CN106544357B - 一种培育镉低积累籼稻品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培育镉低积累籼稻品种的方法，包括：克隆籼稻受体材料的OsNramp5的部分CDS序列；利用CRISPR/Cas9系统，根据外显子序列选择靶标序列，构建pCRISPR/Cas9重组载体；将pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；筛选转基因阳性植株；获得突变植株；将突变植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突变体。本发明利用CRISPR/Cas9技术定向敲除籼稻镉吸收主效基因OsNramp5，定向育成不带转基因成分，综合农艺性状无显著变异且稻米镉含量低的籼稻材料，具有靶向高效、育种周期短、成本低、实用性强等优势。

Description

一种培育镉低积累籼稻品种的方法
技术领域
本发明涉及水稻生物技术育种领域，具体涉及一种培育镉低积累籼稻品种的方法。
背景技术
近20年来，随着我国采矿、冶炼的发展，工业“三废”的排放，城市垃圾处理不善及污水灌溉等，造成土壤重金属污染问题日益突出。水稻是我国主要的粮食作物，也是相对容易积累镉(Cadmium,Cd)的作物之一。镉随着水和营养物质吸收进入水稻后，不仅影响水稻的生长、发育，而且通过食物链的富集危害人体健康。中国的一些地方已经出现因食用高镉污染的稻米引起了人肾功能损害、骨痛等现象，而日本早在20世纪中叶就出现因稻米镉超标导致骨痛病(日本称“痛痛病”)的爆发。目前，稻米镉污染对粮食生产已造成严重的安全挑战，筛选和培育籽粒镉低积累的水稻品种十分必要且紧迫。
传统的改良品种的籽粒镉含量方法为利用低镉材料与受体材料杂交、回交，结合后代农艺性状观察和镉含量鉴定多代筛选，这样的育种方法工作量大，育种周期长，并且无论回交多少代都会多少渗入与靶标基因连锁的其他基因，改变遗传背景，影响受体品种的农艺性状。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsNramp5定向的育种方法，利用CRISPR/Cas9技术定向敲除籼稻OsNramp5，彻底失活镉吸收转运蛋白OsNramp5，靶向高效育成不带转基因成分，稻米镉含量显著降低，综合农艺性状无显著变异的籼稻材料，育种周期短、成本低且实用性强。
为此，本发明提供了一种培育低镉籼稻品种的方法，包括以下步骤：
S1、扩增籼稻受体材料的OsNramp5的部分CDS序列并测序；
S2、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsNramp5的部分CDS序列选择靶标序列；
S3、构建含所述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体；
S4、将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；
S5、筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；
S6、对所述转基因阳性植株的靶位点测序，筛选突变植株；
S7、将所述突变植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突变体。
上述的方法，优选的，所述步骤S2中设计的靶标序列的的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，所述N表示A、T、C和G中的任意一个，所述X为19或20。
上述的方法，优选的，所述靶标序列包括TPS1和TPS2，所述TPS1的DNA序列为SEQID NO.2所示的序列，所述TPS2的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的序列。
上述的方法，优选的，所述步骤S3具体包括以下步骤：
S3-1、根据靶标序列以及酶切位点信息，设计带粘性末端的接头引物；
S3-2、酶切原始载体；
S3-3、将所述带粘性末端的接头引物退火后连接到酶切过的原始载体上，得到重组gRNA表达盒；
S3-4、将所述重组gRNA表达盒进行PCR扩增得到扩增产物；
S3-5、酶切扩增产物，将酶切后的扩增产物连接到酶切过的pCRISPR/Cas9载体上，得到重组载体。
上述的方法，优选的，所述步骤S3-1中所述接头引物包括TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R，所述TPS1-F的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的序列，所述TPS1-R的DNA序列为SEQID NO.5所示的序列，所述TPS2-F的DNA序列为SEQ ID NO.6所示的序列；所述TPS2-R的DNA序列为SEQ ID NO.7所示的序列。
上述的方法，优选的，所述原始载体为pU3-gRNA或pU6a-gRNA。
上述的方法，优选的，所述步骤S3-2中采用Bsa I酶切所述原始载体。
上述的方法，优选的，所述步骤S3-5中采用Bsa I酶切所述扩增产物。
主要利用了Bsa I的切割位点在识别位点之外的特点，便于一次酶切产生多种带不同粘性末端的DNA片段，一次完成酶切、连接。
上述的方法，优选的，所述步骤S3-3中，所述带粘性末端的接头引物位于所述表达载体的两个Bsa I内切酶位点之间，形成重组的gRNA表达盒。
上述的方法，优选的，所述步骤S6步骤具体为：提取所述转基因阳性植株的DNA，进行PCR扩增得到扩增产物；对所述扩增产物进行测序，选择两个等位OsNramp5均发生功能缺失突变的T0代纯合突变体和双等位突变体的植株作为突变植株。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsNramp5培育镉低积累籼稻品种的方法。OsNramp5是目前在水稻中鉴定出来的根吸收镉的主效转运蛋白，目前的研究表明该基因突变可导致水稻的Mn和Cd含量显著降低，突变对产量的影响因不同遗传背景而表现不同。本发明基于CRISPR/Cas9系统，定点突变OsNramp5，快速靶向改良籼稻的籽粒镉积累性状，获得不带转基因成分的镉低积累籼稻材料。这种技术方法一方面规避了转基因可能带来的安全隐患，另一方面由于是靶向突变，具有突变位点精准可控的优点。
(2)本发明提供了一种基于CRISPR/Csa9系统靶向突变OsNramp5培育镉低积累籼稻品种的方法，采用5’-(N)X-NGG-3’结构的靶标序列，靶标序列NGG上游的12bp在水稻基因组中有较好的特异性，能显著降低脱靶概率。
(3)本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsNramp5培育镉低积累籼稻品种的方法，大大缩短了育种周期，加快了育种进程，节省了时间和成本。
(4)本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统靶向突变OsNramp5培育镉低积累籼稻品种的方法，由于是靶向定点突变，不改变受体材料的遗传背景；而传统杂交、回交的育种方法，无论回交多少代都会多少渗入与靶标基因连锁的其他基因，改变遗传背景，影响受体品种的农艺性状。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为实施例1中的T1代敲除株系Hpt PCR检测结果；其中1-15表示15株不同的T1代植株，CK+表示阳性对照，CK-表示阴性对照。
图2为实施例1中的T1代敲除株系Cas PCR检测结果；其中1-15表示15株不同的T1代植株，CK+表示阳性对照，CK-表示阴性对照。
图3为实施例1中的突变体osnramp5和对照WT的产量性状比较；材料于2mg/kg的镉胁迫盆栽种植，3次重复。A∶单株产量；B∶稻草干重。
图4为实施例1中的突变体osnramp5和对照WT的糙米Cd含量；材料于2mg/kg的镉胁迫盆栽种植，3次重复。**表示0.01水平差异显著。
图5为实施例1中的突变体osnramp5和对照WT的糙米Mn、Cu、Fe、Zn含量；材料于2mg/kg的镉胁迫盆栽种植，3次重复。**表示0.01水平差异显著。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
本发明的一种培育镉低积累籼稻品种的方法，有效改良籽粒镉积累性状，步骤如下：
1)克隆籼稻(indica rice)品种华占的OsNramp5翻译起始密码子ATG后第286～1251位的核苷酸序列，进行测序。测序结果为SEQ ID NO.1所示的序列：
GCAGCTAATCTTGGAGTGGTTACAGGGAGGCATCTGGCTGAGATCTGCAAGAGTGAGTACCCCAAGTTCGTCAAGATTTTCCTATGGCTGCTGGCAGAGTTGGCCGTCATCGCTGCAGATATCCCAGAAGTTATAGGGACGGCCTTTGCTTTCAACATATTGTTCCATATTCCGGTGTGGGTCGGCGTCCTCATCACCGGCACCAGCACTCTACTGCTTCTTGGCCTCCAAAAATACGGGGTGAGGAAGCTGGAGTTTCTGATATCGATGCTGGTGTTCGTGATGGCGGCGTGCTTCTTCGGGGAGCTGAGCATCGTGAAGCCGCCGGCGAAGGAGGTGATGAAGGGGCTCTTCATCCCCAGGCTCAACGGCGACGGCGCCACCGCCGACGCCATTGCCCTCCTCGGAGCTCTTGTCATGCCCCACAATCTGTTCTTGCATTCTGCCTTGGTGCTATCGAGGAAGACACCGGCATCAGTCAGAGGAATCAAGGACGGGTGCAGGTTCTTCCTGTACGAGAGCGGGTTCGCGCTGTTCGTGGCGCTGCTGATAAACATCGCCGTCGTCTCCGTCTCCGGCACCGCCTGCTCCTCCGCCAACCTCTCCCAAGAGGACGCCGACAAGTGCGCCAACCTCAGCCTCGACACCTCCTCCTTCCTTCTCAAGAACGTGCTGGGCAAGTCGAGTGCGATCGTGTACGGCGTGGCACTGTTGGCATCTGGGCAGAGCTCCACTATTACCGGCACATACGCTGGACAGTACATCATGCAGGGTTTCTTGGACATCAGGATGAGGAAGTGGCTTCGGAACCTGATGACAAGAACCATCGCCATCGCGCCGAGCCTCATCGTCTCCATCATCGGCGGCTCCAGGGGCGCCGGCCGCCTCATCATCATCGCTTCGATGATACTGTCCTTCGAGCTGCCGTTTGCTCTCATCCCTCTTCTCAAGTTCAGCAGCAGTAAG。
2)根据步骤1)中序列，设计两条靶标序列，分别为TPS1和TPS2：
TPS1(SEQ ID NO.2)：CCGTCTCCGGCACCGCCTGCTCC；
TPS2(SEQ ID NO.3)：CCGACAAGTGCGCCAACCTCAGC
以上两条靶标序列的反向互补链含有5’-(N)X-NGG-3’结构。其中，下划线部分为5’-(N)X-NGG-3’结构中的NGG的互补链序列。
3)含TPS1、TPS2双靶点pCRISPR/Cas9重组载体的构建：
3.1、合成带粘性末端的靶标序列双链，作为接头引物：
TPS1包括合成正向寡核苷酸链TSP1-F(SEQ ID NO.4)和与之互补的反向寡核苷酸链TSP1-R(SEQ ID NO.5)，TPS2包括合成正向寡核苷酸链TSP2-F(SEQ ID NO.6)和与之互补的反向寡核苷酸链TSP2-R(SEQ ID NO.7)，具体序列为：
TSP1-F(SEQ ID NO.4)：GCCGGAGCAGGCGGTGCCGGAGA；
TSP1-R(SEQ ID NO.5)：AAACTCTCCGGCACCGCCTGCTC；
TSP2-F(SEQ ID NO.6)：GGCAGCTGAGGTTGGCGCACTTGT；
TSP2-R(SEQ ID NO.7)：AAACACAAGTGCGCCAACCTCAGC。
其中，未划线的部分为靶标序列TPS1(SEQ ID NO.2)、TPS2(SEQ ID NO.3)中去除NGG的序列或其互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
3.2、构建pCRISPR/Cas9重组载体：
3.2.1接头的制备：将接头引物TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R分别溶解成100μM的母液，各取1μL，其中TSP1-F与TSP1-R混合得到TSP1混合液，TSP2-F与TSP2-R混合得到TSP2混合液，将TSP1混合液、TSP2混合液均稀释到1μM。在95℃下放置30S，移至室温冷却，完成退火。
3.2.2酶切pU3-gRNA、pU6a-gRNA载体：在20μL反应体系中用10U Bsa I酶切pU3-gRNA、pU6a-gRNA载体20min，在70℃下放置5min使酶失活，得到酶切后的pU3-gRNA、pU6a-gRNA载体。
3.2.3将步骤3.2.1中得到的接头与步骤3.2.2得到的pU3-gRNA、pU6a-gRNA载体的连接反应：取1μL 10x T4DNA ligase buffer，0.5μL pU3-gRNA/pU6a-gRNA载体(12ng)，1μLTSP2/TSP1，1μL T4DNA ligase(35U)，最后加ddH2O至总体积10μl，在20℃～25℃下连接15min，得到重组的sgRNA表达盒：pU3-TSP2-gRNA、pU6a-TSP1-gRNA。
3.2.4PCR扩增表达盒：用KOD高保真酶，和U3-F、U3-R引物对、扩增步骤3.2.3中得到的pU3-TSP2-gRNA；用KOD高保真酶，和U6a-F、U6a-R引物对、扩增步骤3.2.3中得到的pU6a-TSP1-gRNA表达盒。其中引物对的序列分别为：
U3-F(SEQ ID NO.8)：TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG；
U3-R(SEQ ID NO.9)：AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC；
U6a-F(SEQ ID NO.10)：TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG；
U6a-R(SEQ ID NO.11)：AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC；
反应体系为：1μL pU3-TSP2-gRNA/pU6a-TSP1-gRNA载体，0.5μL U3-F/U6a-F，0.5μL U3-R/U6a-R，4μL dNTP，15μL 2xbuffer，0.5μL KOD酶，加ddH2O至总体积30μL。
反应程序为：95℃预变性1min，28个循环：95℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸20s。
电泳，把扩增后的pU3-TSP2-gRNA、pU6a-TSP1-gRNA表达盒等量混合，用PCR产物纯化试剂盒纯化。
3.2.5酶切扩增产物、连接到酶切过的pCRISPR/Cas9载体上获得pCRISPR/Cas9重组载体。具体构建方法采用边酶切边连接的方法，以Bsa I为内切酶。
反应体系如下：1μL pU3-TSP2-gRNA(30ng)和pU6a-TSP1-gRNA表达盒混合物，1μLpCRISPR/Cas9载体(80ng)，1μL Bsa I(10U)，1.5μL 10xSmart Buffer，1.5μL ATP(1mM)，1μL T4DNA ligase(35U)，最后加ddH2O至总体积15μL。
反应程序：在PCR仪上完成12循环：37℃5min、10℃5min、20℃5min。
构建方法可参照Ma等文献A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant(2015)。
4)农杆菌介导遗传转化水稻：将步骤3)中构建好的pCRISPR/Cas9重组载体导入农杆菌种EHA105，用籼稻品种华占的成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。具体步骤如下：将含有pCRISPR/Cas9重组载体的EHA105接种于YM琼脂培养基28℃培养2天得到培养液。将收集到的培养液加入到含有100mol/L的乙酰丁香酮的NB液体培养基中，调OD600到0.5得到菌液。将水稻愈伤组织在以上菌液中浸泡30min，用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸干水分，风干，转移到NB琼脂培养基培养26℃～28℃暗培养3天。然后转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素、头胞霉素500mg/L的培养基26℃～28℃暗培养，每15天继代一次，共继代2次。抗性筛选后，转入到分化培养基中继续培养，25℃～28℃，光照14h/d，待分化出的小苗高约3～5cm时，转移到生根培养基上壮苗，25℃～28℃，光照14h/d。3～4周后，加入适量蒸馏水，炼苗3天，洗去幼苗根上的培养基，培养箱水培1周，移栽到试验田中。挑选正常生长的植株，进行潮霉素PCR检测，共获得20株转基因阳性植株。
5)突变位点的鉴定：
5.1、提取上述转基因阳性植株的基因组DNA。
5.2、针对含靶标位点的800bp以内的DNA片段，设计特异性引物，以T0代转基因水稻的基因组DNA为模板，扩增含靶标位点的DNA片段，具体步骤为：
以步骤5.1中提取的DNA为模板，以P-T-F1和P-T-R1为上游引物和下游引物，用高保真酶扩增包含双靶标位点的DNA片段。
P-T-F1：CGGCATCAGTCAGAGGAATC(SEQ ID NO.12)；
P-T-R1：AGGACGGAGAAATCGTGTAGAC(SEQ ID NO.13)。
反应体系：0.5μL DNA模板，1μL T-C-F4，1μL T-C-R4，4μL dNTP，15μL 2xbuffer，0.5μL KOD酶，加ddH2O至总体积30μL。
反应程序：95℃预变性3min，30个循环：98℃变性10s，64℃退火30s，68℃延伸40s。
5.3、扩增得到的PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，对于测序结果为叠峰的样品，TA克隆，挑取10个左右单克隆，测序比对分析样品基因型，部分突变分析结果如表1所示。
表1 CRISPR/Cas9系统诱导的T0代转基因植株突变序列
表1为实施例1中的CRISPR/Cas9系统引入的T0代转基因植株突变序列分析；1-2、1-5等表示不同的转基因株系，CK表示对照；WT表示野生型；标注下划线的字母为NGG序列的反向互补序列；“-//-”表示此处碱基省略；“-”表示碱基缺失，“+”表示碱基插入，其后的数字表示碱基数。
从表1的测序结果表明，获得的20株T0代转基因植株，其中16株发生突变，突变率为80％。
6)根据测序比对结果，选取OsNramp5开放阅读框发生移码突变或提前终止，导致OsNramp5功能缺失的T0代纯合突变株系(如表1中的1-2、2-3)，繁种，于T1代转基因分离群体分子检测Hpt、Cas9等转基因元件，结果参见图1、图2，筛选不带转基因成分的功能缺失突变体。
图1为实施例1中的T1代敲除株系Hpt PCR检测结果；其中1-15表示15株不同的T1代植株，CK+表示阳性对照，CK-表示阴性对照。从图1中可知Hpt在T1代群体发生了分离，株系4、5、6、12不含HPT。
图2为实施例1中的T1代敲除株系Cas PCR检测结果；其中1-15表示15株不同的T1代植株，CK+表示阳性对照，CK-表示阴性对照。从图2中可知Cas在T1代群体发生了分离，株系4、5、6、12不含Cas。
7)采取镉胁迫盆栽试验，土壤取自大田表层，测定基础肥力，风干、过筛、去杂、混匀，分装至每盆25mg/kg，将Cd(CdCl2)以溶液形式加入备用土壤，镉处理浓度为2mg/kg，平衡4周待用。
将步骤6中的功能缺失突变体及对照种植于镉污染盆，每盆6穴，每穴2株，3次重复。于水稻成熟期取样，将单株的茎叶和穗分开，脱粒，茎叶用自来水冲洗，用去离子水洗净，各样品105℃杀青30min，80℃烘干至恒重，分别测定单株稻草和籽粒的干重，结果参加图3。将糙米粉碎，过100目筛，用HNO3-HClO4消解，用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP鉴定糙米镉含量及其他相关矿质元素含量，结果参见图4、图5。
结果显示，osnramp5糙米Cd、Mn含量较对照极显著降低，而其他相关金属元素并无显著影响，且植株的生物学产量和经济产量较对照没有显著差异。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (8)

1.一种培育镉低积累籼稻品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、扩增籼稻受体材料的OsNramp5的部分CDS序列并测序；
S2、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsNramp5的部分CDS序列选择靶标序列；靶标序列的反向互补链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，所述N表示A，T，C和G中的任意一个，所述X为19或20；所述靶标序列包括TPS1和TPS2，所述TPS1的DNA序列为SEQ IDNO.2所示的序列，所述TPS2的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的序列；
S3、构建含所述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体；
S4、将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；
S5、筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；
S6、对所述转基因阳性植株的靶位点测序，筛选突变植株；
S7、将所述突变植株进行繁种，于后代T1代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以下步骤：
S3-1、根据靶标序列以及酶切位点信息，设计带粘性末端的接头引物；
S3-2、酶切原始载体；
S3-3、将所述带粘性末端的接头引物退火后连接到酶切过的原始载体上，得到重组的gRNA表达盒；
S3-4、将所述重组gRNA表达盒进行PCR扩增得到扩增产物；
S3-5、酶切扩增产物，将酶切后的扩增产物连接到酶切过的pCRISPR/Cas9载体上得到重组载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S3-1中所述接头引物包括
TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R，所述TPS1-F的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的序列，所述TPS1-R的DNA序列为SEQ ID NO.5所示的序列，所述TPS2-F的DNA序列为SEQ ID NO.6所示的序列；所述TPS2-R的DNA序列为SEQ ID NO.7所示的序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原始载体为pU3-gRNA或pU6a-gRNA。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S3-2中采用Bsa I酶切所述原始载体。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S3-3中，所述带粘性末端的接头引物位于所述表达载体的两个Bsa I酶切位点之间，形成重组的gRNA表达盒。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S3-5中，采用Bsa I酶切所述扩增产物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S6步骤具体为：提取所述转基因阳性植株的DNA，进行PCR扩增得到扩增产物；对所述扩增产物进行测序，选择两个等位OsNramp5均发生功能缺失突变的T0代纯合突变体或双等位突变体的植株作为突变植株。
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