KR102254602B1 - Cas9 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용의 일부 측면은 RNA-프로그램 가능한 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9의 특이성을 개선시키기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 또한, 핵산 표적을 절단하기 위한 개선된 특이성을 지니도록 조작된, Cas9의 변이체, 예를 들어 Cas9 이량체 및 융합 단백질이 제공된다. 또한, Cas9 융합 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제 촉매 도메인 또는 재조합효소 촉매 도메인과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 이용하여 부위-특이적 핵산 변형시키기 위한 조성물, 방법 및 키트가 제공된다. 이러한 Cas9 변이체는 DNA의 부위-특이적 변형, 예를 들어 게놈 변형과 관련되는 임상 및 연구 환경에 유용하다.

Description

Cas9 변이체 및 그의 용도 {CAS9 VARIANTS AND USES THEREOF}

관련 출원

본 출원은 35 U.S.C. § 365(c) 하에 2014년 6월 30일에 출원된 미국 출원 번호 14/320,498 및 2014년 6월 30일에 출원된 미국 출원 번호 14/320,467을 우선권 주장하며, 또한 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/874,609; 및 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 61/915,414; 및 2014년 4월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 61/980,315를 우선권 주장하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.

부위-특이적 엔도뉴클레아제는 이론상, 게놈 내의 단일 부위의 표적화된 조작을 허용해주고 치료 및 연구 적용을 위한 유전자 표적화의 맥락에서 유용하다. 포유류를 포함한 각종 유기체에서는, 부위-특이적 엔도뉴클레아제가 비-상동 말단 결합 또는 상동 재조합을 자극함으로써 게놈 공학을 위해 사용되어 왔다. 강력한 연구 도구를 제공하는 것 이외에도, 부위-특이적 뉴클레아제는 또한, 유전자 요법 작용제로서의 잠재력을 지니고 있고, 다음 2개의 부위-특이적 엔도뉴클레아제가 최근에 임상 시험에 들어갔다: (1) 항-HIV 치료적 접근 방식의 일부로서 인간 CCR-5 대립 유전자를 표적으로 하는 CCR5-2246 (NCT00842634, NCT01044654, NCT01252641); 및 (2) 항암 치료적 접근 방식의 일부로서 인간 VEGF-A 프로모터를 표적으로 하는 VF24684 (NCT01082926).

표적을 벗어난 활성(off-target activity)을 수반하지 않거나 최소한의 표적을 벗어난 활성만을 수반하는 것으로 의도된 뉴클레아제 표적 부위를 특이적으로 절단하는 것이 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 임상 적용을 위한 전제 조건이고, 또한 기본 연구 적용에서 고-효율 게놈 조작을 위한 전제 조건이다. 예를 들어, 조작된 부위-특이적 결합성 도메인의 불완전한 특이성은 의도한 표적 이외의 게놈 유전자 자리의 바람직하지 못한 변경 및 세포성 독성과 연관이 있어 왔다. 그러나, 현재 입수 가능한 대부분의 뉴클레아제는 상당히 표적을 벗어난 활성을 나타내므로, 임상 적용에 적합하지 않을 수 있다. 임상 및 연구 환경에서 사용하기 위하여 최근에 생겨난 뉴클레아제 플랫폼(platform)은 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas9이다. 이들 뉴클레아제가 특이적 표적 부위의 절단을 지시하는 가이드 RNA (gRNA)와 결합할 수 있긴 하지만, 특정의 Cas9:gRNA 복합체에 대해서는 표적을 벗어난 활성이 여전히 관찰된다 (Pattanayak et al., "High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity." Nat Biotechnol. 2013; doi: 10.1038/nbt.2673). 따라서, 개선된 특이성을 지닌 뉴클레아제를 조작하기 위한 기술이 필요하다.

표적화된 유전적 조작에 유용한 또 다른 부류의 효소는 부위-특이적 재조합효소 (SSR)이다. 이들 효소는 짧은 DNA 서열을 인식하고 이와 결합함으로써 DNA 절편의 재배열을 수행하는데, 여기에서 이들은 DNA 골격을 절단하고, 관련된 2개의 DNA 나선을 교환하며 DNA 가닥을 재연결시킨다. 이러한 재배열로 인해, DNA 절편의 표적화된 삽입, 역위, 절제 또는 전위가 허용된다. 그러나, 부위-특이적 엔도뉴클레아제와 같이, 자연 발생적 SSR은 전형적으로, 특이적 컨센서스 서열을 인식하고 이와 결합하므로, 이 점에 있어서 제한된다. 변경되고/되거나 개선된 특이성을 지닌 재조합효소(recombinase)를 조작하기 위한 기술이 또한 필요하다.

본 개시내용의 일부 측면은 일부 조작된 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 보고된 독성이 표적을 벗어난 DNA 절단에 근거한다는 인식에 기초한다. 따라서 본원에 기재된 특정 측면은 서열 (예를 들어, 목적하는 표적에서 2개 이상의 부위에 뉴클레아제 결합을 갖는다)의 수를 증가시키고/시키거나 2개 이상의 단백질 간의 뉴클레아제의 활성 (예를 들어, 표적 결합성 및 표적 절단성)을 분할시키는 것이 뉴클레아제의 특이성을 증가시킴으로써, 표적을 벗어난 효과가 발생할 가능성이 감소된다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 부위-특이적 뉴클레아제, 특히 RNA-프로그램 가능한 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9 엔도뉴클레아제의 특이성을 개선하기 위한 전략, 조성물, 시스템 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 특정 측면은 개선된 특이성을 갖도록 조작된 Cas9 엔도뉴클레아제의 변이체를 제공한다.

본 개시내용의 다른 측면은 현재 입수 가능한 부위-특이적 재조합효소 (SSR)가 전형적으로, 별개의 컨센서스 서열을 인식하고 이와 결합하는 것으로 제한된다는 인식에 기초한다. 따라서 본원에 기재된 특정 측면은 RNA-프로그램 가능한 (뉴클레아제-불활성화) 뉴클레아제 (또는 그의 RNA-결합성 도메인)와 재조합효소 도메인 간의 융합이, 이론상 예를 들어, 시술자에 의해 선택된 어떠한 부위 [예를 들어, 재조합되는 구역의 서열에 따라서 조작되거나 선별되는 가이드 RNA (gRNA)에 의해 지정된 부위]에서도 DNA와 결합하고 재조합할 수 있는 신규 재조합효소를 제공한다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 이러한 신규 재조합효소는 특히, 표적화된 삽입, 결실, 역위, 전위 또는 기타 게놈 변형에 유용하다. 따라서, 예를 들어 상기 표적화된 게놈 조작을 위하여, 이들 본 발명이 재조합효소 융합 단백질을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

따라서, 본 개시내용의 한 실시양태는, 예를 들어 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 그의 이량체를 제공한다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인; 및 (ii) 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI DNA 절단 도메인의 단량체) (예를 들어, 도 1A, 6d 참조). 이러한 융합 단백질은 세포의 핵 내로 수송될 융합 단백질에 대하여 신호를 보내는 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 하나 이상의 도메인은 링커에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 이러한 링커는 비-펩티드성 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 경우, 이러한 펩티드 링커는 XTEN 링커, 트리-펩티드 GGS의 하나 이상의 반복 서열을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 12a에 제공된 바와 같은 어느 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 9, 서열 10, 서열 11, 또는 서열 12, 또는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 또는 서열 12 중 어느 하나의 변이체 또는 단편으로서 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 상기 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 가이드 RNA (gRNA)와 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각 표적 핵산의 2개의 별개의 영역과 결합되는 gRNA를 포함하는, 상기 융합 단백질의 이량체를 가짐으로써, 예를 들어 표적 핵산과의 결합을 지시하는 단일 gRNA를 포함하는 단량체성 RNA-가이드된 뉴클레아제와 비교해서 개선된 특이성이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 본 발명의 Cas9 변이체를 이용한 부위-특이적 DNA 절단 방법이 제공된다. 이러한 방법은 전형적으로, (a) DNA를 본 발명의 융합 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인과 FokI DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질)과 접촉시키는 단계 (여기서, 불활성 Cas9 도메인은 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 gRNA와 결합된다); 및 (b) 상기 DNA를 제2 융합 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 FokI DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질)과 접촉시키는 단계 (여기서, 이러한 제2 융합 단백질의 불활성 Cas9 도메인은 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2의 gRNA와 결합된다)를 포함한다 [여기서, 단계 (a) 및 (b)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 융합 단백질의 뉴클레아제 도메인이 이량체화되어, DNA가 상기 결합된 융합 단백질들 사이의 영역에서 절단된다]. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA는 DNA의 동일 가닥과 혼성화되거나, 또는 단계 (a) 및 (b)의 gRNA는 DNA의 반대 가닥과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, DNA는 특정 개체, 예컨대 인간 내에 존재할 수 있는 특정 세포, 예를 들어 진핵 세포 또는 원핵 세포 내에 있다.

또 다른 실시양태에 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 이량체 (예를 들어, 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 FokI DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질의 이량체)를 포함하는 복합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 이량체의 각 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 단일 연장된 gRNA와 결합되어, 이량체의 하나의 융합 단백질이 gRNA의 특정 부분과 결합되고 이량체의 다른 융합 단백질이 gRNA의 또 다른 부분과 결합되도록 한다 (예를 들어, 도 1B 참조). 일부 실시양태에서, 상기 gRNA는 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 또는 300개 이상 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산과 혼성화되는 상기 연장된 gRNA의 영역은 15 내지 25개, 19 내지 21개, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, DNA를, 단일 연장된 gRNA와 결합된 본 발명의 2개 융합 단백질의 복합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 부위-특이적 DNA 절단 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 절단될 DNA의 2개의 별도의 영역과 혼성화되는 2개 부분을 함유하고; 복합체는 이러한 gRNA의 부분들이 상기 2개의 영역과 혼성화됨에 따라 DNA와 결합되며; 이러한 복합체의 결합으로 인해, 융합 단백질의 뉴클레아제 도메인이 이량체화되어, 이러한 도메인이 상기 결합된 융합 단백질들 사이의 영역에서 DNA를 절단한다. 일부 실시양태에서, gRNA의 2개 부분은 DNA의 동일 가닥과 혼성화된다. 다른 실시양태에서, gRNA의 2개 부분은 DNA의 반대 가닥과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, gRNA의 2개 부분은 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, DNA는 특정 개체, 예컨대 인간 내에 존재할 수 있는 특정 세포, 예를 들어 진핵 세포 또는 원핵 세포 내에 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따라서, Cas9 단백질의 단편을 포함하는 분할(split) Cas9 단백질 (분할 Cas9 단백질을 포함하는 융합 단백질 포함)이 제공된다. 일부 실시양태에서, Cas9의 gRNA 결합성 도메인은 포함하지만, DNA 절단 도메인은 포함하지 않는 단백질이 제공된다. 다른 실시양태에서, Cas9의 DNA 절단 도메인은 포함하지만, gRNA 결합성 도메인은 포함하지 않는 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공된다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인, 및 (ii) Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, 여기서 도메인 (ii)은 DNA 절단 도메인을 포함하지 않는다) (예를 들어, 도 2B 참조). 일부 실시양태에서, 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공된다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인, 및 (ii) DNA 절단 도메인 (예를 들어, 여기서 도메인 (ii)은 gRNA 결합성 도메인을 포함하지 않는다) [예를 들어, 도 2C ("B" 도메인을 포함한, 우측 상의 융합 단백질) 참조]. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질 중 어느 것의 단백질 이량체가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이량체는 분할 Cas9 단백질의 2개의 절반, 예를 들어 (i) Cas9의 gRNA 결합성 도메인은 포함하지만, DNA 절단 도메인은 포함하지 않는 단백질, 및 (ii) Cas9의 DNA 절단 도메인은 포함하지만, gRNA 결합성 도메인은 포함하지 않는 단백질을 포함한다 (예를 들어, 도 2A 참조). 일부 실시양태에서, 이량체는 분할 Cas9 단백질의 하나의 절반; 및 분할 Cas9 단백질의 다른 절반을 포함하는 융합 단백질을 포함한다 (예를 들어, 도 2B 참조). 예를 들어, 특정 실시양태에서 이러한 이량체는 (i) Cas9의 gRNA 결합성 도메인은 포함하지만, DNA 절단 도메인은 포함하지 않는 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 이량체는 (i) Cas9의 DNA 절단 도메인은 포함하지만, gRNA 결합성 도메인은 포함하지 않는 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 융합 단백질 (각각의 융합 단백질은 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 분할 Cas9의 하나의 절반을 포함한다)을 포함하는 이량체가 제공된다 (예를 들어, 도 2C 참조). 예를 들어, 특정 실시양태에서, 이러한 이량체는 (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이와 같이 제공된 단백질 이량체 중 어느 것이 하나 이상의 gRNA(들)와 연합된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질 이량체를 활용하는 부위-특이적 DNA 절단 방법이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 DNA를, (i) Cas9의 gRNA 결합성 도메인은 포함하지만, DNA 절단 도메인은 포함하지 않는 단백질, 및 (ii) Cas9의 DNA 절단 도메인은 포함하지만, gRNA 결합성 도메인은 포함하지 않는 단백질을 포함하는 단백질 이량체와 접촉시키는 단계 (여기서, 이러한 이량체는 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 gRNA와 결합되고, 이러한 DNA의 절단이 일어난다)를 포함한다 (예를 들어, 도 2A 참조). 일부 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 절단에 사용된 단백질 이량체는 (i) Cas9의 gRNA 결합성 도메인은 포함하지만, DNA 절단 도메인은 포함하지 않는 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다 (예를 들어, 도 2B 참조). 일부 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 절단에 사용된 이량체는 (i) Cas9의 DNA 절단 도메인은 포함하지만, gRNA 결합성 도메인은 포함하지 않는 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단백질 이량체는 DNA의 2개 영역과 혼성화되는 2개의 gRNA와 결합되고, 이러한 DNA의 절단이 일어난다 (예를 들어, 도 2B 참조). 일부 실시양태에서, 상기 2개의 gRNA는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 절단에 사용된 이량체는 다음 2개의 융합 단백질을 포함한다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질. 일부 실시양태에서, 단백질 이량체는 DNA의 3개 영역과 혼성화되는 3개의 gRNA와 결합되고, 이러한 DNA의 절단이 일어난다. 이러한 배열을 가짐으로써, 예를 들어 2개 이상의 gRNA (또는 표적과 혼성화되는 2개 이상의 영역을 포함하는 gRNA)와 연합된 이량체를 이용하여, 예를 들어 표적 핵산의 2개 이상의 영역을 표적화함으로써, 표적 핵산의 단일 영역과 결합되는 뉴클레아제와 비교해서 절단 특이성이 증가된다. 일부 실시양태에서, 3개의 gRNA는 제1 영역과 제2 영역 사이, 및 제2 영역과 제3 영역 사이가 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, DNA는 특정 개체, 예컨대 인간 내에 존재할 수 있는 특정 세포, 예를 들어 진핵 세포 또는 원핵 세포 내에 있다.

또 다른 실시양태에 따라서, 최소한의 Cas9 단백질이 제공되는데, 예를 들어 이러한 단백질은 N- 및/또는 C-말단 끝을 잘라낸 것을 포함하고, RNA 결합성과 DNA 절단 활성을 보유하고 있다. 일부 실시양태에서, 상기와 같이 N-말단 끝을 잘라낸 것은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 40개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 150개 이상의 아미노산을 제거한다. 일부 실시양태에서, C-말단 끝을 잘라내는 것은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 40개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 또는 150개 이상의 아미노산을 제거한다. 일부 실시양태에서, 상기와 같이 최소화된 Cas9 단백질은 추가로, 결합된 gRNA를 포함한다.

일부 실시양태에서, DNA를 최소화된 Cas9 단백질:gRNA 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 부위-특이적 DNA 절단 방법이 제공된다.

또 다른 실시양태에 따라서, Cas9 (또는 그의 단편)의 이량체 (여기서, 이러한 이량체는 단일 gRNA를 통하여 조정된다)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 gRNA는 (i) 각각 Cas9 단백질과 결합할 수 있고, (ii) 각각 표적 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열)과 혼성화되는 2개 이상의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산과 혼성화되는 gRNA의 부분은 각각, 표적 핵산 서열에 대해 상보적인 5개 이하, 10개 이하, 또는 15개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산과 혼성화되는 gRNA의 부분은 링커 서열에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 이러한 링커 서열은 표적 핵산과 혼성화된다 (예를 들어, 도 4 참조). 일부 실시양태에서, DNA를, 단일 gRNA를 통하여 조정된 Cas9 단백질의 이량체와 접촉시키는 단계를 포함하는 부위-특이적 DNA 절단 방법이 제공된다.

또 다른 실시양태에 따라서, 본 개시내용은, 예를 들어 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 그의 이량체 및 사량체를 제공한다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인; 및 (ii) 재조합효소 촉매 도메인 (예를 들어, 도 5 참조). 이러한 재조합효소 촉매 도메인은 일부 실시양태에서, Hin 재조합효소, Gin 재조합효소, 또는 Tn3 위치 특이성 재조합 촉진 효소(resolvase)의 재조합효소 촉매 도메인으로부터 유래된다. 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은, 예를 들어 상기 융합 단백질이 표적 핵산 서열을 표적으로 하도록 gRNA와 결합할 수 있다. 융합 단백질은 세포의 핵 내로 수송될 융합 단백질에 대하여 신호를 보내는 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 하나 이상의 도메인은 링커에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 이러한 링커는 비-펩티드성 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 경우, 이러한 펩티드 링커는 XTEN 링커, 트리-펩티드 GGS의 하나 이상의 반복 서열을 포함하는 아미노산 서열, 또는 도 12a에 제공된 바와 같은 어느 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질을 활용하는, 부위-특이적 재조합 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 2개의 별도의 DNA 분자를 재조합하는 데 유용하고, 이는 (a) 제1 DNA를 제1 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제1 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 제1 gRNA와 결합된다); (b) 제1 DNA를 제2 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제1 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2 gRNA와 결합된다); (c) 제2 DNA를 제3 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제3 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제2 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 제3 gRNA와 결합된다); 및 (d) 제2 DNA를 제4 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제4 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제2 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제4 gRNA와 결합된다)를 포함한다 [여기서, 단계 (a) 내지 (d)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 상기 DNA가 재조합되도록 하는 조건 하에 융합 단백질의 재조합효소 촉매 도메인이 사량체화된다]. 일부 실시양태에서, 단일 DNA 분자의 2개 영역 간의 부위-특이적 재조합 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 특정 DNA를 제1 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 제1 gRNA와 결합된다); (b) 상기 DNA를 제2 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2 gRNA와 결합된다); (c) 상기 DNA를 제3 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제3 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제3 영역과 혼성화되는 제3 gRNA와 결합된다); 및 (d) 상기 DNA를 제4 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제4 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제4 영역과 혼성화되는 제4 gRNA와 결합된다)를 포함한다 [여기서, 단계 (a) 내지 (d)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 상기 DNA가 재조합되도록 하는 조건 하에 융합 단백질의 재조합효소 촉매 도메인이 사량체화된다]. 부위-특이적 재조합 방법을 포함한 일부 실시양태에서, 동일한 DNA 분자와 혼성화되는 gRNA는 이러한 DNA 분자의 반대 가닥과 혼성화된다. 예를 들어, 단일 DNA 분자의 부위-특이적 재조합을 포함한 일부 실시양태에서, 2개의 gRNA는 상기 DNA의 하나의 가닥과 혼성화되고, 다른 2개의 gRNA는 반대 가닥과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 이들 gRNA는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 그들 각각의 DNA의 영역 (예를 들어, 동일한 가닥 상에 있음)과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA는 특정 개체, 예컨대 인간 내에 존재하거나 또는 이로부터 수득될 수 있는 특정 세포, 예를 들어 진핵 세포 또는 원핵 세포 내에 있다.

또 다른 실시양태에 따라서, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 단백질 (예를 들어, Cas9 변이체, Cas9 이량체, Cas9 융합 단백질, Cas9 단편, 최소화 Cas9 단백질, 절단 도메인을 수반하지 않는 Cas9 변이체, gRNA 도메인을 수반하지 않는 Cas9 변이체, Cas9-재조합효소 융합물 등) 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 gRNA 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 Cas9 단백질 및 본원에 기재된 바와 같은 gRNA(들)의 어느 조합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Cas9 단백질 및/또는 gRNA 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 단백질 발현을 위한 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Cas9 단백질 및/또는 gRNA 중 어느 것을 발현하기 위한 유전적 구조물을 포함하는 세포가 제공된다.

일부 실시양태에서, 키트가 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 Cas9 단백질 및/또는 gRNA 중 어느 것을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 Cas9 단백질 및/또는 gRNA를 코딩하는 것 중 어느 것을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 재조합 단백질 발현을 위한 벡터 (여기서, 이러한 벡터는 본원에 기재된 Cas9 단백질 및/또는 gRNA 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다)를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Cas9 단백질 및/또는 gRNA 중 어느 것을 발현하기 위한 유전적 구조물을 포함하는 세포를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명의 다른 이점, 특징 및 용도는 본 발명의 특정의 비-제한적 실시양태의 상세한 설명; 일정한 비율로 도시되지 않고 도식적인 도면; 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1은 본 발명의 특정 실시양태를 도식적으로 상세히 열거한 것이다. (A) 이 실시양태에서는, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 단백질이 FokI 뉴클레아제 도메인의 단량체와 융합된다. 이중 가닥 DNA-절단은 표적 부위에서 FokI 단량체의 이량체화를 통하여 달성되고, 이는 2개의 별개의 Cas9:gRNA 복합체의 동시 결합에 의존적이다. (B) 이 실시양태에서는, 대체 입체배치가 제공되는데, 여기서는 2개의 별개의 gRNA 모티프를 함유하는 단일 연장된 gRNA의 작용을 통하여 2개의 Cas9-FokI 융합물이 조정된다. 이러한 gRNA 모티프는 별개의 영역 내의 표적과 혼성화되는 영역 뿐만 아니라 각 융합 단백질과 결합되는 영역을 포함한다. 상기 연장된 gRNA는 협조적 결합을 증강시킬 수 있고, 상기 융합물의 특이성 프로파일을 변경시킬 수 있다.
도 2는 본 발명의 특정 실시양태를 도식적으로 상세히 열거한 것이다. (A) 이 실시양태에서는, 이량체성 분할 Cas9가 A) gRNA-결합성 능력을 B) dsDNA 절단으로부터 분리시켜 준다. 단백질의 양 절반을 공동-국재하여 연합시키고 뉴클레아제-활성 상태가 되도록 재폴딩하는 경우에 DNA 절단이 일어난다. (B) 이 실시양태에서는, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 돌연변이체가 분할 Cas9 뉴클레아제의 A-절반 (또는 일부 실시양태에서, B-절반)과 융합된다. 표적 부위에서 Cas9-A-절반 (또는 Cas9-B-절반) 융합물과 불활성 gRNA-결합성 Cas9 B-절반 (또는 A-절반) 둘 다가 각각 결합되면, dsDNA는 분할 단백질 재어셈블리를 수행할 수 있게 된다. 이러한 분할 Cas9-쌍 형성은 2개의 별개의 gRNA-결합성 Cas9 단백질을 이용하여, 분할 뉴클레아제-활성 Cas9가 반드시 정확한 표적 서열 상에서만 재어셈블리되도록 할 수 있다. (C) 이 실시양태에서는, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 돌연변이체가 분할 Cas9 뉴클레아제의 A-절반과 융합된다. 별도의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 돌연변이체는 분할 Cas9 뉴클레아제의 B-절반과 융합된다. 하나의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 돌연변이체가 gRNA 표적 부위와 결합되고, 다른 뉴클레아제-불활성화 Cas9 돌연변이체가 제2의 gRNA 표적 부위와 결합되면, 분할 Cas9 절반은 이량체화될 수 있고 제3의 gRNA 표적과 결합되어, dsDNA를 절단할 수 있는 완전한 활성의 Cas9 뉴클레아제가 될 수 있다. 이러한 분할 Cas9-쌍 형성은 3개의 별개의 gRNA-결합성 Cas9 단백질을 이용하여, 분할 뉴클레아제-활성 Cas9가 반드시 정확한 표적 서열 상에서만 재어셈블리되도록 한다. 불활성 Cas9 대신 다른 DNA-결합성 도메인 (아연 핑거, TALE 단백질 등)을 이용하여 분할 Cas9 뉴클레아제의 재어셈블리를 완료할 수 있다.
도 3은 Cas9 활성을 위한 필수 도메인을 포함하는 최소한의 Cas9 단백질을 도식적으로 나타낸 것이다. 완전한 길이의 Cas9는 >150 kDa의 단백질을 초래하는 4.1 kb 유전자이다. 특이적 결실 및/또는 끝을 잘라내는 것은 Cas9의 활성 (예를 들어, gRNA 결합성 및 DNA 절단 활성)에는 영향을 미치지 않으면서 그의 크기를 감소시킨다. 이와 같이 최소화된 Cas9 단백질은, 예를 들어 바이러스 벡터, 예컨대 AAV (수용 서열 약 <4700 bp) 또는 렌티바이러스 (수용 서열 약 <9 kb)를 이용하여 세포에 전달하는 효능을 증가시키거나, 또는 다중화 gRNA/Cas9 접근 방식을 추구하는 경우에 그 효능을 증가시킨다.
도 4는 2개의 Cas9 단백질이 2개의 별개의 gRNA 모티프를 함유하는 단일 연장된 RNA의 작용을 통하여 어떻게 조정될 수 있지를 도시한 것이다. 각각의 gRNA 표적화 영역은 단일 Cas9:gRNA 단위가 그 자체에 의해서 효율적으로 결합될 수 없도록 단축된다. 정상적인 20 nt 표적화 서열은 그 일부분 (예를 들어, 5' 초기 10 nt)이 일부 비-특이적 링커 서열, 예컨대 AAAAAAAAAA (서열 13)로 변화되도록 변경시켰는데, gRNA의 10 nt 만이 여전히 표적 결합을 지시하고 있다 (또 다른 한편으론, 상기 5' 10 nt가 완전히 잘려진다). 이러한 "저-친화성" gRNA 단위는 링커 서열에 의해 분리된, 제2의 별개의 저 친화성 gRNA 단위 하류를 수반한 탠덤(tandem) gRNA 구조물의 일부로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 2개 초과의 저 친화성 gRNA 단위 (예를 들어, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 등)가 존재한다. 일부 실시양태에서, 링커는 표적 핵산 상보성 서열을 포함한다 (예를 들어, DNA 표적과 접촉하는 링커 영역으로써 도시된 바와 같음).
도 5는 Cas9-재조합효소 융합물이 목적하는 서열 (부위)에서 표적 DNA와 결합 및 조합하기 위해 gRNA를 통하여 어떻게 조정될 수 있는지를 도식적으로 나타낸 것이다. (a, b) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (dCas9)단백질이 재조합효소 도메인 (Rec)의 단량체와 융합된다. 부위-특이적 재조합은 표적 부위에서 재조합효소 촉매 도메인 단량체를 이량체화 (a)한 다음, 별도의 Cas9-재조합 부위 상에 어셈블리된 2개의 이량체를 사량체화 (b)함으로써 달성된다. dCas9:gRNA 복합체와의 융합물은 양옆에 위치하고 있는 표적 부위의 서열 실체를 결정하는 반면, 재조합효소 촉매 도메인은 코어 서열 (2개의 dCas9-결합 부위 사이의 서열)의 실체를 결정한다. (b) 재조합은 dCas9-재조합효소 사량체 복합체 내에서의 가닥 절단, 교환, 및 재결찰을 통하여 진행된다.
도 6은 Cas9와 FokI-dCas9 융합 변이체의 구조를 도시한 것이다. (a) 가이드 RNA (gRNA)와 복합체를 형성하는 Cas9 단백질이 표적 DNA와 결합된다. 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 단백질은 dsDNA의 풀림을 개시하고 gRNA:DNA 염기쌍 형성을 개시하는 PAM 서열 NGG를 인식한다. (b) FokI-dCas9 융합물 구조를 시험하였다. NLS, FokI 뉴클레아제, 및 dCas9의 4가지 별개의 입체배치를 어셈블리하였다. 17개의 단백질 링커 변이체를 또한 시험하였다. (c) gRNA 표적 부위를 GFP 내에서 시험하였다. 7개 gRNA 표적 부위를 선택하여, PAM이 상기 절단된 스페이서 서열으로부터 멀리 떨어진 배향 (배향 A)에서 FokI-dCas9 활성을 시험하였다. 취합하면, 이들 7개 gRNA는 FokI-dCas9 융합 변이체가 5 내지 43 bp 범위의 스페이서 길이 전반에 걸쳐 시험될 수 있게 해주었다. PAM이 스페이서 서열에 인접한 배향 B를 시험하기 위해 사용된 가이드 RNA에 관해서는 도 9를 참조할 수 있다. (d) dCas9와 융합된 FokI 뉴클레아제의 단량체는 표적 유전자 자리 내의 별도의 부위와 결합된다. 인접하게 결합된 FokI-dCas9 단량체 만이 dsDNA 절단을 촉발시키는 촉매적 활성의 FokI 뉴클레아제 이량체를 어셈블리할 수 있다. (c)에 제시된 서열은 다음과 같이 확인된다: "EmGFP (bp 326-415)"는 서열 204에 상응하고; "G1"은 서열 205에 상응하며; "G2"는 서열 206에 상응하고; "G3"은 서열 207에 상응하며; "G4"는 서열 208에 상응하고; "G5"는 서열 209에 상응하며; "G6"은 서열 210에 상응하고; "G7"은 서열 211에 상응한다.
도 7은 fCas9, Cas9 니카제(nickase), 및 야생형 Cas9에 의한 게놈 DNA 변형을 나타낸 것이다. (a)는 gRNA를 수반하지 않거나, 또는 GFP 유전자를 배향 A로 표적화하는 가변 스페이서 길이의 gRNA 쌍을 수반한 fCas9, Cas9 니카제, 또는 야생형 Cas9의 GFP 붕괴 활성을 도시한 그래프를 나타낸다. (b)는 fCas9, Cas9 니카제 또는 야생형 Cas9, 및 GFP 부위를 표적화하는 14 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA (gRNA G3 및 G7; 도 6c) (각각의 gRNA를 개별적으로 수반하거나, 또는 gRNA를 전혀 수반하지 않음)로 처리된 세포로부터 증폭된 재생한 표적 부위 DNA의 서베이어(Surveyor) 절단 검정의 PAGE 분석으로부터 삽입-결실 변형 효율(Indel modification efficiency)을 보여주는 겔의 영상이다. 이러한 삽입-결실 변형 비율(%)은 샘플에 대한 각 레인 아래에 제시되는데, 탐지 한계 (약 2%) 초과의 변형을 나타낸다. (c-g)는 (c) GFP 부위를 표적화하는 14 또는 25 bp 간격으로 떨어진 gRNA의 2개 쌍, (d) CLTA 부위를 표적화하는 19 bp 간격으로 떨어진 gRNA의 1개 쌍, (e) EMX 부위를 표적화하는 23 bp 간격으로 떨어진 gRNA의 1개 쌍, (f) HBB 부위를 표적화하는 16 bp 간격으로 떨어진 gRNA의 1개 쌍, 및 (g) VEGF 부위를 표적화하는 14 또는 16 bp 간격으로 떨어진 gRNA의 2개 쌍에 대한 삽입-결실 변형 효율을 도시한 그래프를 나타낸다. 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3개의 생물학적 복제물로부터의 평균의 표준 오차를 반영한다.
도 8은 fCas9, Cas9 니카제, 및 야생형 Cas9의 DNA 변형 특이성을 나타낸 것이다. (a)는 gRNA 쌍을 배향 A로 이용하여 야생형 Cas9, Cas9 니카제, 및 fCas9에 의한 GFP 유전자 붕괴를 도시한 그래프를 나타낸다. fCas9의 고 활성을 위해서는 약 15 및 25 bp의 스페이서 길이가 필요한데, 이는 대략 1회의 DNA 나선형 회전만큼 떨어져 있다. (b)는 gRNA 쌍을 배향 B로 이용하여 GFP 유전자 붕괴를 도시한 그래프를 나타낸다. Cas9 니카제는 gRNA 쌍의 어느 하나의 배향을 받아들이지만, fCas9는 그렇지 못하다. (c)는 2개의 gRNA의 존재에 의존하는, Cas9 니카제 또는 야생형 Cas9에 의해서가 아니라 fCas9에 의한 GFP 유전자 붕괴를 도시한 그래프를 나타낸다. 4개의 단일 gRNA를 다양한 스페이서 길이의 3개의 gRNA 쌍과 함께 시험하였다. 14 또는 25 bp의 스페이서 길이를 수반한 배향 A에 gRNA 쌍 (각각 gRNA 1+5, 및 gRNA 3+7)이 존재하면, fCas9는 활성이지만, 10-bp 스페이서를 수반한 gRNA 쌍 (gRNA 1+4)이 사용되는 경우에는 그렇지 않다. (a-c)에서, "처리하지 않음"은 세포에게 플라스미드 DNA를 전달하지 않는 것을 지칭한다. (d-f)는 fCas9, Cas9 니카제, 또는 야생형 Cas9와, (d) CLTA 부위를 표적화하는 19 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA (gRNA C1 및 C2), (e) EMX 부위를 표적화하는 23 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA (gRNA E1 및 E2), 또는 (f, g) VEGF 부위를 표적화하는 14 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA (gRNA V1 및 V2)로 처리된 인간 세포로부터 증폭된 게놈의 표적에 적중한 부위와 표적을 벗어난 부위의 고 처리량 DNA 서열 분석으로부터 삽입-결실 돌연변이 빈도를 도시한 그래프를 나타낸다. (g)는 VEGF 표적을 벗어난 부위 1에서의 게놈 변형을 측정하기 위한 2가지 심층 시험을 도시하는 그래프를 나타낸다. 시험 1은 각 샘플에 대한 > 8 x 10⁵개 서열 판독치 및 150 ng의 게놈 입력 DNA를 사용하였고; 시험 2는 각 샘플에 대한 > 23 x 10⁵개 서열 판독치 및 600 ng의 게놈 입력 DNA를 사용하였다. (d-g)에는, 모든 유의적 [P 값 < 0.005 피셔(Fisher)의 직접 확률 시험] 삽입-결실 빈도가 제시된다. P 값은 표 3에 열거되어 있다. (d-f)의 경우, 표적에 적중한 샘플과 표적을 벗어난 샘플 각각을 1회 서열 분석하였는데, 표적에 적중한 샘플당 > 10,000개 서열이 분석되었고, 표적을 벗어난 샘플당 평균 76,260개 서열이 분석되었다 (표 3). (c)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 다음과 같이 확인된다: 도 8c의 상단에서 발견된 서열은 서열 204에 상응하고; "G1"은 서열 205에 상응하며; "G3"은 서열 207에 상응하고; "G5"는 서열 209에 상응하며; "G7"은 서열 211에 상응하고; "G1+4"는 서열 205 및 서열 208에 상응하며; "G1+5"는 서열 205 및 서열 209에 상응하고; "G3+7"은 서열 207 및 서열 211에 상응한다.
도 9는 게놈 GFP 유전자 내의 표적 DNA 서열을 나타낸 것이다. 7개 gRNA 표적 부위를 선택하여, PAM이 상기 절단된 스페이서 서열과 인접한 배향 (배향 B)으로 FokI-dCas9 후보 활성을 시험하였다. 취합하면, 이들 7개 gRNA는 FokI-dCas9 융합 변이체가 4 내지 42 bp 범위의 6개 스페이서 길이 전반에 걸쳐 시험될 수 있게 해주었다. 제시된 서열은 다음과 같이 확인된다: "EmGFP (bp 297-388)"는 서열 212에 상응하고; "G8"은 서열 213에 상응하며; "G9"는 서열 214에 상응하고; "G10"은 서열 215에 상응하며; "G11"은 서열 216에 상응하고; "G12"는 서열 217에 상응하며; "G13"은 서열 218에 상응하고; "G14"는 서열 219에 상응한다.
도 10은 게놈 DNA-변형 활성을 측정하기 위한 GFP 붕괴 검정을 나타낸 것이다. (a)는 후보 FokI-dCas9 융합 구조물의 활성을 시험하기 위해 사용된 게놈적으로 통합된 EmGFP 유전자를 구성적으로 발현하는 HEK293-유래된 세포주를 도식적으로 도시한 것이다. 이들 세포를 적당한 뉴클레아제 및 gRNA 발현 플라스미드로 공동-형질감염시키면, EmGFP 코딩 서열 내에서 dsDNA 절단이 초래되어, 변이성 NHEJ가 자극되고 GFP의 발현을 붕괴시킬 수 있는 삽입-결실이 발생하여, 세포성 형광의 상실이 야기된다. 이어서, GFP 형광의 상실을 디스플레이하는 세포의 분획을 유동 세포계수법에 의해 정량화한다. (b)는 야생형 Cas9 및 gRNA 발현 플라스미드로 공동-형질감염시키기 전 및 후에 EmGFP-HEK293 세포의 200x 배율 하에 전형적인 표면형광(epifluorescence) 현미경 영상을 나타낸다.
도 11은 상이한 배향과 다양한 스페이서 길이의 gRNA 쌍과 조합된 FokI-dCas9 융합물 후보의 활성을 도시한 그래프를 나타낸 것이다. 도 6b에 기재된 융합물 구조를 대상으로 하여, 모든 (a) 배향 A gRNA 스페이서 및 (b) 배향 B gRNA 스페이서 (도 6c 및 도 9) 전반에 걸쳐 GFP 기능 상실 리포터를 이용하여 유동 세포계수법에 의해 기능성에 관하여 시험하였다. 제시된 모든 FokI-dCas9 융합물 데이터는 단일 시험에 따른 결과이다. 야생형 Cas9 및 Cas9 니카제 데이터는 2개 복제물의 평균인 반면, '처리하지 않은' 음성 대조군 데이터는 6개 복제물의 평균이며, 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다. Y-축 전반에 걸친 회색 점선은 동일자로 수행된 '처리하지 않은' 대조군의 평균에 상응한다. "(GGS)x3"으로서 제시된 서열은 서열 14에 상응한다.
도 12는 NLS-FokI-dCas9에서의 단백질 링커의 최적화를 나타낸 것이다. (a)는 시험된 모든 링커 변이체의 표를 나타낸다. 야생형 Cas9 및 Cas9 니카제가 비교를 위해 포함되었다. FokI와 dCas9 사이에 (GGS)₃ (서열 14) 링커를 수반한 초기 활성 구조물 NLS-FokI-dCas9을 특정 범위의 대체 링커 전반에 걸쳐 시험하였다. fCas9에 대한 링커의 최종 선택이 강조되었다. (b)는 링커 변이체를 수반한 FokI-dCas9 융합물의 활성을 도시한 그래프를 나타낸다. 각 변이체를 gRNA 쌍 배향 A를 이용하여 5 내지 43 bp 범위의 스페이서 길이 전반에 걸쳐 시험하였다. gRNA가 결여된 대조군 ("gRNA 없음")이 각각의 별도의 융합 구조물에 포함되었다. NLS-FokI-dCas9 변이체 L8이 가장 우수한 활성을 나타냈는데, 이는 Cas9 니카제의 활성에 근접하다. 변이체 L4 내지 L9는 14-bp 및 25-bp 스페이서 길이를 수반한 피크 활성을 나타내는데, 이는 2개의 최적 스페이서 길이가 대략 dsDNA의 1회의 나선형 회전만큼 떨어져 있다는 것을 제안하고 있다. (a)에 제시된 서열은 다음과 같이 확인된다: GGSGGSGGS는 서열 14에 상응하고; GGSGGSGGSGGSGGSGGS는 서열 15에 상응하며; MKIIEQLPSA는 서열 22에 상응하고; VRHKLKRVGS는 서열 23에 상응하고; VPFLLEPDNINGKTC는 서열 19에 상응하며; GHGTGSTGSGSS는 서열 24에 상응하고; MSRPDPA는 서열 25에 상응하며; GSAGSAAGSGEF는 서열 20에 상응하고; SGSETPGTSESA는 서열 17에 상응하며; SGSETPGTSESATPES는 서열 16에 상응하고; SGSETPGTSESATPEGGSGGS는 서열 18에 상응하며; GGSM은 서열 301에 상응하고; SIVAQLSRPDPA는 서열 21에 상응한다.
도 13은 내인성 인간 EMX, VEGF, CLTA, 및 HBB 유전자 내의 표적 DNA 서열을 나타낸 것이다. 내인성 인간 EMX, VEGF, CLTA, 및 HBB 유전자 내에서 시험된 gRNA 표적 부위가 제시되어 있다. 13개 gRNA 표적 부위를 선택하여, PAM이 상기 절단된 스페이서 서열으로부터 멀리 떨어진 배향 (배향 A)으로 최적화된 fCas9 융합물의 활성을 시험하였다. 취합하면, 이들 13개 gRNA는 fCas9 융합 변이체가 5 내지 47 bp 범위의 8개 스페이서 길이 전반에 걸쳐 시험될 수 있게 해주었다. 제시된 서열은 다음과 같이 확인된다: "CLTA-1"은 서열 220에 상응하고; "C1"은 서열 221에 상응하며; "C2"는 서열 222에 상응하고; "C3"은 서열 224에 상응하며; "C4"는 서열 225에 상응하고; "HBC"는 서열 226에 상응하며; "H1"은 서열 227에 상응하고; "H2"는 서열 228에 상응하며; "H3"은 서열 229에 상응하고; "H4"는 서열 230에 상응하며; "H5"는 서열 231에 상응하고; "H6"은 서열 232에 상응하며; "H7"은 서열 233에 상응하고; "EMX"는 서열 234에 상응하며; "E1"은 서열 235에 상응하고; "E2"는 서열 236에 상응하며; "E3"은 서열 237에 상응하고; "VEGF"는 서열 238에 상응하며; "V1"은 서열 239에 상응하고; "V2"는 서열 240에 상응하며; "V3"은 서열 241에 상응하고; "V4"는 서열 242에 상응한다.
도 14는 fCas9, Cas9 니카제, 및 야생형 Cas9에 의한 게놈 DNA 변형의 스페이서 길이 선호도를 도시하는 그래프를 나타낸 것이다. (a) GFP 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍, (b) CLTA 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍, (c) EMX 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍, (d) HBB 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍, 및 (e) VEGF 부위를 표적화하는 gRNA의 쌍에 대한 삽입-결실 변형 효율. 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3개의 생물학적 복제물로부터의 평균의 표준 오차를 반영한다.
도 15는 다양한 양의 Cas9 및 gRNA 발현 플라스미드를 이용한 fCas9, Cas9 니카제, 및 야생형 Cas9에 의한 게놈 DNA 변형의 효율을 도시한 그래프를 나타낸 것이다. fCas9, Cas9 니카제 또는 야생형 Cas9와 2개의 표적 부위 gRNA로 처리된 세포 집단으로부터 증폭된 재생한 표적-부위 DNA의 서베이어 검정으로부터의 삽입-결실 변형 효율. 700 ng의 Cas9 발현 플라스미드와 250 ng의 gRNA 발현 플라스미드 (총 950 ng), 350 ng의 Cas9 발현 플라스미드와 125 ng의 gRNA 발현 플라스미드 (총 475 ng), 175 ng의 Cas9 발현 플라스미드와 62.5 ng의 gRNA 발현 플라스미드 (총 238 ng) 또는 88 ng의 Cas9 발현 플라스미드와 31 ng의 gRNA 발현 플라스미드 (총 119 ng)를 적당한 양의 불활성 캐리어 플라스미드로 형질감염시켜 모든 처리군 전반에 걸쳐 950 ng의 플라스미드의 균일한 형질감염을 보장하였다. (a) CLTA 부위를 표적화하는 19-bp 간격으로 떨어진 gRNA, (b) EMX 부위를 표적화하는 23-bp 간격으로 떨어진 gRNA, 및 (c) VEGF 부위를 표적화하는 14-bp 간격으로 떨어진 gRNA에 대한 삽입-결실 변형 효율. 오차 막대는 별도의 날에 수행된 3개의 생물학적 복제물로부터의 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 16은 단일 gRNA의 존재 하에 게놈 DNA를 변형시킬 수 있는 fCas9, Cas9 니카제, 및 야생형 Cas9의 능력을 나타낸 것이다. (A)는 Cas9 단백질과 gRNA(들)의 표시된 조합물로 처리된 세포의 DNA로부터의 게놈 GFP 표적의 서베이어 검정을 도시하는 겔의 영상을 나타낸 것이다. 단일 gRNA는 fCas9와 Cas9 니카제 둘 다에 대하여 탐지 가능한 수준 (< 2% 변형)에서 게놈 변형을 유도하지 않는다. 야생형 Cas9는 시험된 모든 단일 gRNA와 쌍을 이룬 gRNA에 대하여 GFP 표적을 효과적으로 변형시킨다. fCas9와 Cas9 니카제 둘 다의 경우에는, 적당하게 쌍을 형성한 gRNA가 야생형 Cas9와 거의 동등한 수준으로 게놈 변형을 유도시킨다. (B)는 야생형 Cas9, Cas9 니카제, 또는 fCas9 중 어느 하나를 발현하는 플라스미드와 단일 gRNA (G1, G3, G5 또는 G7)를 발현하는 단일 플라스미드, 또는 각각 상이한 gRNA (G1+G5, 또는 G3+G7)를 발현하는 2개의 플라스미드로 처리된 인간 세포로부터 단리된 150 ng 게놈 DNA로부터 증폭된 GFP 표적에 적중한 부위를 서열 분석한 결과를 도시한 그래프를 나타낸다. 음성 대조군으로서, 어떠한 gRNA 발현 플라스미드도 이용하지 않는 상기와 같은 형질감염 및 서열 분석을 3중으로 수행하였다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. GFP 표적 부위에 1개 초과의 삽입 또는 결실을 수반한 서열 (G1 결합성 부위에서 시작하여 G7 결합성 부위에서 끝난다)이 삽입-결실로서 간주된다. 삽입-결실 비율(%)은 삽입-결실의 수를 서열 총 수로 나눔으로써 계산하였다. 야생형 Cas9가 모든 gRNA 처리군 전반에 걸쳐 삽입-결실을 야기시켰지만, fCas9와 Cas9 니카제는 쌍을 이룬 gRNA가 존재하는 경우에만 삽입-결실을 효율적으로 야기시켰다 (> 1%). fCas9와 단일 gRNA에 의해 유도된 삽입-결실은 gRNA 없는 대조군 상에서는 탐지되지 않았지만, Cas9 니카제와 단일 gRNA는 표적 GFP 서열을 평균 0.12%의 비율로 변형시켰다.
도 17은 게놈 표적의 fCas9 삽입-결실 빈도가 gRNA 쌍 스페이서 길이 선호도에 어떻게 영향을 미치는지를 도시하는 그래프를 나타낸 것이다. 이러한 그래프는 야생형 Cas9 뉴클레아제와 공동-발현된 동일한 gRNA의 삽입-결실 변형 효율에 대해 표준화시킨 fCas9의 삽입-결실 변형 효율과 스페이서 길이 (두 gRNA 간의 bp 수) 간의 관계를 보여준다. X-축 아래의 착색 삼각형은 시험되긴 하였지만, 표시된 표적 유전자에 대해 탐지 가능한 삽입-결실을 전혀 산출하지 않았던 스페이서 길이를 의미한다. 이들 결과는 fCas9가 DNA를 효율적으로 절단하기 위해 절반-부위 사이에 약 15 bp 또는 약 25 bp를 필요로 한다는 것을 제안한다.
도 18은 내인성 유전자 자리에서 Cas9 뉴클레아제, Cas9 니카제, 또는 fCas9 뉴클레아제에 의해 유도된 변형을 나타낸 것이다. (a)는 야생형 Cas9 뉴클레아제, Cas9 니카제, 또는 fCas9 뉴클레아제, 및 VEGF 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA (gRNA V1 및 gRNA V2)를 발현하는 단일 플라스미드를 이용하여 VEGF 표적에 적중한 부위에서 변형된 서열의 예를 나타낸다. 제시된 각 예에 대하여, 변형되지 않은 게놈 부위가 첫 번째 서열이고, 그 다음이 결실을 함유하는 상단 8개 서열이다. 각 서열 앞의 숫자는 서열 분석 계수치를 표시한다. gRNA 표적 부위는 볼드체의 대문자로 표기된다. (b)는 VEGF 표적을 벗어난 부위 1VEG_Off1에 대하여 (a)에서와 동일한 분석이다. (c)는 VEGF 표적을 벗어난 부위 1에 대한 2개의 gRNA의 잠재적 결합 방식을 나타낸다. 상단 가닥은 표준 방식으로 결합되는 반면, 하단 가닥은 G:U 염기 쌍을 포함하는 gRNA:DNA 염기 쌍형성을 통하여 제2의 gRNA인 gRNA V2와 결합된다. (a)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 다음과 같이 확인된다: 서열 243; 서열 244; 서열 245; 서열 246; 서열 247; 서열 248; 서열 249; 서열 250; 서열 251; 서열 252; 서열 253; 서열 254; 서열 255; 서열 256; 서열 257; 서열 258; 서열 259; 서열 260; 서열 261; 서열 262; 서열 263; 서열 264; 서열 265; 서열 266; 서열 267; 서열 268; 및 서열 269. (b)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 다음과 같이 확인된다: 서열 270; 서열 271; 서열 272; 서열 273; 서열 274; 서열 275; 서열 276; 서열 277; 서열 278; 서열 279; 서열 280; 서열 281; 서열 282; 서열 283; 서열 284; 서열 285; 서열 286; 서열 287; 서열 288; 서열 289; 서열 290; 서열 291; 서열 292; 서열 293; 서열 294; 서열 295; 및 서열 296. (c)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 다음과 같이 확인된다: 서열 297; 서열 298; 서열 299; 및 서열 300.
도 19는 게놈 CCR5 유전자 내에서의 표적 DNA 서열을 나타낸 것이다. (a) PAM이 상기 절단된 스페이서 서열과 인접한 배향 (배향 A)으로 Cas9 변이체 (예를 들어, FokI-dCas9) 활성을 시험하기 위하여 8개의 gRNA 표적 부위를 확인하였다. (b) PAM이 상기 절단된 스페이서 서열과 인접한 배향 (배향 B)으로 Cas9 변이체 (예를 들어, FokI-dCas9) 활성을 시험하기 위하여 6개의 gRNA 표적 부위를 확인하였다. 취합하면, 이들 14개 gRNA는 Cas9 융합 변이체가 0 내지 74 bp 범위의 스페이서 길이 전반에 걸쳐 시험될 수 있게 해준다. (a)에 제시된 서열은 다음과 같이 확인된다: "CRA"는 서열 302에 상응하고; "CRA-1"은 서열 303에 상응하며; "CRA-2"는 서열 304에 상응하며; "CRA-3"은 서열 305에 상응하고; "CRA-4"는 서열 306에 상응하며; "CRA-5"는 서열 307에 상응하고; "CRA-6"은 서열 308에 상응하며; "CRA-7"은 서열 309에 상응하고; "CRA-8"은 서열 310에 상응한다. (b)에 제시된 서열은 다음과 같이 확인된다: "CRB"는 서열 311에 상응하고; "CB-1"은 서열 312에 상응하며; "CB-2"는 서열 313에 상응하고; "CB-3"은 서열 314에 상응하며; "CB-4"는 서열 315에 상응하고; "CB-5"는 서열 316에 상응하며; "CB-6"은 서열 317에 상응한다.
도 20은 Fok1-dCas9 (fCas9) 구조물을 함유하는 예시되는 플라스미드를 상세히 열거하는 벡터 맵을 도시한 것이다.
정의
본원 및 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 단수 및 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "작용제"에 대한 언급은 단일 작용제 및 복수 개의 상기 작용제를 포함한다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 단백질, 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한, 종종 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR [클러스터링되고 규칙적으로 사이에 공간을 남겨둔 짧은 팔린드롬성(palindromic) 반복 서열]-관련 뉴클레아제로서 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전적 요소 (바이러스, 전위 요소 및 접합 플라스미드)에 대항하여 보호를 제공하는 적응 면역 체계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 대해 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서 pre-crRNA를 정확하게 프로세싱하기 위해서는, 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. 상기 tracrRNA는 crRNA 전구의 리보뉴클레아제 3-지원 프로세싱에 대한 가이드로서 제공된다. 연속해서, Cas9/crRNA/tracrRNA는 상기 스페이서에 대해 상보적인 선형 또는 환상 dsDNA 표적을 내부핵산분해적으로 절단한다. crRNA에 대해 상보적이지 않은 표적 가닥을 먼저, 내부핵산분해적으로 커팅한 다음, 3'-5' 외부핵산분해적으로 트리밍한다. 사실상, DNA-결합과 절단을 위해서는, 전형적으로 단백질과 둘 다의 RNA가 필요하다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gNRA")는 crRNA와 tracrRNA 둘 다의 측면이 단일 RNA 종 내로 혼입되도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). Cas9는 자기 대 비-자기를 구별하는 데 도움을 주기 위해 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식한다. Cas9 뉴클레아제 서열과 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오르소로그(ortholog)가 에스. 피오게네스 및 에스. 더모필루스 (S. thermophilus)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 종에서 보고되었다. 부가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열이 본 개시내용을 근거로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에 개시된 유기체 및 유전자 자리로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화) DNA 절단 도메인을 갖는다. 뉴클레아제-불활성화 Cas9 단백질은 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제 "사멸" Cas9에 대함)로서 상호 교환적으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, dCas9는 부분으로든 전체로든, 다음 서열 5로서 제시된 아미노산 세트에 상응하거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, dCas9의 변이체 (예를 들어, 서열 5의 변이체)가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 예를 들어 뉴클레아제 불활성화 Cas9 (dCas9)를 초래하는, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 변이체가 제공된다. 이러한 돌연변이는 한 예로서, D10 및 H840에서의 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내에서의 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인 내에서의 치환)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 5와 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일한 dCas9의 변이체 또는 동족체 (예를 들어, 서열 5의 변이체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열 5 보다 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산 또는 그 초과 정도가 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는 dCas9의 변이체 (예를 들어, 서열 5의 변이체)가 제공된다.
dCas9 (D10A 및 H840A):

불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질 (또는 그의 단편)을 생성시키는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 본 실시예; 및 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)]; [Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인, 즉 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 대해 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (예를 들어, 본 실시예; 및 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)]; [Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)] 참조). 일부 실시양태에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 다음 2개의 Cas9 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합성 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로서 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9, 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합성 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하므로, 이러한 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 서열 1 (뉴클레오티드); 서열 2 (아미노산))에 상응한다.

일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 서열 3 (뉴클레오티드) 및/또는 서열 4 (아미노산)에 상응하거나 이를 포함한다.

일부 실시양태에서, Cas9는 다음으로부터의 Cas9를 지칭한다: 코리네박테륨 울세란스 (Corynebacterium ulcerans) (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테륨 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria) (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라 (Spiroplasma syrphidicola) (NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인테르메디아 (Prevotella intermedia) (NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨세 (Spiroplasma taiwanense) (NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니아에 (Streptococcus iniae) (NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카 (Belliella baltica) (NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉수스 토르퀴시 (Psychroflexus torquisI) (NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 더모필루스 (Streptococcus thermophilus) (NCBI Ref: YP_820832.1); 리스테리아 인노쿠아 (Listeria innocua) (NCBI Ref: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) (NCBI Ref: YP_002344900.1) 또는 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) (NCBI Ref: YP_002342100.1).
용어 "접합하는", "접합된" 및 "접합"은 두 실체, 예를 들어 두 분자, 예컨대 두 단백질, 두 도메인 (예를 들어, 결합성 도메인과 절단 도메인), 또는 단백질과 작용제, 예를 들어 단백질 결합성 도메인과 소분자의 연합을 지칭한다. 일부 측면에서, 이러한 연합은 단백질 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제)과 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA) 간의 연합이다. 상기 연합은, 예를 들어 직접 또는 간접 (예를 들어, 링커를 통함) 공유 연쇄를 통해서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 연합은 공유적이다. 일부 실시양태에서, 두 분자는 양 분자를 연결하는 링커를 통하여 접합된다. 예를 들어, 두 단백질이 서로 접합하여, 예를 들어 결합성 도메인과 조작된 뉴클레아제의 절단 도메인이 접합되어 단백질 융합물을 형성하는 일부 실시양태에서, 이러한 두 단백질은 폴리펩티드 링커, 예를 들어 하나의 단백질의 C-말단을 다른 단백질의 N-말단과 연결시켜 주는 아미노산 서열을 통하여 접합될 수 있다.
핵산 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "컨센서스 서열"은 복수 개의 유사한 서열 내의 각 위치에서 발견된 가장 빈번한 뉴클레오티드 잔기를 나타내는 계산된 서열을 지칭한다. 전형적으로, 컨센서스 서열은 유사한 서열을 서로 비교하고 유사한 서열 모티프를 계산하는 서열 정렬에 의해 결정된다. 뉴클레아제 표적 부위 서열의 맥락에서, 뉴클레아제 표적 부위의 컨센서스 서열은 일부 실시양태에서, 소정의 뉴클레아제에 의해 가장 빈번하게 결합되거나 또는 가장 높은 친화도로 결합된 서열일 수 있다. 재조합효소 표적 부위 서열의 맥락에서, 재조합효소 표적 부위의 컨센서스 서열은 일부 실시양태에서, 소정의 재조합효소에 의해 가장 빈번하게 결합되거나 또는 가장 높은 친화도로 결합된 서열일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조작된"은 인간에 의해 설계, 생성, 제조, 합성 및/또는 제작된 바 있는 단백질 분자, 핵산, 복합체, 물질 또는 실체를 지칭한다. 따라서, 조작된 생성물은 자연에서는 존재하지 않는 생성물이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발시키기에 충분한 생물학상 활성제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제의 유효량은 이러한 뉴클레아제에 의해 특이적으로 결합되고 절단된 표적 부위의 절단을 유도시키기에 충분한 뉴클레아제의 양을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합효소의 유효량은 이러한 재조합효소에 의해 특이적으로 결합되고 재조합된 표적 부위에서 재조합을 유도시키기에 충분한 재조합효소의 양을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 특정 작용제, 예를 들어 뉴클레아제, 재조합효소, 혼성체 단백질, 융합 단백질, 단백질 이량체, 단백질 (또는 단백질 이량체)과 폴리뉴클레오티드의 복합체, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 각종 인자, 예를 들어 목적하는 생물학적 반응, 특이적 대립 유전자, 게놈, 표적 부위, 표적화되는 세포 또는 조직, 및 사용되는 작용제에 따라서 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열의 수준에서 고도로 관련이 있는 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 관련 기술분야에서 이해되는 용어이다. 서로 상동성인 핵산 또는 폴리펩티드는 "동족체"로 지칭된다. 두 서열 간의 상동성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 서열 정렬 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따라서, 두 서열이 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 120개 이상, 150개 이상, 또는 200개 이상의 아미노산의 하나 이상의 연장물에 대하여, 약 50 내지 60% 이상 동일하거나, 예를 들어 하나의 서열 또는 다른 서열에 포함된 모든 잔기의 약 50 내지 60% 이상에서 동일한 잔기 (예를 들어, 아미노산 잔기)를 공유하거나, 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일한 경우에, 이들 두 서열은 상동성인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 2개의 인접한 분자 또는 모이어티(moiety) , 예를 들어 뉴클레아제 (예를 들어, FokI)의 절단 도메인과 결합성 도메인 (예를 들어, dCas9)을 연결하는 분자 또는 화학 기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인을 또 다른 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질 또는 뉴클레아제 또는 재조합효소 또는 그의 융합물)과 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 링커는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합성 도메인과 재조합효소의 촉매 도메인을 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 링커는 dCas9와 재조합효소를 연결시켜 준다. 전형적으로, 링커는 2개 기, 분자 또는 기타 모이어티 사이에 위치되거나 또는 이들이 양옆에 위치하고 있고, 공유 결합을 통하여 각자 연결되므로, 둘을 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수 개의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상의 아미노산을 갖는, 아미노산의 모든 연장물이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 트리-펩티드 Gly-Gly-Ser, 예를 들어 서열 (GGS)_n (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 반복 서열을 나타낸다)을 포함하는 반복 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 (GGS)₆ (서열 15)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 16개 잔기 "XTEN" 링커, 또는 그의 변이체이다 (예를 들어, 본 실시예; 및 문헌 [Schellenberger et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol . 27, 1186-1190 (2009)] 참조). 일부 실시양태에서, XTEN 링커는 서열 SGSETPGTSESATPES (서열 16), SGSETPGTSESA (서열 17), 또는 SGSETPGTSESATPEGGSGGS (서열 18)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 도 12a에 제공된 바와 같은 모든 링커, 예를 들어 VPFLLEPDNINGKTC (서열 19), GSAGSAAGSGEF (서열 20), SIVAQLSRPDPA (서열 21), MKIIEQLPSA (서열 22), VRHKLKRVGS (서열 23), GHGTGSTGSGSS (서열 24), MSRPDPA (서열 25); 또는 GGSM (서열 301)으로부터 선택된 하나 이상이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 특정 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 내의 특정 잔기를 또 다른 잔기로 치환시키거나, 또는 특정 서열 내의 하나 이상의 잔기를 결실 또는 삽입하는 것을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로, 본래의 잔기를 확인한 다음, 서열 내에서의 이러한 잔기의 위치를 확인하고 새로이 치환된 잔기의 실체를 확인함으로써 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 만들기 위한 각종 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레아제"는 핵산 분자 내의 2개의 뉴클레오티드 잔기를 연결시켜 주는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 작용제, 예를 들어 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "뉴클레아제"는 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 단백질을 지칭하므로, 이러한 뉴클레아제는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 없다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단백질, 예를 들어 핵산 분자와 결합할 수 있고 이러한 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 잔기를 연결시켜 주는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오티드 쇄의 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 "인식 서열", "뉴클레아제 표적 부위" 또는 "표적 부위"로서 본원에 지칭되기도 하는, 특이적 뉴클레오티드 서열 내의 특이적 포스포디에스테르 결합과 결합하고/하거나 이러한 결합을 절단하는 부위-특이적 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 표적 부위를 보완하는 서열을 갖는 RNA (예를 들어, 가이드 RNA인 "gRNA")와 연합됨으로써 (예를 들어, 이와 결합됨으로써) 뉴클레아제의 서열 특이성을 제공하는 RNA-가이드된 (즉, RNA-프로그램 가능한) 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단일 가닥 표적 부위를 인식하는 반면, 다른 실시양태에서는, 뉴클레아제가 이중 가닥 표적 부위, 예를 들어 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식한다. 많은 자연 발생적 뉴클레아제, 예를 들어 많은 자연 발생적 DNA 제한 뉴클레아제의 표적 부위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 많은 경우에 있어서, DNA 뉴클레아제, 예컨대 EcoRI, HindIII, 또는 BamHI는 4 내지 10개 염기 쌍 길이의 팔린드롬성 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식하고, 이러한 표적 부위 내의 특이적 위치에서 2개의 DNA 가닥 각각을 커팅한다. 일부 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 대칭적으로 커팅하는데, 즉 양 가닥을 동일한 위치에서 커팅하여 그 말단이 염기 쌍 형성된 뉴클레오티드를 포함하도록 한다 (이는 본원에서 평활 말단으로서 지칭되기도 함). 기타 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 비대칭적으로 커팅하는데, 즉 각 가닥을 상이한 위치에서 커팅하여 그 말단이 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 포함하도록 한다. 이중 가닥 DNA 분자의 말단에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드는 또한, "오버행"으로서 지칭되는데, 예를 들어 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)가 각각의 DNA 가닥의 5' 또는 3' 말단을 형성하는 지에 따라서 "5'-오버행"으로서 또는 "3'-오버행"으로서 지칭된다. 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)로 종결되는 이중 가닥 DNA 분자 말단은 또한, 점착성 말단으로서 지칭되는데, 이는 이들이 쌍을 형성하지 않은 상보적 뉴클레오티드(들)를 포함하는 다른 이중 가닥 DNA 분자 말단에 "점착"될 수 있기 때문이다. 뉴클레아제 단백질은 전형적으로, 단백질과 핵산 기질의 상호 작용을 매개하고, 또한 일부 경우에는, 표적 부위와 특이적으로 결합하는 "결합성 도메인"과, 핵산 골격 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매하는 "절단 도메인"을 포함한다. 일부 실시양태에서 뉴클레아제 단백질은 단량체성 형태의 핵산 분자와 결합하고 이를 절단할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 뉴클레아제 단백질은 표적 핵산 분자를 절단하기 위하여 이량체화되거나 또는 다량체화되어야 한다. 자연 발생적 뉴클레아제의 결합성 도메인 및 절단 도메인 뿐만 아니라 뉴클레아제 결합 특이성 표적 부위를 창출시키기 위해 융합될 수 있는 모듈(modular) 결합성 도메인 및 절단 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9), 또는 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질의 결합성 도메인을 결합성 도메인 (예를 들어, 표적 부위에 대한 결합을 지시하는 gRNA와 결합한다)으로서 사용하여, 목적하는 표적 부위와 특이적으로 결합할 수 있고, 절단 도메인, 예를 들어 FokI의 절단 도메인과 융합 또는 접합되어, 표적 부위를 절단하는 조작된 뉴클레아제를 창출시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 Cas9 융합 단백질은 FokI의 절단 도메인을 포함하므로, "fCas9" 단백질로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 fCas9 단백질에서의 FokI의 절단 도메인은 부분으로든 전체로든, 다음에 서열 6으로서 제시된 아미노산 서열 (또는 그의 변이체)에 상응하거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, FokI 절단 도메인의 변이체 또는 동족체는 표적 핵산 내의 표적 부위에서 또 다른 FokI 절단 도메인과 이량체화함으로써 (예를 들어, fCas9 융합 단백질의 일부로서), 표적 핵산의 절단을 초래할 수 있는 임의의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 6과 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일한 FokI 절단 도메인의 변이체 (예를 들어, 서열 6의 변이체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열 6 보다 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산 또는 그 초과 정도가 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는 FokI 절단 도메인의 변이체 (예를 들어, 서열 6의 변이체)가 제공된다.
FokI의 절단 도메인:

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 뉴클레오염기 및 산성 모이어티를 포함하는 화합물, 예를 들어 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자인데, 여기서는 인접한 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연쇄를 통하여 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 개개의 핵산 잔기 (예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개개의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체 (예를 들어, 3개 이상의 일련의 뉴클레오티드)를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA를 포괄한다. 핵산은, 예를 들어 게놈, 전사물, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, gRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 기타 자연 발생적 핵산 분자의 맥락에서 자연 발생적일 수 있다. 다른 한편으론, 핵산 분자는 비-자연 발생적 분자, 예를 들어 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 혼성체일 수 있거나 또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA" 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 골격 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 자연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 이용하여 생성될 수 있으며, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성될 수 있다. 적당한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당을 갖는 유사체, 및 골격 변형을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학상 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기); 삽입된 염기; 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 인산염 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연쇄)이거나 이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약 조성물"은 특정 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방의 맥락에서 특정 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 활성 성분, 예를 들어 Cas9 단백질과 융합된 뉴클레아제 또는 재조합효소, 또는 그의 단편 (또는 이러한 융합물을 코딩하는 핵산), 및 임의의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 Cas9 변이체/융합물 (예를 들어, fCas9) 단백질(들)과, 이러한 Cas9 변이체/융합 단백질(들)이 표적 핵산을 표적화하는 데 적합한 gRNA(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 특정 유전자이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 특정 질환과 연관된 대립 유전자이므로, 이러한 대립 유전자는 Cas9 변이체/융합 단백질(들)의 작용에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 대립 유전자는 CLTA 유전자, EMX 유전자, HBB 유전자, VEGF 유전자, 또는 CCR5 유전자의 대립 유전자이다 (예를 들어, 본 실시예; 도 7, 8, 13, 14, 15, 17 및 19 참조).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "증식성 질환"은 특정 세포 또는 세포 집단이 비정상적으로 상승된 증식률을 나타낸다는 점에서 세포 또는 조직 생체 항상성이 교란되는 모든 질환을 지칭한다. 증식성 질환은 과증식성 질환, 예컨대 전-종양 과형성 병태 및 종양 질환을 포함한다. 종양 질환은 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 하고, 양성 종양과 악성 종양 둘 다를 포함한다. 악성 종양은 또한, 암으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 증식성 질환을 치료하는 데 유용하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 Cas9 (예를 들어, fCas9) 단백질(들)과, 이러한 Cas9 단백질(들)이 VEGF 대립 유전자를 표적화하는 데 적합한 gRNA(들)를 포함함으로써, 상기 대립 유전자가 Cas9 단백질(들)의 작용에 의해 불활성화된다 (예를 들어, 본 실시예 참조).
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 모든 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 3개 이상의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 개개의 단백질, 또는 단백질의 컬렉션을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 화학적 실체, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 인산염 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기; 접합, 기능화 또는 기타 변형을 위한 링커 등을 부가함으로써 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 또한, 단일 분자일 수 있거나 또는 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 단지, 자연 발생적 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 자연 발생적, 재조합, 또는 합성, 또는 그의 모든 조합일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 2가지 이상의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 혼성체 폴리펩티드를 지칭한다. 하나의 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분 또는 카르복시-말단 (C-말단) 부분에 위치할 수 있으므로, "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 각각 형성할 수 있다. 본원에 제공된 단백질 중 어느 것도 관련 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 재조합 단백질 발현 및 정제를 통하여 생성될 수 있는데, 이는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 대해서 특히 적합하다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 이는 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)); 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에 기재된 것을 포함한다.
용어 "RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제" 및 "RNA-가이드된 뉴클레아제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 절단에 대한 표적이 아닌 하나 이상의 RNA와 복합체를 형성하는 (예를 들어, 이러한 RNA와 결합되거나 연합되는) 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA와 복합체를 형성하는 경우의 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 뉴클레아제:RNA 복합체로서 지칭될 수 있다. 전형적으로, 이와 같이 결합된 RNA(들)는 가이드 RNA (gRNA)로서 지칭된다. gRNA는 2개 이상의 RNA의 복합체로서 존재하거나 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다. 단일 RNA 분자로서 존재하는 gRNA는 단일-가이드 RNA (sgRNA)로서 지칭될 수 있지만, "gRNA"는 단일 분자로서 또는 2개 이상의 분자의 복합체로서 존재하는 가이드 RNA를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 전형적으로, 단일 RNA 종으로서 존재하는 gRNA는 다음 2개의 도메인을 포함한다: (1) 표적 핵산과의 상동성을 공유하는 (예를 들어, Cas9 복합체가 상기 표적과 결합하는 것을 지시한다) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질과 결합하는 도메인. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)은 tracrRNA로서 공지된 서열에 상응하고, 줄기-고리 구조를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 도메인 (2)은 문헌 [Jinek et al., Science 337:816-821(2012); 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]의 도 1E에 도시된 바와 같이 tracrRNA와 상동성이다. gRNA의 다른 예 (예를 들어, 도메인 2를 포함한 예)는 "전환 가능한 Cas9 뉴클레아제 및 그의 용도"란 발명의 명칭으로, 2013년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/874,682; "기능성 뉴클레아제에 대한 전달 시스템"이란 발명의 명칭으로, 2013년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/874,746; "RNA-지시된 표적 DNA 변형 및 전사의 RNA-지시된 조정을 위한 방법 및 조성물"이란 발명의 명칭으로, 2013년 3월 15일에 출원된 PCT 출원 WO 2013/176722; 및 "Cas9-crRNA 복합체에 의한 RNA-지시된 DNA 절단"이란 발명의 명칭으로 2013년 3월 20일에 출원된 PCT 출원 WO 2013/142578 (이들 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 발견될 수 있다. 또한 gRNA 및 gRNA 구조의 다른 예가 본원에 제공된다 (예를 들어, 본 실시예 참조). 일부 실시양태에서, gRNA는 도메인 (1) 및 (2) 중 2개 이상을 포함하고, 이는 "연장된 gRNA"로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 연장된 gRNA는, 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 2개 이상의 Cas9 단백질과 결합될 것이고, 2개 이상의 별개의 영역에서 표적 핵산과 결합될 것이다. 이러한 gRNA는 특정 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하는 표적 부위를 보완하여, 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-관련 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (Csn1)이다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)는 RNA:DNA 혼성화를 이용하여 표적 DNA 절단 부위를 결정하기 때문에, 이들 단백질은 원칙상, 가이드 RNA에 의해 지정된 모든 서열을 절단할 수 있다. 부위-특이적 절단을 위해 (예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)]; [Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)]; [Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)]; [Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)]; [Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합효소"는 재조합효소 인식 서열들 간의 DNA 단편의 절제, 통합, 역위 또는 교환 (예를 들어, 전위)을 초래하는, 재조합효소 인식 서열들 간의 DNA의 재조합을 매개하는 부위-특이적 효소를 지칭한다. 재조합효소는 2가지 별개의 계열로 분류될 수 있다: 세린 재조합효소 (예를 들어, 위치 특이성 재조합 촉진 효소 및 전화효소) 및 티로신 재조합효소 [예를 들어, 인테그라제(integrase)]. 세린 재조합효소의 예는 Hin, Gin, Tn3, β-six, CinH, ParA, γδ, Bxb1, ΦC31, TP901, TG1, φBT1, R4, φRV1, φFC1, MR11, A118, U153, 및 gp29를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 티로신 재조합효소의 예는 Cre, FLP, R, 람다, HK101, HK022, 및 pSAM2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 세린 및 티로신 재조합효소 명칭은 재조합효소가 DNA를 공격하기 위해 사용되고 가닥 교환 동안 DNA와 공유적으로 연결되는, 보존된 친핵성 아미노산 잔기에 기인한다. 재조합효소는 유전자 녹아웃/녹인의 창출 및 유전자 요법 적용을 포함한 수많은 적용을 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Brown et al., "Serine recombinases as tools for genome engineering." Methods. 2011;53(4):372-9]; [Hirano et al., "Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration." Appl . Microbiol . Biotechnol. 2011; 92(2):227-39]; [Chavez and Calos, "Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system." Curr . Gene Ther . 2011;11(5):375-81]; [Turan and Bode, "Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J. 2011; 25(12):4088-107]; [Venken and Bellen, "Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase." Methods Mol . Biol. 2012; 859:203-28]; [Murphy, "Phage recombinases and their applications." Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414]; [Zhang et al., "Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era." J . Zhejiang Univ. Sci . B. 2012; 13(7):511-24]; [Karpenshif and Bernstein, "From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination." DNA Repair (Amst). 2012; 1;11(10):781-8] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 본원에 제공된 재조합효소가 본 발명의 실시양태에 사용될 수 있는 재조합효소의 독점적 예를 의미하지는 않는다. 본 발명의 방법 및 조성물은 새로운 직교 재조합효소에 대한 데이터베이스를 발굴하거나 또는 규정된 DNA 특이성을 지닌 합성 재조합효소를 설계함으로써 확장될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Groth et al., "Phage integrases: biology and applications." J . Mol . Biol . 2004; 335, 667-678]; [Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc . Natl . Acad. Sci . U S A. 2009; 106, 5053-5058] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 재조합효소의 다른 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 발견되거나 생성되는 어떠한 새로운 재조합효소도 본 발명의 상이한 실시양태에 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 재조합효소의 촉매 도메인이 뉴클레아제-불활성화 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, dCas9, 또는 그의 단편)와 융합되므로, 재조합효소 도메인은 핵산 결합성 도메인을 포함하지 않거나, 또는 표적 핵산과 결합될 수 없다 (예를 들어, 이러한 재조합효소 도메인은 특이적 DNA 결합 활성을 지니지 않도록 조작된다). DNA 결합 활성이 결여된 재조합효소 및 이를 조작하는 방법은 공지되어 있고, 이는 문헌 [Klippel et al., "Isolation and characterisation of unusual gin mutants." EMBO J. 1988; 7: 3983-3989]; [Burke et al., "Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation." Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948]; [Olorunniji et al., "Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants." Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191]; [Rowland et al., "Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome." Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298]; [Akopian et al., "Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691]; [Gordley et al., "Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells." J Mol Biol. 2007; 367: 802-813]; [Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106: 5053-5058]; [Arnold et al., "Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity." EMBO J. 1999;18: 1407-1414]; [Gaj et al., "Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity." Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(2):498-503]; 및 [Proudfoot et al., "Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity." PLoS One. 2011;6(4):e19537; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 위치 특이성 재조합 촉진 효소-전화효소 군, 예를 들어 Tn3 및 γδ 위치 특이성 재조합 촉진 효소와 Hin 및 Gin 전화효소의 세린 재조합효소는 자기 촉매 도메인과 DNA-결합성 도메인을 수반한 모듈 구조를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Grindley et al., "Mechanism of site-specific recombination." Ann Rev Biochem. 2006; 75: 567-605] 참조: 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 따라서, 이들 재조합효소의 촉매 도메인은, 예를 들어 어떠한 보조 인자 (예를 들어, DNA 결합 활성)도 요구하지 않는 '활성화' 재조합효소 돌연변이체의 단리 후, 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제-불활성화 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, dCas9, 또는 그의 단편)와의 재조합을 잘 받아들일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klippel et al., "Isolation and characterisation of unusual gin mutants." EMBO J. 1988; 7: 3983-3989]: [Burke et al., "Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation." Mol Microbiol . 2004; 51: 937-948]; [Olorunniji et al., "Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants." Nucleic Acids Res. 2008; 36: 7181-7191]; [Rowland et al., "Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome." Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298]; [Akopian et al., "Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 8688-8691] 참조). 부가적으로, N-말단 촉매 도메인과 C-말단 DNA 결합성 도메인을 갖는 많은 다른 자연 세린 재조합효소가 공지되어 있고 (예를 들어, phiC31 인테그라제, TnpX 유전자 전위효소, IS607 유전자 전위효소), 그들의 촉매 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 프로그램 가능한 부위-특이적 재조합효소를 조작하도록 공동-선택될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Smith et al., "Diversity in the serine recombinases." Mol Microbiol. 2002;44: 299-307] 참조: 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 유사하게, 티로신 재조합효소 (예를 들어, Cre, λ 인테그라제)의 코어 촉매 도메인은 공지되어 있고, 본원에 기재된 바와 같은 프로그램 가능한 부위-특이적 재조합효소를 조작하도록 유사하게 공동-선택될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Guo et al., "Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse." Nature. 1997; 389:40-46]; [Hartung et al., "Cre mutants with altered DNA binding properties." J Biol Chem 1998; 273:22884-22891]; [Shaikh et al., "Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre." J Mol Biol. 2000;302:27-48]; [Rongrong et al., "Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase." Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544]; [Kilbride et al., "Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system." J Mol Biol. 2006; 355:185-195]; [Warren et al., "A chimeric cre recombinase with regulated directionality." Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:18278-18283]; [Van Duyne, "Teaching Cre to follow directions." Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5]; [Numrych et al., "A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase arm-type binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ." Nucleic Acids Res. 1990; 18:3953-3959]; [Tirumalai et al., "The recognition of core-type DNA sites by λ integrase." J Mol Biol. 1998; 279:513-527]; [Aihara et al., "A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase." Mol Cell. 2003; 12:187-198]; [Biswas et al., "A structural basis for allosteric control of DNA recombination by λ integrase." Nature. 2005; 435:1059-1066]; 및 [Warren et al., "Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination." Mol Microbiol. 2005; 55:1104-1112] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
핵산 변형 (예를 들어, 게놈 변형)의 맥락에서 용어 "재조합하다" 또는 "재조합"은 2개 이상의 핵산 분자, 또는 단일 핵산 분자의 2개 이상의 영역이 재조합효소 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 본 발명의 재조합효소 융합 단백질)의 작용에 의해 변형되는 과정을 지칭하기 위해 사용된다. 재조합으로 인해, 특히 예를 들어, 하나 이상의 핵산 분자 내에 또는 그 사이에 핵산 분자가 삽입, 역위, 절제 또는 전위될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 개개의 유기체, 예를 들어 개개의 포유류를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 고양이, 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리, 또는 선충이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연구용 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전적으로 조작된, 예를 들어 유전적으로 조작된 비-인간 대상체이다. 대상체는 어느 한 가지 성별일 수 있고 발생의 어떠한 단계일 수도 있다.
뉴클레아제의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 핵산" 및 "표적 게놈"은 소정의 뉴클레아제의 하나 이상의 표적 부위를 포함하는 핵산 분자 또는 게놈을 각각 지칭한다. (뉴클레아제-불활성화) RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제와 재조합효소 도메인을 포함하는 융합물의 맥락에서, "표적 핵산" 및 "표적 게놈"은 하나 이상의 표적 부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(들), 또는 게놈을 각각 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산(들)은 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산(들)은 4개의 표적 부위를 포함한다.
용어 "표적 부위"는 (1) 뉴클레아제 (예를 들어, 본원에 제공된 Cas9 융합 단백질)에 의해 결합되고 절단되거나, 또는 (2) 재조합효소 (예를 들어, 본원에 제공된 dCas9-재조합효소 융합 단백질)에 의해 결합되고 재조합되는 (예를 들어, 표적 부위에서 또는 그 근처에서) 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다. 표적 부위는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA-가이드된 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한) 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 gRNA 결합성 도메인과 활성 Cas9 DNA 절단 도메인 또는 다른 뉴클레아제 도메인, 예컨대 FokI를 포함하는 단백질 이량체)의 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 상기 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제의 gRNA(들)에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 gRNA-상보성 서열에 인접한 3' 말단에서의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 예컨대 fCas9와 관련해서는, 표적 부위가 fCas9 단량체와 결합되는 특별한 서열, 및/또는 이량체화 FokI 도메인에 의해 절단되는 상기 결합된 단량체들 사이의 개재 서열을 포괄할 수 있다 (예를 들어, 본 실시예; 및 도 1A, 6d 참조). RNA-가이드된 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한, 뉴클레아제-불활성화) 뉴클레아제와 재조합효소 (예를 들어, 재조합효소의 촉매 도메인) 간의 융합물의 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 상기 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 도메인의 gRNA에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 gRNA-상보성 서열에 인접한 3' 말단에서의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 4개의 재조합효소 단량체가 표적 핵산(들)과 재조합되도록 조정되는데, 각 단량체는 gRNA에 의해 가이드된 (뉴클레아제-불활성화) Cas9 단백질과 융합된다. 이러한 예에서, 각 Cas9 도메인은 별개의 gRNA에 의해 가이드되어 표적 핵산(들)과 결합되므로, 이러한 표적 핵산은 4개의 표적 부위를 포함하는데, 각 부위는 별도의 dCas9-재조합효소 융합물에 의해 표적화된다 (이로써 표적 핵산(들)과 재조합되는 4개의 재조합효소 단량체와 조정된다). RNA-가이드된 뉴클레아제 Cas9 (또는 그의 gRNA-결합성 도메인) 및 Cas9의 본 발명의 융합물의 경우에는, 표적 부위가 일부 실시양태에서, 17개 내지 20개 염기 쌍 플러스 3개 염기 쌍 PAM [예를 들어, NNN (여기서, N은 독립적으로, 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다)]일 수 있다. 전형적으로, PAM의 제1 뉴클레오티드는 어떠한 뉴클레오티드일 수도 있지만, 2개의 하류 뉴클레오티드는 특이적 RNA-가이드된 뉴클레아제에 따라서 지정된다. RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 Cas9에 대해 예시되는 표적 부위 (예컨대, PAM을 포함)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, NNG, NGN, NAG, 및 NGG (여기서, N은 독립적으로, 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상이한 종 (예를 들어, 에스. 피오게네스 대신 에스. 더모필루스)으로부터의 Cas9 뉴클레아제는 서열 NGGNG를 포함하는 PAM을 인식한다. NNAGAAW 및 NAAR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 부가의 PAM 서열이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 측면에서, RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어 Cas9의 표적 부위 (예컨대, PAM 포함)는 구조 [N_z]-[PAM] (여기서, 각각의 N은 독립적으로, 임의의 뉴클레오티드이고, z는 1 내지 50의 정수이다)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, z는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 또는 50 이상이다. 일부 실시양태에서, z는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50이다. 일부 실시양태에서, z는 20이다. 일부 실시양태에서, "표적 부위"는 또한, 뉴클레아제와 결합되긴 하지만, 이에 의해 절단되지 않는 핵산 분자 내의 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 특정 실시양태는 불활성 (또는 불활성화) Cas9 DNA 절단 도메인을 포함하는 단백질을 제공한다. 이러한 단백질 (예를 들어, 또한 Cas9 RNA 결합성 도메인을 포함하는 경우)은 gRNA에 의해 지정된 표적 부위와 결합할 수 있지만; DNA 절단 부위가 불활성화되기 때문에, 표적 부위는 특별한 단백질에 의해 절단되지 않는다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 상기 단백질은 전형적으로, 핵산 분자의 절단을 매개하는 또 다른 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제) 또는 분자와 접합, 융합 또는 결합된다. 다른 실시양태에서, 상기 단백질은 표적 핵산의 재조합을 매개하는 재조합효소 (또는 재조합효소의 촉매 도메인)와 접합, 융합 또는 결합된다. 일부 실시양태에서, 실제적으로 절단되거나 재조합되는 서열은 핵산 분자의 절단 또는 재조합을 매개하는 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 재조합효소) 또는 분자에 좌우될 것이고, 일부 경우에는 예를 들어, 불활성화 Cas9 단백질(들)이 결합되는 것으로부터의 거리 또는 근접성에 관한 것이다.
이량체화 (또는 다량체화)되는 본 발명의 단백질, 예를 들어 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (또는 Cas9 RNA 결합성 도메인)와 DNA 절단 도메인 (예를 들어, FokI 절단 도메인 또는 활성 Cas9 절단 도메인)을 포함하는 단백질의 이량체, 또는 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (또는 Cas9 gRNA 결합성 도메인)와 재조합효소 (또는 재조합효소의 촉매 도메인) 간의 융합물을 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 좌측-절반 부위 (하나의 단백질에 의해 결합됨), 우측-절반 부위 (제2의 단백질에 의해 결합됨), 및 커팅 또는 재조합이 이루어지는 상기 절반 부위들 사이의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 좌측-절반 부위 또는 우측-절반 부위 중 어느 하나 (스페이서 서열은 아니다)가 커팅되거나 재조합된다. 다른 실시양태에서, 스페이서 서열이 커팅되거나 재조합된다. 이러한 구조 ([좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위])는 본원에서 LSR 구조로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 좌측-절반 부위 및/또는 우측-절반 부위는 RNA-가이드된 표적 부위 (예를 들어, Cas9 표적 부위)에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상기 절반 부위 중 어느 하나 또는 둘 다는, 예를 들어 Cas9에 의해 표적화된 전형적인 영역 보다 더 짧거나 더 긴데, 예를 들어 20개 뉴클레오티드 보다 더 짧거나 더 길다. 일부 실시양태에서, 좌측 절반 부위와 우측 절반 부위는 상이한 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 뉴클레아제와 관련된 일부 실시양태에서, 표적 부위는 3개의 RNA-가이드된 뉴클레아제 표적 부위 서열, 예를 들어 Cas9 표적 부위 서열에 상응하는 3개의 서열을 포함하는 서열인데 (예를 들어, 도 2C 참조), 여기서 제1 Cas9 표적 부위 서열과 제2 Cas9 표적 부위 서열, 및 제2 Cas9 표적 부위 서열과 제3 Cas9 표적 부위 서열이 스페이서 서열에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 5 bp 이상, 6 bp 이상, 7 bp 이상, 8 bp 이상, 9 bp 이상, 10 bp 이상, 11 bp 이상, 12 bp 이상, 13 bp 이상, 14 bp 이상, 15 bp 이상, 16 bp 이상, 17 bp 이상, 18 bp 이상, 19 bp 이상, 20 bp 이상, 25 bp 이상, 30 bp 이상, 35 bp 이상, 40 bp 이상, 45 bp 이상, 50 bp 이상, 60 bp 이상, 70 bp 이상, 80 bp 이상, 90 bp 이상, 100 bp 이상, 125 bp 이상, 150 bp 이상, 175 bp 이상, 200 bp 이상, 또는 250 bp 이상 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 대략 15 bp 내지 대략 25 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 대략 15 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 대략 25 bp 길이이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 이펙터" (TALE)는 고도로 가변적인 2개-아미노산 모티프 (반복 가변 2잔기, RVD)를 포함하는, 고도로 보존된 33 내지 34개 아미노산 서열을 함유하는 DNA 결합성 도메인을 포함하는 박테리아성 단백질을 지칭한다. 상기 RVD 모티프는 핵산 서열에 대한 결합 특이성을 결정하고, 목적하는 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라서 조작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing" Nature Biotechnology 29 (2): 143-8]; [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Boch, Jens (February 2011). "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6]; [Boch, Jens; et.al. (December 2009). "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors". Science 326 (5959): 1509-12]; 및 [Moscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). "A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors". Science 326 (5959): 1501] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 아미노산 서열과 DNA 인식 간의 단순 관계는 적당한 RVD를 함유하는 반복 절편의 조합을 선택함으로써 특이적 DNA 결합성 도메인을 조작할 수 있게 해주었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제" (TALEN)는 DNA 절단 도메인, 예를 들어 FokI 도메인에 대한 전사 활성인자-유사 이펙터 DNA 결합성 도메인을 포함하는 인공 뉴클레아제를 지칭한다. 조작된 TALE 구조물을 생성시키기 위한 수많은 모듈 어셈블리 계획이 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acids Research]; [Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acids Research]; [Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Research.]; [Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed. ed. "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". PLoS ONE 6 (5): e19722] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 한 가지 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 이러한 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 증상의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 한 가지 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 이러한 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 증상의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 한 가지 이상의 증상이 발생된 후 및/또는 특정 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 증상의 부재 하에, 예를 들어 증상의 발병을 방지 또는 지연시키거나, 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 이전에 감수성 개체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 증상 병력을 고려하고/하거나 유전적 또는 기타 감수성 요인을 고려한다). 치료는 또한, 증상이 해소된 후에도, 예를 들어 그의 재발을 방지하거나 지연시키기 위해 지속될 수 있다.
용어 "벡터"는 본 발명의 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 제공된 Cas9 단백질 (또는 그의 융합물) 및/또는 gRNA를 코딩하는 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 재칭한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성 벡터, 코스미드, 인공 염색체 및 파지미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 있고, 벡터가 커팅될 수 있고 목적하는 핵산 서열이 삽입될 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가의 특징으로 한다. 벡터는 이러한 벡터를 이용하여 형질전환시켰거나 시키지 않았거나, 또는 이러한 벡터를 이용하여 게놈적으로 변형시켰거나 시키지 않은 세포의 확인 및/또는 선별에 사용하는 데 적합한 하나 이상의 마커 서열을 함유할 수 있다. 마커는, 예를 들어 항생제 (예를 들어, 카나마이신, 앰피실린) 또는 다른 화합물에 대한 내성 또는 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자; 그의 활성이 관련 기술분야에 공지된 표준 검정에 의해 탐지 가능한 효소 (예를 들어, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 또는 루시페라제)를 코딩하는 유전자; 및 형질전환되거나 형질감염된 세포, 숙주, 집락 또는 플라크의 표현형에 가시적으로 영향을 미치는 유전자를 포함한다. 숙주 세포 [예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포, 곤충 세포 등]의 형질전환에 적합한 어떠한 벡터도 본 발명에 포괄되는데, 예를 들어 pUC 시리즈, pGEM 시리즈, pET 시리즈, pBAD 시리즈, pTET 시리즈, 또는 pGEX 시리즈에 속하는 벡터가 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 단백질 생성을 위하여 숙주 세포를 형질전환시키는 데 적합하다. 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 것)을 발현하기 위하여 벡터 및 숙주 세포를 선별 및 조작하는 방법, 세포를 형질전환하는 방법, 및/또는 재조합 단백질을 발현/정제하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 제공되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아연 핑거"는 특정 폴드와, 이러한 폴드를 안정화시키는 하나 이상의 아연 이온의 배위를 특징으로 하는 소형 핵산-결합성 단백질 구조 모티프를 지칭한다. 아연 핑거는 광범위한 각종 상이한 단백질 구조를 포괄한다 (예를 들어, 문헌 [Klug A, Rhodes D (1987). "Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition". Cold Spring Harb . Symp . Quant. Biol. 52: 473-82] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 아연 핑거는 뉴클레오티드의 특이적 서열과 결합하도록 설계될 수 있고, 일련의 아연 핑거의 융합물을 포함하는 아연 핑거 어레이는 사실상 목적하는 어떠한 표적 서열과도 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 아연 핑거 어레이는, 예를 들어 핵산 절단 도메인과 접합된 경우에, 단백질, 예를 들어 뉴클레아제의 결합성 도메인을 형성할 수 있다. Cys₂His₂, 개그 너클(Gag knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 아연 리본, Zn₂/Cys₆, 및 TAZ2 도메인-유사 모티프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 유형의 아연 핑거 모티프가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003). "Structural classification of zinc fingers: survey and summary". Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50] 참조). 전형적으로, 단일 아연 핑거 모티프는 핵산 분자의 3 또는 4개 뉴클레오티드와 결합된다. 따라서, 예를 들어 2개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 6 내지 8개 뉴클레오티드와 결합될 수 있고, 3개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 9 내지 12개 뉴클레오티드와 결합될 수 있으며, 4개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 12 내지 16개 뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 적합한 모든 단백질 공학 기술을 이용하여, 3 내지 30개 뉴클레오티드 길이로부터 사실상 목적하는 어떠한 표적 서열과도 결합하도록 신규 아연 핑거 융합물을 설계할 수 있고/있거나 아연 핑거의 DNA-결합 특이성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). "Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins". Annual Review of Biochemistry 70: 313-340]; [Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003). "Drug discovery with engineered zinc-finger proteins". Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368]; 및 [Liu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997). "Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes". Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 94 (11)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 핵산을 절단하는 단백질 도메인과 조작된 아연 핑거 어레이 간의 융합을 이용하여, "아연 핑거 뉴클레아제"를 생성시킬 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 전형적으로, 핵산 분자 내의 특이적 표적 부위와 결합하는 아연 핑거 도메인; 및 결합성 도메인에 의해 결합된 표적 부위 내에 또는 이러한 부위에 근접하여 핵산 분자를 커팅하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 전형적으로 조작된 아연 핑거 뉴클레아제는 3 내지 6개 개개의 아연 핑거 모티프와 9개 염기 쌍 내지 18개 염기 쌍 길이의 범위의 결합성 표적 부위를 갖는 결합성 도메인을 포함한다. 소정의 게놈 내에서 독특한 표적 부위와 결합하고 이를 절단시키는 것이 요망되는 상황 하에서는 보다 긴 표적 부위가 특히 매력적이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아연 핑거 뉴클레아제"는 아연 핑거 어레이를 포함하는 결합성 도메인과 접합된 핵산 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 절단 도메인은 유형 II 제한 엔도뉴클레아제 FokI의 절단 도메인이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 절단을 위해 소정의 핵산 분자 내의 사실상 목적하는 어떠한 서열도 표적으로 하도록 설계될 수 있고, 복합체 게놈의 맥락에서 독특한 부위와 결합하도록 아연 핑거 결합성 도메인을 설계할 가능성은, 예를 들어 치료적 가치의 표적화된 게놈 변경을 달성하기 위하여, 살아있는 세포 내의 단일 게놈 부위의 표적화된 절단을 허용해 준다. 이중 가닥 브레이크를 목적하는 게놈 유전자 자리로 표적화하는 것을 이용하여, 비-상동 DNA 복구 경로의 변이성 성질에 기인하여, 프레임 시프트 돌연변이를 유전자의 코딩 서열 내로 도입할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 관심 부위를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 공지된 특이성의 개개의 아연 핑거 모티프를 조합함으로써, 목적하는 특이성을 지닌 아연 핑거 결합성 도메인을 설계할 수 있다. DNA와 결합된 아연 핑거 단백질 Zif268의 구조는 이러한 분야에서의 많은 작업에 영향을 미쳐왔고, 64개의 가능한 염기 쌍 삼중체 각각에 대한 아연 핑거를 수득한 다음, 이들 모듈 아연 핑거를 혼합 및 매칭하여 목적하는 모든 서열 특이성을 지닌 단백질을 설계한다는 개념이 보고되었다 (Pavletich NP, Pabo CO (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809-17; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 각각 3개의 염기 쌍 DNA 서열을 인식하는 별도의 아연 핑거를 조합하여, 9개 염기 쌍 내지 18개 염기 쌍 길이 범위의 표적 부위를 인식하는 3-, 4-, 5-, 또는 6-핑거 어레이를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 보다 긴 어레이가 고려된다. 다른 실시양태에서, 6 내지 8개 뉴클레오티드를 인식하는 2-핑거 모듈을 조합하여, 4-, 6-, 또는 8-아연 핑거 어레이를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 박테리아성 또는 파지 디스플레이를 이용하여, 목적하는 핵산 서열, 예를 들어 3 내지 30 bp 길이의 목적하는 뉴클레아제 표적 부위를 인식하는 아연 핑거 도메인을 발생시킨다. 아연 핑거 뉴클레아제는 일부 실시양태에서, 링커, 예를 들어 폴리펩티드 링커를 통하여 서로 융합되거나 또는 달리 접합된, 아연 핑거 결합성 도메인과 절단 도메인을 포함한다. 링커의 길이가, 아연 핑거 도메인에 의해 결합된 핵산 서열로부터의 커팅물의 거리를 결정한다. 보다 짧은 링커가 사용된 경우에는, 절단 도메인이, 상기와 같이 결합된 핵산 서열에 보다 근접한 핵산을 커팅하는 반면, 보다 긴 링커는 상기 결합된 핵산 서열과 커팅물 간의 거리를 보다 크게 만들 것이다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인은 결합된 핵산을 커팅하기 위해 이량체화해야 한다. 이러한 일부 실시양태에서, 이량체는 2개 단량체의 이종-이량체인데, 이러한 단량체 각각은 상이한 아연 핑거 결합성 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이량체는 FokI 절단 도메인과 접합된 아연 핑거 도메인 A를 포함하는 하나의 단량체와, FokI 절단 도메인과 접합된 아연 핑거 도메인 B를 포함하는 하나의 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 비제한적 예에서, 아연 핑거 도메인 A는 표적 부위의 한쪽의 핵산 서열과 결합되고, 아연 핑거 도메인 B는 표적 부위의 다른 쪽의 핵산 서열과 결합되며, 이량체화 FokI 도메인은 아연 핑거 도메인 결합 부위 사이에 있는 핵산을 커팅한다.

부위-특이적 뉴클레아제 및 부위-특이적 재조합효소는 시험관내 및 생체 내에서 표적화된 게놈 변형을 위한 강력한 도구이다. 살아있는 세포 내에서의 뉴클레아제 절단으로 인해, 예를 들어 상동 재조합을 통하여 절단되고 복구된 게놈 서열의 변형을 종종 초래하는 DNA 복구 기전이 촉발되는 것으로 보고되었다. 따라서, 특정 게놈 내의 독특한 특이적 서열을 표적화 절단시키면, 통상적인 유전자 표적화 방법으로는 조작하기가 어려운 세포, 예컨대 많은 인간 체세포 또는 배아 줄기 세포를 포함한 살아있는 세포 내에서 유전자를 표적화하고 유전자를 변형시키기 위한 새로운 수단을 이용할 수 있게 된다. 또 다른 접근 방식은 지정된 DNA 절편의 효율적이고 정확한 통합, 결실, 역위 또는 전위를 유발시키는 데 요구되는 기능성 모두를 보유하고 있는 부위-특이적 재조합효소를 활용한다.

질환 관련 서열, 예를 들어 HIV/AIDS 환자에게서의 CCR-5 대립 유전자, 또는 종양 신생혈관증식에 필요한 유전자의 뉴클레아제-매개된 변형이 임상 상황에서 이용될 수 있고, 2개의 부위 특이적 뉴클레아제가 현재 임상 시험 중이다 (Perez, E.E. et al., "Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases." Nature biotechnology. 26, 808-816 (2008); ClinicalTrials.gov identifiers: NCT00842634, NCT01044654, NCT01252641, NCT01082926). 따라서, 거의 어떠한 유전 질환도 부위-특이적 뉴클레아제 및/또는 재조합효소를 이용하여 치료할 수 있고, 이러한 질환은 예를 들어, 트리플리트(triplet) 확장과 연관된 질환 [예를 들어, 헌팅톤병(Huntington's disease), 근긴장성 퇴행위축, 척수소뇌 실조 등], 낭포성 섬유증 (CFTR 유전자를 표적화함으로써), 혈액학적 질환 (예를 들어, 이상 혈색소증), 암, 자가면역 질환, 및 바이러스성 감염을 포함한다. 본원에 제공된 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 이용하여 치료될 수 있는 기타 질환은 연골 형성 부전, 색맹, 산성 말타제 결핍증, 아데노신 데아미나제 결핍증, 부신 백색질 형성 장애증, 에카르디(aicardi) 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 알파-지중해 빈혈, 안드로겐 무감성 증후군, 아페르트(apert) 증후군, 부정맥 형성 우심실 형성이상, 모세혈관확장성 운동실조, 바르트(barth) 증후군, 베타-지중해 빈혈, 청색 고무 수포 모반 증후군(blue rubber bleb nevus syndrome), 카나반병(canavan disease), 만성 육아종성 질환 (CGD), 고양이울음 증후군(cri du chat syndrome), 더컴병(dercum's disease), 외배엽 형성이상, 판코니(fanconi) 빈혈, 진행성 골화성 섬유형성이상, 취약 X 증후군, 갈락토스혈증, 고셔병(Gaucher's disease), 전신성 강글리오시드증 (예를 들어, GM1), 혈색소 침착증, 베타-글로빈의 6번째 코돈에서의 헤모글로빈 C 돌연변이 (HbC), 혈우병, 헐러(Hurler) 증후군, 저포스파타제증, 클라인펠터(Klinefelter) 증후군, 크라베병(Krabbes Disease), 랑거-기디온(Langer-Giedion) 증후군, 백혈구 부착 결핍증 (LAD), 백색질 형성 장애증, QT 연장 증후군, 마르판(Marfan) 증후군, 뫼비우스(Moebius) 증후군, 점액다당류증 (MPS), 과슬개(nail patella) 증후군, 신장성 요붕증, 신경섬유종증, 니만-피크병(Neimann-Pick disease), 불완전 골형성증, 포르피린병(porphyria), 프래더-윌리(Prader-Willi) 증후군, 유전조로증, 프로테우스(Proteus) 증후군, 망막모세포종, 레트(Rett) 증후군, 루빈스타인-테이비(Rubinstein-Taybi) 증후군, 산필리포(Sanfilippo) 증후군, 중증 복합 면역결핍증 (SCID), 슈와크만(Shwachman) 증후군, 겸상 적혈구병 (겸상 적혈구 빈혈), 스미스-마게니스(Smith-Magenis) 증후군, 스티클러(Stickler) 증후군, 테이-새크스병(Tay-Sachs disease), 혈소판감소증 결석 반경 (TAR) 증후군, 트리처 콜린스(Treacher Collins) 증후군, 세염색체증, 결절성 경화증, 터너(Turner) 증후군, 요소 회로 장애, 폰히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 바르덴부르크(Waardenburg) 증후군, 윌리암스(Williams) 증후군, 윌슨(Wilson) 질환, 비스코트-올드리히(Wiskott-Aldrich) 증후군, 및 X 연관 림프구증식 증후군 (XLP)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

부위-특이적 게놈 변형의 한 가지 측면은 표적을 벗어난 뉴클레아제 또는 재조합효소 효과의 가능성인데, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드가 의도한 표적 서열과 상이한 게놈 서열의 절단 또는 재조합이다. 표적을 벗어난 절단/재조합의 바람직하지 못한 부작용은 유전자 표적화 현상 동안 불필요한 유전자 자리 내로의 삽입에서부터 임상 시나리오에서 중증의 합병증까지로 다양하다. 특정 대상체에게 투여된 엔도뉴클레아제 또는 재조합효소에 의해 종양 억제 유전자 또는 필수 유전자 작용기를 코딩하는 서열이 표적을 벗어나서 절단되거나 재조합되면, 이러한 대상체에게 질환이 유발되거나 심지어 사망할 수 있다. 따라서, 표적을 벗어난 효과를 최소화하는 가장 큰 기회를 갖는 뉴클레아제 및 재조합효소를 설계하는 데 있어서 새로운 전략을 이용하는 것이 요망된다.

본 개시내용의 방법 및 조성물은 일부 측면에서, 자신의 의도된 표적에 대하여 개선된 특이성을 지니도록 조작된 뉴클레아제 (및 그의 사용 방법) 및 재조합효소 (및 그의 사용 방법)를 제공하는 기존의 방법 및 조성물에 비해 개선을 나타낸다. 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 뉴클레아제 및 재조합효소 (자연 발생적인 것과 조작된 것 둘 다)는 전형적으로, 특별한 서열을 인식하는 표적 (예를 들어, DNA) 결합성 도메인을 갖는다. 부가적으로, 공지된 뉴클레아제 및 재조합효소는 절단 또는 재조합을 유도할 수 있는 단일 단백질 내의 DNA 결합성 도메인 및 촉매 도메인을 포함할 수 있으므로, 표적을 벗어난 효과가 나타날 기회가 증가되는데, 이는 뉴클레아제 또는 재조합효소 각각의 표적을 벗어난 결합시 절단 또는 재조합이 발생되는 것으로 예상되기 때문이다. 본 발명의 측면은 서열 (예를 들어, 목적하는 표적에서 2개 이상의 부위에 뉴클레아제 결합을 갖는다)의 수를 증가시키고/시키거나 2개 이상의 단백질 간의 뉴클레아제의 활성 (예를 들어, 표적 결합성 및 표적 절단성)을 분할시키는 것이 뉴클레아제의 특이성을 증가시킴으로써, 표적을 벗어난 효과가 발생할 가능성이 감소된다는 인식에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 재조합효소 (또는 불활성 DNA 결합성 도메인을 갖는 재조합효소)의 촉매 도메인과 뉴클레아제-불활성화 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 간의 융합으로 인해, 어떠한 위치에서도 DNA의 표적화된 재조합이 허용된다는 인식에 관한 것이다.

부위-특이적 뉴클레아제의 맥락에서, 본원에 제공된 전략, 방법, 조성물 및 시스템을 활용하여, 모든 부위-특이적 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 변이체의 특이성을 개선시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 변형에 적합한 뉴클레아제는 본 개시내용을 근거로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 전략, 방법, 조성물 및 시스템을 활용하여 RNA-가이드된 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한) 엔도뉴클레아제 Cas9의 특이성을 개선시킨다. 전형적인 엔도뉴클레아제는 단일 표적 서열을 인식하고 절단하는 반면, Cas9 엔도뉴클레아제는 RNA:DNA 혼성화를 이용하여 표적 DNA 절단 부위를 결정하므로, 단일 단량체성 단백질은 원칙상, 가이드 RNA (gRNA)에 의해 지정된 모든 서열을 절단할 수 있게 된다. Cas9:가이드 RNA 복합체가 세포 (문헌 [Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013)]; [Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013)]; [Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)])와 유기체 (문헌 [Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 227-229 (2013)]) 둘 다를 변형시키기 위해 성공적으로 사용되어 왔지만, 제브라피시(zebrafish) 배아를 변형시키기 위해 Cas9:가이드 RNA 복합체를 이용하는 연구에서는 ZFN 및 TALEN과 유사한 비율로 독성 (예를 들어, 표적을 벗어난 효과)이 관찰되었다 (Hwang, W.Y. et al. Nature Biotechnology. 31, 227-229 (2013)). 추가로, 하나의 DNA 가닥만을 절단하는 Cas9의 최근에 조작된 변이체 ("니카제")는 이중 가닥 브레이크를 2개의 별개의 gRNA 서열에 의해 지정될 수 있게 하지만 (문헌 [Cho, S. W. et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24, 132-141 (2013)]; [Ran, F. A. et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013)]; [Mali, P. et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat. Biotechnol. 31, 833-838 (2013)]), 이들 변이체는 DNA와 개별적으로 결합된 경우에 활성을 유지할 수 있는 각 단량체성 니카제의 능력으로부터 비롯되는 (문헌 [Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819-823 (2013)]; [Jinek, M. et al. Science 337, 816-821 (2012)]; [Gasiunas, G., et al., Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc . Natl . Acad . Sci. 109, E2579-E2586 (2012)]) 표적을 벗어난 절단 활성으로 인해 여전히 고통받고 있다 ([Ran, F. A. et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013)]; [Fu, Y., et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. (2014)]). 따라서, 본 개시내용의 측면은 신규 조작된 Cas9 변이체를 이용하여 Cas9 표적을 벗어난 효과가 나타날 기회를 저하시키는 것을 목적으로 한다. 한 예에서, 예를 들어 야생형 Cas9 보다 >10배, >50배, >100배, >140배, > 200배 이상 더 높은 특이성을 나타내는, Cas9 니카제 또는 야생형 Cas9와 비교해서 개선된 특이성을 지닌 Cas9 변이체 (예를 들어, fCas9)가 제공된다 (예를 들어, 본 실시예 참조).

본 개시내용의 다른 측면은 본 발명의 RNA-가이드된 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한) Cas9-재조합효소 융합 단백질을 활용하는 전략, 방법, 조성물 및 시스템을 제공한다. 전형적인 재조합효소는 별개의 표적 서열을 인식하고 재조합하는 반면, 본원에 제공된 Cas9-재조합효소 융합물은 RNA:DNA 혼성화를 이용하여 표적 DNA 재조합 부위를 결정하므로, 이러한 융합 단백질은 원칙상, gRNA(들)에 의해 지정된 모든 영역을 재조합할 수 있게 된다.

DNA 및 DNA-절단성 뉴클레아제 및/또는 재조합효소에 대한 특별한 관련성이 있긴 하지만, 본원에 제공된 본 발명의 개념, 방법, 전략 및 시스템은 이러한 점에서 제한되지 않고, 모든 핵산:뉴클레아제 또는 핵산:재조합효소 시스템에 적용될 수 있다.

뉴클레아제

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 방법 및 전략을 이용하여 설계되는, 증강된 특이성을 지닌 부위-특이적 뉴클레아제를 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 이러한 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 상기 코딩 핵산을 포함하는 발현 구조물을 제공한다 (예를 들어, 도 20 참조). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 특정 게놈 내의 목적하는 표적 부위를 절단하도록 조작시킨 단리된 뉴클레아제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 단리된 뉴클레아제는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제의 변이체이다.

한 실시양태에서, 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공된다: (ii) 뉴클레아제 도메인과 융합되거나 결합된 (i) RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 단백질, 또는 그의 단편) 도메인. 예를 들어, 일부 측면에서, Cas9 단백질 (예를 들어, 상기 융합 단백질의 Cas9 도메인)은 RNA (gRNA) 결합 활성을 보유하고 있으므로 gRNA에 대해 상보적인 표적 부위와 결합할 수 있는 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (예를 들어, DNA 절단 활성이 결여된 Cas9; "dCas9")를 포함한다. 일부 측면에서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인과 융합된 뉴클레아제는 표적 핵산 (예를 들어, DNA)을 절단하기 위하여 이량체화 (예를 들어, 뉴클레아제의 두 단량체가 함께 온다)를 필요로 하는 모든 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 융합된 뉴클레아제는 FokI DNA 절단 도메인의 단량체이므로, 예를 들어 fCas9로서 지칭된 Cas9 변이체가 생성된다. 이러한 FokI DNA 절단 도메인은 공지되어 있고, 일부 측면에서 이는 FokI (NCBI 수탁 번호 J04623)의 아미노산 388-583에 상응한다. 일부 실시양태에서, FokI DNA 절단 도메인은 FokI의 아미노산 300-583, 320-583, 340-583, 또는 360-583에 상응한다 (또한, 문헌 [Wah et al., "Structure of FokI has implications for DNA cleavage" Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 1998; 1;95(18):10564-9]; [Li et al., "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain" Nucleic Acids Res. 2011; 39(1):359-72]; [Kim et al., "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain" Proc . Natl Acad . Sci . USA. 1996; 93:1156-1160] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, FokI DNA 절단 도메인은 부분으로든 전체로든, 서열 6으로서 제시된 아미노산 서열에 상응하거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, FokI DNA 절단 도메인은 본원에 기재된 바와 같은, FokI의 변이체 (예를 들어, 서열 6의 변이체)이다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 이량체, 예를 들어 fCas9의 이량체가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 그 자신과 이량체를 형성하여 표적 핵산의 절단을 매개한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질, 또는 그의 이량체는 하나 이상의 gRNA와 연합된다. 일부 측면에서, 이량체는 2개의 융합 단백질 (각각은 gRNA 결합 활성을 지닌 Cas9 도메인을 갖는다)을 함유하기 때문에, 핵산 표적의 2개의 별개의 영역을 보완하는 2개의 별개의 gRNA 서열을 이용하여 표적 핵산을 표적화한다 (예를 들어, 도 1A, 6d 참조). 따라서, 이러한 예에서, 양 융합 단백질이 표적 핵산과 결합될 때까지 (예를 들어, gRNA:표적 핵산 염기 쌍형성에 의해 지정된 바와 같음) 표적 핵산의 절단이 일어나지 않고, 뉴클레아제 도메인은 이량체화되며 (예를 들어, FokI DNA 절단 도메인; 상기 융합 단백질의 Cas9:gRNA 도메인의 결합성에 근거한 그들의 근접성에 따른 결과로서), 예를 들어 상기 결합된 Cas9 융합 단백질 사이의 영역 ("스페이서 서열") 내의 표적 핵산을 절단한다. 이는 도 1A 및 6d에 나타낸 도식에 의해 예시된다. 이러한 접근 방식은 핵산을 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인의 이량체화를 요구하지 않는 야생형 Cas9 및 다른 Cas9 변이체, 예컨대 니카제에 비해 현저한 개선을 나타낸다 ([Ran et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013)]; [Mali et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat. Biotechnol. 31, 833-838 (2013)]). 본 실시예에 기재된 바와 같은 이들 니카제 변이체는 표적에 적중한 부위와 표적을 벗어난 부위에서 발생할 수 있는, 핵산에 대한 단일 니카제의 결합시 절단 또는 니킹(nicking)을 유도할 수 있고, 니킹은 돌연변이를 유발시키는 것으로 공지되어 있다. Cas9 니카제를 코딩하는 예시되는 뉴클레오티드 (서열 7) 및 Cas9 니카제의 예시되는 아미노산 서열 (서열 8)이 다음에 제공된다. 본원에 제공된 변이체는 표적 핵산 절단을 유도하기 위하여 2개의 Cas9 변이체가 서로 근접하여 결합될 필요가 있기 때문에, 표적을 벗어난 절단이 유도될 기회가 감소된다 (예를 들어, 본 실시예 참조). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인과 융합된 Cas9 변이체 (예를 들어, fCas9)는 야생형 Cas9 또는 다른 Cas9 변이체 (예를 들어, 니카제)의 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비 보다 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 110배 이상, 120배 이상, 130배 이상, 140배 이상, 150배 이상, 175배 이상, 200배 이상, 250배 이상 더 높은, 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인과 융합된 Cas9 변이체 (예를 들어, fCas9)는 야생형 Cas9 또는 다른 Cas9 변이체의 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비 보다 약 60배 내지 180배, 약 80배 내지 160배, 약 100배 내지 150배, 또는 약 120배 내지 140배 더 높은, 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 갖는다. 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 결정하는 방법은 공지되어 있고, 본 실시예에 기재된 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비는 특정 유전자 내의 공지된 Cas9 표적을 벗어난 부위의 변형 수 또는 양을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, CLTA, EMX, 및 VEGF 유전자의 Cas9 표적을 벗어난 부위는 공지되어 있고, 이들 부위에서의 변형을 측정하고 시험 단백질과 대조군을 비교할 수 있다. 표적 부위 및 그의 상응하는 공지된 표적을 벗어난 부위 (예를 들어, CLTA, EMX, 및 VEGF 표적을 벗어난 부위에 대한 표 5 참조)는 특별한 Cas9 단백질 또는 변이체로 처리된 세포 (예를 들어, HEK293)로부터 단리된 게놈 DNA로부터 증폭된다. 이어서, 이러한 변형을 고 처리량 서열 분석에 의해 분석한다. 잠재적 게놈성의 표적을 벗어난 부위에 2개 이상의 염기 쌍의 삽입 또는 결실을 함유하고 대조군 gRNA-처리된 샘플과 비교해서 표적 gRNA-처리된 샘플에서 유의적으로 더 큰 수가 존재하는 (P 값 < 0.005, 피셔의 직접 확률 시험) 서열이 Cas9 뉴클레아제-유도된 게놈 변형물로 간주된다.

Cas9 니카제 (뉴클레오티드 서열):

Cas9 니카제 (D10A)(아미노산 서열):

일부 실시양태에서, Cas9 변이체 (예를 들어, fCas9)와 결합되는 gRNA는 스페이서 서열을 기준으로 하여, "A" 및 "B" 배향으로 간주된 2가지 방식 중 한 가지로 배향될 수 있다. 배향 A에서는, PAM 모티프와 결합되는 gRNA의 영역이 스페이서 서열로부터 원위이고, gRNA의 5' 말단이 스페이서 서열에 인접한 반면 (도 6c); 배향 B에서는, PAM 모티프와 결합되는 gRNA의 영역이 스페이서 서열에 인접해 있다 (도 9). 일부 실시양태에서, 이러한 gRNA는 A 또는 B 배향으로 표적 핵산과 결합하도록 (예를 들어, Cas9 변이체, 예컨대 fCas9와의 복합체의 일부로서) 조작되거나 선별된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 A 배향으로 표적 핵산과 결합하도록 (예를 들어, Cas9 변이체, 예컨대 fCas9와의 복합체의 일부로서) 조작되거나 선별된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 B 배향으로 표적 핵산과 결합하도록 (예를 들어, Cas9 변이체, 예컨대 fCas9와의 복합체의 일부로서) 조작되거나 선별된다.

일부 실시양태에서, 융합 단백질의 도메인은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 링커를 통하여 연결된다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 다른 실시양태에서, 링커는 비-펩티드성 링커이다. 일부 실시양태에서, 기능성 도메인은 펩티드 링커 (예를 들어, 융합됨) 또는 비-펩티드성 링커를 통하여 본 발명의 융합 단백질과 연결된다. 일부 실시양태에서, 이러한 기능성 도메인은 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인이다. NLS 도메인은 핵 수송에 의해 세포 핵 내로 유입하기 위하여 특정 단백질에 "태그를 부착"하거나 또는 신호를 보내는 아미노산 서열을 포함한다. 전형적으로, 이러한 신호는 단백질 표면 상에 노출된 양 전하를 띤 리신 또는 아르기닌의 하나 이상의 짧은 서열로 이루어진다. NLS 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Lange et al., "Classical nuclear localization signals: definition, function, and interaction with importin alpha." J Biol Chem. 2007 Feb 23;282(8):5101-5] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다), 예를 들어 본 실시예 섹션에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS 서열은 부분으로든 전체로든, 아미노산 서열 MAPKKKRKVGIHRGVP (서열 318)을 포함한다. 링커를 통하여 연합된 도메인 [예를 들어, gRNA 결합성 도메인 (dCas9 도메인), 촉매 뉴클레아제 도메인, 및 NLS 도메인 중 2개 이상]는 어떠한 배향이나 순서로든 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 모든 도메인은 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단에서의 도메인과 C-말단에서의 도메인 사이에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 내의 도메인의 배향 또는 순서는 도 6b에 제공된 바와 같다. 융합 단백질이 3개의 도메인 [예를 들어, gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, dCas9 도메인), 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI), 및 NLS 도메인]을 포함하는 일부 실시양태에서, 각 도메인은 본원에 제공된 바와 같은 링커를 통하여 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 도메인은 링커를 통하여 연결되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 도메인 중 하나 이상이 링커를 통하여 연결된다.

일부 실시양태에서, 3개의 도메인 [예를 들어, gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, dCas9 도메인), 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI), 및 NLS 도메인]을 포함하는 본 발명의 융합 단백질 (예를 들어, fCas9)은 다음에 제시된 바와 같이, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 또는 서열 319로서 제시된 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 단편 또는 변이체)에 의해 코딩된다.

fCas9 (예를 들어, dCas9-NLS-GGS3링커-FokI)

fCas9 (예를 들어, NLS-dCas9-GGS3링커-FokI):

fCas9 (예를 들어, FokI-GGS3링커-dCas9-NLS):

fCas9 (예를 들어, NLS -FokI-GGS3링커-dCas9):

fCas9:

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 (예를 들어, fCas9)은 서열 9 내지 12 또는 서열 319 중 어느 하나의 동족체에 상응하거나 또는 이에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질 (예를 들어, fCas9)은 부분으로든 전체로든, 본원에 제공되고 다음에 제시된 바와 같은, 서열 5, 서열 320, 서열 6, 서열 16, 서열 318, 및 서열 321로서 제시된 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함한다. 서열 5, 서열 320, 서열 6, 서열 16, 서열 318, 및 서열 321에 상응하는 각종 도메인은 서로에 대하여 어떠한 순서로도 배열될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, dCas9 도메인 (예를 들어, 서열 5 또는 서열 320)은 아미노 또는 카르복시 말단에 있거나, 또는 아미노 말단과 카르복시 말단 사이의 어딘가에 있다. 유사하게, 서열 6, 서열 16, 서열 318, 및 서열 321에 상응하는 다른 도메인 각각은 본 발명의 융합 단백질 (예를 들어, fCas9)의 아미노 또는 카르복시 말단에 있거나, 또는 아미노 말단과 카르복시 말단 사이의 어딘가에 있다. 각종 도메인 배열을 갖는 본 발명의 융합 단백질의 예는 서열 9 내지 12 및 서열 319에 상응하는 본 발명의 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 제공된 바와 같은 도메인 중 어느 것에 대하여 부가되거나 치환될 수 있는, 부가 또는 기타 도메인, 예컨대 기타 링커, 기타 NLS 도메인, 기타 뉴클레아제 도메인, 또는 기타 Cas9 도메인을 포함한다.

FokI 절단 도메인:

dCas9:

3xFLAG TAG:

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK (서열 321)

NLS 도메인:

MAPKKKRKVGIHRGVP (서열 318)

XTEN 링커:

SGSETPGTSESATPES (서열 16)

일부 실시양태에서, 이량체를 형성하는 융합 단백질은 단일 연장된 gRNA (예를 들어, 2개의 별도의 gRNA와는 달리, 각각 융합 단백질 이량체의 단량체와 결합된다)의 작용을 통하여 조정된다. 따라서, 일부 측면에서, 단일 연장된 gRNA는 표적 핵산을 보완하는 (예를 들어, 2개의 별개의 부위에서 표적 핵산과 결합하는), 링커 서열에 의해 분리된 2개 이상의 부분을 함유하고, 이러한 gRNA는 본원에 기재된 바와 같이, 2개 이상의 융합 단백질과 결합할 수 있다. 이는 도 1B에 나타낸 도식에 의해 예시된다. 일부 실시양태에서, 상기 연장된 gRNA 중에서의 2개 부분을 분리시키는 링커 서열은 표적 서열과 상보성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 연장된 gRNA는 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 표적 핵산을 절단할 수 있는 이량체를 형성하기 위하여, 융합 단백질이 별도의 gRNA를 통해서 조정되든 단일 gRNA를 통해서 조정되든지 간에, 이러한 절단의 특이성은 단일 표적 핵산 결합 부위를 갖는 뉴클레아제와 비교해서 증강되는 것으로 (예를 들어, 표적을 벗어난 절단이 감소되거나 이러한 절단이 없는 것으로) 예상된다. 뉴클레아제의 특이성을 결정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 공개된 PCT 출원, WO 2013/066438; 계류중인 가출원 US 61/864,289; 및 문헌 [Pattanayak, V., Ramirez, C.L., Joung, J.K. & Liu, D.R. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nature Methods 8, 765-770 (2011)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).

또 다른 실시양태에 따라서, Cas9 단백질의 이량체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 이량체는 표적 핵산을 보완하는 2개 이상의 부분을 포함하는 단일 연장된 gRNA의 작용을 통하여 조정된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 대해 상보적인 부분은 표적 핵산을 보완하는 25개 이하, 24개 이하, 23개 이하, 22개 이하, 21개 이하, 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 또는 5개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 대해 상보적인 부분은 5 내지 30개, 5 내지 25개, 또는 5 내지 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 대해 상보적인 부분은 15 내지 25개, 19 내지 21개, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 부분은 표적 핵산을 보완하는 동일한 수의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 부분은 표적 핵산을 보완하는 상이한 수의 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 연장된 gRNA는 표적 핵산을 보완하는 (예를 들어, 그리고 표적 핵산과 혼성화되는) 2개 부분을 포함하는데, 각 부분은 표적 핵산을 보완하는 5 내지 19개, 10 내지 15개, 또는 10개 뉴클레오티드를 포함한다. 특별한 어떠한 이론에도 얽매이는 것은 아니지만, gRNA 특유의 대략 20개 미만의 뉴클레오티드를 포함하는 부분을 갖게 되면 (예를 들어, 대략 5 내지 19개, 10 내지 15개, 또는 10개 상보적 뉴클레오티드를 포함하는 부분을 갖게 되면), 단일 Cas9:gRNA 단위는 그 자체만으로는 효율적으로 결합될 수 없다. 따라서, 이러한 연장된 gRNA에 의해 잘 적응된 Cas9 단백질 간의 협조적 결합은, 의도된 표적 핵산의 특이성과 절단을 개선시켜 준다. 일부 실시양태에서, 연장된 gRNA의 2개 부분을 분리시켜 주는 링커 서열은 표적 서열과 상보성을 지닌다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 링커 서열은 표적 핵산을 보완하는 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 또는 50개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다. 특별한 어떠한 이론에도 얽매이는 것은 아니지만, Cas9 단백질에 의해 결합되는 것 뿐만 아니라 링커 서열 내의 것을 포함한, 다중 결합 부위 (예를 들어, 다중 저 친화성 결합 부위)를 포함하는 연장된 gRNA를 갖게 되면, 협조적 결합성이 증진됨으로써 증가된 특이성이 제공된다. 이러한 실시양태의 특정 측면이 도 4에 도시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Cas9 단백질 중 어느 것도 단일 연장된 gRNA를 통하여 잘 적응될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, Cas9의 gRNA 결합성 도메인을 포함하는 단백질은 DNA 절단 도메인 (본원에서 Cas9의 "A-절반"으로서 지칭됨)을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, Cas9의 DNA 절단 도메인(들) (예를 들어, HNH, RuvC1 서브도메인)을 포함하는 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 "DNA 절단 도메인"은 집합적으로, 이중 가닥 DNA 절단을 위해 필요한 Cas9의 부분 (예를 들어, HNH, RuvC1 서브도메인)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9의 DNA 절단 도메인을 포함하는 단백질은 gRNA 결합성 도메인 (본원에서 Cas9의 "B-절반"으로서 지칭됨)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, (i) Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, A-절반)을 포함하는 단백질, 및 (ii) Cas9의 DNA 절단 도메인 (예를 들어, B-절반)을 포함하는 단백질을 포함하는 이량체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 이량체는 gRNA에 의해 결합된다. 예를 들어, 상기 이량체는 완전한 길이의 Cas9 단백질의 결합 및 절단 활성을 반복 발생시키는 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 본원에서 "이량체성 분할 Cas9"로서 지칭된다. 표적 핵산을 절단하기 위해 이량체성 분할 Cas9를 사용하는 것이, 단일의 완전한 길이의 Cas9 단백질과 비교해서 증가된 특이성을 제공하는 것으로 예상되는데, 이는 상기 단백질의 절반 둘 다가 뉴클레아제-활성 상태가 되도록 연합 및 재폴딩되기 위해 공동-국재되어야만 하기 때문이다. 이러한 전략은 도 2A의 도식에 제시된다.

일부 실시양태에서, 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공된다: (ii) RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제의 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, Cas9의 A- 또는 B-절반)과 융합되거나 연결된 (i) 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 뉴클레아제-불활성화 RNA 프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 뉴클레아제-불활성화 Cas9). 일부 실시양태에서, 전술된 융합 단백질의 도메인 (i)은 DNA 결합성 도메인, 예를 들어 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 DNA 결합성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9, 및 (ii) Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질의 도메인 (ii)은 DNA 절단 도메인을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9, 및 (ii) DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질의 도메인 (ii)은 gRNA 결합성 도메인을 포함하지 않는다.

일부 실시양태에서, 다음 2개의 단백질을 포함하는 이량체가 제공된다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) Cas9의 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반)을 포함하는 단백질. 다른 실시양태에서, 상기 이량체는 (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반)을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단백질 이량체는 하나 이상의 gRNA를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 2개의 gRNA를 포함하는데, 하나는 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인에 의해 결합되고; 다른 하나는 A-절반 도메인 (예를 들어, 융합 단백질의 A-절반, 또는 융합 단백질의 일부가 아닌 이량체의 A-절반)에 의해 결합된다. 상기 이량체 (예를 들어, 표적 핵산의 별도의 영역과 결합하는 서열을 갖는 2개의 gRNA와 연합됨)는, 예를 들어 단일 gRNA를 갖는 Cas9 단백질과 비교해서 개선된 특이성을 지닌 것으로 예상된다. 이러한 전략은 도 2B에 도시된다.

일부 실시양태에서, 다음 2개의 융합 단백질을 포함하는 단백질 이량체가 제공된다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질. 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 하나 이상의 별개의 gRNA와 연합 (예를 들어, 결합)된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 2개 또는 3개의 gRNA와 연합된다. 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 3개의 gRNA와 연합된다. 예를 들어, 핵산 표적의 특정 영역에 대한 하나의 뉴클레아제-불활성화 Cas9:gRNA의 결합, 및 핵산 표적의 제2 영역에 대한 다른 뉴클레아제-불활성화 Cas9:gRNA의 결합시, 분할 Cas9 절반들 (예를 들어, 융합 단백질의 A-절반과 B-절반)은 이량체화될 수 있고, 핵산 표적의 제3 영역에 대해 상보적인 제3의 gRNA와 결합되어, 완전한 활성의 Cas9 뉴클레아제로 될 수 있는데, 이는 dsDNA를 절단할 수 있다. 이러한 전략은 도 2C에 예시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 최소화된 Cas9 단백질이 제공된다. "최소화된다"는 것은, Cas9 단백질이 야생형 단백질과 비교해서 아미노산 결실 및/또는 끝을 잘라낸 것을 포함하지만, gRNA 결합 활성, DNA 절단 활성, 또는 둘 다는 보유하고 있다는 것을 의미한다. Cas9 단백질 (예를 들어, 분할 Cas9 단백질, Cas9 A-절반, Cas9 B-절반, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 융합 단백질 등)을 설명하는 본원의 실시양태 중 어느 것도 최소화 Cas9 단백질을 활용할 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단 결실 및/또는 끝을 잘라낸 것을 포함하는 최소화 Cas9 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, C-말단 결실 및/또는 끝을 잘라낸 것을 포함하는 최소화 Cas9 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, N- 및/또는 C-말단 결실 및/또는 끝을 잘라낸 것을 포함하는 최소화 Cas9 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 최소화 Cas9 단백질은 gRNA 결합 활성과 DNA 절단 활성 둘 다를 보유하고 있다. 일부 실시양태에서, 최소화 Cas9 단백질은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 40개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 또는 500개 이상의 아미노산을 제거하는, N-말단 끝을 잘라내는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 최소화 Cas9 단백질은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 40개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 또는 500개 이상의 아미노산을 제거하는, C-말단 끝을 잘라내는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결실은 Cas9 내에서, 예를 들어 gRNA 결합성 및/또는 DNA 절단에 영향을 미치지 않는 영역에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 최소화 Cas9 단백질은 하나 이상의 gRNA와 연합된다. 특정 실시양태에서, 최소화 Cas9 단백질은 하나의 gRNA와 연합된다.

재조합효소

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 방법 및 전략을 이용하여 설계되는 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질을 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 상기 재조합효소를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 상기 코딩 핵산을 포함하는 발현 구조물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 특정 게놈 내의 목적하는 표적 부위 (예를 들어, 조작된 재조합효소 중 하나 이상과 결합된 하나 이상의 gRNA에 의해 표적화된 부위)를, 예를 들어 상기 게놈 내의 또 다른 부위 또는 외인성 핵산과 재조합하도록 조작시킨 단리된 재조합효소가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 단리된 재조합효소는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (예를 들어, dCas9)이다. 일부 실시양태에서, dCas9는 부분으로든 전체로든, 서열 5 또는 서열 320을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, dCas9는 서열 5 또는 서열 320의 변이체를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

한 실시양태에서, RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질이 제공된다. 전형적으로, 이러한 융합 단백질은 2개 이상의 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 2개의 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 도메인 중 하나는 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (또는 그의 단편, 예를 들어 Cas9 A-절반), 예를 들어 본원에 기재된 것 (예를 들어, dCas9)이다. 재조합효소 융합 단백질의 Cas9 도메인은 하나 이상의 gRNA와 결합할 수 있으므로, 재조합효소 융합 단백질(들)이, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 표적 핵산을 지시하거나 또는 이를 표적으로 한다. 2개 이상의 도메인 중 또 다른 도메인은 재조합효소, 또는 그의 단편, 예를 들어 재조합효소의 촉매 도메인이다. "재조합효소의 촉매 도메인"이란, 융합 단백질이 특정 재조합효소의 아미노산 서열 (예를 들어, 특정 재조합효소로부터 유래된 아미노산 서열)을 포함하는 도메인을 포함하므로, 이러한 도메인이 표적 핵산과 접촉되는 경우에 (단독으로, 또는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있거나 형성할 수 없는 다른 재조합효소 촉매 도메인을 포함한 부가 인자와 함께) 재조합을 유도시키기에 충분하다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 재조합효소의 촉매 도메인은 재조합효소의 DNA 결합성 도메인을 배제한다. 일부 실시양태에서, 재조합효소의 촉매 도메인은 특정 재조합효소의 일부 또는 전부를 포함하는데, 예를 들어 촉매 도메인은 재조합효소 도메인 및 DNA 결합성 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 또는 촉매 도메인은 DNA 결합 활성을 없애기 위하여 돌연변이되거나 끝이 잘려지는 DNA 결합성 도메인 및 재조합효소 도메인을 포함할 수 있다. 재조합효소 및 재조합효소의 촉매 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 어떠한 재조합효소로부터도 유래된다. 일부 실시양태에서, 재조합효소 촉매 도메인은 Tn3 위치 특이성 재조합 촉진 효소, Hin 재조합효소, 또는 Gin 재조합효소의 촉매 도메인이다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 부분으로든 전체로든, 다음에 제공된 바와 같은 서열 322를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 Tn3 위치 특이성 재조합 촉진 효소 [예를 들어, 스타르크(Stark) Tn3 재조합효소]를 포함한다. 일부 실시양태에서, Tn3 촉매 도메인은 서열 322의 변이체에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Tn3 촉매 도메인은 서열 325에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 변이체)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 부분으로든 전체로든, 다음에 제공된 바와 같은 서열 323을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 Hin 재조합효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, Hin 촉매 도메인은 서열 323의 변이체에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Hin 촉매 도메인은 서열 326에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 변이체)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 부분으로든 전체로든, 다음에 제공된 바와 같은 서열 324를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 Gin 재조합효소 (예를 들어, Gin 베타 재조합효소)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Gin 촉매 도메인은 서열 324의 변이체에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Gin 촉매 도메인은 서열 327에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 변이체)에 의해 코딩된다.

스타르크 Tn3 재조합효소 (뉴클레오티드: 서열 322; 아미노산: 서열 325):

Hin 재조합효소 (뉴클레오티드: 서열 323; 아미노산: 서열 326):

Gin 베타 재조합효소 (뉴클레오티드: 서열 324; 아미노산: 서열 327):

일부 실시양태에서, 재조합효소 촉매 도메인은 Cas9 단백질 (예를 들어, sCas9)의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 사이의 어딘가와 융합된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 신호 (NLS; 예를 들어, 본원에 제공된 것 중 어느 것)를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 예시되는 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질 (예를 들어, Cas9-재조합효소 융합물)의 일반적 구조는 다음 구조 중 하나를 포함한다:

[NH₂]-[Cas9]-[재조합효소]-[COOH],

[NH₂]-[재조합효소]-[Cas9],

[NH₂]-[NLS]-[Cas9]-[재조합효소]-[COOH],

[NH₂]-[NLS]-[재조합효소]-[Cas9]-[COOH],

[NH₂]-[Cas9]-[NLS]-[재조합효소]-[COOH],

[NH₂]-[재조합효소]-[NLS]-[Cas9]-[COOH],

[NH₂]-[Cas9]-[재조합효소]-[NLS]-[COOH], 또는

[NH₂]-[재조합효소]-[Cas9]-[NLS]-[COOH]

(여기서, NLS는 핵 국재화 신호이고, NH₂는 융합 단백질의 N-말단이며, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다). 일부 실시양태에서, 링커가 Cas9 도메인과 재조합효소 도메인 사이에 삽입되는데, 예를 들어 본원에 제공된 모든 링커가 있다. 부가의 특징, 예컨대 서열 태그 (예를 들어, 본원에 제공된 것 중 어느 것)이 또한 존재할 수 있다.

제약 조성물

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 뉴클레아제 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질) 및 재조합효소 (예를 들어, 재조합효소 또는 재조합효소 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질) 중 어느 것도 제약 조성물의 일부로서 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태는 본원에 제공된 바와 같은 뉴클레아제 및/또는 재조합효소, 또는 이러한 뉴클레아제 및/또는 재조합효소를 코딩하는 핵산, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 임의로, 하나 이상의 부가 치료상 활성 물질을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여되어, 이러한 대상체 내에서의 표적화된 게놈 변형을 수행한다. 일부 실시양태에서, 세포를 상기 대상체로부터 수득하고; 이를 생체 외에서 뉴클레아제 및/또는 재조합효소와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 제거되고 생체 외에서 본 발명의 뉴클레아제 및/또는 재조합효소와 접촉시킨 세포를, 임의로 목적하는 게놈 변형을 수행하였거나 또는 세포에서 탐지한 후에 상기 대상체에게 재도입한다. 본원에 제공된 제약 조성물의 설명이 주로, 인간에게 투여하는 데 적합한 제약 조성물에 관한 것이긴 하지만, 이러한 조성물이 일반적으로, 모든 종류의 동물에게 투여하는 데 적합하다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 제약 조성물이 각종 동물에게 투여하는 데 적합하도록 만들기 위해, 인간에게 투여하는 데 적합한 제약 조성물을 변형시키는 것이 널리 이해되고 있고, 통상의 전문 기술을 가진 수의 약리학자는, 있다 하더라고 단지 통상적인 실험을 이용해서 상기 변형을 설계하고/하거나 수행할 수 있다. 제약 조성물이 투여되는 것으로 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유류, 가축, 애완용 동물, 및 상업적으로 관련된 포유류, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 래트; 및/또는 조류 (상업적으로 관련된 조류, 예컨대 치킨, 오리, 거위 및/또는 칠면조 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기재된 제약 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되어 있거나 추후 개발될 어떠한 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제와 연합시키는 단계, 및 이어서, 필요하고/하거나 원하는 경우에는 상기 생성물을 목적하는 단일 용량 단위 또는 다수 용량 단위로 성형하고/하거나 패키징하는 단계를 포함한다.

제약 제형은 부가적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 목적하는 특별한 투여 형태에 적합한 바 대로, 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 기타 액상 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고형 결합제, 윤활제 등을 포함하는 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006); 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에는 제약 조성물을 제형화하는 데 사용된 각종 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술이 개시되어 있다. 뉴클레아제를 포함하는 제약 조성물을 생성시키는 데 적합한 부가의 방법, 시약, 부형제 및 용매에 관해서는 또한, PCT 출원 PCT/US2010/055131을 참조할 수 있다 (그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 예컨대 바람직하지 못한 모든 생물학적 효과를 유발시키거나 또는 달리 유해한 방식으로 제약 조성물의 다른 성분(들)과 상호 작용함으로써, 통상적인 모든 부형제 매질이 특정 물질 또는 그의 유도체와 비화합성인 경우를 제외하고는, 상기 통상적인 부형제 매질의 용도가 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따르는 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 그에 제한되지 않는, 각종 질환, 장애 및/또는 병태 중 어느 것을 치료하는 데 사용될 수 있다: 자가면역 장애 (예를 들어, 당뇨병, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염); 염증성 장애 (예를 들어, 관절염, 골반 염증성 질환); 감염성 질환 [예를 들어, 바이러스성 감염 (예를 들어, HIV, HCV, RSV), 박테리아성 감염, 진균성 감염, 패혈증]; 신경학적 장애 [예를 들어, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅톤병; 자폐증; 뒤시엔느(Duchenne) 근위축증]; 심혈관계 장애 (예를 들어, 아테롬성 경화증, 고콜레스테롤혈증, 혈전증, 응고 장애, 혈관형성성 장애, 예컨대 황반 변형); 증식성 장애 (예를 들어, 암, 양성 종양); 호흡기 장애 (예를 들어, 만성 폐쇄성 폐 질환); 소화기 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 궤양); 근골격계 장애 (예를 들어, 섬유근육통, 관절염); 내분비, 대사 및 영양 장애 (예를 들어, 당뇨병, 골다공증); 비뇨기과 장애 (예를 들어, 신장 질환); 심리적 장애 (예를 들어, 우울증, 정신분열증); 피부 장애 (예를 들어, 상처, 습진); 혈액 및 림프성 장애 (예를 들어, 빈혈, 혈우병) 등.

부위-특이적 핵산 절단 방법

본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 부위-특이적 핵산 (예를 들어, DNA) 절단 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 DNA를 본원에 기재된 Cas9:gRNA 복합체 중 어느 것과 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 DNA를, 다음 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, fCas9)과 접촉시키는 단계를 포함한다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (dCas9); 및 (ii) 뉴클레아제 (예를 들어, FokI DNA 절단 도메인) (여기서, 불활성 Cas9 도메인은 상기 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 gRNA와 결합된다). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 DNA를 본원에 기재된 제2 융합 단백질 (예를 들어, fCas9)과 접촉시키는 단계 (여기서, 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 (dCas9) 도메인은 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2의 gRNA와 결합된다)를 추가로 포함한다 (여기서, 상기 융합 단백질의 결합으로 인해, 융합 단백질의 뉴클레아제 도메인이 이량체화되어, 상기 DNA가 상기 결합된 융합 단백질 사이의 영역에서 절단된다) (예를 들어, 도 1A, 6d 참조). 일부 실시양태에서, 각각의 융합 단백질과 결합된 gRNA는 DNA의 동일 가닥과 혼성화되거나, 또는 이들은 DNA의 반대 가닥과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 상기 gRNA는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화된다. 결합된 Cas9:gRNA 복합체 사이의 영역이 "스페이서 서열"로서 지칭될 수 있는데, 이는 전형적으로 표적 핵산이 절단되는 곳이다 (예를 들어, 도 6c-d 참조). 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 또는 100개 이상의 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 5개 내지 약 50개 염기 쌍, 약 10개 내지 약 40개 염기 쌍, 또는 약 15개 내지 약 30개 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 15개 내지 약 25개 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 15개, 약 20개, 또는 약 25개 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, Cas9:gRNA 복합체는 본원에 기재된 바와 같이, A 배향으로 결합된다. 일부 실시양태에서, Cas9:gRNA 복합체는 본원에 기재된 바와 같이, B 배향으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 야생형 Cas9 또는 다른 Cas9 변이체를 활용하는 방법의 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비 보다 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 110배 이상, 120배 이상, 130배 이상, 140배 이상, 150배 이상, 175배 이상, 200배 이상, 또는 250배 이상 더 높은 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 야생형 Cas9 또는 다른 Cas9 변이체를 활용하는 방법의 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비 보다 약 60배 내지 약 180배, 약 80배 내지 약 160배, 약 100배 내지 약 150배, 또는 약 120배 내지 약 140배 더 높은, 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 갖는다. 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 결정하는 방법은 공지되어 있고, 본 실시예에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 단일 gRNA를 통하여 조정되거나 연합된다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 특정 핵산을, 본원에 기재된 바와 같은 단일 gRNA와 조정된 (예를 들어, 단일 gRNA에 의해 결합된) Cas9 단백질 (또는 그의 단편)의 이량체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 단일 gRNA는 핵산과 혼성화되는 2개 이상의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 부분은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 19개 이상의 상보적 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 부분은 20개 미만의 상보적 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열이 이러한 부분을 분리시키는데, 여기서 링커 서열은 또한, 표적 핵산에 대해 상보적인 (예를 들어, Cas9 단백질에 의해 결합되지는 않는다) 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 표적 핵산과 혼성화되지 않는다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 DNA를, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 단백질 이량체와 접촉시키는 단계 (여기서, 융합 단백질은 하나 이상의 gRNA에 의해 결합된다)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 이량체의 하나의 융합 단백질은 Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반)을 포함하고 [여기서, 상기 단백질은 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반)을 포함하지 않는다]; 이량체의 다른 융합 단백질은 Cas9의 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반)을 포함한다 [여기서, 상기 단백질은 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반)을 포함하지 않는다]. 따라서, 일부 실시양태에서, gRNA (예를 들어, 표적 핵산과 혼성화되는 것)가 상기 이량체의 단량체 중 하나 또는 둘 다와 결합하면, 이러한 이량체가 표적 핵산에 공동-국재되어, 이량체가 뉴클레아제-활성 상태가 되도록 재폴딩될 수 있고 표적 핵산을 절단할 수 있게 된다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 특정 핵산을 다음 2개의 단백질을 포함하는 단백질 이량체와 접촉시키는 단계를 포함한다: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) Cas9의 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반)을 포함하는 단백질. 다른 실시양태에서, 이량체는 (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반)을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 이량체는 하나 이상의 gRNA와 연합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이량체는 2개의 gRNA와 연합되는데: 하나는 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인에 의해 결합되고; 다른 하나는 A-절반 도메인 (예를 들어, 융합 단백질의 A-절반이거나, 또는 융합 단백질의 일부가 아닌 이량체의 A-절반)에 의해 결합된다. 일부 실시양태에서, 단백질 이량체는 (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 Cas9의 gRNA 결합성 도메인 (예를 들어, Cas9 A-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) 뉴클레아제-불활성화 Cas9와 DNA 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 B-절반과 융합된 뉴클레아제-불활성화 Cas9)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 하나 이상의 별개의 gRNA와 연합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 2개 또는 3개의 gRNA와 연합된다. 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 3개의 gRNA와 연합된다. 예를 들어, 핵산 표적의 특정 영역에 대한 하나의 뉴클레아제-불활성화 Cas9:gRNA의 결합, 및 핵산 표적의 제2 영역에 대한 다른 뉴클레아제-불활성화 Cas9:gRNA의 결합시, 분할 Cas9 절반들 (예를 들어, 융합 단백질의 A-절반과 B-절반)은 이량체화되고, 핵산 표적의 제3 영역에 대해 상보적인 제3의 gRNA와 결합되어, 완전한 활성의 Cas9 뉴클레아제로 되어 표적 DNA를 절단하게 된다.

일부 실시양태에서, 핵산을 부위-특이적으로 절단하는 방법은 특정 핵산 (예를 들어, DNA)을, gRNA와 연합된 최소화 Cas9 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)과 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 중 어느 것도 특정 세포, 예를 들어 박테륨, 효모 세포, 또는 포유류 세포 내의 DNA 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 어느 Cas9 단백질에 의해 접촉된 DNA는 진핵 세포 내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체 외에서의 세포 또는 조직 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 특정 개체, 예컨대 환자 또는 연구용 동물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 인간이다.

부위-특이적 재조합 방법

본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 부위-특이적 핵산 (예를 들어, DNA) 재조합 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 2개 이상의 핵산 (예를 들어, DNA) 분자의 2개 이상 영역의 재조합 또는 이러한 2개 이상 영역들 간의 재조합을 유도시키는 데 유용하다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 단일 핵산 분자 (예를 들어, DNA) 내의 2개 이상 영역의 재조합 또는 이러한 2개 이상 영역들 간의 재조합을 유도시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 핵산 분자를 재조합하기 위해서는, 표적 부위에서 사량체성 복합체가 형성되어야 한다. 전형적으로, 이러한 사량체는 4개의 본 발명의 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 모든 본 발명의 4개 재조합효소 융합 단백질의 복합체)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사량체의 각각의 재조합효소 융합 단백질은 각각의 재조합효소 융합 단백질과 결합된 별개의 gRNA를 통하여 특별한 DNA 서열을 표적으로 한다 (예를 들어, 도 5 참조).

일부 실시양태에서, 2개의 DNA 분자 간의 부위-특이적 재조합 방법은 (a) 제1 DNA를 제1 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제1 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 제1 gRNA와 결합된다); (b) 제1 DNA를 제2 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제1 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2 gRNA와 결합된다); (c) 제2 DNA를 제3 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제3 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제2 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 제3 gRNA와 결합된다); 및 (d) 제2 DNA를 제4 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제4 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제2 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제4 gRNA와 결합된다)를 포함한다. 단계 (a) 내지 (d)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 융합 단백질의 재조합효소 촉매 도메인이 사량체화되어 상기 DNA가 재조합된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA는 제1 DNA의 반대 가닥과 혼성화되고, 단계 (c) 및 (d)의 gRNA는 제2 DNA의 반대 가닥과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (d)의 gRNA의 표적 부위는 재조합효소 촉매 도메인의 사량체화를 허용하는 간격으로 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (d)의 gRNA의 표적 부위는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어져 있다. 일부 실시양태에서, 재조합되는 2개 DNA 분자의 2개 영역은, 이러한 재조합되는 영역이 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 100% 상동성이 되도록 상동성을 공유한다.

또 다른 실시양태에서, 단일 DNA 분자의 2개 영역 간의 부위-특이적 재조합 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 특정 DNA를 제1 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 특정 영역과 혼성화되는 제1 gRNA와 결합된다); (b) 상기 DNA를 제2 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2 gRNA와 결합된다); (c) 상기 DNA를 제3 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제3 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제3 영역과 혼성화되는 제3 gRNA와 결합된다); 및 (d) 상기 DNA를 제4 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질과 접촉시키는 단계 (여기서, 제4 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제4 영역과 혼성화되는 제4 gRNA와 결합된다)를 포함한다. 단계 (a) 내지 (d)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 융합 단백질의 재조합효소 촉매 도메인이 사량체화되어 상기 DNA가 재조합된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (d)의 gRNA 중 2개는 DNA의 동일 가닥과 혼성화되고, 단계 (a) 내지 (d)의 다른 2개의 gRNA는 DNA의 반대 가닥과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화되고, 단계 (c) 및 (d)의 gRNA는 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 재조합되는 DNA 분자의 2개 영역은, 이러한 재조합되는 영역이 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 100% 상동성이 되도록 상동성을 공유한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 부위-특이적 재조합 방법 중 어느 것도 재조합을 유도시킬 수 있으므로, 이러한 재조합으로 인해 절제 (예를 들어, DNA의 절편이 표적 DNA 분자로부터 절제된다), 삽입 (예를 들어, DNA의 절편이 표적 DNA 분자 내로 삽입된다), 역위 (예를 들어, DNA의 절편이 표적 DNA 분자 내에서 역위된다), 또는 전위 (예를 들어, 하나 이상의 표적 DNA 분자(들) 간의 DNA 절편의 교환)가 발생된다. 일부 실시양태에서, 특별한 재조합 현상 (예를 들어, 절제, 삽입, 역위, 전위 등)은 특히, 결합된 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질(들)의 배향 (예를 들어, 표적 DNA 분자(들)를 기준으로 함)에 좌우된다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질이 표적 핵산과 결합되는 배향 또는 방향은, 예를 들어 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질(들)과 결합된 gRNA의 특별한 서열에 의해 제어될 수 있다. 특별한 재조합 현상을 제어 또는 지시하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Turan and Bode, "Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J. 2011; Dec;25(12):4088-107; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에 기재된 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 부위-특이적 재조합 방법 중 어느 것도 생체내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위-특이적 재조합 방법 중 어느 것도 특정 세포 내에서 수행된다 (예를 들어, 세포 내의 게놈 DNA와 재조합된다). 이러한 세포는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 세포, 예컨대 진핵 세포는 본원에 기재된 바와 같은 특정 개체, 예컨대 대상체 (예를 들어, 인간 대상체) 내에 있을 수 있다. 본원에 기재된 방법은 시험관내 및 생체 내에서, 예를 들어 트랜스제닉 세포, 세포주 또는 동물의 발생의 맥락에서, 또는 게놈 서열의 변경, 예를 들어 유전적 결함의 교정에서, 특정 대상체 내에 있거나 이러한 대상체로부터 수득된 세포에서, 세포의 유전적 변형에 유용하다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 수득되고 본원에 제공된 방법에 따라서 변형된 세포를 대상체 (예를 들어, 동일 대상체) 내로 재도입하여, 예를 들어 특정 질환을 치료하거나 또는 농업 또는 생물학적 연구에서 유전적으로 변형된 유기체를 생성시킨다.

핵산 서열이 표적 핵산 내로 삽입되도록 2개 이상의 핵산을 재조합하는 것이 요망되는 적용에서는, 삽입될 공여자 서열을 포함하는 핵산이 또한, 예를 들어 세포에 제공된다. "공여자 서열"이란, 하나 이상의 RNA-가이드된 재조합효소 융합 단백질(들)에 의해 유도된 표적 부위에 삽입될 핵산 서열을 의미한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 게놈 변형의 맥락에서, 공여자 서열은 표적 부위에서의 게놈 서열과 상동성을 공유할 것인데, 예를 들어 표적 부위 양옆에 위치하고 있는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적 부위의 약 100개 이하 염기 이내, 예를 들어 약 90개 염기 이내, 약 80개 염기 이내, 약 70개 염기 이내, 약 60개 염기 이내, 약 50개 염기 이내, 약 40개 염기 이내, 약 30개 염기 이내, 약 15개 염기 이내, 약 10개 염기 이내, 약 5개 염기 이내, 또는 표적 부위 바로 양옆에 위치하고 있는 뉴클레오티드 서열과 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 상동성을 공유할 것이다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 표적 핵산과 어떠한 상동성도 공유하지 않는데, 예를 들어 표적 부위에서의 게놈 서열과 상동성을 공유하지 않는다. 공여자 서열은 어떠한 길이일 수도 있는데, 예를 들어 10개 이상의 뉴클레오티드, 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 250개 이상의 뉴클레오티드, 500개 이상의 뉴클레오티드, 1,000개 이상의 뉴클레오티드, 5,000개 이상의 뉴클레오티드, 10,000개 이상의 뉴클레오티드, 100,000개 이상의 뉴클레오티드 등일 수 있다.

전형적으로, 공여자 서열은 이것을 대체되거나 또는 이것이 삽입되는 표적 서열과 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 표적 서열 (예를 들어, 표적 게놈 서열)을 기준으로 하여 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 함유한다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 또한, 관심 DNA 영역과 상동성이 아니고 관심 DNA 영역 내로 삽입되는 것으로 의도되지 않은 서열을 함유하는 벡터 골격을 포함한다.

공여자 서열은 표적 (예를 들어, 게놈) 서열과 비교해서 특정의 서열 상이성, 예를 들어 제한 부위, 뉴클레오티드 다형태, 선별성 마커 (예를 들어, 약물 내성 유전자, 형광성 단백질, 효소 등)를 포함할 수 있는데, 이들은 표적 부위에서의 공여자 서열의 성공적인 삽입을 평가하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 일부 경우에는, 다른 목적을 위해 (예를 들어, 표적화된 게놈 유전자 자리에서의 발현을 나타내기 위해) 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 영역 내에 위치되는 경우에는, 이러한 뉴클레오티드 서열 상이성이 아미노산 서열을 변화시키지 않을 것이거나, 또는 침묵 아미노산 변화 (예를 들어, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변화)를 만들 것이다. 일부 실시양태에서, 이들 서열 상이성은 양옆에 위치하고 있는 재조합 서열, 예컨대 FLP, loxP 서열 등을 포함할 수 있는데, 이들은 예를 들어, 마커 서열을 제거하기 위하여 나중에 활성화될 수 있다.

공여자 서열은 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 또는 이중 가닥 RNA로서 세포에 제공될 수 있다. 이는 선형 또는 환상 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우에는, 공여자 서열의 말단이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 보호될 수 있다 (예를 들어, 외부핵산분해적 분해로부터 보호될 수 있다). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기를 선형 분자의 3' 말단에 부가하고/하거나 자기 상보적 올리고뉴클레오티드를 한쪽 말단 또는 양 말단에 결찰시킨다 (예를 들어, 문헌 [Chang et al., Proc . Natl . Acad Sci USA. 1987; 84:4959-4963]; [Nehls et al., Science. 1996; 272:886-889] 참조). 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 부가 서열, 예컨대, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 항생제 내성을 코딩하는 유전자를 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 네이키드(naked) 핵산으로서, 리포솜 또는 폴옥사머와 같은 작용제와 복합체를 형성한 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV 등)에 의해 전달될 수 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 키트

본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 단백질 및/또는 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 예를 들어, Cas9 변이체를 포함하는, 단리된 뉴클레아제 및 재조합효소의 재조합 발현 및 정제를 위한, 예를 들어 본원에 기재된 단백질 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Cas9 절반 부위 (예를 들어, A-절반 및/또는 B-절반)를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Cas9 융합 단백질, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 융합 단백질 중 어느 것 (예를 들어, 뉴클레아제-불활성화 Cas9를 포함하는 것)을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 서열만을 포함하거나, 또는 이를 본원에 기재된 단백질 중 어느 것을 코딩하는 서열과 조합하여 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 Cas9 단백질, 및/또는 Cas9 단백질을 포함하는 융합물 (예를 들어, 변이체)의 재조합 발현 및 정제를 위한, 본원에 기재된 단백질 중 어느 것을 코딩하는 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 벡터는, 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 것을 포함하거나, 또는 이를 포함하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 Cas9 단백질 (본원에 기재된 바와 같음), gRNA, 또는 그의 조합물 (본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 전형적으로, 벡터는 융합 단백질이 숙주 세포에서 발현되도록, 프로모터와 작동적으로 연결된 본 발명의 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 제공된 Cas9 단백질 중 어느 것의 재조합 발현 및 정제를 위한 세포가 제공된다. 이러한 세포는 재조합 단백질 발현에 적합한 모든 세포, 예를 들어 본 발명의 단백질을 발현하거나 또는 발현할 수 있는 유전적 구조물을 포함하는 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질전환시킨 세포, 또는 게놈 변형을 갖는 세포, 예를 들어 세포의 게놈에 혼입시킨 특정 대립 유전자로부터 본원에 제공된 단백질을 발현하는 것)를 포함한다. 세포를 형질전환시키는 방법, 세포를 유전적으로 변형시키는 방법, 및 이러한 세포에서 유전자 및 단백질을 발현하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))] 및 [Friedman and Rossi, Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual (1^st ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2006))]에 제공된 것을 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은, Cas9 변이체 및/또는 뉴클레아제 및/또는 재조합효소를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 키트는, 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은, 본 발명의 Cas9 변이체, 뉴클레아제, 및/또는 재조합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 재조합 단백질 발현을 위한 벡터를 포함하는데, 여기서 이러한 벡터는 본원에 제공된 단백질 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 단백질 중 어느 것을 발현하기 위한 유전적 구조물을 포함하는 세포 (예를 들어, Cas9 단백질, 또는 Cas9 단백질을 포함하는 융합물을 발현하는 데 적합한 모든 세포, 예컨대 박테리아, 효모 또는 포유류 세포)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 키트 중 어느 것도 하나 이상의 gRNA 및/또는 하나 이상의 gRNA를 발현하기 위한 벡터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 부형제; 및 뉴클레아제 및/또는 재조합효소를 이러한 부형제와 접촉시켜, 핵산을 뉴클레아제 및/또는 재조합효소와 접촉시키는 데 적합한 조성물을 생성시킴으로써, 표적 핵산과의 혼성화 및 표적 핵산의 절단 및/또는 재조합이 일어나도록 하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 Cas9 단백질을 특정 세포에 전달하는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 Cas9 단백질을 특정 대상체에게 전달하는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 제약상 허용되는 부형제이다.

본 발명의 이들 실시양태 및 기타 실시양태의 기능과 이점은 다음 실시예로부터 보다 상세히 이해될 것이다. 다음 실시예는 본 발명의 이득을 예시하고 특별한 실시양태를 설명하고자 한 것이지만, 본 발명의 전체 범위를 예시하고자 한 것은 아니다. 따라서, 다음 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 불활성화 Cas9를 FokI 뉴클레아제와 융합시키면 게놈 변형 특이성이 개선된다

방법:

올리고뉴클레오티드 및 PCR

모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies; IDT)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 표 1에 열거되어 있다. 달리 언급되지 않는 한은, 1x HF 완충제를 수반한 50 ㎕ 중의 2 U/㎕ 푸션 핫 스타트 플렉스(Phusion Hot Start Flex) DNA 중합효소 (NEB) 0.4 ㎕, 0.2 mM dNTP 혼합물 (0.2 mM dATP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dTTP) (NEB), 0.5 μM의 각 프라이머 및 다음 프로그램을 이용하여 PCR을 수행하였다: 98℃, 1 min; [98℃, 15 s; 65℃, 15 s; 72℃, 30 s]의 35 주기.

FokI - dCas9 , Cas9 니카제 및 gRNA 발현 플라스미드의 구축

NLS 및 3xFLAG 태그를 수반한 인간 코돈-최적화 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 뉴클레아제 [애드젠(Addgene) 플라스미드 43861]²를 야생형 Cas9 발현 플라스미드로서 사용하였다. 다음 표 1에 열거된 Cas9_Exp 프라이머를 이용하여 주형으로서의 야생형 Cas9 발현 플라스미드의 PCR (72℃, 3 min) 생성물을 깁슨 어셈블리 클로닝 키트(Gibson Assembly Cloning Kit) [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)]와 어셈블리하여 Cas9 및 FokI-dCas9 변이체를 구축하였다. 단일 gRNA 구조물 (gRNA G1 내지 G13)을 코딩하는 발현 플라스미드를 기존에 언급된 바와 같이 클로닝하였다. 간략하게 언급하면, 20-bp 프로토스페이서 표적 서열을 함유하는 표 1에 열거된 gRNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 이로써 생성되는 4-bp 오버행을 BsmBI-분해된 gRNA 발현 플라스미드 내로 결찰시켰다. 단일 플라스미드 상의 별도의 프로모터로부터의 2개의 별도의 gRNA 구조물의 발현을 코딩하는 gRNA 발현 플라스미드를 2-단계 과정으로 클로닝하였다. 첫째, 하나의 gRNA (gRNA E1, V1, C1, C3, H1, G1, G2 또는 G3)를 상기와 같이 클로닝하고, PCR_Pla-fwd 및 PCR_Pla-rev 프라이머를 이용하여 PCR (72℃, 3 min)하기 위한 주형으로서 사용하며, 1 ㎕ DpnI (NEB)를 가하고, 반응물을 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션한 다음, "제1 gRNA + 벡터 DNA"에 대하여 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 [퀴아젠(Qiagen)]을 수행하였다. 표 1에 열거된 PCR_gRNA-fwd1, PCR_gRNA-rev1, PCR_gRNA-rev2 및 적당한 PCR_gRNA 프라이머를 이용하여 주형으로서의 100 pg의 BsmBI-분해된 gRNA 발현 플라스미드의 PCR (72℃, 3 min) 생성물을 DpnI 처리하고, "제2 gRNA 삽입 DNA"에 대하여 상기와 같이 정제하였다. 약 200 ng의 "제1 gRNA + 벡터 DNA" 및 약 200 ng의 "제2 gRNA 삽입 DNA"를 실온 하에 (약 21℃) 15분 동안 20 ㎕의 총 용적 중에서 1x T4 DNA 리가제 완충제, 1 ㎕의 T4 DNA 리가제 (400 U/㎕, NEB)에서 평활 말단 결찰시켰다. 모든 클로닝을 위하여, 1 ㎕의 결찰 또는 어셈블리 반응물을 Mach1 화학적으로 적격한 세포 [라이프 테크놀로지(Life Technologies)] 내로 형질전환시켰다.

<표 1>

올리고뉴클레오티드. '/5Phos/'는 5' 인산화 올리고뉴클레오티드를 표시한다

게놈 GFP의 변형

HEK293-GFP 안정적 세포 [젠타겟(GenTarget)]를, 게놈 상에 통합된 에머랄드(Emerald) GFP 유전자 (GFP)를 구성적으로 발현하는 세포주로서 사용하였다. 세포를, 10% (vol/vol) 태내 소 혈청 (FBS, 라이프 테크놀로지) 및 페니실린/스트렙토마이신 [1x, 암레스코(Amresco)]을 보충시킨 둘벡코(Dulbecco) 변형 이글 배지 (DMEM, 라이프 테크놀로지)에 유지시켰다. 5 x 10⁴개의 HEK293-GFP 세포를, 48-웰 콜라겐 코팅된 바이오코트 판 [벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)] 상에 도말하였다. 도말한지 1일 후에, 약 75% 전면생장률을 나타내는 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라서 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (라이프 테크놀로지)으로 형질감염시켰다. 간략하게 언급하면, 1.5 ㎕의 리포펙타민 2000을 사용하여 950 ng의 총 플라스미드 (Cas9 발현 플라스미드 + gRNA 발현 플라스미드)를 형질감염시켰다. 700 ng의 Cas9 발현 플라스미드, 125 ng의 하나의 gRNA 발현 플라스미드 및 125 ng의 쌍을 형성한 gRNA 발현 플라스미드 (도 6d 및 도 9에 열거된 표적화된 gRNA의 쌍을 수반함). 별도의 웰을 형질감염 대조군으로서 1 ㎍의 근적외선 iRFP670 (애드젠 플라스미드 45457)³²로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 3.5일 후, 세포를 트립신 처리하고, 10% FBS를 보충시킨 DMEM에 재현탁시키며, 20 nm 대역 통과를 나타내는 520 nm 필터 및 488 nm 레이저 여기를 수반한 C6 유동 세포계수기 [아쿠리(Accuri)] 상에서 분석하였다. 각 샘플에 대하여, 형질감염 및 유동 세포계수 측정을 1회 수행하였다.

게놈 변형의 T7 엔도뉴클레아제 I 서베이어 검정

HEK293-GFP 안정적 세포를 상기 언급된 바와 같이 Cas9 발현 및 gRNA 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 2개의 별도의 gRNA를 코딩하는 단일 플라스미드를 형질감염시켰다. 발현 플라스미드 (Cas9 발현 + gRNA 발현 플라스미드)의 총 량을 적정하는 실험에 대해서는, 700/250, 350/125, 175/62.5, 88/31 ng의 Cas9 발현 플라스미드/ng의 gRNA 발현 플라스미드를, 필요에 따라 불활성 캐리어 플라스미드 pUC19 (NEB)와 조합하여 총 950 ng 형질감염된 플라스미드 DNA에 도달시켰다.

게놈 DNA 단리용 키트인 DNAdvance 키트 [아젠코트(Agencourt)]를 이용하여 형질감염시킨지 2일 후에 게놈 DNA를 세포로부터 단리하였다. 간략하게 언급하면, 48-웰 판 중의 세포를 37℃ 하에 5분 동안 40 ㎕의 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 160 ㎕의 DNAdvance 용해 용액을 가하고, 이 용액을 55℃ 하에 2시간 동안 인큐베이션한 후, 아젠코트 DNAdvance 키트 프로토콜에서의 후속 단계를 수행하였다. 40 ng의 단리된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여, 표 1에 명시된 양옆에 위치하고 있는 서베이(Survey) 프라이머 쌍을 이용하여 표적화된 게놈 유전자 자리를 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)으로 정제하고, 퀀트-iT (Quant-iT™) 피코그린(PicoGreen®) dsDNA 키트 (라이프 테크놀로지)로 정량화하였다. 250 ng의 정제된 PCR DNA를 총 용적 19 ㎕ 중에서 2 ㎕의 NE 완충제 2 (NEB)와 합하고, 변성시킨 다음, 95℃에서 5분, 2℃/s 하의 95 내지 85℃; 0.2℃/s 하의 85 내지 20℃에서 열순환시키면서 재어닐링하였다. 이와 같이 재어닐링된 DNA를 37℃ 하에 15분 동안 1 ㎕의 T7 엔도뉴클레아제 I (10 U/㎕, NEB)과 함께 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 50% 글리세롤을 상기 T7 엔도뉴클레아제 반응물에 가하고, 12 ㎕를 150 V 하에 30분 동안 전기영동시킨 5% TBE 18-웰 크리테리온(Criterion) PAGE 겔 [바이오-래드(Bio-Rad)] 상에서 분석한 다음, 1x SYBR 골드 (라이프 테크놀로지)로 30분 동안 염색하였다. Cas9-유도된 절단 밴드와 절단되지 않은 밴드를 알파이매저(AlphaImager) HP [알파 이노테크(Alpha Innotech)] 상에서 가시화하고, 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다³³. 상기와 같이 절단된 밴드의 피크 세기를 모든 밴드 (절단되지 않은 밴드 + 절단된 밴드)의 총 세기로 나누어, 기존에 언급된 바와 같이 유전자 변형 수준을 평가하기 위하여 사용되었던 절단된 분획을 결정하였다²⁸. 각 샘플에 대하여, 형질감염 및 후속 변형 측정을 상이한 날에 세번 되풀이하여 수행하였다.

게놈 변형의 고 처리량 서열 분석

HEK293-GFP 안정적 세포를, Cas9 발현 및 gRNA 발현 플라스미드로 형질감염시키고, 700 ng의 Cas9 발현 플라스미드 플러스 한 쌍의 gRNA를 발현하는 250 ng의 단일 플라스미드를 형질감염시키며 (고 수준), 다만 Cas9 뉴클레아제에 대해서는, 88 ng의 Cas9 발현 플라스미드 플러스 한 쌍의 gRNA를 발현하는 31 ng의 단일 플라스미드를 형질감염시켰다 (저 수준). 게놈 DNA를 상기와 같이 단리하고, 3개의 생물학적 복제물로부터 풀링하였다. 150 ng 또는 600 ng의 풀링된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여, 표 1에 명시된 양옆에 위치하고 있는 HTS 프라이머 쌍을 이용하여 표적에 적중한 게놈 부위와 표적을 벗어난 게놈 부위를 PCR함으로써 증폭시켰다. 조 PCR 생성물의 상대적 양을 겔 전기영동에 의해 정량화하고, 상이한 gRNA 쌍 또는 Cas9 뉴클레아제 유형으로 처리된 샘플을, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제하기 전에 등몰 농도로 별도로 풀링하였다. 약 500 ng의 풀링된 DNA를 200 V 하에 30분 동안 5% TBE 18-웰 크리테리온 PAGE 겔 (바이오래드) 상에서 수행하고, 약 125 bp 내지 약 300 bp 길이의 DNA를 단리하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)에 의해 정제하였다. 정제된 DNA를 서열 분석용 적응인자를 함유하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시키고, 정제한 다음, 기존에 언급된 바와 같이¹ MiSeq 고 처리량 DNA 서열 분석기 [일루미나(Illumina)] 상에서 서열 분석하였다.

데이터 분석

일루미나 서열 분석용 판독치를 필터링하고, 유닉스 배쉬(Unix Bash)로 작성된 스크립트로 분석하였다. 모든 스크립트는 배쉬로 작성되었다.

팻매치(Patmatch) 프로그램³⁸을 사용하여, Cas9 결합 부위에 상응하는 패턴 서열 (배향 A의 경우 CCN N²⁰ 스페이서 N²⁰NGG 및 배향 B의 경우 N²⁰NGG 스페이서 CCN N²⁰)에 대한 인간 게놈 (GRCh37/hg19 빌드)을 조사하였다. 게놈 부위의 서열 내에서 삽입-결실을 확인하기 위한 단계는 다음과 같이 발견될 수 있다:

1) 서열 판독치를 초기에 필터링하여, 50개 미만 염기의 판독치를 제거하고 B-J가 아닌 일루미나 염기 스코어의 10% 초과를 나타내는 판독치를 제거하였다:

예 SeqA-제1 판독치:

예 SeqA-제2 판독치:

2) 1개의 미스매치를 허용하는 SeqA-제1 판독치 중의 SeqA-제2 판독치의 역 보체의 시작으로부터 첫 번째 20개 염기 4개 염기를 발견한다:

SeqA-제2 판독치의 역 보체:

SeqA-제1 판독치 내에서의 위치

3) 서열을 정렬한 다음 합하여, 간단한 염기 쌍 정렬에서 5% 초과의 미스매치를 수반하는 모든 서열을 제거한다:

SeqA-제1 판독치와 SeqA-제2 판독치의 조합:

4) 표적 부위를 확인하기 위하여, 양옆에 위치하고 있는 게놈 서열을 대상으로 하여, 양옆에 위치하고 있는 게놈 서열 사이에 1 내지 300개 염기의 다양한 양을 허용해 주는 팻매치 프로그램³⁸으로 조사하였다 (표 2):

<표 2> 팻매치 서열

인간 게놈 (GRCh37/hg19 빌드) 중의 참조 게놈 부위와 동일한 크기에 상응하는 모든 표적 부위 서열을 변형되지 않은 것으로 간주하였고, 참조 크기에 상응하지 않는 모든 서열을 잠재적 삽입 또는 결실물로 간주하였다. 클러스털(Clustal)W³⁹를 이용하여 참조 크기에 상응하지 않는 서열을 참조 게놈 부위와 정렬시켰다. 2개의 절반-부위 서열 내의 또는 그 사이의 DNA 스페이서 서열 내에 2개 이상의 삽입 또는 1개의 결실을 수반하는 것으로 정렬된 서열이 삽입-결실로 간주되었다. 고 처리량 서열 분석으로 인해서는, 1개 염기 쌍의 삽입 또는 결실 (미스-단계화)이 낮은 비율이긴 하지만 적절한 비율로 초래될 수 있기 때문에, 2 bp의 삽입-결실은 Cas9 유도된 변형으로부터 발생될 가능성이 더 크다.

서열 분석 실험을 위한 샘플 크기를 최대화하여 (실제 실험 고려 사항 내에서), 효과를 탐지하기 위한 가장 강력한 영향력을 보장하였다. 표 3에서 Cas9-변형된 게놈 부위에 대한 통계적 분석을, 본페로니(Bonferroni) 방법을 이용한 다중 비교 교정을 이용하여 기존에 언급된 바와 같이³⁴ 수행하였다.

다음의 결과를 지칭한 표 3은 (A) 야생형 Cas9, Cas9 니카제 또는 fCas9를 발현하는 플라스미드, 및 CLTA 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA (gRNA C3과 gRNA C4)를 발현하는 단일 플라스미드로 처리된 인간 세포로부터 단리된 150 ng 게놈 DNA로부터 증폭된, 기존에 보고된 표적을 벗어난 게놈 부위 및 CLTA 표적에 적중한 부위를 서열 분석한 것으로부터의 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로서, GFP 유전자 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA (gRNA G1, G2 또는 G3과 gRNA G4, G5, G6 또는 G7)를 사용하는 것을 제외하고는, 형질감염 및 서열 분석을 상기와 같이 수행하였다. 삽입-결실: 3개의 Cas9 뉴클레아제-유도된 절단 중 어느 것과 일치하는 삽입 또는 결실을 함유하는 것으로 관찰된 서열의 수. 총: 첫 번째 10,000개 서열만을 대상으로 하여 표적에 적중한 부위 서열에 관하여 분석하는 동안의 서열 계수치의 총 수. 변형된: 삽입-결실의 수를 서열의 총 수로 나눈다 (%로서 나타냄). 잠재적 변형의 상한치는 1개 미만의 삽입-결실이 존재한다고 가정한 다음, 이를 상한치 변형 비율 (%)에 도달하는 총 서열 계수치로 나누거나, 또는 이론적 탐지 한계치 (1/49,500)를 취함으로써 (어느 것이든 더 큰 것을 고른다), 관찰되지 않은 삽입-결실을 수반한 부위에 대하여 계산하였다. P-값: 야생형 Cas9 뉴클레아제, Cas9 니카제 또는 fCas9 뉴클레아제에 대해서는, CLTA 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA로 처리된 각 샘플과 GFP 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA로 처리된 대조군 샘플 간의 양측 피셔의 직접 확률 시험을 이용하여 기존에 보고된 바와 같이¹⁸ P-값을 계산하였다. < 0.0045의 P-값은 유의적인 것으로 간주되었고, 본페로닌 방법을 이용한 보존적 다중 비교 교정에 근거하여 제시되었다. on:off 특이성은 각 부위에 대한 표적에 적중한 게놈 변형 빈도 대 표적을 벗어난 게놈 변형 빈도의 비이다. (B)는 EMX 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA (gRNA E1과 gRNA E2)를 발현하는 단일 플라스미드를 이용하여 EMX 표적 부위에 적용된 (A)에서와 같은 실험적 및 분석적 방법을 나타낸다. (C)는 VEGF 표적에 적중한 부위를 표적화하는 2개의 gRNA (gRNA V1과 gRNA V2)를 발현하는 단일 플라스미드를 이용하여 VEGF 표적 부위에 적용된 (A)에서와 같은 실험적 및 분석적 방법을 나타낸다. (D)는 탐지 감도를 1/198,000로 증가시키기 위하여 600 ng 게놈 DNA로부터 증폭된 VEGF 표적에 적중한 부위 및 VEGF 표적을 벗어난 부위 1에 적용된 (A)에서와 같은 실험적 및 분석적 방법을 나타낸다.

<표 3>

표적에 적중한 게놈 부위 및 표적을 벗어난 게놈 부위에서 야생형 Cas9, Cas9 니카제, 및 fCas9에 의해 유도된 세포성 변형

결과

1개의 DNA 가닥만을 절단하는 Cas9의 최근에 조작된 변이체 ("니카제")는, 이중 가닥 브레이크가 2개의 별개의 gRNA 서열^{5 -7}에 의해 지정될 수 있게 하지만, DNA와 개별적으로 결합되는 경우에^{9 - 11} 각 단량체성 니카제가 여전히 활성을 유지할 수 있는 능력으로부터 비롯되는 표적을 벗어난 절단 활성^{6 , 8}으로 인해 여전히 고통받을 수 있게 된다. 이와는 달리, DNA를 절단하기 위해 2개의 FokI-dCas9 단량체의 동시적인 DNA 결합과 연합을 필요로 하는 촉매적으로 사멸된 Cas9와의 FokI 뉴클레아제 융합물을 개발하는 것이 본원에 기재되어 있다. 이와 같이 조작된 FokI-dCas9 (fCas9)의 표적을 벗어난 DNA 절단은 약 15개 또는 25개 염기 쌍 떨어진 2개의 gRNA가 양옆에 위치한 부위만을 절단해야 하는 요구 사항 (니카제 보다 훨씬 더 엄격한 간격 요구 사항이다)에 의해 추가로 저하된다. 인간 세포에서는, fCas9가 니카제와 거의 동등한 수준의 효율, 및 야생형 Cas9 보다 >140배 더 높은 특이성으로 표적 DNA 부위를 변형시켰다. fCas9의 기질 요구 사항에 따르는 표적 부위는 인간 게놈 내에 풍부하여, 34 bp마다 평균 1회 존재한다.

세포에서, Cas9:gRNA-유도된 이중 가닥 브레이크는 비-상동 말단 결합 (NHEJ)을 통하여 기능적 유전자 녹아웃을 초래할 수 있거나 또는 외인성 DNA 주형을 수반한 상동성-지시된 복구 (HDR)을 통하여 사실상 모든 서열에 대한 표적 유전자 자리의 변경이 초래될 수 있다^{9 ,15, 16}. Cas9는 특히 편리한 게놈 편집 플랫폼인데¹⁷, 이는 각각의 새로운 관심 표적 부위에 대한 게놈 편집 작용제가 상응하는 gRNA를 단순히 생성시킴으로써 접근될 수 있기 때문이다. 이러한 접근 방식은 세포 및 모델 유기체에서 표적화된 녹아웃과 유전자 삽입을 창출시키기 위해 광범위하게 사용되어 왔고, 또한 그의 잠재적 치료 관련성에 대해 인식되어 왔다.

Cas9:gRNA 시스템이 전례없는 수준의 프로그램 가능성과 사용 용이성을 제공하긴 하지만, 연구 도구로서 및 잠재적 치료제로서 Cas9의 유용성과 안전성을 제한할 수 있는 의도하지 않은 유전자 자리의 변형을 초래하는, 표적을 벗어난 게놈 부위를 절단할 수 있는 Cas9의 능력에 관한 연구^{1 -5}가 보고되었다. 2개의 동시적인 인접한 Cas9:DNA 결합 현상이 일어나는 경우에만 DNA를 절단하도록 Cas9 변이체를 조작하는 것이, 게놈 편집 특이성을 실질적으로 개선시킬 수 있는 것으로 가정되었는데, 이는 2개의 인접한 표적을 벗어난 결합 현상이 발생할 가능성이, 표적을 벗어난 단일 결합 현상이 발생할 가능성 보다 훨씬 더 적기 때문이다 (대략 1/n ² 대 1/n). 이러한 접근 방식은 dsDNA의 단일 가닥 만을 절단하는 돌연변이체 Cas9 단백질, 예컨대 니카제의 최근 개발과는 완전히 다르다. 니카제를 사용하여 2개의 가까운 표적 부위의 반대 가닥을 니킹하면, 효과적으로 이중 가닥 브레이크인 것을 생성시킬 수 있고, 쌍을 이룬 Cas9 니카제는 실질적으로 표적에 적중한 DNA 변형을 수행할 수 있는데, 표적을 벗어난 변형은 감소된다^{5 ,6, 8}. 성분 Cas9 니카제 각각은 여전히 촉매적으로 활성이고^{9 - 11} 단일 가닥 DNA 절단 현상은 약한 수준의 돌연변이 유발성이기 때문에^{18 ,19}, 니카제는 단량체로서 작용하는 경우에도 게놈 변형을 유도시킬 수 있다^5,7,16. 실제로, Cas9 니카제는 세포에서 표적을 벗어난 변형을 유도시키는 것으로 기존에 보고되었다^{6 , 8}. 더욱이, 쌍을 이룬 Cas9 니카제는 약 100 bp 이하 떨어져 결합된 경우에도 dsDNA 절단-유래 변형 현상을 효율적으로 유도시킬 수 있기 때문에⁶, 쌍을 이룬 니카제에 대한 표적을 벗어난 잠재적 부위의 통계적 수는, 보다 공간적으로 제한된 이량체성 Cas9 절단 시스템의 것 보다 더 많다.

Cas9:gRNA 시스템의 특이성을 추가로 개선시키기 위하여, 절대적인 이량체성 Cas9 시스템이 본원에 제공된다. 본 실시예에서는, FokI 제한 엔도뉴클레아제 절단 도메인을 촉매적으로 사멸된 Cas9 (dCas9)와 융합시키면, 2개의 별개의 FokI-dCas9:gRNA 복합체가 특별한 간격 제약을 받는 인접한 부위 ("절반-부위")와 결합되는 경우에만 DNA를 절단할 것인 절대적인 이량체성 Cas9가 창출되었다 (도 6d). 단량체에 의한 단일 가닥 DNA 절단이 독립적으로 발생하는 Cas9 니카제와는 달리, FokI-dCas9의 DNA 절단을 위해서는 2개의 별개의 FokI-dCas9 단량체를 동시에 결합시켜야 하는데, 이는 단량체성 FokI 뉴클레아제 도메인이 촉매적으로 적격하지 않기 때문이다²¹. 이러한 접근 방식은 FokI-dCas9 이량체의 양 단량체로 인해 지정된 표적 염기의 수를 배가시킴으로써, 야생형 Cas9와 비교해서 DNA 절단의 특이성을 증가시켰고, 단량체성 FokI-dCas9:gRNA 복합체의 불활성에 기인하여 니카제와 비교해서 개선된 특이성을 부여하였으며, FokI-dCas9 이량체의 어셈블리에 대한 보다 엄격한 공간적 요구 사항을 부여하였다.

Cas9와 짧은 기능성 펩티드 태그와의 융합이 gRNA-프로그램된 전사 조절을 가능하게 하는 것으로 보고되긴 하였지만²², Cas9와 활성 효소 도메인과의 융합은 기존에 전혀 보고된 바가 없는 것으로 여겨진다. 따라서, FokI 뉴클레아제 도메인, 불활성화 돌연변이 D10A 및 H840A를 함유하는 dCas9, 및 핵 국재화 서열 (NLS)의 별개의 입체 배치를 수반한 광범위한 FokI-dCas9 융합 단백질을 구축하였고 그 특징을 명확히 규명하였다. FokI를 dCas9의 N-말단 또는 C-말단과 융합시키고, 상기 NLS가 어느 한 말단에 위치하거나 또는 두 도메인 사이에 위치하도록 변화시켰다 (도 6b). 링커 서열의 길이는 FokI 도메인과 dCas9 도메인 사이의 Gly-Gly-Ser (GGS)의 1개 또는 3개 반복 서열로서 변화시켰다. 기존에 개발된 이량체성 뉴클레아제 시스템은 절반-부위들 사이의 스페이서 서열의 길이에 민감하기 때문에^23,24, 광범위한 스페이서 서열 길이를 시험 표적 유전자인 에머랄드 GFP (본원에서 GFP로서 후술됨) 내의 2개의 gRNA 결합 부위 사이에서 시험하였다 (도 6c 및 도 9). 상이한 배향을 수반한 gRNA 결합-부위 쌍 2개 세트를 GFP 내에서 선택하였다. 1개 세트는 스페이서 서열로부터 원위의 NGG PAM 서열 쌍에 놓아둔 반면 [gRNA의 5' 말단은 스페이서에 인접해 있다 (배향 A)] (도 6c), 다른 세트는 스페이서에 바로 인접한 PAM 서열에 놓아두었다 (배향 B) (도 9). 전체로서, 7개 쌍의 gRNA가 배향 A에 적합하고, 9개 쌍의 gRNA가 배향 B에 적합하였다. gRNA 표적들을 쌍을 이뤄 조합함으로써, 8개 스페이서 길이를 양 이량체 배향에서 시험하였는데, 배향 A에서는 5 내지 43 bp의 범위이고, 배향 B에서는 4 내지 42 bp의 범위이다. 전체로서, 104개 쌍의 FokI-dCas9:gRNA 복합체에 상응하는 DNA 구조물을 생성시키고 시험하여, 4개의 융합 구조물, 17개의 단백질 링커 변이체 (다음에 기재됨), 양 gRNA 배향 및 절반 부위들 사이의 13개 스페이서 길이를 검토하였다.

이들 후보 FokI-dCas9:gRNA 쌍의 활성을 검정하기 위하여, HEK293 세포에서 안정적으로 통합되고 구성적으로 발현된 GFP 유전자의 DNA 절단 및 NHEJ로 인해 세포성 형광이 상실되는, 기존에 보고된 유동 세포계수법-기반 형광 검정^{2 ,8}을 사용하였다 (도 10). 비교를 위해, FokI-dCas9 변이체의 초기 세트를 대상으로 하여, 양 gRNA 스페이서 배향 세트 A 및 B 전반에 걸쳐 동일한 발현 플라스미드 내의 상응하는 Cas9 니카제 및 야생형 Cas9를 이용하여 나란히 검정하였다. 상응하는 Cas9 단백질 발현 플라스미드를 적당한 쌍의 gRNA 발현 플라스미드와 함께 일시적으로 공동-형질감염시킴으로써, Cas9 단백질 변이체 및 gRNA를 세포에서 생성시켰다. FokI-dCas9 변이체, 니카제, 및 야생형 Cas9는 모두, 동일한 gRNA를 이용하여 동일한 DNA 부위를 표적화하였다.

대부분의 초기 FokI-dCas9 융합 변이체는 불활성이거나 또는 매우 약하게 활성이었다 (도 11). 그러나, NLS-FokI-dCas9 구조 (N 말단에서 C 말단으로 열거됨)는 배향 A로 사용되는 경우에 (PAM은 스페이서로부터 윈위에 있다) 상응하는 gRNA 없는 대조군 위에서 GFP-음성 세포를 10% 증가시켰다 (도 11a). 이와는 달리, NLS-FokI-dCas9 활성은, 스페이서에 인접한 PAM을 수반한 gRNA 쌍 상에서 사용되는 경우에 탐지 가능하지 않았다 (도 11b). 최근에 보고된 Cas9 구조물^{25 ,26}을 조사한 결과, Cas9 N-말단이 RuvCI 도메인으로부터 돌출되어, gRNA:DNA 이중체의 5' 말단과 접촉되는 것으로 밝혀졌다. 어떠한 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이러한 배열은 N-말단적으로 융합된 FokI를 PAM으로부터 원위에 배치시켜, 절단된 스페이서로부터 원위의 PAM을 수반한 gRNA 쌍에 대한 선호도가 생기는 것으로 추정된다 (도 6d). 일부 경우에 다른 FokI-dCas9 융합 쌍 형성과 다른 gRNA 배향이 보통 수준의 활성을 나타내긴 하였지만 (도 11), 배양 A에서 gRNA를 수반한 NLS-FokI-dCas9가 추가 개발을 위해 선택되었다.

이어서, NLS-FokI-dCas9 구조에서 NLS와 FokI 도메인 사이의 단백질 링커, 및 FokI 도메인과 dCas9 사이의 단백질 링커를 최적화하였다. 광범위한 아미노산 조성, 예측되는 유연성, 및 9개 내지 21개 잔기로 다양한 길이를 수반한 17개 링커를 시험하였다 (도 12a). 게놈 GFP 변형의 가장 높은 수준을 뒷받침하는 바와 같이 (도 12b), 개방되고 연장된 입체 형태를 수반한 기존에 보고된 조작된 단백질²⁷에 근거하여, FokI 도메인과 dCas9 사이에서 가요성 18개-잔기 링커, (GGS)₆ (서열 15), 및 16개-잔기 "XTEN" 링커 (도 12a에서의 FokI-L8)를 확인하였다.

화학적 PEG화에 대한 단백질-기반 기능성 유사체로서 작용하는, 그들의 유체역학적 반경을 증가시킴으로써 해독상 융합된 생물학적 약물의 혈청 반감기를 연장시키도록 XTEN 단백질을 최초로 설계하였다³⁵. 화학적으로 안정하고, 비-양이온성, 및 비-소수성 일차 서열, 및 연장된 입체 형태를 보유함으로써, XTEN의 일부가 융합 단백질에 대한 안정적이고 불활성인 링커 서열로서 기능할 수 있었다고 가정된다. E-XTEN으로부터의 XTEN 단백질 태그의 서열을 분석하였고, 아미노산 서열 내의 반복되는 모티프를 정렬하였다. FokI-dCas9 융합 구조물 FokI-L8에 사용된 사열 (도 12a)은 공통의 E-XTEN 모티프의 컨센서스 서열로부터 유래되었고, 이러한 모티프 내의 16개 아미노산을 선택하여 FokI-dCas9 링커로서 시험하였다.

시험된 많은 FokI-dCas9 링커 (최적의 XTEN 링커 포함)는 절반 부위들 사이에 약 15 및 약 25 bp의 스페이서 길이에 대한 현저한 선호도를 나타내는 뉴클레아제를 초래하였는데, 20 bp를 포함한 다른 모든 스페이서 길이는 실질적으로 더 낮은 활성을 나타내었다 (도 12b). 이러한 패턴의 링커 선호도는 FokI-dCas9 융합물이 DNA 이중 나선의 반대 면과 결합하여 DNA를 절단해야만 하는 모델과 일치하였는데, 최적의 결합은 약 1.5 또는 2.5회의 나선형 회전만큼 떨어져 일어난다. NLS-FokI 링커의 변이는, 특히 XTEN FokI-dCas9 링커와 조합되는 경우에, 뉴클레아제 성능에 강력한 영향을 미치지 못하였다 (도 12b).

NLS-FokI-dCas9 구조 내에서 FokI 도메인과 dCas9 사이의 링커를 검정하는 것 이외에도, N-말단 NLS와 FokI 도메인 사이의 4개의 링커 변이체를 또한 시험하였다 (도 12a). NLS-GSAGSAAGSGEF(서열 20)-FokI-dCas9 링커가, 단순한 GGS 링커를 FokI와 dCas9 도메인 사이에 사용한 경우에 시험된 다른 NLS-FokI 링커 보다 거의 2배 더 우수한 GFP 유전자 변형을 나타내긴 하였지만 (도 12b), GSAGSAAGSGEF (서열 20) 링커는 FokI와 dCas9 도메인 사이에 XTEN 링커과 조합되는 경우에 실질적으로 더 우수하게 수행되지 못하였다.

NLS-GGS-FokI-XTEN-dCas9 구조물은 일관되게, 시험된 후보들 중에서 가장 높은 활성을 나타내어, Cas9 니카제 및 야생형 Cas9 뉴클레아제 각각에 대한 약 20% 및 약 30%와 비교해서, 세포의 약 15%에서 GFP의 상실을 유도하였다 (도 7a). fCas9로서 후술되는 상기 구조물을 이용하여, 모든 후속 실험을 수행하였다. 게놈 표적 부위를 효율적으로 변형시킬 수 있는 fCas9의 능력을 확증하기 위하여, T7 엔도뉴클레아제 I 서베이어 검정²⁸을 사용하여, fCas9, Cas9 니카제 또는 야생형 Cas9, 및 배향 A에서의 2개의 별개의 gRNA 또는 음성 대조군으로서 gRNA 없이 처리된 HEK293 세포에서 통합된 GFP 유전자 내의 7개 표적 부위 각각에서의 돌연변이의 양을 측정하였다. 유동 세포계수법-기반 연구와 일치하게, fCas9는 약 15 또는 약 25 bp의 최적의 스페이서 길이를 이용하여 약 20%의 비율로 GFP 표적 부위를 변형시킬 수 있었는데, 이는 니카제-유도된 변형 효율과 거의 동등한 수준이었고 야생형 Cas9의 효율의 대략 2/3였다 (도 7a-c).

이어서, 서베이어 검정에 의해 4개의 별개의 내인성 게놈 유전자 자리를 변형시킬 수 있는 최적화된 fCas9의 능력을 평가하였다. CLTA (2개 부위), EMX (2개 부위), HBB (6개 부위), VEGF (3개 부위)를, 다양한 길이 간격을 둔 배향 A에서의 1개 부위당 2개의 gRNA로 표적화하였다 (도 13). GFP를 표적화하는 실험 결과와 일치하게, 적당하게 간격을 둔 표적 절반-부위에서, fCas9는 4개 모든 유전자의 효율적인 변형을 유도시켰는데, 8% 내지 22% 범위의 표적 염색체 부위 변형을 나타내었다 (도 7d-g 및 도 14). 표적화된 5개 유전자 (GFP 포함) 각각에서 가장 높은 변형을 초래하는 gRNA 스페이서 길이 중에서, fCas9가 평균 15.6% (± 6.3% s.d.) 변형을 유도시킨 반면, Cas9 니카제 및 야생형 Cas9는 각각, 각 유전자에 대한 그들의 최적의 gRNA 쌍으로부터 평균 22.1% (± 4.9% s.d.) 및 30.4% (± 3.1% s.d.) 변형을 유도시켰다. 형질감염 동안 Cas9 발현 플라스미드와 gRNA 발현 플라스미드의 양을 감소시키는 것이 일반적으로, Cas9 니카제 및 fCas9에 대한 게놈 변형 활성을 비례적으로 감소시키지 않았기 때문에 (도 15a-c), 시험된 조건 하에서는 발현이 제한되지 않는 것으로 예상된다.

fCas9의 gRNA 요구 사항이 잠재적으로, fCas9의 표적을 벗어난 잠재적 기질의 수를 제한하기 때문에, 표적 GFP 서열을 절단할 수 있는 fCas9, Cas9 니카제, 및 야생형 Cas9의 능력에 대한 가이드 RNA 배향의 효과를 비교하였다. 기존의 보고 내용과 일치하게^{5 ,6,17}, Cas9 니카제는 가이드 RNA가 야생형 Cas9와 유사하게 배향 A 또는 배향 B로 결합되는 경우에 표적을 효율적으로 절단하였다 (도 8a, b). 이와는 달리, fCas9는 가이드 RNA가 배향 A로 정렬된 경우에 GFP 표적만을 절단하였다 (도 8a). 이러한 배향 요구 사항은 바람직하지 못한 표적을 벗어난 DNA 절단에 대한 기회를 추가로 제한한다.

중요하게도, 4개의 단일 gRNA 중 어느 것도 fCas9와 함께 개별적으로 발현되는 경우에는 GFP 붕괴 또는 서베이어 검정에 의해서 어떠한 변형도 관찰되지 않았는데, 이는 FokI 활성을 위해서는 2개의 동시적인 결합 현상이 필요하기 때문에 예상된 바와 같다 (도 7b 및 도 8c). 이와는 달리, GFP 붕괴는 야생형 Cas9를 동반한 모든 단일 gRNA의 발현 (예상된 바와 같음), 및 2개의 단일 gRNA의 경우에는 Cas9 니카제를 동반한 발현으로부터 비롯되었다 (도 8c). 놀랍게도, 서베이어 검정 결과, GFP가 단일 gRNA를 수반한 야생형 Cas9에 의해 심하게 변형되긴 하였지만, fCas9 또는 Cas9 니카제는 단일 gRNA로 처리된 세포에서 탐지 가능한 변형을 전혀 나타내지 않은 것으로 (< 약 2%) 밝혀졌다 (도 16A). 단일 gRNA 및 fCas9, Cas9 니카제, 또는 야생형 Cas9로 처리된 세포 내의 GFP 표적 부위에서 삽입-결실을 탐지하기 위한 고 처리량 서열 분석 결과, 야생형 Cas9에 의해 예상되는 실질적 수준의 변형 (서열 판독치의 3 내지 7%)이 밝혀졌다. 4개의 단일 gRNA 중 어느 것의 존재 하에서 fCas9에 의한 변형은 배경 위에서 탐지되지 않았는데 (< 약 0.03% 변형), 이는 DNA를 절단하기 위해 2개의 gRNA를 개입시켜야 하는 fCas9의 요구 사항과 일치한다. 이와는 달리, 단일 gRNA의 존재 하에서의 Cas9 니카제는 표적 부위에서 0.05% 내지 0.16% 범위의 변형 수준을 초래하였다 (도 16B). 단일 gRNA로 Cas9 니카제를 처리한 후 표적 부위에서 진짜의 삽입-결실이 탐지되는 것은, 게놈 DNA 니킹의 돌연변이 유발 가능성을 확증시켜 주는데, 이는 기존의 보고 내용과 일치한다^{5 ,7,18,19}.

그러나, 니카제-유도된 DNA 변형의 관찰된 비율은 유동 세포계수법 검정에서의 훨씬 더 높은 GFP 붕괴 신호를 설명하지 못하였다 (도 8c). Cas9 니카제와 함께 GFP 신호 손실을 유도시켰던 gRNA (gRNA G1 및 G3)는 둘 다, GFP 유전자의 비-주형 가닥을 표적으로 하고; 특정 유전자의 코딩 영역에서 dCas9를 이용하여 비-주형 가닥을 표적화하는 것이 효율적인 전사 억제를 매개하는 것으로 공지되어 있기 때문에²⁹, G1 또는 G3 단일 가이드 RNA와 조합된 Cas9 니카제가 저 수준의 게놈 변형 이외에도, 상당한 전사 억제를 유도시킨 것으로 추정된다. 동일한 효과가 fCas9에 대해서는 관찰되지 않았는데, 이는 fCas9가 전사 기구에 의해 DNA로부터 보다 용이하게 대체될 수 있다는 것을 제안하고 있다. 취합해 보면, 이들 결과는 fCas9가, 단일 가이드 RNA와 결합되는 경우에 DNA를 절단할 수 있는 야생형 Cas9 및 Cas9 니카제의 능력과는 달리, 인접한 부위를 표적화하는 2개의 가이드 RNA의 동시 개입을 요구하는 방식으로 게놈 DNA를 효율적으로 변형시킬 수 있다는 것을 표시한다.

상기 결과는 집합적으로, Cas9 니카제와 비교해서 fCas9에 대해서는 훨씬 더 엄격한 스페이서, gRNA 배향 및 가이드 RNA 쌍 형성을 요구한다는 것을 나타낸다. fCas9와는 달리 (도 17), Cas9 니카제는 검정된 모든 스페이서 전반에 걸친 부위 (본 작업에서 배향 A에서 5-bp 내지 47-bp, 및 배향 B에서 4 내지 42 bp)를 절단하였다 (도 8a, b). 이들 관찰 결과는 100 bp 이하 떨어진 스페이서 길이를 이용하여 gRNA에 의해 표적화된 부위를 변형시키는 Cas9 니카제의 기존 보고 내용과 일치한다⁶. Cas9 니카제와 비교해서 fCas9의 보다 엄격한 스페이서 및 gRNA 배향 요구 사항은 fCas9의 잠재적 게놈의 표적을 벗어난 부위의 수를 대략 10배 정도 감소시킨다 (표 4). fCas9의 보다 엄격한 스페이서 요구 사항이 또한, 잠재적으로 표적 가능한 부위의 수를 감소시키긴 하지만, fCas9 스페이서 및 이중 PAM 요구 사항에 따르는 서열이 인간 게놈 내에 34 bp 마다 평균 1회 존재한다 (3.1 x 10⁹ bp 중에 9.2 x 10⁷개 부위) (표 4). 상이한 PAM 특이성을 지닌 Cas9 상동체의 수가 증가하는 것이³⁰ 본원에 기재된 바와 같이 사용하는 것을 잘 받아들이고, fCas9 접근 방식을 이용하여 표적 가능한 부위의 수를 추가로 증가시킬 것으로 또한 예상된다.

표 4에서 (A) 칼럼 2는 2개의 gRNA 결합 부위 사이에 -8 bp 내지 25 bp (칼럼 1)의 스페이서 길이를 허용하는 배향 A에서의 쌍을 이룬 gRNA 결합 부위를 수반한 인간 게놈에서의 부위 수를 나타낸다. 배향 A에서의 gRNA 결합 부위는 스페이서 서열로부터 원위의 NGG PAM 서열을 갖는다 (CCNN₂₀-스페이서-N₂₀NGG). 칼럼 3은 2개의 gRNA 결합 부위 사이에 4 bp 내지 25 bp (칼럼 1)의 스페이서 길이를 허용하는 배향 B에서의 쌍을 이룬 gRNA 결합 부위를 수반한 인간 게놈에서의 부위 수를 나타낸다. 배향 B에서의 gRNA 결합 부위는 스페이서 서열에 인접한 NGG PAM 서열을 갖는다 (N₂₀NGG 스페이서 CCNN₂₀). NC는 인간 게놈 내의 부위 수가 계산되지 않았다는 것을 표시한다. 음성 스페이서 길이는 표시된 수의 염기 쌍에 의해 중복되는 표적 gRNA 결합 부위를 지칭한다. 표 4 (B)는 13 내지 19 bp, 또는 22 내지 29 bp의 스페이서 길이 (fCas9의 스페이서 선호도)를 수반한 배향 A에서의 쌍을 이룬 gRNA 결합 부위의 수의 합을 나타낸다 (도 16). 배향 A에서 -8 bp 내지 100 bp의 스페이서 길이, 또는 배향 B에서 4 내지 42 bp의 스페이서 길이 (Cas9 니카제의 스페이서 선호도)를 수반한 쌍을 이룬 gRNA 결합 부위의 수의 합을 나타낸다 (배향 B에서의 4 내지 42 bp는 도 8b, c에 근거한 것이고, 배향 A에서의 -8 bp 내지 100 bp는 기존의 보고 내용^36,37에 근거한 것이다).

<표 4>

인간 게놈에서 fCas9 및 Cas9 니카제에 대한 쌍을 이룬 gRNA 표적 부위 존재도

(A)

(B)

fCas9의 DNA 절단 특이성을 평가하기 위하여, CLTA, EMX, 및 VEGF 게놈 표적 부위의 공지된 Cas9 표적을 벗어난 부위의 변형을 측정하였다^{1 ,2,6, 8}. 표적 부위 및 그의 상응하는 공지된 표적을 벗어난 부위 (표 5)를, fCas9, Cas9 니카제, 또는 야생형 Cas9 및 CLTA 부위를 표적화하는 19 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA, EMX 부위를 표적화하는 23 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA, VEGF 부위를 표적화하는 14 bp 간격으로 떨어진 2개의 gRNA, 또는 음성 대조군으로서 무관한 부위 (GFP)를 표적화하는 2개의 gRNA로 처리된 HEK293 세포로부터 단리된 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 총 11개의 표적을 벗어난 부위를 고 처리량 서열 분석에 의해 분석하였다.

게놈의 표적을 벗어난 절단을 탐지하기 위한 고 처리량 서열 분석 방법의 민감도는 각 게놈 표적 부위의 PCR 증폭 내로 유입된 게놈 DNA (gDNA)의 양에 의해 제한된다. 인간 gDNA의 1 ng 샘플은 약 330개 만의 독특한 게놈을 나타내므로, 각 게놈 부위의 약 330개 만의 독특한 카피가 존재한다. 각 게놈 표적에 대한 PCR 증폭을 총 150 ng의 유입 gDNA 상에서 수행하였는데, 이는 기껏해야 50,000개의 독특한 gDNA 카피로부터 유래된 앰플리콘을 제공한다. 따라서, 고 처리량 서열 분석 검정은 50,000개 중의 1개 미만의 빈도, 또는 0.002%로 발생되는 희귀한 게놈 변형 현상을 탐지할 수 없다.

<표 5>

EMX, VEGF, 및 CLTA에서 Cas9 표적 부위의 공지된 표적을 벗어난 기질. EMX, VEGF, 및 CLTA의 게놈의 표적에 적중한 부위와 표적을 벗어난 부위의 목록이 제시되어 있는데, 표적에 적중한 것로부터의 돌연변이가 소문자의 볼드체이다. PAM은 대문자의 볼드체로 제시된다.

잠재적 게놈의 표적을 벗어난 부위에서 2개 이상의 염기 쌍의 삽입 또는 결실을 함유하고 대조군 gRNA-처리된 샘플과 비교해서 표적 gRNA-처리된 샘플에서 상당히 더 큰 수로 존재하는 (P 값 < 0.005, 피셔의 직접 확률 시험) 서열이 Cas9 뉴클레아제-유도된 게놈 변형물로 간주되었다. 검정된 11개의 표적을 벗어난 부위 중 10개에 대하여, fCas9는 검정의 민감도 한계치 내에서 어떠한 탐지 가능한 게놈의 표적을 벗어난 변형을 초래하지 못하였는데 (< 0.002%,), 이는 5% 내지 10%의 실질적인 표적에 적중한 변형 효율을 명확하게 보여준다 (도 8d-f 및 표 3). fCas9-변형된 VEGF 표적에 적중한 서열을 상세히 검사한 결과 (도 18a), 아연 핑거 또는 TALE DNA-결합성 도메인과 융합된 FokI 뉴클레아제 도메인의 효과와 유사한, 2개의 표적 결합 부위 사이의 DNA 스페이서에서 발생되는 절단과 일치하는 2개 내지 수십 개의 염기 쌍 범위의 결실이 우세한 것으로 밝혀졌다³¹.

이와는 달리, 게놈의 표적을 벗어난 DNA 절단이, 검정된 11개 모든 부위에서 야생형 Cas9에 대해 관찰되었다. 표적을 벗어난 fCas9 활성에 대한 상한으로서 상기 검정의 탐지 한계치를 이용하여, fCas9가 야생형 Cas9 뉴클레아제 보다 훨씬 더 낮은 표적을 벗어난 변형 비율을 갖는 것으로 계산하였다. 야생형 Cas9 뉴클레아제에 의해 변형된 11개의 표적을 벗어난 부위에서, fCas9는 야생형 Cas9 보다 적어도 140배 더 높은 표적에 적중한:표적을 벗어난 변형 비를 산출시켰다 (도 8d-f).

기존의 보고 내용과 일치하게^{5 ,6,8}, Cas9 니카제는 또한, 야생형 Cas9와 비교해서 실질적으로 더 적은 수의 표적을 벗어난 변형 현상을 유도시켰다 (탐지 가능한 비율로 변형된 11개의 표적을 벗어난 부위 중 1개). 초기 고 처리량 서열 분석 검정 결과, VEGF 표적을 벗어난 부위 1에서 서열의 0.024%에서 Cas9 니카제에 의해 유도된 유의적 (P 값 < 10^-3, 피셔의 직접 확률 시험) 변형이 밝혀졌다. Cas9 니카제의 경우에는 유사한 VEGF 표적에 적중한 변형 효율이 12.3%이고 fCas9의 경우에는 10.4%임에도 불구하고, 상기 게놈의 표적을 벗어난 부위는 fCas9에 의해 변형되지 않았다 (도 8f 및 표 3C). Cas9 니카제-유도된 변형 수준이 탐지 한계치의 한 자릿수 이내였고, fCas9 변형 수준은 탐지하지 못하였기 때문에, 이 실험을 보다 큰 유입 DNA 샘플과 보다 많은 수의 서열 판독치 (초기 실험 및 반복된 실험 각각에 대하여 150 대 600 ng 게놈 DNA 및 > 8 x 10⁵개 판독치 대 > 23 x 10⁵개 판독치)를 이용하여 반복하여, Cas9 니카제 또는 fCas9에 의한 상기 부위에서의 표적을 벗어난 절단을 탐지하였다. 이러한 심층 문의로부터, Cas9 니카제와 fCas9 둘 다가 VEGF 표적을 벗어난 부위 1을 상당히 변형시키는 것으로 관찰되었다 (P 값 < 10^-5, 피셔의 직접 확률 시험) (도 8g, 표 3D, 도 18b). VEGF 표적을 벗어난 부위 1에서의 변형 비율을 문의하는 양 실험의 경우, fCas9는 Cas9 니카제 보다 더 큰 표적에 적중한:표적을 벗어난 DNA 변형 비를 나타내었다 (fCas9의 경우 > 5,150 및 1,650 대 Cas9 니카제의 경우 510 및 1,230, 도 8g).

VEGF 표적을 벗어난 부위 1의 어느 한쪽에는, VEGF 표적에 적중한 서열의 2개 절반-부위 중 어느 하나로부터 6개 이하의 돌연변이를 수반한 다른 부위가 존재하지 않는다. 하나의 gRNA (V2)의 첫 번째 11개 염기는 VEGF 표적을 벗어난 부위 1 내의 표준 Cas9:gRNA 결합으로부터 풀려난 단일 가닥 DNA와 혼성화될 수도 있다 (도 18c). 이러한 gRNA:DNA 혼성화를 통하여, 제2의 Cas9 니카제 또는 fCas9가 동원되어 상기 표적을 벗어난 부위를 극히 낮은 수준이긴 하지만, 탐지 가능한 수준으로 변형시킬 수 있다는 것이 가능하다. 신중한 gRNA 쌍 설계가 이러한 표적을 벗어난 DNA 절단의 잠재적 방식을 없앨 수 있었는데, 이는 VEGF 표적을 벗어난 부위 1이 특정 쌍의 제2의 gRNA를 수반한 11개의 연속되는 잠재적 염기 쌍을 형성할 수 있는 그의 능력에 있어서 고도로 특이하기 때문이다. 일반적으로, fCas9는 FokI 뉴클레아제 도메인을 이량체화하고 활성화시키는 데 요구되는 어느 인접한 제2 결합 부위의 부재로 인해, 시험된 게놈의 표적을 벗어난 부위를 변형시킬 수 없었다.

본 연구에서 개발된 최적화 FokI-dCas9 융합 구조는 표적화된 5개의 모든 게놈 유전자 자리를 변형시켰는데, 이는 fCas9를 이용한 변형이 야생형 Cas9를 이용한 경우 보다 다소 덜 유효하긴 하였지만, 인간 세포에서 게놈 변형을 유도시키기 위해 fCas9를 이용하는 일반론을 입증해준다. fCas9를 사용하는 것은 간단한 일인데, 이는 단지, PAM 서열이 적당한 간격과 배향으로 존재해야만 하고, 야생형 Cas9 또는 Cas9 니카제와 동일한 gRNA를 사용한다. 야생형 Cas9 보다 >140배 더 낮은, 상기와 같이 관찰된 fCas9의 낮은 표적을 벗어난:표적에 적중한 변형 비는 이량체성 FokI의 별개의 작용 방식 [여기서, 2개의 DNA 부위가 지정된 거리 (본원에서는, 약 15 bp 또는 약 25 bp 떨어짐)에서 특이적 절반-부위 배향으로 2개의 FokI 도메인에 의해 동시에 점유되는 경우에만 DNA 절단이 진행된다]으로부터 비롯되는 것으로 예상된다. 이로써 생성되는, 특이하게 낮은 fCas9의 표적을 벗어난 활성은 극히 고도의 표적 특이성을 필요로 하는 Cas9:gRNA-기반 기술의 적용, 예컨대 인간 세포의 생체외 또는 생체내 치료적 변형을 가능하게 해준다.

참고문헌

실시예 2: Cas9 변이체 - 매개된 불활성화를 위하여 CCR5 를 표적화함

강력한 연구 도구를 제공하는 것 이외에도, 부위-특이적 뉴클레아제는 또한, 유전자 요법 작용제로서의 잠재력을 지니고 있고, 부위-특이적 아연 핑거 엔도뉴클레아제는 최근에 임상 시험에 들어갔다: 항-HIV 치료적 접근 방식의 일부로서 인간 CCR-5 대립 유전자를 표적화하는 CCR5-2246.

유사한 접근 방식에서, 본 개시내용의 본 발명의 Cas9 변이체를 사용하여, 예를 들어 특정 대상체로부터 수득된 자기 유래의 T 세포에서 CCR5를 불활성화시킬 수 있는데, 일단 Cas9 변이체에 의해 변형되면, 이를 HIV 감염의 치료 또는 예방을 위하여 상기 대상체 내로 재도입한다.

본 실시예에서는, CCR5 유전자를 특정 대상체로부터 수득된 T 세포에서 표적화한다. CCR5 단백질은 HIV의 특정의 공통 유형이 T 세포와 결합하여 이러한 세포 내로 유입됨으로써 이들 세포를 감염시키는 데 필요하다. T 세포는 신체가 HIV와 싸우기 위해 사용되는 백혈구 중 하나이다.

일부 사람은 그들의 T 세포 상에서 CCR5 발현이 결여되도록 태어나고, 건강한 상태를 유지하다가 HIV으로의 감염에 대해 내성이 있다. 다른 사람들은 그들의 T 세포 상에서의 CCR5의 발현이 낮고, 그들의 HIV 질환은 덜 중증이며 발병 속도도 더 느리다 (AIDS).

T 세포 상에서 CCR5 단백질을 결실시키기 위해서, 많은 수의 T 세포를 특정 대상체로부터 단리한다. 이어서, CCR5를 불활성화시킬 수 있는 Cas9 변이체 (예를 들어, fCas9) 및 gRNA를, 바이러스성 벡터, 예를 들어 아데노바이러스성 벡터를 이용하여 상기 단리된 T 세포로 전달한다. 적합한 Cas9 변이체의 예는 본원에 제공된 본 발명의 융합 단백질을 포함한다. CCR5 대립 유전자를 표적화하는 gRNA에 적합한 표적 서열의 예는 도 19에 기재된 것, 예를 들어 서열 303 내지 310 및 312 내지 317을 포함한다. Cas9 변이체 및 gRNA를 발현할 수 있는 바이러스성 벡터(들)을 상기 단리된 T 세포에 가하여 CCR5 단백질을 녹아웃시킨다. 이러한 T 세포를 대상체에게 재투입하게 되면, 최소한의 아데노바이러스 또는 Cas9 변이체 단백질이 존재하게 된다. 그러나, 대상체에게 투여된 T 세포 상에서의 CCR5 단백질의 제거는 영구적이다. 이어서, 상기 세포를 HIV/AIDS의 치료 또는 예방을 위하여 대상체에게 재도입한다.

실시예 3: Cas9 -재조합효소 융합 단백질

예시되는 Cas9-재조합효소 융합 단백질이 다음에 제공된다:

dCas9 - NLS - GGS3링커 - Tn3

NLS - dCas9 - GGS3링커 - Tn3

Tn3 - GGS3링커 - dCas9 - NLS

NLS - Tn3 - GGS3링커 - dCas9

dCas9 - NLS - GGS3링커 - Hin

NLS - dCas9 - GGS3링커 - Hin

Hin - GGS3링커 - dCas9 - NLS

NLS - Hin - GGS3링커 - dCas9

dCas9 - NLS - GGS3링커 -Gin

NLS - dCas9 - GGS3링커 -Gin

Gin- GGS3링커 - dCas9 - NLS

NLS -Gin- GGS3링커 - dCas9

실시예 4: Cas9 -재조합효소 융합 단백질를 이용한 상동 재조합에 의한 마커 유전자의 도입

숙주 세포 유전자의 게놈 서열이 양옆에 위치하고 있는 그린 형광성 단백질 (GFP) 마커 유전자를 수반하는 벡터를, 이러한 GFP 마커와 재조합되는 게놈 유전자 자리 및 GFP 마커 유전자를 표적으로 하는 4개의 적당하게 설계된 gRNA 및 dCas9-재조합효소 융합 단백질 (서열 328 내지 339 중 어느 하나)을 코딩하는 발현 구조물과 함께 세포 내로 도입한다. 4개의 dCas9-재조합효소 융합 단백질은, gRNA의 결합을 통하여 GFP 마커 유전자와 함께 상기 게놈 유전자 자리에서 조정된다 (도 5b). 상기 융합 단백질의 4개의 재조합효소 도메인은 사량체화되고, 이러한 융합 단백질의 재조합효소 도메인의 재조합효소 활성으로 인해, 상기 게놈 유전자 자리와 마커 유전자 간에 재조합이 발생됨으로써, 마커 유전자가 게놈 유전자 자리 내로 도입된다. 상기 마커 유전자의 도입은 GFP 발현 및/또는 PCR에 의해 확증된다.

등가 및 범위

관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 통상적인 실험을 이용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가내용을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명으로 제한되지 않고, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같와 같다.

청구범위에서, 단수 형태는 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하지 않는 한 하나 이상을 의미한다. 특정 군의 하나 이상의 구성원들 간의 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은 이러한 군 구성원 중 하나, 2개 이상, 또는 모두가 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하지 않는 한은 소정의 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나 또는 달리 관련되는 경우에 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 상기 군의 바로 하나의 구성원이 소정의 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 군 구성원의 2개 이상 또는 모두가 소정의 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다.

더욱이, 본 발명이 청구항들 중 하나 이상으로부터, 또는 상기 설명의 관련 부분으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절, 기술적 용어 등이 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변동, 조합 및 순열을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속항인 어떠한 청구항도 동일한 기본 청구항에 종속적인 다른 청구항에서 발견된 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 더욱이, 청구항이 조성물을 인용하는 경우, 달리 표시되지 않는 한 또는 모순이나 불일치가 발생할 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하지 않는 한은, 본원에 개시된 목적 중 어느 것을 위하여 이러한 조성물을 사용하는 방법이 포함되고, 본원에 개시된 제조 방법 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법 중 어느 것에 따라서 상기 조성물을 제조하는 방법이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

요소들이 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬(Markush) 군 형식으로 제시되는 경우에는, 이러한 요소들의 각 아군이 또한 개시되고, 어떠한 요소(들)도 이러한 군으로부터 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는"은 부가의 요소 또는 단계의 봉입을 허용하고 개방하기 위한 것이란 사실에 주목해야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특별한 요소, 특징, 단계 등을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시양태는 이러한 요소, 특징, 단계 등으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 편의상, 이들 실시양태는 본원에서 그런 말로 구체적으로 제시되지 않았다. 따라서, 하나 이상의 요소, 특징, 단계 등을 포함하는 본 발명의 각 실시양태에 대하여, 본 발명은 또한, 이러한 요소, 특징, 단계 등으로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 실시양태를 제공한다.

범위가 제공되는 경우에는, 종말점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되지 않거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 맥락 및/또는 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 모든 구체적 값 내지 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한은 이러한 범위의 하한치의 단위의 1/10을 추정할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 달리 표시되지 않거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 맥락 및/또는 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 소정의 범위 내의 모든 아범위를 추정할 수 있는 것으로 이해되어야 하는데, 여기서 이러한 아범위의 종말점은 상기 범위의 하한치의 단위의 1/10과 동일한 정확도로 표현된다.

또한, 본 발명의 특별한 어떠한 실시양태도 어느 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위 내의 어떠한 값도 어느 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 모든 실시양태, 요소, 특징, 적용 또는 측면이 어느 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다. 간결성을 위해, 하나 이상의 요소, 특징, 목적 또는 측면이 배제되는 모든 실시양태가 본원에 명백하게 제시되지 않는다.

상기 열거된 항목을 포함한, 본원에 언급된 모든 공개 공보, 특허 및 서열 데이터베이스 목록은 마치 각각의 개별 공개 공보 또는 특허가 특이적이고도 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되었던 것처럼 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 분쟁이 있는 경우, 본원의 모든 정의를 포함한 본 출원이 우선할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College <120> CAS9 VARIANTS AND USES THEREOF <130> H0824.70146WO00 <140> PCT/US2014/054291 <141> 2014-09-05 <150> US 61/980,315 <151> 2014-04-16 <150> US 61/915,414 <151> 2013-12-12 <150> US 61/874,609 <151> 2013-09-06 <160> 339 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4104 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg attataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg gcagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggcag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga 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1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgagggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680 gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740 tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggcgcct accatgattt gctaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860 ttaacattga ccttatttga agataggggg atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920 cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980 cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040 gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100 agtttgacat ttaaagaaga tattcaaaaa gcacaggtgt ctggacaagg ccatagttta 2160 catgaacaga ttgctaactt agctggcagt cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220 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Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Ile Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys 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cctcaaagac aatcgtgaaa agattgagaa aatcctaacc 2100 tttcgcatac cttactatgt gggacccctg gcccgaggga actctcggtt cgcatggatg 2160 acaagaaagt ccgaagaaac gattactcca tggaattttg aggaagttgt cgataaaggt 2220 gcgtcagctc aatcgttcat cgagaggatg accaactttg acaagaattt accgaacgaa 2280 aaagtattgc ctaagcacag tttactttac gagtatttca cagtgtacaa tgaactcacg 2340 aaagttaagt atgtcactga gggcatgcgt aaacccgcct ttctaagcgg agaacagaag 2400 aaagcaatag tagatctgtt attcaagacc aaccgcaaag tgacagttaa gcaattgaaa 2460 gaggactact ttaagaaaat tgaatgcttc gattctgtcg agatctccgg ggtagaagat 2520 cgatttaatg cgtcacttgg tacgtatcat gacctcctaa agataattaa agataaggac 2580 ttcctggata acgaagagaa tgaagatatc ttagaagata tagtgttgac tcttaccctc 2640 tttgaagatc gggaaatgat tgaggaaaga ctaaaaacat acgctcacct gttcgacgat 2700 aaggttatga aacagttaaa gaggcgtcgc tatacgggct ggggacgatt gtcgcggaaa 2760 cttatcaacg ggataagaga caagcaaagt ggtaaaacta ttctcgattt tctaaagagc 2820 gacggcttcg ccaataggaa ctttatgcag ctgatccatg atgactcttt aaccttcaaa 2880 gaggatatac aaaaggcaca 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cgtagggacc gcactcatta agaaataccc gaagctagaa 3780 agtgagtttg tgtatggtga ttacaaagtt tatgacgtcc gtaagatgat cgcgaaaagc 3840 gaacaggaga taggcaaggc tacagccaaa tacttctttt attctaacat tatgaatttc 3900 tttaagacgg aaatcactct ggcaaacgga gagatacgca aacgaccttt aattgaaacc 3960 aatggggaga caggtgaaat cgtatgggat aagggccggg acttcgcgac ggtgagaaaa 4020 gttttgtcca tgccccaagt caacatagta aagaaaactg aggtgcagac cggagggttt 4080 tcaaaggaat cgattcttcc aaaaaggaat agtgataagc tcatcgctcg taaaaaggac 4140 tgggacccga aaaagtacgg tggcttcgat agccctacag ttgcctattc tgtcctagta 4200 gtggcaaaag ttgagaaggg aaaatccaag aaactgaagt cagtcaaaga attattgggg 4260 ataacgatta tggagcgctc gtcttttgaa aagaacccca tcgacttcct tgaggcgaaa 4320 ggttacaagg aagtaaaaaa ggatctcata attaaactac caaagtatag tctgtttgag 4380 ttagaaaatg gccgaaaacg gatgttggct agcgccggag agcttcaaaa ggggaacgaa 4440 ctcgcactac cgtctaaata cgtgaatttc ctgtatttag cgtcccatta cgagaagttg 4500 aaaggttcac ctgaagataa cgaacagaag caactttttg ttgagcagca caaacattat 4560 ctcgacgaaa tcatagagca aatttcggaa ttcagtaaga gagtcatcct agctgatgcc 4620 aatctggaca aagtattaag cgcatacaac aagcacaggg ataaacccat acgtgagcag 4680 gcggaaaata ttatccattt gtttactctt accaacctcg gcgctccagc cgcattcaag 4740 tattttgaca caacgataga tcgcaaacga tacacttcta ccaaggaggt gctagacgcg 4800 acactgattc accaatccat cacgggatta tatgaaactc ggatagattt gtcacagctt 4860 gggggtgac 4869 <210> 320 <211> 1367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 320 Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly 1 5 10 15 Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys 20 25 30 Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly 35 40 45 Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys 50 55 60 Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe 85 90 95 Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His 100 105 110 Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn 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Arg Leu Gly Arg Ser Met Lys His Leu Ile Ser Leu Val Gly Glu Leu 85 90 95 Arg Glu Arg Gly Ile Asn Phe Arg Ser Leu Thr Asp Ser Ile Asp Thr 100 105 110 Ser Ser Pro Met Gly Arg Phe Phe Phe Tyr Val Met Gly Ala Leu Ala 115 120 125 Glu Met Glu Arg Glu Leu Ile Ile Glu Arg Thr Met Ala Gly Ile Ala 130 135 140 Ala Ala Arg Asn Lys Gly Arg Arg Phe Gly Arg Pro Pro Lys Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile 165 170 175 Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp 180 185 190 Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp 195 200 205 Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser 210 215 220 Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg 225 230 235 240 Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser 245 250 255 Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu 260 265 270 Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe 275 280 285 Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile 290 295 300 Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu 305 310 315 320 Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His 325 330 335 Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys 340 345 350 Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn 355 360 365 Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg 370 375 380 Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly 385 390 395 400 Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly 405 410 415 Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys 420 425 430 Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu 435 440 445 Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn 450 455 460 Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu 465 470 475 480 Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu 485 490 495 His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu 500 505 510 Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr 515 520 525 Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe 530 535 540 Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val 545 550 555 560 Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn 565 570 575 Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu 580 585 590 Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys 595 600 605 Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu 610 615 620 Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu 625 630 635 640 Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser 645 650 655 Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro 660 665 670 Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr 675 680 685 Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg 690 695 700 Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu 705 710 715 720 Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp 725 730 735 Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val 740 745 750 Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys 755 760 765 Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile 770 775 780 Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met 785 790 795 800 Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val 805 810 815 Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser 820 825 830 Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile 835 840 845 Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln 850 855 860 Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala 865 870 875 880 Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu 885 890 895 Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val 900 905 910 Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile 915 920 925 Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys 930 935 940 Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu 945 950 955 960 Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln 965 970 975 Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr 980 985 990 Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp 995 1000 1005 Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn 1010 1015 1020 Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn 1025 1030 1035 Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg 1040 1045 1050 Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn 1055 1060 1065 Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala 1070 1075 1080 Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys 1085 1090 1095 His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 1100 1105 1110 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys 1115 1120 1125 Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys 1130 1135 1140 Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu 1145 1150 1155 Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu 1160 1165 1170 Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg 1175 1180 1185 Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala 1190 1195 1200 Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu 1205 1210 1215 Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu 1220 1225 1230 Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp 1235 1240 1245 Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile 1250 1255 1260 Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser 1265 1270 1275 Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys 1280 1285 1290 Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val 1295 1300 1305 Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser 1310 1315 1320 Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met 1325 1330 1335 Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1340 1345 1350 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro 1355 1360 1365 Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu 1370 1375 1380 Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro 1385 1390 1395 Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys 1400 1405 1410 Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val 1415 1420 1425 Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser 1430 1435 1440 Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys 1445 1450 1455 Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu 1460 1465 1470 Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly 1475 1480 1485 Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys 1490 1495 1500 Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His 1505 1510 1515 Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln 1520 1525 1530 Leu Gly Gly Asp 1535

Claims (113)

1. 2개의 도메인: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인; 및 (ii) 뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 비-펩티드성 링커 또는 (GGS)₃, (GGS)₆, SGSETPGTSESATPES (서열 16), SGSETPGTSESA (서열 17), SGSETPGTSESATPEGGSGGS (서열 18), VPFLLEPDNINGKTC (서열 19), GSAGSAAGSGEF (서열 20), SIVAQLSRPDPA (서열 21), MKIIEQLPSA (서열 22), VRHKLKRVGS (서열 23), GHGTGSTGSGSS (서열 24), MSRPDPA (서열 25) 및 GGSM (서열 301)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드성 링커에 의해 상기 2개의 도메인이 분리되는 것인 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 뉴클레아제 도메인이 FokI DNA 절단 도메인의 단량체인 융합 단백질.
3. 제1항의 융합 단백질의 이량체.
4. 제1항에 있어서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인이 gRNA와 결합할 수 있는 것인 융합 단백질.
5. (a) DNA를 제4항의 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 불활성 Cas9 도메인은 상기 DNA의 한 영역과 혼성화되는 gRNA와 결합할 수 있는 것인 단계; 및
   (b) 상기 DNA를 제4항의 제2 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제2 융합 단백질의 불활성 Cas9 도메인은 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2의 gRNA와 결합할 수 있는 것인 단계
   를 포함하고, 여기서 단계 (a) 및 (b)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해 융합 단백질의 뉴클레아제 도메인이 이량체화되어, DNA가 상기 결합된 융합 단백질들 사이의 영역에서 절단되는 것인, 시험관내 부위-특이적 DNA 절단 방법.
6. 제5항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA가 DNA의 동일 가닥과 혼성화되거나, 또는 단계 (a) 및 (b)의 gRNA가 DNA의 반대 가닥과 혼성화되는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA가 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화되는 것인 방법.
8. 제3항의 이량체와 단일 연장된 gRNA를 포함하며, 여기서 이량체의 각 융합 단백질의 불활성 Cas9 도메인은 상기 gRNA와 결합되어, 하나의 융합 단백질이 gRNA의 한 부분과 결합하고 다른 융합 단백질이 gRNA의 또 다른 부분과 결합하는 것인 복합체.
9. 제8항에 있어서, gRNA가 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 또는 300개 이상 뉴클레오티드 길이인 복합체.
10. 제8항에 있어서, 표적 핵산과 혼성화되는 연장된 gRNA의 영역이 15 내지 25개, 19 내지 21개, 또는 20개 뉴클레오티드 길이를 포함하는 것인 복합체.
11. DNA를, 제8항의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서
    (a) gRNA는 DNA의 2개의 별도의 영역과 혼성화되는 2개 부분을 함유하고;
    (b) 복합체는 이들 gRNA의 부분이 상기 2개의 영역과 혼성화됨에 따른 결과로서 DNA와 결합되며;
    (c) 복합체의 결합으로 인해, 각 융합 단백질의 뉴클레아제 도메인이 이량체화되어, 상기 도메인이 상기 결합된 융합 단백질 사이의 영역에서 DNA를 절단하는 것인, 시험관내 부위-특이적 DNA 절단 방법.
12. 제11항에 있어서, gRNA의 2개 부분이 DNA의 동일 가닥과 혼성화되거나, 또는 gRNA의 2개 부분이 DNA의 반대 가닥과 혼성화되는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, gRNA의 2개 부분이 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화되는 것인 방법.
14. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제3항의 이량체 및 gRNA에 의해 형성되는 단백질:gRNA 복합체.
15. DNA를 제14항의 단백질:gRNA 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 부위-특이적 DNA 절단 방법.
16. 2개의 도메인을 포함하는 융합 단백질의 이량체로서, 1개의 도메인이 Cas9이고, 상기 이량체는 단일 gRNA를 통하여 조정되고, 비-펩티드성 링커 또는 (GGS)₃, (GGS)₆, SGSETPGTSESATPES (서열 16), SGSETPGTSESA (서열 17), SGSETPGTSESATPEGGSGGS (서열 18), VPFLLEPDNINGKTC (서열 19), GSAGSAAGSGEF (서열 20), SIVAQLSRPDPA (서열 21), MKIIEQLPSA (서열 22), VRHKLKRVGS (서열 23), GHGTGSTGSGSS (서열 24), MSRPDPA (서열 25) 및 GGSM (SEQ ID NO:301)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드성 링커에 의해 2개의 도메인이 분리되는 것인 이량체.
17. 제16항에 있어서, 단일 gRNA가 (i) 각각 Cas9 단백질과 결합할 수 있고, (ii) 각각 표적 핵산 서열과 혼성화되는 2개 이상의 부분을 포함하는 것인 이량체.
18. 제17항에 있어서, 표적 핵산에 혼성화되는 gRNA의 부분이 표적 핵산 서열에 대해 상보적인 5개 이하, 10개 이하, 또는 15개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 이량체.
19. 제18항에 있어서, gRNA의 부분이 링커 서열에 의해 분리되는 것인 이량체.
20. 제19항에 있어서, 링커 서열이 표적 핵산과 혼성화되는 것인 이량체.
21. DNA를 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 이량체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관내 부위-특이적 DNA 절단 방법.
22. 2개의 도메인: (i) 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인; 및 (ii) 재조합효소 촉매 도메인을 포함하고, 비-펩티드성 링커 또는 (GGS)₃, (GGS)₆, SGSETPGTSESATPES (서열 16), SGSETPGTSESA (서열 17), SGSETPGTSESATPEGGSGGS (서열 18), VPFLLEPDNINGKTC (서열 19), GSAGSAAGSGEF (서열 20), SIVAQLSRPDPA (서열 21), MKIIEQLPSA (서열 22), VRHKLKRVGS (서열 23), GHGTGSTGSGSS (서열 24), MSRPDPA (서열 25) 및 GGSM (SEQ ID NO:301)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드성 링커에 의해 상기 2개의 도메인이 분리되는 것인 융합 단백질.
23. 제22항에 있어서, 재조합효소 촉매 도메인이 Hin 재조합효소, Gin 재조합효소, 또는 Tn3 재조합 촉진 효소(resolvase)의 재조합효소 촉매 도메인의 단량체인 융합 단백질.
24. 제22항에 있어서, 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인이 gRNA와 결합할 수 있는 것인 융합 단백질.
25. 하나 이상의 핵산과 결합하는 것인, 제22항의 융합 단백질의 이량체.
26. 제25항에 있어서, 이량체의 각각의 융합 단백질은 핵산의 반대 가닥과 결합하는 것인 이량체.
27. 하나 이상의 핵산과 결합하는 것인, 제22항의 융합 단백질의 사량체.
28. (a) 제1 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제1 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제1 DNA의 한 영역과 혼성화되는 제1 gRNA와 결합하는 것인 단계;
    (b) 제1 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제2 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제1 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2 gRNA와 결합하는 것인 단계;
    (c) 제2 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제3 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제3 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제2 DNA의 한 영역과 혼성화되는 제3 gRNA와 결합하는 것인 단계; 및
    (d) 제2 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제4 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제4 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 제2 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제4 gRNA와 결합하는 것인 단계
    를 포함하며, 여기서 단계 (a) 내지 (d)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 상기 DNA가 재조합되도록 하는 조건 하에 융합 단백질의 재조합효소 촉매 도메인이 사량체화되는 것인, 시험관내 2개 DNA 분자 간의 부위-특이적 재조합 방법.
29. 제28항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA가 제1 DNA의 반대 가닥과 혼성화되고, 단계 (c) 및 (d)의 gRNA가 제2 DNA의 반대 가닥과 혼성화되는 것인 방법.
30. 제28항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA; 단계 (c) 및 (d)의 gRNA; 또는 단계 (a), (b), (c) 및 (d)의 gRNA가 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 그들 각각의 DNA의 영역과 혼성화되는 것인 방법.
31. (a) DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제1 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 한 영역과 혼성화되는 제1 gRNA와 결합하는 것인 단계;
    (b) 상기 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제2 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제2 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제2 영역과 혼성화되는 제2 gRNA와 결합하는 것인 단계;
    (c) 상기 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제3 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제3 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제3 영역과 혼성화되는 제3 gRNA와 결합하는 것인 단계; 및
    (d) 상기 DNA를 제25항 또는 제26항의 이량체 또는 제27항의 사량체의 제4 융합 단백질과 접촉시키며, 여기서 제4 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성화 Cas9 도메인은 상기 DNA의 제4 영역과 혼성화되는 제4 gRNA와 결합하는 것인 단계
    를 포함하며, 여기서 단계 (a) 내지 (d)에서의 융합 단백질의 결합으로 인해, 상기 DNA가 재조합되도록 하는 조건 하에 융합 단백질의 재조합효소 촉매 도메인이 사량체화되는 것인, 시험관내 단일 DNA 분자의 2개 영역 간의 부위-특이적 재조합 방법.
32. 제31항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)의 gRNA 중 2개가 상기 DNA의 동일 가닥과 혼성화되고, 단계 (a) 내지 (d)의 gRNA 중 다른 2개가 상기 DNA의 반대 가닥과 혼성화되는 것인 방법.
33. 제31항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)의 gRNA가 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화되고, 단계 (c) 및 (d)의 gRNA가 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 40개 이하, 50개 이하, 60개 이하, 70개 이하, 80개 이하, 90개 이하, 또는 100개 이하 염기 쌍 떨어진 DNA의 영역과 혼성화되는 것인 방법.
34. 제5항 내지 제7항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, DNA가 세포 내에 있는 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, 세포가 진핵 세포 또는 원핵 세포인 방법.
36. 제1항, 제2항, 제4항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 복합체, 제3항, 제16항 내지 제20항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 이량체 또는 제27항의 사량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
37. 제36항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
38. 제1항, 제2항, 제4항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 복합체, 제3항, 제16항 내지 제20항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 이량체 또는 제27항의 사량체를 발현하기 위한 유전적 구조물을 포함하는 세포.
39. 제1항, 제2항, 제4항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질.
40. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 핵 국재화 신호 도메인을 추가로 포함하는 복합체.
41. 제3항, 제16항 내지 제20항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 핵 국재화 신호 도메인을 추가로 포함하는 이량체.
42. 제27항에 있어서, 핵 국재화 신호 도메인을 추가로 포함하는 사량체.
43. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 XTEN 링커; 트리-펩티드 GGS의 하나 이상의 반복 서열을 포함하는 아미노산 서열; 또는 하기에 제공된 바와 같은 어느 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
    

    
44. 제3항에 있어서, 펩티드 링커가 XTEN 링커; 트리-펩티드 GGS의 하나 이상의 반복 서열을 포함하는 아미노산 서열; 또는 하기에 제공된 바와 같은 어느 서열을 포함하는 것인 이량체.
    

    
45. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 XTEN 링커; 트리-펩티드 GGS의 하나 이상의 반복 서열을 포함하는 아미노산 서열; 또는 하기에 제공된 바와 같은 어느 서열을 포함하는 것인 복합체.
    

    
46. 제1항, 제2항, 제4항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12로서 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 중 어느 하나의 변이체 또는 단편에 의해 코딩되는 것인 융합 단백질.
47. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12로서 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 중 어느 하나의 변이체 또는 단편에 의해 코딩되는 것인 복합체.
48. 제3항, 제16항 내지 제20항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12로서 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 중 어느 하나의 변이체 또는 단편에 의해 코딩되는 것인 이량체.
49. 제27항에 있어서, 단백질이 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12로서 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 9, 서열 10, 서열 11 또는 서열 12 중 어느 하나의 변이체 또는 단편에 의해 코딩되는 것인 사량체.
50. 제1항, 제2항, 제4항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 복합체, 제3항, 제16항 내지 제20항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 이량체 또는 제27항의 사량체를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물.
51. 제1항, 제2항, 제4항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 복합체, 제3항, 제16항 내지 제20항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 이량체 또는 제27항의 사량체를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간을 치료하는 데 사용하기 위한 조성물.
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