CN113454101A - 用于腺相关病毒产生的悬浮系统 - Google Patents
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Abstract
本技术涉及一种用于在无血清悬浮平台中和高滴度下产生AAV载体的产生系统。这种技术所使用的试剂包括培养基、细胞、转染试剂、AAV增强剂和裂解缓冲液,其中的每一种都被设计成从哺乳动物细胞,例如HEK293细胞的悬浮培养物中提供最大AAV产生。使用这种新系统能够递送至多约2×1011个病毒基因组每毫升(vg/mL)的非浓缩的AAV载体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年2月22日提交的美国临时申请第62/809,407号的优先权和权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文中。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种会感染人和一些非人灵长类动物细胞的小DNA病毒。已知AAV不会引起疾病并且在人中具有低免疫原性。可以生产含有所关注的DNA序列、具有很少或没有病毒基因的AAV载体。这些优势使得AAV载体已在基因疗法和其它临床和研究目的中使用。
需要大规模产生AAV载体和产生高滴度的方法。
发明内容
本技术通常涉及一种在无血清悬浮平台中和高滴度下产生载体的新AAV系统。这种技术所采用的新开发的一组专有良好制造工艺(GMP)试剂包括培养基、细胞、转染试剂、AAV增强剂和裂解缓冲液,其中的每一个都被设计成从哺乳动物细胞的悬浮培养物中提供最大AAV产生。使用这种新系统能够递送至多约2×1011个病毒基因组每毫升(vg/mL)的非浓缩的AAV载体(也就是说,在使用本文所描述的采集方法采集后尚未被进一步浓缩的载体)。
一方面,本文中提供了一种用于AAV载体产生的方法,所述方法包含:(i)培养哺乳动物细胞;(ii)使用转染试剂用AAV转移载体转染所述哺乳动物细胞;(iii)使经转染的细胞与AAV增强剂接触;(iv)以及将所述经转染的细胞在悬浮培养物中培养足以包装所述AAV载体的一段时间,由此产生经转染的AAV细胞培养物。在实施例中,在悬浮培养物中培养所述哺乳动物细胞。在实施例中,所述方法包含从所述经转染的AAV细胞培养物中采集AAV。在实施例中,使用裂解缓冲液采集所述AAV。在实施例中,所述转染步骤包含使所述细胞与转染促进剂接触。
在实施例中,所述方法包含对所采集的AAV进行滴定。在实施例中,使用定量PCR对所述AAV进行滴定。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约2×1010个病毒基因组每毫升(vg/mL)。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约2×1011vg/mL之间。
在实施例中,以约10毫升(mL)到约800升(L)的体积培养所述细胞。在实施例中,以约1L到约10L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积转染所述细胞。在实施例中,以约1L到约2L的体积转染所述细胞。
在实施例中,在生物反应器中培养所述细胞。
在实施例中,在支持HEK293细胞生长和扩增的培养基中培养所述细胞。在实施例中,在培养期间(例如,在转染后)使所述细胞与AAV产生增强剂接触。
一方面,本文提供了一种AAV产生系统,其包含:HEK293细胞;AAV转移载体;包装质粒;AAV产生增强剂;以及细胞培养基,所述细胞培养基支持所述HEK293细胞生长和扩增。在实施例中,所述AAV产生系统包含转染试剂。在实施例中,所述AAV产生系统包含转染促进剂。在实施例中,所述AAV产生系统包含裂解缓冲液。在实施例中,所述HEK293细胞以至少约0.3×106个细胞/mL的密度存在。在实施例中,所述HEK293细胞以至少约2×106个细胞/mL的密度存在。在实施例中,所述HEK293细胞以介于约0.3×106个细胞/mL与约1×107个细胞/mL之间的密度存在。在实施例中,所述AAV载体在采集后以至少约2×1010个病毒基因组每毫升(vg/mL)的滴度存在。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含表面活性剂。在实施例中,所述表面活性剂是Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188(poloxamer 188)和NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液不包含表面活性剂。在实施例中,所述裂解缓冲液包括以下中的至少一种:Tris-HCl、tricine HCL、柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和磷酸二氢钠。在实施例中,所述裂解缓冲液包括至少一种洗涤剂。在实施例中,所述洗涤剂是CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、辛基硫葡萄糖苷和/或脱氧胆酸钠。
在实施例中,所述AAV产生增强剂包含以下中一种或多种:组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠、蛋卵磷脂、乙酸锂、曲古抑菌素羟基脲、诺考达唑-DMSO(nocodazole-DMSO)、NaCl和咖啡因。在实施例中,所述HDAC抑制剂是阿匹西定(apicidin)、贝利司他(belinostat)、CI-994、CRA-024781、姜黄素、帕比司他(panobinostat)、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。在实施例中,所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。在实施例中,所述AAV增强剂是在转染后介于约0小时与约6小时之间添加的。
在实施例中,所述转染试剂包含阳离子脂质。在实施例中,所述转染试剂进一步包含肽。在实施例中,所述转染促进剂包含阳离子脂质。在实施例中,所述转染促进剂包含肽。在实施例中,所述肽是膜穿透肽。U.S.9,856,496中提供了膜穿透肽的非限制性实例,所述文献以全文引用的方式并入本文中。在实施例中,以介于5:1与约1:5(体积/重量)之间的转染促进剂:DNA的比率使用所述转染促进剂。
在实施例中,所述哺乳动物细胞是HEK293细胞或HEK293细胞的衍生物。在实施例中,所述HEK293细胞已经适于在AAV载体产生系统中进行高AAV表达。在实施例中,所述HEK293细胞可以以至少0.3×106个细胞每毫升(个细胞/mL)的密度在悬浮培养物中生长。在实施例中,所述HEK293细胞可以以至多1.2×107个细胞每毫升(个细胞/mL)的密度在悬浮培养物中生长。在实施例中,以介于约2.5×106个细胞/mL与约4×106个细胞/mL之间的细胞密度转染所述细胞。
在实施例中,不使用辅助病毒。在实施例中,所述方法包含用包装质粒转染所述细胞。在实施例中,所述AAV产生系统包含包装质粒。在实施例中,所述包装质粒包括pRC和pHelper。
在实施例中,在采集AAV前不对所述细胞进行离心。
在实施例中,所述细胞不包括大T抗原。
一方面,本文提供了一种用于腺相关病毒(AAV)产生的试剂盒。在实施例中,所述试剂盒包含:HEK293细胞;增强剂;转染试剂,所述转染试剂包括阳离子脂质;以及细胞培养基,所述细胞培养基支持所述HEK293细胞生长和扩增。在实施例中,所述转染试剂含有阳离子脂质和肽。
在实施例中,所述试剂盒包含转染促进剂。在实施例中,所述转染促进剂含有肽。
在实施例中,所述试剂盒包含裂解缓冲液。在实施例中,所述裂解缓冲液含有至少一种表面活性剂。在实施例中,所述表面活性剂是Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188和/或NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有Tris-HCl、柠檬酸钠、TricineHCL、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和/或磷酸二氢钠。在实施例中,所述裂解缓冲液包含至少一种洗涤剂。在实施例中,所述洗涤剂是CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、脱氧大CHAP、Triton X-114、辛基硫葡萄糖苷和/或脱氧胆酸钠。
附图说明
图1示出了不同条件对AAV2的产生的影响。与系统1相比,在以下三种不同条件下通过由聚乙烯亚胺(PEI)转染的粘附HEK293细胞(6孔板)产生AAV2病毒:Prot-1(增强剂1和补充剂1);Prot-2(补充剂1,无增强剂);Prot-3(增强剂1,无补充剂)。
图2示出了适于四种不同类型的培养基中的HEK293F细胞的AAV2产生比较。
图3示出了用于AAV产生的三种不同系统的比较。将适于培养基4的HEK293细胞如实例中详述的用系统1、系统2和系统3进行测试。
图4A-4B示出了适于培养基4的克隆HEK293细胞(克隆45)的生长特性。培养基支持在高细胞活力的情况下以高密度(约11×106个细胞/mL)生长的克隆45细胞(图4A)。如图4B中所示出的,细胞在高密度下凝集非常有限。
图5A-5E示出了克隆HEK293细胞中不同AAV血清型的产生。对照:培养基4中的亲本HEK293细胞;Expi45:Expi293培养基中的克隆45;Cl45、Cl12、Cl22和Cl51:培养基4中的所指示的HEK293克隆。
图6示出了转染试剂的比较。针对AAV2产生,将转染试剂1(TR1)与转染试剂2(TR2)进行比较。
图7示出了增强剂添加的定时对AAV产生系统中的病毒滴度的影响。
图8示出了AAV裂解缓冲液中的各种洗涤剂对病毒滴度的影响。
图9示出了来自不同的AAV血清型的细胞沉淀物对全转染细胞培养物的提取物AAV滴度。
图10A-10B示出了克隆45、亚克隆系C13和C20以及LV293细胞(VPC)在转染后在AAV产生(图10A)和细胞活力(图10B)方面的比较。
图11A-11B示出了克隆45和LV293细胞(VPC)在AAV产生方面的比较:图11A对不同AAV血清型的所获得的病毒滴度(vg/mL)进行比较;图11B将来自每个克隆细胞系的所采集的AAV2和AAV6的感染性(如Ht1080中的GFP%所表示的)进行比较。
图12A-12B示出了克隆45AAV系统和LV293-PEI系统在采集后在AAV6产生(vg/ml,图12A)和AAV6感染性(如Ht1080中的GFP%所表示的,图12B)方面的比较。
图13A-13B示出了克隆45AAV系统和HEK293T-PEI系统在AAV产生方面的比较:图13A对不同AAV血清型的所获得的病毒滴度(vg/mL)进行比较;图13B对来自每个系统的所采集的AAV2、AAV6和AAV-dj的感染性(如Ht1080中的GFP%所表示的)进行比较。
图14示出了硅藻土过滤之前和之后的粗裂解物中的AAV滴度。
具体实施方式
在阅读本说明书之后,对于本领域的技术人员而言,如何在各个替代性实施例和替代性应用中实施本发明将变得显而易见。然而,本文中将不描述本发明的所有各个实施例。将理解的是,此处所呈现的实施例仅通过举例而非限制的方式进行呈现。如此,各个替代性实施例的这种详细描述不应被解释为限制如下文所阐述的本发明的范围或广度。
在公开和描述本发明之前,应当理解,以下描述的方面并不限于具体组合物、制备此类组合物的方法或其用途,因而这些方面当然可以变化。还应当理解,本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的,而不旨在是限制性的。
本发明的详细描述仅出于读者的方便而被分成各个部分,并且在任何部分中发现的公开内容可以与在另一个部分中的公开内容组合。为了方便读者,可以在说明书中使用标题或子标题,其并不旨在影响本发明的范围。
定义
除非另有定义,否则本文所使用的全部技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。在本说明书和以下权利要求书中,将参考多个术语,所述多个术语应被定义为具有以下含义:
本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,而不旨在限制本发明。除非上下文另外清楚地说明,否则如本文所用,单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在包含复数形式。
“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”是指随后描述的事件或情况可能发生或不发生,并且所述描述包含事件或情况发生的实例以及事件或情况不发生的实例。
当在包含范围的数值指定例如温度、时间、量、浓度以及此类其它之前使用时,术语“约”指示可以变化(+)或(-)10%、5%、1%或在其之间的任何子范围或子值的近似值。优选地,当关于剂量使用时,术语“约”意指剂量可以变化+/-10%。
“包括(comprising)”或“包括(comprises)”旨在意味着组合物和方法包含所叙述的要素,但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时,“基本上由……组成(consistingessentially of)”应当意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其它要素。因此,基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除对所要求保护的发明的基本和新颖特性不具有实质影响的其它材料或步骤。“由……组成(consisting of)”应当意味着排除超过痕量要素的其它成分和大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施例处于本发明的范围内。
腺相关病毒(AAV)产生系统
如本文所用,术语“细胞”是指包含所有类型的真核和原核细胞。在一些实施例中,术语是指真核细胞,尤其是哺乳动物细胞。在某些示例性但非限制性实施例中,术语“细胞”意指人胚胎肾(HEK)或人293细胞或其变体,例如可以以悬浮形式生长的293(HEK293)变体。在一些实施例中,可以在悬浮培养物中生长、增殖和转染的293细胞的变体,特别是可以以高密度培养的那些变体(例如,至少约2×106个细胞/mL、至少约3×106个细胞/mL或甚至任选地至少约4×106个细胞/mL或约1.2×106个细胞/mL)。
在一些实施例中,当在培养细胞和进行转染工作流程的上下文中使用时,术语“高密度”通常是指已知细胞系或已知细胞系的变体,其可以在合适的细胞培养基中生长或培养到密度为至少约2×106个细胞/mL、至少约3×106个细胞/mL或甚至任选地至少约4×106个细胞/mL,同时仍然保持高效转染的能力,并且能够以高滴度例如5×1010个病毒基因组每mL(vg/mL)或更多表达目标AAV载体。
在一些实施例中,细胞适于高密度细胞培养。这是指衍生自相同亲本细胞谱系的细胞谱系或(非克隆)细胞群,其已经适于在高密度培养基中以高密度生长,同时保持细胞活力为或高于约80%。通过将细胞维持在高密度≥约40次、50次、60次、70次或80次连续传代,并逐渐用所需的高密度培养基替换生长培养基的比例,可以从亲代细胞群分离或选择这种细胞。任选地,在过程期间,不同的细胞池可以单独地繁殖且经历选择程序,同时同步评估转染效率和或AAV载体生产效率,使得可以选择可以以高密度维持并生长、高效转染并表达高滴度的AAV的克隆细胞群。可以使用已知的方法和技术例如流式细胞术分选和/或单细胞克隆来产生克隆细胞群。在实施例中,流式细胞术分选用于分离适于高密度细胞培养并在AAV产生系统中使用的细胞克隆。在一些实施例中,通过单细胞克隆获得适于高密度细胞培养并在AAV产生系统中使用的细胞克隆,并且使用已知技术如成像将其确认为单细胞克隆。虽然熟练的从业者将容易地显而易见多种细胞类型和谱系可以经历这种选择程序,但是已经确定,衍生自293人胚胎肾细胞的细胞谱系特别适合于适应高密度生长条件的选择过程。在一些场景中,适于高密度生长培养且适合于在本文中使用的细胞还将能够高效转染和/或能够以超过至少约5×109vg/mL至多约5×1012vg/mL、介于约1×1010vg/mL至多约2×1011vg/mL之间、介于约1×1010vg/mL至多约1×1011vg/mL之间、介于约8×1010vg/mL到约3×1011vg/mL之间、介于约5×1010vg/mL到约2×1011vg/mL的非浓缩的AAV载体的产率表达AAV载体。在一些场景中,所使用的适于高密度培养的细胞能够以范围为约1×106个细胞/mL到约2×107个细胞/mL、约1×106个细胞/mL到约3×106个细胞/mL、约2×106个细胞/mL到约4×106个细胞/mL或约2.5×106个细胞/mL到约4×106个细胞/mL的密度维持和转染。在一些实施例中,细胞可以适于高密度培养,并且以范围为约1×106个细胞/mL到约2×107个细胞/mL、约1×106个细胞/mL到约4×106个细胞/mL、约1×106个细胞/mL到约3×106个细胞/mL、约1×106个细胞/mL到约2×106个细胞/mL的密度转染。
在一些实施例中,细胞在悬浮培养物中生长。这包含细胞培养物,其中培养容器中的大部分或全部细胞以悬浮形式存在,并且培养容器中的少数细胞或没有细胞附着于容器表面或容器内的另一个表面。在一些实施例中,悬浮培养物具有≥约75%的培养容器中的细胞处于悬浮状态,未附着于培养容器上或培养容器中的表面。在一些实施例中,悬浮培养物具有≥约85%的培养容器中的细胞以悬浮形式存在,未附着于培养容器上或培养容器中的表面。在一些实施例中,悬浮培养物具有≥约95%的培养容器中的细胞以悬浮形式存在,未附着于培养容器上或培养容器中的表面。
AAV产生系统允许293细胞或衍生自其的细胞能够以约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL的密度生长且5天之后细胞死亡少于20%。在实施例中,所述细胞能够以约0.3×106个细胞/mL到约12×106个细胞/mL的密度生长且5天之后细胞死亡小于20%。在一些实施例中,如本文所提供的所述293细胞能够以如约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL或约0.3×106个细胞/mL到约12×106个细胞/mL的高密度生长且6天之后、7天之后或8天之后细胞死亡小于20%。在实施例中,所述293细胞能够以如约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL或约0.3×106个细胞/mL到约12×106个细胞/mL的高密度生长且5天之后、6天之后、7天之后或8天之后细胞死亡小于10%。
以另一种方式所描述的,本文所提供的所述AAV产生系统允许293细胞或衍生自其的细胞能够以约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL的密度生长且5天之后培养物中的细胞活力大于80%。在实施例中,所述细胞能够以约0.3×106个细胞/mL到约12×106个细胞/mL的密度生长且5天之后培养物中的细胞活力大于80%。在一些实施例中,如本文所提供的所述293细胞能够以如约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL或约0.3×106个细胞/mL到约12×106个细胞/mL的高密度生长且6天之后、7天之后或8天之后培养物中的细胞活力大于80%。在实施例中,所述293细胞能够以如约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL或约0.3×106个细胞/mL到约12×106个细胞/mL的高密度生长且5天之后、6天之后、7天之后或8天之后培养物中的细胞活力大于90%。
在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物如克隆45、克隆45的亚克隆和本文所描述的其它克隆在高密度培养3天之后具有比HEK293F细胞、Expi293FTM细胞或LV293(LV-MAX病毒产生细胞)(均可从赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)获得)的活力高至少10%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养4天之后、5天之后、6天之后、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高至少10%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天之后、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高至少15%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高至少20%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高至少25%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高至少30%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高至少40%的活力。在实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天之后、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高约10%到约30%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天之后、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高约20%到约40%的活力。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物在高密度培养3天之后、4天之后、5天之后、6天之后、7天之后或8天之后具有比HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的活力高约25%到约50%的活力。
在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物如克隆45、克隆45的亚克隆和本文所描述的其它克隆产生比相同量的HEK293F细胞、Expi293FTM细胞或LV293(LV-MAX病毒产生细胞)(均可从赛默飞世尔科技公司获得)的AAV载体产率或滴度显著更高的AAV载体产率或滴度(vg/mL)。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物产生的所采集的AAV滴度(vg/mL)是来自相同量的HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的所采集的滴度的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少18倍、至少20倍。在一些实施例中,如本文所提供的适于高密度的293细胞的悬浮培养物产生的所采集的AAV滴度(vg/mL)是来自相同量的HEK 293F、Expi293F或LV293细胞的AAV载体产率或滴度(vg/mL)所采集的滴度的约2到约20倍、约2到约5倍、约2到约10倍、约5到约15倍、约5到约10倍、约7到约20倍、约10到约15倍。
在实施例中,所述细胞在非常高的密度例如大于约8×106个细胞/mL下表现出有限的凝集。在实施例中,所述细胞在大于约9×106个细胞/mL下表现出有限的凝集。在实施例中,所述细胞在大于约10×106个细胞/mL下表现出有限的凝集。在实施例中,所述细胞在培养基中和在如本文所描述的条件下以非常高的密度生长时会表现出有限的凝集。
在实施例中,所述细胞的直径为介于约15μm与约20μm之间,如介于约16μm与约19μm之间或介于约16.5μm与约19μm之间。在实施例中,所述细胞在以约0.3×106个细胞/mL到约20×106个细胞/mL的密度生长时的直径为介于约15μm与约20μm之间。在实施例中,所述细胞在以约1×106个细胞/mL到约10×106个细胞/mL的密度生长时的直径为介于约16μm与约19μm之间。
在实施例中,适于高密度生长培养并且能够高效转染和/或能够以约5×109vg/mL到约5×1012vg/mL的产率表达AAV载体的293细胞不表达或包括大T抗原。
可以使用多种细胞培养基来培养AAV产生系统细胞。研究者通常需要无血清培养基。可以使用支持本文所描述的细胞的生长的任何培养基,包含无血清培养基。培养基也可以不含蛋白质。
“无血清培养基”(有时被称为“SFM培养基”)是不含血清(例如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清、山羊血清、人类血清等)的培养基且一般由字母SFM表示。短语“无蛋白质”培养基是指不含蛋白质(例如无血清蛋白,如血清白蛋白或贴附因子,营养蛋白,如生长因子,或金属离子载剂蛋白,如转铁蛋白、铜蓝蛋白等)的培养基。在一些实施例中,如果存在肽,则肽是较小肽,例如二肽或三肽。在一些实施例中,十肽长度或更长的肽不超过无蛋白质培养基中存在的氨基酸的约1%,不超过约0.1%,和不超过约0.01%。
在一些实施例中,可以使用高密度培养基,包含能够维持哺乳动物细胞的生长的任何培养基。在一些实施例中,细胞以至多约2×107个细胞/mL例如至多约12×106个细胞/mL的密度以悬浮形式生长,同时维持超过约80%如高于约90%的细胞活力并且进一步地维持所述悬浮细胞高效转染和表达高量的AAV载体的能力。所使用的高密度培养基可以在不同应用与用途之间变化,并且可能取决于正在使用的细胞系的性质、选择用于将表达载体转移到细胞中的转染模态的性质以及添加到如本文所描述的系统的任何表达增强剂的量和性质。在实施例中,本发明系统和方法中使用的高密度培养基是无血清和无蛋白质的。在实施例中,所述细胞培养基允许将悬浮细胞培养和生长达到至多约2×107个细胞/mL例如至多约1.2×107个细胞/mL或介于约2×106个细胞/mL到约1×107个细胞/mL之间的密度。在实施例中,所使用的所述培养基将使得在瞬时表达系统中产生的病毒滴度能够超过至少1×1010vg/mL至多约1×1012vg/mL或至多约2×1011vg/mL。在一些实施例中,所使用的高密度培养基将有助于细胞以范围为约1×106到约20×106个细胞/mL、约1×106到约4×106个细胞/mL或约2.5×106到约3×106个细胞/mL的密度转染。
适用于本文的高密度培养基的实例包含但不限于HuMEC基础无血清培养基、KNOCKOUTTM CTSTM XenoFREE ESC/iPSC培养基、STEMPROTM-34SFM培养基、STEMPROTM NSC培养基、ESSENTIALTM-8培养基、培养基254、培养基106、培养基131、培养基154、培养基171、培养基171、培养基200、培养基231、HeptoZYME-SFM、人类内皮-SFM、FREESTYLETM293表达培养基、培养基154CF/PRF、培养基154C、培养基154CF、培养基106、培养基200PRF、培养基131、EssentialTM-6培养基、STEMPROTM-34培养基、星形胶质细胞培养基、AIM培养基CTSTM、AMINOMAXTM C-100基础培养基、AMINOMAXTM-II完全培养基、CD FORTICHOTM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLETM CHO表达培养基、CDOPTICHOTM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、SF-900TM培养基、EXPI293TM表达培养基、LHC基础培养基、LHC-8培养基、293SFM培养基、CD 293培养基、AEM生长培养基、细胞培养基、AIM培养基、培养基、Keratinocyte-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修饰。在某些非限制性实施例中,高密度培养基可以是CD FORTICHOTM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLETMCHO表达培养基、CD OPTICHOTM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基、FREESTYLETM 293表达培养基、EXPI293TM表达培养基、LV-MAXTM产生培养基、FREESTYLETM F17表达培养基、DYNAMISTM培养基、HEK293培养基或类似培养基或其经修饰的版本。所述培养基可以是适用于(例如,被调配成用于)适于在高密度培养系统中使用的293细胞、293细胞变体或任何其它细胞的高密度生长、繁殖、转染和维持的任何培养基。
AAV产生系统还包括转染试剂或促进大分子进入到细胞中的组合物。在实施例中,所述转染试剂包括阳离子脂质。在实施例中,所述转染试剂是如美国专利第9,856,496号中所描述的阳离子脂质,所述美国专利以全引用的方式并入本文中。
在一些实施例中,用于将大分子引入到细胞中的试剂可以包括可以是阳离子脂质和/或中性脂质的一种或多种脂质。优选的脂质包含但不限于N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)、1,2-双(油酰基氧基)-3-(4'-三甲基铵基)丙烷(DOTAP)、二羟基-二肉豆蔻基精胺四盐酸(DHDMS)、羟基-二肉豆蔻基精胺四盐酸(HDMS)、1,2-二油酰基-3-(4'-三甲基铵基)丁酰基-sn-甘油(DOTB)、1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、胆固醇基(4'-三甲基铵基)丁酸酯(ChoTB)、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)、1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DOME)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)、O,O'-十二烷基-N-[p(2-三甲基铵基乙氧基)苯甲酰基]-N,N,N-三甲基氯化铵、与一种或多种脂质缀合的精胺(例如,5-羧基精胺基甘氨酸二十八烷基酰胺(DOGS)、N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四棕榈基精胺(TM-TPS)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPES))、脂聚赖氨酸(与DOPE缀合的聚赖氨酸)、与脂肪酸(TFA)和/或肽缀合的TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷,氨丁三醇)(如三赖氨酰-丙氨酰-TRIS单-、双-、三-棕榈酸酯)、(3B-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰]胆固醇(DCChol)、N-(α-三甲基铵基乙酰基)-二十二烷基-D-谷氨酸氯化物(TMAG)、二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-羧酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺-三乙酸铟(DOSPA)及其组合。任选地,所述转染试剂可以进一步包括至少一种另外的辅助脂质。辅助脂质是本领域已知的,并且包含但不限于优选地选自由DOPE、DOPC和胆固醇组成的组的中性脂质。在实施例中,所述转染试剂包括至少一种阳离子脂质和至少一种中性脂质。
本领域的技术人员将理解的是,上文提及的脂质的某些组合已经示出特别适合于将核酸引入到细胞中,例如,以3:1(w/w)组合的DOSPA和DOPE可从加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司(Life Technologies Corporation,Carlsbad,Calif.)以商品名LIPOFECTAMINETM获得,以1:1(w/w)组合的DOTMA和DOPE可从赛默飞世尔科技公司以商品名获得,以1:1(M/M)组合的DIVIRIE和胆固醇可从加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司以商品名DIVIRIE-C试剂获得;以1:1.5(M/M)组合的TM-TPS和DOPE可从生命技术公司获得。在一些实施例中,所述转染试剂是阳离子脂质转染试剂。在一些实施例中,所述转染试剂是基于聚合物的转染试剂。其它可商购获得的阳离子脂质转染试剂包含但不限于TRANSFASTTM(可从普洛麦格公司(Promega Corporation)获得);LYOVECTM(可从英杰公司(InvivoGen)获得);DOTAP脂质体转染试剂(可从罗氏公司(Roche)获得);转染试剂(可从米卢斯公司(Mirus)获得);以及昆虫转染试剂(EMD密理博公司(EMD Millipore))。可以在本文中使用的另外的转染试剂包含但不限于2000、3000,其可从赛默飞世尔科技公司获得;VIAFECTTM转染试剂、6转染试剂和HD转染试剂,其中的每种转染试剂均可从普洛麦格公司获得;以及TRANSFECTINTM脂质试剂,其可从伯乐实验室有限公司(BioRad Laboratories,Inc.)获得。
在实施例中,所述转染试剂与转染促进剂组合。在实施例中,所述转染促进剂包含肽。在实施例中,所述转染促进剂包括至少一种肽。在实施例中,所述转染促进剂的所述至少一种肽是天然存在或非天然存在的膜穿透肽。在实施例中,所述转染促进剂的所述至少一种肽包括天然存在或非天然存在的膜穿透肽序列。美国专利第9,856,496号中提供了适合的膜穿透肽和肽序列的非限制性实例,所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。在实施例中,所述转染促进剂的所述至少一种肽是融合肽、细胞穿透肽、核定位肽、细胞表面粘附肽或植物病毒移动肽。在实施例序列中,所述转染促进剂的所述至少一种肽包括融合肽序列、细胞穿透肽序列、核定位肽序列、细胞表面粘附肽序列或植物病毒移动肽序列。美国专利申请公开第2017/0253888A1号中提供了适合的融合、细胞穿透、核定位、细胞表面粘附和植物病毒移动肽和肽序列的非限制性实例,所述美国专利申请公开以全文引用的方式并入本文中。
在实施例中,所述转染试剂与转染促进剂和AAV转移载体组合以形成转染复合物。在实施例中,所述转染试剂与转染促进剂、rep/cap质粒(pRC)、pHelper质粒(对辅助病毒组分进行编码)和AAV转移载体组合以形成转染复合物。
在实施例中,所述AAV产生系统包含裂解缓冲液。裂解缓冲液是一种用于破碎细胞并释放其内容物例如AAV载体的缓冲溶液。在实施例中,以5倍浓度(与细胞接触的最终浓度的五倍)提供所述裂解缓冲液。在实施例中,以10倍浓度(与细胞接触的最终浓度的十倍)提供所述裂解缓冲液。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有洗涤剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自以下的至少一种洗涤剂:CHAP、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-([3-胆酰氨基丙基]二甲基铵)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)、N,N-双-(3-D-葡糖酰氨基丙基)脱氧胆酰胺(大CHAP)、辛基硫葡萄糖苷(OTG)和脱氧胆酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、OTG和脱氧胆酸钠的一种洗涤剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、OTG和脱氧胆酸钠的两种洗涤剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、OTG和脱氧胆酸钠的三种洗涤剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、OTG和脱氧胆酸钠的四种或更多种洗涤剂。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.005%与约1%(w/v)之间的CHAP。在实施例中,CHAP以介于约0.01%与约1%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。在实施例中,CHAP以介于约0.01%与约0.8%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.005%与约1%(w/v)之间的CHAPS。在实施例中,CHAPS以介于约0.01%与约1%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。在实施例中,CHAPS以介于约0.01%与约0.8%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.005%与约1%(w/v)之间的CHAPSO。在实施例中,CHAPSO以介于约0.01%与约1%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。在实施例中,CHAPSO以介于约0.01%与约0.8%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.005%与约1%(w/v)之间的大CHAP。在实施例中,大CHAP以介于约0.01%与约1%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。在实施例中,大CHAP以介于约0.01%与约0.8%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.005%与约1%(w/v)之间的OTG。在实施例中,OTG以介于约0.01%与约1%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。在实施例中,OTG以介于约0.01%与约0.8%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液包含浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.005%与约1%(w/v)之间的脱氧胆酸钠。在实施例中,脱氧胆酸钠以介于约0.01%与约1%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。在实施例中,脱氧胆酸钠以介于约0.01%与约0.8%(w/v)之间的浓度(与细胞接触的最终浓度)存在于所述裂解缓冲液中。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自以下的至少一种表面活性剂:Triton-100、Triton-alter、NP40和泊洛沙姆188(聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物;F-68)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自Triton-100、Triton-alter、NP40和泊洛沙姆188的一种表面活性剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自Triton-100、Triton-alter、NP40和泊洛沙姆188的两种表面活性剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自Triton-100、Triton-alter、NP40和泊洛沙姆188的三种表面活性剂。在实施例中,所述裂解缓冲液含有选自Triton-100、Triton-alter、NP40和泊洛沙姆188的四种表面活性剂。泊洛沙姆188具有以下式(I):
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.01%与约0.1%(w/v)之间的Triton-100或Triton-alter。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.05%与约0.1%(w/v)之间的Triton-100或Triton-alter。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.01%与约0.05%(w/v)之间的Triton-100或Triton-alter。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.05%与约0.5%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1%与约0.5%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.2%与约0.5%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.3%与约0.5%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.4%与约0.5%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.05%与约0.4%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.05%与约0.3%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.05%与约0.2%(w/v)之间的NP40。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.05%与约0.1%(w/v)之间的NP40。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.08%与约0.2%(w/v)之间的泊洛沙姆188。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.09%与约0.2%(w/v)之间的泊洛沙姆188。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1%与约0.2%(w/v)之间的泊洛沙姆188。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.08%与约0.15%(w/v)之间的泊洛沙姆188。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.08%与约0.1%(w/v)之间的泊洛沙姆188。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有至少一种盐。在实施例中,所述盐是柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸铵、磷酸铵和/或磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约1000mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约500mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约400mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约300mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约200mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约100mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约1000mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约500mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约400mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约300mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约200mM之间的柠檬酸钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约100mM之间的柠檬酸钠。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约1000mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约500mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约400mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约300mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约200mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约100mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约1000mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约500mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约400mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约300mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约200mM之间的氯化钠。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM与约100mM之间的氯化钠。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约500mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约250mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约100mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约50mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约10mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约500mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约250mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约100mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约50mM之间的磷酸铵。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约10mM之间的磷酸铵。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约500mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约250mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约100mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约50mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5mM与约10mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约500mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约250mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约100mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约50mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约10mM之间的磷酸钠(例如,磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸三钠)。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有螯合剂。在实施例中,所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA三钾和/或乙二醇四乙酸(EGTA)。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约50mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约40mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约30mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约20mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约10mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约5mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约50mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约40mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约30mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约20mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约10mM之间的EDTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约5mM之间的EDTA。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约50mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约40mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约30mM之间的EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约20mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约10mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约5mM之间的EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约50mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约40mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约30mM之间的EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约20mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约10mM之间EDTA三钾。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约5mM之间的EDTA三钾。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约50mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约40mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约30mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约20mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约10mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.1mM与约5mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约50mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约40mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约30mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约20mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约10mM之间的EGTA。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM与约5mM之间的EGTA。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有至少一种另外的化合物。例如,裂解缓冲液可以含有3-(1-吡啶基)丙烷磺酸盐(NDSB 201;非洗涤剂硫代甜菜碱201)。在实施例中,所述裂解缓冲液含有Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有氢氧化钠(NaOH)。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5M到约1M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.6M到约1M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.7M到约1M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.8M到约1M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.9M到约1M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5M到约0.9M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5M到约0.8M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5M到约0.7M之间的NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约0.5M到约0.6M之间的NDSB-201。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约5mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约6mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约8mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约12mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约14mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约15mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约12mM到约20mM之间的Tris-HCl。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约15mM到约20mM之间的Tris-HCl。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约20mM到约100mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约40mM到约100mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约50mM到约100mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约60mM到约100mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约80mM到约100mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约20mM到约80mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约20mM到约60mM之间的柠檬酸。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约20mM到约40mM之间的柠檬酸。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM到约50mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约10mM到约50mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约20mM到约50mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约30mM到约50mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约40mM到约50mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM到约40mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM到约30mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM到约20mM之间的NaOH。在实施例中,所述裂解缓冲液含有浓度(与细胞接触的最终浓度)为介于约1mM到约10mM之间的NaOH。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
AAV产生系统还包括AAV产生增强剂(AAV增强剂)。所述AAV增强剂包括以下中的一种或多种:组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠、丁酸钠、可可碱和咖啡因。
在一些实施例中,所述HDAC抑制剂选自阿匹西定、贝利司他、CI-994、CRA-024781、姜黄素、帕比司他、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A和丙戊酸。在实施例中,所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。
在实施例中,丙酸钠和/或HDAC抑制剂以水的形式提供。在实施例中,咖啡因在细胞培养表达培养基如Expi293TM表达培养基中提供。
在实施例中,丙酸钠以约1mM到50mM的浓度(与细胞接触的最终浓度)包含在内。在实施例中,丙酸钠以约1mM到40mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约1mM到30mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约1mM到20mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约1mM到10mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约1mM到5mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约2mM到30mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约2mM到20mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约2mM到10mM包含在内。在实施例中,丙酸钠以约2mM到5mM包含在内。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约100mM的浓度(与细胞接触的最终浓度)包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约75mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约50mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约25mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约10mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约9mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约8mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约7mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约6mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约0.1mM到约5mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约100mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约50mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约25mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约10mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约9mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约8mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约7mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约6mM的浓度包含在内。在实施例中,所述HDAC抑制剂以约1mM到约5mM的浓度包含在内。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约50mM的浓度(与细胞接触的最终浓度)包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约25mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约15mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约10mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约9mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约8mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约7mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约6mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约5mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约4mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约3mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.1mM到约2mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.5mM到约50mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.5mM到约10mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.5mM到约5mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.5mM到约4mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.5mM到约3mM的浓度包含在内。在实施例中,咖啡因以约0.5mM到约2mM的浓度包含在内。浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
在一些实施例中,所述AAV增强剂是在一个或多于一个时间点添加的,如在转染时(约0小时)直到转染之后约48小时。所述AAV增强剂可以在转染之后约1小时到约16小时添加以促进AAV载体的细胞包装。在一些实施例中,所述AAV增强剂可以在转染时添加。在一些实施例中,所述AAV增强剂可以在转染时和转染之后约1小时到约16小时添加。在一些实施例中,所述AAV增强剂可以在转染之后约4到5小时添加。在一些实施例中,所述AAV增强剂可以在转染之后约0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、16小时、24小时、36小时或48小时添加。所述AAV增强剂可以在包含端点在内的所叙述范围内的任何时间(或子范围)添加。
AAV载体的设计和产生是本领域已知的。参见例如美国专利第5,354,678号;第6,759,237号;第5,753,500号;和第5,474,935号。为了正确包装AAV,可以使用包装质粒。这些质粒对包装AAV载体所必需的基因进行编码。此类基因包含表达衣壳蛋白(cap)和复制(rep)基因的基因。可替代地,所述基因可以由细胞稳定表达。所述AAV基因可以是来自包含但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ或DJ/8的任何血清型AAV的任何。对AAV rep和cap基因进行编码的包装质粒通常被称为pAAV-RC、pRep/Cap或pRC质粒。AAV转移载体、包装质粒、包装细胞系和用于AAV产生的其它产物可例如从细胞实验室有限公司(Cell Biolabs,Inc.)、载体生物实验室(Vector Biolabs)、阿德基因公司(Addgene)、克隆技术公司(Clontech)和赛默飞世尔科技公司商购获得。
在实施例中,辅助病毒(例如,来自腺病毒或疱疹病毒)组分是AAV产生系统的正常功能所必需的。辅助病毒组分可以存在于质粒上(并且通常被称为pAAV-Helper或pHelper质粒)或以其它方式存在于细胞中。辅助病毒组分包含但不限于E1A、E1B、E2A、E4和/或VA。
本文提供了一种用于腺相关病毒(AAV)产生的试剂盒。在实施例中,所述试剂盒包含:293细胞,其适于高密度悬浮培养物;AAV产生增强剂;转染试剂,所述转染试剂包括阳离子脂质;以及细胞培养基,所述细胞培养基支持所述293细胞生长和扩增。在实施例中,所述转染试剂含有阳离子脂质和肽。在实施例中,所述转染试剂包括至少一种阳离子脂质和至少一种中性脂质。在实施例中,所述AAV产生增强剂包括以下中的一种或多种:HDAC抑制剂、丙酸钠、丁酸钠、可可碱和咖啡因。在实施例中,所述293细胞不包括大T抗原。
在实施例中,所述试剂盒包含转染促进剂。在实施例中,所述转染促进剂含有肽。在实施例中,所述转染促进剂含有膜穿透肽。
在实施例中,所述试剂盒包含裂解缓冲液。在实施例中,所述裂解缓冲液含有至少一种表面活性剂。在实施例中,所述表面活性剂是Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188和/或NDSB-201。在实施例中,所述裂解缓冲液含有Tris-HCl、柠檬酸钠、TricineHCL、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和/或磷酸二氢钠。在实施例中,所述裂解缓冲液包含至少一种洗涤剂。在实施例中,所述洗涤剂是CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、脱氧大CHAP、Triton X-114、辛基硫葡萄糖苷和/或脱氧胆酸钠。
用于使用腺相关病毒(AAV)产生系统的方法
如本文所描述的AAV产生系统可以用于产生AAV载体。在实施例中,所述AAV载体以高滴度产生。
一方面,提供了一种用于AAV载体产生的方法,所述方法包含:(i)培养哺乳动物细胞;(ii)使用转染试剂用AAV转移载体转染所述哺乳动物细胞;以及(iii)将所述经转染的细胞在悬浮培养物中培养足以表达所述AAV载体的一段时间。在实施例中,在悬浮培养物中培养所述哺乳动物细胞。在实施例中,所述方法包含从所述经转染的AAV细胞培养物中采集AAV。在实施例中,所述转染步骤包含使所述细胞与转染促进剂接触。在实施例中,在转染之后使所述细胞与增强剂接触。
在实施例中,在添加到所述细胞之前,将所述转染试剂与所述AAV转移载体组合以形成DNA/转染试剂复合物。在实施例中,在添加到所述细胞之前,将所述转染试剂与所述AAV转移载体、所述pRep/Cap质粒和所述pHelper质粒组合以形成DNA/转染试剂复合物。
在其它实施例中,将所述转染促进剂与所述AAV转移载体组合以形成DNA/转染促进剂混合物,并且然后在添加到所述细胞之前,将所述转染试剂与所述DNA/转染促进剂混合物组合。在实施例中,将所述转染促进剂与AAV转移载体、所述pRep/Cap质粒和所述pHelper质粒组合以形成DNA/转染促进剂混合物,并且然后在添加到所述细胞之前,将所述转染试剂与所述DNA/转染促进剂混合物组合。在一些实施例中,将所述DNA和所述转染促进剂在管中组合,将所述转染试剂稀释到第二管中的培养基中,并且然后将稀释的转染试剂添加到DNA/转染促进剂混合物以形成DNA/转染促进剂/转染试剂复合物。在其它实施例中,将所述DNA和所述转染促进剂在管中组合,并且然后将所述转染试剂添加到同一管以形成DNA/转染促进剂/转染试剂复合物。在其它实施例中,将所述DNA和所述转染试剂在管中组合,并且然后将所述转染促进剂添加到同一管以形成DNA/转染促进剂/转染试剂复合物。
在实施例中,以介于5:1与约1:5(体积/重量)之间的转染促进剂:DNA的比率使用所述转染促进剂。在实施例中,所述转染试剂与转染促进剂、rep/cap质粒(pRC)、pHelper质粒(对辅助病毒组分进行编码)和AAV转移载体组合以形成转染复合物。
在实施例中,使用裂解缓冲液采集所述AAV。在实施例中,在采集AAV前不对所述细胞进行离心。在实施例中,将所述裂解缓冲液直接添加到所述经转染的细胞培养物(例如,细胞和培养基)。
在实施例中,在下游加工过程如核酸酶处理和纯化过程之前过滤含有AAV的粗培养裂解物。在实施例中,将所述粗裂解物与硅藻土混合,并且然后使所述混合物通过过滤器例如2微米过滤器以回收所采集的AAV。可替代地,纤维素过滤步骤可以与粗裂解物一起使用以产生准备用于下游加工过程的AAV制剂。例如用硅藻土、纤维素或等同物对粗AAV裂解物进行此种过滤步骤会减少所需的过滤器数量并且会减少AAV裂解物在纯化过程之前的过滤和加工过程时间。
在实施例中,在生物反应器中培养所述细胞。在实施例中,在烧瓶中培养所述细胞。
在实施例中,所述方法包含对所采集的AAV进行滴定。可以使用任何方法对所述AAV进行滴定。在实施例中,使用聚合酶链反应(PCR)对所述AAV进行滴定。在实施例中,使用定量PCR(qPCR)对所述AAV进行滴定。在实施例中,使用数字液滴PCR对所述AAV进行滴定。在实施例中,使用ELISA对所述AAV进行滴定。在实施例中,使用病毒滴度试剂盒例如QUICKTITERTM AAV定量试剂盒(细胞实验室有限公司)对所述AAV进行滴度;还参见美国专利第6,841,357号,所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。在实施例中,通过确定可以转导细胞的病毒颗粒的浓度(感染性滴度),例如通过细胞转导测定来对所述AAV进行滴定。在实施例中,使用DNA斑点印迹对所述AAV进行滴定。
在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约1×1010个病毒基因组每毫升(vg/mL)。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约2×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约3×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约4×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约5×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约6×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约7×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约8×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约9×1010vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约1×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约2×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约3×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约4×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约5×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约6×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约7×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约8×1011vg/mL。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度为至少约9×1011vg/mL。
在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约1×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约3×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约4×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约5×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约6×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约7×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约8×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约9×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约1×1011vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1011vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约3×1011vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约4×1011vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约5×1011vg/mL与约1×1012vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约9×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约8×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约7×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约6×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约5×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约4×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约3×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约2×1011vg/mL之间。在实施例中,所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约1×1011vg/mL之间。滴度可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
可以在支持细胞生长和AAV产生的任何体积的细胞培养基中培养所述细胞。在实施例中,以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积培养所述细胞。在实施例中,以约30mL到约200L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约50mL到约200L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约100mL到约200L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约500mL到约200L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约1L到约200L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约10L到约200L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15mL到约100L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15mL到约50L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15mL到约20L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15mL到约5L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15mL到约1L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约15mL到约500mL的体积培养所述细胞。在实施例中,以约500mL到约10L的体积培养所述细胞。在实施例中,以约1L到约10L的体积培养所述细胞。培养体积可以是所叙述范围内的任何值或子范围,包含端点。
应当理解,本文所描述的实例和实施例仅是出于说明性目的,并且根据其进行的各种修改或改变将启发本领域的技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的特此通过引用整体并入。
实例
本领域技术人员应理解,对本文所描述的制备和使用颗粒的描述仅出于说明目的,并且本公开内容不受这种说明的限制。
实例1:培养条件对病毒滴度的影响
将粘附HEK293T细胞和HEK293F细胞在37℃、8%CO2和80%湿度下在温育箱中培养。在以下条件之一下使用PEI(HEK293T)或系统1(HEK293F)在6孔板中用AAV转移载体、pAAV-RC和pAAV-Helper以约4×106个细胞/mL的密度转染细胞:Prot-1(增强剂1和补充剂1);Prot-2(补充剂1,无增强剂);Prot-3(增强剂1,无补充剂)。系统1包含支持HEK293细胞生长和增殖的培养基(LV-MAXTM产生培养基,GIBCOTM,赛默飞世尔科技公司,目录号A3583401)、LV-MAXTM转染试剂、LV-MAXTM补充剂和LV-MAXTM增强剂(GIBCOTM,赛默飞世尔科技公司,目录号A35348)。通过以下来提取AAV:将200μL的5X AAV裂解缓冲液添加到800μL转染的细胞培养物,充分混合,并在室温下温育30分钟。温育后,将管倒置以完全裂解细胞,然后在台式离心机中以最大速度旋转10分钟。收集含有粗AAV的上清液。
用针对ITR2的引物和探针通过qPCR对AAV进行滴定。简而言之,用DNase和蛋白酶K对提取物进行处理。将提取物以1:50稀释于水中,并进行qPCR并与标准曲线(消化的AAV质粒)进行比较。
图1中提供了结果。针对HEK293F细胞,不含LV-MAXTM补充剂的系统1产生最高的AAV滴度。
实例2:培养基对病毒滴度的影响
在支持悬浮培养物中的HEK293F细胞的四种不同类型的可商购获得的培养基中建立HEK293F细胞。将细胞在其适应的培养基中冷冻,并在使用前解冻。用AAV转移载体(pAAV-GFP)转染解冻的细胞。将AAV转移载体、pAAV-RC2和pAAV-Helper在Opti-MEM复合物溶液缓冲液中与AAV转染试剂以1:4w/w的比率复合并且与转染促进剂以2:1(v/w)的比率复合,然后在室温下温育10分钟。温育后,将DNA/转染试剂复合物混合物直接添加到所制备的细胞培养物。AAV2产生在所有四种细胞系统/培养基类型的第6次细胞传代时发生。
图2示出了与所测试的其它培养基相比,适于培养基4中的HEK293F细胞产生更多的AAV2。
实例3:适应培养基4的细胞的特性
为了确定用于在培养基4中建立的HEK293F细胞的转染的最佳条件,对不同转染试剂的效应进行了评价。使用以下系统用AAV2、AAV6或AAV-Dj转染细胞:系统1:在具有LV-MAX转染试剂、增强剂和补充剂的情况下的HEK293F细胞(参见实例1);系统2:在具有LV-MAX增强剂和补充剂的情况下使用不同的转染试剂(转染试剂2)的HEK293F细胞;以及系统3:在没有补充剂的情况下用转染试剂2和LV-MAX增强剂的适应培养基4的HEK293细胞。针对所有AAV血清型,使用系统3的适应培养基4的HEK293细胞中的病毒滴度最高(图3)。转染试剂2是阳离子脂质转染试剂,其包含含肽的转染促进剂(如本文所描述的)。
实例4:克隆45细胞
对适应培养基4的HEK293细胞的克隆群(克隆45)的生长特性进行评价。在第5次传代时,克隆45细胞在培养基4中的250mL摇瓶中分裂到0.3×106个活细胞/mL的细胞的密度。每天收集细胞密度和细胞活力,持续9天。生长曲线示出于图4A中(插图:细胞活力百分比)。培养基4支持至多约11×106个细胞/mL的高细胞密度,并且高密度培养物中的克隆45细胞表现出高细胞活力。如图4B中所示出的,即使在高密度下,克隆45细胞也表现出非常少的凝集。
对克隆45细胞和其它三种适应培养基4的克隆系在培养基4中产生不同AAV血清型的可接受滴度的能力进行评价。将克隆45细胞在EXPI293TM表达培养基(Expi45;GIBCOTM,赛默飞世尔科技公司,目录号A1435101)或培养基4(Cl45)中生长,并用关注对GFP进行编码的转基因的AAV2、AAV6、AAV-dj、AAV8或AAV9载体转染。类似地,将适应培养基4的克隆系克隆12(Cl12)、克隆22(Cl22)和克隆51(Cl51)在培养基4中生长并用5种AAV血清型的载体转染。使用如上文所描述的转染试剂2进行转染。将克隆45细胞中的产生与亲本细胞系(亲本HEK293,对照)或其它三种适应培养基4的克隆系进行比较。用如本文其它地方所描述的AAV-GFP引物和探针使用qPCR确定所产生的AAV滴度。针对每种血清型,在培养基4中生长的克隆45细胞产生介于约1×1011vg/mL与约2×1011vg/mL之间的高细胞滴度(图5A-5E)。
还对不同转染试剂对克隆45细胞的病毒产生的影响进行评价。用LV-MAXTM转染试剂(TR1)或转染试剂2(TR2)转染细胞。在这些条件下,与LV-MAXTM转染试剂相比,转染试剂2介导的质粒递送更多的所产生的AAV病毒(图6)。
实例5:添加增强剂提高病毒产生
在转染之后0小时、4.5小时、8小时、15.5小时、24小时或28小时,在添加或不添加增强剂的情况下,使用转染试剂2用AAV质粒转染培养基4中的克隆45细胞。添加增强剂,特别是在转染之后介于0与15.5小时之间,会增加AAV产生(图7)。增强剂含有HDAC抑制剂、丙酸钠、丁酸钠和咖啡因。
实例6:裂解缓冲液试剂的筛选
DOE平台允许研究人员同时改变多个参数,而不是单独改变参数中的每一个,并且然后考虑整个优化调配物的每个优化参数。当参数之间的二阶效应可以影响结果时,DOE平台同时改变所有候选参数,允许更有效和准确的结果。使用DOE平台的实验也需要更少的运行并且比传统的实验方法更经济。参见Kauffman等人,“用分数因子和最终筛选设计优化脂质纳米颗粒调配物用于体内mRNA递送(Optimization of Lipid NanoparticleFormulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial andDefinitive Screening Designs)”,《纳米快报(NanoLetters)15:7300-7306(2015)以及关于DOE平台的理论讨论的补充材料。
如表1中所指示的,在不同浓度下对Triton-alter、CHAPSO、大CHAP和NDSB-201进行评价。以每体积重量(w/v)为单位提供百分比。
表1:所使用的每种洗涤剂的量。
使用Jmp软件分析结果以确定洗涤剂在细胞裂解过程期间的影响。图8中提供了三种不同AAV血清型的结果。
还对来自经转染的细胞培养物对细胞沉淀物的AAV提取物进行裂解缓冲液测试。使用转染试剂2和增强剂用AAV质粒转染克隆45细胞。通过将1x裂解缓冲液添加到细胞沉淀物或将5x裂解缓冲液添加到全细胞培养物(经转染的细胞和培养基)在转染后70-72小时提取AAV。图9中提供了所产生的AAV滴度。
实例7:第一AAV产生方案
遵循以下针对AAV产生细胞的悬浮培养物的指南。将细胞根据标准AAV悬浮细胞培养方案生长。当细胞的密度达到大约3×106个到6.5×106个活细胞/mL时,通常每3-4天对细胞进行传代培养。在培养约3天或4天之后,细胞分裂成0.3×106个到0.6×106个细胞。通过每天在每天的大约同一时间对细胞进行计数来监测细胞生长。在细胞培养期间,针对125mL到1L的摇瓶,以约125rpm使用轨道振荡器(19mm的轨道直径)。将培养箱设置为约37℃、约8%CO2和约75%-80%湿度。
试剂和材料:
125mL、250mL和1L的聚碳酸酯、一次性、无菌、向上通气且无挡板的爱伦美式摇瓶
50mL无菌锥形管
Opti-MEM I培养基
克隆45细胞
AAV293细胞培养基
AAV转染试剂和转染促进剂
AAV增强剂
5X AAV裂解缓冲液
例如,如果细胞在星期五早上分裂到0.55×106个细胞/mL的细胞计数,则可以将它们在1L烧瓶中在约300mL培养基处培养3天。例如,在星期一早上,通过对细胞进行计数制备细胞,并且可以预期细胞密度为4.0×106个细胞/mL左右。可以将细胞在新鲜温热的培养基中稀释到约3.0×106个细胞/mL并培养另外24小时(近似)。
例如,可以在星期二进行转染。可以对细胞进行计数,并将其在125mL烧瓶中在30mL细胞培养基中稀释到介于约2.5×106个细胞/mL与约4×106个细胞/mL之间。表2提供了各种比率下的每种质粒的量。表3提供了另外的转染指南。
表2:不同的DNA比率制备
表3:DNA/转染试剂复合制备
DNA/转染试剂如下制备。将两个管标记为管1和管2。在管1中:将4.5mL的OPTI-MEMTM I培养基和135μg的DNA(以表2中所指示的比率)混合,并添加270μL转染促进剂。在管2中:将4.5mL的OPTI-MEMTM I培养基与540μL转染试剂混合,并在室温下温育1分钟。通过将管2溶液添加到管1并混合而将管1和管2足额和,然后在室温下温育10分钟。将大约3.2mL的DNA/AAV转染试剂复合物添加到细胞的每个烧瓶。在转染时以1%v/v每烧瓶添加AAV增强剂。
在转染之后70-72小时例如星期五早上采集AAV。可替代地,可以使经转染的细胞培养物储存在-80℃下(800μL的样品应单独储存在-80℃下以进行滴定)。以1:5的稀释度添加5xAAV裂解缓冲液(每800μL经转染的细胞培养样品200μL裂解缓冲液),上下移液并涡旋以混合。将样品温育约30分钟,然后用手倒置25-30次。一旦培养溶液变清并观察到一大块细胞碎片,细胞就会完全裂解。
将裂解的细胞在4℃下离心10分钟(台式离心机中的最大速度)。将含有粗AAV的上清液转移到新管并储存在4℃下。例如通过qPCR对样品进行滴定。
实例8:对来自实例7中的产生的AAV滴度的测量
将来自实例7的上清液充分混合,并将100μL的粗AAV样品等分到带盖的96孔圆底板的2个孔的每个孔。通过将2μL粗AAV样品添加到2μL 10x DNase I缓冲液以及总体积为20μL的137个单位的DNase I并在37℃下温育60分钟、在95℃下温育20分钟并且然后在4℃下温育,用DNase I消化样品。
通过将19μL 2x PK缓冲液和20μg蛋白酶K添加到每个样品并在60℃下温育60分钟、在95℃下温育10分钟并且然后在4℃下温育,用蛋白酶K消化经DNase处理的样品。
蛋白酶K消化之后,将样品以1:50稀释于水中。使用对AAV-GFP基因具有特异性的引物和带标记的探针运行定量PCR(qPCR)。
使用线性化AAV转移质粒生成标准曲线。对于pAAV-GFP,通过用HindIII或BamHI进行消化而使质粒线性化,然后确定DNA浓度。可以通过将切割和未切割的质粒负载到0.8%琼脂糖凝胶上并观察电泳之后所产生的带来确定线性化。未切割的质粒应显示为涂片,切割的质粒应为约5kb的大带。
使用2X EXPRESS qPCR Supermix并根据制造商的说明用预混合ROX(赛默飞世尔科技公司)在384孔qPCR样品板中进行QPCR。简而言之,将3μL稀释的样品(或标准曲线)与7.5μL 2x Supermix、0.11μL AAV-GFP探针(FAM/TAMRA)、1.13μL GFP特异性引物(以10μM混合正向和反向引物)和3.26μL水组合。使用以下循环程序在qPCR机器中运行样品:50℃持续2分钟(UDG温育);95℃持续2分钟;40个循环:95℃持续15秒,60℃持续1分钟。
实例9:AAV-GFP病毒感染性测试方案
可以测试AAV感染靶细胞(例如,Ht1080或HEK293)的能力。在感染之前约4小时,在100μL培养基中,将细胞以7000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。
通过将1μL粗AAV制剂添加到每个孔来感染细胞。将细胞温育大约3天。对于含有可表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的AAV,运行流式细胞术以测量表达GFP的细胞的百分比。
实例10:AAV产生系统比较
将来自克隆45的和来自衍生自克隆45的两个亚克隆系的AAV载体产生与来自HEK293F衍生物LV293(LV-MAX病毒产生细胞(VPC),赛默飞世尔科技公司)的AAV载体产生进行比较。根据上文所描述的培养方案生长细胞,并且针对AAV8,用pAAV-GFP、pAAV-Helper和pAAV-RC转染细胞。在具有如上文所描述的转染促进剂的情况下用转染试剂2进行转染。转染之后约72小时,确定培养物的AAV滴度(通过针对GFP的qPCR(实例8))和细胞活力。与用LV293(VPC,图10A)的相同系统相比,克隆45和亚克隆系C13和C20产生显著较高的AAV8滴度(介于约1.5×1011到约2.5×1011vg/mL之间)。另外,与用LV293(VPC,图10B)的培养物相比,用克隆45、C13和C20的AAV产生培养物具有显著较高的细胞活力。
将克隆45细胞中的各种AAV血清型之间的载体产生与LV293(VPC)细胞中的载体产生进行比较。根据如上文所描述的针对AAV的悬浮细胞培养方案生长细胞,并将细胞在125mL烧瓶中在30ml细胞培养基4中稀释(以3×106个细胞/mL稀释克隆45并且以2.5×106个细胞/mL稀释LV293)。针对AAV2、AAV6、AAV8和AAV9,用pAAV-GFP、pAAV-Helper和pAAV-RC转染细胞。在具有如上文所描述的转染促进剂的情况下用转染试剂2进行转染。转染之后约72小时从培养物中采集AAV。通过针对GFP的qPCR方法并且通过感染性测试方案(实例9)确定AAV滴度。示例性结果示出于图11中。与用LV293(VPC,图11A)的相同系统相比,在血清型之间,将克隆45作为生产者细胞的AAV产生系统产生显著较高的病毒滴度(介于约1.3×1011到约2.15×1011vg/mL之间)。如图11B中所示出的,与LV293 VPC细胞相比,用克隆45的AAV产生系统也导致AAV2和AAV6具有更大的感染性。
将用本文所提供的AAV载体产生系统的AAV载体产生与两种基于聚乙烯亚胺(PEI)的产生系统进行比较。根据制造商的说明和已知方法进行基于PEI的转染系统。在一项分析中,针对AAV6,用pAAV-GFP、pAAV-Helper和pAAV-RC转染细胞:(1)在不具有增强剂的情况下使用PEIproTM(Polyplus转染)转染LV293细胞以及(2)在具有如上文所描述的转染促进剂和AAV产生增强剂的情况下用转染试剂2转染克隆45细胞。在培养期之后,采集AAV,并通过针对GFP的qPCR方法以及通过感染性测试方案确定滴度。示例性结果示出于图12中。与用PEIpro系统的LV293相比,本文所提供的AAV产生系统导致显著较高的AAV6滴度(图12A)和感染性(图12B)。
在另一项分析中,使用以下对各种AAV血清型之间的载体产生进行比较:(1)HEK293T粘附细胞与PEI-MAX转染试剂(欣科宝利公司(Polysciences,Inc.))和克隆45细胞与如上文所描述的转染试剂2和转染促进剂。针对AAV2、AAV6、AAV8、AAV9和AAV-dj,用pAAV-GFP、pAAV-Helper和pAAV-RC转染细胞。在培养期之后,采集AAV,并通过针对GFP的qPCR方法以及通过感染性测试方案确定滴度。示例性结果示出于在图13A-B中。与用PEI-MAX系统的HEK293T相比,在所测试的5种血清型中的4种血清型之间,本文所提供的AAV产生系统产生显著较高的AAV滴度(图13A)。如图13B中所示出的,与用PEI-MAX系统相比,本文所提供的AAV产生系统还导致AAV 2和AAV6具有更大的感染性。
实例11:采集后加工过程
在转染、病毒产生和细胞裂解后,在下游加工过程之前使用硅藻土过滤粗AAV裂解物。用冻融方法(在没有裂解缓冲液的情况下)或通过添加10X AAV裂解缓冲液并温育30分钟(如上文所描述)裂解来自同一AAV培养物的两个样品,以形成粗AAV裂解液。裂解后立即将硅藻土(DE)与粗AAV裂解物混合,并使混合物通过2微米过滤器。对每mL的裂解液不同量的DE进行测试,包含0.5g DE:30mL裂解液和1g DE:100mL裂解液。在DE过滤之前和之后,从每个裂解物中采集样品,以确定过滤步骤后AAV的回收率。使用GFP qPCR确定来自样品的AAV滴度,并且示例性结果示出于图14中。用AAV裂解缓冲液方法形成粗裂解物导致在DE过滤期间AAV滴度的回收率较高,而冻融细胞裂解方法导致回收率显著降低。如图14中所示出的,例如,用裂解缓冲液获得约100%的滴度回收率,相比之下,用冻融获得约10%的回收率。单个DE过滤步骤减少了所需的过滤器数量并且大大减少了AAV裂解物在下游加工过程如核酸酶处理和纯化过程之前的过滤和加工过程时间。
Claims (73)
1.一种用于腺相关病毒(AAV)载体产生的方法,所述方法包括:
(a)在悬浮培养物中培养哺乳动物细胞;
(b)使用转染试剂用AAV转移载体转染所述哺乳动物细胞;
(c)使经转染的细胞与增强剂接触;
(d)将所述经转染的细胞在悬浮培养物中培养足以表达所述AAV载体的一段时间,由此产生经转染的AAV细胞培养物;
(e)从所述经转染的AAV细胞培养物中采集AAV。
2.根据权利要求1所述的方法,其中采集所述AAV包括使所述经转染的AAV细胞培养物与裂解缓冲液接触。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种表面活性剂:Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188(poloxamer 188)和NDSB-201。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中所述裂解缓冲液包括以下中的至少一种:Tris-HCl、柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和磷酸二氢钠。
5.根据权利要求2到4中任一项所述的方法,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种洗涤剂:CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、辛基硫葡萄糖苷和脱氧胆酸钠。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述增强剂包括以下中的一种或多种:组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠和咖啡因。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述HDAC抑制剂选自阿匹西定(apicidin)、贝利司他(belinostat)、CI-994、CRA-024781、姜黄素(curcumin)、帕比司他(panobinostat)、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A(trichostatin A)和丙戊酸。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述增强剂是在转染后约0小时与约12小时之间添加的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述转染试剂包括阳离子脂质。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述转染试剂进一步包括肽。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(b)进一步包括使所述细胞与转染促进剂接触。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述转染促进剂包括肽。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中以介于5:1与约1:5(体积/重量)之间的转染促进剂:DNA的比率使用所述转染促进剂。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞或HEK293细胞的衍生物。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述HEK293细胞已经适于在AAV载体产生系统中进行高AAV表达。
17.根据权利要求15或16所述的方法,其中所述HEK293细胞能够以至少5×106个细胞每毫升(个细胞/mL)的密度在悬浮培养物中生长。
18.根据权利要求15或16所述的方法,其中所述HEK293细胞能够以至多1.1×107个细胞每毫升(个细胞/mL)的密度在悬浮培养物中生长。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中以介于约1.5×106个细胞/mL与约5×106个细胞/mL之间的细胞密度转染所述细胞。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中不使用辅助病毒。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在采集AAV前不对所述细胞进行离心。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞不包括大T抗原。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括对所采集的AAV进行滴定。
24.根据权利要求23所述的方法,其中使用定量PCR对所述AAV进行滴定。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中所述所采集的AAV的滴度为至少约2×1010个病毒基因组每毫升(vg/mL)。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述所采集的AAV的滴度介于约2×1010vg/mL与约1×1012vg/mL之间。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(b)进一步包括用包装质粒转染所述细胞。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述包装质粒包括pRC和pHelper。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积培养所述细胞。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中以约1L到约10L的体积培养所述细胞。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积转染所述细胞。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中以约1L到约10L的体积转染所述细胞。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在生物反应器中培养所述细胞。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在支持HEK293细胞生长和扩增的培养基中培养所述细胞。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(a)和/或(d)期间,使所述细胞与培养补充剂接触。
36.一种腺相关病毒(AAV)产生系统,其包括:
(a)密度为至少约2×106个细胞/mL的HEK293细胞;
(b)AAV转移载体;
(c)包装质粒;
(d)增强剂,所述增强剂包括以下中的一种或多种:组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠、丁酸钠和咖啡因;以及
(e)细胞培养基,所述细胞培养基支持所述HEK293细胞生长和扩增。
37.根据权利要求36所述的AAV产生系统,其中所述HEK293细胞的密度介于约2×106个细胞/mL与约2×107个细胞/mL之间。
38.根据权利要求36或37所述的AAV产生系统,其进一步包括转染试剂。
39.根据权利要求38所述的AAV产生系统,其中所述转染试剂包括阳离子脂质。
40.根据权利要求38或39所述的AAV产生系统,其中所述转染试剂进一步包括肽。
41.根据权利要求36到40中任一项所述的AAV产生系统,其进一步包括转染促进剂。
42.根据权利要求41所述的AAV产生系统,其中所述转染促进剂包括阳离子脂质。
43.根据权利要求41或42所述的AAV产生系统,其中所述转染促进剂包括肽。
44.根据权利要求36到43中任一项所述的AAV产生系统,其进一步包括裂解缓冲液。
45.根据权利要求4443所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种表面活性剂:Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188和NDSB-201。
46.根据权利要求44或45所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括以下中的至少一种:Tris-HCl、柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和磷酸二氢钠。
47.根据权利要求44到46中任一项所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种洗涤剂:CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、辛基硫葡萄糖苷和脱氧胆酸钠。
48.根据权利要求36到47中任一项所述的AAV产生系统,其中所述HDAC抑制剂选自阿匹西定、贝利司他、CI-994、CRA-024781、姜黄素、帕比司他、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A和丙戊酸。
49.根据权利要求48所述的AAV产生系统,其中所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。
50.根据权利要求36到49中任一项所述的AAV产生系统,其中所述AAV载体在采集后的滴度为至少约2×1010个病毒基因组每毫升(vg/mL)。
51.一种腺相关病毒(AAV)产生系统,其包括:
(a)HEK293细胞;
(b)AAV载体,所述AAV载体在采集后的滴度为至少约2×1010个病毒基因组每毫升(vg/mL)
(c)包装质粒;
(d)增强剂,所述增强剂包括以下中的一种或多种:组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠、丁酸钠和咖啡因;以及
(e)细胞培养基,所述细胞培养基支持所述HEK293细胞生长和扩增。
52.根据权利要求51所述的AAV产生系统,其中所述HEK293细胞的密度介于约2×106个细胞/mL与约2×107个细胞/mL之间。
53.根据权利要求51或52所述的AAV产生系统,其进一步包括转染试剂。
54.根据权利要求53所述的AAV产生系统,其中所述转染试剂包括阳离子脂质。
55.根据权利要求54所述的AAV产生系统,其中所述转染试剂进一步包括肽。
56.根据权利要求51到55中任一项所述的AAV产生系统,其进一步包括转染促进剂。
57.根据权利要求56所述的AAV产生系统,其中所述转染促进剂包括阳离子脂质。
58.根据权利要求56或57所述的AAV产生系统,其中所述转染促进剂包括肽。
59.根据权利要求51到58中任一项所述的AAV产生系统,其进一步包括裂解缓冲液。
60.根据权利要求59所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种表面活性剂:Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188和NDSB-201。
61.根据权利要求59或60所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括以下中的至少一种:Tris-HCl、柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和磷酸二氢钠。
62.根据权利要求59到61中任一项所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种洗涤剂:CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、辛基硫葡萄糖苷和脱氧胆酸钠。
63.根据权利要求51到62中任一项所述的AAV产生系统,其中所述HDAC抑制剂选自阿匹西定、贝利司他、CI-994、CRA-024781、姜黄素、帕比司他、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A和丙戊酸。
64.根据权利要求63所述的AAV产生系统,其中所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。
65.一种用于腺相关病毒(AAV)产生的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)HEK293细胞;
(b)增强剂,所述增强剂包括以下中的一种或多种:组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙酸钠和咖啡因;
(c)转染试剂,所述转染试剂包括阳离子脂质;以及
(d)细胞培养基,所述细胞培养基支持所述HEK293细胞生长和扩增。
66.根据权利要求65所述的试剂盒,其进一步包括转染促进剂。
67.根据权利要求66所述的试剂盒,其中所述转染促进剂包括阳离子脂质和/或肽。
68.根据权利要求65到67中任一项所述的试剂盒,其进一步包括裂解缓冲液。
69.根据权利要求68所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种表面活性剂:Triton-100、Triton-alter、NP-40、泊洛沙姆188和NDSB-201。
70.根据权利要求68或69所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括以下中的至少一种:Tris-HCl、柠檬酸钠、氯化钠、柠檬酸、EDTA、EDTA三钾、氢氧化钠和磷酸二氢钠。
71.根据权利要求68到70中任一项所述的AAV产生系统,其中所述裂解缓冲液包括选自以下的至少一种洗涤剂:CHAP、CHAPS、CHAPSO、大CHAP、辛基硫葡萄糖苷和脱氧胆酸钠。
72.根据权利要求65到71中任一项所述的AAV产生系统,其中所述HDAC抑制剂选自阿匹西定、贝利司他、CI-994、CRA-024781、姜黄素、帕比司他、丁酸钠、苯丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸、曲古抑菌素A和丙戊酸。
73.根据权利要求72所述的AAV产生系统,其中所述HDAC抑制剂是丁酸钠、苯丁酸钠、曲古抑菌素A和/或丙戊酸。
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