KR20230084578A - 막 파열 조성물 및 이의 제조 방법과 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 막 파열 용액을 제공하며, 하나 이상의 정제된 비이온성 세제, 및 선택적으로 스캐빈저(scavenger)를 포함하고, 상기 세제 중 적어도 하나는 전단 응력에 대한 바이러스 벡터/단백질 안정화에 적합한 표면 활성 특징을 갖는다.

Description

막 파열 조성물 및 이의 제조 방법과 사용 방법

본 발명은 세포 막 파열 조성물(예를 들어 용액) 및 이의 제조 방법과 사용 방법에 관한 것이다. 막 파열 용액은 첨가제와 더불어 하나 이상의 비이온성 세제를 포함하며, 상기 세제 중 적어도 하나는 전단 응력에 대한 세포, 바이러스 벡터, 및 단백질 안정화에 중요한 표면 활성 특징을 갖는다.

일반적으로 대부분의 세포에는 외막이 있다. 이 막의 기능은 세포로의 침투를 보호, 조직 및 조절하는 것이다. 몇 가지 예외를 제외하고 세포막은 글리세로인지질, 단백질, 다당류, 글리코칼릭스 및 프로테오글리칸으로 구성된다. 세포 용해는 세포막이 파열되고 이어서 세포가 분해되는 것을 의미한다. 세포의 외막을 파괴하여 DNA, RNA, 단백질 또는 바이러스 벡터와 같은 세포내 물질을 방출시키기 위해 효소, 삼투압, 동결-해동 및 기계적 압력과 같은 다양한 기술이 활용된다. 이러한 기술 중 일부는 단백질, DNA 및 기타 관심 있는 구성요소를 손상/변성시킬 수 있다. 이와 같이, 잠재적으로 가혹한 제조 과정 동안 세포막을 분해하고 관심 물질을 손상으로부터 보호하는 세포 용해 시약이 필요하다. 세포 용해는 또한 병원체의 분자 진단, 현장 진단을 위한 면역검정, 단백질 기능 및 구조 연구를 위한 단백질 정제와 같은 다운스트림 과정, 바이러스 벡터의 다운스트림 정제, 암 진단, 약물 스크리닝, mRNA 전사체, 및 특정 단백질, 지질 및 핵산의 조성의 결정 및 분석에 개별적으로 또는 복합체로서 중요하다.

세포 용해에는 몇 가지 화학적 또는 기계적 방법이 있다[2]. 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 세포로부터 유리시키는(liberate) 기초적인 기계적 기술은 동결/해동 순환과 뒤이어 저속 원심분리 정화 단계이다. 그러나, 이 기술은 그에 따라 규모를 조정하기 어렵기 때문에 rAAV의 대규모 정제에는 적합하지 않다. 기계적 균질화는 배지 내 세포가 고압을 사용하여 오리피스(orifice)를 통해 강제되는 또 다른 용해 방법이다. 세포가 오리피스에 들어가는 동안 압축을 받고 배출 시 팽창함에 따라 높은 전단력으로 인해 막의 파열이 발생한다. 이 방법은 확장성이 있지만, 전단 응력-유도 응집 및 침전으로 인해 생성물 손실의 단점이 있다.

SDS에 의한 세포 용해는 알칼리성 pH에서만 작동하며[3], 이는 바이러스 입자 안정성뿐만 아니라 기타 세포내 성분에 대한 최적의 용액 조건은 아니다[4]. SDS 세포 용해 과정에서, 바이러스 벡터는 가혹한 용액 조건에서 숙주 세포로부터 방출되어, 가공으로 인해 바이러스 벡터가 상당히 손실된다.

세포 용해 과정은 또한 핵산 불순물을 방출하며, 이를 제거하려면 별도의 단위 작업이 필요하다. 현재 용해 방법은 전단 응력으로 인한 생성물 손실을 방지하지 못하며 세포 용해 과정으로부터 비롯되는 과정 관련 불순물을 제거하지도 않는다. 전단 응력으로 인한 손실을 방지하면서도 세포 용해와 DNA 제거 과정을 둘 다 조합할 수 있는 임의의 용액은 바이러스 벡터 제조에 가치가 있을 것이다.

바이러스 불활성화는 바이러스가 더 이상 활성이 아니거나 감염시킬 수 없도록 바이러스의 표면 특성이 변경되는 과정이다. 약물 제조업체는 생물학적 치료제의 바이러스 안전성을 보장해야 한다. 바이러스 오염은 모든 동물 및 인간 유래 바이오 의약품에 대한 일반적인 위협이다. 바이러스 오염물질은 세포주(예를 들어 내인성 레트로바이러스)로부터 또는 약물 제조 동안 우발적(예를 들어 마이코플라즈마) 도입으로부터 비롯될 수 있다.

바이러스 불활성화를 위해, 약물 제조업체는 바이러스를 제거하거나 불활성화시키기 위해 다양한 기술을 적용한다. 이들 기술은 낮은 pH 불활성화, 바이러스 여과 및 화학적 불활성화를 포함한다. 모든 생물학적 제품의 안전성을 보장할 수 있는 단일 전략은 없다. 그러나, 용매/세제 처리는 강력하고 확장하기 쉽기 때문에 지질-코트 외피 바이러스를 불활성화시키기 위해 선택되는 방법이다.

전형적으로, 옥톡시놀(Octoxynol)-9(Triton X-100으로도 판매됨), 소듐 데옥시콜레이트 및 소듐 도데실 설페이트와 같은 다양한 세제가 세포 용해를 위한 1차 세제로 사용되어 왔다[5]. 이들 중에서 Triton X-100은 우수한 성능으로 인해 바이러스 벡터 정제 과정[5] 및 외피 바이러스의 불활성화에 선호되는 세제이다.

연구에 따르면 Triton X-100은 급성 경구 독성, 눈 손상, 피부 자극 및 만성 수생 독성을 유발한다[6]. 그 결과, 세제는 2016년 12월에 REACH 규정에 따라 유럽 화학물질 관리청(European Chemicals Agency)에 의해 "매우 우려되는 물질 목록"에 올랐다[6]. 화학물질의 등록, 평가, 허가 및 제한(Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals)을 나타내는 REACH는 인간의 건강과 환경 둘 다에 대한 화학물질 안전성을 다루기 위해 2006년 12월에 제정된 유럽 연합 규정이다. 상기 세제는 2021년 1월부터 유럽에서 사용이 금지되었으며[7], 전세계 다른 지역도 유럽의 여파로 뒤따르거나 어려움을 겪을 수 있다.

따라서, 세포를 용해하고 숙주 세포로부터 세포내 물질을 방출할 뿐만 아니라 가공 조건 동안 관심 물질을 손상으로부터 보호하는 세포 용해 및 바이러스 불활성화를 위한 안전하고 효과적인 막 파열 용액에 대한 분명한 필요성이 있다. 바람직하게는, 막 파열 용액은 생성물에 영향을 주지 않고 생성물을 단리할 수 있어야 하며 세포 용해 과정 동안 생성되는 과정 관련 불순물을 제거할 수 있어야 한다. 본 발명의 막 파열 용액은 현재의 조성물과 상이하고, 놀라울 정도로 신속하고 효율적인 용해를 나타내었으며, 한편 이와 동시에 전단 응력으로 인한 손상으로부터 바이러스 벡터를 보호한다. 더욱이, 이는 빈(empty) 캡시드, 세포 파편 및 세포 DNA와 같은 생성물 및 과정 관련 불순물을 제거한다.

본 발명은 정량적 세포 용해를 가능하게 하는 한편, 놀랍게도 관심 세포 구성요소(예를 들어, 바이러스 벡터 및 단백질)를 보호하는 비이온성 세제 혼합물을 제공한다. 본 발명의 막 파열 용액은 세포막의 외부 경계를 교란시키며(disrupt), 잠재적으로 가혹한 제조 과정 동안 관심 물질을 손상으로부터 보호하고, 생성물 및 과정 관련 불순물로부터 관심 물질을 분리한다. 세포 용해 및 바이러스 불활성화라는 막 파열 용액의 2개의 주요 적용 분야가 있다. 바이러스는 2개 그룹으로 나뉜다: 제1 그룹인 외피 바이러스는 외부 지질막으로 둘러싸여 있으며; 제2 그룹인 비(非)외피 바이러스는 이러한 지질막이 없다. 막 파열 용액은 외피 바이러스를 불활성화시킨다. 세포 용해와 외피 바이러스의 불활성화의 메커니즘은 동일하다. 세포막과 외피 바이러스는 둘 다 소수성 분자와 친수성 분자로 이루어진 지질 이중층을 함유한다. 막 파열 용액은 지질-지질, 지질-단백질 및 단백질-단백질 상호작용을 교란시킨다[2]. 따라서, 세포를 용해시킬 수 있는 임의의 용액은 외피 바이러스를 불활성화시킬 수도 있다.

본 막 파열 용액의 세제는 온화하고(benign), 거품이 적게 발생하며, 환경적으로 상용적일 수 있고, 더 구체적으로는 OECD 301에 따른 쉽게 생분해 가능한 물질에 대한 OECD 가이드라인을 충족한다. 세제가 환경 친화적인 경우 본 막 파열 용액 및 세포 파열 방법은 생리학적 조건에 가까운 용해물(그리고 잠재적으로는 세포 용해의 경우 생성물 및 과정 관련 불순물을 제거함) 또는 용액(바이러스 불활성화의 경우)에서 관심 생성물을 보호할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 세포 용해 및 바이러스 불활성화에 유용한 막 파열 조성물(즉, 용액)을 포함한다. 일 구현예에서, 용액은 하나 이상의 정제된 비이온성 세제를 포함하며, 상기 세제 중 적어도 하나는 전단 응력에 대한 바이러스 벡터/단백질 안정화에 적합한 표면 활성 특성을 갖는다(표 1). 적합한 세제의 예는 알코올 에톡실레이트(예를 들어, TDA 9, Tergitol 15-s-9), 소르비톤 에톡실레이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80) 및 삼중블록(triblock) 공중합체(예를 들어, 폴록사머 188, 폴록사머 407 및 폴록사머 305)를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 예를 들어 세포 용해 동안 불순물로부터 관심 생성물을 분리함으로써 바이러스 벡터 제조 작업 흐름을 단순화할 수 있는 스캐빈저(scavenger)를 추가로 포함한다. 적합한 스캐빈저의 예는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에탄올, 폴리에틸렌이민(PEI)과 이의 유도체 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(DTTP)를 포함한다. PEI 유도체는 PEI의 아세틸화 및 4차화, 알킬 할라이드, 알킬 무수물 또는 알킬 아세틸 클로라이드를 통한 2차 아민기에의 메틸기, 에틸기 또는 프로필기의 첨가를 포함한다.

일부 구현예에서, 정제된 세제 조성물은 95% 초과의 순도를 가지며, 에틸렌 옥사이드(<5 ppm) 및 디옥산(<10 ppm)과 같은 독성을 갖는 것으로 알려진 일반적인 불순물이 제어된다. 정제 과정은 증류, 반응 증류, 여과, 컬럼 크로마토그래피 흡착 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 막 파열 용액은 또한 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 소듐 클로라이드(NaCl) 및 마그네슘 클로라이드(MgCl₂)과 같은 다른 안정화제를 함유할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 고순도 세제를 생산하는 방법 및 세포 파열 용액을 제조하는 방법을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 포유류 및 곤충 세포주를 용해시키고 외피 바이러스를 불활성화시키는 방법을 포함한다. 또 다른 양태에서, 막 파열 용액은 바이러스 벡터 입자를 단리하는데 유용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 막 파열 조성물은 빈 캡시드 및 기타 생성물 및 과정 관련 불순물로부터 전체 캡시드(게놈 함유)를 분리하는 데 유용할 수 있다.

도 1: 용액 A 및 Triton X-100에 의한 HEK-293(패널 A) 및 SF9(패널 B) 세포의 세포 용해를 나타내는 그래프이다. 세포 생존율 퍼센트는 세포 용해 1시간 후에 측정되었다.
도 2: 용액 A 및 용액 B에 의한 HEK-293(패널 A) 및 SF9(패널 B) 세포의 세포 용해를 나타내는 그래프이다. 세포 생존율 퍼센트는 세포 용해 1시간 후에 측정되었다.
도 3: HEK-293(패널 A) 및 SF9(패널 B) 세포의 세포 용해에 미치는 용액 A 및 폴리소르베이트 20의 상승작용 효과를 나타내는 그래프이다. 세포 생존율 퍼센트는 세포 용해 1시간 후에 측정되었다.
도 4: 용액 B 및 용액 C에 의한 HEK-293(패널 A) 및 SF9(패널 B) 세포의 세포 용해를 나타내는 그래프이다. 세포 생존율 퍼센트는 세포 용해 1시간 후에 측정되었다.
도 5: 막 파열 용액 Triton X-100, 용액 A, 용액 B 및 용액 C의 거품 높이를 나타내는 그래프이다. 측정은 ASTM D 1173, 표면 활성제의 표준 발포 특성 테스트 방법(Standard Test Method for Foaming Properties of Surface-Active Agents)에 따라 0.1% 막 파열 용액 농도에서 실시되었다.
도 6: pH 4.0의 50 mM Tris 및 세포 배양 배지에서 용액 C에 의한 HEK-293 세포의 세포 용해를 나타내는 그래프이다. 세포 생존율 퍼센트는 세포 용해 1시간 후에 측정되었다.
도 7: 막 파열 용액 Triton X-100, 용액 A, 용액 B 및 용액 C를 사용하여 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다. 역가는 qPCR 방법을 사용하여 측정되었다.

본 발명은 숙주 세포로부터 비(非)용해성 바이러스, 단백질 및 펩타이드 분자를 추출하고 단리하는데 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 용해를 통해 숙주 세포(예를 들어, 포유류 및 곤충 세포)로부터 바이러스 벡터의 추출 및 단리에 유용한 이러한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 막 파열 용액을 제공한다. 이러한 용액은 숙주 세포 용해 및 바이러스 불활성화에 사용될 수 있다. 조성물은 약 0.001% (w/v) 내지 약 1% (w/v) 농도 범위의 하나 이상의 정제되고 생분해성이며 환경 친화적인 세제(들)를 포함한다. 적합한 세제의 예는 알코올 에톡실레이트(예를 들어, TDA 9, Tergitol 15-S-9), 소르비톤 에톡실레이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80) 및 삼중블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머 188, 폴록사머 407 및 폴록사머 305)를 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 또한 0.01% (w/v) 내지 약 1% (w/v) 농도 범위의 적어도 하나의 스캐빈저를 포함한다. 적합한 스캐빈저의 예는 EDTA, 에탄올, DTTP 및 PEI 또는 이의 유도체를 포함한다. 구체적으로, PEI는 분자량이 3000 KD 내지 100,000 KD인 선형 또는 분지형 구조일 수 있다. PEI의 유도체화는 예를 들어 아세트산 무수물 또는 아세틸 클로라이드와 같은 시약을 활용하는 현재 공지된 아세틸화 또는 알킬화 기술을 사용하여 2차 아민기에서 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기의 첨가를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제의 예는 약 0.001 M 내지 약 2 M 농도 범위의 수크로스, 트레할로즈, 덱스트로스, 다양한 사슬 길이의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 소듐 클로라이드(NaCl) 및 마그네슘 클로라이드(MgCl₂)를 포함한다. PEG의 사슬 길이는 100 내지 10,000개 단량체 단위로 다양할 수 있다.

일부 다른 구현예에서, 조성물은 pH를 약 3.0 내지 약 9.0 범위로 유지하기에 충분한 양의 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 수용액 또는 수성 농축물일 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 포유류 및 곤충 세포와 같은 숙주 세포로부터 바이러스 벡터를 회수하는 방법을 제공한다. 방법은: (a) 세포 성장을 위한 방법을 제공함으로써 세포 조제물을 제공하는 단계; (b) 약 0.01% (w/v) 내지 약 1% (w/v) 농도 범위의 하나 이상의 세제(들)를 포함하는 세포 파열 용액을 제공하는 단계로서, 상기 세제 중 적어도 하나는 전단 응력에 대한 바이러스 벡터/단백질 안정화에 중요한 표면 활성 특징(선택적으로 스캐빈저 및 안정화제 포함)을 갖는, 단계; (c) 세포 용해가 일어나는 세포 파열 용액을 세포 조제물과 접촉시키는 단계; (d) 세포 생존율 분석을 실시하는 단계; (e) DNA 측정을 실시하는 단계; 및 (f) 바이러스 역가를 실시하는 단계를 포함한다.

일 구현예에서, 사용중 세포 파열 용액은 용액 pH가 약 3.0 내지 9.0인 수용액에 약 0.25% (w/v) TDA9(용액 A)를 포함한다. TDA9는 이소트리데실 알코올로부터 유래되고 평균 9 몰의 에틸렌 옥사이드로 에톡실화된 생분해성 비이온성 세제이다. 이는 유화제, 분산제 및 가용화제로서 탁월한 빠른 습윤 특성, 비교적 낮은 거품 수준, 우수한 세정력 및 다용도성을 나타낸다. 세포 파열 용액은 HEK 293 세포주와 SF9 세포주 둘 다에 대해 테스트되었다. 세포 농도는 >5X10⁶ 세포/ml이었다. 세포 배양 배지 내 세포 수합물을 세포 파열 용액의 농축 스톡으로 스파이킹하여 0% 내지 0.5% 범위의 최종 세포 파열 용액 농도에 도달시켰고, 15℃ 내지 30℃에서 약 5분 내지 약 1시간 동안 배양하였다. 스톡 용액의 농도는 표적 농도보다 1배 내지 500배 더 높을 수 있다. 인큐베이션 기간 후, 세포의 세포 생존율을 Vi-Cell 판독기로 분석하였다. 세포 생존율 분석은 약 5분 이내에 완전한 세포 용해를 입증하였다. 5분을 초과한 인큐베이션은 어떠한 이점도 제공하지 않았으며 해를 끼치지도 않았다.

일 양태에서, 본 발명은 현재 사용되는 세제 Triton X-100과 유사하게 포유류 세포와 곤충 세포를 둘 다 용해시킬 수 있는 생분해성 친환경 세제를 제공한다. Triton X-100은 2021년 1월부터 사용할 수 없으므로, 본 발명은 바이러스 벡터 및 기타 비용해성 세포 생성물에 중요하다. 본 발명에서, 세제는 고순도이며 관심 생성물에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 및 자유 에틸렌 옥사이드와 같은 생성물 관련 불순물이 없다. 본원에 사용되는 세제는 미생물 오염물질과 에틸렌 옥사이드가 둘 다 적다. TDA9의 정제 단계 동안 미생물 오염 감소는 크로마토그래피와 같은 정제 단계에서 폴리에틸렌 글리콜 및 자유 에틸렌 옥사이드와 같은 불순물을 제거하기 위한 다운스트림 가공에 대한 부담을 줄인다. TDA9에서 에틸렌 옥사이드를 제거하는 것은 에틸렌 옥사이드가 유해 물질[8]이며 발암성이고 취급 시 추가 주의가 필요하기 때문에 중요하다. 또한, TDA9는 쉽게 생분해되는 물질에 대한 OECD 지침 301F를 충족하는 환경 친화적 세제이다. 세제의 단기(급성) 독성은 경고 라벨이 필요 없는 카테고리 2로 분류되며, LC₅₀ 및 EC₅₀ 값은 1.00 초과 내지 100 미만이다. OECD 203(어류에 대한 독성), OECD 202(수생 무척추 동물에 대한 독성) 및 OECD 201(조류에 대한 독성)에 따르면 수생 환경에 대한 독성은 모든 3개의 트로픽(trophic) 수준에서 테스트된다.

본 발명의 이 구현예의 또 다른 양태에서, 세포 파열 용액은 수용액 중의 약 0.05% TDA9 및 약 0.20% (w/v) 폴리소르베이트 20(용액 B)으로 이루어진다. Tween 20으로도 알려진 폴리소르베이트 20은 라우르산을 첨가하기 전에 소르비탄 에스테르의 에톡실화에 의해 형성된 소르비탄 에톡실레이트 유형의 비이온성 계면활성제이다. 이는 상대적으로 무독성이며, 여러 국내, 과학 및 약리학 적용 분야에 사용된다. 이름에서 알 수 있듯이, 에톡실화 과정은 분자에 폴리에틸렌 글리콜의 20개 반복 단위를 남긴다. 용액 pH는 약 3.0 내지 약 9.0이다. 이러한 세포 파열 용액은 HEK 293 세포주와 SF9 세포주 둘 다에 대해 테스트되었다. 세포 농도는 >5x10⁶ 세포/mL이었다. 세포 배양 배지 내 세포 수합물을 세포 파열 용액의 농축 스톡으로 스파이킹하여 0% 내지 0.5% 범위의 최종 세포 파열 용액 농도에 도달시켰고, 15℃ 내지 30℃에서 약 5분 내지 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 세포 생존율을 Vi-Cell 판독기로 분석하였다. 세포 생존율 분석은 약 5분 이내에 완전한 세포 파열을 입증하였다. 용액 B는 0.1% (w/v) 이상의 용해 용액 농도에 대해 용액 A와 유사한 용해를 보여주었다. 실시예 3에 예시된 바와 같이, 파열 용액 B는 예기치 않게, 성분 농도에 기초한 수학적 계산을 활용하여 이론적으로 예상되는 것보다 더 높은 세포 용해를 나타내었다. 이러한 상승작용 성능 현상은 더 나은 세포 용해를 유도한다. 본 발명의 막 파열 용액은 폴리소르베이트 20에 비해 낮은 TDA9 농도를 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 폴리소르베이트 20은 Avantor J.T. Baker 브랜드로부터의 초정제된(super refined) 저불순물 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 구현예에서, 용액 B는 용액 A 또는 Triton X-100에 비해 거품 높이가 더 낮아 작동 유연성을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 막 파열 용액은 약 0.05% TDA9, 약 0.20% (w/v) 폴리소르베이트 20 및 약 0.005% (w/v) 폴록사머 188(용액 C)을 포함한다. 폴록사머는 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 사슬에 의해 플랭킹된(flanked) 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 사슬로 이루어진 비이온성 삼중블록 공중합체이다. 폴록사머 188은 전단 응력으로부터 생성물을 보호하며, 예를 들어 용해 및 정제 동안 바이러스 벡터를 보호한다. 전단 유도 응력으로 인한 바이러스 벡터의 분해는 문헌[9]에 보고되어 있다. 폴록사머 188은 세포막 안정화제인 것으로 보고되었으므로 세포 용해에 영향을 미치며 생물의학 공학에서 막 재밀봉 시약으로도 사용된다[10,11]. 세포를 용해시키는 막 파열 용액의 능력에 미치는 폴록사머 188의 효과를 평가하였다. 본 발명에서 용액 pH는 약 3.0 내지 약 9.0이었다. 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 폴록사머 188이 막 파열 용액의 일부로 사용될 때 세포 용해에 부정적인 영향을 미치지 않음을 관찰하였다. 세포 파열 용액은 HEK 293 세포주와 SF9 세포주 둘 다에 대해 테스트되었다. 세포 농도는 >5X10⁶ 세포/mL이었다. 세포 배양 배지 내 세포 수합물을 세포 파열 용액의 농축 스톡으로 스파이킹하여 0% 내지 0.5% 범위의 최종 세포 파열 완충액 농도에 도달시켰고, 15℃ 내지 30℃에서 약 5분 내지 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 세포의 세포 생존율을 Vi-Cell 판독기로 분석하였다. 세포 생존율 분석은 약 5분 이내에 완전한 세포 파열을 입증하였다. 5분 초과의 인큐베이션은 어떠한 이점도 제공하지 않았으며 부정적인 영향도 초래하지 않았다. 결과는 세포 용해가 용액 B 및 용액 C와 유사함을 입증하였다. 일 구현예에서, 본 발명은 세포를 완전히 용해시킬 뿐만 아니라 제조 과정 동안 경험하게 될 전단 유도 손상으로부터 용해물 내 관심 생성물을 보호하는 용해 완충액을 제공한다. 본 연구에 사용된 폴록사머 188 또한, 제약 산업에서 오랜 사용 역사를 갖고 있으며 GRAS 부형제로 등재되어 있다[1,12,13]. 본 발명에 사용된 폴록사머 188은 Avantor J.T. Baker 브랜드의 것일 수 있거나 다른 공급업체에서 공급받을 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 막 파열 용액은 0.05% TDA9, 0.20% (w/v) 폴리소르베이트 20, 0.005% (w/v) 폴록사머 188 및 0.1% PEI를 포함한다(용액 D). 폴리에틸렌이민인 PEI는 아민기와 2개의 탄소 지방족 CH₂CH₂ 스페이서로 이루어진 반복 단위를 갖는 중합체이다. PEI가 DNA를 선택적으로 침전시키는 데 사용되었지만 [14], 인지질 및 막 단백질과 같은 세포막 구성요소와의 활성을 방해하기 때문에 세포 용해 용액에 사용되지 않는다. 본 발명에서, 본 발명자들은 놀랍게도, 용해 완충액 내 PEI의 존재가 세포 용해 강도의 현저한 변화 없이 세포 막 구성요소로부터의 간섭 및 세포 파편의 제거 없이 세포 용해 후 용해물 내 DNA를 현저하게 감소시켰음을 발견하였다. PEI에 의한 DNA 제거는 용액 D에 의해 용해된 용해물 내 총 DNA를 PEI-무함유 용해 용액과 비교하여 계산되었다. 용해물 내 DNA는 Denovix 형광 정량화 검정(DeNovix dsDNA Broad Range Kit)으로 측정되었다. PEI는 바이러스 벡터 수율을 크게 향상시킬 수 있으며, 결과적으로 제조 작업 흐름을 단순화시킬 수 있다. PEI는 용해물에 전체 바이러스 벡터 캡시드를 유지하는 한편, 생성물 관련 불순물(예를 들어 빈 캡시드 및 DNA)을 선택적으로 침전시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 세포를 용액 A, 용액 B 및 용액 C로 용해시켰다. 간략하게는, 세포 및 용해 완충액 혼합물을 전단 응력에 노출시킨 다음, 정제하였다. 수율은 qPCR에 의해 측정된 바와 같이 용액 A 및 용액 B보다 용액 C로 용해된 세포에 대해 더 양호하였다. 폴록사머-함유 용액의 더 높은 역가는 폴록사머 188에 의한 바이러스 벡터 보호를 입증한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 용액 D에 의한 세포의 용해는 놀랍게도 DNA 불순물과 AAV 바이러스를 둘 다 침전시켰다. 빈 캡시드 대 전체 캡시드, 뿐만 아니라 DNA 불순물의 PI가 상이하기 때문에, 용해 용액 조건을 최적화하여 용해 동안 용액에 관심 바이러스인 전체 캡시드로부터 빈 바이러스 캡시드 및 DNA 불순물을 선택적으로 침전시킬 수 있다.

본 발명은 비용해성 세포 생성물의 제조에 상당한 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 조성물은 다운스트림 가공 동안 전단 응력으로 인한 생성물 손상을 최소화하기 위해 폴록사머 188을 포함하고, 용해물로부터 빈 캡시드 및 DNA 불순물을 선택적으로 감소시키기 위해 PEI를 포함한다. 이는 현재의 바이러스 벡터 제조 작업 흐름을 크게 향상시켜, 전반적인 수율을 향상시키고 처리 비용을 낮춘다.

막 파열 용액의 농축 스톡은 사용을 위해 제공될 수 있고 작동 용액에서 최종 농도로 희석될 수 있다. 농축 용액의 스톡은 사용 농도의 약 1-500배 또는 약 5-200배로 다양할 수 있다.

일례에서, 사용중 세포 파열 용액은 0.25% (w/v) 에톡실화 알코올을 포함한다(용액 A). 또 다른 예에서, 사용중 막 파열 용액은 수용액에 0.05% 에톡실화 알코올 및 0.20% (w/v) 폴리소르베이트 20을 함유한다(용액 B). 다른 예에서, 사용중 막 파열 용액은 0.05% 에톡실화 알코올, 0.20% (w/v) 폴리소르베이트 20 및 0.005% (w/v) 폴록사머 188을 함유한다(용액 C). 또 다른 예에서, 사용중 막 파열 용액은 0.05% 에톡실화 알코올, 0.20% (w/v) 폴리소르베이트 20 및 0.005% (w/v) 폴록사머 188 및 0.10% PEI를 함유한다(용액 D). 용액 pH는 약 3.0 내지 약 9.0이다. 용액의 전도도는 약 5 내지 약 200 mS/cm이다. 일부 구현예에서, 전도도는 소듐 클로라이드 또는 마그네슘 클로라이드와 같은 염 용액을 사용하여 약 5 내지 200 mS/cm 범위로 조정된다.

본 발명자들은 또한 막 파열 용액의 특정한 조성물이 더 낮은 거품 높이를 제공하여, 이로써 사용 용이성을 제공하고 바이러스 입자 회수율을 향상시킴을 예기치 않게 관찰하였다.

막 파열 용액의 사용 방법은 세포 배양 배지 또는 적합한 완충 시스템에서 세포 현탁액에 스톡 용해 용액을 첨가하는 단계를 포함한다. 세포 현탁액 중 최종 막 파열 용액 농도는 약 0.01% (w/v) 초과, 바람직하게는 약 0.25% (w/v) 초과, 일부 구현예에서는 약 1% (w/v) 초과이다. 저장 막 파열 용액은 배양 배지의 세포에 직접 첨가될 수 있거나, 수합된 세포는 표적 최종 농도에서 적절한 완충 용액에 재현탁될 수 있다. 용액의 pH는 약 3.0 내지 약 9.0으로 다양할 수 있다. 용액의 전도도는 약 5 내지 200 mS/cm로 다양할 수 있다. 세포 현탁액과 막 파열 용액의 혼합물은 최소 약 5분 동안, 바람직하게는 세포 용해가 완료될 때까지 약 1시간 동안 유지되어야 한다.

세포 용해의 전형적인 예는 비외피 AAV 바이러스 벡터의 제조 과정 동안 달성된다. 일반적인 다운스트림 과정은 먼저 원심분리 및 세포 용해를 포함하며, 여기서 세포는 원심분리에 의해 슬러리로 농축된 다음 생성물 및 과정 관련 불순물을 제거하기 위한 추가 정제 전에 세제, 동결/해동 또는 기계적 균질화를 통해 바이러스를 방출하기 위해 용해된다. 바이러스 벡터 다운스트림 가공의 다른 단위 작업은, 세포 용해 후 생성된 용해물이 핵산 오염물질을 줄이기 위해 엔도뉴클레아제로 분해되는 핵산 제거; 크로마토그래피 정제 전에 세포 단편 및 파편을 제거하기 위한 원심분리 또는 정밀여과에 의한 고형물 제거; HCP 및 임의의 혈청 단백질 불순물을 제거하기 위한 친화성 크로마토그래피; 세슘 클로라이드 구배 초원심분리 절차 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 빈 비감염성 캡시드로부터 게놈-함유 감염성 AAV 바이러스의 제거; 및 코어-비드 흡착제를 사용하여 HCP 또는 기타 저분자량 오염물질을 추가로 줄이기 위한 최종 연마를 포함한다[15].

바이러스 불활성화의 전형적인 예는 혈장으로부터 바이러스를 제거하는 것이다[16,17]. 보건 당국은 환자에게 투여하기 전에 혈장에서 바이러스를 제거하도록 지시한다. 이는 혈액 성분을 통한 전염성 감염 인자(예를 들어 간염)의 수혈 가능성을 최소화하기 위한 중요한 안전 단계이다. 세포 유래 생성물의 바이러스 불활성화의 또 다른 예는 단일클론 항체와 같은 재조합 생성물의 생산 동안 발생한다. 단일클론 항체 제조는 생성물로부터 바이러스를 불활성화/제거하기 위한 여러 단위 작업을 포함한다. FDA 및 기타 규제 기관 지침에 따라 재조합 생성물의 경우 바이러스 제거 입증이 필수이다[18]. 세제에 의한 바이러스 불활성화 과정은 CMC 이상에서 세포 유래 생성물에 세제 용액을 첨가하고 몇 시간 동안 유지하는 것을 포함한다. 그러나, 불활성화된 바이러스는 사람이 사용하기 전에 여과, 크로마토그래피 및/또는 기타 방법으로 생성물로부터 제거되어야 한다[16,17].

현재 본 발명의 바람직한 구현예라고 생각되는 것이 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 다른 추가 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 진정한 범위 내에 있는 이러한 모든 수정 및 변경을 청구하기 위한 것이다. 본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 더욱 상세하게 예시된다.

실시예

본 개시내용에 사용된 재료 및 방법은 하기와 같다:

TDA9 정제

생성물-관련 불순물, 특히 에틸렌 옥사이드를 줄이기 위해 TDA9 정제를 수행하였다. 정제 과정은 (1) 질소 또는 불활성 가스와 혼합하거나 진공을 가하면서 원료를 50-180℃로 가열하는 단계, (2) 불활성 가스와 혼합하면서 생성물을 15-40℃로 냉각시키는 단계, (3) 완전히 균질화된 용액을 만들기 위해 10-50 부피%의 물을 첨가하는 단계, (4) 나머지 휘발성 불순물의 완전한 가수분해를 위해 용액을 40-120℃로 가열하는 단계, 및 (5) 0.2-1.0 μm 필터로 혼합물을 여과하는 단계.

세포 성장:

연구를 위한 HEK 293 세포를 환기형 비(non)-배플(baffled) 진탕 플라스크의 Expi293 발현 배지(Gibco A14351-01)에서 성장시켰다. 인큐베이터를 37℃로 설정하였다. 진탕기 속도는 125 rpm이었다. CO₂를 6%로 유지시켰고, 상대 습도는 >60%였다. >5x10⁶ 생존 세포/mL의 표적 세포 수는 4-5일 내에 달성되었다. 연구를 위한 SF9 세포를 비환기형 비배플 진탕 플라스크에서 SF-900 II SFM(Invitrogen/Gibco 10902) 배지에서 성장시켰다. 인큐베이터를 27℃ 및 125 rpm으로 설정하였다. >5x10⁶ 생존 세포/mL의 표적 세포 수는 4-5일 내에 달성되었다.

세포 용해를 위한 샘플 준비:

세포 용해 연구를 위해 2 mL의 세포를 멸균 생물안전성 캐비닛 아래의 각각의 10 x 15 ml 튜브에 첨가하였다. 각각의 튜브에 0%(대조군, 세제 없음), 0.0025%, 0.005%, 0.0075%, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.25% 및 0.5%의 세포 파열 용액을 농축 스톡을 사용하여 스파이킹하였다. ViCell 세포 생존율 분석기를 사용하여 각각의 샘플에 대해 15분, 30분 및 1시간 시점에서 세포 수 및 세포 생존율 퍼센트를 결정하였다.

세포 생존율 연구:

트리판 블루 배제 염색을 사용하여 Vi-Cell XR로 세포 생존율을 평가하였다. Vi-Cell XR 세포 생존율 분석기는 세포 생존율을 분석하는 데 사용되는 비디오 이미징 시스템이다. 이는 죽은 세포는 염료를 흡수하고 살아있는 세포는 흡수하지 않는 트리판 블루 배제 프로토콜을 자동화한다[19]. 샘플을 이미징을 위해 플로우 셀과 카메라로 전달하고, 여기서 살아있는 세포와 죽은 세포 사이의 그레이 스케일 차이가 소프트웨어에 의해 결정된다. 모든 샘플에 대해 기기는 500 μL의 샘플 부피가 필요하며, 이는 트리판 블루와 1:1로 혼합되고 세포 농도 및 생존율을 결정하기 위해 최대 50개의 이미지를 촬영한다.

거품 높이 측정:

다양한 막 파열 용액의 거품 높이 측정을 ASTM D 1173, 표면 활성제의 거품 형성 특성에 대한 표준 시험 방법[20]에 따라 수행하였다. 모든 거품 높이 측정을 Wilmad-Labglass의 Ross-Miles Foam Apparatus(VWR Cat# 14007-876)를 사용하여 25℃(실온)에서 수행하였다.

DNA 측정:

DNA를 DeNovix의 dsDNA 광범위 형광 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 이 키트를 사용하면 200 μl 부피에서 총 질량 2 내지 2000 ng의 표준 검출 범위로 dsDNA 샘플을 검출할 수 있다. 염료의 분광 특성은 dsDNA 존재 시 350/460 nm의 여기/방출이다. 이는 광범위한 2-포인트 분석이다. DNase가 없는 피펫 팁을 이 검정에 사용하였고(VWR Cat#s 89174-528, 89174-530, 89714-524); 모든 시약을 실온으로 평형화시켰다. 작업 용액을 캡이 있는 2 mL VWR 마이크로 튜브(멸균, DNase-무함유, Cat#16466-042)에서 준비하였고: 1 mL 검정 완충액 + 10 μl 염료 + 10 μl 인핸서. 모든 표준(0 ng 및 200 ng) 및 샘플을 PCR 튜브에서 10 μl 표준 또는 10 μl 샘플에 190 μl 작업 용액을 첨가하여 준비하였다. 검정 튜브를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 메뉴에서 사전작제된 표준을 선택한 다음, "새 표준 곡선 생성"을 선택하였다. 그런 다음 0 ng/μl 및 200ng/μl 표준을 판독하였다. 이 곡선이 생성된 후 샘플을 측정하였다. 상대 형광 단위 및 DNA 농도를 샘플과 표준 둘 다에 대해 기록하였다.

실시예 1: 막 파열 용액 A에 의한 세포 용해

막 파열 용액 A 및 Triton X-100에 의한 HEK 293 및 SF9 세포의 세포 용해를 수행하였다. 세포 유형 둘 다에 대해 용해 전 세포 수를 측정하였다. 앞에서 논의한 대로 샘플을 준비하고 분석하였다. Triton X-100을 사용한 대조군 실험을 용액 A와 동일하게 실시하였다. 세포 수와 세포 생존율 퍼센트를 ViCell 세포 생존율 분석기를 사용하여 1시간 배양 후 결정되었다. 세포 용해 결과는 도 1에 나와 있다. 세포주 둘 다에 대해, 세포 용해는 0.05% (w/v)의 세제 농도에서 완료되었고, 그 결과는 용액 A와 Triton X-100에서 유사하였다. 0.05%를 초과하는 세제 농도는 어떠한 이점도 제공하지 않았다.

실시예 2: 막 파열 용액 B에 의한 세포 용해:

용액 A 및 용액 B(용액 A+PS20)에 의한 HEK 293 및 SF9 세포의 세포 용해를 수행하였다. 세포 유형 둘 다에 대해 용해 전 세포 수를 측정하였다. 앞에서 논의한 대로 샘플을 준비하고 분석하였다. 1시간 인큐베이션된 샘플에 대한 세포 용해 결과는 도 2에 나와 있다. 0.1% 농도의 용액 B에 대해 완전한 세포 용해가 달성되었다. 0.1%를 초과하는 농도는 어떠한 이점도 제공하지 않았다. 세포 용해는 용액 B보다 낮은 농도의 용액 A에 의해 달성되었지만, 세포 용해는 일반적으로 0.1% 초과의 농도에서 수행되기 때문에 작은 차이는 실질적으로 가치가 없다[5,6,21,22]. 따라서, 전형적인 사용 농도에서 용액 A와 용액 B는 성능면에서 유사하다. 용액 A에 비해 용액 B를 사용하는 이점 중 하나는 용액 A에 비해 거품 높이가 더 낮다는 것이다(실시예 5).

실시예 3: 용액 A 및 폴리소르베이트 20의 상승작용 효과:

용액 A, PS20 및 용액 B(용액 A+PS20)에 의한 HEK 293 및 SF9 세포의 세포 용해를 수행하였다. 세포 유형 둘 다에 대해 용해 전 세포 수를 측정하였다. 샘플 준비를 위해 막 파열 용액의 3개 스톡(용액 A, PS20 및 용액 B)을 사용하였다. 앞에서 논의한 대로 샘플을 준비하고 분석하였다. 결과는 도 3에 나와 있다. 이 연구는 용액 A와 PS20의 상승작용 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 이를 확인하기 위해 용액 B에 의한 실험적 세포 용해를 예상 세포 용해와 비교하였다. 용액 B의 예상 반응을 하기와 같이 계산하였다:

도면에서 볼 수 있듯이 실험적으로 관찰된 용액 B에 의한 용해는 예상된 용해보다 상당히 우수하며, 이는 용액 A와 PS20 간의 상승작용 효과를 시사한다.

실시예 4: 막 파열 용액 C에 의한 세포 용해:

용액 B 및 용액 C(용액 B + 폴록사머)에 의한 HEK 293 및 SF9 세포의 세포 용해를 수행하였다. 세포 유형 둘 다에 대해 용해 전 세포 수를 측정하였다. 1시간 동안 인큐베이션된 샘플에 대한 세포 용해 결과는 도 4에 나와 있다. 세포 용해는 용액 B와 용액 C 모두에서 유사하였으며, 이는 폴록사머가 용액 B 용액과 상용성이고 세포 용해에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이는 폴록사머가 가혹한 제조 조건 동안 세포 용해를 손상시키지 않으면서 관심 생성물, 이 경우 바이러스 벡터에 대한 보호를 제공할 것으로 예상되기 때문에 매우 중요한 발명이다.

실시예 5: 막 파열 용액의 거품 높이 비교:

거품 높이를 최소화하는 것은 세제를 사용할 때 흔히 겪는 문제이다. 이상적으로 세포 용해 용액은 너무 많은 거품을 생성하지 않고 세포를 용해할 수 있어야 한다. 이 실험에서는 Triton X-100, 용액 A, 용액 B 및 용액 C의 거품 높이를 비교하였다. 거품 높이 결정은 Wilmad-Labglass의 Ross-Miles Foam Apparatus(VWR Cat# 14007-876)를 사용하여 수행되었다. 도 5는 시간이 0일 때와 유지 시간 5분 후 거품 높이를 보여준다. PEI는 세제가 아니기 때문에 용액 D의 거품 높이는 측정되지 않았고, 따라서 용액 C의 거품 높이에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 세포 용해 용액 B 및 C의 거품 높이는 용액 A 및 Triton X-100의 거품 높이보다 상당히 더 낮다.

용액 A, 용액 B 및 용액 C는 Triton X-100와 유사한 용해 능력을 나타내었고 용액 B 및 용액 C는 Triton X-100과 용액 A 둘 다보다 더 낮은 거품 높이를 갖기 때문에, 막 파열 용액인 용액 B, 용액 C 및 용액 D는 용액 A보다 Triton X-100에 대한 더 나은 대안이다.

실시예 6: 세포 용해 동안 DNA 제거:

HEK 293 및 SF9 세포 용해를, 용액 B, 용액 C 및 용액 D를 첨가하여 동결/해동 방법 및 파열 용액 방법 모두에 의해 수행하였다. 용해 전 및 후에 HEK 세포의 DNA 농도를 측정하였다. 동결/해동에 의한 세포 용해를, 세포 현탁액을 -80℃에서 30분 동안 동결시키고 37℃ 수조에서 15분 동안 해동시켜 수행하였다. 동결-해동을 4주기 동안 반복하였다. 대조군 및 동결-해동 샘플을 500 x g에서 10분 동안 회전시켜 세포 파편을 제거하였다. 상층액의 DNA를 dsDNA 광역 형광 분석 키트로 측정하였다. 결과는 표 2에 나와 있다. 베이스라인은 세포 배양 배지를 사용하여 수정되었다. 파열 용액을 통한 세포 용해를 위해 용액 B, 용액 C, 용액 D를 각각 2 mL 세포 현탁액 내로 스파이킹하였다. DNA 정량화 측정 전에 세포 용해가 일어나도록 15분의 기간이 허용되었다. 결과는 표 2에 나와 있다. 총 DNA 농도는 동결/해동 방법으로 세포 용해를 수행한 용해물에서 가장 높았다. 용액 B 및 용액 C 용해물의 DNA 농도는 동결/해동 용해물의 DNA 농도보다 약간 낮았다. 용액 D의 DNA 농도는 거의 0이었다. 이는 다운스트림 가공에 대한 부담을 줄이기 때문에 중요한 발명이다.

실시예 7: 세포 농도 의존적 DNA 제거:

실시예 6에 기재된 방법에 따라 용액 B, 용액 C, 용액 D 용해 완충액을 사용하여 50 mM Tris, pH 6.5 완충액에서 5x10⁶ 세포/mL, 10x10⁶ 세포/mL, 20x10⁶ 세포/mL 및 40x10⁶ 세포/mL의 세포 농도에서 HEK 293 세포 용해를 수행하였다. 결과는 표 3에 나와 있다. 용액 D에 의해 용해된 세포의 DNA 농도는 용액 B 및 C에 의해 용해된 세포보다 상당히 낮았으며, 이는 PEI 함유 용해 완충액이 세포 현탁액으로부터 DNA를 효과적으로 제거할 수 있음을 입증한다. 예상대로, 용액 B와 용액 C로 용해한 후 세포 농도에 따라 DNA 농도가 증가하였으며; 그러나 DNA 농도는 용액 D를 사용한 용해와 유사하였고, 이는 용액 D의 용해 완충액 혼합물에서 PEI에 의한 DNA 제거가 5x10⁶ 내지 40x10⁶ 세포/mL 범위의 세포 농도에 독립적임을 시사한다.

실시예 8: 용해 완충액과 수크로스 및 마그네슘 클로라이드의 상용성:

수크로스 및 마그네슘 클로라이드는 전체 수율과 생성물 품질을 향상시키기 위해 바이러스 벡터 제조에 널리 사용된다[23]. 본 연구는 개시된 세포막 파열 용액이 수크로스 및 마그네슘 클로라이드(MgCl₂)과 상용성이고 세포 용해에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않음을 입증하기 위해 수행되었다. 세포 스톡을 2개의 튜브로 나누고 100 x g에서 10분 동안 회전시켰다. 제1 튜브에서 상층액을 제거하고 고체 펠릿을 50 mM Tris, pH 6.5에 재현탁하였다. 제2 튜브에서 상층액을 제거하고 펠릿을 50 mM Tris, pH 6.5, 2 mM MgCl₂ 및 1 M 수크로스에 재현탁하였다. 현탁액의 세포 농도는 ViCell로 측정했을 때 약 5x10⁶ 세포/mL인 것으로 측정되었다. 세포 용해를 위해 농축 스톡을 사용하여 용액 C를 2 mL의 세포에 첨가하여 0%, 0.05%, 0.1%, 0.25% 및 0.5%의 최종 세제 농도를 얻었다. ViCell 세포 생존율 분석기를 사용하여 각각의 샘플에 대해 1시간 배양 후 세포 수 및 세포 생존율 퍼센트를 결정하였다. 세제 농도의 함수로서의 세포 생존율 결과는 표 4에 나와 있다. 세제가 없는 세포 생존율은 MgCl₂와 수크로스를 포함하는 완충액에 현탁된 세포의 경우 완충액 단독보다 낮았으며, 이는 MgCl₂와 수크로스가 세제 없이 세포를 부분적으로 용해시킬 수 있음을 시사한다. 삼투 충격으로 인해 세포가 파열될 가능성이 있기 때문에 이는 예상치 못한 결과가 아니다. 그러나, 부분(45%) 용해는 세제 사용을 대체하기에 충분하지 않다. 50 mM Tris, pH 6.5 및 50 mM Tris, pH 6.5, 2mM MgCl₂ 및 1 M 수크로스의 삼투압 값은 각각 114 mOsm/Kg 및 1462 mOsm/Kg이다. 더 낮은 세제 농도에서 막 파열 용액은 MgCl₂ 및 수크로스가 있을 때보다 MgCl₂ 및 수크로스가 없는 완충액에서 약간 더 효과적이다. 그러나, 전형적인 세제 사용 농도에서 용해 퍼센트는 두 경우 모두 유사하여, 안정화제로 사용되는 MgCl₂와 수크로스가 세포 용해에 부정적인 영향을 미치지 않음을 시사한다. 세포 용해 동안 수크로스 및 MgCl₂의 사용이 바이러스 벡터를 안정화시키고 회수를 향상시킬 것으로 예상되기 때문에 이는 중요한 관찰이다.

실시예 9: 막 파열 용액에 의한 pH 의존적 세포 용해

용액 C에 의한 HEK 293의 세포 용해는 50 mM 트리스 완충액 중 pH 4.0에서 수행되었고 실시예 4에서 논의된 바와 같이 세포 배지(pH 7.2-7.4)에서의 세포 용해와 비교되었다. 세포 배양 배지에서 필요한 적절한 부피의 세포를 100 x g에서 10분 동안 회전시켰다. 상층액을 제거하고, 고체 펠릿을 적절한 부피의 50 mM Tris, pH 4.0에 재현탁시켰다. 현탁액의 세포 농도는 약 5x10⁶ 세포/mL로 측정되었다. 용액 C의 농축 스톡을 사용하여 세포 현탁액을 스파이킹하였다. 2 mL의 세포를 멸균 생물안전 캐비닛 아래의 5 x 15 ml 튜브 각각에 첨가하였다. 각각의 튜브를 세제 스톡 용액의 0%(대조군, 세제 없음), 0.05%, 0.1%, 0.25% 및 0.5% 최종 농도의 세제로 스파이킹하였다. ViCell 세포 생존율 분석기를 사용하여 각각의 샘플에 대해 1시간 인큐베이션 후 세포 수 및 세포 생존율 퍼센트를 결정하였다. 1시간 인큐베이션된 샘플에 대한 세포 용해의 결과는 도 6에 나와 있다. pH 4.0에서의 세포 용해는 세포 배양 배지에서의 세포 용해와 유사하였고, 이는 낮은 pH의 세포 용해가 막 파열 용액에 의한 세포 용해에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다.

실시예 10: 막 파열 용액에 의한 pH 의존적 DNA 제거:

막 파열 용액에 의한 DNA 제거는 HEK 293 세포에서 50 mM Tris 완충액의 pH 4.0에서 평가되었고 실시예 8에서 논의된 바와 같이 세포 배양 배지(pH 7.2-7.4)에서 DNA 제거와 비교되었다. 세포 배양 배지에서 필요한 적절한 부피의 세포를 100 x g에서 10분 동안 회전시켰다. 상층액을 제거하고, 고체 펠릿을 적절한 부피의 50 mM Tris, pH 4.0에 재현탁시켰다. 현탁액의 세포 농도는 약 5x10⁶ 세포/mL로 측정되었다. 용액 B, 용액 C 및 용액 D를 첨가하여 세포 용해를 수행하여, 최종 막 파열 용액 농도를 0.25%로 만들었다. 용해 전 용액의 DNA 농도를 대조군으로 측정하였다. 상층액의 DNA 함량을 dsDNA 광역 형광 검정 키트로 측정하였다. 결과는 표 5에 나와 있다. 베이스라인은 50 mM Tris pH 4.0 완충액을 사용하여 보정되었다. DNA 정량화 측정 전에 세포 용해가 일어나도록 15분의 기간이 허용되었다. 총 DNA 농도는 용액 D보다 용액 B 또는 용액 C에 의해 세포 용해가 수행된 용해물에서 더 높았다. 용해물의 DNA는 실시예 8에 제시된 바와 같이 pH 4.0에서 세포 배지의 용해물에 있는 DNA와 유사하였다. 세포 밀도는 두 실시예에서 유사하였다(약 5x10⁶ 세포/mL). 이 결과는 pH 4.0에서 세포 용해 동안 생성된 DNA와 막 파열 용액에 의한 이의 후속 제거가 세포 배양 배지(pH 7.2-7.4)에서 용해 동안 생성된 DNA와 막 파열 용액에 의한 이의 후속 제거와 유사함을 입증하며, 이는 낮은 pH가 용액 D로 이루어진 막 파열 용액에 의한 DNA 제거에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다.

실시예 11: 막 파열 용액의 바이러스 벡터 역가 비교:

헬퍼, R2C2 플라스미드 및 GFP 플라스미드 각각에 대해 2:1.6:1의 비율로 플라스미드 DNA와 4:1 혼합된 PEI max를 사용하여 부착성 HEK293T 세포의 형질주입을 수행하였다. 형질주입 후 5일째에, 농축된 용해 용액을 세포 현탁액에 스파이킹하여 용해 실험을 수행하였다. rAAV2로 형질주입된 세포의 용해를 위해 mL당 2백만 개 세포 농도의 세포 현탁액 2 mL를 5 ml 원심분리 튜브에 첨가하고 20 μl의 100x 농축 Triton X-100, 용액 A, 용액 B 및 용액 C를 약 0.25%의 최종 세제 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 후에, 4개 혼합물 모두를 전단 응력에 노출시켜 용해 완충액 및 엔도뉴클레아제 첨가 후 혼합과 같은 일반적인 제조 과정 동안 경험할 수 있는 응력 조건을 모방하였다. 작은 12 mm 크기의 자기 막대를 각각의 튜브에 삽입한 다음 각각의 튜브를 진탕기에 놓았다. 혼합물을 실온에서 60분 동안 250 rpm으로 진탕시켰다. 전단 응력 후, 현탁액을 14,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하고 상층액을 수집하여 바이러스 벡터를 수합하였다. 농축된 PEG 8000/NaCl 혼합물을 상층액에 첨가하여 최종 농도 20%에 도달하게 하여 rAAV2를 응집시키고 생성된 현탁액을 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 2500 x g에서 1시간 동안 원심분리한 후, 펠릿을 수집하고 TAE 완충액에 재현탁시켰다. 클로로포름 및 PEG8000 추출 단계 후, 37℃에서 2 μl의 샘플을 DNAse I로 처리한 다음 0.5 M NaOH/0.2 M EDTA 용액으로 바이러스를 용해시켜 역가를 결정하였다. 후속적으로, 0.5 M Tris를 첨가하여 용액을 중화시키고, GFP 플라스미드를 표적화하는 프라이머를 포함하는 Promega Taq 중합효소 qPCR 키트를 사용하여 역가를 정량화하였다.

도 7은 상이한 막 파열 용액에 대한 바이러스 역가를 보여준다. 차트는 역가가 Triton X-100, 용액 A 및 용액 B에 대해 유사함을 보여준다. 역가는 용액 C에서 상당히 높았으며, 이는 폴록사머가 혼합 동안 전단 응력으로 인한 바이러스 벡터 손상(역가 손실)을 방지할 수 있었음을 시사한다. 이는 매우 중요한 관찰이며; 이는 벡터 제조업체가 전체 바이러스 벡터 수율을 향상시킬 수 있게 할 것이다.

실시예 12: 용해 완충 용액 D를 사용한 바이러스 벡터의 정제:

헬퍼, R2C2 플라스미드 및 GFP 플라스미드 각각에 대해 2:1.6:1의 비율로 플라스미드 DNA와 4:1 혼합된 PEI max를 사용하여 부착성 HEK293T 세포의 형질주입을 수행하였다. 형질주입 후 5일째에, 용액 D의 농축된 용해 용액을 세포 현탁액에 스파이킹하여 용해 실험을 수행하였다. rAAV2로 형질주입된 세포의 용해를 위해 mL당 2백만 세포 농도의 세포 현탁액 2 mL를 5 ml 원심분리 튜브에 첨가하고 100x 농축 용액 D 20 μl를 첨가하여 최종 농도 0.25% 세제에 도달하였다. rAAV2를 정제하고 이전에 설명한 대로 역가를 측정하였다. 결과는 용해물에서 바이러스 벡터의 무시할 수 있는 회수를 입증하였으며, 이는 PEI가 다른 부정적으로 변화된 불순물과 함께 바이러스 벡터를 침전시켰음을 시사한다. 이는 적절한 용액 조건 하에서 관심 바이러스 벡터를 선택적으로 회수하는 데 활용될 수 있기 때문에 예상치 못한 것이지만 매우 중요한 관찰이다.

참조문헌:

Claims (19)

1. 세포 파열 용액으로서:
   하나 이상의 정제된 비이온성 세제로서, 상기 세제 중 적어도 하나는 전단 응력에 대한 바이러스 벡터/단백질 안정화에 적합한 표면 활성 특징을 가지며, 상기 비이온성 세제는 에톡실화된 알코올, 소르비톤 에톡실레이트, 삼중블록(triblock) 공중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세제는 약 0.01% (w/v) 내지 약 2.0% (w/v) 범위의 농도로 존재하는, 하나 이상의 정제된 비이온성 세제; 및
   0% 내지 약 2.0% 범위의 농도의 스캐빈저(scavenger)
   를 포함하고,
   상기 용액은 약 3.0 내지 9.0 범위의 pH 및 약 5 내지 200 mS/cm 범위의 전도도를 갖는, 세포 파열 용액.
2. 제1항에 있어서,
   상기 에톡실화된 알코올은 TDA9, tergitol15-S-9 또는 이들의 조합인, 세포 파열 용액.
3. 제1항에 있어서,
   상기 소르비톤 에톡실레이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합인, 세포 파열 용액.
4. 제1항에 있어서,
   상기 삼중블록 공중합체는 폴록사머 188, 폴록사머 407, 폴록사머 305 또는 이들의 조합인, 세포 파열 용액.
5. 제1항에 있어서,
   상기 비이온성 세제는 약 0.25% (w/v)의 농도로 존재하는, 세포 파열 용액.
6. 제1항에 있어서,
   상기 비이온성 세제는 약 0.05% (w/v) 농도의 TDA9 및 약 0.2% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 20인, 세포 파열 용액.
7. 제1항에 있어서,
   상기 스캐빈저는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에탄올, 데옥시티미딘 트리포스페이트(DTTP), 폴리에틸렌이민(PEI), PEI 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 스캐빈저는 약 0.01% (w/v) 내지 약 1.0% (w/v) 범위의 농도로 존재하는, 세포 파열 용액.
8. 제1항에 있어서,
   상기 비이온성 세제는 약 0.05% (w/v) 농도의 에톡실화된 알코올, 약 0.2% (w/v) 농도의 폴리소르베이트 20 및 약 0.005% (w/v) 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 세포 파열 용액.
9. 제8항에 있어서,
   약 0.1% (w/v) 농도의 PEI인 스캐빈저를 추가로 포함하는, 세포 파열 용액.
10. 제1항에 있어서,
    안정화제를 추가로 포함하는, 세포 파열 용액.
11. 제10항에 있어서,
    상기 안정화제는 수크로스, 마그네슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 다양한 사슬 길이의 PEG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 파열 용액.
12. 세포를 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 막 파열 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 용해 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 또는 곤충 세포인, 방법.
14. 제12항에 있어서,
    상기 용액을 세포 배양 배지 내 세포에, 또는 세포 현탁액에 직접 첨가하고, 상기 세포를 원심분리하여 세포 배지를 제거하고 적합한 완충액에 재현탁시키는, 방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 완충액은 Tris, 포스페이트, 히스티딘, 시트레이트, 아세테이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 완충액은 약 3.0 내지 9.0의 pH에서 약 5 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재하는, 방법.
16. 제12항에 있어서,
    상기 PEI를 세포 용해 후에만 첨가하는, 방법.
17. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 혈액 혈장 또는 단일클론 항체에 존재하는, 방법.
18. 세포 용해물로부터 DNA 및/또는 빈(empty) 바이러스 캡시드를 제거하는 방법으로서,
    상기 세포 용해물을 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 막 파열 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
19. 세포 용해물로부터 DNA 및/또는 빈 바이러스 캡시드를 선택적으로 침전시키는 방법으로서,
    상기 세포 용해물을 PEI와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.

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