JPWO2020172624A5 - - Google Patents
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トランスフェクション、ウイルス産生、細胞溶解に続いて、下流での処理の前に、粗ＡＡＶ溶解物を珪藻土を使用してろ過した。同じＡＡＶ培養物からの２つのサンプルを、凍結融解法（溶解緩衝液なし）または１０Ｘ ＡＡＶ溶解緩衝液の添加と３０分間のインキュベート（上記のとおり）のいずれかで溶解し、粗ＡＡＶ溶解物を形成した。溶解の直後に、珪藻土（ＤＥ）を粗ＡＡＶ溶解物と混合し、混合物を２ミクロンフィルターに通した。０．５ｇのＤＥ対３０ｍＬの溶解物および１ｇのＤＥ対１００ｍＬ溶解物を含む、溶解物１ｍＬ当たりのさまざまな量のＤＥをテストした。ろ過ステップ後のＡＡＶの回収率を測定するために、ＤＥろ過の前後に各溶解物からサンプルを採取した。サンプルからのＡＡＶ力価はＧＦＰ ｑＰＣＲを使用して決定され、例示的な結果が図１４に示されている。ＡＡＶ溶解緩衝液法で粗溶解物を形成すると、ＤＥろ過中のＡＡＶ力価の高い回収率が得られたが、凍結融解細胞溶解法では、回収率が大幅に低くなった。図１４に示すように、例えば、凍結融解による約１０％の回収と比較して、溶解緩衝液では約１００％の力価の回収が得られた。単一のＤＥろ過ステップにより、必要なフィルターの数が減り、ヌクレアーゼ処理や精製プロセスなどの下流処理前のＡＡＶ溶解物のろ過および処理時間が大幅に短縮された。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター産生のための方法であって、
（ａ）浮遊培養物で哺乳動物細胞を培養することと、
（ｂ）トランスフェクション試薬を使用して、ＡＡＶ移入ベクターで前記哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、
（ｃ）トランスフェクトされた細胞をエンハンサーと接触させることと、
（ｄ）前記トランスフェクトされた細胞を、前記ＡＡＶベクターの発現に十分な時間、浮遊培養物内で培養し、それにより、トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を産生することと、
（ｅ）前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物からＡＡＶを採取することと、
を含む方法。
〔２〕前記ＡＡＶの採取は、前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を溶解緩衝液と接触させることを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔２〕から〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕前記エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、およびカフェインのうちの１つまたは複数を含む、前記〔０〕から〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔６〕に記載の方法。
〔９〕トランスフェクション後約０時間から約１２時間の間に前記エンハンサーを添加する、前記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、前記〔１〕から〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕ステップ０は、前記細胞をトランスフェクションブースターと接触させることをさらに含む、前記〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕前記トランスフェクションブースターは、５：１から約１：５（体積／重量）のトランスフェクションブースター：ＤＮＡの比率で使用される、前記〔１２〕または〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の誘導体である、前記〔１〕から〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、前記ＡＡＶベクター産生システムにおける高ＡＡＶ発現に適合されている、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり少なくとも５×１０ 6 細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる、前記〔１５〕または〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり最大１．１×１０ 7 細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる、前記〔１５〕または〔１６〕に記載の方法。
〔１９〕前記細胞は、約１．５×１０ 6 および約５×１０ 6 細胞／ｍＬの間の細胞密度でトランスフェクトされる、前記〔１〕から〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２０〕ヘルパーウイルスが使用されない、前記〔１〕から〔１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２１〕ＡＡＶを採取する前に前記細胞を遠心分離しない、前記〔１〕から〔２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２２〕前記細胞はラージＴ抗原を含まない、前記〔１〕から〔２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２３〕前記採取されたＡＡＶを力価測定することをさらに含む、前記〔１〕から〔２２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２４〕前記ＡＡＶは定量的ＰＣＲを使用して力価測定される、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕前記採取されたＡＡＶは、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０ 10 のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有する、前記〔２３〕または〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕前記採取されたＡＡＶは、約２×１０ 10 ｖｇ／ｍＬから約１×１０ 12 ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕ステップ０は、パッケージングプラスミドで前記細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、前記〔１〕から〔２６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２８〕前記パッケージングプラスミドは、ｐＲＣおよびｐＨｅｌｐｅｒを含む、前記〔２７〕記載の方法。
〔２９〕前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量で培養される、前記〔１〕から〔２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３０〕前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量で培養される、前記〔１〕から〔２９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３１〕前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量でトランスフェクトされる、前記〔１〕から〔３０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３２〕前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量でトランスフェクトされる、前記〔１〕から〔３１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３３〕前記細胞は、バイオリアクターで培養される、前記〔１〕から〔３２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３４〕前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する培地中で培養される、前記〔１〕から〔３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３５〕ステップ０および／または０中に、前記細胞を培養サプリメントと接触させる、前記〔１〕から〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３６〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
（ａ）少なくとも約２×１０ 6 細胞／ｍＬの密度のＨＥＫ２９３細胞と、
（ｂ）ＡＡＶ移入ベクターと、
（ｃ）パッケージングプラスミドと、
（ｄ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
（ｅ）前記ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるＡＡＶ産生システム。
〔３７〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０ 6 細胞／ｍＬから約２×１０ 7 細胞／ｍＬの間の密度である、前記〔３６〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔３８〕トランスフェクション試薬をさらに含む、前記〔３６〕または〔３７〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔３９〕前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、前記〔３８〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４０〕前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、前記〔３８〕または〔３９〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４１〕トランスフェクションブースターをさらに含む、前記〔３６〕から〔４０〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４２〕前記トランスフェクションブースターはカチオン性脂質を含む、前記〔４１〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４３〕前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、前記〔４１〕または〔４２〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４４〕溶解緩衝液をさらに含む、前記〔３６〕から〔４３〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４５〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔４４４〕３に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４６〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔４４〕または〔４５〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４７〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔４４〕から〔４６〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４８〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔３６〕から〔４７〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４９〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔４８〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５０〕前記ＡＡＶベクターは、採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０ 10 のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価である、前記〔３６〕から〔４９〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５１〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞と、
（ｂ）採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０ 10 のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価のＡＡＶベクターと、
（ｃ）パッケージングプラスミドと、
（ｄ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
（ｅ）前記ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるＡＡＶ産生システム。
〔５２〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０ 6 細胞／ｍＬから約２×１０ 7 細胞／ｍＬの間の密度である、前記〔５１〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５３〕トランスフェクション試薬をさらに含む、前記〔５１〕または〔５２〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５４〕前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、前記〔５３〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５５〕前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、前記〔５４〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５６〕トランスフェクションブースターをさらに備える、前記〔５１〕から〔５５〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５７〕前記トランスフェクションブースターはカチオン性脂質を含む、前記〔５６〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５８〕前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、前記〔５６〕または〔５７〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５９〕溶解緩衝液をさらに備える、前記〔５１〕から〔５８〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６０〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔５９〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６１〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔５９〕または〔６０〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６２〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔５９〕から〔６１〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６３〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔５１〕から〔６２〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６４〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔６３〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６５〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生用のキットであって、
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞と、
（ｂ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウムおよびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
（ｃ）カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬と、
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるキット。
〔６６〕トランスフェクションブースターをさらに備える、前記〔６５〕に記載のキット。
〔６７〕前記トランスフェクションブースターは、カチオン性脂質および／またはペプチドを含む、前記〔６６〕に記載のキット。
〔６８〕溶解緩衝液をさらに備える、前記〔６５〕から〔６７〕のいずれか一項に記載のキット。
〔６９〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔６８〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７０〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔６８〕または〔６９〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７１〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔６８〕から〔７０〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７２〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔６５〕から〔７１〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７３〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔７２〕に記載のＡＡＶ産生システム。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター産生のための方法であって、
（ａ）浮遊培養物で哺乳動物細胞を培養することと、
（ｂ）トランスフェクション試薬を使用して、ＡＡＶ移入ベクターで前記哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、
（ｃ）トランスフェクトされた細胞をエンハンサーと接触させることと、
（ｄ）前記トランスフェクトされた細胞を、前記ＡＡＶベクターの発現に十分な時間、浮遊培養物内で培養し、それにより、トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を産生することと、
（ｅ）前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物からＡＡＶを採取することと、
を含む方法。
〔２〕前記ＡＡＶの採取は、前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を溶解緩衝液と接触させることを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔２〕または〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔２〕から〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕前記エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、およびカフェインのうちの１つまたは複数を含む、前記〔０〕から〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔６〕に記載の方法。
〔９〕トランスフェクション後約０時間から約１２時間の間に前記エンハンサーを添加する、前記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、前記〔１〕から〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕ステップ０は、前記細胞をトランスフェクションブースターと接触させることをさらに含む、前記〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕前記トランスフェクションブースターは、５：１から約１：５（体積／重量）のトランスフェクションブースター：ＤＮＡの比率で使用される、前記〔１２〕または〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の誘導体である、前記〔１〕から〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、前記ＡＡＶベクター産生システムにおける高ＡＡＶ発現に適合されている、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり少なくとも５×１０ 6 細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる、前記〔１５〕または〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、浮遊培養物において、１ミリリットル当たり最大１．１×１０ 7 細胞（細胞／ｍＬ）の密度で成長することができる、前記〔１５〕または〔１６〕に記載の方法。
〔１９〕前記細胞は、約１．５×１０ 6 および約５×１０ 6 細胞／ｍＬの間の細胞密度でトランスフェクトされる、前記〔１〕から〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２０〕ヘルパーウイルスが使用されない、前記〔１〕から〔１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２１〕ＡＡＶを採取する前に前記細胞を遠心分離しない、前記〔１〕から〔２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２２〕前記細胞はラージＴ抗原を含まない、前記〔１〕から〔２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２３〕前記採取されたＡＡＶを力価測定することをさらに含む、前記〔１〕から〔２２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２４〕前記ＡＡＶは定量的ＰＣＲを使用して力価測定される、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕前記採取されたＡＡＶは、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０ 10 のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有する、前記〔２３〕または〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕前記採取されたＡＡＶは、約２×１０ 10 ｖｇ／ｍＬから約１×１０ 12 ｖｇ／ｍＬの間の力価を有する、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕ステップ０は、パッケージングプラスミドで前記細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、前記〔１〕から〔２６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２８〕前記パッケージングプラスミドは、ｐＲＣおよびｐＨｅｌｐｅｒを含む、前記〔２７〕記載の方法。
〔２９〕前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量で培養される、前記〔１〕から〔２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３０〕前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量で培養される、前記〔１〕から〔２９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３１〕前記細胞は、約１５ミリリットル（ｍＬ）から約２００リットル（Ｌ）の容量でトランスフェクトされる、前記〔１〕から〔３０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３２〕前記細胞は、約１Ｌから約１０Ｌの容量でトランスフェクトされる、前記〔１〕から〔３１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３３〕前記細胞は、バイオリアクターで培養される、前記〔１〕から〔３２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３４〕前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する培地中で培養される、前記〔１〕から〔３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３５〕ステップ０および／または０中に、前記細胞を培養サプリメントと接触させる、前記〔１〕から〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３６〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
（ａ）少なくとも約２×１０ 6 細胞／ｍＬの密度のＨＥＫ２９３細胞と、
（ｂ）ＡＡＶ移入ベクターと、
（ｃ）パッケージングプラスミドと、
（ｄ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
（ｅ）前記ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるＡＡＶ産生システム。
〔３７〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０ 6 細胞／ｍＬから約２×１０ 7 細胞／ｍＬの間の密度である、前記〔３６〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔３８〕トランスフェクション試薬をさらに含む、前記〔３６〕または〔３７〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔３９〕前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、前記〔３８〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４０〕前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、前記〔３８〕または〔３９〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４１〕トランスフェクションブースターをさらに含む、前記〔３６〕から〔４０〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４２〕前記トランスフェクションブースターはカチオン性脂質を含む、前記〔４１〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４３〕前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、前記〔４１〕または〔４２〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４４〕溶解緩衝液をさらに含む、前記〔３６〕から〔４３〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４５〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔４４４〕３に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４６〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔４４〕または〔４５〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４７〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔４４〕から〔４６〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４８〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔３６〕から〔４７〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔４９〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔４８〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５０〕前記ＡＡＶベクターは、採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０ 10 のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価である、前記〔３６〕から〔４９〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５１〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞と、
（ｂ）採取後、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０ 10 のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価のＡＡＶベクターと、
（ｃ）パッケージングプラスミドと、
（ｄ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
（ｅ）前記ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるＡＡＶ産生システム。
〔５２〕前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０ 6 細胞／ｍＬから約２×１０ 7 細胞／ｍＬの間の密度である、前記〔５１〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５３〕トランスフェクション試薬をさらに含む、前記〔５１〕または〔５２〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５４〕前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質を含む、前記〔５３〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５５〕前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、前記〔５４〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５６〕トランスフェクションブースターをさらに備える、前記〔５１〕から〔５５〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５７〕前記トランスフェクションブースターはカチオン性脂質を含む、前記〔５６〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５８〕前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、前記〔５６〕または〔５７〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔５９〕溶解緩衝液をさらに備える、前記〔５１〕から〔５８〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６０〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔５９〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６１〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔５９〕または〔６０〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６２〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔５９〕から〔６１〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６３〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔５１〕から〔６２〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６４〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔６３〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔６５〕アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生用のキットであって、
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞と、
（ｂ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、プロピオン酸ナトリウムおよびカフェインの１つまたは複数を含むエンハンサーと、
（ｃ）カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬と、
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるキット。
〔６６〕トランスフェクションブースターをさらに備える、前記〔６５〕に記載のキット。
〔６７〕前記トランスフェクションブースターは、カチオン性脂質および／またはペプチドを含む、前記〔６６〕に記載のキット。
〔６８〕溶解緩衝液をさらに備える、前記〔６５〕から〔６７〕のいずれか一項に記載のキット。
〔６９〕前記溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－ａｌｔｅｒ、ＮＰ－４０、ポロキサマー１８８、およびＮＤＳＢ－２０１から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、前記〔６８〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７０〕前記溶解緩衝液は、トリス－ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ三カリウム、水酸化ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、前記〔６８〕または〔６９〕に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７１〕前記溶解緩衝液は、ＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ビッグＣＨＡＰ、オクチルチオグルコシド、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの洗浄剤を含む、前記〔６８〕から〔７０〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７２〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、前記〔６５〕から〔７１〕のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
〔７３〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸である、前記〔７２〕に記載のＡＡＶ産生システム。
Claims (34)
- アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター産生のための方法であって、
（ａ）浮遊培養で哺乳動物細胞を培養するステップ、
（ｂ）前記哺乳動物細胞を、（ｉ）トランスフェクション試薬と複合体化されたＡＡＶ移入ベクターおよび（ｉｉ）１つまたは複数のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むエンハンサーと接触させるステップ、
（ｃ）前記トランスフェクトされた細胞を、前記ＡＡＶベクターの発現に十分な時間、浮遊培養で培養し、それにより、トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を産生するステップ、および
（ｄ）前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物からＡＡＶを採取するステップ、
を含む方法。 - 前記ＡＡＶを採取するステップは、前記トランスフェクトされたＡＡＶ細胞培養物を溶解緩衝液と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記エンハンサーは、プロピオン酸ナトリウム、カフェイン、酪酸ナトリウム、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質またはポリマー系トランスフェクション試薬を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（ｂ）は、前記細胞をトランスフェクションブースターと接触させることをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の誘導体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞のクローン誘導体である、請求項８に記載の方法。
- ヘルパーウイルス成分が前記細胞中に存在する、請求項１に記載の方法。
- ＡＡＶを採取する前に前記細胞を遠心分離しない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞はラージＴ抗原を含まない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記採取されたＡＡＶを力価測定するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記採取されたＡＡＶは、１ミリリットル当たり少なくとも約２×１０10のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有する、請求項１３に記載の方法。
- ステップ（ｂ）は、１つまたは複数のパッケージングプラスミドで前記細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記１つまたは複数のパッケージングプラスミドは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ＤＪまたはＤＪ／８の遺伝子をコードする、請求項１５記載の方法。
- 前記細胞は、バイオリアクターで培養される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
- 無血清である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
- アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生システムであって、
（ａ）浮遊培養に適合した哺乳動物細胞と、
（ｂ）ＡＡＶ移入ベクターと、
（ｃ）１つまたは複数のパッケージングプラスミドと、
（ｄ）１つまたは複数のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むエンハンサーと、
（ｅ）前記哺乳動物細胞の成長および増殖を支持する細胞培養培地と、
を備えるＡＡＶ産生システム。 - トランスフェクション試薬をさらに含む、請求項１９に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記トランスフェクション試薬はカチオン性脂質またはポリマー系トランスフェクション試薬を含む、請求項２０に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記トランスフェクション試薬はペプチドをさらに含む、請求項２０または２１に記載のＡＡＶ産生システム。
- トランスフェクションブースターをさらに含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記トランスフェクションブースターはペプチドを含む、請求項２３に記載のＡＡＶ産生システム。
- 溶解緩衝液をさらに含む、請求項１９から２４のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記エンハンサーは、プロピオン酸ナトリウム、カフェイン、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ－９９４、ＣＲＡ－０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、および／またはバルプロ酸を含む、請求項１９から２５のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞の誘導体である、請求項１９から２６のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞のクローン誘導体である、請求項２７に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記ＨＥＫ２９３細胞は、約２×１０6細胞／ｍＬから約２×１０7細胞／ｍＬの間の密度で、浮遊培養物内で培養される、請求項２７または２８に記載のＡＡＶ産生システム。
- 前記１つまたは複数のパッケージングプラスミドは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ＤＪまたはＤＪ／８の遺伝子をコードする、請求項１９から２９のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- ヘルパーウイルス成分が前記細胞中に存在する、請求項１９から３０のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- 無血清である、請求項１９から３１のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- バイオリアクターに含まれている、請求項１９から３２のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
- １ミリリットル当たり少なくとも約２×１０10のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）の力価を有するＡＡＶウイルス粒子を産生する、請求項１９から３３のいずれか一項に記載のＡＡＶ産生システム。
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