CN118086408A - 一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本申请提供的仿病毒颗粒包括融合蛋白、蛋白酶以及靶向肌肉细胞的膜融合蛋白。本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，通过所含仿病毒颗粒中携带的基因编辑蛋白和靶向肌肉细胞的膜融合蛋白，基因编辑蛋白和膜融合蛋白利用膜融合的方式，使基因编辑蛋白通过携带肌肉细胞膜融合蛋白的仿病毒颗粒递送至肌肉细胞中，实现体内和体外均能直接基因编辑肌肉细胞的目的，从而减少基因编辑的脱靶性和毒副作用，进而能够高效且精准地提高基因编辑肌肉细胞的稳定性、特异性以及靶向性。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
肌肉组织是由肌肉细胞（肌纤维）和特定的蛋白质组成的一种组织类型。其主要组成部分包括肌肉细胞、肌原纤维蛋白、肌肉细胞膜、基底膜和肌肉间质细胞。肌肉细胞是多核的细胞，具有收缩和伸展的能力。肌原纤维蛋白组成了肌肉的收缩和伸展装置，肌肉细胞膜传导神经冲动，基底膜提供结构支持，肌肉间质细胞参与调节肌肉功能。因此肌肉组织在人体中具有重要的意义，它负责产生力量和实现运动，维持身体的姿势和平衡，支持和保护内脏器官，促进血液循环和热量调节，以及参与代谢调节和免疫支持。肌肉组织的缺陷可能导致多种肌肉疾病，如肌营养不良症（DMD）、炎症性肌病、肌肉腱单头肌病、肌肉变性疾病和运动神经元疾病等。这些疾病可能导致肌肉无力、运动障碍、肌肉萎缩、疼痛和功能障碍等症状，严重影响患者的生活质量。
基因编辑肌肉组织可以用于修复或修改肌肉细胞中的基因缺陷，恢复其正常功能，帮助改善肌肉功能、减轻疾病症状，为患者提供更好的生活质量。此外，基因编辑肌肉组织还可以用于研究肌肉生物学和疾病机制，为开发新的治疗方法和药物提供基础，推动肌肉疾病的治疗和预防研究。然而，在小鼠身上有约600多块肌肉组织，而人类身上约有700多块肌肉组织，将基因编辑工具（如CRISPR-Cas9系统）递送到肌肉组织中是一个巨大的挑战。肌肉组织的结构和复杂性使得有效递送基因编辑工具变得困难，需要寻找合适的递送载体和方法。同时，肌肉组织由多种类型的细胞组成，包括肌肉细胞、血管细胞和间质细胞等。在进行基因编辑时，要确保目标细胞特异性，以避免对其他细胞产生意外影响。基因编辑的效率和特异性也是关键问题，要确保在目标基因上进行准确的基因编辑，并使其在大量肌肉细胞中达到高效率，以实现有效的治疗效果，同时也要避免高表达Cas9蛋白导致的细胞损伤和细胞死亡。
如何解决上述问题是实现特异性基因编辑肌肉组织的关键。通过体外向细胞递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体（RNP）能够在实现基因编辑细胞的同时降低脱靶效应以及对细胞的损伤。但是CRISPR-Cas9 RNP直接递送到活体动物或人体内部，需要克服多种生物屏障。仿病毒颗粒（VLP）是一种由病毒外壳蛋白组装而成的纳米颗粒，类似于真实病毒，但不具有感染性，其外壳蛋白可以提供良好的细胞内递送能力，使得基因编辑工具能够有效地进入目标细胞。此外，VLP的结构和组装特性可以提高递送的稳定性和特异性。有研究通过VLP递送CRISPR-Cas9RNP实现了在体内基因编辑肝脏、大脑和眼睛等多个组织和器官，从而治疗多种疾病。但是，现在已有的VLPs难以靶向递送至肌肉组织。
因此目前仍需要开发精确且高效的仿病毒颗粒用以实现靶向肌肉细胞基因编辑来治疗多种肌肉疾病。
发明内容
本申请的目的在于提供一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中无法有效且快速地实现靶向肌肉细胞基因编辑的技术问题。
为了实现上述目的，本申请实施例的技术方案是：
本申请的第一方面提供一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，所述仿病毒颗粒包括基因编辑器融合蛋白、蛋白酶以及靶向肌肉细胞的膜融合蛋白。
结合第一方面优选地，所述基因编辑器融合蛋白包括：a）HIV型结构蛋白Gag；b）核酸可编程DNA结合蛋白或Cre重组酶；c）核定位和核出口序列；d）可裂解接头序列；其中，所述HIV型结构蛋白Gag包含基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白，不包含逆转录酶、蛋白水解酶和整合酶；和/或，所述HIV型结构蛋白Gag包括3个核出口序列（NES），且所述3个NES序列插入Gag核衣壳蛋白的C端；和/或，所述核酸可编程DNA结合蛋白或所述Cre重组酶包括2个核定位序列（NLS），位于N末端的第一NLS和C末端第二NLS。
结合第一方面优选地，所述蛋白酶包括HIV转录酶、HIV蛋白水解酶和HIV整合酶。
结合第一方面优选地，所述靶向肌肉细胞的膜融合蛋白包括膜融合蛋白Myomaker和Myomerger序列；和/或，所述膜融合蛋白Myomaker和Myomerger序列通过T2A连接肽连接。
结合第一方面优选地，所述核酸可编程DNA结合蛋白为Cas9蛋白；和/或，所述可裂解接头序列是HIV蛋白酶切割位点，所述HIV蛋白酶切割位点的氨基酸排列顺序为丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、天门冬酰胺（ASn）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）和所述谷氨酰胺（Gln）；和/或，所述Cas9蛋白与向导RNA结合形成CRISPR Cas9/gRNA复合物。
本申请的第二方面提供一种第一方面所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S101：分别构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒；
S102：瞬时转染S101中的质粒，获得可同时表达所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及可表达所述靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的工程细胞；
S103：利用步骤S102中获得的工程细胞产生携载靶向肌肉细胞的膜融合蛋白、基因编辑器融合蛋白和HIV蛋白酶的仿病毒颗粒，即得到可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
结合第二方面优选地，所述构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒，包括：查询Gag序列、NES序列，并对所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白依次进行连接、合成，以得到所述可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒。
结合第二方面优选地，所述构建可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒，包括：查询所述肌肉细胞的膜融合蛋白序列，并对所述肌肉细胞膜的融合蛋白进行合成、连接，以得到所述可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒。
结合第二方面优选地，所述仿病毒颗粒的平均粒径为102.93-104.07 nm。
本申请的第三方面提供一种第二方面所述方法制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒在治疗肌肉相关疾病药剂中的应用。
与现有技术相比，本申请实施例的优点或有益效果至少包括：
本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，通过所含仿病毒颗粒中携带的基因编辑蛋白和靶向肌肉细胞的膜融合蛋白，利用膜融合的方式，使基因编辑蛋白通过携带肌肉细胞膜融合蛋白的仿病毒颗粒递送至肌肉细胞中，实现体内和体外均能直接基因编辑肌肉细胞的目的，从而减少基因编辑的脱靶性和毒副作用，进而能够高效且精准地提高基因编辑肌肉细胞的稳定性、特异性以及靶向性。
本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，一方面，可以通过静脉注射的方式在体内特异性地基因编辑肌肉细胞，而不会基因编辑其他组织细胞，从而实现修复或修改肌肉细胞中的基因缺陷，使其恢复正常功能；另一方面，通过可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒直接递送核蛋白复合体，使其具备瞬时作用的优势，能够在实现基因编辑细胞的同时降低脱靶效应以及对肌肉细胞的损伤；第三方面，该可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒通过细胞膜融合的方式递送基因编辑工具，其细胞膜具有较低的免疫原性从而减少毒副作用；第四方面，该可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒可以通过携载的CRISPR-Cas9 RNP高效且永久地切除杜氏肌营养不良症突变基因序列，从而恢复肌肉组织中Dystrophin蛋白的表达，显著提高小鼠的抓力和运动能力。
附图说明
图1为本申请实施例提供的Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白示意图；
图2为本申请实施例提供的靶向肌肉细胞的膜融合蛋白示意图；
图3为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备流程图；
图4为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒结构图；
图5为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的粒径分布图；
图6为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的透射电镜图；
图7为本申请实施例提供的WB检测可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒携载靶向肌肉的细胞膜融合蛋白表达的检测结果图；
图8为本申请实施例提供的WB检测纳米操纵子携载基因编辑蛋白表达的检测结果图；
图9为本申请实施例提供的靶向肌肉细胞的膜融合蛋白促进可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒与成肌细胞发生膜融合的检测结果图；
图10为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒与肌肉细胞的融合效率检测结果图；
图11为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒在不同保存温度下的稳定性检测结果图；
图12为本申请实施例提供的激光共聚焦显微镜检测制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒靶向成肌细胞C2C12递送Cas9蛋白的检测结果图；
图13为本申请实施例提供的仿病毒颗粒在体外通过递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体基因编辑切除DMD小鼠成肌细胞基因组突变四号外显子的检测结果图；
图14为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒在体内通过递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体基因编辑切除DMD小鼠肌肉组织基因组突变四号外显子的检测结果图；
图15为本申请实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒恢复DMD小鼠体内抗肌萎缩蛋白表达的检测结果图；
图16为本申请实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒对DMD小鼠抓力的增强效果图；
图17为本申请实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒对DMD小鼠运动能力的改善效果图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请作进一步地详细描述，所描述的实施例不应视为对本申请的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
在以下的描述中，涉及到“一些实施例”，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。除非另有定义，本申请实施例所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请实施例的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本申请实施例所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。
在本实施例以下描述中，术语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”等均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
需要说明的是，本申请实施例中的所有原料/试剂均可在市场上购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备获得；本申请实施例中的术语“和/或”仅用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B表示单独存在A、单独存在B、同时存在A和B的三种情况，其中，A、B可以为单数或复数，字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项（个）”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项（个）”，或，“a，b和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a，b，c，a-b（即a和b），a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例中的数值范围应理解为具体公开该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值和陈述范围内的中间值以及其他任何陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的技术/科学术语具有本申请所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本申请仅描述优选的方法和材料，但在本申请的实施例或测试例中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通常引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本申请书的内容为准。
需要说明的是，本申请实施例中的所有原料和/或试剂均是在市场上购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备获得。
第一方面，本申请实施例提供一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，所述仿病毒颗粒包括基因编辑器融合蛋白、蛋白酶以及靶向肌肉细胞的膜融合蛋白。
具体实施例中，本申请实施例的基因编辑器融合蛋白优选为：a）HIV型结构蛋白Gag；b）核酸可编程DNA结合蛋白或Cre重组酶；c）核定位和核出口序列；d）可裂解接头序列。
其中，HIV型结构蛋白Gag包含基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白，不包含逆转录酶、蛋白水解酶和整合酶。
具体实施例中，本申请实施例的HIV型结构蛋白Gag包括3个核出口序列（NES），且所述3个NES序列插入Gag核衣壳蛋白的C端；
具体实施例中，本申请实施例的核酸可编程DNA结合蛋白或Cre重组酶包括2个核定位序列（NLS），位于N末端的第一NLS和C末端第二NLS。
具体实施例中，本申请实施例的蛋白酶优选为HIV转录酶、HIV蛋白水解酶和HIV整合酶中的一种。
具体实施例中，本申请实施例的靶向肌肉细胞的膜融合蛋白优选为膜融合蛋白Myomaker和Myomerger序列。
具体实施例中，本申请实施例膜融合蛋白Myomaker和Myomerger序列通过T2A连接肽连接。
需要说明的是，本申请实施例中的膜融合蛋白还可以是改造后的原核细胞的人类免疫缺陷病毒、流感病毒HA的膜融合蛋白，以及真核细胞中的线虫细胞中的EFF-1融合蛋白，Hapless 2/Germ cell-specific 1（HAP2/GCS1）、合胞素-1、p14 TF蛋白，以及麻疹病毒的F蛋白和H蛋白等融合蛋白，只要是具有靶向肌肉细胞膜融合蛋白即可，本申请实施例不作具体限制。
具体实施例中，本申请实施例的核酸可编程DNA结合蛋白优选为Cas9蛋白。
具体实施例中，本申请实施例的可裂解接头序列是HIV蛋白酶切割位点， HIV蛋白酶切割位点的氨基酸排列顺序优选为丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、天门冬酰胺（ASn）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）和谷氨酰胺（Gln）。
具体实施例中，本申请实施例的Cas9蛋白与向导RNA结合形成CRISPR Cas9/gRNA复合物。
本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，通过所含仿病毒颗粒中携带的基因编辑蛋白和靶向肌肉细胞的膜融合蛋白，利用膜融合的方式，使基因编辑蛋白通过携带肌肉细胞膜融合蛋白的仿病毒颗粒递送至肌肉细胞中，实现体内和体外均能直接基因编辑肌肉细胞的目的，从而减少基因编辑的脱靶性和毒副作用，进而能够高效且精准地提高基因编辑肌肉细胞的稳定性、特异性以及靶向性。
第二方面，本申请实施例提供一种第一方面所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，该制备方法包括：
S101：分别构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒；
S102：瞬时转染S101中的质粒，获得可同时表达所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及可表达所述靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的工程细胞；
S103：利用步骤S102中获得的工程细胞产生携载靶向肌肉细胞的膜融合蛋白、基因编辑器融合蛋白和HIV蛋白酶的仿病毒颗粒，即得到可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
具体实施例中，本申请实施例的构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒时，优选为查询Gag序列、NES序列，并对所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白依次进行连接、合成，以得到所述可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒。
具体实施例中，本申请实施例的构建可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒时，优选为查询所述肌肉细胞的膜融合蛋白序列，并对所述肌肉细胞膜的融合蛋白进行合成、连接，以得到所述可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒。
在具体实施例中，仿病毒颗粒的制备方法优选为：收集工程化细胞上清，4 ℃的温度下1000 g离心10 min，收集上清并过0.45 μm滤膜；加入1-2 ml 20%蔗糖溶液，4 ℃的温度下110000 g离心2 h；弃去上清，并用PBS重悬，4 ℃的温度下1000 g离心5 min，取上清后得到仿病毒颗粒，即为可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
具体实施例中，本申请实施例的仿病毒颗粒的平均粒径优选为102.93-104.07nm。
第三方面，本申请实施例提供一种第二方面所述方法制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒在治疗肌肉相关疾病药剂中的应用。
本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，一方面，可以通过静脉注射的方式在体内特异性地基因编辑肌肉细胞，而不会基因编辑其他组织细胞，从而实现修复或修改肌肉细胞中的基因缺陷，使其恢复正常功能；另一方面，通过可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒直接递送核蛋白复合体，使其具备瞬时作用的优势，能够在实现基因编辑细胞的同时降低脱靶效应以及对肌肉细胞的损伤。
下面将结合具体实施例对本申请的技术方法作进一步地阐述。
实施例中所用原料及其来源包括：
0.25%的胰蛋白酶、细胞培养基、胎牛血清：美国Gibco公司；
RIPA细胞裂解液：上海碧云天生物技术有限公司；
牛血清白蛋白（BSA）：上海生工生物工程有限公司；
低熔点琼脂糖：广州擎科生物科技有限公司；
Gel red：广州擎科生物科技有限公司；
二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）：上海沪试实验室器材股份有限公司；
4%多聚甲醛：合肥Biosharp公司；
DAPI：上海生工生物工程股份有限公司；
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺：上海生工生物工程有限公司；
Tris缓冲液：美国Sigma-Aldrich公司；
浓盐酸：上海国药集团化学试剂有限公学司；
过硫酸铵（Ammonium persulfate，APS）：美国，Sigma-Aldrich公司；
丙烯酰胺：上海生工生物工程有限公司；
四甲基乙二胺（TEMED）：美国Sigma-Aldrich公司；
甘油、溴酚蓝：上海生工生物工程有限公司；
Tween-20：美国Sigma-Aldrich公司；
胰蛋白胨（Tryptone）：上海生工生物工程有限公司；
酵母提取物（Yeast extract）：上海生工生物工程有限公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒：美国Thermo公司；
ECL显色系统Western Blot底物试剂盒：美国Pierce公司；
Triton X-100：上海生工生物工程有限公司。
实施例中所用仪器型号及其来源：
12色流式细胞仪：美国BD公司，FACSCelesta；
动态光散射仪：英国Malvern公司，Zetasizer Nano ZSE；
微量分光光度计：美国ThermoFisher Scientific公司，Nanodrop one；
PCR仪：美国ThermoFisher Scientific公司，2720 Thermal Cycler；
超纯水处理装置：美国Merck公司，Millipore Milli-Q Direct；
激光共聚焦扫描显微镜：德国卡尔蔡司公司，LSM 880 with Airyscan；
小型高速离心机：德国Eppendorf公司，Microfuge 20R；
二氧化碳细胞培养箱：美国Thermo公司，3111；
电泳仪：中国上海天能科技有限公司，EPS-300；
垂直电泳槽：中国上海天能科技有限公司，VE-180；
全自动轮转式切片机：德国Leica公司，RM2255；
酶标仪：美国BioTek公司，800TS；
倒置荧光显微镜：日本Nikon公司，TS2；
pH计：瑞士Mettler Toledo公司，FE28-Standard；
石蜡包埋机：德国Leica公司，Arcadia；
全密闭自动脱水机：德国Leica公司，ASP200S；
数字病理扫描系统：德国Leica公司，Aperio CS2；
超净工作台：苏净安泰，SW-CJ-1FD；
超低温冰箱：美国Thermo公司，995；
-25℃立式低温保存箱：中科美菱，DW-LY270；
电子天平：梅特勒，ME204E。
实施例1
本实施例1提供一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，具体步骤如下：
S101：分别构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒：
S1011：构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒（即pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS），具体包括：
首先从国家生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）上查找Gag蛋白和NES出核信号的序列；其次，将Gag蛋白（即图1中的Gagprotein）、3×NES序列和HIV蛋白酶切割位点Prot与NLS-Cas9-NLS连接以实现Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的共表达，即得设计好的Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS蛋白序列，该Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS蛋白序列为图1所示。图1为本申请实施例提供的Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白示意图。
需要说明的是，将查询好的3×NES-Prot序列进行合成，并在序列两端添加NcoI和AvrII两个酶切位点。
将合成且包含3×NES-Prot序列通过NcoI和AvrII双酶切，得到3×NES-Prot序列；从psPAX2慢病毒包装质粒中PCR（聚合酶链式反应）得到Gag蛋白序列，并用AgeI和NcoI双酶切；通过Overlap PCR连接Gag和3×NES-Prot，得到Gag-3×NES-Prot序列；再用引物扩增出Prot序列；通过AgeI/AvrII双酶切pX458载体；将线性pX458载体与Gag-3×NES-Prot序列用T4连接酶连接，室温30 min，随后转化入DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增并保存。测序验证其序列，正确的质粒命名为pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS。
S1012：构建可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶（即pCMV-Gag-Prot-Pol），具体包括：
首先从国家生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）上查找Gag蛋白和HIV蛋白酶（Pol）的序列；其次，将Gag蛋白、HIV蛋白酶切割位点Prot与HIV蛋白酶（Pol）以实现Gag-可裂解接头序列-蛋白酶的共表达，即得设计好的Gag-Prot-Pol蛋白序列。
需要说明的是，将查询好的Gag蛋白和HIV蛋白酶（Pol）基因序列进行合成。
在本申请中，Gag蛋白和HIV蛋白酶（Pol）的基因序列直接合成构建进pCMV载体上，随后转化入DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增并保存。测序验证其序列，正确的质粒命名为pCMV-Gag-Prot-Pol。
S1013：构建可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒，具体包括：
首先从NCBI上查找Myomaker蛋白与Myomerger蛋白的基因序列；其次，通过T2A自剪切肽序列将Myomaker蛋白（即图2中的Myomaker protein）与Myomerger蛋白（即图2中的Myomerger protein）连接，以实现两种蛋白的共表达，即得设计好的靶向肌肉细胞的膜融合蛋白序列，包括Myomaker和Myomerger两种靶向肌肉细胞的膜融合蛋白序列，该靶向肌肉细胞的膜融合蛋白序列为图2所示。图2为本申请实施例提供的靶向肌肉细胞的膜融合蛋白示意图。
需要说明的是，将查询好的Myomaker蛋白与Myomerger蛋白的基因序列进行合成。
在本申请中，Myomaker蛋白与Myomerger蛋白的基因序列直接合成构建进pCMV载体上，随后转化入DH5α感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增并保存。测序验证其序列，正确的质粒命名为pCMV-Myomaker-T2A-Myomerger。
S102：瞬时转染S101中的质粒，获得可同时表达所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及可表达所述靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的工程细胞，具体包括：将pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS、包膜质粒pCMV-Myomaker-T2A-Myomerger和pCMV-Gag-Prot-Pol共转染HEK293T细胞，包装得到仿病毒颗粒。
S103：制备可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9
请参阅图3所示，图3为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备流程图。其中，HEK 293T Cell为人胚肾细胞。该可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法具体包括：收集工程化细胞上清，4 ℃的温度下1000 g离心10min，收集上清并过0.45 μm滤膜；加入1-2 ml 20%蔗糖溶液，4 ℃的温度下110000 g离心2h；弃去上清，并用PBS重悬，4 ℃的温度下1000 g离心5 min，取上清后得到仿病毒颗粒，即得可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，记为FuVLPCas9，其结构图如图4所示。图4为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒结构图。
为了验证实施例1制备的可实现靶向编辑肌肉的仿病毒颗粒FuVLPCas9的相关性能，对可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9的相关生物性能进行了相关表征，包括以下几方面：
1）本实施例对制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9进行了表征，具体为：
将可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9用PBS缓冲液稀释后，用动态光散射仪（Dynamic light scattering，DLS）进行粒径分布以及透射电镜进行形貌颗粒表征，其表征结果如图5至图6所示。图5为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的粒径分布图。图6为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的透射电镜图。
根据图5可以看出，可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9的粒径约为102.93-104.07 nm，粒径分布均一。
根据图6可以看出，可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9是一个膜结构的球状颗粒，其粒径约为90 nm左右。
2）本实施例通过蛋白质免疫印迹（WB）检测仿病毒颗粒上携载有靶向肌肉细胞的膜融合蛋白（Myomaker蛋白与Myomerger蛋白）和Cas9蛋白，具体为：
将制备成的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9通过RIPA裂解液重悬后，室温下持续震荡1 min，冰上放置5 min，重复4次，完全裂解仿病毒颗粒，得到含有仿病毒颗粒的溶液。对于可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9，在WB中通过抗体检测靶向肌肉细胞膜融合蛋白的表达，以及用抗体检测Cas9蛋白的表达，检测结果为图7至图8所示。WB检测中，内参蛋白为Gag（p55+p24+p17）。图7为本申请实施例提供的WB检测可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒携载靶向肌肉的细胞膜融合蛋白表达的检测结果图。图8为本申请实施例提供的WB检测可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒携载Cas9蛋白表达的检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图7和图8可以看出，本申请实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒能够有效携载靶向肌肉细胞的膜融合蛋白和Cas9蛋白。
3）仿病毒颗粒（FuVLPCas9）与成肌细胞膜融合效率检测，具体为：
取8×1010个FuVLPCas9和携带基因编辑器蛋白的仿病毒颗粒VLPCas9，并使用膜染料细胞膜红色荧光探针（DiI）标记，然后与成肌细胞共孵育10 h。使用PBS清洗成肌细胞后，用DAPI标记细胞核，用激光共聚焦显微镜能观察DiI在成肌细胞表面的分布情况，其结果为图9所示。图9为本申请实施例提供的靶向肌肉细胞的膜融合蛋白促进可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒与成肌细胞发生膜融合的检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图9可以看出，在FuVLPCas9组，用激光共聚焦显微镜能够观察到DiI分布在成肌细胞表面，而携带基因编辑器蛋白的仿病毒颗粒VLPCas9组则没有观察到显著的成肌细胞表面有DiI分子，说明靶向肌肉细胞的膜融合蛋白能够促进仿病毒颗粒与成肌细胞的膜融合。
进一步地，用流式细胞仪检测FuVLPCas9和成肌细胞的膜融合效率，其结果为图10所示。图10为本申请实施例提供的仿病毒颗粒与成肌细胞的融合效率检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
需要说明的是，本申请采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，对实验数据进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验（t检验）。p值<0.05为有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，数据表示为平均值±SD。
根据图10可以看出，与VLPCas9和FuVLPCas9发生融合的C2C12细胞比例分别约为17.6%和69.6%。
4）检测FuVLPCas9保存的稳定性，具体为：
将制备好的FuVLPCas9分别放置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存，并在2、4、6、8、10天等时间点取样检测FuVLPCas9粒径，通过粒径变化判断FuVLPCas9的稳定性，检测结果为图11所示。图11为本申请实施例提供的仿病毒颗粒在不同保存温度下的稳定性检测结果图。
根据图11可以看出，在4 ℃和-20 ℃下保存的FuVLPCas9在长期存放后，粒径出现明显变化，而在-80 ℃长期存放则没有观察到粒径的明显变化。因此，-80 ℃是FuVLPCas9适合保存温度条件。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
应用例1
1）FuVLPCas9体外靶向肌肉细胞递送Cas9蛋白
使用可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白质粒（pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS）、可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白Myomaker和Myomerger包膜质粒（pCMV-Myomaker-T2A-Myomerger）和可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶质粒（pCMV-Gag-Prot-Pol）共转染HEK293T细胞，包装得到仿病毒颗粒FuVLPCas9（8×1010）；使用pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS和pCMV-Gag-Prot-Pol质粒共转染HEK293T细胞，包装得到不携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒VLPCas9（8×1010）；与成肌细胞C2C12、小鼠树突状细胞DC2.4、小鼠皮下结缔组织细胞A9、小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7共孵育24 h，用鬼笔环肽Phalloidin-Alexa Fluor488标记细胞骨架，用DAPI标记细胞核，用APC-Cas9抗体标记细胞中的Cas9蛋白，并用激光共聚焦显微镜检测FuVLPCas9靶向成肌细胞C2C12递送Cas9蛋白，结果如图12所示。图12为本申请实施例提供的仿病毒颗粒靶向成肌细胞C2C12递送Cas9蛋白的检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图12可以看出，FuVLPCas9与不同细胞共孵育后再培养24 h，能在成肌细胞C2C12中观察到Cas9蛋白的存在，在非靶细胞：小鼠树突状细胞DC2.4、小鼠皮下结缔组织细胞A9、小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7中则没有观察到Cas9蛋白的存在，而未携载Myomaker蛋白与Myomerger蛋白的颗粒VLPCas9与不同细胞共孵育后，均未观察到Cas9蛋白的存在。这证明了携载Myomaker蛋白与Myomerger蛋白的FuVLPCas9能够将Cas9蛋白通过膜融合的方式递送至成肌细胞内。
2）FuVLPCas9在体外通过CRISPR/Cas9实现外显子跳跃
使用可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白质粒（pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS）、可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白Myomaker和Myomerger包膜质粒（pCMV-Myomaker-T2A-Myomerger）和可表达Gag-可裂解接头序列-蛋白酶质粒（pCMV-Gag-Prot-Pol）共转染HEK293T细胞，包装得到仿病毒颗粒FuVLPCas9（8×1010），使用pX458-Gag-3×NES-Prot-NLS-Cas9-NLS和pCMV-Gag-Prot-Pol质粒共转染HEK293T细胞，包装得到不携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒VLPCas9（8×1010）；与DMD（DMD基因四号外显子突变的肌营养不良症）小鼠骨骼肌原代细胞共孵育72 h后，收集细胞使用基因组DNA小量抽提试剂盒提取基因组DNA，通过PCR扩增目标基因组区域。这里，PCR条件为：98 ℃变性10 s；63 ℃退火15 s；72 ℃延伸1 min；持续35个循环。检测FuVLPCas9在成肌细胞中切除四号外显子以实现突变外显子的跳跃，结果如图13所示。图13为本申请实施例提供的仿病毒颗粒FuVLPCas9在体外通过递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体基因编辑切除DMD小鼠成肌细胞基因组突变四号外显子的检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图13可以看出，与FuVLPCas9共孵育后的DMD小鼠骨骼肌原代细胞基因组中的四号外显子被切除，而在PBS、仿病毒颗粒VLP、携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒FuVLP和VLPCas9组的基因组PCR中未检测到四号外显子的切除。
需要说明的是，未经编辑的基因组产物为883 bp，基因编辑产物为445 bp。证明FuVLPCas9在体外通过递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体基因编辑切除DMD小鼠成肌细胞基因组突变四号外显子，实现外显子跳跃。
3）FuVLPCas9在体内通过CRISPR/Cas9实现外显子跳跃
将DMD小鼠随机分成5组，每组5只，分别尾静脉注射PBS、VLP、FuVLP、VLPCas9、FuVLPCas9（仿病毒颗粒的注射剂量为2.4×1013/kg）。每七天给药一次，一共给药四次。治疗过程中，每周检测小鼠体重变化。在第五周后收集小鼠血液、脏器（心、肝、脾、肺、肾）和肌肉（胫骨前肌、腓肠肌、三头肌、四头肌、膈肌）。取25 mg的组织，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，使用上述基因组DNA小量抽提试剂盒提取组织中总DNA，加入180 μL样品裂解液和20μL蛋白酶K，涡旋混匀，55 ℃水浴孵育至完全裂解；涡旋15 s后加入200 μL样品裂解液B，涡旋混匀；70 ℃孵育10min，加入200 μL无水乙醇，涡旋混匀；把混合物加入到DNA纯化柱内，8000 rpm离心1 min，倒弃废液收集管内液体；加入500 μL洗涤液I，8000 rpm离心1 min，倒弃废液收集管内液体；加入600 μL洗涤液II，12000 rpm离心1 min，倒弃废液收集管内液体；12000 rpm离心1 min，将DNA纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管上，加入50 μL洗脱液。室温放置1-3 min，12000rpm离心1 min，所得液体即为纯化得到的总DNA。通过PCR扩增目标基因组区域，PCR条件为：98 ℃变性10 s；63 ℃退火15 s；72 ℃延伸1 min；持续35个循环。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，并使用PCR Purification Kit从PCR产物中纯化，用于直接测序。图14为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9在体内通过递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体基因编辑切除DMD小鼠肌肉组织基因组突变四号外显子的检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图14可以看出，尾静脉注射FuVLPCas9，在小鼠的胫骨前肌、腓肠肌、三头肌、四头肌、膈肌中能检测到四号外显子被切除，而在PBS、VLP、FuVLP和VLPCas9组的肌肉中未检测到四号外显子的切除。
需要说明的是，未经编辑的基因组产物为883 bp，基因编辑产物为445 bp。这证明了FuVLPCas9可以在体内通过递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体基因编辑切除DMD小鼠肌肉组织基因组突变四号外显子，实现外显子跳跃。
4）FuVLPCas9恢复DMD小鼠抗肌萎缩蛋白的表达
将DMD小鼠随机分成5组，每组5只，分别尾静脉注射PBS、VLP、FuVLP、VLPCas9、FuVLPCas9（仿病毒颗粒的注射剂量为2.4×1013/kg）。每七天给药一次，一共给药四次。治疗过程中，每周检测小鼠体重变化。在第五周后收集小鼠血液、脏器（心、肝、脾、肺、肾）和肌肉（胫骨前肌、腓肠肌、三头肌、四头肌、膈肌）。将组织块放在圆底的5 mL Ep管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，每5 mg组织中加入约300 μL预冷的RIPA裂解液，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 h，4 ℃离心12000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本。使用BCA蛋白检测试剂盒（Thermo）测量样品的蛋白浓度。将来自每个肌肉样品的10 μg蛋白加到梯度SDS-PAGE上，160 V恒压电泳60 min，将分离的蛋白质在低温条件下以300 mA恒流5 h转移至PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭1 h，将封闭好的膜与Dystrophin抗体在4℃下孵育过夜，再用PBST洗涤，最后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG二抗在室温下孵育45min。用PBST洗涤后，将印迹暴露于Western BlottingLuminol Reagent中以检测信号。同时，通过抗GAPDH抗体监测蛋白上样量。图15为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9恢复DMD小鼠体内抗肌萎缩蛋白表达的检测结果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图15可以看出，尾静脉注射FuVLPCas9，在小鼠的胫骨前肌、腓肠肌、三头肌、四头肌、膈肌中能检测到抗肌萎缩蛋白，而在PBS、VLP、FuVLP和VLPCas9组的肌肉中未检测到，该实验结果证明通过尾静脉注射FuVLPCas9可以在体内恢复抗肌萎缩蛋白的表达。
5）FuVLPCas9用于小鼠肌营养不良症的治疗
将DMD小鼠随机分成5组，每组5只，分别尾静脉注射PBS、VLP、FuVLP、VLPCas9、FuVLPCas9（仿病毒颗粒的注射剂量为2.4×1013/kg）。每七天给药一次，一共给药四次。在第五周后，利用大小鼠抓力仪检测每组小鼠上肢的抓力情况。再利用小动物跑步机检测小鼠的跑步力竭时间，以此来检测注射FuVLPCas9对DMD小鼠运动能力的改善。其中，小动物跑步机的参数为：初始速度：5 m/min，5 min后以1m/min的加速度加速直至跑步力竭，刺激电流为0.8 mA，耐受时间为4 s。图16为本申请实施例提供的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒FuVLPCas9对DMD小鼠抓力的增强效果图。图17为本申请实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒对DMD小鼠运动能力的改善效果图。其中，VLP为空白对照组，即仿病毒颗粒；FuVLP为携带靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的仿病毒颗粒；VLPCas9为携带基因编辑蛋白的仿病毒颗粒；FuVLPCas9为实施例制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
根据图16可以看出，尾静脉注射FuVLPCas9后，能够显著增强DMD小鼠的上肢抓力，而在VLP、FuVLP和VLPCas9组的DMD小鼠的上肢抓力与PBS组DMD小鼠之间没有显著差异。
根据图17可以看出，尾静脉注射FuVLPCas9后，能够显著增长DMD小鼠的跑步力竭时间，而在VLP、FuVLP和VLPCas9组的DMD小鼠的跑步力竭时间与PBS组DMD小鼠之间没有显著差异。以上实验结果证明通过尾静脉注射FuVLPCas9可以增强DMD小鼠的上肢抓力，也能显著增长DMD小鼠的跑步力竭时间，证明了FuVLPCas9具备治疗杜氏肌营养不良症的能力。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，其特征在于，所述仿病毒颗粒包括基因编辑器融合蛋白、蛋白酶以及靶向肌肉细胞的膜融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，其特征在于，所述基因编辑器融合蛋白包括：a）HIV型结构蛋白Gag；b）核酸可编程DNA结合蛋白或Cre重组酶；c）核定位和核出口序列；d）可裂解接头序列；
其中，所述HIV型结构蛋白Gag包含基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白，不包含逆转录酶、蛋白水解酶和整合酶；
和/或，所述HIV型结构蛋白Gag包括3个核出口序列（NES），且所述3个NES序列插入Gag核衣壳蛋白的C端；
和/或，所述核酸可编程DNA结合蛋白或所述Cre重组酶包括2个核定位序列（NLS），位于N末端的第一NLS和C末端第二NLS。
3.根据权利要求1所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，其特征在于，所述蛋白酶包括HIV转录酶、HIV蛋白水解酶和HIV整合酶。
4.根据权利要求1所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，其特征在于，所述靶向肌肉细胞的膜融合蛋白包括膜融合蛋白Myomaker和Myomerger序列；
和/或，所述膜融合蛋白Myomaker和Myomerger序列通过T2A连接肽连接。
5.根据权利要求2所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒，其特征在于，所述核酸可编程DNA结合蛋白为Cas9蛋白；
和/或，所述可裂解接头序列是HIV蛋白酶切割位点，所述HIV蛋白酶切割位点的氨基酸排列顺序为丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、天门冬酰胺（ASn）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）和所述谷氨酰胺（Gln）；
和/或，所述Cas9蛋白与向导RNA结合形成CRISPR Cas9/gRNA复合物。
6.一种权利要求1-5任一所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101：分别构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒；
S102：瞬时转染S101中的质粒，获得同时可表达所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白、所述Gag-可裂解接头序列-蛋白酶以及所述靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的工程细胞；
S103：利用步骤S102中获得的所述工程细胞产生携载靶向肌肉细胞的膜融合蛋白、基因编辑器融合蛋白和HIV蛋白酶的仿病毒颗粒，即得到可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒。
7.根据权利要求6所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，其特征在于，所述构建可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒，包括：
查询Gag序列、NES序列，并对所述Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白依次进行连接、合成，以得到所述可表达Gag-可裂解接头序列-基因编辑器融合蛋白的质粒。
8.根据权利要求6所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，其特征在于，所述构建可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒，包括：
查询所述肌肉细胞的膜融合蛋白序列，并对所述肌肉细胞膜的融合蛋白进行合成、连接，以得到所述可表达靶向肌肉细胞的膜融合蛋白的质粒。
9.根据权利要求6所述的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒的制备方法，其特征在于，所述仿病毒颗粒的平均粒径为102.93-104.07 nm。
10.一种权利要求6-9任一所述方法制备的可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒在治疗肌肉相关疾病药剂中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410501161.2A CN118086408A (zh) | 2024-04-25 | 2024-04-25 | 一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410501161.2A CN118086408A (zh) | 2024-04-25 | 2024-04-25 | 一种可实现靶向肌肉细胞基因编辑的仿病毒颗粒及其制备方法和应用 |
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Family Applications (1)
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