KR20210131353A - 아데노 관련 바이러스 생산을 위한 현탁 시스템 - Google Patents

아데노 관련 바이러스 생산을 위한 현탁 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20210131353A
KR20210131353A KR1020217028135A KR20217028135A KR20210131353A KR 20210131353 A KR20210131353 A KR 20210131353A KR 1020217028135 A KR1020217028135 A KR 1020217028135A KR 20217028135 A KR20217028135 A KR 20217028135A KR 20210131353 A KR20210131353 A KR 20210131353A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
aav
production system
sodium
transfection
Prior art date
Application number
KR1020217028135A
Other languages
English (en)
Inventor
신 위
몰레라 뒤 죄 자비에 드
차오 옌 류
졘 류
?? 류
조나단 즈무다
Original Assignee
라이프 테크놀로지스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 라이프 테크놀로지스 코포레이션 filed Critical 라이프 테크놀로지스 코포레이션
Publication of KR20210131353A publication Critical patent/KR20210131353A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 무혈청 현탁 플랫폼에서 고역가로 AAV 벡터를 생산하기 위한 생산 시스템에 관한 것이다. 이러한 기술은 배지, 세포, 형질감염 시약, AAV 인핸서, 및 세포용해 완충액을 포함하는 시약을 사용하고, 이들 각각은 포유류 세포, 예컨대 HEK293 세포의 현탁 배양으로부터 최대 AAV 생산을 제공하도록 설계되어 있다. 이러한 새로운 시스템으로 우리는 농축되지 않은 AAV 벡터의 최대 약 2 x 1011의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL)을 전달할 수 있다.

Description

아데노 관련 바이러스 생산을 위한 현탁 시스템
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 2월 22일자로 출원된 미국 임시출원 제 62/809,407 호의 우선권 및 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
아데노-관련 바이러스(AAV: Adeno-associated virus)는 인간 및 일부 비-인간 영장류 세포를 감염시키는 작은 DNA 바이러스이다. AAV는 질병을 유발하는 것으로 알려져 있지 않으며 인간에서 면역원성이 낮다. 바이러스 유전자가 거의 또는 전혀 없는 관심 DNA 서열을 함유하는 AAV 벡터가 생산될 수 있다. 이러한 장점으로 인해 유전자 치료 및 다른 임상 및 연구 목적에서 AAV 벡터를 사용하게 되었다.
AAV 벡터를 생산하고 높은 역가를 생산하는 대규모 방법이 필요하다.
본 기술은 일반적으로 무혈청 현탁 플랫폼에서 높은 역가로 벡터를 생산하기 위한 새로운 AAV 시스템에 관한 것이다. 상기 기술은 배지, 세포, 형질감염 시약, AAV 인핸서, 및 세포용해 완충액을 포함하는 새로 개발된 적절한 우수 제조 공정(GMP: good manufacturing process) 시약 세트를 사용하며, 각각은 포유류 세포의 현탁 배양에서 최대 AAV 생산을 제공하도록 설계되었다. 상기 새로운 시스템으로 우리는 비농축된 AAV 벡터(즉, 본원에 기술된 수확 방법을 사용하여 수확한 후에 추가로 농축되지 않은 벡터)의 최대 약 2 x 1011의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL)을 전달할 수 있다.
일 양태에서, (i) 포유류 세포를 배양하는 단계; (ii) 형질감염 시약을 사용하여 포유류 세포를 AAV 전달 벡터(transfer vector)로 형질감염시키는 단계; (iii) 형질감염된 세포를 AAV 인핸서와 접촉시키는 단계; (iv) 및 상기 형질감염된 세포를 현탁 배양으로 AAV 벡터 포장에 충분한 시간 동안 배양하여, 형질감염된 AAV 세포 배양물을 생성하는 단계를 포함하는, AAV 벡터 생산 방법이 본원에서 제공된다. 실시형태에서, 상기 포유류 세포는 현탁 배양으로 배양된다. 실시형태에서, 상기 방법은 형질감염된 AAV 세포 배양물로부터 AAV를 수확하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 상기 AAV는 세포용해 완충액을 사용하여 수확된다. 실시형태에서, 상기 형질감염 단계는 상기 세포를 형질감염 부스터와 접촉하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 상기 방법은 수확된 AAV를 적정하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 상기 AAV는 정량적 PCR을 사용하여 적정된다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 2 x 1010의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL) 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 2 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다.
실시형태에서, 상기 세포는 약10 밀리리터(mL) 내지 약800 리터(L) 사이의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 1 L 내지 약 10 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약15 밀리리터(mL) 내지 약200 리터(L)의 부피에서 형질감염된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약1 L 내지 약2 L의 부피에서 형질감염된다.
실시형태에서, 상기 세포는 생물반응기에서 배양된다.
실시형태에서, 상기 세포는 HEK293 세포의 성장 및 확장(expansion)을 지원하는 배지에서 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 배양 동안(예컨대, 형질감염 후에) AAV 생산 인핸서와 접촉된다.
일 양태에서, HEK293 세포, AAV 전달 벡터, 포장 플라스미드(packaging plasmid), AAV 생산 인핸서, 및 HEK293 세포의 성장 및 확장을 지원하는 세포 배양 배지를 포함하는 AAV 생산 시스템이 본원에서 제공된다. 실시형태에서, 상기 AAV 생산 시스템은 형질감염 시약을 포함한다. 실시형태에서, 상기 AAV 생산 시스템은 형질감염 부스터를 포함한다. 실시형태에서, 상기 AAV 생산 시스템은 세포용해 완충액을 포함한다. 실시형태에서, 상기 HEK293 세포는 적어도 약 0.3 x 106 세포/mL의 밀도로 존재한다. 실시형태에서, 상기 HEK293 세포는 적어도 약 2 x 106 세포/mL의 밀도로 존재한다. 실시형태에서, 상기 HEK293 세포는 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약1 x 107 세포/mL 사이의 밀도로 존재한다. 실시형태에서, 상기 AAV 벡터는 수확 후 적어도 약 2 x 1010의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL)의 역가로 존재한다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 계면활성제를 포함한다. 실시형태에서, 상기 계면활성제는 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 또는 NDSB-201이다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 계면활성제를 포함하지 않는다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: Tris-HCl, 트리신 HCL, 소듐 시트레이트, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및 소듐 디히드로겐 포스페이트. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 세제(detergent)를 포함한다. 실시형태에서, 상기 세제는 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 옥틸티오글루코시드, 및/또는 소듐 디옥시콜레이트이다.
실시형태에서, 상기 AAV 생산 인핸서는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 소듐 프로피오네이트, 계란 레시틴, 리튬 아세테이트, 트리코스타틴 히드록시우레아, 노코다졸-DMSO, NaCl, 및 카페인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산이다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산이다. 실시형태에서, 상기 AAV 인핸서는 형질감염 후 약 0시간 내지 약 6시간 사이에 첨가된다.
실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 함유한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 펩티드를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 양이온성 지질을 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 펩티드를 포함한다. 실시형태에서, 상기 펩티드는 막-투과(membrane-penetrating) 펩티드이다. 막-투과 펩티드의 비-제한적인 예가 미국특허 제 9,856,496 호에 제공되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 5:1 내지 약 1:5(부피/중량) 사이의 형질감염 부스터:DNA 비율로 사용된다.
실시형태에서, 상기 포유류 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293 세포의 유도체이다. 실시형태에서, 상기 HEK293 세포는 AAV 벡터 생산 시스템에서 높은 AAV 발현을 위해 적응되었다. 실시형태에서, 상기 HEK293 세포는 적어도 0.3 x 106의 밀리리터 당 세포(세포/mL)의 밀도로 현탁 배양으로 성장할 수 있다. 실시형태에서, 상기 HEK293 세포는 최대 1.2 x 107의 밀리리터 당 세포(세포/mL)의 밀도로 현탁 배양으로 성장할 수 있다. 실시형태에서, 상기 세포는 약2.5 x 106 내지 약4 x 106 세포/mL 사이의 세포 밀도로 형질감염된다.
실시형태에서, 헬퍼 바이러스는 사용되지 않는다. 실시형태에서, 상기 방법은 상기 세포를 포장 플라스미드로 형질감염시키는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 상기 AAV 생산 시스템은 포장 플라스미드를 포함한다. 실시형태에서, 상기 포장 플라스미드는 pRC 및 pHelper를 포함한다.
실시형태에서, 상기 세포는 AAV를 수확하기 전에 원심분리되지 않는다.
실시형태에서, 상기 세포는 거대 T 항원을 포함하지 않는다.
일 양태에서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 생산을 위한 키트가 본원에서 제공된다. 실시형태에서, 상기 키트는 HEK293 세포; 인핸서; 양이온성 지질을 포함하는 형질감염 시약; 및 HEK293 세포의 성장 및 확장을 지원하는 세포 배양 배지를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 및 펩티드를 함유한다.
실시형태에서, 상기 키트는 또한 형질감염 부스터를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 펩티드를 함유한다.
실시형태에서, 상기 키트는 또한 세포용해 완충액을 포함한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 계면활성제는 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 및/또는 NDSB-201이다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Tris-HCl, 소듐 시트레이트, 트리신 HCL, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및/또는 소듐 디히드로겐 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 세제를 포함한다. 실시형태에서, 상기 세제는 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 데옥실 Big CHAP, Triton X-114, 옥틸티오글루코시드, 및/또는 소듐 디옥시콜레이트이다.
도 1은 AAV2 생산에 대한 상이한 조건의 효과를 나타낸다. AAV2 바이러스는 3가지 상이한 조건인 Prot-1(인핸서 1 및 보충제 1), Prot-2(보충제 1, 인핸서 없음), Prot-3(인핸서 1, 보충제 없음) 하에서 시스템 1과 비교하여 폴리에틸렌이민(PEI: polyethylenimine)으로 형질감염된 부착성 HEK293 세포(6-웰 플레이트)에 의해 생산되었다.
도 2는 4가지 상이한 유형의 배양 배지에서 적응된 HEK293F 세포에 대한 AAV2 생산 비교를 나타낸다.
도 3은 AAV 생산을 위한 3가지 상이한 시스템의 비교를 나타낸다. 배지 4에 대해 적응된 HEK293 세포는 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이, 시스템 1, 시스템 2, 및 시스템 3으로 시험하였다.
도 4a 내지 도 4b는 배지 4(클론 45)에 적응된 클론 HEK293 세포에 대한 성장 특성을 나타낸다. 배양 배지는 높은 세포 생존율로 고밀도(약 11 x 106 세포/mL)에서 성장하는 클론 45 세포를 지원하였다(도 4a). 세포는 도 4b에 도시된 바와 같이 고밀도에서 매우 제한된 덩어리(clumping)를 갖는다.
도 5a 내지 도5e는 클론 HEK293 세포에서 상이한 AAV 혈청형의 생산을 나타낸다. 대조군: 배지 4에서 모 HEK293 세포; Expi45: Expi293 배지에서 클론 45; Cl45, Cl12, Cl22 및 Cl51: 배지 4에서 표시된 HEK293 클론.
도 6은 형질감염 시약의 비교를 나타낸다. AAV2 생산에 대해 형질감염 시약 1(TR1)을 형질감염 시약 2(TR2)와 비교하였다.
도 7은 AAV 생산 시스템에서 바이러스 역가에 대한 인핸서 첨가 시기의 효과를 보여준다.
도 8은 바이러스 역가에 대한 AAV 세포용해 완충액 중 다양한 세제의 효과를 나타낸다.
도 9는 상이한 AAV 혈청형에 대한 전체 형질감염된 세포 배양물에 대한 세포 펠릿으로부터의 추출물 AAV 역가를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10b는 형질감염 후 AAV 생산(도 10a) 및 세포 생존율(도 10b)에서 클론 45, 서브-클론주 C13 및 C20, 및 LV293 세포(VPC)의 비교를 보여준다.
도 11a 내지 도 11b는 AAV 생산에서 클론 45 및 LV293 세포(VPC)의 비교를 나타낸다: 도 11a는 상이한 AAV 혈청형으로부터 수득된 바이러스 역가(vg/mL)를 비교하고; 도 11b는 각각의 클론 세포주로부터 수확된 AAV2 및 AAV6의 감염성(Ht1080에서 GFP%로서)을 비교한다.
도 12a 내지 도 12b는 수확 후 AAV6 생산(vg/ml, 도 12a) 및 AAV6 감염성(Ht1080에서 GFP%로서, 도 12b)에서 클론 45 AAV 시스템 및 LV293-PEI 시스템의 비교를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13b는 AAV 생산에서 클론 45 AAV 시스템 및 HEK293T-PEI 시스템의 비교를 나타낸다: 도 13a는 상이한 AAV 혈청형으로부터 수득된 바이러스 역가(vg/mL)를 비교하고; 도 13b는 각각의 시스템으로부터 수확된 AAV2, AAV6 및 AAV-dj의 감염성(Ht1080에서 GFP%로서)을 비교한다.
도 14는 규조토 여과 전후 조 세포용해물에서의 AAV 역가를 나타낸다.
본 명세서를 읽은 후에는 다양한 대안적인 실시형태 및 대안적인 출원에서 본 발명을 구현하는 방법이 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 모든 다양한 실시형태는 본원에서 기술되지 않을 것이다. 본원에 제시된 실시형태는 단지 예로서 제시되고 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 이와 같이, 다양한 대안적인 실시형태에 대한 이러한 상세한 설명이 아래에서 설명되는 바와 같이 본 발명의 범주 또는 폭을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 개시하고 기술하기 전에, 하기 기술된 양태는 특정 조성물, 이러한 조성물의 제조 방법, 또는 그 자체로서의 용도에 제한되지 않고 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 양태를 설명하기 위한 목적이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 상세한 설명은 단지 독자의 편의를 위해 여러 부분으로 나누어져 있으며, 어느 부분에 있는 개시내용은 다른 부분에 있는 것과 결합될 수 있다. 본 명세서에 사용된 제목 또는 부재는 독자의 편의를 위해 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 영향을 미치려는 의도가 아니다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 다음의 청구범위에서, 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 정의되어야 하는 다수의 용어에 대한 참조가 이루어질 것이다:
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 목적이며, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 이후에 기술된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 상기 기술은 해당 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함한다.
범위를 포함하여 예를 들어, 온도, 시간, 양, 농도 등과 같은 수치 지정 앞에 사용되는 경우 용어 "약"은 ( + ) 또는 ( - ) 10%, 5%, 1%, 또는 그 사이의 모든 하위 범위 또는 하위 값에 의해 달라질 수 있는 근사치를 나타낸다. 바람직하게는, 용어 "약"은 투여량과 관련하여 사용될 때 투여량이 +/- 10%만큼 변할 수 있음을 의미한다.
"포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(comprises)"는 조성 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하지 않음을 의미하도록 의도된다. "~로 본질적으로 이루어진"은 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우 명시된 목적을 위한 조합에 대해 임의의 본질적인 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미해야 한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성된 조성물은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 재료 및 단계를 배제하지 않을 것이다. "~로 이루어진"은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 초과를 제외하는 것을 의미해야 한다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 생산 시스템
본원에서 사용된 용어 "세포"는 모든 유형의 진핵세포 및 원핵세포를 포함하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 용어는 진핵세포, 특히 포유류 세포를 지칭한다. 비-제한적인 실시형태를 통한 특정 예에서, 용어 "세포"는 인간 배아 신장(HEK: human embryonic kidney) 또는 인간 293 세포, 또는 이의 변이체, 예컨대, 예를 들어 현탁으로 성장할 수 있는 293(HEK293) 변이체를 지칭하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 성장, 증식 및 형질감염될 수 있는 293 세포의 변이체, 특히 고밀도(예컨대, 적어도 약 2 x 106 세포/mL, 적어도 약 3 x 106 세포/mL, 또는 심지어는 선택적으로 적어도 약 4 x 106 세포/mL 또는 약 1.2 x 106 세포/mL)로 배양될 수 있는 변이체.
일부 실시형태에서, 용어 "고밀도"는 세포를 배양하고 형질감염 워크플로우를 수행하는 맥락에서 사용되는 경우 일반적으로 적절한 세포 배양 배지에서 적어도 약 2 x 106 세포/mL, 적어도 약 3 x 106 세포/mL, 또는 심지어는 선택적으로 적어도 약 4 x 106 세포/mL의 밀도로 성장 또는 배양될 수 있지만, 여전히 고효율로 형질감염될 수 있는 능력을 유지하고 높은 역가, 예컨대 5 x 1010 mL 당 바이러스 게놈(vg/mL) 이상에서 표적 AAV 벡터를 발현할 수 있는 공지된 세포주, 또는 공지된 세포주의 변이체를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 고밀도 세포 배양에 대해 적응되었다. 이는 세포 생존율을 약 80% 이상으로 유지하면서 고밀도 배양 배지에서 고밀도로 성장하도록 적응된 동일한 모 세포 계통에서 유도된 세포 계통 또는 세포의 (비-클론) 집단을 지칭한다. 이러한 세포는 세포를 고밀도 ≥ 약 40, 50, 60, 70, 또는 80 순차 계대에서 유지하고 성장 배지의 비율을 원하는 고밀도 배양 배지로 점차적으로 교체함으로써 세포의 모집단으로부터 단리되거나 선택될 수 있다. 선택적으로, 공정 동안, 세포의 상이한 풀이 개별적으로 증식되고 선별 절차를 거치면서 동시에 형질감염 효율 및/또는 AAV 벡터 생산 효율을 평가하여, 고밀도에서 유지 및 성장될 수 있고, 높은 효율로 형질감염될 수 있고, 높은 역가의 AAV를 발현할 수 있는 세포의 클론 집단이 선별될 수 있다. 세포의 클론 집단은 공지된 방법 및 기술, 예를 들어 유세포 분석 분류 및/또는 단일 세포 클로닝을 사용하여 생성될 수 있다. 실시형태에서, 유세포 분석 분류는 고밀도 세포 배양 및 AAV 생산 시스템에서의 사용에 대해 적응된 세포 클론을 단리하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 고밀도 세포 배양 및 AAV 생산 시스템에서의 사용에 대해 적응된 세포 클론은 단일 세포 클로닝을 통해 수득되고 공지된 기술, 예컨대 이미지화를 사용하여 단일 세포 클론으로 확인된다. 다양한 세포 유형 및 계통이 이러한 선별 절차를 거칠 수 있다는 것이 숙련된 의사에게 용이하게 명백할 것이지만, 293 인간 배아 신장 세포로부터 유도된 세포 계통은 고밀도 성장 조건에 적응되기 위한 선별 과정에 특히 적합한 것으로 결정되었다. 일부 시나리오에서, 고밀도 성장 배양에 적응되고 본원에서 사용하기 쉬운 세포는 또한 고효율로 형질감염될 수 있고/있거나 비농축된 AAV 벡터의 적어도 약 5 x 109 vg/mL 최대 약 5 x 1012 vg/mL, 약 1 x 1010 vg/mL 내지 최대 약 2 x 1011 vg/mL 사이, 약 1 x 1010 vg/mL 내지 최대 약 1 x 1011 vg/mL 사이, 약 8 x 1010 vg/mL 내지 약 3 x 1011 vg/mL 사이, 또는 약 5 x 1010 vg/mL 내지 약 2 x 1011 vg/mL 사이를 초과하는 수율로 AAV 벡터를 발현할 수 있을 것이다. 일부 시나리오에서, 사용된 고밀도 배양에 대해 적응된 세포는 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 2 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 또는 약 2.5 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL의 범위의 밀도로 유지되고 형질감염될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 고밀도 배양에 대해 적응될 수 있고 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 2 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL의 범위의 밀도로 형질감염될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 현탁 배양으로 성장된다. 이는 배양 용기에 있는 대부분의 또는 모든 세포가 현탁으로 존재하고, 배양 용기에 있는 소수의 세포가 용기 표면 또는 용기 내의 다른 표면에 부착되거나 부착되는 세포가 없는 세포 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양은 배양 용기에서 약 75% 이상의 세포는 배양 용기 표면 또는 배양 용기 안에 부착되지 않은 현탁 상태를 갖는다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양은 배양 용기에서 약 85% 이상의 세포는 배양 용기 표면 또는 배양 용기 안에 부착되지 않은 현탁 상태를 갖는다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양은 배양 용기에서 약 95% 이상의 세포는 배양 용기 표면 또는 배양 용기 안에 부착되지 않은 현탁 상태를 갖는다.
AAV 생산 시스템은 293 세포, 또는 그로부터 유도된 세포가 5일 후 20% 미만의 세포 사멸로 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL의 밀도로 성장할 수 있게 한다. 실시형태에서, 상기 세포는 5일 후 20% 미만의 세포 사멸로 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 12 x 106 세포/mL의 밀도로 성장할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 293 세포는 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후에 20% 미만의 세포 사멸로, 고밀도, 예컨대 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL 또는 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 12 x 106 세포/mL로 성장할 수 있다. 실시형태에서, 상기 293 세포는 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 10% 미만의 세포 사멸로 고밀도, 예컨대 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL 또는 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 12 x 106 세포/mL로 성장할 수 있다.
다른 방식으로 기술하면, 본원에 제공된 AAV 생산 시스템은 상기 293 세포, 또는 이로부터 유도된 세포가 5일 후 배양에서 80% 초과의 세포 생존율로 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL의 밀도로 성장할 수 있게 한다. 실시형태에서, 상기 세포는 5일 후 배양에서 80% 초과의 세포 생존율로 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 12 x 106 세포/mL의 밀도로 성장할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 293 세포는 6일후, 7일후, 또는 8일후 배양에서 80% 초과의 세포 생존율로, 고밀도, 예컨대 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL 또는 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 12 x 106 세포/mL로 성장할 수 있다. 실시형태에서, 293 세포는 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 배양에서 90% 초과의 세포 생존율로, 고밀도로, 예컨대 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL 또는 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 12 x 106 세포/mL로 성장할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포, 예컨대 클론 45, 클론 45의 서브클론, 및 본원에 기술된 다른 클론의 현탁 배양은 HEK293F 세포, Expi293F™ 세포, 또는 LV293(LV-MAX Viral Production Cells)(모두 Thermo Fisher Scientific로부터 입수 가능함)보다 고밀도 배양에서 3일 후 적어도 10% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양 4일 후, 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 적어도 10% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 적어도 15% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 적어도 20% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 적어도 25% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양의 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 적어도 30% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양의 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 적어도 40% 더 큰 생존율을 갖는다. 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양의 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 약 10% 내지 약 30% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양의 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 약 20% 내지 약 40% 더 큰 생존율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 고밀도 배양의 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 7일 후, 또는 8일 후 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포보다 약 25% 내지 약 50% 더 큰 생존율을 갖는다.
실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포, 예컨대 클론 45, 클론 45의 서브클론, 및 본원에 기술된 다른 클론의 현탁 배양은 동량의 HEK293F 세포, Expi293F™ 세포, 또는 LV293(LV-MAX Viral Production Cells)(모두 Thermo Fisher Scientific로부터 입수 가능함)보다 유의하게 더 높은 AAV 벡터 수율 또는 역가(vg/mL)를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 동량의 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포로부터 수확된 역가의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 18배, 적어도 20배의 수확된 AAV 역가(vg/mL)를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같이 고밀도에 대해 적응된 293 세포의 현탁 배양은 동량의 HEK 293F, Expi293F, 또는 LV293 세포로부터 AAV 벡터 수율 또는 역가(vg/mL)의 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 15배, 약 5배 내지 약 10배, 약 7배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 15배의 수확된 AAV 역가(vg/mL)를 생성한다.
실시형태에서, 상기 세포는 매우 높은 밀도, 예컨대 약 8 x 106 세포/mL 초과의 제한된 덩어리를 나타낸다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 9 x 106 세포/mL 초과의 제한된 덩어리를 나타낸다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 10 x 106 세포/mL 초과의 제한된 덩어리를 나타낸다. 실시형태에서, 상기 세포는 본원에 기술된 바와 같은 배양 배지 및 조건 하에서 성장된 매우 높은 밀도에서 제한된 덩어리를 나타낸다.
실시형태에서, 상기 세포는 약 15 μm 내지 약 20 μm 사이, 예컨대 약 16 μm 내지 약 19 μm 사이, 또는 약 16.5 μm 내지 약 19 μm 사이의 직경을 갖는다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 μm 내지 약 20 μm 사이의 직경을 갖는 동시에 약 0.3 x 106 세포/mL 내지 약 20 x 106 세포/mL의 밀도로 성장한다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 16 μm 내지 약 19 μm 사이의 직경을 갖는 동시에 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 10 x 106 세포/mL의 밀도로 성장한다.
실시형태에서, 고밀도 성장 배양에 대해 적응되고 높은 효율로 형질감염될 수 있고/있거나 약 5 x 109 vg/mL 내지 약 5 x 1012 vg/mL의 수율로 AAV 벡터를 발현할 수 있는 293 세포는 거대 T 항원을 발현하거나 포함하지 않는다.
다양한 세포 배양 배지가 AAV 생산 시스템 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 무혈청 배지를 종종 조사자들이 원한다. 본원에 기술된 세포의 성장을 지원하는 무혈청 배지를 비롯한 임의의 배지가 사용될 수 있다. 상기 배지는 또한 무단백질(protein free)일 수 있다.
"무혈청 배지"(종종 "SFM 배지"로도 지칭됨)는 혈청(예컨대, 우태아 혈청(FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 인간 혈청 등)을 함유하지 않고 일반적으로 문자 SFM으로 지정된 배지이다. 어구 "무단백질" 배양 배지는 단백질(예컨대, 혈청 단백질 예컨대 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양 단백질 예컨대 성장 인자, 또는 금속 이온 담체 단백질 예컨대 트렌스페린, 세룰로플라스민 등)을 함유하지 않은 배양 배지를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 펩티드가 존재하는 경우, 상기 펩티드는 보다 작은 펩티드, 예컨대, 디- 또는 트리-펩티드이다. 일부 실시형태에서, 데카-펩티드 길이 이상의 펩티드는 무단백질 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 이하, 약 0.1% 이하, 및 약 0.01% 이하이다.
일부 실시형태에서, 포유류 세포의 성장을 유지할 수 있는 임의의 배양 배지를 비롯한 고밀도 배양 배지가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 최대 약 2 x 107 세포/mL, 예컨대 최대 약 12 x 106 세포/mL의 밀도로 현탁으로 성장되는 동안 약 80% 초과, 예컨대 약 90% 초과의 세포 생존율이 유지되며, 추가로, 상기 현탁 세포가 효율적으로 형질감염되고 다량의 AAV 벡터를 발현할 수 있는 능력이 유지된다. 사용되는 고밀도 배양 배지는 다양한 적용 및 용도에 따라 달라질 수 있으며, 사용되는 세포주의 특성, 발현 벡터를 세포로 전달하기 위해 선택된 형질감염 방식의 특성, 및 본원에 기술된 바와 같은 시스템에 추가된 임의의 발현 인핸서의 특성에 따라 달라질 수 있다. 실시형태에서, 본 시스템 및 방법에서 사용된 고밀도 배양 배지는 무혈청 및 무단백질이다. 실시형태에서, 상기 세포 배양 배지는 최대 약 2 x 107 세포/mL, 예컨대 최대 약 1.2 x 107 세포/mL, 또는 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL 사이의 밀도로 현탁 세포의 배양 및 성장을 가능케 한다. 실시형태에서, 사용되는 배양 배지는 일시적 발현 시스템에서 생산된 바이러스 역가가 적어도 1 x 1010 vg/mL 최대 약 1 x 1012 vg/mL, 또는 최대 약 2 x 1011 vg/mL을 초과할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 사용된 고밀도 배양 배지는 약 1 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 내지 약 4 x 106 세포/mL, 또는 약 2.5 x 106 내지 약 3 x 106 세포/mL의 범위의 밀도에서 세포의 형질감염을 촉진할 것이다.
본원에서의 사용에 적합한 고밀도 배양 배지의 예는 비제한적으로 HuMEC 기초 무혈청 배지, KNOCKOUT™ CTS™ XenoFREE ESC/iPSC 배지, STEMPRO™-34 SFM 배지, STEMPRO™ NSC 배지, ESSENTIAL™-8 배지, 배지 254, 배지, 106, 배지, 131, 배지, 154, 배지, 171, 배지 171, 배지 200, 배지 231, HeptoZYME-SFM, 인간 내피-SFM, GIBCO® FREESTYLE™ 293 발현 배지, 배지 154CF/PRF, 배지 154C, 배지 154 CF, 배지 106, 배지 200PRF, 배지 131, Essential™-6 배지, STEMPRO™-34 배지, Gibco® Astrocyte 배지, AIM V® 배지 CTS™, AMINOMAX™ C-100 기초 배지, AMINOMAX™-II 완전 배지, CD FORTICHO™ 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO® FREESTYLE™ CHO 발현 배지, CD OPTICHO™ 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, SF-900™ 배지, EXPI293™ 발현 배지, LHC 기초 배지, LHC-8 배지, 293 SFM 배지, CD 293 배지, AEM 성장 배지, PER.C6® Cell 배지, AIM V® 배지, EXPILIFE® 배지, 케라티노사이트-SFM 배지, LHC 배지, LHC-8 배지, LHC-9 배지, 및 이들의 임의의 유도체 또는 변형체를 포함한다. 특정 비제한적인 실시형태에서, 고밀도 배양 배지는 CD FORTICHO™ 배지, CD CHO AGT 배지, CHO-S-SFM 배지, GIBCO® FREESTYLE™ CHO 발현 배지, CD OPTICHO™ 배지, CD CHO 배지, CD DG44 배지, GIBCO® FREESTYLE™ 293 발현 배지, EXPI293™ 발현 배지, LV-MAX™ 생산 배지, FREESTYLE™ F17 발현 배지, DYNAMIS™ 배지, BALANCD® HEK293 배지, 또는 유사 배지, 또는 이들의 변형된 버전일 수 있다. 상기 배양 배지는 고밀도 배양 시스템에서 사용하기 위해 적응된 293 세포, 293 세포 변이체, 또는 임의의 다른 세포의 고밀도 성장, 증식, 형질감염 및 유지에 적합한(예컨대, 제형화) 임의의 배지일 수 있다.
AAV 생산 시스템은 또한 거대분자가 세포 내로 진입을 촉진하는 형질감염 시약 또는 조성물을 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 미국특허 제 9,856,496 호에 기술된 양이온성 지질이며, 상기 특허는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 거대 분자의 세포내로의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 비제한적으로 N-[1-(2,3-디올레일옥시) 프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 디올레일포스파티딜콜린(DOPE), 1,2-비스(올레일옥시)-3-(4'-트리메틸암모니오) 프로판(DOTAP), 디히드록실-디미리스틸스퍼민 테트라히드로클로라이드(DHDMS), 히드록실-디미리스틸스퍼민 테트라히드로클로라이드(HDMS), 1,2-디올레일-3-(4'-트리메틸암모니오) 부타노일-sn-글리세롤(DOTB), 1,2-디올레일-3-숙시닐-sn-글리세롤 콜린 에스터(DOSC), 콜레스테릴(4'-트리메틸암모니오)부타노에이트(ChoTB), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 1,2-디올레일-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DOME), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), O,O'-디도데실-N-[p(2-트리메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 접합된 스퍼민(예컨대, 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드(DOGS), N,N I ,N II ,N III -테트라메틸-N,N I ,N II ,N III -tet-라팔미틸스퍼민(TM-TPS) 및 디팔미토일파스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)), 리포폴리리신(DOPE에 접합된 폴리리신), TRIS(트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 접합된 지방산(TFA) 및/또는 펩티드 예컨대 트릴리실-알라닐-TRIS 모노-, 디-, 및 트리-팔미테이트, (3B-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤(DCChol), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복시아미도)에틸] -N,N-디메틸-1-프로판아민-이니움트리누오로아세테이트(DOSPA) 및 이들의 조합을 포함한다. 선택적으로, 형질감염 시약은 적어도 하나의 부가 헬퍼 지질을 추가로 포함할 수 있다. 헬퍼 지질은 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로 바람직하게는 DOPE, DOPC 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 중성 지질을 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 적어도 하나의 양이온성 지질 및 적어도 하나의 중성 지질을 포함한다.
당업자는 상기 언급된 지질의 특정 조합이 세포 내로 핵산 도입에 특히 적합한 것으로 나타났으며 예컨대 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 상표명 LIPOFECTAMINETM 하에 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies Corporation으로부터 입수 가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 상표명 LIPOFECTIN® 하에 Thermo Fisher Scientific으로부터 입수 가능하고, DIVIRIE 및 콜레스테롤의 1:1(M/M) 조합이 상표명 DIVIRIE-C 시약 하에 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies Corporation으로부터 입수 가능하고; TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 Life Tech로부터 입수 가능하다. 일부 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 형질감염 시약이다. 일부 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 중합체-기재 형질감염 시약이다. 다른 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질 형질감염 시약은 제한 없이 TRANSFAST™(Promega Corporation으로부터 입수 가능); LYOVEC™(InvivoGen으로부터 입수 가능); DOTAP 리포좀 형질감염 시약(Roche로부터 입수 가능); TRANSIT® 형질감염 시약(Mirus로부터 입수 가능); 및 Insect GENEJUICE® 형질감염 시약(EMD Millipore)을 포함한다. 본원에서 사용될 수 있는 추가 형질감염 시약은 제한 없이 LIPOFECTAMINE® 2000, LIPOFECTAMINE® 3000(Thermo Fisher Scientific으로부터 입수 가능); VIAFECT™ 형질감염 시약, FUGENE® 6 형질감염 시약, 및 FUGENE® HD 형질감염 시약(이들 각각은 Promega Corporation으로부터 입수 가능); 및 TRANSFECTIN™ 지질 시약(BioRad Laboratories, Inc.로부터 입수 가능)을 포함한다.
실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 형질감염 부스터와 조합된다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 펩티드를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 적어도 하나의 펩티드를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터의 적어도 하나의 펩티드는 천연 발생 또는 비-천연 발생 막-투과 펩티드이다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터의 적어도 하나의 펩티드는 천연 발생 또는 비-천연 발생 막-투과 펩티드 서열을 포함한다. 적합한 막-투과 펩티드 및 펩티드 서열의 비-제한적인 예가 미국특허 제 9,856,496 호에 제공되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터의 적어도 하나의 펩티드는 융합유도(fusogenic) 펩티드, 세포-투과 펩티드, 핵 국소화 펩티드, 세포 표면 부착 펩티드, 또는 식물 바이러스 운동 펩티드이다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터의 적어도 하나의 펩티드는 융합유도 펩티드 서열, 세포-투과 펩티드 서열, 핵 국소화 펩티드 서열, 세포 표면 부착 펩티드 서열, 또는 식물 바이러스 운동 펩티드 서열을 포함한다. 적합한 융합유도, 세포-투과, 핵 국소화, 세포 표면 부착, 및 식물 바이러스 운동 펩티드 및 펩티드 서열의 비제한적인 예가 미국 특허출원공개 US 2017/0253888 A1 호에 제공되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 형질감염 부스터 및 상기 AAV 전달 벡터와 조합되어 형질감염 복합체를 형성한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 형질감염 부스터, 상기 rep/cap 플라스미드(pRC), 상기 pHelper 플라스미드(헬퍼 바이러스 성분을 코딩함), 및 상기 AAV 전달 벡터와 조합되어 형질감염 복합체를 형성한다.
실시형태에서, 상기 AAV 생산 시스템은 세포용해 완충액을 포함한다. 세포용해 완충액은 세포를 파쇄 개방하여 이들의 내용물, 예컨대 AAV 벡터를 방출시키기 위해 사용되는 완충 용액이다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 5X 농도(세포와 접촉하는 최종 농도의 5배)로 제공된다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 10X 농도(세포와 접촉하는 최종 농도의 10배)로 제공된다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 세제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 CHAP, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 3-([3-콜아미도프로필]디메틸암모니오)-2-히드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO), N,N-비스-(3-D-글루콘아미도프로필)디옥시콜아미드(Big CHAP), 옥틸티오글루코시드(OTG), 및 소듐 디옥시콜레이트로부터 선택되는 적어도 하나의 세제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 CHAP, CHAPS, CHAPSO, Big CHAP, OTG, 및 소듐 디옥시콜레이트로부터 선택된 하나의 세제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 CHAP, CHAPS, CHAPSO, Big CHAP, OTG, 및 소듐 디옥시콜레이트로부터 선택된 2개의 세제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 CHAP, CHAPS, CHAPSO, Big CHAP, OTG, 및 소듐 디옥시콜레이트로부터 선택된 3개의 세제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 CHAP, CHAPS, CHAPSO, Big CHAP, OTG, 및 소듐 디옥시콜레이트로부터 선택된 4개 이상의 세제를 함유한다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.005% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 CHAP를 포함한다. 실시형태에서, CHAP는 약 0.01% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 실시형태에서, CHAP는 약 0.01% 내지 약 0.8%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.005% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 CHAPS를 포함한다. 실시형태에서, CHAPS는 약 0.01% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 실시형태에서, CHAPS는 약 0.01% 내지 약 0.8%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.005% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 CHAPSO를 포함한다. 실시형태에서, CHAPSO는 약 0.01% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 실시형태에서, CHAPSO는 약 0.01% 내지 약 0.8%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.005% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Big CHAP를 포함한다. 실시형태에서, Big CHAP는 약 0.01% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 실시형태에서, Big CHAP는 약 0.01% 내지 약 0.8%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.005% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 OTG를 포함한다. 실시형태에서, OTG는 약 0.01% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 실시형태에서, OTG는 약 0.01% 내지 약 0.8%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.005% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 디옥시콜레이트를 포함한다. 실시형태에서, 소듐 디옥시콜레이트는 약 0.01% 내지 약 1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 실시형태에서, 소듐 디옥시콜레이트는 약 0.01% 내지 약 0.8%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 세포용해 완충액 중에 존재한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Triton-100, Triton-alter, NP40, 및 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 공중합체; Pluronic® F-68)로부터 선택되는 적어도 하나의 계면활성제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Triton-100, Triton-alter, NP40, 및 폴록사머 188로부터 선택되는 하나의 계면활성제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Triton-100, Triton-alter, NP40, 및 폴록사머 188로부터 선택되는 2개의 계면활성제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Triton-100, Triton-alter, NP40, 및 폴록사머 188로부터 선택되는 3개의 계면활성제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Triton-100, Triton-alter, NP40, 및 폴록사머 188로부터 선택되는 4개의 계면활성제를 함유한다. 폴록사머 188은 다음의 화학식 (I)를 갖는다:
Figure pct00001
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.01% 내지 약 0.1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Triton-100 또는 Triton-alter를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.05% 내지 약 0.1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Triton-100 또는 Triton-alter를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.01% 내지 약 0.05%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Triton-100 또는 Triton-alter를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.05% 내지 약 0.5%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1% 내지 약 0.5%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.2% 내지 약 0.5%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.3% 내지 약 0.5%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.4% 내지 약 0.5%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.05% 내지 약 0.4%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.05% 내지 약 0.3%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.05% 내지 약 0.2%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.05% 내지 약 0.1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NP40을 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.08% 내지 약 0.2%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 폴록사머 188을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.09% 내지 약 0.2%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 폴록사머 188을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1% 내지 약 0.2%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 폴록사머 188을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.08% 내지 약 0.15%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 폴록사머 188을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.08% 내지 약 0.1%(w/v) 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 폴록사머 188을 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 염을 함유한다. 실시형태에서, 상기 염은 소듐 시트레이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 및/또는 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)이다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 1000 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 400 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 300 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 200 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 1000 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 400 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 300 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 200 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 시트레이트를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 1000 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 400 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 300 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 200 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 1000 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 400 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 300 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 200 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 클로라이드를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 250 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 250 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 암모늄 포스페이트를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 250 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 500 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 250 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 100 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 소듐 포스페이트(예컨대, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트)를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 킬레이팅제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 킬레이팅제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 트리-포타슘 EDTA, 및/또는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)이다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 40 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 30 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 40 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 30 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 5 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EDTA를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 40 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 30 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 40 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 30 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 5 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 트리-포타슘 EDTA를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 40 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 30 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 50 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 40 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 30 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 5 mM 사이의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 EGTA를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 추가 화합물을 함유한다. 예컨대, 상기 세포용해 완충액은 3-(1-피리디니오) 프로판설포네이트(NDSB 201; 비-세제 설포베타인 201)를 함유할 수 있다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 소듐 히드록시드(NaOH)를 함유한다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 M 내지 약 1 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.6 M 내지 약 1 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.7 M 내지 약 1 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.8 M 내지 약 1 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.9 M 내지 약 1 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 M 내지 약 0.9 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 M 내지 약 0.8 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 M 내지 약 0.7 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 0.5 M 내지 약 0.6 M의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NDSB-201을 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 5 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 6 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 8 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 12 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 14 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 15 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 12 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 15 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 Tris-HCl을 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 20 mM 내지 약 100 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 40 mM 내지 약 100 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 50 mM 내지 약 100 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 60 mM 내지 약 100 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 80 mM 내지 약 100 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 20 mM 내지 약 80 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 20 mM 내지 약 60 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 시트르산을 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 20 mM 내지 약 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 30 mM 내지 약 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 40 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 30 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 NaOH를 함유한다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
상기 AAV 생산 시스템은 또한 AAV 생산 인핸서(AAV 인핸서)를 포함한다. 상기 AAV 인핸서는 히스톤 디아시텔라제(HDAC) 억제제, 소듐 프로피오네이트, 소듐 부티레이트, 테오브로민, 및 카페인 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산이다.
실시형태에서, 상기 소듐 프로피오네이트 및/또는 HDAC 억제제는 물 중에서 제공된다. 실시형태에서, 상기 카페인은 세포 배양 발현 배지, 예컨대 Expi293™ 발현 배지 중에 제공된다.
실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 1 mM 내지 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 1 mM 내지 40 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 1 mM 내지 30 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 1 mM 내지 20 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 1 mM 내지 10 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 1 mM 내지 5 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 2 mM 내지 30 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 2 mM 내지 20 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 2 mM 내지 10 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 소듐 프로피오네이트는 약 2 mM 내지 5 mM의 농도로 포함된다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 75 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 25 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 9 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 8 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 7 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 6 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 100 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 25 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 9 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 7 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 6 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 상기 HDAC 억제제는 약 1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 포함된다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 50 mM의 농도(세포와 접촉되는 최종 농도)로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 25 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 15 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 9 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 8 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 7 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 6 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 4 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 3 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.1 mM 내지 약 2 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.5 mM 내지 약 50 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.5 mM 내지 약 10 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.5 mM 내지 약 5 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.5 mM 내지 약 4 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.5 mM 내지 약 3 mM의 농도로 포함된다. 실시형태에서, 카페인은 약 0.5 mM 내지 약 2 mM의 농도로 포함된다. 상기 농도는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 AAV 인핸서는 하나 이상의 한 시점, 예컨대 형질감염 시점(약 0시간) 내지 형질감염 후 약 48시간까지 첨가된다. 상기 AAV 인핸서는 AAV 벡터의 세포 포장을 부스팅하기 위해 형질감염 후 약 1시간 내지 약 16시간에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 AAV 인핸서는 형질감염 시점에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 AAV 인핸서는 형질감염 시점 및 형질감염 후 약 1시간 내지 약 16시간에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 AAV 인핸서는 형질감염 후 약 4시간 내지 5시간에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 인핸서는 형질감염 후 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 24, 36, 또는 48시간에 첨가될 수 있다. 상기 AAV 인핸서는 종말점을 포함하여, 인용된 범위 이내의 임의의 시점(또는 하위범위)에 첨가될 수 있다.
AAV 백터의 설계 및 생산이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 미국특허 제 5,354,678 호; 미국특허 제 6,759,237 호; 미국특허 제 5,753,500 호; 및 미국특허 제 5,474,935 호를 참조한다. AAV의 적합한 포장을 위해, 포장 플라스미드가 사용될 수 있다. 이러한 플라스미드는 AAV 벡터의 포장에 필요한 유전자를 코딩한다. 이러한 유전자는 캡시드 단백질(cap) 및 복제(rep) 유전자를 발현하는 유전자를 포함한다. 대안적으로, 상기 유전자는 상기 세포에 의해 안정하게 발현될 수 있다. 상기 AAV 유전자는 비제한적으로 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, DJ 또는 DJ/8을 포함하여, 임의의 혈청형 AAV일 수 있다. AAV rep 및 cap 유전자를 코딩하는 포장 플라스미드는 종종 pAAV-RC, pRep/Cap 또는 pRC 플라스미드로 지칭된다. AAV 전달 벡터, 포장 플라스미드, 포장 세포주, 및 AAV 생산을 위한 다른 생성물이 예컨대 Cell Biolabs, Inc., Vector Biolabs, Addgene, Clontech, 및 Thermo Fisher Scientific으로부터 시판되고 있다.
실시형태에서, 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스) 성분이 상기 AAV 생산 시스템의 적합한 기능을 위해 요구된다. 헬퍼 바이러스 성분은 플라스미드(및 종종 pAAV-헬퍼 또는 pHelper 플라스미드로도 지칭됨) 상에 존재할 수 있거나 세포 내에 다른 방식으로 존재할 수 있다. 헬퍼 바이러스 성분은 비제한적으로 E1A, E1B, E2A, E4, 및/또는 VA를 포함한다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 생산을 위한 키트가 본원에서 제공된다. 실시형태에서, 상기 키트는 고밀도 현탁 배양에 대해 적응된 293 세포; AAV 생산 인핸서; 양이온성 지질을 포함하는 형질감염 시약; 및 293 세포의 성장 및 팽창을 지원하는 세포 배양 배지를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 및 펩티드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 적어도 하나의 양이온성 지질 및 적어도 하나의 중성 지질을 포함한다. 실시형태에서, 상기 AAV 생산 인핸서는 하나 이상의 HDAC 억제제, 소듐 프로피오네이트, 소듐 부티레이트, 테오브로민 및 카페인을 포함한다. 실시형태에서, 293 세포는 거대 T 항원을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 상기 키트는 또한 형질감염 부스터를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 펩티드를 함유한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 막-투과 펩티드를 함유한다.
실시형태에서, 상기 키트는 또한 세포용해 완충액을 포함한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 함유한다. 실시형태에서, 상기 계면활성제는 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 및/또는 NDSB-201이다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 Tris-HCl, 소듐 시트레이트, 트리신 HCL, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및/또는 소듐 디히드로겐 포스페이트를 함유한다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 적어도 하나의 세제를 포함한다. 실시형태에서, 상기 세제는 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 데옥실 Big CHAP, Triton X-114, 옥틸티오글루코시드, 및/또는 소듐 디옥시콜레이트이다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 생산 시스템의 사용 방법
본원에 기술된 AAV 생산 시스템은 AAV 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 실시형태에서, 상기 AAV 벡터는 높은 역가로 생산된다.
일 양태에서 (i) 포유류 세포를 배양하는 단계; (ii) 형질감염 시약을 사용하여 AAV 전달 벡터로 상기 포유류 세포를 형질감염시키는 단계 및 (iii) 현탁 배양 중의 상기 형질감염된 세포를 상기 AAV 벡터의 발현에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, AAV 벡터 생산 방법이 제공된다. 실시형태에서, 상기 포유류 세포는 현탁 배양으로 배양된다. 실시형태에서, 상기 방법은 형질감염된 AAV 세포 배양물로부터 AAV를 수확하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 단계는 상기 세포를 형질감염 부스터와 접촉하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 상기 세포는 형질감염 후 인핸서와 접촉된다.
실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 상기 세포에 첨가되기 전에 상기 AAV 전달 벡터와 조합되어 DNA/형질감염 시약 복합체를 형성한다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 상기 세포에 첨가되기 전에 상기 AAV 전달 벡터, 상기 pRep/Cap 플라스미드 및 상기 pHelper 플라스미드와 조합되어 DNA/형질감염 시약 복합체를 형성한다.
다른 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 상기 AAV 전달 벡터와 조합되어 DNA/형질감염 부스터 혼합물을 형성하고 이어서 상기 형질감염 시약은 상기 세포에 첨가되기 전에 상기 DNA/형질감염 부스터 혼합물과 조합된다. 실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 상기 AAV 전달 벡터, 상기 pRep/Cap 플라스미드 및 상기 pHelper 플라스미드와 조합되어 DNA/형질감염 부스터 혼합물을 형성하고 이어서 상기 형질감염 시약은 상기 세포에 첨가되기 전에 DNA/형질감염 부스터 혼합물과 조합된다. 일부 실시형태에서, 상기 DNA 및 형질감염 부스터는 튜브 내에서 조합되고, 상기 형질감염 시약은 제2 튜브에서 배지 내로 희석되고 이어서 상기 희석된 형질감염 시약은 상기 DNA/형질감염 부스터 혼합물에 첨가되어 DNA/형질감염 부스터/형질감염 시약 복합체를 형성한다. 다른 실시형태에서, 상기 DNA 및 형질감염 부스터는 튜브에서 조합되고 이어서 상기 형질감염 시약은 동일한 튜브에 첨가되어 DNA/형질감염 부스터/형질감염 시약 복합체를 형성한다. 다른 실시형태에서, 상기 DNA 및 형질감염 시약은 튜브에서 조합되고 이어서 상기 형질감염 부스터는 동일한 튜브에 첨가되어 DNA/형질감염 부스터/형질감염 시약 복합체를 형성한다.
실시형태에서, 상기 형질감염 부스터는 5:1 내지 약 1:5(부피/중량) 사이의 형질감염 부스터:DNA 비율로 사용된다. 실시형태에서, 상기 형질감염 시약은 형질감염 부스터, 상기 rep/cap 플라스미드(pRC), 상기 pHelper 플라스미드(헬퍼 바이러스 성분을 코딩함), 및 상기 AAV 전달 벡터와 조합되어 형질감염 복합체를 형성한다.
실시형태에서, 상기 AAV는 세포용해 완충액을 사용하여 수확된다. 실시형태에서, 상기 세포는 AAV를 수확하기 전에 원심분리되지 않는다. 실시형태에서, 상기 세포용해 완충액은 상기 형질감염된 세포 배양(예컨대, 상기 세포 및 배양 배지)에 직접적으로 첨가된다.
실시형태에서, AAV를 함유하는 상기 조 배양 세포용해물은 뉴클레아제 처리 및 정제 공정과 같이, 다운스트림 공정 전에 여과된다. 실시형태에서, 상기 조 세포용해물은 규조토와 혼합된 다음 상기 혼합물은 필터, 예컨대 2개의 마이크론 필터에 통과되어 수확된 AAV가 회수된다. 대안적으로, 셀룰로스 여과 단계는 조 세포용해물과 함께 사용되어 다운스트림 공정을 위해 준비된 AAV 제제를 생성할 수 있다. 조 AAV 세포용해물을 예컨대 규조토, 셀룰로스 또는 등가물과 함께 이러한 여과 단계에 적용시키면 필요한 필터의 수가 감소하고 정제 공정 전에 AAV 세포용해물의 여과 및 공정 시간이 감소한다.
실시형태에서, 상기 세포는 생물반응기에서 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 플라스크에서 배양된다.
실시형태에서, 상기 방법은 수확된 AAV를 적정하는 단계를 포함한다. 상기 AAV는 임의의 방법을 사용하여 적정될 수 있다. 실시형태에서, 상기 AAV는 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 사용하여 적정된다. 실시형태에서, 상기 AAV는 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 적정된다. 실시형태에서, 상기 AAV는 디지털 액적 PCR을 사용하여 적정된다. 실시형태에서, 상기 AAV는 ELISA를 사용하여 적정된다. 실시형태에서, 상기 AAV는 바이러스 역가 키트, 예컨대, QUICKTITER™ AAV 정량 키트(Cell BioLabs, Inc.)를 사용하여 적정되며; 예컨대 미국특허 제 6,841,357 호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 실시형태에서, 상기 AAV는 예컨대 세포 형질도입 분석에 의해 세포를 형질도입할 수 있는 바이러스 입자의 농도(감염 역가)를 결정함으로써 적정된다. 실시형태에서, 상기 AAV는 DNA 도트 블롯팅을 사용하여 적정된다.
실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 1 x 1010의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL)의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 2 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 3 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 4 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 5 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 6 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 7 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 8 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 9 x 1010 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 1 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 2 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 3 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 4 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 5 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 6 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 7 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 8 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 적어도 약 9 x 1011 vg/mL의 역가를 갖는다.
실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 1 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 2 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 3 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 4 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 5 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 6 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 7 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 8 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 9 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 1 x 1011 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 2 x 1011 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 3 x 1011 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 4 x 1011 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 5 x 1011 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 9 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 8 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 7 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 6 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 5 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 4 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 3 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 2 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 실시형태에서, 상기 수확된 AAV는 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1011 vg/mL 사이의 역가를 갖는다. 상기 역가는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
상기 세포는 세포의 성장 및 AAV의 생산을 지원하는 세포 배양 배지의 임의의 부피로 배양될 수 있다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 밀리리터(mL) 내지 약 200 리터(L)의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 30 mL 내지 약 200 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 50 mL 내지 약 200 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 100 mL 내지 약 200 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 500 mL 내지 약 200 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 1 L 내지 약 200 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 10 L 내지 약 200 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 mL 내지 약 100 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 mL 내지 약 50 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 mL 내지 약 20 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 mL 내지 약 5 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 mL 내지 약 1 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 15 mL 내지 약 500 mL의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 500 mL 내지 약 10 L의 부피로 배양된다. 실시형태에서, 상기 세포는 약 1 L 내지 약 10 L의 부피로 배양된다. 상기 배양 부피는 종말점을 포함하여 인용된 범위 내에서 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
본원에 기술된 실시예 및 실시형태는 단지 예시의 목적을 위한 것이며 이에 비추어 다양한 수정 또는 변형이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원 및 첨부된 청구범위의 범주의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이의 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
실시예
당업자는 본원에 기술된 입자의 제조 및 사용에 대한 설명이 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 본 개시내용이 이러한 예시에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1. 바이러스 역가에 대한 배양 조건의 영향
부착 HEK293T 세포 및 HEK293F 세포를 37℃, 8% CO2 및 80% 습도의 인큐베이터에서 배양하였다. 다음의 조건 중 하나 하에서 PEI(HEK293T) 또는 시스템 1(HEK293F)을 사용하여 6-웰 플레이트에서 약 4 x 106 세포/mL의 밀도로 세포를 AAV 전달 벡터, pAAV-RC 및 pAAV-Helper로 형질감염시켰다: Prot-1(인핸서 1 및 보충제 1), Prot-2(보충제 1, 인핸서 없음), Prot-3(인핸서 1, 보충제 없음). 시스템 1은 HEK293 세포 성장 및 증식을 지원하는 배지(LV-MAX™ 생산 배지, GIBCO™, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 A3583401), LV-MAX™ 형질감염 시약, LV-MAX™ 보충제, 및 LV-MAX™ 인핸서(GIBCO™, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 A35348)를 포함한다. 200 μL의 5X AAV 세포용해 완충액을 800 μL 형질감염된 세포 배양에 첨가하고, 잘 혼합하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 AAV를 추출하였다. 인큐베이션 후, 상기 튜브를 뒤집어 세포를 완전히 세포용해 시킨 다음 탁상 원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 회전시켰다. 조 AAV를 함유하는 상등액을 수집하였다.
ITR2에 대한 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR로 AAV를 적정하였다. 간단하게, 추출물을 DNase 및 프로티네이즈 K로 처리하였다. 추출물을 물에 1:50으로 희석하고, qPCR을 수행하고 표준 커브(소화된 AAV 플라스미드)와 비교하였다.
결과를 도 1에 제공하였다. HEK293F 세포의 경우, LV-MAX™ 보충제가 없는 시스템 1이 가장 높은 AAV 역가를 생성하였다.
실시예 2. 바이러스 역가에 대한 배양 배지의 영향
HEK293F 세포를 현탁 배양에서 HEK293F 세포를 지원하는 4가지 상이한 유형의 상업적으로 입수 가능한 배지에서 확립하였다. 세포를 이들의 적응된 배지에서 동결시키고, 사용 전에 해동하였다. 해동된 세포를 AAV 전달 벡터(pAAV-GFP)로 형질감염시켰다. AAV 전달 벡터, pAAV-RC2 및 pAAV-Helper를 1:4 w/w 비율의 AAV 형질감염 시약, 및 Opti-MEM 복합체 용액 완충제 중의 2:1(v/w) 비율의 형질감염 부스터를 사용하여 복합체화한 다음, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DNA/형질감염 시약 복합체 혼합물을 제조된 세포 배양에 직접 첨가하였다. AAV2 생산은 4가지 모든 세포 시스템/배지 유형에 대해 세포 계대 6에서 발생하였다.
도 2는 배지 4에서 적응된 HEK293F 세포가 시험된 다른 배지보다 AAV2를 더 생산함을 나타낸다.
실시예 3. 배지 4-적응된 세포의 특성분석
배지 4에서 확립된 HEK293F 세포의 최적의 형질감염 조건을 결정하기 위해 상이한 형질감염 시약의 영향을 평가하였다. 세포를 다음을 사용하여 AAV2, AAV6, 또는 AAV-Dj로 형질감염시켰다: 시스템 1, LV-MAX 형질감염 시약, 인핸서 및 보충제를 포함하는 HEK293F 세포(실시예 1 참조); 시스템 2: LV-MAX 인핸서 및 보충제를 포함하는 상이한 형질감염 시약(형질감염 시약 2)을 사용하는 HEK293F 세포; 및 시스템 3: 형질감염 시약 2 및 LV-MAX 인핸서를 포함하고 보충제가 없는 배지 4-적응된 HEK293 세포. 배지 4-적응된 HEK293 세포 중의 바이러스 역가는 모든 AAV 혈청형에 대해 시스템 3을 사용하여 가장 높았다(도 3). 형질감염 시약 2는 펩티드-함유 형질감염 부스터(본원에 기술된 바와 같음)를 포함하는 양이온성 지질 형질감염 시약이다.
실시예 4. 클론 45 세포
배지 4-적응된 HEK293 세포(클론 45)의 클론 집단의 성장 특성을 평가하였다. 클론 45 세포를 계대 5에서 배지 4의 250 mL 진탕 플라스크에서 0.3 x 106 생존 세포/mL의 세포 밀도로 분할하였다. 세포 밀도 및 세포 생존율을 9일 동안 매일 수집하였다. 성장 곡선을 도 4a에 나타냈다(삽입: 세포 생존율 퍼센트). 배지 4는 최대 약 11 x 106 세포/mL의 높은 세포 밀도를 지원하였고 고밀도 배양에서 클론 45 세포는 높은 세포 생존율을 입증하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 클론 45 세포는 고밀도에서도 매우 작은 덩어리를 나타낸다.
배지 4에서 상이한 AAV 혈청형의 허용가능한 역가를 생성하기 위한 클론 45 세포 및 3개의 다른 배지-4 적응된 클론주의 능력을 평가하였다. 클론 45 세포를 EXPI293™ 발현 배지(Expi45; GIBCO™ Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 A1435101) 또는 배지 4(Cl45)에서 성장시키고 GFP를 코딩하는 이식유전자가 있는 AAV2, AAV6, AAV-dj, AAV8, 또는 AAV9 벡터로 형질감염시켰다. 유사하게, 배지 4-적응된 클론주 클론 12(Cl12), 클론 22(Cl22), 및 클론 51(Cl51)을 배지 4에서 성장시키고 5개의 AAV 혈청형의 벡터로 형질감염시켰다. 상기된 형질감염 시약 2를 사용하여 형질감염을 수행하였다. 클론 45 세포의 생산을 모 세포주(모 HEK293, 대조군), 또는 다른 3개의 다른 배지 4-적응된 클론주와 비교하였다. 본원의 다른 곳에서 기술된 AAV-GFP 프라이머 및 프로브와 함께 qPCR을 사용하여 생성된 AAV 역가를 결정하였다. 배지 4에서 성장한 클론 45 세포는 각각의 혈청형에 대해 약 1 x 1011 vg/mL 내지 약 2 x 1011 vg/mL 사이의 높은 바이러스 역가를 생성하였다(도 5a 내지 도 5e).
클론 45 세포에 대한 바이러스 생산에 대한 상이한 형질감염 시약의 효과를 평가하였다. 세포를 LV-MAX™ 형질감염 시약(TR1) 또는 형질감염 시약 2(TR2)로 형질감염시켰다. 형질감염 시약 2-매개된 플라스미드 전달은 이러한 조건 하에서 LV-MAX™ 형질감염 시약보다 더 많은 AAV 바이러스를 생산하였다(도 6).
실시예 5. 인핸서의 첨가는 바이러스 생산을 향상시킨다
배지 4의 클론 45 세포를 형질감염 후 0, 4.5, 8, 15.5, 24, 또는 28시간 후에 인핸서를 첨가하거나 첨가하지 않고 형질감염 시약 2를 사용하여 AAV 플라스미드로 형질감염시켰다. 특히 형질감염 후 0시간 내지 15.5시간 사이에 인핸서를 첨가하면 AAV 생산이 증가한다(도 7). 인핸서는 HDAC 억제제, 소듐 프로피오네이트, 소듐 부티레이트, 및 카페인을 함유한다.
실시예 6. 세포용해 완충액 시약의 스크리닝
JMP® 실험 설계(DOE: Design of Experiment) 플랫폼을 사용하여, 스크리닝 실험을 4가지 핵심 화학물질을 세포용해 완충액의 잠재적 세제로 사용하여 설계하였다: Triton-alter, CHAPSO, Big CHAP, 및 NDSB-201.
DOE 플랫폼을 사용하면 조사자가 각 파라미터를 개별적으로 변경한 다음 전체 최적화된 제형에 대해 각각 최적화된 파라미터를 고려하는 대신, 여러 파라미터를 동시에 변경할 수 있다. 파라미터간의 2차 효과가 결과에 영향을 미칠 수 있는 경우, 모든 후보 파라미터를 동시에 변경하는 DOE 플랫폼을 사용하면 보다 효율적이고 정확한 결과를 얻을 수 있다. DOE 플랫폼을 사용하는 실험은 또한 기존 실험 접근 방식보다 실행 횟수가 적고 경제적이다. 문헌[Kauffman et al., Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs, NanoLetters 15:7300-7306 (2015)] 및 DOE 플랫폼에 대한 이론적인 논의를 위한 보충 자료를 참조한다.
Triton-alter, CHAPSO, Big CHAP, 및 NDSB-201을 표 1에 표시된 대로 다양한 농도에서 평가하였다. 백분율은 부피 당 중량으로 제공된다(w/v).
Figure pct00002
세포 용해 과정 동안 세제 영향을 결정하기 위한 결과 분석을 위해 Jmp 소프트웨어를 사용하였다. 결과를 3가지 상이한 AAV 혈청형에 대해 도 8에 제공하였다.
상기 세포용해 완충액을 또한 형질감염된 세포 배양 대 세포 펠릿으로부터의 AAV 추출물에 대해 시험하였다. 클론 45 세포를 형질감염 시약 2 및 인핸서를 사용하여 AAV 플라스미드로 형질감염시켰다. AAV를 세포 펠릿에 1x 세포용해 완충액을 첨가하거나, 전체 세포 배양물(형질감염된 세포 및 배양 배지)에 5x 세포용해 완충액을 첨가하여 형질감염 후 70시간 내지 72시간에 추출하였다. 생성된 AAV 역가를 도 9에 제공하였다.
실시예 7. 제1 AAV 생산 프로토콜
AAV 생산 세포의 현탁 배양에 대한 다음의 지침을 따른다. 세포를 표준 AAV 현탁 세포 배양 프로토콜에 따라 성장시킨다. 상기 세포를 전형적으로 3일 내지 4일마다 대략 3 x 106 내지 6.5 x 106 생존 세포/mL의 밀도에 도달할 때까지 계대배양한다. 상기 세포를 배양 후 약 3일 내지 4일에 0.3 x 106 내지 0.6 x 106 세포로 분할한다. 세포 성장을 매일 거의 동일한 시간에 매일 세포를 계수하여 모니터링한다. 세포 배양 동안, 125 mL 내지 1 L 진탕 플라스크에 대해 오비탈 진탕기(19 mm 오비탈 직경)를 약 125 rpm에서 사용한다. 인큐베이터를 약 37℃, 약 8% CO2, 및 약 75% 내지 80% 습도로 설정한다.
시약 및 재료:
125 mL, 250 mL, 1 L 폴리카보네이트, 1회용, 멸균, 벤트업, 및 배플이 없는 삼각 진탕 플라스크
50 mL 멸균 원추형 튜브
Opti-MEM I 배지
클론 45 세포
AAV293 배양 배지
AAV 형질감염 시약 및 형질감염 부스터
AAV 인핸서
5X AAV 세포용해 완충액
예를 들어 금요일 아침에 세포를 0.55 x 106 세포/mL의 세포 수로 분할하는 경우, 약 300 mL 배양 배지에서 1 L 플라스크에서 3일 동안 배양할 수 있다. 예를 들어 월요일 아침에, 세포를 계수하여 세포를 준비하고, 약 4.0 x 106 세포/mL의 세포 밀도를 예상할 수 있다. 상기 세포를 신선하게 가온된 배양 배지 중에 약 3.0 x 106 세포/mL로 희석하고 다른 24시간(대략) 동안 배양할 수 있다.
예를 들어, 형질감염을 화요일에 수행할 수 있다. 상기 세포를 125 mL 플라스크에서 30 mL 세포 배양 배지 중에 약 2.5 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL 사이로 계수하고 희석할 수 있다. 표 2는 다양한 비율의 각각의 플라스미드의 양을 제공한다. 표 3은 추가 형질감염 지침을 제공한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
DNA/형질감염 시약을 다음과 같이 제조한다. 2개의 튜브를 튜브-1 및 튜브-2로 표지한다. 튜브-1에서: 4.5 mL의 OPTI-MEM™ I 배지 및 135 μg의 DNA(표 2에 표시된 비율로)를 혼합하고 270 μL 형질감염 부스터를 첨가한다. 튜브-2에서: 4.5 mL의 OPTI-MEM™ I 배지를 540 μL 형질감염 시약과 혼합하고 실온에서 1분 동안 인큐베이션 한다. 튜브-2 용액을 튜브-1에 첨가하고 혼합하여 튜브-1과 튜브-2를 합친 다음, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 약 3.2 mL의 DNA/AAV 형질감염 시약 복합체를 세포의 각 플라스크에 첨가한다. AAV 인핸서를 플라스크 당 1% v/v로 형질감염 시 첨가한다.
형질감염 후 70시간 내지 72시간에, 예컨대 금요일 아침에 AAV를 수확한다. 대안적으로, 형질감염된 세포 배양을 -80℃에 저장할 수 있다(800 μL의 샘플은 적정을 위해 -80℃에 별도로 저장해야 함). 5x AAV 세포용해 완충액을 1:5 희석으로 첨가하고(800 μL 형질감염된 세포 배양 샘플 당 200 μL 세포용해 완충액), 위 아래로 피펫팅하고 볼텍스하여 혼합한다. 샘플을 약 30분 동안 인큐베이션한 다음, 손으로 25회 내지 30회 뒤집어 혼합한다(inverting). 배양 용액이 투명하고 세포 파편 덩어리가 관찰되면 세포가 완전히 용해된다.
용해된 세포를 4℃에서 10분 동안 회전시킨다(벤치탑 원심분리기에서 최대 속도). 조 AAV를 함유하는 상등액을 새로운 튜브에 옮기고 4℃에 저장한다. 샘플을 예컨대 qPCR로 적정한다.
실시예 8. 실시예 7의 산물로부터 AAV 역가 측정
실시예 7의 상등액을 잘 혼합하고 100 μL의 조 AAV 샘플을 뚜껑이 있는 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 2개의 웰 각각에 분취한다. 2 μL 조 AAV 샘플을 2 μL 10x Dnase I 완충액, 및 137 단위 DNase I, 총 부피 20 μL에 첨가하여 샘플을 DNase I으로 소화시키고, 37℃에서 60분, 95℃에서 20분 및 4℃에서 인큐베이션한다.
19 μL 2x PK 완충액 및 20 μg 프로티네이즈 K를 각각의 샘플에 첨가하여 DNase-처리된 샘플을 프로티네이즈 K로 소화시키고 60℃에서 60분, 95℃에서 10분 및 4℃에서 인큐베이션한다.
프로티네이즈 K 소화 후, 샘플을 물 중에 1:50으로 희석한다. 프라이머 및 AAV-GFP 유전자에 특이적인 표지된 프로브를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)을 수행한다.
선형화된 AAV 전달 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성한다. pAAV-GFP의 경우, HindIII 또는 BamHI로 소화시켜 플라스미드를 선형화한 다음, DNA 농도를 결정한다. 절단된 플라스미드 및 절단되지 않은 플라스미드를 0.8% 아가로스 겔에 로딩하고 전기영동 후 생성된 밴드를 시각화하여 선형화를 결정할 수 있다. 절단되지 않은 플라스미드는 도말로(smear) 나타나야 하고, 절단된 플라스미드는 약 5 kb에서 하나의 큰 밴드여야 한다.
제조업체의 지침에 따라 사전 혼합된 ROX(Thermo Fisher Scientific)와 함께 2X EXPRESS qPCR Supermix를 사용하여 384-웰 qPCR 샘플 플레이트에서 QPCR을 수행한다. 간단하게, 3 μL 희석된 샘플(또는 표준 곡선)을 7.5 μL 2x Supermix, 0.11 μL AAV-GFP 프로브(FAM/TAMRA), 1.13 μL GFP-특이적 프라이머(10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 혼합), 및 3.26 μL 물과 합한다. 다음의 사이클 프로그램을 사용하여 qPCR 기계에서 샘플을 수행한다: 50℃에서 2분 동안(UDG 인큐베이션); 95℃에서 2분 동안; 40 사이클: 95℃에서 15초 동안, 60℃에서 1분 동안.
실시예 9. AAV-GFP 바이러스 감염 시험 프로토콜
AAV는 표적 세포(예컨대, Ht1080 또는 HEK293)를 감염시키는 능력에 대해 시험될 수 있다. 세포를 감염 약 4시간 전에 100 μL 배양 배지 중의 7000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 씨딩한다.
1 μL 조 AAV 제제를 각각의 웰에 첨가하여 세포를 감염시킨다. 세포를 약 3일 동안 인큐베이션한다. 발현 가능한 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 함유하는 AAV의 경우, 유세포 분석을 실행하여 GFP를 발현하는 세포의 백분율을 측정한다.
실시예 10. AAV 생산 시스템 비교
클론 45 및 클론 45에서 유도된 2개의 서브-클론주로부터의 AAV 벡터 생산을 HEK293F 유도체 LV293(LV-MAX 바이러스 생산 세포(VPC: Viral Production Cells), Thermo Fisher Scientific)로부터의 것과 비교하였다. 상기 세포를 상기 기술된 배양 프로토콜에 따라 성장시키고 AAV8에 대해 pAAV-GFP, pAAV-Helper, 및 pAAV-RC로 형질감염시켰다. 전술된 바와 같은 형질감염 부스터와 함께 형질감염 시약 2로 형질감염을 수행하였다. 형질감염 약 72시간 후, AAV 역가(GFP의 경우 qPCR을 통해(실시예 8)) 및 배양물의 세포 생존율을 측정하였다. 클론 45 및 서브-클론주 C13 및 C20은 LV293(VPC, 도 10a)과 함께 동일한 시스템과 비교하여 현저하게 더 높은 AAV8 역가(약 1.5 x 1011 vg/mL 내지 약 2.5 x 1011 vg/mL 사이)를 생산하였다. 또한, 클론 45, C13 및 C20을 사용한 AAV 생산 배양물은 LV293(VPC, 도 10b)을 사용한 배양물보다 현저하게 더 높은 세포 생존율을 가졌다.
클론 45 세포에서 다양한 AAV 혈청형에 걸친 벡터 생산을 LV293(VPC) 세포에서의 생산과 비교하였다. 세포를 전술된 바와 같이 AAV에 대한 현탁 세포 배양 프로토콜에 따라 성장시키고 상기 세포를 125 mL 플라스크에서 30 ml 세포 배양 배지-4에 희석하였다(3 x 106 세포/mL의 클론 45 및 2.5 x 106 세포/mL의 LV293). 상기 세포를 AAV2, AAV6, AAV8 및 AAV9에 대해 pAAV-GFP, pAAV-Helper, 및 pAAV-RC로 형질감염시켰다. 전술된 바와 같은 형질감염 부스터와 함께 형질감염 시약 2로 형질감염을 수행하였다. 배양물로부터의 AAV를 형질감염 약 72시간 후에 수확하였다. AAV 역가를 GFP 방법의 경우 qPCR을 통해 그리고 감염 시험 프로토콜(실시예 9)을 통해 측정하였다. 예시적인 결과를 도 11에 나타냈다. 생산자 세포로서 클론 45를 가진 AAV 생산 시스템은 LV293(VPC, 도 11a)를 가진 동일한 시스템과 비교하여 혈청형에 걸쳐 유의하게 더 높은 바이러스 역가(약 1.3 x 1011 vg/mL 내지 약 2.15 x 1011 vg/mL)를 야기하였다. 도 11b에 나타난 바와 같이, 클론 45를 가진 AAV 생산 시스템은 또한 LV293 VPC 세포보다 더 큰 감염성을 가진 AAV2 및 AAV6을 야기하였다.
본원에 제공된 AAV 벡터 생산 시스템을 사용한 AAV 벡터 생산을 2개의 폴리에틸렌이민(PEI)-기재 생산 시스템과 비교하였다. PEI-기재 형질감염 시스템을 제조업체의 지침 및 공지된 방법에 따라 수행하였다. 하나의 분석에서, AAV6의 경우 세포를 pAAV-GFP, pAAV-Helper, 및 pAAV-RC로 형질감염시켰다: (1) LV293 세포를 인핸서 없이 PEIpro™(Polyplus 형질감염)를 사용하여 형질감염시켰고 (2) 클론 45 세포를 전술된 형질감염 부스터 및 AAV 생산 인핸서와 함께 형질감염 시약 2로 형질감염시켰다. 배양 기간 후, AAV를 수확하고 GFP 방법의 경우 qPCR을 통해 그리고 감염 시험 프로토콜을 통해 역가를 결정하였다. 예시적인 결과를 도 12에 나타냈다. 본원에 제공된 AAV 생산 시스템은 PEIpro 시스템을 가진 LV293보다 유의하게 더 높은 AAV6 역가(도 12a) 및 감염성(도 12b)을 야기하였다.
다른 분석에서, 다양한 AAV 혈청형에 걸친 벡터 생산을 다음을 사용하여 비교하였다: (1) PEI-MAX 형질감염 시약(Polysciences, Inc.)으로 HEK293T 부착 세포 및 전술된 형질감염 시약 2 및 형질감염 부스터로 클론 45 세포. 세포를 AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, 및 AAV-dj에 대해 pAAV-GFP, pAAV-Helper, 및 pAAV-RC로 형질감염시켰다. 배양 기간 후, AAV를 수확하고 GFP 방법의 경우 qPCR을 통해 그리고 감염 시험 프로토콜을 통해 역가를 결정하였다. 예시적인 결과를 도 13a 내지 도 13b에 나타냈다. 본원에 제공된 AAV 생산 시스템은 PEI-MAX 시스템을 사용하는 HEK293T보다(도 13a) 시험된 혈청형 5개 중 4개에 걸쳐 유의하게 더 높은 AAV 역가를 야기하였다. 도 13b에 나타난 바와 같이, 본원에 제공된 AAV 생산 시스템은 또한 PEI-MAX 시스템보다 더 큰 감염성으로 AAV2 및 AAV6을 야기하였다.
실시예 11. 수확 후 처리
형질감염 후, 바이러스 생산 및 세포 세포용해, 조 AAV 세포용해물을 다운스트림 처리 전에 규조토를 사용하여 여과하였다. 동일한 AAV 배양으로부터의 2개의 샘플을 동결-해동 방법(세포용해 완충액 없이)으로 또는 10X AAV 세포용해 완충액 첨가 및 30분 인큐베이션(전술된 바와 같음)으로 세포용해하여 조 AAV 세포용해물을 형성하였다. 세포용해 직후, 규조토(DE)를 조 AAV 세포용해물과 혼합하고 상기 혼합물을 2 마이크론 필터에 통과시켰다. 0.5 g DE:30 mL 세포용해물 및 1 g DE:100 mL 세포용해물을 비롯하여 다양한 양의 mL 당 DE의 세포용해물을 시험하였다. DE 여과 전후에 각각의 세포용해물로부터 샘플을 취하여 여과 단계 후 AAV의 회수를 결정하였다. 샘플로부터의 AAV 역가를 GFP qPCR을 사용하여 결정하고 예시적인 결과를 도 14에 나타냈다. AAV 세포용해 완충 방법으로 조 세포용해물을 형성하면 DE 여과 동안 AAV 역가의 높은 회수율을 가져오는 반면 동결-해동된 세포 용해 방법은 회수율이 실질적으로 더 낮았다. 도 14에 나타난 바와 같이, 예컨대, 동결-해동으로 약 10% 회수율과 비교하여 세포용해 완충액으로 약 100% 역가 회수율이 수득되었다. 단일 DE 여과 단계는 필요한 필터 수를 줄이고 뉴클레아제 처리 및 정제 단계와 같은 다운스트림 공정 전에 AAV 세포용해물의 여과 및 처리 시간을 크게 단축시켰다.

Claims (73)

  1. 아데노-관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터 생산 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 포유류 세포를 현탁 배양으로 배양하는 단계;
    (b) 형질감염 시약을 사용하여 상기 포유류 세포를 AAV 전달 벡터(transfer vector)로 형질감염시키는 단계;
    (c) 형질감염된 세포를 인핸서와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 형질감염된 세포를 현탁 배양으로 상기 AAV 벡터 발현에 충분한 시간 동안 배양하여, 형질감염된 AAV 세포 배양물을 생성하는 단계;
    (e) 상기 형질감염된 AAV 세포 배양물로부터 AAV를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAV를 수확하는 단계는 상기 형질감염된 AAV 세포 배양물을 세포용해 완충액과 접촉하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포용해 완충액은 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 및 NDSB-201로부터 선택되는 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 세포용해 완충액은 Tris-HCl, 소듐 시트레이트, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및 소듐 디히드로겐 포스페이트 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포용해 완충액은 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 옥틸티오글루코시드, 및 소듐 디옥시콜레이트로부터 선택되는 적어도 하나의 세제를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 소듐 프로피오네이트, 및 카페인 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 HDAC 억제제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 HDAC 억제제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서는 형질감염 후 약 0시간 내지 약 12시간 사이에 첨가되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 세포를 형질감염 부스터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 형질감염 부스터는 펩티드를 포함하는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 형질감염 부스터는 5:1 내지 약1:5(부피/중량) 형질감염 부스터:DNA의 비율로 사용되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293 세포의 유도체인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 HEK293 세포는 AAV 벡터 생산 시스템에서 높은 AAV 발현을 위해 적응된 것인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 HEK293 세포는 적어도 5 x 106의 밀리리터 당 세포(세포/mL)의 밀도로 현탁 배양으로 성장할 수 있는, 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 HEK293 세포는 적어도 1.1 x 107의 밀리리터 당 세포(세포/mL)의 밀도로 현탁 배양으로 성장할 수 있는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 약1.5 x 106 내지 약5 x 106 세포/mL 사이의 세포 밀도로 형질감염되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 바이러스는 사용되지 않는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 AAV를 수확하기 전에 원심분리되지 않는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 거대 T 항원을 포함하지 않는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수확된 AAV를 적정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 AAV가 정량적 PCR을 사용하여 적정되는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 수확된 AAV가 적어도 약 2 x 1010의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL) 역가를 갖는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 수확된 AAV가 약 2 x 1010 vg/mL 내지 약 1 x 1012 vg/mL 사이의 역가를 갖는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 세포를 포장 플라스미드로 형질감염하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 포장 플라스미드가 pRC 및 pHelper를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 약 15 밀리리터(mL) 내지 약200 리터(L)의 부피로 배양되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 약 1 L 내지 약10 L의 부피로 배양되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 약 15 밀리리터(mL) 내지 약200 리터(L)의 부피로 형질감염되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 약 1 L 내지 약10 L의 부피로 형질감염되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 생물반응기에서 배양되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 HEK293 세포의 성장 및 확장(expansion)을 지원하는 배지에서 배양되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 단계 (a) 및/또는 (d) 동안 배양 보충물과 접촉되는, 방법.
  36. 아데노-관련 바이러스(AAV) 생산 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) 적어도 약 2 x 106 세포/mL의 밀도의 HEK293 세포;
    (b) AAV 전달 벡터;
    (c) 포장 플라스미드;
    (d) 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 소듐 프로피오네이트, 소듐 부티레이트, 및 카페인 중 하나 이상을 포함하는 인핸서; 및
    (e) 상기 HEK293 세포의 성장 및 확장을 지원하는 세포 배양 배지를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 HEK293 세포는 약 2 x 106 세포/mL 내지 약2 x 107 세포/mL 사이의 밀도로 존재하는, AAV 생산 시스템.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 형질감염 시약을 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  39. 제38항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함하는, AAV 생산 시스템.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 펩티드를 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 부스터를 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  42. 제41항에 있어서, 상기 형질감염 부스터가 양이온성 지질을 포함하는, AAV 생산 시스템.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 형질감염 부스터가 펩티드를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포용해 완충액을 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 및 NDSB-201로부터 선택되는 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 Tris-HCl, 소듐 시트레이트, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및 소듐 디히드로겐 포스페이트 중 적어도 하나를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 옥틸티오글루코시드, 및 소듐 디옥시콜레이트 중 적어도 하나의 세제를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  48. 제36항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택되는, AAV 생산 시스템.
  49. 제48항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산인, AAV 생산 시스템.
  50. 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 수확 후 적어도 약 2 x 1010의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL)의 역가로 존재하는, AAV 생산 시스템.
  51. 아데노-관련 바이러스(AAV) 생산 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) HEK293 세포;
    (b) 수확 후 적어도 약 2 x 1010의 밀리리터 당 바이러스 게놈(vg/mL)의 역가로 존재하는 AAV 벡터;
    (c) 포장 플라스미드;
    (d) 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 소듐 프로피오네이트, 소듐 부티레이트, 및 카페인 중 하나 이상을 포함하는 인핸서; 및
    (e) 상기 HEK293 세포의 성장 및 확장을 지원하는 세포 배양 배지를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  52. 제51항에 있어서, 상기 HEK293 세포는 약 2 x 106 세포/mL 내지 약2 x 107 세포/mL 사이의 밀도로 존재하는, AAV 생산 시스템.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 형질감염 시약을 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  54. 제53항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함하는, AAV 생산 시스템.
  55. 제54항에 있어서, 상기 형질감염 시약은 펩티드를 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 부스터를 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  57. 제56항에 있어서, 상기 형질감염 부스터가 양이온성 지질을 포함하는, AAV 생산 시스템.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 형질감염 부스터가 펩티드를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포용해 완충액을 추가로 포함하는, AAV 생산 시스템.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 및 NDSB-201로부터 선택되는 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 Tris-HCl, 소듐 시트레이트, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및 소듐 디히드로겐 포스페이트 중 적어도 하나를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 옥틸티오글루코시드, 및 소듐 디옥시콜레이트 중 적어도 하나의 세제를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택되는, AAV 생산 시스템.
  64. 제63항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산인, AAV 생산 시스템.
  65. 아데노-관련 바이러스(AAV) 생산을 위한 키트로서, 상기 키트는:
    (a) HEK293 세포;
    (b) 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 소듐 프로피오네이트, 및 카페인 중 하나 이상을 포함하는 인핸서;
    (c) 양이온성 지질을 포함하는 형질감염 시약; 및
    (d) 상기 HEK293 세포의 성장 및 확장을 지원하는 세포 배양 배지를 포함하는 키트.
  66. 제65항에 있어서, 형질감염 부스터를 추가로 포함하는, 키트.
  67. 제66항에 있어서, 상기 형질감염 부스터가 양이온성 지질 및/또는 펩티드를 포함하는, 키트.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 세포용해 완충액을 추가로 포함하는, 키트.
  69. 제68항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 Triton-100, Triton-alter, NP-40, 폴록사머 188, 및 NDSB-201로부터 선택되는 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 Tris-HCl, 소듐 시트레이트, 소듐 클로라이드, 시트르산, EDTA, 트리-포타슘 EDTA, 소듐 히드록시드, 및 소듐 디히드로겐 포스페이트 중 적어도 하나를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포용해 완충액이 CHAP, CHAPS, CHAPSO, big CHAP, 옥틸티오글루코시드, 및 소듐 디옥시콜레이트 중 적어도 하나의 세제를 포함하는, AAV 생산 시스템.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택되는, AAV 생산 시스템.
  73. 제72항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A, 및/또는 발프로산인, AAV 생산 시스템.
KR1020217028135A 2019-02-22 2020-02-21 아데노 관련 바이러스 생산을 위한 현탁 시스템 KR20210131353A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962809407P 2019-02-22 2019-02-22
US62/809,407 2019-02-22
PCT/US2020/019355 WO2020172624A1 (en) 2019-02-22 2020-02-21 Suspension system for adeno associated virus production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210131353A true KR20210131353A (ko) 2021-11-02

Family

ID=69844956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217028135A KR20210131353A (ko) 2019-02-22 2020-02-21 아데노 관련 바이러스 생산을 위한 현탁 시스템

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11608491B2 (ko)
EP (1) EP3927723A1 (ko)
JP (1) JP2022521755A (ko)
KR (1) KR20210131353A (ko)
CN (1) CN113454101A (ko)
AU (1) AU2020225632A1 (ko)
CA (1) CA3130108A1 (ko)
WO (1) WO2020172624A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112662706A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种外泌体包裹aav载体的制备及纯化方法
MX2023009554A (es) * 2021-02-15 2023-09-13 Biomarin Pharm Inc Uso de peptidos ricos en histidina como reactivo de transfeccion para la produccion de raav y rbv.
WO2023053899A1 (ja) 2021-10-01 2023-04-06 株式会社カネカ ウイルスベクター産生誘導剤
KR102529962B1 (ko) * 2021-10-07 2023-05-08 재단법인대구경북과학기술원 마이크로-스케일 아데노부속바이러스 벡터 정제 방법
US20230323395A1 (en) * 2021-12-15 2023-10-12 Homology Medicines, Inc. Methods and compositions for the production of adeno-associated virus
CN114574430A (zh) * 2022-03-22 2022-06-03 成都博宠生物科技有限公司 一种Expi293F细胞培养方法
JP2023141423A (ja) * 2022-03-24 2023-10-05 国立大学法人 東京大学 ウイルスの精製方法
WO2023200679A1 (en) * 2022-04-11 2023-10-19 Adverum Biotechnologies, Inc. OPTIMIZATION OF HEK293 SUSPENSION PLATFORM FOR IMPROVED rAAV TITERS

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
AU7906691A (en) 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6841357B1 (en) 2001-03-30 2005-01-11 Stratagene California Method and kits for titering adeno-associated virus vectors
US9856496B2 (en) * 2013-12-12 2018-01-02 Life Technologies Corporation Membrane-penetrating peptides to enhance transfection and compositions and methods for using same
WO2017151733A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Molecular Transfer, Inc. Plant virus movement proteins and methods of using the same
SG11201809643UA (en) * 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
CN109890959A (zh) * 2016-09-30 2019-06-14 生命技术公司 慢病毒生产用的无血清悬浮液系统
CN108085301B (zh) * 2016-11-22 2021-10-26 贺道耀 从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒
PE20200619A1 (es) * 2017-06-07 2020-03-11 Spark Therapeutics Inc AGENTES POTENCIADORES PARA LA TRANSFECCION CELULAR MEJORADA Y/O LA PRODUCCION DEL VECTOR rAAV

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020172624A1 (en) 2020-08-27
US11608491B2 (en) 2023-03-21
CN113454101A (zh) 2021-09-28
AU2020225632A1 (en) 2021-09-02
US20230193214A1 (en) 2023-06-22
CA3130108A1 (en) 2020-08-27
US20200270583A1 (en) 2020-08-27
EP3927723A1 (en) 2021-12-29
JP2022521755A (ja) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210131353A (ko) 아데노 관련 바이러스 생산을 위한 현탁 시스템
JP2021530985A (ja) フソソームの組成物及びその使用
KR20220032050A (ko) 조작된 casx 시스템
US20230048166A1 (en) Fusosome compositions for hematopoietic stem cell delivery
AU2020294216B2 (en) Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines
EP3461894A1 (en) Engineered crispr-cas9 compositions and methods of use
EP3662066A1 (en) Cellular models of and therapies for ocular diseases
KR20200093635A (ko) 변형된 폐쇄된 말단 dna (cedna)를 사용한 유전자 편집
EP1325960A2 (en) Negative strand RNA virus vector having autonomously replicating activity
JP6363956B2 (ja) 細胞および組成物の調製方法
KR20230002401A (ko) C9orf72의 표적화를 위한 조성물 및 방법
JP7432621B2 (ja) 選択的遺伝子調節のための組成物および方法
JP2020523006A (ja) 増強された改変ウイルスカプシドタンパク質
JP2022530457A (ja) 遺伝子操作ａａｖ
CN106755089B (zh) 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用
CN113710811B (zh) T细胞基因表达的非病毒修饰
GB2599212A (en) Stable cell lines for inducible production of rAAV virions
EP3792367A1 (en) Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest
CA3126886A1 (en) Liver-specific inducible promoters and methods of use thereof
RU2811724C2 (ru) РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)
CN117867023A (zh) 基于腺相关病毒载体的视黄酸水平可视化检测方法
Bayeva et al. Overexpression and Downregulation of Proteins in Vitro
JP3732204B2 (ja) 自律複製能を有する（−）鎖ｒｎａウイルスベクター
CN115315518A (zh) 重组aav的生产