JP2022551931A - 改変エンドヌクレアーゼおよび関連方法 - Google Patents

Abstract

オフターゲット活性が減少しているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどの改変エンドヌクレアーゼを産生するための組成物および方法が提供される。改変エンドヌクレアーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチドを編集する方法も開示される。一態様では、本開示は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに共有結合している１つまたは複数の混合電荷部分を含み、それぞれの混合電荷部分が約１０～約４００の正電荷部分および約１０～約４００の負電荷部分を含み、負電荷部分の数に対する正電荷部分の数の比が約１：０．５～約１：２である、改変エンドヌクレアーゼを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１１日に提出の米国特許仮出願第６２／９１３，９１６号の利益を主張するものであり、前記特許文献の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表に関する声明
本出願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、それによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は７２９６８＿ＳＥＱ＿ｆｉｎａｌ－２０２０－１０－７．ｔｘｔである。テキストファイルサイズは２７．２ＫＢであり２０２０年１０月７日に作成され、明細書のとじ込みと一緒にＥＦＳ－Ｗｅｂを経て提出されている。

政府のライセンス権の声明
本発明は、国立衛生研究所より授与された、認可番号Ｒ２１ ＧＭ１２８００４の下で政府支援により行われた。政府は本発明にある種の権利を有する。

発明の背景
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、種々の生物および細胞型でのゲノム編集用に広く使用されているツールである。不運なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、オンターゲット配列に似ているオフターゲット部位で望ましくない突然変異も引き起こすことがある。オフターゲット突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰによるＤＮＡ配列の非特異的認識により引き起こされる。Ｃａｓ９は、最適ＰＡＭ配列５’－ＮＧＧ－３’の他にも５’－ＮＡＧ－３’または５’－ＮＧＡ－３’ ＰＡＭを有する部位も切断することができるが、切断はそれほど効率的ではないことは実証されている。さらに、２０ｎｔのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｓｇＲＮＡを有する３～５もの塩基対ミスマッチを宿すＤＮＡ配列を認識することができ、ヒトゲノムには所与のヌクレアーゼに対する最大何千もの考えられる結合部位が存在することを示唆している。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＲＮＡガイド鎖と比べて数個の余分な塩基（「ＤＮＡバルジ」）または数個のミッシング塩基（「ＲＮＡバルジ」）を含有するＤＮＡ配列でのオフターゲット切断を誘導することができる。オフターゲットＤＮＡ切断は意図されないゲノム遺伝子座に突然変異ならびに欠失、逆位、および転座などの大規模染色体再編を生じることができる。望ましくない部位でのこれらの突然変異は、腫瘍抑制遺伝子の能力をなくすまたは発がん遺伝子を活性化させる場合がある。転座は、慢性骨髄性白血病の考えられる原因であることが知られてきた。

これらのオフターゲット効果を妨げる、回避する、または少なくとも減らすことは、いかなる下流ゲノム編集応用の成功にとって極めて重大である。一般に使用されているＣａｓ９ヌクレアーゼのゲノム全体でのオフターゲット突然変異を減らすための種々の戦略、例えば、標的相補性の短縮領域を保有する切詰めｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９突然変異体、対になったＣａｓ９ニッカーゼ、および非特異的ＦｏｋＩヌクレアーゼに対して触媒的に不活性なＣａｓ９の二量体融合物が開発されてきた。しかし、これらのアプローチは、部分的にしか効果的ではないおよび／またはさらに多くのオフターゲット部位を作り出す可能性を有する。さらに、これらのアプローチは、複数のｓｇＲＮＡの発現および／またはＣａｓ９への追加の機能的ドメインの融合も必要とする場合があり、このせいでターゲティング範囲が減少し、核酸のペイロードサイズが限られているウイルスベクターを使用する送達に難問を生じることがある。

従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのオフターゲット効果を減少させることができる単純で頑強な戦略およびオフターゲット効果が減少しているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの必要性が残っている。

概要
本概要は、下の詳細な説明においてさらに記載される単純化された形での概念の選択を導入するために提供される。本概要は、特許請求されている主題のキーとなる特長を特定することを意図されておらず、特許請求されている主題の範囲を決定する補助として使用されることも意図されていない。

一態様では、本開示は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに共有結合している１つまたは複数の混合電荷部分を含み、それぞれの混合電荷部分が約１０～約４００の正電荷部分および約１０～約４００の負電荷部分を含み、負電荷部分の数に対する正電荷部分の数の比が約１：０．５～約１：２である、改変エンドヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約７．４のｐＨで実質的に電子的に中性である。

一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、核酸ガイドヌクレアーゼシステムタンパク質である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－関連（Ｃａｓ）タンパク質、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはその突然変異体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、またはその突然変異体もしくはバリアントである。

一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて活性であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比べて減少したオフターゲット編集活性および維持されたオンターゲット編集活性を示す。一部の実施形態では、オフターゲット編集活性は、非改変エンドヌクレアーゼと比べて、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少している。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、エンドヌクレアーゼのアミノ酸の側鎖に、エンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ基に、および／またはエンドヌクレアーゼのＣ末端カルボキシル基に共有結合している。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、約２ｋＤａ～約１３０ｋＤａの分子量を有するペプチドである。

一部の実施形態では、改変エンドヌクレアーゼは融合タンパク質であり、混合電荷部分は、
ａ）複数の負電荷アミノ酸、
ｂ）複数の正電荷アミノ酸、および
ｃ）任意選択で、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される複数の追加のアミノ酸
からなり、
負電荷アミノ酸の数に対する正電荷アミノ酸の数の比は約１：０．５～約１：２である混合電荷ドメインである。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインはランダム配列を含む。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、配列（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３）_ｎを含み、Ｘ１は正電荷アミノ酸であり、Ｘ２は負電荷アミノ酸であり、Ｘ３は何もないまたはプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される追加のアミノ酸であり、ｎは約５～約５０の整数である。

一部の実施形態では、複数の負電荷アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびその誘導体からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、複数の正電荷アミノ酸は、リシン、ヒスチジン、アルギニン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは複数の追加のアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、複数の正電荷アミノ酸はリシンであり、複数の負電荷アミノ酸はグルタミン酸である。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のリシンならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のヒスチジンならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む。一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は、プロリン、セリン、およびグリシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は、複数のプロリンである。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のリシン、複数のグルタミン酸、および複数のプロリンを含む。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、約２ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、およびポリ（トリメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリマーはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）である。

別の態様では、本開示は、本明細書で開示される改変エンドヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸を提供する。

別の態様では、本開示は、本開示の核酸およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを提供する。

別の態様では、本開示は、本開示の核酸または発現ベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は原核細胞または真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は細胞培養物中にある。一部の実施形態では、細胞は生物中にある。

別の態様では、本開示は、細胞においてまたは対象においてポリヌクレオチドを編集するための方法であって、本開示の少なくとも１つの改変エンドヌクレアーゼ、核酸、または発現ベクターを細胞または対象中に導入するステップを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は改変エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

前述の態様および本発明の付随する利点の多くは、添付図面と併せて解釈して以下の詳細な説明を参照することにより、これらのことがもっとよく理解されるようになるに従ってもっと容易に認識されるようになる。

図１Ａは、ＧＦＰ破壊アッセイおよびＧＦＰ遺伝子で使用される標的部位の模式的概要図である。 図１Ｂは、天然のＣａｓ９および例示的な改変Ｃａｓ９（ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲート）により媒介されるＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞でのＧＦＰ破壊の効率を示す図である。 図１Ｃは、ＧＦＰ破壊アッセイにおける天然のＣａｓ９および１つ、２つ、または３つのヌクレオチド突然変異を宿すミスマッチｓｇＲＮＡを有するｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートのオフターゲット編集効率を示す図である。 図２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのオフターゲット効率を減少させる際のｐＣＢコンジュゲーションの機構の模式図である。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体は、その標的ＤＮＡ部位の最適認識に必要なエネルギーよりも多くのエネルギーを有し、ミスマッチオフターゲット部位の切断をもたらす。ｐＣＢポリマーコンジュゲーションは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体と二本鎖ＤＮＡの間の非特異的結合を取り除き、それによって結合エネルギーを減少させる。残されたエネルギーは、オンターゲット結合には十分強力であるが、ミスマッチ結合には十分ではない。 図３Ａ～３Ｃは、ＶＥＧＦ（３Ａ）、ＥＭＸ（３Ｂ）およびＣＬＴＡ（３Ｃ）遺伝子座を標的にする場合のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのオンターゲットおよびオフターゲット配列を示している。 図３Ａ～３Ｃは、ＶＥＧＦ（３Ａ）、ＥＭＸ（３Ｂ）およびＣＬＴＡ（３Ｃ）遺伝子座を標的にする場合のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのオンターゲットおよびオフターゲット配列を示している。 図３Ａ～３Ｃは、ＶＥＧＦ（３Ａ）、ＥＭＸ（３Ｂ）およびＣＬＴＡ（３Ｃ）遺伝子座を標的にする場合のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのオンターゲットおよびオフターゲット配列を示している。 図３Ｄ～３Ｆは、３種の異なる細胞株ＨＥＫ２９３（３Ｄ）、Ｕ２ＯＳ（３Ｅ）およびＫ５６２（３Ｆ）においてＶＥＧＦ（上）、ＥＭＸ（中間）およびＣＬＴＡ（下）を標的にする場合の天然のＣａｓ９およびｐＣＢ－Ｃａｓ９から生じるオンターゲットおよびオフターゲットＤＮＡ編集効率を示す図である。 図３Ｄ～３Ｆは、３種の異なる細胞株ＨＥＫ２９３（３Ｄ）、Ｕ２ＯＳ（３Ｅ）およびＫ５６２（３Ｆ）においてＶＥＧＦ（上）、ＥＭＸ（中間）およびＣＬＴＡ（下）を標的にする場合の天然のＣａｓ９およびｐＣＢ－Ｃａｓ９から生じるオンターゲットおよびオフターゲットＤＮＡ編集効率を示す図である。 図３Ｄ～３Ｆは、３種の異なる細胞株ＨＥＫ２９３（３Ｄ）、Ｕ２ＯＳ（３Ｅ）およびＫ５６２（３Ｆ）においてＶＥＧＦ（上）、ＥＭＸ（中間）およびＣＬＴＡ（下）を標的にする場合の天然のＣａｓ９およびｐＣＢ－Ｃａｓ９から生じるオンターゲットおよびオフターゲットＤＮＡ編集効率を示す図である。 図４は、例示的なｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートの調製のために使用される合成経路を示す図である。 図５は、天然Ｃａおよび例示的なｐＣＢ_１０－Ｃａｓ９、ｐＣＢ_２０－Ｃａｓ９、ｐＣＢ_５０－Ｃａｓ９コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラムである。 図６Ａおよび６Ｂは、天然Ｃａｓ９（６Ａ）およびｐＣＢ－Ｃａｓ９（６Ｂ）についての例示的な最適ｓｇＲＮＡ対タンパク質比を示す図である。実験はすべて、１１０μｌの容積を使用する９６ウェルプレートで実施した。 図６Ａおよび６Ｂは、天然Ｃａｓ９（６Ａ）およびｐＣＢ－Ｃａｓ９（６Ｂ）についての例示的な最適ｓｇＲＮＡ対タンパク質比を示す図である。実験はすべて、１１０μｌの容積を使用する９６ウェルプレートで実施した。 図７Ａおよび７Ｂは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ（７Ａ）およびｐＣＢ－Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ（７Ｂ）の送達効率および細胞傷害性に対するＣＲＩＳＰＲＭＡＸ投与の効果を示す図である。 図７Ａおよび７Ｂは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ（７Ａ）およびｐＣＢ－Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ（７Ｂ）の送達効率および細胞傷害性に対するＣＲＩＳＰＲＭＡＸ投与の効果を示す図である。 図８Ａ～８Ｃは、例示的な改変Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－（ＥＫ）ｎ）をコードする発現プラスミドの構築を示す図である。 図８Ａ～８Ｃは、例示的な改変Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－（ＥＫ）ｎ）をコードする発現プラスミドの構築を示す図である。 図８Ａ～８Ｃは、例示的な改変Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－（ＥＫ）ｎ）をコードする発現プラスミドの構築を示す図である。 図９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＣａｓ９およびＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡプレ－およびポスト－ポリアデニル化のゲル電気泳動図である。 図１０は、市販のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび実験室調製Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを使用するＣａｓ９の遺伝子編集効率のグラフである。 図１１Ａ～１１Ｃは、ＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞における標的部位ＧＦＰ（１１Ａ）、ＶＥＧＦ（１１Ｂ）、およびＥＭＸ（１１Ｃ）についての天然Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０、（ＥＫ）_１０－Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０、およびＣａｓ９－（ＥＫ）_３０から生じるオンターゲットＤＮＡ編集のゲル電気泳動図である。 図１１Ｄは、図１１Ａ～Ｃに示される定量化データのグラフである。

詳細な説明
クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質（Ｃａｓ）システムは、多くの異なる用途で広く使用されている強力なゲノム編集ツールである。しかし、意図されているオンターゲット部位以外の部位でのＲＮＡガイドＣａｓタンパク質により誘導される高頻度突然変異は、治療および臨床応用を妨げる大きな懸念である。理論に縛られたくはないが、大半のオフターゲットイベントはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と標的ＤＮＡの間の非特異的ミスマッチから生じるので、本発明者らは、非特異的ＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用を最小限に抑えることが、この問題の効果的な解決であり得るとの仮定を立てた。

本発明者らは、Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼを、混合電荷部分を用いて改変することにより、このミスマッチ問題は最小限に抑えることができる（例えば、Ｃａｓ９を双性イオンポリマーとコンジュゲートするまたは混合電荷ペプチドドメインをエンドヌクレアーゼのＮおよび／またはＣ末端に付加することにより）ことを実証した。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、オフターゲットＤＮＡ編集は減少しているが類似するレベルのオンターゲット遺伝子編集活性を示している。このアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術の多様なバイオテクノロジー適用および治療応用を促進する潜在力のあるゲノム編集の開発を合理化するための簡単で効果的な方法を提供する。

従って、一態様では、本開示は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに共有結合している１つまたは複数の混合電荷部分を含み、それぞれの混合電荷部分が約１０～約４００の正電荷部分または基および約１０～約４００の負電荷部分または基を含み、負電荷部分または基の数に対する正電荷部分または基の数の比が約１：０．５～約１：２である、改変エンドヌクレアーゼを提供する。

一部の実施形態では、１つまたは複数の混合電荷部分は、約２０～約３００、約３０～約２００、約３０～約１５０、または約３０～約１００の正電荷部分または基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の混合電荷部分は、約２０～約３００、約３０～約２００、約３０～約１５０、または約３０～約１００の負電荷部分または基を含む。

本明細書で使用される場合、用語「混合電荷部分」とは、実質的に等しい数の正電荷基と負電荷基を有して生理的に適切なｐＨで実質的に電子的に中性である部分を提供する部分のことである。一部の実施形態では、混合電荷部分は約７．４のｐＨで実質的に電子的に中性である。混合電荷部分は双性イオン部分を含む。

本明細書で使用される場合、用語「実質的に電子的に中性」とは、実質的にゼロの正味荷電を有する部分のことである。一部の実施形態では、負電荷部分または基の数に対する正電荷部分または基の数の比が約１：１．１～約１：０．５である。一部の実施形態では、負電荷部分または基の数に対する正電荷部分または基の数の比が約１：１．１～約１：０．７である。一部の実施形態では、負電荷部分または基の数に対する正電荷部分または基の数の比が約１：１．１～約１：０．９である。

本開示の改変エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えば、ゲノム工学などのポリヌクレオチド編集に適合させるクラス２クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムにおいて活性である。そのような操作されたＣＲＩＳＰＲシステムは、典型的には２つの成分：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓタンパク質）を含有する。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合に必要なスキャフォールド配列および改変されるポリヌクレオチド（例えば、ゲノム）標的を定義するユーザー定義のヌクレオチドスペーサーで構成された短い合成ＲＮＡである。従って、Ｃａｓタンパク質の標的は、ｇＲＮＡに存在する標的配列を簡単に変えることにより変化させることができる。

本開示の改変エンドヌクレアーゼには、非改変（例えば、野生型）エンドヌクレアーゼと比べてある特定の有利な特性がある。具体的には、本明細書で開示される改変エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用される場合、非改変エンドヌクレアーゼと比べて減少したオフターゲット活性を有する一方でそのオンターゲット活性を実質的に維持することができる。一部の実施形態では、改変エンドヌクレアーゼは、核酸ガイドヌクレアーゼシステムタンパク質、例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを含む。適切なエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ならびにその突然変異体およびバリアントを含む。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓバリアント」とは、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性、ＲＮＡ結合活性、またはＤＮＡターゲティング活性のうちの実質的に１つまたは複数を保持するタンパク質または野生型Ｃａｓタンパク質のポリペプチド誘導体のことである。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１によりコードされるタンパク質の断片を含む、からなる、またはから本質的になることができる。一部の実施形態では、突然変異体またはバリアントは、配列番号１によりコードされるタンパク質に少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％を含むがこれらに限定されない５０％から１００％までの、５０％と１００％を含む、任意の数字）同一である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９またはその突然変異体もしくはバリアントである。

本開示の改変エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用される場合、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（すなわち、対応する非改変エンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）と比べて減少したオフターゲット編集活性および維持されたオンターゲット編集活性を示す。一部の実施形態では、オフターゲット編集は、望ましくないゲノム位置および／または望ましくない遺伝子標的での編集を含む。一部の実施形態では、オフターゲット編集は、望ましくないゲノム位置および／または望ましくない遺伝子標的での意図されないゲノム改変を含む。一部の実施形態では、オフターゲット編集は、非特異的および／または意図されない遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、オフターゲット編集は、意図されない／望ましくない遺伝子改変、例えば、点突然変異、欠失、挿入、逆位および／または転座を含む。一部の実施形態では、オフターゲット編集は、挿入および／または欠失（インデル）を含む。一部の実施形態では、オフターゲット活性は、非改変エンドヌクレアーゼと比べて、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少する。一部の実施形態では、オフターゲット編集活性は、標的が１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多いミスマッチを含む場合、非改変エンドヌクレアーゼと比べて、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少する。

本明細書で開示される改変エンドヌクレアーゼでは、１つまたは複数の混合電荷部分をいかなる適切な方法でも非改変エンドヌクレアーゼに結合させることができる。一部の実施形態では、改変エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの１つまたは複数のアミノ酸の側鎖に、例えば、リシンのアミノ基に結合している混合電荷部分を含む。部分、例えば、混合電荷部分に共有結合する方法は、当技術分野では公知である。例えば、１つのそのような例示的な方法は図４に示されている。一部の実施形態では、改変エンドヌクレアーゼは短いリンカー、例えば、２～１０個の炭素原子を含み、エンドヌクレアーゼと混合電荷部分を連結している任意選択的に置換されたアルキレンまたは任意選択的に置換されたヘテロアルキレンを含むことができる。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に結合させることができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端とＣ末端に結合している２つの混合電荷部分を含むことができる。

本明細書で開示されるエンドヌクレアーゼの改変に適した混合電荷部分の例は、合成ポリマーおよびペプチドを含む。一部の実施形態では、混合電荷部分は、正電荷基を有する繰り返し単位と負電荷基を有する繰り返し単位を含む合成コポリマー、例えば、ランダムコポリマーである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、双性イオン性繰り返し単位を含む、すなわち、陽性基と陰性基の両方が同じ繰り返し単位中に存在している双性イオン性合成ポリマーである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、実質的に等しい数の正電荷アミノ酸と負電荷アミノ酸を含むペプチドである。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、ポリマー骨格に沿って正電荷または負電荷である広範な領域がない（すなわち、正電荷および負電荷の構成単位がポリマー骨格に沿って比較的均一に分布している）ランダムコポリマーである。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、双性イオン性ポリマーである。適切な双性イオン性ポリマーの非限定的例は、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、およびポリ（トリメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）を含む。一部の実施形態では、混合電荷部分はポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）である。

一部の実施形態では、混合電荷部分は、約２ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約５ｋＤａ～約４０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約５ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである。

一部の実施形態では、混合電荷部分はペプチドである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約２ｋＤａ～約１３０ｋＤａの分子量を有するペプチドである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約２ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有するペプチドである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約５ｋＤａ～約７０ｋＤａの分子量を有するペプチドである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約１０ｋＤａ～約６０ｋＤａの分子量を有するペプチドである。一部の実施形態では、混合電荷部分は、約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａの分子量を有するペプチドである。

本開示の改変エンドヌクレアーゼは融合タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、単一の単位として転写され翻訳されて、単一のポリペプチドを産生するように結合されている別々の遺伝子によりコードされている少なくとも２つのドメインからなるタンパク質である。

一部の実施形態では、改変エンドヌクレアーゼは融合タンパク質であって、混合電荷部分は、
ａ）複数の負電荷アミノ酸、
ｂ）複数の正電荷アミノ酸、および
ｃ）任意選択で、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびそれらの誘導体からなる群から独立して選択される複数の追加のアミノ酸
からなり、
正電荷アミノ酸の数に対する負電荷アミノ酸の数の比は約１：０．５～約１：２である混合電荷ドメインである、融合タンパク質。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは複数の追加のアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数の負電荷アミノ酸と複数の正電荷アミノ酸から本質的になる。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインはランダム配列を含む。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、１つまたは複数の正電荷アミノ酸、１つまたは複数の負電荷アミノ酸、および１つまたは複数の追加のアミノ酸を含む配列の繰り返しを含む。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、配列（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３）_ｎを含み、Ｘ１は正電荷アミノ酸であり、Ｘ２は負電荷アミノ酸であり、Ｘ３はプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびそれらの誘導体からなる群から独立して選択される追加のアミノ酸であり、ｎは約５～約５０の整数である。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、配列（Ｅ－Ｋ－Ｘ）ｎを含み、ここで、Ｅはリシン、Ｋはグルタミン酸、Ｘは何もないまたはプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびそれらの誘導体からなる群から独立して選択される追加のアミノ酸であり、ｎは約５～約５０の整数である。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、配列（Ｅ－Ｋ－Ｐ）ｎを含み、ここで、Ｅはリシン、Ｋはグルタミン酸、Ｐはプロリンであり、ｎは約５～約５０の整数である。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、配列（Ｅ－Ｋ）ｎを含み、ここで、Ｅはリシン、Ｋはグルタミン酸であり、ｎは約５～約５０の整数である。

混合電荷ドメインは典型的には約６またはそれよりも多いアミノ酸を含む。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、約６～約１０００アミノ酸、約２０～約１０００アミノ酸、約３０～約１０００アミノ酸、約５０～約１０００アミノ酸、約８０～１０００約アミノ酸、約８０～約６００アミノ酸、または約５０～約５００アミノ酸を含む。

本明細書で開示される融合タンパク質の混合電荷ドメインは、負電荷アミノ酸と正電荷アミノ酸を実質的に等しい数で含む。一部の実施形態では、正電荷アミノ酸の数に対する負電荷アミノ酸の数の比は、約１：０．５～約１：２、約１：０．７～約１：１．４、約１：０．８～約１：１．２５、または約１：０．９～約１：１．１である。従って、混合電荷ドメインは実質的に電子的に中性である。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、約７．４のｐＨで実質的に電子的に中性である。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のリシン、ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のヒスチジン、ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む。

一部の実施形態では、混合電荷ドメイン中の複数の追加のアミノ酸は、セリン、アスパラギン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は、セリン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は、セリンおよびグリシンからなる群から選択される。改変エンドヌクレアーゼの混合電荷ドメインは、一種類のみの追加のアミノ酸（例えば、プロリン）、２つの異なる追加のアミノ酸（例えば、プロリンおよびグリシン）、３つの異なる追加のアミノ酸（例えば、セリン、グリシン、およびプロリン）を含むことができる。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは１つの追加のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、混合電荷ドメインは２つの追加のアミノ酸を含む。

一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は複数のプロリンである。一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は複数のグリシンである。一部の実施形態では、複数の追加のアミノ酸は複数のセリンである。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のリシン、複数のグルタミン酸、ならびにセリン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される複数の追加のアミノ酸を含む。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数のリシン、複数のグルタミン酸、ならびにグリシン、およびプロリンからなる群から選択される複数の追加のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、複数の正電荷アミノ酸はリシン（Ｋ）であり複数の負電荷アミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）である。

一部の実施形態では、混合電荷ドメインは、複数の負電荷アミノ酸、複数の正電荷アミノ酸、ならびにプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される複数の追加のアミノ酸、ならびに任意選択的に、融合タンパク質の親和性精製用に使用することができる親和性タグ、例えば、ヒスチジンタグから本質的になる。一部の実施形態では、電荷ドメインは、複数のグルタミン酸、複数のリシン、ならびにプロリンおよびグリシンからなる群から独立して選択される複数の追加のアミノ酸、ならびに任意選択的に、融合タンパク質の親和性精製用に使用することができる親和性タグ、例えば、ヒスチジンタグから本質的になる。

一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、融合タンパク質の親和性精製用に使用することができる親和性タグ（例えば、ヒスチジンタグ）などの任意選択のドメインを含むことができる。

電荷ドメイン中のアミノ酸は、いかなる方法または配列でも、例えば、上に記載される方法で配置することができる。一部の実施形態では、電荷ドメインは、ランダムコイルポリペプチドである。

本明細書で開示される融合タンパク質は、例えば、分子クローニング技法を使用して、いかなる適切な方法ででも調製することができる。

従って、一態様では、改変エンドヌクレアーゼが融合タンパク質である場合、本開示は、本開示の改変エンドヌクレアーゼの配列を含む核酸を提供する。一実施形態では、本開示は、融合タンパク質、すなわち、改変エンドヌクレアーゼをコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、ゲノム中のまたはｃＤＮＡ配列中のその正常な周囲の核酸配列から取り除かれている核酸である。そのような単離された核酸配列は、前述したコードされたポリペプチドの発現および／または精製を促進するのに有用である追加の配列をさらに含むことができる。一部の実施形態では、核酸は、配列番号２～４によりコードされたタンパク質の断片を含む、からなる、またはから本質的になることができる。一部の実施形態では、核酸は、改変エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、配列番号２～４の配列のＤＮＡである。

融合タンパク質、すなわち、本開示の改変エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、適切な発現ベクター中に組み込むことができる。従って、本開示は、本開示の改変エンドヌクレアーゼをコードする核酸およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを提供する。発現ベクターまたは発現構築物は、特定の遺伝子を宿主細胞内に運び入れ細胞のタンパク質合成機械を使用して遺伝子にコードされたタンパク質を産生するＤＮＡ分子などの核酸である。発現ベクターは、遺伝子の効率的な転写を可能にする遺伝子発現に不可欠なエレメント、例えば、遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター領域も含有する。タンパク質の発現は制御することが可能であり、タンパク質は、誘導物質を使用することにより、必要な時だけ有意量で産生される。大腸菌はタンパク質産生のための宿主として一般に使用されているが、他の細胞型、例えば、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞も使用可能である。

別の態様では、本開示の改変エンドヌクレアーゼをコードする核酸またはベクターを含む細胞が本明細書で提供される。細胞は原核細胞または真核細胞が可能である。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は細胞培養物中にある。一部の実施形態では、細胞は生物中にある。

一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質（すなわち、改変エンドヌクレアーゼ）はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現させることが可能である。

一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、任意の適切な発現系、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現系、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現系、または任意の他の原核生物発現系を使用して合成することができる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系を使用して合成することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、ヒト胚腎臓２９３発現系を使用して合成することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣発現系を使用して合成することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、無原核細胞または無真核細胞発現系を使用して合成することができる。

本明細書で開示される融合タンパク質の回収および精製は、いかなる適切な方法またはそのような方法の組合せによっても達成することができる。一部の実施形態では、タンパク質沈殿技法を使用することができる。一部の実施形態では、精製はサイズ排除クロマトグラフィーを含むことができる。一部の実施形態では、精製はイオン交換クロマトグラフィーを含むことができる。一部の実施形態では、精製は脱塩カラムの使用を含むことができる。一部の実施形態では、精製は親和性クロマトグラフィーを含むことができる。

別の態様では、細胞においてまたは対象においてポリヌクレオチドを編集するための方法であって、本開示の少なくとも１つの改変エンドヌクレアーゼ、本開示の核酸、または本明細書で開示される発現ベクターを細胞または対象中に導入するステップを含む方法が本明細書で提供される。本明細書で開示される改変エンドヌクレアーゼにより編集するのに適したポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、例えば、ヒトゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはミトコンドリアＤＮＡである。改変エンドヌクレアーゼならびにそれをコードする核酸およびベクターは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して細胞または対象中に導入することができる。

本開示の改変エンドヌクレアーゼは、遺伝子工学、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ－ｖｉｖｏでの治療遺伝子編集、ならびに診断適用を含む広範囲の使用を有する。

本明細書で特に定義されなければ、本明細書で使用される用語はすべて、本発明の分野の当業者にとって有すると考えられるのと同じ意味を有する。当技術分野の定義および用語については、実行者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１０）；およびＣｏｌｉｇａｎ、Ｊ．Ｅ．ら、（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１０）に案内される。さらに、分子生物学での一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ ＩＸ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ、２００８年（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗら、（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、１９９４年（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、１９９５年（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）に見出される。対立する場合には、明細書中の用語が統制する。

特許請求の範囲での用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替物のみに言及するまたは代替物が相互に排他的であることが明白に示されていなければ「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみに言及する定義および「および／または」を支持する。単語「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、特許請求の範囲または明細書において単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、特に言及されなければ、１つまたは複数を意味する。

文脈が別段はっきりと要求しなければ、記述および特許請求の範囲全体を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および同類のものは、排他的または網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で、すなわち、「含むが、限定されない」という意味を示していると解釈されるべきである。単数または複数を使用する単語は、それぞれ複数および単数も含む。説明する目的で、「Ａ／Ｂ」の形のまたは「Ａおよび／またはＢ」の形の語句は、（Ａ）、（Ｂ）、または（ＡおよびＢ）を意味する。説明する目的で、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」の形の語句は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（ＡおよびＢ）、（ＡおよびＣ）、（ＢおよびＣ）、または（Ａ、ＢおよびＣ）を意味する。説明する目的で、「（Ａ）Ｂ」の形の語句は（Ｂ）または（ＡＢ）を意味し、すなわち、Ａは任意選択的要素である。さらに、単語「本明細書で」、「上の」、および「下の」、ならびに類似する意味の単語は、本出願において使用される場合、本出願全体を指し本出願のいかなる特定の部分も指さないものとする。単語「約（ａｂｏｕｔ）」は、記述されている参照数よりも上または下の小変動の範囲内の数を示している。例えば、一部の実施形態では、「約」は、示されている参照数よりも１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％上または下の範囲内の数字を指すことができる。

開示されている方法および組成物の産物のために使用することができる、産物と併せて使用することができる、産物の調製において使用することができる、または産物である材料、組成物、および成分が開示される。これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群、等が開示される場合、これらの成分のそれぞれの単一組合せおよび順列への特定の言及が明白に開示されていないとしても、様々な個別的および集合的組合せのそれぞれが具体的に想定されていることが理解される。この考え方は、記載されている方法におけるステップを含むがこれに限定されない本開示の態様すべてに当てはまる。従って、任意の前述の実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるかまたは代わりに用いることができる。例えば、実施することができる種々の追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは、任意の特定の方法ステップまたは開示された方法の方法ステップの組合せを用いて実施することができること、およびそれぞれのそのような組合せまたは組合せのサブセットは具体的に想定されており開示されていると見なされるべきであることが理解されている。さらに、本明細書に記載される実施形態は、本明細書の他の場所に記載されている材料などのまたは当技術分野で公知である任意の適切な材料を使用して実行できることが理解されている。

本明細書で引用されるすべての出版物および出版物が引用される主題は、これにより参照によりその全体を具体的に組み込まれる。

以下の実施例は、本開示のある特定の特長および／または実施形態を説明するために提供される。実施例は、本開示に記載されている特定の特長または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。

実施例１ 混合電荷ポリマーとのコンジュゲーションによる例示的な改変エンドヌクレアーゼの調製
この実施例では、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを、親水性双性イオン性合成ポリマーとのコンジュゲーションにより改変した。

１．１ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドポリ（カルボキシベタインアクリルアミド）（ＮＨＳ－ＰＣＢＡＡ）の合成
ｐＣＢ－ＮＨＳは以前記載された通りに合成した。手短に言えば、３－アクリルアミド－Ｎ－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミニウム（ＣＢＡＡＭ－ｔＢｕ）を合成した。次に、典型的な可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合反応を実施して、１０ｋＤａのＳＨ－ｐＣＢポリマーを得た。最終的な無色のＮＨＳ－活性化ポリマーは、ＤＩ水（ｐＨ６）中３０分間のＡＭＡＳとの１：１０のモル比での反応により形成され、続いてＡｍｉｃｏｎ回転透析チューブおよび４８時間の凍結乾燥によって未反応のＡＭＡＳを取り除いた。

１．２ ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートの調製および特徴付け
ｐＣＢ－Ｃａｓ９のコンジュゲートは、ポリマーのＮＨＳエステル基をタンパク質上の利用できるアミン基と反応させることにより合成した。典型的なコンジュゲーション反応では、１：１０、１：２０、または１：５０のモル比のＣａｓ９ヌクレアーゼとＮＨＳ－ｐＣＢを、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に溶解した。最終タンパク質濃度は約５ｍｇ／ｍＬであった。反応混合液は４℃で２時間撹拌し、氷酢酸を用いて混合液のｐＨを４．５に合わせることにより停止した。ポリマー－タンパク質コンジュゲートは、分画分子量（ＭＷＣＯ）回転透析膜、続いてイオン交換クロマトグラフィーにより単離した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、タンパク質コンジュゲートの流体力学サイズを測定した。

１．３ ｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成
ｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成は、ＥｎＧｅｎ（登録商標）ｓｇＲＮＡ合成キットを製造業者が推奨する条件で使用して実行した。ｓｇＲＮＡ産物は、ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡクリーンアップおよび濃縮マイクロキットを手引きに記載される通りに使用して精製した。ＲＮＡの濃度は、マイクロプレートリーダー上で２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。

１．４ 哺乳動物細胞培養
ＨＥＫ ２９３－ＧＦＰ細胞は、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地で維持した。Ｕ２ＯＳ細胞は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０％のＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ改変培地で維持した。Ｋ５６２細胞は、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。解凍後、細胞はトランスフェクション用に使用する前に４～５回継代した。トランスフェクション用の実験を準備すると、培養された細胞は２４ウェルフォーマット（５００μｌ容積）の完全成長培地において、その次の日に約７０％コンフルエンスに到達するのに必要な細胞密度で蒔いた。完全血清培地は同じであるが抗生物質を含有しない培地で、送達の少なくとも１時間前に置き換えた。培養物はすべて、加湿インキュベーターにおいて３７℃で５％ＣＯ_２中に維持した。

１．５ Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ同時送達
Ｃａｓ９タンパク質トランスフェクションでは、２００ｎｇの精製Ｃａｓ９タンパク質を５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に添加し、続いて５０ｎｇのｇＲＮＡを添加した。Ｃａｓ９タンパク質に対するｇＲＮＡのモル比はおおよそ１～１．２：１に保った。試料はチューブを数回穏やかにたたくことにより混合し、次に、室温で１０分間インキュベートした。別の試験チューブで、０．８μｌのリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸトランスフェクション試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で５μｌまで希釈した。希釈されたトランスフェクション試薬は、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体を含有するチューブに移し、続いて室温で１０分間インキュベートし、次に全溶液を２４ウェルプレートの細胞に添加し、プレートを穏やかに旋回させることにより混合した。プレートは、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で４８時間インキュベートした。

１．６ ヒト細胞におけるオン－およびオフ－ターゲット突然変異頻度の決定
ゲノムＤＮＡは、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者の説明書に従って使用して、Ｕ２ＯＳ、ＨＥＫ２９３またはＫ５６２細胞からトランスフェクションの２日後に収穫した。１００ｎｇの単離されたゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、標的にされたゲノム部位を、プライマー対を用いてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物はＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて精製し、マイクロリーダー上で定量化した。２５０ｎｇの精製ＰＣＲ ＤＮＡを２μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ）と全容積１９μｌで組み合わせて変性し、次に９５℃で５分間、２℃／秒で９５－８５℃、０．２℃／秒で８５－２０℃の熱サイクリングで再アニールした。再アニールしたＤＮＡは１μｌのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（１０Ｕ／μｌ、ＮＥＢ）と一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。Ｃａｓ９誘導切断バンドおよび非切断バンドはＵＶ光下で可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア３０を使用して定量化した。切断バンドのピーク強度は全バンド（非切断＋切断バンド）の全強度で割って切断された画分を決定し、この画分を使用して遺伝子改変レベルを推定した。それぞれの試料では、トランスフェクションおよびそれに続く改変測定は異なる日に３通り実施した。オフターゲット分析は、バイオインフォーマティクスベースの検索ツールを使用して実施して潜在的オフターゲット部位を選択し、これはＴ７ＥＩ突然変異検出アッセイも使用して評価した。

１．７ サンガーシーケンシング
突然変異率をもっとよく決定するため、Ｔ７ＥＩアッセイ用に使用したのと同じ精製ＰＣＲ産物を配列決定して、個々の突然変異を観察し突然変異スペクトラムを決定した。サンガーシーケンシングを使用して、改変されたおよび非改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムについて遺伝子改変頻度を確かめた。結果は、ＩＣＥ解析（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）により解析した。

１．８ 結果
ヌクレアーゼの「オフターゲット」活性は、本来Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体が、その意図される標的ＤＮＡ部位の効果的な認識のために必要とされるよりも多くのエネルギーを有するために生じる。その結果、複合体は高い特異性を欠き、オンターゲットＤＮＡ鎖に類似する配列に結合することができる。従って、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲット効果は、その標的ＤＮＡ部位との非特異的相互作用を減少させることにより最小限に抑えられると仮定した。

双性イオン性ポリ（カルボキシベタイン）（ｐＣＢ）ポリマーは高度に水和され、非特異的相互作用に効果的に抵抗性である。以前、ｐＣＢポリマーは、キモトリプシン（ＣＴ）、ウリカーゼ、およびインターフェロン－α２ａにコンジュゲートされてタンパク質の生物活性を保っていた。このポリマーの超親水性は、平衡を移し、基質と結合部位が相互作用するのに有利に働く環境を生み出す。ｐＣＢコンジュゲートタンパク質は、その周囲の環境との減少した非特異的相互作用を見せることが実証されてきた。本発明者らは、非特異的相互作用を減少させると、タンパク質循環時間を有意に増しタンパク質特異的抗体産生をｉｎ ｖｉｖｏで減少させることが示されることを以前実証した。

特異的なＤＮＡ－ｓｇＲＮＡマッチングは非特異的相互作用よりもはるかに強力なので、本発明者らは、ｐＣＢコンジュゲーションは非特異的相互作用を減少させ、それでもオンターゲットＤＮＡ鎖を有するほど強い特定の相互作用を維持することができると仮定した。この戦略を用いれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲット効果を最小限に抑えることができる。従って、例示的なエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９をｐＣＢポリマーにコンジュゲートし、こうして得られたコンジュゲートのオンターゲットおよびオフターゲット効率は調べられてきた。ｐＣＢコンジュゲートＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの特異性を評価するため、複数のｓｇＲＮＡ標的ＤＮＡインターフェイス内に単一、二重、または三重の置換を含有する一連のミスマッチｓｇＲＮＡを設計した。異なる内在性ヒト遺伝子を試験した。例示的な改変エンドヌクレアーゼ（例えば、本明細書で開示されるｐＣＢコンジュゲート）は、非改変（野生型）Ｃａｓ９と比べて、オフターゲット活性は減少しているが、類似するレベルのオンターゲット遺伝子編集効率を示した。従って、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを、混合電荷部分を用いて改変すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムベースの遺伝子編集に簡単で、安全で、頑強な戦略を提供できる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのオフターゲット効率に対する双性イオン性ｐＣＢポリマーコンジュゲーションの効果を調べるため、タンパク質当たり異なる数のポリマー鎖を有する一連の例示的ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートを調製した。ｐＣＢ－Ｃａｓ９のコンジュゲートは、ポリマーのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基をタンパク質上の利用できるアミン基と反応させることにより合成した。反応図式は図５に図示されている。ポリマー密度は、反応でのＣａｓ９とＮＨＳ－ｐＣＢの間のモル比を変更することにより制御された。ｐＣＢ１０－Ｃａｓ９、ｐＣＢ２０－Ｃａｓ９、およびｐＣＢ５０－Ｃａｓ９と表された例示的な改変エンドヌクレアーゼは、それぞれ１：１０、１：２０、および１：５０のモル比で合成された。天然の（非コンジュゲート）Ｃａｓ９タンパク質は、本開示全体を通じて比較のために使用された。天然のＣａｓ９とｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートの間のサイズの違いは図６に示されており、この図は、ポリマー－タンパク質コンジュゲートの合成に成功していることを確証している。

ほぼすべての場合で、ポリマーとの共有結合コンジュゲーションによるタンパク質の表面改変、例えば、ペグ化はコンジュゲートタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を低下させる。従って、本発明者らは、双性イオン性ポリマーが存在すればコンジュゲーション後オンターゲット活性が損なわれるのかどうかを先ず試験した。これらの実験では、標的にされたヌクレアーゼ活性の迅速な定量化を可能にする確立したＣａｓ９誘導ＧＦＰ破壊アッセイが使用された（Ｙ．Ｆｕ、Ｊ．Ａ．Ｆｏｄｅｎ、Ｃ．Ｋｈａｙｔｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｍａｅｄｅｒ、Ｄ．Ｒｅｙｏｎ、Ｊ．Ｋ．Ｊｏｕｎｇ、Ｊ．Ｄ．Ｓａｎｄｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３年、３１巻、８２２頁、前記文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる）。

このアッセイでは、ヒトＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞中のゲノムＧＦＰレポーター遺伝子が標的にされた。その活性はヒトＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞中の蛍光シグナルの消失を測定することにより定量化され、この消失はオンターゲットＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断により引き起こされる（図１Ａ）。細胞は、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて４８時間、５０ｎｇのｓｇＲＮＡおよび２００ｎｇの天然Ｃａｓ９／Ｃａｓ９と同量ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートをＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（図７および８）と一緒に用いて処置してＧＦＰレポーター遺伝子の破壊を誘導した。図１Ｂに示されるように、例示的なエンドヌクレアーゼｐＣＢ_１０－Ｃａｓ９およびｐＣＢ_２０－Ｃａｓ９は天然のＣａｓ９に匹敵する編集効率を示し、約６０％の細胞が処置後そのＧＦＰ発現を失ったことが分かった。結果により、ｐＣＢポリマーが存在してもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの「オンターゲット」編集効率は損なわれないことが実証された。しかし、ｐＣＢ_５０－Ｃａｓ９で処置された場合は４０％のＧＦＰ陰性細胞しか見出されなかった（図１Ｂ）。これはより多くのｐＣＢポリマーの存在のせいであり、このポリマーはＤＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰの間の結合を物理的に妨げることができる。

オフターゲット活性を減少させるうえでのｐＣＢコンジュゲートの潜在能力を探るため、１つ、２つ、または３つのミスマッチヌクレオチドを有する標的部位用のバリアントｓｇＲＮＡを無作為に作製し、これらのミスマッチｓｇＲＮＡがヒト細胞においてオフターゲットＧＦＰ破壊を駆り立てることができるかどうかを試験した（図１Ｃ）。ｐＣＢコンジュゲーションがオフターゲティングを減らすことができるならば、ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートは天然のＣａｓ９ほどミスマッチに耐性ではないと考えられる。図１Ｃに示されているように、天然のＣａｓ９は、ミスマッチｓｇＲＮＡを使用する場合、ヒト細胞において実質的なＧＦＰ遺伝子破壊をそれでも誘導できる。これとは対照的に、ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートは、ミスマッチｓｇＲＮＡを使用した場合、ＧＦＰ破壊効率の有意な減少を示した（図１Ｃ）。１つ、２つ、または３つのヌクレオチドミスマッチがｓｇＲＮＡに存在する場合、ｐＣＢ_１０－Ｃａｓ９はそれぞれ３５．６％、２１．９％、および５．６％のＧＦＰ破壊を誘導し、ｐＣＢ_２０－Ｃａｓ９はそれぞれ１４．２％、８．９％、および０％のＧＦＰ破壊をもたらした。ｐＣＢ_５０－Ｃａｓ９は、２つまたは３つのヌクレオチドミスマッチが存在する場合、検出可能なＧＦＰ破壊を生じなかった。これらのデータは、ｐＣＢコンジュゲーションが、ミスマッチｓｇＲＮＡが使用された場合、オフターゲット遺伝子編集を有意に減少できることを示唆している。オンターゲットとオフターゲット効率の両方を考慮に入れると、ｐＣＢ_２０－Ｃａｓ９は、完全なオンターゲット効率を示しオフターゲット効率を有意に減少させたが、下に記載されるさらなる研究のために選択された。

ｐＣＢ－Ｃａｓ９に対するミスマッチの効果をさらに評価するため、１つ、２つ、または３つのヌクレオチド突然変異を保有する追加のｓｇＲＮＡを設計した。表１に示されるように、天然のＣａｓ９は単一ミスマッチシナリオでは有意なオフターゲット編集を見せた（５７．４％、６０．６％、および４９．３％）。これらのオフターゲット編集効率は、上で考察された完全適合シナリオでのそのオンターゲット編集効率（６２．６％）に非常に近い。これとは対照的に、同じミスマッチｓｇＲＮＡを使用すると、例示的なｐＣＢ_２０－Ｃａｓ９コンジュゲートは有意に減少したオフターゲット編集効率を示した（１４．２％、１２．６％、および６．８％）。この編集効率は、完全適合シナリオでのその編集効率（６７．４％）よりも８０％以上低い。この観察は、ｓｇＲＮＡが２つまたは３つのミスマッチを有する別の２つのシナリオで確かめられた。ｓｇＲＮＡに３つのミスマッチが提示されている場合、天然Ｃａｓ９はそれでも正の編集効率（１２．４％、７．９％、９．３％）を見せた。これとは対照的に、ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲート群では「オフターゲット」効率は観察されない。これは、ｐＣＢコンジュゲートＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がＤＮＡ編集では高い分解能を有し、単一塩基のレベルでミスマッチを区別できることを示している。

ヌクレアーゼの「オフターゲット」活性は根本的に、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体が有する余分なエネルギーにより引き起こされ、完全な特異性の欠如をもたらすことが知られている。そのような余分なエネルギーは、主に非特異的力、特に疎水性力および静電気的力に由来する。タンパク質を非汚染性ポリマー物質で被覆すると、これらの非特異的相互作用を変更することができ、エネルギーを下げ特異的な結合を促進する鍵となる。ヌクレアーゼの「オフターゲット」活性は根本的に、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体が有する余分なエネルギーにより引き起こされ、完全な特異性の欠如をもたらすことが知られている。そのような余分なエネルギーは、主に非特異的力、特に疎水性力および静電気的力に由来する。タンパク質を非汚染性ポリマー物質で被覆すると、これらの非特異的相互作用を変更することができ、エネルギーを下げ特異的な結合を促進する鍵となる。この数年にわたって、天然に存在するベタインを主成分とする双性イオン性物質、例えば、ｐＣＢは特に高い水和作用を有する。その結果、複雑な生物媒体中の超低非特異的吸着が、異なるシナリオで観察されてきた。本発明者らは、Ｃａｓ９にｐＣＢをコンジュゲートすると、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体と標的ＤＮＡの間の非特異的結合力を減らすことができると仮定した。図２に示されるように、天然のＣａｓ９では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体が有するエネルギーは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの間のオンターゲット結合に必要とされる最小エネルギーよりもはるかに高い。その結果、ＲＮＰ複合体は、１つまたは複数のミスマッチヌクレオチドが存在していてもそれでも十分なエネルギーを有する。ｐＣＢコンジュゲートがあれば、前述の非特異的結合、特に疎水性－疎水性相互作用は、有意に減少する。複合体は、ミスマッチヌクレオチドが配列上に存在する場合、十分なエネルギーなしでは二本鎖ＤＮＡに結合することはできない。その結果、オフターゲット効果は有意に減らすことができる。さらに、ポリマーの超親水性から利益を得て、強固に結合した水層が周囲に形成され、ＲＮＰと双性イオン性ポリマーの間の非特異的相互作用は以前観察されたように最小限に抑えることができる。その結果、Ｃａｓ９の生物活性はポリマーコンジュゲーション後に保持することができ、これはオンターゲット効率を保つのに極めて重要である。

ｐＣＢコンジュゲートＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰが、ヒト細胞において他のＤＮＡドメインに対するオフターゲット効果を減少させることができるかどうかを調べるため、ＶＥＧＦＡ、ＥＭＸ、およびＣＬＴＡ遺伝子中の３つの新たなゲノム遺伝子座を、その潜在的生物医学関連性およびＣａｓ９オフターゲット研究における広い使用によって選択した。図３Ｄに示されているように、３つの標的すべてで、その内在性遺伝子座でのＣＲＩＳＰＲ／ｐＣＢ_２０－Ｃａｓ９媒介インデルがＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイを使用して検出された。これら３つの標的配列のそれぞれについて、本発明者らは、他の研究で観察されているいくつかの潜在的オフターゲット部位の編集効率を調べた。本開示では、類似の傾向が観察された。選択されたオフターゲット部位での突然変異率は、細胞が天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して編集された場合は、非常に高く、９．４％～９３．６％に及んだ。これとは対照的に、例示的なｐＣＢ_２０コンジュゲートＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して編集された細胞では、オフターゲット突然変異率はずっと低いレベルで観察され、２．４％～１０．５％に及んだ。ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートの編集効率は天然のＣａｓ９の編集効率よりもわずかに高いことは注目に値する。これは、Ｃａｓ９の生物活性がコンジュゲート後に保存されているという仮説を確証している。

ｐＣＢコンジュゲーションがＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲット突然変異を減少させたことを実証した後、この改変Ｃａｓ９は他のタイプのヒト細胞において評価された。ここでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオン－／オフ－ターゲット活性を試験するためにも広く使用されたので、Ｕ２ＯＳおよびＫ５６２細胞株を使用した。３つの標的上での編集効率は、Ｕ２ＯＳおよびＫ５６２細胞編集において天然のＣａｓ９またはｐＣＢ－Ｃａｓ９を使用して調査した。予想通り、ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲートは、標的ゲノム遺伝子座での天然のＣａｓ９と比べた場合、類似するまたはわずかに高い編集効率を生じた（図３Ｅおよび３Ｆ）。バリアントミスマッチを使用するオフ－ターゲット試験では、ｐＣＢ－Ｃａｓ９コンジュゲート群は２２のオフ－ターゲット部位のうちの２０部位で４％未満のインデル率を生じた。これとは対照的に、天然のＣａｓ９は２．９％～２４．７％のオフターゲットインデルを生じ、そのうちの６つは１０％よりも高かった。これらの結果により、ｐＣＢコンジュゲートＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が異なる細胞株において減少したオフターゲット効果を示すことがさらに実証された。

実施例２ 例示的な改変エンドヌクレアーゼ（融合タンパク質Ｃａｓ９－ＥＫ）の調製ならびに遺伝子編集およびオフターゲティング減少のためのｅｘ ｖｉｖｏ Ｃａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡ送達
この実施例では、ＮおよびＣ末端核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヒトコドン最適化ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクター中にクローニングした。１０ｋＤａまたは３０ｋＤａ長のポリ（ＥＫ）をコードするＤＮＡは商業的に合成され、Ｃａｓ９遺伝子のＣ末端またはＣ－とＮ－末端の両方に付加されてＣａｓ９－ＥＫ構築物を作製した（図８Ａ～８Ｃ）。ポリ（ＥＫ）の長さおよび融合位置に基づいて、３つのＣａｓ９－ＥＫプラスミド、Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０、（ＥＫ）１０－Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０、およびＣａｓ９－（ＥＫ）_３０を構築した。ポリ（ＥＫ）配列のないＣａｓ９配列は対照配列として使用した。プラスミドおよび転写物の構成的存在は高レベルの望ましくないオフターゲット遺伝子編集を生じることがあるので、その所望の遺伝子編集効果を達成するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡの両方をトランスフェクトすることにより、無ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを使用した。ＩＶＴ ｍＲＮＡはゲノム挿入のリスクを最小限に抑え、転写のための核移行の必要性を迂回し、ゲノム編集の迅速な開始をもたらす。さらに、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ送達はＣａｓ９タンパク質の一過性発現を提供し、これによりオフターゲット効果が潜在的に減少する可能性がある。

Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を通して作製した。Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＥＫコードプラスミドは、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の説明書に従って使用して直線化した。精製に続いて、Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ウルトラ転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造業者の説明書に従って使用して、３７℃、２時間のインキュベーション時間で転写した。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅを添加して転写を停止させた。このシステムは細胞でのＣａｓ９ ｍＲＮＡの翻訳に頼っているので、ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳が起こる前にＣａｓ９ ｍＲＮＡを分解から防ぐためにはトランスフェクションに先立ってＣａｓ９およびＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡのポリアデニル化（ポリ（Ａ））が必要になる。ポリアデニル化反応は、Ｅ－ＰＡＰ酵素の添加で開始され、３７℃で３０分間インキュベートされた。電気泳動像（図９）でのポリアデニル化後のバンド移動によりポリ（Ａ）テールの存在が確かめられた。スミヤーバンドは分解を示していた。

ｍＲＮＡを得た後、哺乳動物細胞での実験室調製Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの活性は、先ずそれを市販のＣａｓ９ ｍＲＮＡと比べることにより確かめられた。ＧＦＰを標的にするｇＲＮＡ（配列番号５）はこの分析のために選択された。トランスフェクションの１日前、細胞は、ウェル当たり１～２×１０^５細胞の細胞密度で２４ウェルプレートに播種した。０．５μｇのＣａｓ９またはＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡを２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加し、続いて５０～１００ｎｇのｇＲＮＡを添加した。その間に、２μＬのリポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈し、次に、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ試料と混合した。混合液は細胞への添加に先立って１５分間インキュベートした。全溶液を細胞に添加し、プレートを穏やかに旋回させることにより混合した。プレートは、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で４８時間インキュベートした。ＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞を市販のＣａｓ９または実験室調製Ｃａｓ９を発現するｍＲＮＡでＧＦＰ ｇＲＮＡと一緒に同時トランスフェクトした２日後に、インデル突然変異の百分率をＴ７ＥＩアッセイにより定量化した。図１０に示されるように、実験室調製Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは市販のＣａｓ９ ｍＲＮＡに類似するオンターゲット編集効率を有しており、これはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＣａｓ９ ｍＲＮＡの合成に成功したことを示している。

Ｃａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡを哺乳動物細胞において染色体ＤＮＡを切断するようにｇＲＮＡによってプログラムすることができるかどうかを調べるため、同じアッセイを使用してＣａｓ９－（ＥＫ）_１０、（ＥＫ）_１０－Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０、およびＣａｓ９－（ＥＫ）_３０の遺伝子編集効率を試験した。図１１Ａに示されるように、３つのＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡすべてが、ＧＦＰ配列を標的にした場合、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡに類似する編集レベルを示す。ポリ（ＥＫ）が存在しても、選択されたオンターゲット部位上でオンターゲット遺伝子編集効率は損なわれなかった。この効果がターゲティング部位特異的ではないことを承認するため、類似する編集頻度が、ゲノム遺伝子座ＶＥＧＦ（ＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＣ）（図１１Ｂ）およびＥＭＸ（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）（図１１Ｃ）を用いてさらに検証された。定量化されたデータは図１１Ｄにまとめられ提示されている。３つのＣａｓ９－ＥＫ融合物はすべて、ＶＥＧＦとＥＭＸ標的遺伝子座位の両方で、天然のＣａｓ９ ｍＲＮＡに類似するレベルのオンターゲット編集効率を示す。

ポリ（ＥＫ）が存在すればヒト細胞においてオフターゲット効果を減少できるかどうかを調べるため、ＶＥＧＦおよびＥＭＡ標的遺伝子座位についてのいくつかの潜在的なオフターゲット部位を選択し、これらの部位は他の研究で観察されていた。結果は表２に示されている。Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０では、オフターゲット活性は、天然のＣａｓ９と比べて、いくつかのオフターゲット部位について類似しているまたはわずかに減少していた。理論に縛られたくはないが、これは、ｇＲＮＡと二本鎖ＤＮＡの間の非特異的力を減らすことができない不十分な長さのポリ（ＥＫ）のせいであると考えられる。しかし、（ＥＫ）_１０－Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０とＣａｓ９－（ＥＫ）_３０の両方は、１．２％～３．５％に及ぶ有意に減少したオフターゲット編集効率を示した。これらの結果により、Ｃａｓ９－ＥＫが異なるゲノム遺伝子座に対して減少したオフターゲット効果を示すことが実証された。

ポリ（ＥＫ）融合物がＨＥＫ２９３－ＧＦＰ細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲット突然変異を減少させることが実証された後、このＥＫ化Ｃａｓ９は他のタイプのヒト細胞において評価された。ここでは、Ｕ２ＯＳおよびＫ５６２細胞株が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオン－／オフ－ターゲット活性を試験するのにも広く使用されたので、これらの細胞を用いた。２つの標的上での編集効率は、Ｕ２ＯＳおよびＫ５６２細胞編集において天然のＣａｓ９またはＣａｓ９－ＥＫを使用して調査した。予想通り、Ｃａｓ９－ＥＫ融合物は、標的ゲノム遺伝子座で天然のＣａｓ９と比べた場合、類似するオンターゲット編集効率を生じた（表２）。バリアントミスマッチを使用するオフターゲット試験では、Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０は、天然のＣａｓ９に類似するオフターゲット遺伝子編集効率を示す。しかし、（ＥＫ）_１０－Ｃａｓ９－（ＥＫ）_１０およびＣａｓ９－（ＥＫ）_３０は、有意に減少したオフターゲット編集効率が、３６のオフターゲット部位のうち２９で３％未満のインデル率を引き起こすことを示した。これとは対照的に、天然のＣａｓ９ ｍＲＮＡは２．５％～２１．５％のオフターゲットインデルを生じ、このうち４つは１０％より高かった。これらの結果により、ポリ（ＥＫ）融合ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が異なる細胞株において減少したオフターゲット効果を示すことがさらに実証された。

実施例３ 混合電荷ポリペプチドと融合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達
例示的なシステムの有効性はｅｘ ｖｉｖｏシステムにおいてさらに実証することができる。上記のプロトコルは、突然変異のある一次細胞の遺伝子編集用に使用することができる。例えば、パラロガスγ－グロブリン遺伝子（ＨＢＧ１／２）の再発現は、重症β－グロビン障害鎌状赤血球症（ＳＣＤ）および胎児ヘモグロビンの誘導によるβ－サラセミア（ＨｂＦ、α２γ２）を寛解させる普遍的な戦略になれると考えられる。ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーでのコア配列が成体段階の赤血球細胞でのＨｂＦの抑制に必要であるが、非赤血球細胞では必ずしも必要ではないことが知られていた。ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーでのＧＡＴＡ１結合部位内でのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ媒介切断は、このモチーフの高度に浸透性の破壊、ＢＣＬ１１Ａ発現の減少、および胎児性γ－グロビンの誘導をもたらすことがある。実験は、ＳＣＤ患者またはβ－サラセミア患者から収穫されたヒト成人造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を用いて実施される。Ｃａｓ９／Ｃａｓ９－（ＥＫ）_ｎ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（配列番号２１～２４）は上記の通りに送達される。編集効率は、Ｔ７ＥＩアッセイ、部位特異的サンガーシーケンシング、ならびにオンターゲットおよび推定オフターゲット部位のディープシーケンシングにより評価される。ＨＳＰＣは、非相同末端結合修復を優先的に受けると予想される。編集された移植ＳＣＤ ＨＳＣの赤血球子孫は治療レベルのＨｂＦを発現して鎌状赤血球化に抵抗すると予想され、β－サラセミアを有する患者由来の赤血球子孫は回復されたグロビン鎖バランスを示すと予想される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて編集した後、ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｋｉｔ^{Ｗ－４１Ｊ}Ｔｙｒ^＋Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}（ＮＢＳＧＷ）マウスに注射して、ＨＳＰＣに対するＢＣＬ１１Ａエンハンサー編集の影響を調べた。非照射ＮＢＳＧＷメスマウス（４～５週齢）に、ＤＰＢＳに再懸濁された０．２～０．８ＭのＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを用いた後眼窩注射により注入する。骨髄は、生着１６週後ヒト異種移植片分析用に単離される。一次レシピエント由来の骨髄細胞の後眼窩注射を使用して連続移植を実行する。フローサイトメトリーでは、骨髄細胞の分析を行って百分率ヒト生着を測定する。

実施例４ 混合電荷ポリペプチドを融合させたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集は、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両方をコードするＤＮＡプラスミドの形質転換により成し遂げられるが、プラスミドおよび転写物の構成的な存在は、高レベルの望ましくないオフターゲット遺伝子編集をもたらすことがある。多くの研究者が、その所望の遺伝子編集効果を達成するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡの両方をトランスフェクトすることにより無ＤＮＡ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムのほうに変わりつつある。この実施例では、ＮおよびＣ末端核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヒトコドン最適化ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）中にクローニングする。１０ｋＤａまたは３０ｋＤａ長のポリ（ＥＫ）をコードするＤＮＡ配列は商業的に合成され、Ｃａｓ９遺伝子の３’－末端または５’－と３’－末端の両方に付加されてＣａｓ９－ＥＫ構築物を作製する。ｇＲＮＡは、マウスゲノムにおいて多数のオフターゲット部位（オンターゲット部位に対して２つまたはそれよりも少ないミスマッチ）を示したマウスＰｃｓｋ９エクソン内でオンターゲット配列を探索することにより同定する。Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ウルトラ転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造業者の説明書に従って使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を通して作製する。Ｃａｓ９またはＣａｓ９－ＥＫ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは全身送達のために脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。

ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐｃｓｋ９遺伝子編集では、９～１１週齢オスマウスはｇＲＮＡに対してＣａｓ９の一貫した比の尾部静脈注射をリン酸緩衝食塩水と一緒に受ける。末梢血はｍＲＮＡ投与前（基準線）、ウイルス投与の１週間後および終了時（ｍＲＮＡ投与の４日または３週間後）に試料採取される。動物は、実験エンドポイントで、イソフルラン麻酔下、心臓穿刺により安楽死させる。肝臓、脾臓、肺、腎臓、筋肉、脳および精巣を含む臓器が解体され、液体窒素に瞬間凍結され、さらなる分析まで－８０℃で保存される。末梢血は、研究の間に小伏在静脈からおよび終了時に心臓穿刺によりＥＤＴＡ被覆毛細管チューブに収集される。血漿中のマウスＰｃｓｋ９のレベルは、標準ＥＬＩＳＡキットを製造業者の説明書に従って用いて決定される。アデノウイルス注射マウスの肝臓組織由来のゲノムＤＮＡは、インデル分析のため処置後の４日目および３週目に抽出される。オンターゲット部位および種々の同定された潜在的オフターゲット部位はディープシーケンシングにより分析される。

まとめると、上記実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが直面する「オフターゲット」懸案事項は混合電荷部分を用いた改変により取り組むことができることを実証している。混合電荷ポリマーまたは混合電荷ペプチドで改変した後、例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは「オフターゲット」効率の有意な減少を示した。さらに重要なことに、減少した「オンターゲット」頻度は、通常多くの戦略で気づかれるが、全く観察されなかった。この技術は、広範囲のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの生物学および臨床応用の効率および安全性を改善する単純で頑強な戦略を提供することができる。

説明的な実施形態が解説され記載されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そこに種々の変化を加えることができることは認識されている。

排他的所有権または特権が請求されている本発明の実施形態は以下の通り定義される。

Claims (60)

1. エンドヌクレアーゼおよび前記エンドヌクレアーゼに共有結合している１つまたは複数の混合電荷部分を含み、それぞれの混合電荷部分が約１０～約４００の正電荷部分および約１０～約４００の負電荷部分を含み、負電荷部分の数に対する正電荷部分の数の比が約１：０．５～約１：２である、改変エンドヌクレアーゼ。
2. 前記エンドヌクレアーゼが、核酸ガイドヌクレアーゼシステムタンパク質である、
   請求項１に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
3. 前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質である、請求項１または２のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
4. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはその突然変異体もしくはバリアントである、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
5. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはその突然変異体もしくはバリアントである、請求項１～４のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
6. 前記混合電荷部分が、約７．４のｐＨで実質的に電子的に中性である、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
7. 前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて活性であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比べて減少したオフターゲット編集活性および維持されたオンターゲット編集活性を示す、請求項１～６のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
8. 前記オフターゲット編集活性が、非改変エンドヌクレアーゼと比べて、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少している、請求項７に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
9. 前記混合電荷部分が、前記エンドヌクレアーゼのアミノ酸の側鎖に、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ基に、および／または前記エンドヌクレアーゼのＣ末端カルボキシル基に共有結合している、請求項１～８のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
10. 前記混合電荷部分が、約２ｋＤａ～約１３０ｋＤａの分子量を有するペプチドである、請求項１～９のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
11. 前記改変エンドヌクレアーゼが融合タンパク質であり、前記混合電荷部分が、
    ａ）複数の負電荷アミノ酸、
    ｂ）複数の正電荷アミノ酸、および
    ｃ）任意選択で、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される複数の追加のアミノ酸
    からなり、
    負電荷アミノ酸の数に対する正電荷アミノ酸の数の比が約１：０．５～約１：２である混合電荷ドメインである、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
12. 前記複数の負電荷アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびその誘導体からなる群から独立して選択される、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
13. 前記複数の正電荷アミノ酸が、リシン、ヒスチジン、アルギニン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
14. 前記混合電荷ドメインが複数の追加のアミノ酸を含まない、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
15. 前記複数の正電荷アミノ酸がリシンであり、複数の負電荷アミノ酸がグルタミン酸である、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
16. 前記混合電荷ドメインがランダム配列を含む、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
17. 前記混合電荷ドメインが、配列（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３）_ｎを含み、Ｘ１が正電荷アミノ酸であり、Ｘ２が負電荷アミノ酸であり、Ｘ３が何もないまたはプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される追加のアミノ酸であり、ｎが約５～約５０の整数である、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
18. 前記混合電荷ドメインが、複数のリシン、ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
19. 前記混合電荷ドメインが、複数のヒスチジン、ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
20. 前記複数の追加のアミノ酸が、プロリン、セリン、およびグリシンからなる群から選択される、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
21. 前記複数の追加のアミノ酸が複数のプロリンである、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
22. 前記混合電荷ドメインは、複数のリシン、複数のグルタミン酸、および複数のプロリンを含む、請求項１０に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
23. 前記混合電荷部分が、約２ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである、請求項１～９のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
24. 前記ポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、およびポリ（トリメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーからなる群から選択される、請求項２３に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
25. 前記ポリマーがポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）である、請求項２３または２４のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼ。
26. 請求項１～２２のいずれか１項に記載の改変エンドヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸。
27. 請求項２６に記載の核酸およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。
28. 請求項２６に記載の核酸または請求項２７に記載の発現ベクターを含む細胞。
29. 前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項２８に記載の細胞。
30. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の細胞。
31. 前記細胞が細胞培養物中にある、請求項２８に記載の細胞。
32. 前記細胞が生物中にある、請求項２８に記載の細胞。
33. 細胞においてまたは対象においてポリヌクレオチドを編集するための方法であって、請求項１～２５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変エンドヌクレアーゼ、請求項２６に記載の核酸、または請求項２７に記載の発現ベクターを前記細胞または前記対象中に導入するステップを含む前記方法。
34. 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記核酸が前記改変エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記改変エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼに共有結合している混合電荷部分を含み、前記混合電荷部分が約１０～約４００の正電荷部分および約１０～約４００の負電荷部分を含み、負電荷部分の数に対する正電荷部分の数の比が約１：０．５～約１：２である、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記エンドヌクレアーゼが、核酸ガイドヌクレアーゼシステムタンパク質である、
    請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質である、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはその突然変異体もしくはバリアントである、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはその突然変異体もしくはバリアントである、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記混合電荷部分が、約７．４のｐＨで実質的に電子的に中性である、請求項３４～４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて活性であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比べて減少したオフターゲット編集活性および維持されたオンターゲット編集活性を示す、請求項３３～４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記オフターゲット編集活性が、非改変エンドヌクレアーゼと比べて、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少している、請求項４２に記載の方法。
44. 前記混合電荷部分が、前記エンドヌクレアーゼのアミノ酸の側鎖に、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ基に、および／または前記エンドヌクレアーゼのＣ末端カルボキシル基に共有結合している、請求項３３～４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記混合電荷部分が、約２ｋＤａ～約１３０ｋＤａの分子量を有するペプチドである、請求項３３～４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記改変エンドヌクレアーゼが融合タンパク質であって、前記混合電荷部分が、
    ａ）複数の負電荷アミノ酸、
    ｂ）複数の正電荷アミノ酸、および
    ｃ）任意選択で、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される複数の追加のアミノ酸
    からなり、
    正電荷アミノ酸の数に対する負電荷アミノ酸の数の比が約１：０．５～約１：２である混合電荷ドメインである、請求項４５に記載の方法。
47. 前記複数の負電荷アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびその誘導体からなる群から独立して選択される、請求項４６に記載の方法。
48. 前記複数の正電荷アミノ酸が、リシン、ヒスチジン、アルギニン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される、請求項４６に記載の方法。
49. 前記混合電荷ドメインが複数の追加のアミノ酸を含まない、請求項４６に記載の方法。
50. 前記複数の正電荷アミノ酸がリシンであり、複数の負電荷アミノ酸がグルタミン酸である、請求項４６に記載の方法。
51. 前記混合電荷ドメインがランダム配列を含む、請求項４６に記載の方法。
52. 前記混合電荷ドメインが、配列（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３）_ｎを含み、Ｘ１が負電荷アミノ酸であり、Ｘ２が正電荷アミノ酸であり、Ｘ３が何もないまたはプロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびその誘導体からなる群から独立して選択される追加のアミノ酸であり、ｎが約５～約５０の整数である、請求項４６に記載の方法。
53. 前記混合電荷ドメインが、複数のリシン、ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む、請求項４６に記載の方法。
54. 前記混合電荷ドメインが、複数のヒスチジン、ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される複数の負電荷アミノ酸を含む、請求項４６に記載の方法。
55. 前記複数の追加のアミノ酸が、プロリン、セリン、およびグリシンからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
56. 前記複数の追加のアミノ酸が複数のプロリンである、請求項４６に記載の方法。
57. 前記混合電荷ドメインは、複数のリシン、複数のグルタミン酸、および複数のプロリンを含む、請求項４６に記載の方法。
58. 前記混合電荷部分が、約２ｋＤａ～約８０ｋＤａの分子量を有する合成ポリマーである、請求項３３～４４のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記ポリマーが、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）、およびポリ（トリメチルアミンオキシド）（ＴＭＡＯ）ポリマーからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
60. 前記ポリマーがポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）である、請求項５８または請求項５９に記載の方法。

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