培养基，专门开发用于293细胞的高密度悬浮培养和转染，并且不含人或动物来源的产品。用GlutaMAXTM-I试剂配制Expi293TM表达培养基。对于悬浮生长和转染应用，可以使用此培养基而无需任何补充。此外，抗生素不是必需的；然而，当有益时，可以使用含有青霉素、链霉素和两性霉素B的5mL/L抗生素-抗真菌剂(Thermo Fisher Scientific Cat#15240)。
在一些实施例中，可以使用高密度培养基，包含能够维持哺乳动物细胞生长的任何培养基，在一些实施例中，悬浮生长的细胞密度高达约2×107个细胞/ml，同时保持所述细胞的存活率超过约80％，并且进一步保持所述悬浮细胞有效转染的能力并表达大量重组蛋白。所用的高密度培养基可以在不同应用与用途之间变化，且可能取决于所用细胞系、瞬时表达的所需蛋白质的性质、选择用于将表达载体转移到细胞中的转染模态的性质以及添加到如下文所述的系统中的任何表达增强剂的量和性质。然而，设想用于本瞬时表达系统和方法的高密度培养基将通常是无血清、无蛋白质的，允许悬浮细胞的密度培养并生长到高达约2×107个细胞/ml，更通常约2×106个细胞/ml到约1×107个细胞/ml之间，且将进一步实现在瞬时表达系统中产生的蛋白质产量超过至少200μg/mL细胞培养物到2mg/mL细胞培养物，更通常约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间。在一些实施例中，使用的高密度培养基将有助于细胞以约1×106个到约20×106个细胞/ml、约2×106个到约2×106个细胞/ml或约2.5×106个到约6×106个细胞/ml范围内的密度转染。
适用于本文的示例性高密度培养基包含但不限于HuMEC基础无血清培养基、KNOCKOUTTM CTSTM XenoFREE ESC/iPSC培养基、STEMPROTM-34SFM培养基、STEMPROTM NSC培养基、ESSENTIALTM-8培养基、培养基254、培养基106、培养基131、培养基154、培养基171、培养基171、培养基200、培养基231、HeptoZYME-SFM、人类内皮-SFM、FREESTYLETM 293表达培养基、培养基154CF/PRF、培养基154C、培养基154CF、培养基106、培养基200PRF、培养基131、EssentialTM-6培养基、STEMPROTM-34培养基、星形胶质细胞培养基、培养基CTSTM、AMINOMAXTM C-100基础培养基、AMINOMAXTM-II完全培养基、CDFORTICHOTM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLETM CHO表达培养基、CD OPTICHOTM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、SF-900TM培养基、EXPI293TM表达培养基、LHC基础培养基、LHC-8培养基、293SFM培养基、CD 293培养基、AEM生长培养基、PER.细胞培养基、AIM培养基、培养基、角质细胞-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修饰物。在某些非限制性实施例中，高密度培养基可以是CD FORTICHOTM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLETM CHO表达培养基、CD OPTICHOTM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基FREESTYLETM 293表达培养基、EXPI293TM表达培养基或类似培养基、或其经修饰的版本。以上列举的示例性高密度培养基可以尤其适用于经调适以用于高密度培养系统中的293细胞、293细胞变体或任何其它细胞的高密度生长、繁殖、转染和维持。
F.慢病毒质粒
多种慢病毒质粒可以用于本方法中。例如，可以使用慢病毒表达(转移)质粒pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和慢病毒包装质粒ViraPowerTM慢病毒包装混合物中的一种或多种。可以使用其它慢病毒载体，包含#277.pCCLsin.cPT.hPGK.eGFP，Wpre(277-eGFP)。也可以使用其它非限制性慢病毒质粒。
可以使用整合能力和整合缺陷两者的慢病毒载体(分别为ICLV和IDLV)。
无血清大规模悬浮慢病毒生产方案示出在图5中。这是使用本文所述的慢病毒生产系统的方法的一个实施例。
本无血清悬浮LV生产系统易于使用、可扩展且高效。系统可以产生比现有方法多十倍的慢病毒载体。本系统和转染试剂可以以高细胞密度有效地将慢病毒表达和包装载体递送到无血清悬浮生长细胞中。并且培养补充物将细胞维持在对数中期以产生最大量的慢病毒颗粒。因此，此系统和其部件的优点包含简单、培养的均一性、高慢病毒效价产生、易于扩大规模、以及慢病毒生产系统的密封自动化的可行性。
II.用于慢病毒生产系统的方法
A.第一慢病毒生产系统
可以遵循以下慢病毒悬浮细胞培养指南。可以根据标准慢病毒悬浮细胞培养方案生长细胞。当细胞的密度达到约4×106个到5×106个活细胞/mL时，通常每3天到4天可以对细胞进行传代培养。在培养约3天或4天之后，细胞可以分裂成0.3×106个到0.6×106个细胞。可以通过每天在每天的同一时间计数细胞来监测细胞生长。细胞倍增时间约为24小时。从解冻日期起两周之后，细胞准备好进行慢病毒生产。在细胞培养期间，可以以约125rpm使用轨道振荡器用于125mL到1L摇瓶。培养箱可以被设置为约37℃，约8％CO2以及约75％到80％的湿度。可以在使用之前在约37℃的水浴中加热培养基。
试剂和方法：
·125mL聚碳酸酯，一次性，无菌，Vent-up Erlenmeyer摇瓶；
·15mL无菌锥形管；
·50mL无菌锥形管；
·Opti-I培养基；
·慢病毒表达(转移)载体：pLENTI6.3/V5-GW-EmGFP；
·慢病毒包装混合物：ViraPower慢病毒包装混合物；
·慢病毒悬浮细胞；
·慢病毒培养补充物；
·慢病毒转染试剂；
·慢病毒增强剂
例如，如果细胞在星期五早上分裂到细胞计数0.6×106个细胞/mL，则它们可以在1L烧瓶中在约250mL培养基中培养3天。例如，在星期一早上10:00am，通过计数细胞制备细胞，并且可以预期细胞密度为约4.5×106个细胞/mL。可以将细胞在新鲜温热的培养基中稀释到3.0×106个细胞/mL并再培养30小时。
例如，转染可以在星期二下午4:00pm进行。可以预期细胞计数为约5.5个到6.0×106个细胞/mL。表4提供了额外的转染指南。
在星期二下午，可以用慢病毒补充物接种细胞。如果选择30mL转染，则可以用高密度细胞进行，如17.5mL中的105×106个细胞/mL。可以添加3.5％的慢病毒培养补充物，其在30mL转染中为1.5mL。新鲜温热的培养基可以用于25.5mL的总体积(6.95mL新鲜培养基，因为使用1.05mL慢病毒培养补充物和17.5mL细胞悬液)。可以从DNA/试剂复合物加入其它4.5mL以达到总体积30mL。
DNA/转染试剂可以如下制备。两个管可以标记为管-1和管-2。在管-1中：可以将2.25的Opti-I培养基和150μL慢病毒转染试剂混合并在室温下培育约5分钟。在管-2中：2.25mL的Opti-I培养基可以与45μg(μL)ViraPowerTM慢病毒包装混合物(ViraPower 1μg/μL)和30μg(μL)pLenti6.3/V5-GW/EmGFP质粒(pLenti表达载体1μg/μL)混合。管-1和管-2可以通过向管-1添加管-2溶液并混合来组合。
可以将复合溶液在室温下培育10分钟。培育10分钟之后，可以将4.5mL DNA/试剂复合物加入到制备的细胞。
第二天(星期三早上9:00am)，向烧瓶加入1.2mL LV增强剂。
在转染后48小时(星期四下午，4:00pm)，在50mL无菌锥形管中收获LVV，并在室温下以3000rpm旋转细胞10分钟。收集上清液并再次以3000rmp旋转10分钟。收集上清液并通过0.45μM过滤器。
任选地将慢病毒稳定剂添加到收集的上清液，以便在已经收获病毒之后调节pH。慢病毒稳定剂可以任选地作为收集的上清液的1％加入(～300μL)。在一些情况下，将生产系统的pH调节到约5到8以稳定病毒。
将慢病毒载体储存在4C用于第二天的纯化，并通过在慢病毒载体的连续稀释液中感染Ht1080细胞测量病毒效价，如下所述。
慢病毒效价(GFP+)的测量可以如下进行。
材料：
·慢病毒：收集细胞上清液或浓缩的慢病毒载体；
·细胞系：HT1080；
·培养基：DMEM高葡萄糖、GlutaMAXTM补充物、丙酮酸+10％FBS；
·(储备溶液)：无菌H2O中的100mg/mL(Fisher ScientificNCO663391)；以及
·用于稀释液的Costar 96孔圆底板(Fisher Scientific 05539200)。
在第1天(早上)，使用96孔板格式开始测量慢病毒效价，以进行高通量流量分析。在早上11:00am，在100μL培养基中以7000个细胞/孔的密度接种具有HT1080细胞的96孔板(在感染时～30％汇合)。
在下午4:00pm，如下制备新鲜的病毒稀释液。(A)将15mL新鲜培养基和12μL 10mg/mL组合(终浓度为8μg/mL)。很好地涡旋以组合。(B)每个病毒样品，将(A)中制备的135μL培养基加入到96孔圆底板的16个孔，形成4孔×4孔的模式(参见图6)。(C)在第1行的每个孔中加入15μL慢病毒上清液的一个样品(或浓缩的病毒等分试样)(每个孔中的总体积150μL)。(D)用移液管(1:10)充分混合。(E)通过将15μL从第1行转移到第2行并充分混合(1:100)，将15μL从第2行转移到第3行并充分混合(1:1000)，并将第3行的15μL转移到第4行并充分混合(1:10,000)，对第1行进行连续稀释(使用多通道移液管，如果有的话)。如果病毒浓缩，可能需要更多稀释液。
感染细胞，从HT1080细胞除去接种培养基，以及通过将100μL制备的稀释液转移到每个对应孔感染(使用多通道移液管，如果有的话)。将96孔感染的细胞板在室温下以2000rpm旋转30分钟，并将感染的细胞板培育过夜。
在第2天(早晨)，去除含有病毒的培养基并用新鲜的HT1080培养基(不含)替换，将细胞再培育3天，分析GFP阳性细胞的％(可以使用流式细胞术分析)。
以TU/mL为单位计算效价，根据％GFP阳性确定要使用的适当稀释因子。可以使用1％到20％的所需感染范围。
效价可以从以下式计算：
效价＝[F*C/V]*D
F＝GFP+细胞的频率(％GFP+细胞/100)
C＝转导时每个孔的细胞数量(7000个细胞)
V＝按mL计的接种体积(0.1mL)
D＝慢病毒稀释因子。
A.第二慢病毒生产系统方案
第二慢病毒生产系统方案可以如下进行。
材料
·125mL、250mL、500mL和1L聚碳酸酯，一次性，无菌，Vent-up摇瓶
·温度37C下的轨道振荡器，8％CO2和75％到80％的湿度受控培养箱
·用于确定细胞存活率的设备和试剂
方案大纲
·□解冻和恢复：3天到4天
·□传代培养：每3天到4天一次
·□使用之前将培养基加热到37℃
·□轨道振荡器速度：对于125mL到1L摇瓶，125rpm
生长特性：特殊培养基中高密度悬浮生长。
细胞倍增时间：
·倍增时间(DT)：～24小时
·计算公式：DT＝T*LN(2)/LN(Xe/Xb)
·T：细胞培养时间-小时
·Xe：最后的细胞密度
·Xb：开始时的细胞密度
为确保存活率，在前3天到4天监测细胞生长和存活率，以确保细胞不受损害。在解冻后24小时，存活率可能降到80％，但不应低于70％。解冻后3天到4天，存活率应为90％到95％。
传代培养条件。图7提供了可以遵循以培养细胞的慢病毒悬浮细胞培养流程图。对于传代培养，在一些实施例中，细胞不应生长到5×106个细胞/mL以上。在第40代之后可以丢弃细胞。
按比例增加细胞培养。细胞可以在振荡器、旋转瓶或生物反应器中按比例增加。确定培养系统的最佳振荡器、旋转器或叶轮速度和接种密度。在一些实施例中，将细胞以0.3×106个到0.6×106个活细胞/mL接种用于传代培养。对于125mL到1L的摇瓶，最佳振荡器速度约为125rpm，并且搅拌槽生物反应器中的最佳叶轮速度为70rpm到100rpm。
要考虑的指南。将细胞传代培养至少三次以使它们在转染实验中使用之前从解冻恢复。将细胞密度保持在3个到5×106个细胞/mL培养物之间，以获得最佳性能。我们建议将细胞维持在250mL或500mL的聚碳酸酯、一次性无菌Erlenmeyer摇瓶中。细胞悬浮液的工作体积为摇瓶尺寸的30％到40％。例如，500mL摇瓶，工作体积为150mL到200mL。可以使用玻璃烧瓶，但每次使用之后彻底清洁它们以避免潜在的毒性。
实例
实例1.细胞培养
将LV悬浮细胞在轨道振荡器上以30％到40％的摇瓶大小体积在聚碳酸酯，一次性无菌Vent-up摇瓶(125mL到1L)中以125rpm在细胞培养箱(37℃，8％CO2，70％到80％湿度)中培养。每3天到4天分离一次细胞，密度在4到5×106/mL之间。
实例2.慢病毒生产实验
根据开发需要，以两种形式进行慢病毒(LV)生产实验：96孔深孔板和125mL摇瓶，分别为1mL和30mL培养物体积。细胞密度为4×106/mL。通过共转染慢病毒表达(转移)质粒-pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和慢病毒包装质粒-ViraPower慢病毒包装混合物包装慢病毒载体(LVV)，总DNA为3μg/mL。对于转染试剂和DNA稀释液两者，Opti-I是7 5uL/mL下的DNA/试剂复合培养基；总复合体积为150ul/mL。络合时间为10分钟到20分钟。ExpifectamineTM 293是LV培养补充物和LV增强剂开发的转染试剂，用量为5ul/mL到8ul/mL。所有正在开发的实验中都包含5％LV培养补充物。在本文所述的发展之前，先将5mM咖啡因用作LV增强剂，并在转染后16小时到18小时加入。转染后48小时，通过旋转细胞收集含有LVV的细胞上清液，并测量病毒效价。
实例3：慢病毒效价测量
通过感染Ht1080细胞测量慢病毒效价。感染之前4小时，在96孔板中每孔接种7000个细胞。在感染时，细胞以约30％的汇合附着在培养容器上。在含有8ug/mL的培养基中进行101到105LVV的系列稀释。通过104和105病毒稀释液感染细胞。感染细胞之后，将感染的Ht1080板在室温下以2000rpm旋转30分钟。感染后18小时，用不含的新鲜培养基更换培养基。将细胞再培育72小时。并且通过Attune流式细胞仪测量GFP阳性细胞。基于1％到20％孔之间的GFP细胞百分比计算效价。
在转染当天，在125mL摇瓶中制备30mL 3种不同细胞密度的培养物：2.5×106/mL，4×106/mL和5×106/mL。每个密度细胞具有4个烧瓶，其含有不同量的LV培养补充物，分别为30mL的0％、1％、5％和10％。通过在2.25mL Opti-I培养基中稀释210μl(7μl/mL)ExpifectamineTM 293来转染每个30mL培养细胞并且在2.25mL Opti-I培养基中稀释54μg ViraPowerTM慢病毒包装混合物和36μg pLenti/V5-GW/EmGFP表达载体，将这两种溶液-总共4.5mL组合并在室温下培育10分钟，然后转染细胞。转染48小时后，通过旋转细胞收获细胞培养上清液。
图1A中提供了示出培养物补充量在慢病毒生产中的影响的结果。
接下来，在含有0％到10％(0％、1％、5％和10％)不同量的LV培养补充物下培养慢病毒悬浮细胞，每天测量细胞密度持续6天。结果示出在图1B中。
实例2：筛选新的转染试剂
使用实验设计(DOE)平台，使用三种核心化学品作为潜在的转染试剂：DHDMS、DOPE和胆固醇设计筛选实验。
DOE平台允许研究人员同时改变多个参数，而不是单独改变参数中的每一个，并且然后考虑整个优化配制品的每个优化参数。当参数之间的二阶效应可以影响结果时，DOE平台同时改变所有候选参数，允许更有效和准确的结果。使用DOE平台的实验也需要更少的操作并且比传统的实验方法更经济。参见Kauffman等人，“用分数因子和最终筛选设计优化脂质纳米颗粒配制品用于体内mRNA递送(Optimization of Lipid NanoparticleFormulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial andDefinitive Screening Designs)”，《纳米快报(NanoLetters)15:7300-7306(2015)和关于DOE平台的理论讨论的补充材料。
以不同的摩尔比评估DHDMS、DOPE和胆固醇，表4中每行的成分总值为1。在表中，软件自动设计重复操作以控制实验精度，1xR1和1xR2、1xR6和1xR7。
基于表5，制备新的转染试剂。这些新配制的试剂用于通过共转染pLenti/V5-GW/EmGFP表达载体和ViraPowerTM慢病毒包装混合物在96深孔块、1mL培养体积、3μg总DNA(pLenti表达载体+ViraPowerTM包装混合物，2:3(重量:重量)比率的两种载体)中包装GFPLVV。5ul/mL和6uL/mL量的转染试剂被研究，细胞密度为4×106/mL，具有5％LV培养补充物。图2A中示出的结果是这两个剂量的平均值，读数为TU/mL。
基于此DoE结果，我们通过制备测试化合物的不同组合设计更多试剂，如具有DOPE的DHDMS、具有胆固醇的DHDMS、以及具有DOPE和胆固醇的DHDMS。我们以30mL生产形式测试了每组新试剂，并使用lipofectamine作为对照试剂。我们发现具有DOPE的DHDMS具有最高的性能量，特别是与其它两种转染试剂组合相比，摩尔比为0.65DHDMS:0.35DOPE。
基于性能和配制品组成选择十二种试剂，并且在此粘接操作中的慢病毒转染试剂示出于表6中。结果示出在图2B中。
实例3：慢病毒增强剂的识别
使用以下实验识别慢病毒增强剂。通过与pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和ViraPower慢病毒包装混合物复合的ExpifectamineTM 293转染试剂转染两个96深块。对于每个孔(1mL反应)，两种溶液组合：将75μl Opti-I培养基中的7μl ExpifectamineTM 293和75μlOpti-I中的3μg总DNA(1.2ugpLenti表达载体和1.8μg ViraPowerTM混合物)，总共150μL复合物。以4×106/mL，用5％LV培养补充物转染细胞。-16小时转染后，根据表7，将制备的由设计的慢病毒增强剂添加，一式三份每种慢病毒增强剂。
48小时转染后，进行慢病毒滴定测定。结果示出在图3A中。
通过jmp分析结果，在图3B中绘制预测分析仪。如下设计和分析二级DoE，发现优化条件(参见表8)。
通过jmp分析结果，并且在图3C中绘制预测分析仪。
实例4：慢病毒生产系统比较
我们将使用LentifectamineTM，Thermo Fisher(LVR)作为转染试剂的新开发的悬浮慢病毒生产系统与PEI介导的(25KD线性聚合物)和用于慢病毒生产的LipofectamineTM2000介导的(LK2)转染技术进行了比较，改变转染试剂并改变生产过程是否含有或不含有慢病毒培养补充物、慢病毒增强剂和/或丁酸钠。
LV293系统中的转染如下进行。系统是125mL摇瓶，具有30mL LV产生。衍生自293F细胞的LV293细胞在转染时，在3.5M/mL的密度接种。使用时，慢病毒培养补充物的终浓度为3.5％，增强剂为4％，丁酸钠为5mM。培养补充物是ExpiCHOTM-Feed并且慢病毒增强剂是4.53mM丙酸钠、2.0mM丁酸钠和1.5mM咖啡因。
简言之，在转染当天对细胞进行计数，并在最终的25.5mL系统中稀释，每当需要样品时用培养补充物稀释。管A：将转染试剂(LVR或L2K(Lipofectamine 2000))在2.25mLGibcoTM Opti-MEMTM中混合，在室温下培育5分钟。管B：将DNA混合物(ViraPowerTM慢病毒混合物45ug和30ugpLenti6.3/V5-GW/GFP)在另一个2.25mL GibcoTM Opti-MEMTM中稀释。然后将管B加入管A，混合并在室温下培育10分钟。将最终混合物(约4.5mL)加入到制备的细胞。转染后16小时在样品中需要时加入1.2mL(4％生产量)增强剂。当样品中需要时，在转染后24小时添加丁酸钠。转染后48小时收获上清液，并如所述进行效价。
对于293F细胞中的转染，最终细胞密度为1M/mL。总DNA量减少到1ug/mL(对于30mL系统，ViraPowerTM慢病毒混合物18ug和12ug pLenti6.3/V5-GW/GFP)。除非另有说明，转染和病毒收获程序与LV293系统中的相同。
我们的慢病毒生产优于其它两个系统，如图4A所示。
实例5：第一慢病毒生产方案
遵循以下慢病毒悬浮细胞培养指南。根据标准慢病毒悬浮细胞培养方案生长细胞。当细胞的密度达到约4×106个到5×106个活细胞/mL时，通常每3天到4天对细胞进行传代培养。在培养约3天或4天之后，细胞分裂成0.3×106个到0.6×106个细胞。通过每天在每天的同一时间计数细胞来监测细胞生长。细胞倍增时间约为24小时。从解冻日期起两周之后，细胞准备好进行慢病毒生产。在细胞培养期间，以约125rpm使用轨道振荡器用于125mL到1L摇瓶。培养箱被设置为约37℃，约8％CO2以及约75％到80％的湿度。在使用之前在约37℃的水浴中加热培养基。
试剂和方法：
·125mL聚碳酸酯，一次性，无菌，Vent-up Erlenmeyer摇瓶；
·15mL无菌锥形管；
·50mL无菌锥形管；
·Opti-MEMTM I培养基；
·慢病毒表达(转移)载体：pLENTI6.3/V5-GW-EmGFP；
·慢病毒包装混合物：ViraPowerTM慢病毒包装混合物；
·慢病毒悬浮细胞；
·慢病毒培养补充物；
·慢病毒转染试剂；
·慢病毒增强剂
·(任选)用于调节pH的慢病毒稳定剂
例如，如果细胞在星期五早上分裂到细胞计数0.6×106个细胞/mL，则它们可以在1L烧瓶中在约250mL培养基中培养3天。例如，在星期一早上10:00am，通过计数细胞制备细胞，并且可以预期细胞密度为约4.5×106个细胞/mL。可以将细胞在新鲜温热的培养基中稀释到3.0×106个细胞/mL并再培养30小时。
例如，转染可以在星期二下午4:00pm进行。可以预期细胞计数为约5.5个到6.0×106个细胞/mL。表9提供了额外的转染指南。
在星期二下午，用慢病毒补充物接种细胞。如果选择30mL转染，则可以用高密度细胞进行，如17.5mL中的105×106个细胞/mL。添加3.5％的慢病毒培养补充物，其在30mL转染中为1.5mL。新鲜温热的培养基用于25.5mL的总体积(6.95mL新鲜培养基，因为使用1.05mL慢病毒培养补充物和17.5mL细胞悬液)。从DNA/试剂复合物加入其它4.5mL以达到总体积30mL。
DNA/转染试剂如下制备。两个管标记为管-1和管-2。在管-1中：将2.25的Opti-MEMTM I培养基和150μL慢病毒转染试剂混合并在室温下培育约5分钟。在管-2中：2.25mL的Opti-MEMTM I培养基与45μg(μL)ViraPowerTM慢病毒包装混合物(ViraPowerTM 1μg/μL)和30μg(μL)pLenti6.3/V5-GW/EmGFP质粒(pLenti表达载体1μg/μL)混合。管-1和管-2通过向管-1添加管-2溶液并混合来组合。
将复合溶液在室温下培育10分钟。培育10分钟之后，将4.5mL DNA/试剂复合物加入到制备的细胞。
第二天(星期三早上9:00am)，向烧瓶加入1.2mL LV增强剂。
在转染后48小时(星期四下午，4:00pm)，在50mL无菌锥形管中收获LVV，并在室温下以3000rpm旋转细胞10分钟。收集上清液并再次以3000rmp旋转10分钟。收集上清液并通过0.45μM过滤器。
将慢病毒稳定剂添加到收集的上清液，以便在已经收获病毒之后调节pH。慢病毒稳定剂作为收集的上清液的1％加入(～300μL)。在一些情况下，将生产系统的pH调节到约5到8以稳定病毒。
将慢病毒载体储存在4C用于第二天的纯化，并通过在慢病毒载体的连续稀释液中感染Ht1080细胞测量病毒效价，如实例6中所述。
实例6：从实例5的生产测量慢病毒效价(GFP+)
慢病毒效价(GFP+)的测量如下进行。
材料：
·慢病毒：收集细胞上清液或浓缩的慢病毒载体；
·细胞系：HT1080；
·培养基：GibcoTM DMEM高葡萄糖、GlutaMAXTM补充物、丙酮酸+10％FBS；
·PolybreneTM(储备溶液)：无菌H2O中的100mg/mL(Fisher ScientificNCO663391)；以及
·用于稀释液的96孔圆底板(Fisher Scientific 05539200)。
在第1天(早上)，使用96孔板格式开始测量慢病毒效价，以进行高通量流量分析。在早上11:00am，在100μL培养基中以7000个细胞/孔的密度接种具有HT1080细胞的96孔板(在感染时～30％汇合)。
在下午4:00pm，如下制备新鲜的病毒稀释液。(A)将15mL新鲜培养基和12μL 10mg/mL组合(终浓度为8μg/mL)。很好地涡旋以组合。(B)每个病毒样品，将(A)中制备的135μL培养基加入到96孔圆底板的16个孔，形成4孔×4孔的模式(参见图6)。(C)在第1行的每个孔中加入15μL慢病毒上清液的一个样品(或浓缩的病毒等分试样)(每个孔中的总体积150μL)。(D)用移液管(1:10)充分混合。(E)通过将15μL从第1行转移到第2行并充分混合(1:100)，将15μL从第2行转移到第3行并充分混合(1:1000)，并将第3行的15μL转移到第4行并充分混合(1:10,000)，对第1行进行连续稀释(使用多通道移液管，如果有的话)。如果病毒浓缩，可能需要更多稀释液。
感染细胞，从HT1080细胞除去接种培养基，以及通过将100μL制备的稀释液转移到每个对应孔感染(使用多通道移液管，如果有的话)。将96孔感染的细胞板在室温下以2000rpm旋转30分钟，并将感染的细胞板培育过夜。
在第2天(早晨)，去除含有病毒的培养基并用新鲜的HT1080培养基(不含)替换，将细胞再培育3天，分析GFP阳性细胞的％(可以使用流式细胞术分析)。
以TU/mL为单位计算效价，根据％GFP阳性确定要使用的适当稀释因子。使用1％到20％的所需感染范围。
效价从以下式计算：
效价＝[F*C/V]*D
F＝GFP+细胞的频率(％GFP+细胞/100)
C＝转导时每个孔的细胞数量(7000个细胞)
V＝按mL计的接种体积(0.1mL)
D＝慢病毒稀释因子。
使用96孔方案，进行以下计算(参见表10)：
选择104用于计算，因为％EmGFP阳性细胞值落在期望的1％到20％范围内。
F＝18/100
C＝7000
V＝0.1
D＝104
效价＝(0.18*7000/0.1)*104＝1.26×108TU/mL
等同物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践实施例。前述描述和实例详述了某些实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，实施例可以以多种方式实践，并且应该根据所附权利要求和其任何等同物来解释。
如本文所用，术语约是指数值，包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语约通常是指本领域普通技术人员认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的一系列数值(例如，所述范围的+/-5％到10％)。当如至少和约等术语在数值或范围列表之前时，术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包含四舍五入到最接近的有效数字的数值。

Claims (59)

1.一种慢病毒载体生产系统，其包括：
a.控制细胞生长的慢病毒培养补充物，
b.脂质聚集体，其包括阳离子脂质和至少一种辅助剂和/或中性脂质，
c.慢病毒生产增强剂，其包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因，
其中所述慢病毒载体生产系统是无血清的。
2.根据权利要求1所述的慢病毒生产系统，其中所述阳离子脂质包括DHDMS。
3.根据权利要求1所述的慢病毒生产系统，其中所述至少一种辅助剂和/或中性脂质包括DOPE。
4.根据权利要求1所述的慢病毒生产系统，其中所述至少一种辅助剂和/或中性脂质包括DOPE和胆固醇。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述系统是为了在293细胞中生产慢病毒而设计。
6.根据权利要求5所述的慢病毒载体生产系统，其中使所述293细胞在悬浮培养物中生长。
7.根据权利要求5或6所述的慢病毒载体生产系统，其中所述293细胞是293F细胞或其衍生物。
8.根据权利要求7所述的慢病毒载体生产系统，其中所述293F细胞或由其衍生的细胞能够以约1×106到约20×106的密度生长，5天之后小于20％的细胞死亡。
9.根据权利要求1到7中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物包括：
a.氨基酸和/或二肽和糖源、糖醇和/或碳源。
10.根据权利要求7所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物包括氨基酸和葡萄糖。
11.根据权利要求9到10中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物包括
a.矿物和/或痕量金属，和/或
b.维生素和/或维生素前体。
12.根据权利要求9到11中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物包括L-丙氨酰-L-半胱氨酸二聚体、L-丙氨酰-L-酪氨酸二水合物、D-葡萄糖、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物以约1％到约10％添加。
14.根据权利要求13所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物以约1％、3.5％、5％、或10％添加。
15.根据权利要求14所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物以约3.5％添加。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物中所述葡萄糖的渗透压为约500mOsm/kg到约700mOsm/kg、约550mOsm/kg到约650mOsm/kg、约575mOsm/kg到约625mOsm/kg。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物中所述葡萄糖的浓度为约85mg/ml到约115mg/ml、约90mg/ml到约110mg/ml、约95mg/ml到约105mg/ml。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物的渗透压为约1000mOsm/kg到约1500mOsm/kg、约1100mOsm/kg到约1400mOsm/kg、约1200mOsm/kg到约1300mOsm/kg、或其间的任何渗透压或范围。
19.根据权利要求1到16中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒培养补充物的渗透压为约1100mOsm/kg、约1150mOsm/kg、约1200mOsm/kg、约1250mOsm/kg、约1300mOsm/kg、约1350mOsm/kg、约1400mOsm/kg、约1450mOsm/kg、约1500mOsm/kg。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约0.4mM到0.6mM的所述DHDMS。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约0.2mM/mL到0.5mM/mL的所述DOPE。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约0.1mM/mL到0.6mM/mL的胆固醇。
23.根据权利要求1到21中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述唯一辅助剂和/或中性脂质是DOPE。
24.根据权利要求23所述的慢病毒载体生产系统，其中DHDMS:DOPE的摩尔比增加到1.0并且范围为约0.6:0.4到0.7:0.3。
25.根据权利要求23所述的慢病毒载体生产系统，其中DHDMS:DOPE的摩尔比增加到1.0并且范围为约0.625:0.375到0.675:0.325。
26.根据权利要求23所述的慢病毒载体生产系统，其中DHDMS:DOPE的摩尔比增加到1.0并且范围为约0.6:0.4到0.625:0.375。
27.根据权利要求1到22中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比增加到1.0，并且所述DHDMS摩尔比范围为约0.4到0.6，所述DOPE摩尔比范围为约0.2到0.5，并且所述胆固醇摩尔比范围为约0.1到0.6。
28.根据权利要求1到22或25中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比选自表2、4或表5。
29.根据权利要求1到22或25到26中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比选自来自表4的操作编号1xR3、1xR4、1xR6、1xR7、1xR9、1xR10、1xR11、1xR12或来自表5的2XbR13或2XbR14。
30.根据权利要求1到29中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒增强剂包括丙戊酸。
31.根据权利要求1到30中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中丙酸钠和/或丁酸钠以水溶液形式提供。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中咖啡因于慢病毒表达培养基中提供。
33.根据权利要求1到32中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约3mM到15mM的丙酸钠。
34.根据权利要求33所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约3mM到5mM的丙酸钠。
35.根据权利要求33所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约5mM到约8mM的丙酸钠。
36.根据权利要求1到35中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约1.5mM到3mM的丁酸钠。
37.根据权利要求36所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约1.5mM到2.5mM的丁酸钠。
38.根据权利要求36所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约2.5mM到3mM的丁酸钠。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约0.75mM到3mM的咖啡因。
40.根据权利要求1到39所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约2mM到3mM的咖啡因。
41.根据权利要求1到40所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约1mM到2mM的咖啡因。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中包含约0.5mM到1mM的丙戊酸。
43.根据权利要求1到42中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述慢病毒生产增强剂成分量选自表3、表6或表7中的那些中的任一种。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的慢病毒载体生产系统，其中所述增强剂成分量选自表6中的操作1xR5、1xR6、1xR13、1xR14、1xR15、1xR16、1xR17、1xR18、1xR19、1xR22、1xR26、1xR27、1xR29、1xR30或1xR31中的那些中的任一种。
45.一种用于慢病毒载体生产的方法，其包括使用根据权利要求1到44中任一项所述的慢病毒载体生产系统。
46.一种用于慢病毒载体生产的方法，其包括；
a.在无血清培养基中培养真核细胞，
b.提供控制细胞生长的慢病毒培养补充物，
c.使用提高转染效率的转染试剂用慢病毒载体转染所述细胞，所述转染试剂包括DHDMS、DOPE和胆固醇，以及
d.提供能够促进慢病毒生产的慢病毒生产增强剂，所述慢病毒生产增强剂包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因。
47.根据权利要求45到46中任一项所述的方法，其中所述培养过的真核细胞处于适于在高密度条件下生长的悬浮培养物中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞在细胞密度为至少1×106个细胞/mL的悬浮细胞培养物中生长。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞在细胞密度为至少10×106个细胞/mL的悬浮细胞培养物中生长。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞在密度为至少20×106个细胞/mL的悬浮细胞培养物中生长。
51.根据权利要求45到50中任一项所述的方法，其中所述方法用于培养293细胞或293细胞的衍生物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法用于培养293F细胞或293F细胞的衍生物。
53.根据权利要求1到52中任一项所述的方法，其中所述慢病毒培养补充物符合权利要求7到17中的任一项。
54.根据权利要求1到53中任一项所述的方法，其中所述转染试剂符合权利要求2到4或20到29中的任一项。
55.根据权利要求1到54中任一项所述的方法，其中所述慢病毒生产增强剂符合权利要求30到44中的任一项。
56.根据权利要求1到56中任一项所述的方法，其中在细胞培养基中进行细胞接种之后24小时到36小时加入所述慢病毒培养补充物。
57.根据权利要求1到56中任一项所述的方法，其中所述方法可以产生约2.5×108TU/ml的未浓缩慢病毒载体。
58.根据权利要求1到57中任一项所述的方法，其中所述悬浮细胞培养物的体积为约10mL到约5L。
59.根据权利要求1到58中任一项所述的方法，其中5天之后的细胞存活率为至少80％。
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