JP2022521755A - アデノ随伴ウイルスの産生のための浮遊システム - Google Patents

Abstract

本技術は、無血清浮遊プラットフォームで高力価でＡＡＶベクターを産生する産生システムに関連する。この技術は、培地、細胞、トランスフェクション試薬、ＡＡＶエンハンサー、および溶解緩衝液を含む試薬を使用しており、そのそれぞれが例えばＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞の浮遊培養物から最大のＡＡＶ産生を提供するように設計されている。この新しいシステムでは、濃縮されていないＡＡＶベクターの１ミリリットル当たり最大約２×１０11のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）を送達できる。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１９年２月２２日に出願された米国仮出願第６２／８０９，４０７号の優先権および利益を主張する。前述の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ））は、ヒトおよび一部の非ヒト霊長類細胞に感染する小さなＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは病気を引き起こすことは知られておらず、ヒトにおける免疫原性は低い。ウイルス遺伝子がほとんどまたはまったくない、目的のＤＮＡ配列を含むＡＡＶベクターを作成できる。これらの利点により、遺伝子治療やその他の臨床および研究目的でＡＡＶベクターを使用するようになった。

ＡＡＶベクターを産生し、高力価を産生する大規模な方法が必要である。

本技術は、概して、無血清浮遊プラットフォームで高力価でベクターを産生するための新しいＡＡＶシステムに関連する。この技術は、培地、細胞、トランスフェクション試薬、ＡＡＶエンハンサー、および溶解緩衝液を含む、新しく開発された適切な一連の適正製造技術（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＧＭＰ））試薬を採用しており、そのそれぞれが哺乳動物細胞の浮遊培養物から最大のＡＡＶ産生を提供するように設計されている。この新しいシステムを使用すると、濃縮されていないＡＡＶベクター（つまり、本明細書に記載の採取方法を使用して採取後にさらに濃縮されていないベクター）の１ミリリットル当たり最大約２×１０¹¹のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）を送達できる。

一態様では、本明細書では、（ｉ）哺乳動物細胞を培養することと、（ｉｉ）トランスフェクション試薬を使用して前記哺乳動物細胞をＡＡＶ移入ベクターでトランスフェクトすることと、（ｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞をＡＡＶエンハンサーと接触させることと、（ｉｖ）前記トランスフェクトされた細胞を、前記ＡＡＶベクターのパッケージングに十分な時間、浮遊培養物内で培養し、それにより、トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を産生することと、を含む、ＡＡＶベクター産生のための方法が提供される。実施形態では、哺乳動物細胞は浮遊培養物内で培養される。実施形態では、この方法は、前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物からＡＡＶを採取することを含む。実施形態では、前記ＡＡＶは、溶解緩衝液を使用して採取される。実施形態では、前記トランスフェクトすることは、前記細胞をトランスフェクションブースターと接触させることを含む。

実施形態では、この方法は、前記採取されたＡＡＶを力価測定することを含む。実施形態では、前記ＡＡＶは、定量的ＰＣＲを使用して力価測定される。実施形態では、前記採取されたＡＡＶは、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有する。実施形態では、前記採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。

実施形態では、前記細胞は、約１０ミリリットル（ｍＬ）から約８００リットル（Ｌ）の容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量でトランスフェクトされる。実施形態では、前記細胞は、約１Ｌから約２Ｌの容量でトランスフェクトされる。

実施形態では、前記細胞はバイオリアクターで培養される。

実施形態では、前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する培地で培養される。実施形態では、前記細胞を、培養中（例えば、トランスフェクション後）にＡＡＶ産生エンハンサーと接触させる。

一態様において、本明細書では、ＨＥＫ２９３細胞、ＡＡＶ移入ベクター、パッケージングプラスミド、ＡＡＶ産生エンハンサー、およびＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地を含むＡＡＶ産生システムが提供される。実施形態では、前記ＡＡＶ産生システムは、トランスフェクション試薬を含む。実施形態では、前記ＡＡＶ産生システムは、トランスフェクションブースターを含む。実施形態では、前記ＡＡＶ産生システムは、溶解緩衝液を含む。実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細胞は、少なくとも約０．３×１０⁶細胞／ｍＬの密度で存在する。実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細胞は、少なくとも約２×１０⁶細胞／ｍＬの密度で存在する。実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細胞は、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１×１０⁷細胞／ｍＬの間の密度で存在する。一実施形態では、前記ＡＡＶベクターは、採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価で存在する。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、界面活性剤を含む。実施形態では、前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、またはＮＤＳＢ－２０１である。実施形態では、前記溶解緩衝液は、界面活性剤を含まない。実施形態では、前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、トリシンＨＣＬ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの洗浄剤を含む。実施形態では、前記洗浄剤は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、および／またはデオキシコール酸ナトリウムである。

実施形態では、前記ＡＡＶ産生エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、卵レシチン、酢酸リチウム、トリコスタチンヒドロキシ尿素、ノコダゾール－ＤＭＳＯ、ＮａＣｌ、およびカフェインのうちの１つ以上を含む。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である。実施形態では、前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクション後約０時間から約６時間の間に添加される。

実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質を含む。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、ペプチドをさらに含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、カチオン性脂質を含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む。実施形態では、前記ペプチドは、膜透過性ペプチドである。膜透過性ペプチドの非限定的な例は、米国特許第９，８５６，４９６号に提供されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、５：１から約１：５（体積／重量）のトランスフェクションブースター：ＤＮＡの間の比率で使用される。

実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の誘導体である。実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＡＶベクター産生システムにおける高ＡＡＶ発現に適合されている。実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり少なくとも０．３×１０⁶細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる。実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり最大１．２×１０⁷細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる。実施形態では、前記細胞は、約２．５×１０⁶および約４×１０⁶細胞／ｍＬの間の細胞密度でトランスフェクトされる。

実施形態では、ヘルパーウイルスは使用されない。実施形態では、この方法は、パッケージングプラスミドで前記細胞をトランスフェクトすることを含む。実施形態では、前記ＡＡＶ産生システムは、パッケージングプラスミドを含む。実施形態では、前記パッケージングプラスミドは、ｐＲＣおよびｐＨｅｌｐｅｒを含む。

実施形態では、前記細胞は、ＡＡＶを採取する前に遠心分離されない。

実施形態では、前記細胞はラージＴ抗原を含まない。

一態様では、本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生のためのキットである。実施形態では、前記キットはＨＥＫ２９３細胞と、エンハンサーと、カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬と、ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地とを含む。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質およびペプチドを含む。

実施形態では、前記キットはまた、トランスフェクションブースターを含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む。

実施形態では、前記キットはまた、溶解緩衝液を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。実施形態では、前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、および／またはＮＤＳＢ－２０１である。実施形態では、前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、トリシンＨＣＬ、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、および／またはリン酸二水素ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの洗浄剤を含む。実施形態では、前記洗浄剤は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、デオキシルビッグＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、オクチルチオグルコシド、および／またはデオキシコール酸ナトリウムである。

ＡＡＶ２の産生に対する異なる条件の影響を示す。ＡＡＶ２ウイルスは、Ｐｒｏｔ－１（エンハンサー１およびサプリメント１）、Ｐｒｏｔ－２（サプリメント１、エンハンサーなし）、Ｐｒｏｔ－３（エンハンサー１、サプリメントなし）という３つの異なる条件下でシステム１と比較してポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でトランスフェクトされた接着ＨＥＫ２９３細胞（６ウェルプレート）によって産生された。 ４つの異なるタイプの培養培地に適合されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞のＡＡＶ２産生の比較を示す。 ＡＡＶ産生のための３つの異なるシステムの比較を示す。培地４に適合されたＨＥＫ２９３細胞は、実施例に詳述されているように、システム１、システム２、およびシステム３でテストされた。 培地４（クローン４５）に適合されたクローンＨＥＫ２９３細胞の成長特性を示す。培養培地は、高い細胞生存率（図４Ａ）で高密度に成長するクローン４５細胞（～１１×１０⁶細胞／ｍＬ）を支持した。図４Ｂに示すように、細胞の高密度での凝集は非常に限られている。 クローンＨＥＫ２９３細胞における異なるＡＡＶ血清型の産生を示す。対照：培地４の親ＨＥＫ２９３細胞。Ｅｘｐｉ４５：Ｅｘｐｉ２９３培地でのクローン４５。Ｃｌ４５、Ｃｌ１２、Ｃｌ２２およびＣｌ５１：培地４のＨＥＫ２９３クローンを示す。 トランスフェクション試薬の比較を示す。トランスフェクション試薬１（ＴＲ１）を、ＡＡＶ２の産生のためにトランスフェクション試薬２（ＴＲ２）と比較した。 ＡＡＶ産生システムにおけるウイルス力価に対するエンハンサー添加のタイミングの影響を示す。 ウイルス力価に対するＡＡＶ溶解緩衝液中の様々な洗浄剤の効果を示す。 異なるＡＡＶ血清型についての、トランスフェクトされた細胞培養物全体に対する細胞ペレットからの抽出物ＡＡＶ力価を示す。 トランスフェクション後のＡＡＶ産生（図１０Ａ）および細胞生存率（図１０Ｂ）におけるクローン４５、サブクローン株Ｃ１３およびＣ２０、およびＬＶ２９３細胞（ＶＰＣ）の比較を示す。 ＡＡＶ産生におけるクローン４５およびＬＶ２９３細胞（ＶＰＣ）の比較を示す。図１１Ａは、異なるＡＡＶ血清型について得られたウイルス力価（ｖｇ／ｍＬ）を比較する。図１１Ｂは、各クローン細胞株から採取されたＡＡＶ２およびＡＡＶ６の感染力（Ｈｔ１０８０における％ＧＦＰとして）を比較する。 採取後のＡＡＶ６産生（ｖｇ／ｍＬ、図１２Ａ）およびＡＡＶ６感染（Ｈｔ１０８０における％ＧＦＰとして、図１２Ｂ）におけるクローン４５のＡＡＶシステムおよびＬＶ２９３－ＰＥＩシステムの比較を示す。 ＡＡＶ産生におけるクローン４５のＡＡＶシステムおよびＨＥＫ２９３Ｔ－ＰＥＩシステムの比較を示す。図１３Ａは、異なるＡＡＶ血清型について得られたウイルス力価（ｖｇ／ｍＬ）を比較する。図１３Ｂは、各システムから採取されたＡＡＶ２、ＡＡＶ６およびＡＡＶ－ｄｊの感染力（Ｈｔ１０８０における％ＧＦＰとして）を比較する。 珪藻土ろ過の前後の粗溶解物中のＡＡＶ力価を示す。

この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態および代替の用途で本発明をどのように実施するかが当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の全ての様々な実施形態は、本明細書では説明されない。ここに提示された実施形態は、限定ではなく、一例としてのみ提示されていることが理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、以下に記載されるように、本発明の範囲または広さを限定するように解釈されるべきではない。

本発明が開示および説明される前に、以下に説明される態様は、特定の組成物に限定されず、そのような組成物を調製する方法、またはそのようなものとしての使用は、もちろん変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定するようには意図されていないことが理解される。

本発明の詳細な説明は、読者の便宜のためにのみ様々なセクションに分割されており、任意のセクションに見られる開示は、別のセクションの開示と組み合わせることができる。タイトルまたはサブタイトルは、読者の便宜のために本明細書で使用することができ、本発明の範囲に影響を与えることを意図していない。
定義

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、本明細書で定義される多数の用語を参照する。

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。

「任意の」または「任意に」とは、後に記載される事象または状況が発生する可能性がある、または発生しない可能性があることを意味し、その記載には、その事象または状況が発生する実例および発生しない実例が含まれる。

「約」という用語は、数値表記、例えば、温度、時間、量、濃度、および範囲を含むそのような他のものの前に使用される場合、（＋）または（－）１０％、５％、１％、またはその間の任意の部分範囲または部分値によって変動し得る近似を示している。好ましくは、「約」という用語は、用量の量に関して使用される場合、用量が＋／－１０％変動し得ることを意味する。

「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物および方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」とは、述べられた目的のために、組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される発明の基本的および新規の特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しないであろう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、他の成分の微量要素および実質的な方法ステップを超えて除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システム

本明細書で使用される「細胞」という用語は、あらゆる種類の真核生物および原核生物細胞を指し、それらを含む。一部の実施形態では、この用語は、真核細胞、特に哺乳類動物細胞を指す。ある特定の例示的であるが非限定的な実施形態において、「細胞」という用語は、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞もしくはヒト２９３細胞、または例えば懸濁液中で成長することができる２９３（ＨＥＫ２９３）変異体のような、その変異体を指すことを意味する。一部の実施形態において、浮遊培養物において成長し、増殖し、トランスフェクトすることができる２９３細胞の変異体であり、特に、高密度（例えば、少なくとも約２×１０⁶細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０⁶細胞／ｍＬ、またはさらに任意で少なくとも約４×１０⁶細胞／ｍＬもしくは約１．２×１０⁶細胞／ｍＬ）で培養することができる当該変異体である。

一部の実施形態において、細胞を培養しトランスフェクションの作業の流れを行うという文脈で使用されるときの「高密度」という用語は一般的に、高い効率でトランスフェクトされる能力をなおも保有しながら、少なくとも約２×１０⁶細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０⁶細胞／ｍＬ、またはさらに任意で少なくとも約４×１０⁶細胞／ｍＬの密度まで適切な細胞培養培地中で成長するまたは培養されることができ、高力価（例えば、１ｍＬ当たり５×１０¹⁰生存ゲノム（ｖｇ／ｍＬ）以上）で標的ＡＡＶベクターを発現することができる、既知の細胞株、または既知の細胞株の変異体を指す。

一部の実施形態では、これらの細胞は、高密度細胞培養に適合されている。これは、約８０％またはそれを上回る細胞生存率を維持しながら、高密度培養培地において高密度で成長するように適合された細胞系列または同じ親細胞系列由来の（非クローン）細胞集団を指す。かかる細胞は、約４０、５０、６０、７０、または８０以上の連続継代にわたって高密度で細胞を維持し、成長培地の割合を所望の高密度培養培地に徐々に置き換えることによって、細胞の親集団から単離されるか、または選別され得る。任意に、プロセス中、異なるプールの細胞は個々に伝播され、選択手順を経てもよく、それと同時にトランスフェクション効率およびまたはＡＡＶベクター産生効率を評価し、その結果、高密度で持続および成長し、高効率でトランスフェクトされ、ＡＡＶの高力価を発現することができる細胞のクローン集団が選択され得る。細胞のクローン集団は、既知の方法および技術、例えば、フローサイトメトリーソーティングおよび／または単一細胞クローニングを使用して産生し得る。実施形態では、フローサイトメトリーソーティングを使用して、高密度細胞培養に適合された細胞クローンを単離し、ＡＡＶ産生システムで使用する。一部の実施形態では、高密度細胞培養およびＡＡＶ産生システムでの使用に適合された細胞クローンは、単一細胞クローニングを介して得られ、イメージングなどの既知の技術を使用して単一細胞クローンとして確認される。様々な細胞型および系列がこの選択手順を経ることができることは当業者には容易に明らかであろうが、２９３ヒト胚腎細胞由来の細胞系列が高密度成長条件に適合されるための選択プロセスに特に適していることが決定された。いくつかのシナリオにおいて、高密度成長培養に適合され、本明細書の使用に適している細胞は、高効率でトランスフェクトされることもでき、かつ／または濃縮されていないＡＡＶベクターの、少なくとも約５×１０⁹ｖｇ／ｍＬから約５×１０¹²ｖｇ／ｍＬまで、約１×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬまで、約１×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹¹ｖｇ／ｍＬまで、約８×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約３×１０¹¹ｖｇ／ｍＬまで、または約５×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬまでという収量でＡＡＶベクターを発現することもできる。いくつかのシナリオにおいて、使用される高密度培養に適合された細胞は、約１×１０⁶から約２×１０⁷細胞／ｍＬ、約１×１０⁶から約３×１０⁶細胞／ｍＬ、約２×１０⁶から約４×１０⁶細胞／ｍＬ、または約２．５×１０⁶から約４×１０⁶細胞／ｍＬの範囲の密度で持続およびトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、細胞は、高密度培養に適合され得、約１×１０⁶から約２×１０⁷細胞／ｍＬ、約１×１０⁶から約４×１０⁶細胞／ｍＬ、約１×１０⁶から約３×１０⁶細胞／ｍＬ、約１×１０⁶から約２×１０⁶細胞／ｍＬの範囲の密度でトランスフェクトされ得る。

一部の実施形態では、前記細胞は浮遊培養物において成長する。これは、培養槽中の細胞の大部分またはすべてが浮遊状態で存在し、培養槽中の細胞の少数が槽の表面または槽内の別の表面に接着するか、またはいずれも接着しない、細胞培養を意味する。一部の実施形態では、浮遊培養物は、培養槽中の細胞の約７５％以上が浮遊状態であり、培養槽上の表面または培養槽内に接着しない。一部の実施形態では、浮遊培養物は、培養槽中の細胞の約８５％以上が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽内に接着しない。一部の実施形態では、浮遊培養物は、培養槽中の細胞の約９５％以上が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽内に接着しない。

前記ＡＡＶ産生システムは、２９３細胞、またはそれに由来する細胞が、５日後に２０％未満の細胞死を伴いながら、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬの密度で成長することができる。実施形態では、前記細胞は、５日後に２０％未満の細胞死を伴いながら、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１２×１０⁶細胞／ｍＬの密度で成長することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される前記２９３細胞は、６日、７日、または８日後に２０％未満の細胞死を伴いながら、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬ、または約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１２×１０⁶細胞／ｍＬなどの高密度で成長することができる。実施形態では、前記２９３細胞は、５日、６日、７日、または８日後に１０％未満の細胞死を伴いながら、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬ、または約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１２×１０⁶細胞／ｍＬなどの高密度で成長することができる。

別の方法で説明すると、本明細書で提供される前記ＡＡＶ産生システムは、前記２９３細胞、またはそれに由来する細胞が、５日後の培養において８０％超の細胞生存率で、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬの密度で成長することができる。実施形態では、前記細胞は、５日後の培養において８０％超の細胞生存率で、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１２×１０⁶細胞／ｍＬの密度で成長することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される前記２９３細胞は、６日、７日、または８日後の培養において８０％超の細胞生存率で、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬ、または約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１２×１０⁶細胞／ｍＬなどの高密度で成長することができる。実施形態では、前記２９３細胞は、５日、６日、７日、または８日後の培養において９０％超の細胞生存率で、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬ、または約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約１２×１０⁶細胞／ｍＬなどの高密度で成長することができる。

一部の実施形態では、クローン４５、クローン４５のサブクローン、および本明細書に記載の他のクローンなど、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、３日後の高密度培養において、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、またはＬＶ２９３（ＬＶ－ＭＡＸウイルス産生細胞）（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）よりも少なくとも１０％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも少なくとも１０％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも少なくとも１５％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも少なくとも２０％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも少なくとも２５％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも少なくとも３０％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも少なくとも４０％高い生存率を有する。実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも約１０％から約３０％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも約２０％から約４０％高い生存率を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、高密度培養の３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、または８日後に、ＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞よりも約２５％から約５０％高い生存率を有する。

実施形態では、クローン４５、クローン４５のサブクローン、および本明細書に記載の他のクローンなど、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、同量のＨＥＫ２９３Ｆ細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、またはＬＶ２９３（ＬＶ－ＭＡＸウイルス産生細胞）（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）よりも著しく高いＡＡＶベクター収量および力価（ｖｇ／ｍＬ）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、同量のＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞から採取された力価と比べて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１８倍、少なくとも２０倍の採取されたＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍＬ）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書で提供される高密度に適合された２９３細胞の浮遊培養物は、同量のＨＥＫ ２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、またはＬＶ２９３細胞から採取された力価と比べて、約２から約２０倍、約２から約５倍、約２から約１０倍、約５から約１５倍、約５から約１０倍、約７から約２０倍、約１０から約１５倍の採取されたＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍＬ）をもたらす。

実施形態では、前記細胞は、例えば、約８×１０⁶細胞／ｍＬよりも大きい非常に高密度で、限定された凝集を示す。実施形態では、前記細胞は、約９×１０⁶細胞／ｍＬを超える限定された凝集を示す。実施形態では、前記細胞は、約１０×１０⁶細胞／ｍＬを超える限定された凝集を示す。実施形態では、前記細胞は、培養培地中で、本明細書に記載の条件下で成長した非常に高密度で、限定された凝集を示す。

実施形態では、前記細胞は、約１５μｍから約２０μｍの間、例えば、約１６μｍから約１９μｍの間、または約１６．５μｍから約１９μｍの間の直径を有する。実施形態では、前記細胞は、約０．３×１０⁶細胞／ｍＬから約２０×１０⁶細胞／ｍＬの密度で成長した、約１５μｍから約２０μｍの間の直径を有する。実施形態では、前記細胞は、約１×１０⁶細胞／ｍＬから約１０×１０⁶細胞／ｍＬの密度で成長した、約１６μｍから約１９μｍの間の直径を有する。

実施形態では、高密度成長培養に適合され、高効率でトランスフェクトされることもでき、かつ／または２９３細胞は、約５×１０⁹ｖｇ／ｍＬから約５×１０¹²ｖｇ／ｍＬまでの収量でＡＡＶベクターを発現することもできる２９３細胞は、ラージＴ抗原を発現しないか、または含まない。

様々な細胞培養培地を使用して、前記ＡＡＶ産生システム細胞を培養することができる。無血清培地はしばしば研究者によって望まれている。本明細書に記載の細胞の成長を支持する無血清培地を含む任意の培地を使用してもよい。培地はまた、無タンパク質であってもよい。

「無血清培地」（「ＳＦＭ培地」とも称される場合がある）は、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、子ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒト血清など）を含有しない培地であり、一般的に、ＳＦＭという文字で表される。「無タンパク質」培養培地という句は、タンパク質を含有しない（例えば、血清アルブミンもしくは接着因子などの血清タンパク質、成長因子などの栄養素タンパク質、またはトランスフェリン、セルロプラスミンなどの金属イオンキャリアタンパク質のない）培養培地を指す。一部の実施形態では、ペプチドが存在する場合、ペプチドは、より小さいペプチド、例えば、ジペプチドまたはトリペプチドである。一部の実施において、デカペプチド長以上のペプチドは、無タンパク質培地中に存在するアミノ酸の約１％以下、約０．１％以下、および約０．０１％以下である。

一部の実施形態では、哺乳動物細胞の成長を維持することができる任意の培養培地を含む、高密度培養培地を使用してもよい。一部の実施形態において、細胞は、約８０％を超える、例えば約９０％を超える当該細胞の生存度を維持しながら、かつ当該浮遊細胞が効率的にトランスフェクトされ、多量のＡＡＶベクターを発現する能力を維持しながら、約２×１０⁷細胞／ｍｌ、例えば約１２×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で浮遊中に成長する。使用される高密度培養培地は、異なる用途および使用によって異なってもよく、使用される細胞系の性質、発現ベクターの細胞内への移入のために選択されたトランスフェクションモダリティの性質、ならびに本明細書に記載される系に添加される任意の発現エンハンサーの量および性質に依存し得る。実施形態では、本システムおよび方法で使用される高密度培養培地は、無血清および無タンパク質である。実施形態では、前記細胞培養培地は、最大約２×１０⁷細胞／ｍＬ、例えば、最大約１．２×１０⁷細胞／ｍＬ、または約２×１０⁶細胞／ｍＬから約１×１０⁷細胞／ｍＬまでの密度の浮遊細胞の培養および成長を可能にする。実施形態では、使用される前記培養培地は、一過性発現系で産生されるウイルス力価が、少なくとも１×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから最大約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬ、または最大約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬを超えることを可能にする。一部の実施形態において、使用される前記高密度培養培地は、約１×１０⁶から約２０×１０⁶細胞／ｍｌ、約１×１０⁶から約４×１０⁶細胞／ｍｌ、または約２．５×１０⁶から約３×１０⁶細胞／ｍｌの範囲の密度の細胞のトランスフェクションを容易にする。

本明細書で使用するのに好適な前記高密度培養培地の例としては、これらに限定されるものではないが、ＨｕＭＥＣ基礎無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）－３４ ＳＦＭ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）－８培地、培地２５４、培地，１０６、培地，１３１、培地，１５４、培地，１７１、培地１７１、培地２００、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭ、ヒト内皮－ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ、培地１５４ ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）－６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）－３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アストロサイト培地、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）Ｃ－１００基礎培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）－ＩＩ完全培地、ＣＤ ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＳＦ－９００（商標）培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＨＣ基礎培地、ＬＨＣ－８培地、２９３ ＳＦＭ培地、ＣＤ ２９３培地、ＡＥＭ成長培地、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ケラチノサイトＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、ＬＨＣ－８培地、ＬＨＣ－９培地、および任意の派生物またはその変形が挙げられる。ある特定の非限定的な実施形態において、高密度培養培地は、ＣＤ ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）産生培地、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）Ｆ１７発現培地、ＤＹＮＡＭＩＳ（商標）培地、ＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）ＨＥＫ２９３培地、もしくは同様の培地、またはそれらの変形形態であってもよい。前記培養培地は、２９３細胞、２９３細胞変異体、または高密度培養システムでの使用に適合された任意の他の細胞の高密度成長、増殖、トランスフェクションおよび維持に適した（例えば、処方された）任意の培地であり得る。

前記ＡＡＶ産生システムはまた、細胞への巨大分子の侵入を促進するトランスフェクション試薬または組成物を含む。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質を含む。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、米国特許第９，８５６，４９６号に記載されているカチオン性脂質であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、細胞内への巨大分子の導入のための試薬は、カチオン性脂質および／または中性脂質であり得る１つ以上の脂質を含み得る。好ましい脂質には、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（４´－トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジヒドロキシル－ジミリスチルスペルミンテトラヒドロクロリド（ＤＨＤＭＳ）、ヒドロキシル－ジミリスチルスペルミンテトラヒドロクロリド（ＨＤＭＳ）、１，２－ジオレオイル－３－（４´－トリメチルアンモニオ）ブタノイル－ｓｎ－グリセロール（ＤＯＴＢ）、１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）、コレステリル（４´－トリメチルアンモニオ）ブタノエート（ＣｈｏＴＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＭＥ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ´－ジドデシル－Ｎ－［ｐ（２－トリメチルアンモニオエチルオキシ）ベンゾイル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、１つ以上の脂質に接合したスペルミン（例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ^I，Ｎ^II，Ｎ^III－テトラメチル－Ｎ，Ｎ^I，Ｎ^II，Ｎ^III－ｔｅｔ－ラパルミチルスペルミン（ＴＭ－ＴＰＳ）、およびジパルミトイルファスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミルアミンド（ＤＰＰＥＳ））、リポポリリジン（ＤＯＰＥに接合したポリリジン）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタミン）接合脂肪酸（ＴＦＡ）、ならびに／またはペプチド、例えば、トリリジル－アラニル－ＴＲＩＳモノ、ジ、およびトリパルミテート（３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣＣｈｏｌ）、Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）－ジドデシル－Ｄ－グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、前記トランスフェクション試薬は、少なくとも１つの追加のヘルパー脂質をさらに含み得る。ヘルパー脂質は、当該技術分野で既知であり、好ましくは、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、およびコレステロールからなる群から選択される中性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つの中性脂質を含む。

当業者であれば、上述の脂質のある特定の組み合わせが、細胞内への核酸の導入に特に好適であることが示されていることを理解し、例えば、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）の組み合わせは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から商品名ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）で入手可能であり、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）の組み合わせは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商品名ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で入手可能であり、ＤＩＶＩＲＩＥおよびコレステロールの１：１（Ｍ／Ｍ）の組み合わせは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から商品名ＤＩＶＩＲＩＥ－Ｃ試薬で入手可能であり、ＴＭ－ＴＰＳおよびＤＯＰＥの１：１．５（Ｍ／Ｍ）の組み合わせは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈから入手可能である。一部の実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬である。一部の実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、ポリマー系トランスフェクション試薬である。他の市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬には、限定されないが、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＬＹＯＶＥＣ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅから入手可能）、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓから入手可能）、および昆虫ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が挙げられる。本明細書で使用され得る追加のトランスフェクション試薬には、限定されないが、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００， ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、ＶＩＡＦＥＣＴ（商標）トランスフェクション試薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬およびＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（これらの各々は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である）、ならびにＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）脂質試薬が挙げられる。

実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、トランスフェクションブースターと組み合わされる。実施形態では、前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、少なくとも１つのペプチドを含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターの前記少なくとも１つのペプチドは、天然に存在するまたは天然に存在しない膜透過性ペプチドである。実施形態では、前記トランスフェクションブースターの前記少なくとも１つのペプチドは、天然に存在するまたは天然に存在しない膜透過性ペプチド配列を含む。適切な膜透過性ペプチドおよびペプチド配列の非限定的な例は、米国特許第９，８５６，４９６号に提供されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態では、前記トランスフェクションブースターの前記少なくとも１つのペプチドは、融合性ペプチド、細胞透過性ペプチド、核局在化ペプチド、細胞表面接着ペプチド、または植物ウイルス運動ペプチドである。実施形態では、前記トランスフェクションブースターの前記少なくとも１つのペプチドは、融合性ペプチド配列、細胞透過性ペプチド配列、核局在化ペプチド配列、細胞表面接着ペプチド配列、または植物ウイルス運動ペプチド配列を含む。適切な融合性、細胞透過性、核局在化、細胞表面接着、および植物ウイルス運動ペプチドおよびペプチド配列の非限定的な例は、米国特許出願公開第２０１７／０２５３８８８ Ａ１号に提供されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、トランスフェクションブースターおよび前記ＡＡＶ移入ベクターと組み合わされて、トランスフェクション複合体を形成する。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、トランスフェクションブースター、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ｐＲＣ）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（ヘルパーウイルス成分をコードする）、および前記ＡＡＶ移入ベクターと組み合わされて、トランスフェクション複合体を形成する。

実施形態では、前記ＡＡＶ産生システムは、溶解緩衝液を含む。溶解緩衝液は、開いた細胞を破壊し、その内容物、例えば、ＡＡＶベクターを放出するために使用される緩衝液である。実施形態では、前記溶解緩衝液は、５倍の濃度（細胞と接触される最終濃度の５倍）で提供される。実施形態では、前記溶解緩衝液は、１０倍の濃度（細胞と接触される最終濃度の１０倍）で提供される。

実施形態では、前記溶解緩衝液は洗浄剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つのＣＨＡＰ、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス－（３－Ｄ－グルコナミドプロピル）デオキシコラミド（ビッグＣＨＡＰ）、オクチルチオグルコシド（ＯＴＧ）、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される洗浄剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、ＯＴＧ、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される１つの洗浄剤を含む。実施形態では、溶前記解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、ＯＴＧ、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される２つの洗浄剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、ＯＴＧ、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される３つの洗浄剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、ＯＴＧ、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される４つ以上の洗浄剤を含む。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．００５％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＣＨＡＰを含む。実施形態では、ＣＨＡＰは、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。実施形態では、ＣＨＡＰは、約０．０１％から約０．８％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．００５％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＣＨＡＰＳを含む。実施形態では、ＣＨＡＰＳは、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。実施形態では、ＣＨＡＰＳは、約０．０１％から約０．８％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．００５％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＣＨＡＰＳＯを含む。実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは、約０．０１％から約０．８％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．００５％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でビッグＣＨＡＰを含む。実施形態では、ビッグＣＨＡＰは、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。実施形態では、ビッグＣＨＡＰは、約０．０１％から約０．８％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．００５％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＯＴＧを含む。実施形態では、ＯＴＧは、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。実施形態では、ＯＴＧは、約０．０１％から約０．８％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．００５％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でデオキシコール酸ナトリウムを含む。実施形態では、デオキシコール酸ナトリウムは、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。実施形態では、デオキシコール酸ナトリウムは、約０．０１％から約０．８％（ｗ／ｖ）の間の濃度で前記溶解緩衝液（細胞と接触する最終濃度）中に存在する。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ４０、およびポロキサマー１８８（ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのコポリマー、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８）から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ４０、およびポロキサマー１８８から選択される１つの界面活性剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ４０、およびポロキサマー１８８から選択される２つの界面活性剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ４０、およびポロキサマー１８８から選択される３つの界面活性剤を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ４０、およびポロキサマー１８８から選択される４つの界面活性剤を含む。ポロキサマー１８８の式（Ｉ）は次のとおりである。

（Ｉ）

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０１％から約０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＴｒｉｔｏｎ－１００またはＴｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０５％から約０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＴｒｉｔｏｎ－１００またはＴｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０１％から約０．０５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＴｒｉｔｏｎ－１００またはＴｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０５％から約０．５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１％から約０．５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．２％から約０．５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．３％から約０．５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．４％から約０．５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０５％から約０．４％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０５％から約０．３％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０５％から約０．２％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０５％から約０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＰ４０を含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０８％から約０．２％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でポロキサマー１８８を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０９％から約０．２％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でポロキサマー１８８を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１％から約０．２％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でポロキサマー１８８を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０８％から約０．１５％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でポロキサマー１８８を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．０８％から約０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でポロキサマー１８８を含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの塩を含む。実施形態では、前記塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、および／またはリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）である。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約４００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約３００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約１０００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約４００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約３００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸ナトリウムを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約４００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約３００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約１０００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約４００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約３００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約２００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で塩化ナトリウムを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約２５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸アンモニウムを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約２５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でリン酸ナトリウム（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム）を含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液はキレート剤を含む。実施形態では、前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、三カリウムＥＤＴＡ、および／またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）である。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約５ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＤＴＡを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約５ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）で三カリウムＥＤＴＡを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．１ｍＭから約５ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＥＧＴＡを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの追加の化合物を含む。例えば、前記溶解緩衝液は、３－（１－ピリジニオ）プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ ２０１、非洗浄剤スルホベタイン２０１）を含み得る。実施形態では、前記溶解緩衝液はトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液はクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５Ｍから約１Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．６Ｍから約１Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．７Ｍから約１Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．８Ｍから約１Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．９Ｍから約１Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５Ｍから約０．９Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５Ｍから約０．８Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５Ｍから約０．７Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約０．５Ｍから約０．６Ｍの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮＤＳＢ－２０１を含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約５ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約６ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約８ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１２ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１４ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１５ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１２ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１５ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でトリス－ＨＣｌを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約２０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約４０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約５０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約６０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約８０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約２０ｍＭから約８０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約２０ｍＭから約６０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約２０ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でクエン酸を含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約３０ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約４０ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、約１ｍＭから約１０ｍＭの間の濃度（細胞と接触する最終濃度）でＮａＯＨを含む。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

前記ＡＡＶ産生システムはまた、ＡＡＶ産生エンハンサー（ＡＡＶエンハンサー）を含む。前記ＡＡＶエンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、テオブロミン、およびカフェインの１つまたは複数を含む。

実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である。

実施形態において、前記プロピオン酸ナトリウムおよび／またはＨＤＡＣ阻害剤は水中で提供される。実施形態では、前記カフェインは、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地などの細胞培養発現培地で提供される。

実施形態では、プロピオン酸ナトリウムは、約１ｍＭから５０ｍＭの濃度（細胞と接触する最終濃度）で含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約１ｍＭから４０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約１ｍＭから３０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約１ｍＭから２０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約１ｍＭから１０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約１ｍＭから５ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約２ｍＭから３０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約２ｍＭから２０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約２ｍＭから１０ｍＭで含まれる。実施形態において、プロピオン酸ナトリウムは、約２ｍＭから５ｍＭで含まれる。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約１００ｍＭの濃度（細胞と接触する最終濃度）で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約７５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約２５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約９ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約８ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約７ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約６ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約０．１ｍＭから約５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約５０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約２５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約９ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約８ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約７ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約６ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、前記ＨＤＡＣ阻害剤は、約１ｍＭから約５ｍＭの濃度で含まれる。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの濃度（細胞と接触する最終濃度）で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約２５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約１５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約９ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約８ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約７ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約６ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約４ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約３ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．１ｍＭから約２ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．５ｍＭから約５０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．５ｍＭから約５ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．５ｍＭから約４ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．５ｍＭから約３ｍＭの濃度で含まれる。実施形態では、カフェインは、約０．５ｍＭから約２ｍＭの濃度で含まれる。濃度は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

一部の実施形態では、前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクション時（約０時間）からトランスフェクション後約４８時間までなどの１つまたは複数の時点で添加される。前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクションの約１時間から約１６時間後に添加して、ＡＡＶベクターの細胞パッケージングを促進することができる。一部の実施形態では、前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクション時に添加され得る。一部の実施形態では、前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクション時およびトランスフェクションの約１時間から約１６時間後に添加され得る。一部の実施形態では、前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクションの約４から５時間後に添加され得る。一部の実施形態では、前記ＡＡＶエンハンサーは、トランスフェクションの約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２４、３６、または４８時間後に添加され得る。前記ＡＡＶエンハンサーは、端点を含む、記載されている範囲内でいつでも（または部分範囲で）追加できる。

ＡＡＶベクターの設計および製造は当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，３５４，６７８号、６，７５９，２３７号、５，７５３，５００号、および５，４７４，９３５号を参照されたい。ＡＡＶを適切にパッケージングするために、パッケージングプラスミドを使用できる。これらのプラスミドは、ＡＡＶベクターのパッケージングに必要な遺伝子をコードしている。このような遺伝子には、キャプシドタンパク質（ｃａｐ）および複製（ｒｅｐ）遺伝子を発現する遺伝子が含まれる。あるいは、遺伝子は細胞によって安定して発現され得る。前記ＡＡＶ遺伝子は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ＤＪまたはＤＪ／８を含むがこれらに限定されない、任意の血清型ＡＡＶからの任意のものであり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするパッケージングプラスミドは、ｐＡＡＶ－ＲＣ、ｐＲｅｐ／Ｃａｐ、またはｐＲＣプラスミドと呼ばれることがよくある。ＡＡＶ移入ベクター、パッケージングプラスミド、パッケージング細胞株、およびＡＡＶ産生用の他の製品は、例えばＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。

実施形態では、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスからの）成分は、前記ＡＡＶ産生システムの適切な機能のために必要とされる。ヘルパーウイルス成分は、プラスミド（さらに、しばしばｐＡＡＶ－ＨｅｌｐｅｒまたはｐＨｅｌｐｅｒプラスミドと呼ばれる）に存在するか、そうでなければ細胞に存在する可能性がある。ヘルパーウイルス成分には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、および／またはＶＡが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で提供されるのは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生のためのキットである。実施形態では、前記キットは、高密度浮遊培養物に適合された２９３細胞、ＡＡＶ産生エンハンサー、カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬、ならびに２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地を含む。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質およびペプチドを含む。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つの中性脂質を含む。実施形態では、前記ＡＡＶ産生エンハンサーは、ＨＤＡＣ阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、テオブロミン、およびカフェインのうちの１つまたは複数を含む。実施形態では、前記２９３細胞はラージＴ抗原を含まない。

実施形態では、前記キットはまた、トランスフェクションブースターを含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む。実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、膜透過性ペプチドを含む。

実施形態では、前記キットはまた、溶解緩衝液を含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。実施形態では、前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、および／またはＮＤＳＢ－２０１である。実施形態では、前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、トリシンＨＣＬ、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、および／またはリン酸二水素ナトリウムを含む。実施形態では、前記溶解緩衝液は、少なくとも１つの洗浄剤を含む。実施形態では、前記洗浄剤は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、デオキシルビッグＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、オクチルチオグルコシド、および／またはデオキシコール酸ナトリウムである。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムの使用方法

本明細書に記載のＡＡＶ産生システムを使用して、ＡＡＶベクターを産生することができる。実施形態では、前記ＡＡＶベクターは高力価で産生される。

ある態様では、（ｉ）哺乳動物細胞を培養することと、（ｉｉ）トランスフェクション試薬を使用して前記哺乳動物細胞をＡＡＶ移入ベクターでトランスフェクトすることと、（ｉｉｉ）前記トランスフェクトされた細胞を、前記ＡＡＶベクターの発現に十分な時間、浮遊培養物内で培養することと、を含む、ＡＡＶベクター産生のための方法が提供される。実施形態では、哺乳動物細胞は浮遊培養物内で培養される。実施形態では、この方法は、前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物からＡＡＶを採取することを含む。実施形態では、前記トランスフェクトすることは、前記細胞をトランスフェクションブースターと接触させることを含む。実施形態では、前記細胞は、トランスフェクション後にエンハンサーと接触される。

実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、前記細胞に添加する前に、前記ＡＡＶ移入ベクターと組み合わされて、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体を形成する。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、前記細胞に添加する前に、前記ＡＡＶ移入ベクター、前記ｐＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドおよび前記ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドと組み合わされて、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体を形成する。

他の実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、前記ＡＡＶ移入ベクターと組み合わされて、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター混合物を形成し、次いで、前記トランスフェクション試薬は、前記細胞に添加する前に、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター混合物と組み合わされる。実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、前記ＡＡＶ移入ベクター、前記ｐＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドおよび前記ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドと組み合わされて、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター混合物を形成し、次いで、前記トランスフェクション試薬は、前記細胞に添加する前に、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター混合物と組み合わされる。一部の実施形態では、前記ＤＮＡおよびトランスフェクションブースターは、チューブ内で組み合わされ、前記トランスフェクション試薬は、第２のチューブ内の培地に希釈され、次いで、希釈されたトランスフェクション試薬は、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター混合物に添加されて、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター／トランスフェクション試薬複合体を形成する。他の実施形態では、前記ＤＮＡおよびトランスフェクションブースターは、チューブ内で組み合わされ、次いで、前記トランスフェクション試薬は、同じチューブに添加されて、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター／トランスフェクション試薬複合体を形成する。他の実施形態では、前記ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬は、チューブ内で組み合わされ、次いで、前記トランスフェクションブースターは、同じチューブに添加されて、ＤＮＡ／トランスフェクションブースター／トランスフェクション試薬複合体を形成する。

実施形態では、前記トランスフェクションブースターは、５：１から約１：５（体積／重量）のトランスフェクションブースター：ＤＮＡの間の比率で使用される。実施形態では、前記トランスフェクション試薬は、トランスフェクションブースター、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ｐＲＣ）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（ヘルパーウイルス成分をコードする）、および前記ＡＡＶ移入ベクターと組み合わされて、トランスフェクション複合体を形成する。

実施形態では、前記ＡＡＶは、溶解緩衝液を使用して採取される。実施形態では、前記細胞は、ＡＡＶを採取する前に遠心分離されない。実施形態では、前記溶解緩衝液は、トランスフェクトされた細胞培養物（例えば、細胞および培養培地）に直接添加される。

実施形態では、ＡＡＶを含む粗培養溶解物は、ヌクレアーゼ処理および精製プロセスなどの下流処理の前にろ過される。実施形態では、粗溶解物を珪藻土と混合し、次に混合物をフィルター、例えば２ミクロンフィルターに通して、採取されたＡＡＶを回収する。あるいは、セルロースろ過工程を粗溶解物とともに使用して、下流処理の準備ができているＡＡＶ調製物を産生することができる。粗ＡＡＶ溶解物を、例えば珪藻土、セルロースまたは同等物を用いてそのようなろ過工程にかけることにより、必要なフィルターの数が減少し、精製プロセス前のＡＡＶ溶解物のろ過および処理時間が減少する。

実施形態では、前記細胞はバイオリアクターで培養される。実施形態では、前記細胞はフラスコ内で培養される。

実施形態では、この方法は、前記採取されたＡＡＶを力価測定することを含む。ＡＡＶは、任意の方法を使用して力価測定することができる。実施形態では、ＡＡＶは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して力価測定される。実施形態では、ＡＡＶは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して力価測定される。実施形態では、ＡＡＶは、デジタル液滴ＰＣＲを使用して力価測定される。実施形態では、ＡＡＶは、ＥＬＩＳＡを使用して力価測定される。実施形態では、ＡＡＶは、ウイルス力価キット、例えば、ＱＵＩＣＫＴＩＴＥＲ（商標）ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｎｃ．）を使用して力価測定される。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８４１，３５７号も参照されたい。実施形態では、ＡＡＶは、例えば、細胞形質導入アッセイによって、細胞を形質導入することができるウイルス粒子の濃度（感染力価）を決定することによって力価測定される。実施形態では、ＡＡＶは、ＤＮＡドットブロッティングを使用して力価測定される。

実施形態では、採取されたＡＡＶは、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約３×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約４×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約５×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約６×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約７×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約８×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約９×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約１×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約３×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約４×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約５×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約６×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約７×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約８×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、少なくとも約９×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの力価を有する。

実施形態では、採取されたＡＡＶは、約１×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約３×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約４×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約５×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約６×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約７×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約８×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約９×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約１×１０¹¹ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約３×１０¹¹ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約４×１０¹¹ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約５×１０¹¹ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約９×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約８×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約７×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約６×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約５×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約４×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約３×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、前記採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。実施形態では、採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する。力価は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

前記細胞は、細胞の成長およびＡＡＶの産生を支持する任意の量の細胞培養培地で培養され得る。実施形態では、前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約３０ｍＬから約２００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約５０ｍＬから約２００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１００ｍＬから約２００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約５００ｍＬから約２００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１Ｌから約２００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１０Ｌから約２００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約１００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約５０Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約２０Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約２０Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約５Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約１Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１５ｍＬから約５００Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約５００ｍＬから約１０Ｌの容量で培養される。実施形態では、前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量で培養される。培養容量は、端点を含む、記載された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。

本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

例

当業者は、本明細書に記載の粒子を作製および使用することの説明は、例示のみを目的とするものであり、本開示は、この例示によって限定されないことを理解するであろう。
実施例１培養条件がウイルス力価に及ぼす影響

接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、３７℃、８％ＣＯ₂および湿度８０％のインキュベーターで培養した。細胞をＰＥＩ（ＨＥＫ２９３Ｔ）またはシステム１（ＨＥＫ２９３Ｆ）を使用して、６ウェルプレート内で約４×１０⁶細胞／ｍＬの濃度で、ＡＡＶ移入ベクター、ｐＡＡＶ－ＲＣ、およびｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒでトランスフェクトした。このときの条件は、Ｐｒｏｔ－１（エンハンサー１およびサプリメント１）、Ｐｒｏｔ－２（サプリメント１、エンハンサーなし）、Ｐｒｏｔ－３（エンハンサー１、サプリメントなし）のうちのいずれかである。システム１としては、ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する培地（ＬＶ－ＭＡＸ（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５８３４０１）、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）サプリメント、およびＬＶ－ＭＡＸ（商標）が含まれている。エンハンサー（ＧＩＢＣＯ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５３４８）が挙げられる。ＡＡＶは、２００μＬの５Ｘ ＡＡＶ溶解緩衝液を８００μＬのトランスフェクトされた細胞培養液に添加し、よく混合し、室温で３０分間インキュベートすることによって抽出した。インキュベート後、チューブを逆さにして細胞を完全に溶解し、次に卓上遠心分離機で最大速度で１０分間回転させた。粗ＡＡＶを含む上清を収集した。

ＡＡＶは、ＩＴＲ２に対するプライマーとプローブを使用したｑＰＣＲによって力価測定された。簡単に説明すると、抽出物をＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫで処理した。抽出物を水で１：５０に希釈し、ｑＰＣＲを実行して、標準曲線（消化ＡＡＶプラスミド）と比較した。

結果を図１に提供する。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の場合、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）サプリメントを含まないシステム１が最も高いＡＡＶ力価をもたらした。
実施例２ウイルス力価に対する培養培地の影響

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞が、浮遊培養物においてＨＥＫ２９３Ｆ細胞を支持する、４つの異なるタイプの市販の培地で確立された。細胞をそれらに適合された培地で凍結し、使用前に解凍した。解凍した細胞にＡＡＶ移入ベクター（ｐＡＡＶ－ＧＦＰ）をトランスフェクトした。ＡＡＶ移入ベクター、ｐＡＡＶ－ＲＣ２、およびｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ複合体溶液緩衝液中で、ＡＡＶトランスフェクション試薬と１：４ ｗ／ｗ比で、およびトランスフェクションブースターと２：１（ｖ／ｗ）比で複合体化し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体混合物を調製した細胞培養物に直接添加した。ＡＡＶ２の産生は、４つの細胞システム／培地タイプすべての細胞継代６で発生した。

図２は、培地４に適合されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞が、試験された他の培地よりも多くのＡＡＶ２を産生したことを示す。
実施例３培地４適合細胞の特徴

培地４で確立されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションに最適な条件を決定するために、異なるトランスフェクション試薬の効果を評価した。細胞をＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ－Ｄｊでトランスフェクトした。このとき、システム１（ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＬＶ－ＭＡＸトランスフェクション試薬、エンハンサー、およびサプリメントと共に使用（実施例１を参照））、システム２（異なるトランスフェクション試薬（トランスフェクション試薬２）を使用したＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＬＶ－ＭＡＸエンハンサーおよびサプリメントと共に使用）、システム３（培地４適合ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクション試薬２およびＬＶ－ＭＡＸエンハンサーと共に使用、サプリメントなし）を使用した。培地４適合ＨＥＫ２９３細胞のウイルス力価は、すべてのＡＡＶ血清型に対してシステム３を使用した場合に最も高かった（図３）。トランスフェクション試薬２は、ペプチド含有トランスフェクションブースター（本明細書に記載）を含むカチオン性脂質トランスフェクション試薬である。
実施例４クローン４５細胞

培地４適合ＨＥＫ２９３細胞（クローン４５）のクローン集団の成長特性を評価した。クローン４５細胞を、培地４で２５０ｍＬの振盪フラスコにおいて、０．３ｘ１０⁶生存細胞／ｍＬの細胞密度まで継代５で分割した。細胞密度と細胞生存率を９日間毎日収集した。成長曲線を図４Ａに示す（挿入図：細胞生存率）。培地４は、最高約１１ｘ１０⁶細胞／ｍＬの高細胞密度を支持し、高密度培養におけるクローン４５細胞は高い細胞生存率を示した。図４Ｂに示すように、クローン４５細胞は、高密度であっても、凝集をほとんど示さない。

クローン４５細胞および他の３つの培地４適合クローン株が培地４で異なるＡＡＶ血清型の許容可能な力価を産生する能力を評価した。クローン４５細胞をＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地（Ｅｘｐｉ４５、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４３５１０１）または培地４（Ｃｌ４５）で成長させ、ＧＦＰをコードする導入遺伝子に対応するＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ－ｄｊ、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ベクターでトランスフェクトした。同様に、培地４適合クローン株クローン１２（Ｃｌ１２）、クローン２２（Ｃｌ２２）、およびクローン５１（Ｃｌ５１）を培地４で成長させ、５つのＡＡＶ血清型のベクターでトランスフェクトした。上記のようにトランスフェクション試薬２を使用してトランスフェクションを行った。クローン４５細胞での産生を、親細胞株（親ＨＥＫ２９３、対照）、または他の３つの培地４適合クローン株と比較した。得られたＡＡＶ力価は、本明細書の他の場所に記載されているように、ＡＡＶ－ＧＦＰプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲを使用して決定された。培地４中で成長させたクローン４５細胞は、各血清型（図５Ａ～図５Ｅ）について、約１×１０¹¹ｖｇ／ｍＬから約２×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の高いウイルス力価をもたらした。

クローン４５細胞によるウイルス産生に対する異なるトランスフェクション試薬の効果も評価された。細胞にＬＶ－ＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬（ＴＲ１）またはトランスフェクション試薬２（ＴＲ２）をトランスフェクトした。トランスフェクション試薬２を介したプラスミドデリバリーは、これらの条件下で、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬よりも多くのＡＡＶウイルスを産生した（図６）。
実施例５エンハンサーの追加によるウイルス産生の向上

培地４のクローン４５細胞を、トランスフェクション試薬２を使用して、トランスフェクションの０、４．５、８、１５．５、２４、または２８時間後にエンハンサーを添加して、または添加なしで、ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした。エンハンサーの添加は、特にトランスフェクション後０から１５．５時間の間に、ＡＡＶ産生を増加させる（図７）。エンハンサーには、ＨＤＡＣ阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、カフェインが含まれている。
実施例６溶解緩衝液試薬のスクリーニング

ＪＭＰ（登録商標）実験計画法（ＤＯＥ）プラットフォームを使用して、溶解緩衝液の潜在的な洗浄剤として４つのコア化学物質（Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、およびＮＤＳＢ－２０１）を使用してスクリーニング実験を設計した。

ＤＯＥプラットフォームにより、研究者らは、各パラメータを個別に変更してから最適化された製剤全体に対して各最適化パラメータを検討する代わりに、複数のパラメータを同時に変更することができた。パラメータ間の２次効果が結果に影響を与える可能性があるとき、ＤＯＥプラットフォームは、すべての候補パラメータを同時に変更することで、より効率的で正確な結果を可能にする。ＤＯＥプラットフォームを使用した実験でも、従来の実験手法よりも少ない実行回数を必要とし、経済的である。ＤＯＥプラットフォームに関する理論的考察については、Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｆａｃｔｏｒｉａｌ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎｓ， ＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ １５：７３００－７３０６ （２０１５）および補足資料を参照されたい。

表１に示すように、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、およびＮＤＳＢ－２０１を異なる濃度で評価した。パーセンテージは、体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として提供される。

Ｊｍｐソフトウェアを使用して結果を分析し、細胞溶解プロセス中の洗浄剤の影響を判断した。この結果を、３つの異なるＡＡＶ血清型について図８に提供する。

溶解緩衝液は、トランスフェクトされた細胞培養からのＡＡＶ抽出物と細胞ペレットからのものもテストされた。クローン４５細胞は、トランスフェクション試薬２とエンハンサーを使用してＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた。ＡＡＶは、トランスフェクションの７０から７２時間後に、細胞ペレットに１倍の溶解緩衝液を加えるか、細胞培養物全体（トランスフェクトされた細胞および培地）に５倍の溶解緩衝液を加えることによって抽出された。得られたＡＡＶ力価を図９に提供する。
実施例７最初のＡＡＶ産生プロトコル

ＡＡＶ産生細胞の浮遊培養に関する以下のガイドラインに従う。細胞は、標準的なＡＡＶ浮遊細胞培養プロトコルに従って成長させる。細胞は、通常は３から４日ごとに約３×１０⁶から６．５×１０⁶生存細胞／ｍＬの密度に達したとき、細胞は継代培養されている。細胞は、培養の約３または４日後に、０．３×１０⁶から０．６×１０⁶細胞に分割される。細胞成長は、毎日ほぼ同じ時間に、毎日細胞を数えることによって監視される。細胞培養中、楕円軌道振盪器（楕円直径１９ｍｍ）を約１２５ ｒｐｍで、１２５ｍＬ～１Ｌの振盪フラスコに使用する。インキュベーターは、約３７°Ｃ、約８％ＣＯ₂、および約７５～８０％湿度に設定されている。

試薬と材料：
１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、１Ｌポリカーボネート、使い捨て、滅菌、ベントアップ、バッフルなし三角フラスコ
５０ｍＬ滅菌コニカルチューブ
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地
クローン４５細胞
ＡＡＶ２９３培養培地
ＡＡＶトランスフェクション試薬およびトランスフェクションブースター
ＡＡＶエンハンサー
５Ｘ ＡＡＶ溶解緩衝液

細胞が０．５５×１０⁶細胞／ｍＬの細胞数に金曜日の朝に分割されている場合、例えば、これら細胞は、約３００ｍＬの培養培地で１Ｌフラスコ中で３日間培養することができる。月曜日の朝に、例えば、細胞は、細胞を計数することによって調製され、およそ４．０×１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度が期待できる。新たに加温した培養培地で細胞を約３．０×１０⁶細胞／ｍＬに希釈し、さらに２４時間（おおよそ）にわたって培養し得る。

トランスフェクションは、例えば火曜日に実施することができる。細胞は、１２５ｍＬのフラスコ中の３０ｍＬの細胞培養培地において、約２．５×１０⁶細胞／ｍＬから約４×１０⁶細胞／ｍＬの間に、計数され、希釈され得る。表２に、さまざまな比率での各プラスミドの量を示す。表３に、追加のトランスフェクションガイドラインを示す。

ＤＮＡ／トランスフェクション試薬は次のように調製する。２本のチューブにはチューブ－１およびチューブ－２と標識される。チューブ－１において、４．５ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（商標）Ｉ培地と１３５μｇのＤＮＡ（表２に示す比率）を混合し、２７０μＬのトランスフェクションブースターを添加する。チューブ－２において、４．５ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（商標）Ｉ培地を５４０μＬのトランスフェクション試薬と混合し、室温で１分間インキュベートする。チューブ－１とチューブ－２は、チューブ－２溶液をチューブ－１へ混合しながら添加して、室温で１０分間インキュベートすることによって組み合わせる。約３．２ｍＬのＤＮＡ／ＡＡＶトランスフェクション試薬複合体を各フラスコの細胞に添加する。ＡＡＶエンハンサーをトランスフェクション時にフラスコ当たり１％ｖ／ｖで添加する。

ＡＡＶは、トランスフェクションの７０～７２時間後、例えば金曜日の朝に採取される。あるいは、トランスフェクトされた細胞培養物を－８０°Ｃで保存することもできる（８００μＬのサンプルは力価測定のために－８０°Ｃで別々に保存する必要がある）。５ｘ ＡＡＶ溶解緩衝液を１：５希釈で添加し（８００μＬのトランスフェクトされた細胞培養物サンプル当たり２００μＬの溶解緩衝液）、ピペットで上下に動かし、ボルテックスして混合する。サンプルを約３０分間インキュベートした後、手で２５～３０回反転させる。培養液が透明になり、細胞片の塊が観察されると、細胞は完全に溶解している。

溶解した細胞を４°Ｃで１０分間回転させる（ベンチトップ遠心分離機での最大速度）。粗ＡＡＶを含む上清を新しいチューブに移し、４°Ｃで保存する。サンプルは、例えばｑＰＣＲによって力価測定される。
実施例８実施例７の産生からのＡＡＶ力価の測定

実施例７からの上清を十分に混合し、１００μＬの粗ＡＡＶサンプルを、蓋付きの９６ウェル丸底プレートの２つのウェルのそれぞれに等分する。サンプルは、２μＬの粗ＡＡＶサンプルを２μＬの１０倍Ｄｎａｓｅ Ｉ緩衝液、および１３７ユニットのＤＮａｓｅ Ｉに、総量２０μＬで添加し、３７°Ｃで６０分間、９５°Ｃで２０分間、さらに４°Ｃインキュベートすることにより、ＤＮａｓｅ Ｉで消化される。

ＤＮａｓｅ処理したサンプルは、１９μＬの２倍ＰＫ緩衝液と２０μｇのプロテイナーゼＫを各サンプルに添加し、６０°Ｃで６０分間、９５°Ｃで１０分間、さらに４°Ｃでインキュベートすることにより、プロテイナーゼＫで消化される。

プロテイナーゼＫ消化後、サンプルを水で１：５０に希釈する。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＡＡＶ－ＧＦＰ遺伝子に特異的なプライマーと標識プローブを使用して実行される。

標準曲線は、線形化されたＡＡＶトランスファープラスミドを使用して産生される。ｐＡＡＶ－ＧＦＰの場合、プラスミドはＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩで消化することにより線形化され、次にＤＮＡ濃度が決定される。線形化は、切断した、および切断していないプラスミドを０．８％アガロースゲルに載せ、電気泳動後に得られたバンドを視覚化することによって決定し得る。切断していないプラスミドは塗抹標本として表示され、切断したプラスミドは約５ｋｂの１つの大きなバンドである必要がある。

ＱＰＣＲは、製造元の指示に従って、２Ｘ ＥＸＰＲＥＳＳ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して、事前混合されたＲＯＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３８４ウェルｑＰＣＲサンプルプレートで実行される。簡単に説明すると、３μＬの希釈サンプル（または標準曲線）を７．５μＬの２倍Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、０．１１μＬのＡＡＶ－ＧＦＰプローブ（ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）、１．１３μＬのＧＦＰ特異的プライマー（１０μＭでフォワードおよびリバースプライマーを混合）、および３．２６μＬの水と組み合わせる。サンプルは、５０°Ｃで２分間（ＵＤＧインキュベート）、９５°Ｃで２分間、９５°Ｃで１５秒間、６０°Ｃで１分間の４０サイクルのサイクリングプログラムを使用してｑＰＣＲマシンで実行される。
実施例９ＡＡＶ－ＧＦＰウイルス感染性試験プロトコル

ＡＡＶは、標的細胞（例えば、Ｈｔ１０８０またはＨＥＫ２９３など）に感染する能力についてテストされ得る。感染の約４時間前に、細胞を１００μＬの培養培地に７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種する。

各ウェルに１μＬの粗ＡＡＶ調製物を添加することにより、細胞を感染させる。細胞を約３日間インキュベートする。発現可能な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むＡＡＶについて、フローサイトメトリーを実行して、ＧＦＰを発現している細胞の割合を測定する。
実施例１０ＡＡＶ産生システムの比較

クローン４５、およびクローン４５に由来する２つのサブクローン株からのＡＡＶベクター産生を、ＨＥＫ２９３Ｆ誘導体ＬＶ２９３（ＬＶ－ＭＡＸウイルス産生細胞（ＶＰＣ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からの産生と比較した。上記の培養プロトコルに従って細胞を成長させ、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ、およびＡＡＶ８用のｐＡＡＶ－ＲＣでトランスフェクトした。上記のように、トランスフェクションブースターと共にトランスフェクション試薬２を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションの約７２時間後、ＡＡＶ力価（ＧＦＰのｑＰＣＲ（実施例８）を介して）および培養物の細胞生存率を決定した。クローン４５およびサブクローン株Ｃ１３およびＣ２０は、ＬＶ２９３（ＶＰＣ、図１０Ａ）と同一のシステムと比較して、（約１．５×１０¹¹から約２．５×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間の）有意に高いＡＡＶ８力価をもたらした。さらに、クローン４５、Ｃ１３、およびＣ２０を用いたＡＡＶ産生培養物は、ＬＶ２９３を用いた培養物（ＶＰＣ、図１０Ｂ）よりも著しく高い細胞生存率を有した。

クローン４５細胞におけるさまざまなＡＡＶ血清型にわたるベクター産生を、ＬＶ２９３（ＶＰＣ）細胞におけるものと比較した。細胞を上述したようにＡＡＶのための浮遊細胞培養プロトコルに従って成長させ、これらの細胞を１２５ｍＬのフラスコにおいて３０ミリリットルの細胞培養培地－４（３×１０⁶細胞／ｍＬのクローン４５および２．５×１０⁶細胞／ｍＬのＬＶ２９３）で希釈した。細胞は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９について、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ、およびｐＡＡＶ－ＲＣでトランスフェクトされた。上記のように、トランスフェクションブースターと共にトランスフェクション試薬２を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションの約７２時間後に培養物からＡＡＶを回収した。ＡＡＶ力価は、ＧＦＰ法のためのｑＰＣＲおよび感染性試験プロトコル（実施例９）を介して決定された。例示的な結果が図１１に示されている。ＬＶ２９３（ＶＰＣ、図１１Ａ）と同一のシステムと比較して、産生細胞としてクローン４５を有するＡＡＶ産生システムは、複数の血清型にわたって（約１．３×１０¹¹から約２．１５×１０¹¹ｖｇ／ｍＬの間で）有意に高いウイルス力価をもたらした。図１１Ｂに示されるように、クローン４５を有するＡＡＶ産生システムはまた、ＬＶ２９３ ＶＰＣ細胞よりも高い感染力を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ６をもたらした。

本明細書で提供されるＡＡＶベクター産生システムを用いたＡＡＶベクター産生を、２つのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースの産生システムと比較した。ＰＥＩベースのトランスフェクションシステムは、メーカーの指示と既知の方法に従って実行された。１つの分析では、細胞をｐＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ、およびＡＡＶ６のためのｐＡＡＶ－ＲＣでトランスフェクトした。（１）エンハンサーなしでＰＥＩｐｒｏ（商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクション）を使用してＬＶ２９３細胞をトランスフェクトし、（２）クローン４５細胞を、上記のトランスフェクションブースターおよびＡＡＶ産生エンハンサーと共に、トランスフェクション試薬２でトランスフェクトした。培養期間後、ＡＡＶを採取し、ＧＦＰ法のｑＰＣＲおよび感染性試験プロトコルを介して力価を決定した。例示的な結果が図１２に示されている。本明細書で提供されるＡＡＶ産生システムは、ＰＥＩｐｒｏシステムを有するＬＶ２９３よりも有意に高いＡＡＶ６力価（図１２Ａ）および感染力（図１２Ｂ）をもたらした。

別の分析では、さまざまなＡＡＶ血清型にわたるベクター産生を比較した。ここで、（１）ＰＥＩ－ＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用したＨＥＫ２９３Ｔ接着細胞、および上記のようにトランスフェクション試薬２とトランスフェクションブースターを使用したクローン４５細胞を使用した。細胞は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｄｊについて、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ、およびｐＡＡＶ－ＲＣでトランスフェクトされた。培養期間後、ＡＡＶを採取し、ＧＦＰ法のｑＰＣＲおよび感染性試験プロトコルを介して力価を決定した。例示的な結果が図１３Ａおよび１３Ｂに示されている。本明細書で提供されるＡＡＶ産生システムは、ＰＥＩ－ＭＡＸシステムを有するＨＥＫ２９３Ｔよりも、試験された５つの血清型のうちの４つにわたって有意に高いＡＡＶ力価をもたらした（図１３Ａ）。図１３Ｂに示すように、本明細書で提供されるＡＡＶ産生システムはまた、ＰＥＩ－ＭＡＸシステムを用いた場合よりも高い感染力を有するＡＡＶ２およびＡＡＶ６をもたらした。
実施例１１採取後の処理

トランスフェクション、ウイルス産生、細胞溶解に続いて、下流での処理の前に、粗ＡＡＶ溶解物を珪藻土を使用してろ過した。同じＡＡＶ培養物からの２つのサンプルを、凍結融解法（溶解緩衝液なし）または１０Ｘ ＡＡＶ溶解緩衝液の添加と３０分間のインキュベート（上記のとおり）のいずれかで溶解し、粗ＡＡＶ溶解物を形成した。溶解の直後に、珪藻土（ＤＥ）を粗ＡＡＶ溶解物と混合し、混合物を２ミクロンフィルターに通した。０．５ｇのＤＥ対３０ｍＬの溶解物および１ｇのＤＥ対１００ｍＬ溶解物を含む、溶解物１ｍＬ当たりのさまざまな量のＤＥをテストした。ろ過ステップ後のＡＡＶの回収率を測定するために、ＤＥろ過の前後に各溶解物からサンプルを採取した。サンプルからのＡＡＶ力価はＧＦＰ ｑＰＣＲを使用して決定され、例示的な結果が図１４に示されている。ＡＡＶ溶解緩衝液法で粗溶解物を形成すると、ＤＥろ過中のＡＡＶ力価の高い回収率が得られたが、凍結融解細胞溶解法では、回収率が大幅に低くなった。図１４に示すように、例えば、凍結融解による約１０％の回収と比較して、溶解緩衝液では約１００％の力価の回収が得られた。単一のＤＥろ過ステップにより、必要なフィルターの数が減り、ヌクレアーゼ処理や精製プロセスなどの下流処理前のＡＡＶ溶解物のろ過および処理時間が大幅に短縮された。

Claims (73)

1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター産生のための方法であって、
   （ａ）浮遊培養物で哺乳動物細胞を培養することと、
   （ｂ）トランスフェクション試薬を使用して、ＡＡＶ移入ベクターで前記哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、
   （ｃ）トランスフェクトされた細胞をエンハンサーと接触させることと、
   （ｄ）前記トランスフェクトされた細胞を、前記ＡＡＶベクターの発現に十分な時間、浮遊培養物内で培養し、それにより、トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を産生することと、
   （ｅ）前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物からＡＡＶを採取することと、
   を含む方法。
2. 前記ＡＡＶの採取は、前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を溶解緩衝液と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、およびカフェインのうちの１つまたは複数を含む、請求項０から３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、請求項６に記載の方法。
9. トランスフェクション後約０時間から約１２時間の間に前記エンハンサーを添加する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. ステップ０は、前記細胞をトランスフェクションブースターと接触させることをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記トランスフェクションブースターは、５：１から約１：５（体積／重量）のトランスフェクションブースター：ＤＮＡの比率で使用される、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の誘導体である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ＨＥＫ２９３細胞は、前記ＡＡＶベクター産生システムにおける高ＡＡＶ発現に適合されている、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり少なくとも５×１０⁶細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり最大１．１×１０⁷細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる、請求項１５または１６に記載の方法。
19. 前記細胞は、約１．５×１０⁶および約５×１０⁶細胞／ｍＬの間の細胞密度でトランスフェクトされる、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ヘルパーウイルスが使用されない、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＡＡＶを採取する前に前記細胞を遠心分離しない、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記細胞はラージＴ抗原を含まない、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記採取されたＡＡＶを力価測定することをさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＡＡＶは定量的ＰＣＲを使用して力価測定される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記採取されたＡＡＶは、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有する、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 前記採取されたＡＡＶは、約２×１０¹⁰ｖｇ／ｍＬから約１×１０¹²ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する、請求項２５に記載の方法。
27. ステップ０は、パッケージングプラスミドで前記細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記パッケージングプラスミドは、ｐＲＣおよびｐＨｅｌｐｅｒを含む、請求項２７記載の方法。
29. 前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量で培養される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量で培養される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量でトランスフェクトされる、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量でトランスフェクトされる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記細胞は、バイオリアクターで培養される、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する培地中で培養される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. ステップ０および／または０中に、前記細胞を培養サプリメントと接触させる、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
    （ａ）少なくとも約２×１０⁶細胞／ｍＬの密度のＨＥＫ２９３細胞と、
    （ｂ）ＡＡＶ移入ベクターと、
    （ｃ）パッケージングプラスミドと、
    （ｄ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
    （ｅ）前記ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
    を備えるＡＡＶ産生システム。
37. 前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０⁶細胞／ｍＬから約２×１０⁷細胞／ｍＬの間の密度である、請求項３６に記載のＡＡＶ産生システム。
38. トランスフェクション試薬をさらに含む、請求項３６または３７に記載のＡＡＶ産生システム。
39. 前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、請求項３８に記載のＡＡＶ産生システム。
40. 前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、請求項３８または３９に記載のＡＡＶ産生システム。
41. トランスフェクションブースターをさらに含む、請求項３６から４０のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
42. 前記トランスフェクションブースターはカチオン性脂質を含む、請求項４１に記載のＡＡＶ産生システム。
43. 前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、請求項４１または４２に記載のＡＡＶ産生システム。
44. 溶解緩衝液をさらに含む、請求項３６から４３のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
45. 前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項４４４３に記載のＡＡＶ産生システム。
46. 前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項４４または４５に記載のＡＡＶ産生システム。
47. 前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、請求項４４から４６のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
48. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、請求項３６から４７のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
49. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、請求項４８に記載のＡＡＶ産生システム。
50. 前記ＡＡＶベクターは、採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価である、請求項３６から４９のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
51. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
    （ａ）ＨＥＫ２９３細胞と、
    （ｂ）採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価のＡＡＶベクターと、
    （ｃ）パッケージングプラスミドと、
    （ｄ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
    （ｅ）前記ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
    を備えるＡＡＶ産生システム。
52. 前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０⁶細胞／ｍＬから約２×１０⁷細胞／ｍＬの間の密度である、請求項５１に記載のＡＡＶ産生システム。
53. トランスフェクション試薬をさらに含む、請求項５１または５２に記載のＡＡＶ産生システム。
54. 前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、請求項５３に記載のＡＡＶ産生システム。
55. 前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、請求項５４に記載のＡＡＶ産生システム。
56. トランスフェクションブースターをさらに備える、請求項５１から５５のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
57. 前記トランスフェクションブースターはカチオン性脂質を含む、請求項５６に記載のＡＡＶ産生システム。
58. 前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、請求項５６または５７に記載のＡＡＶ産生システム。
59. 溶解緩衝液をさらに備える、請求項５１から５８のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
60. 前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項５９に記載のＡＡＶ産生システム。
61. 前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項５９または６０に記載のＡＡＶ産生システム。
62. 前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、請求項５９から６１のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
63. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、請求項５１から６２のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
64. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、請求項６３に記載のＡＡＶ産生システム。
65. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生用のキットであって、
    （ａ）ＨＥＫ２９３細胞と、
    （ｂ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウムおよびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
    （ｃ）カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬と、
    （ｄ）ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
    を備えるキット。
66. トランスフェクションブースターをさらに備える、請求項６５に記載のキット。
67. 前記トランスフェクションブースターは、カチオン性脂質および／またはペプチドを含む、請求項６６に記載のキット。
68. 溶解緩衝液をさらに備える、請求項６５から６７のいずれか一項に記載のキット。
69. 前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項６８に記載のＡＡＶ産生システム。
70. 前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項６８または６９に記載のＡＡＶ産生システム。
71. 前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、請求項６８から７０のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
72. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、請求項６５から７１のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
73. 前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、請求項７２に記載のＡＡＶ産生システム。

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