CN108374019A - 转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，包括：克隆日本晴水稻中OsNramp5基因；以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将所述OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；将所得超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入油菜下胚轴切段中，培育转基因苗并筛选转基因阳性植株；其中，转基因受体植株为甘蓝型油菜K407品种。本发明提供的培育方法可解决野生重金属富集植株耐性有限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊以及重金属重返等问题。此外，本发明还提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制中所得的重金属超富集转基因植株在土壤重金属修复中的应用。

Description

转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜 的创制及应用

技术领域

本发明属于转基因植株和重金属污染治理领域，具体涉及转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制及应用。

背景技术

重金属污染问题已成为一个世界性重大环境问题，重金属污染不仅威胁动 植物、微生物生产发育，还通过食物链等威胁人类健康乃至生命。导致土壤污 染的重金属主要有As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg等，一般为几种重金属的复合污 染。重金属矿区、经济高速发展区的重金属污染情况尤为严重，导致我国许多 农产品由于重金属超标而被拒绝进入国际市场。

各国对重金属污染的生态效应和防治的研究越来越重视，已探索出多种治 理技术。然而传统的重金属污染技术如土壤固化、玻璃化、淋滤化、洗土法、 客土法、电化学法等物理化学方法，不仅成本高昂，难以大规模使用，而且常 常导致土壤结构破坏、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，寻求一种廉 价而永久有效，又可以维持土壤肥力的替换方法一直是国际上研究的难点和热 点。

利用绿色植物清除污染物的策略，即植物修复技术具有成本低，环境友好 和可再利用等特点，是一种非常有前景的环境污染原位治理途径。广义的植物 修复指通过植物萃取、转化、固定、挥发、降解作用将土壤及水体中有机污染 物、重金属等污染物清除的过程。通过种植具有重金属富集能力的植物，将植 物收割并妥善处理(如灰化等)，以到达将重金属移出土壤环境，清除土壤重金 属污染的目的。

基因是决定植物对土壤重金属吸收积累特性的最重要因素，重金属富集植 物耐重金属的机制主要包括三个方面，第一，排斥机制，阻碍重金属的吸收或 体内运输，吸收后又排出体外；第二，局域化机制，使重金属在植物的液泡、 表皮毛、细胞壁等特定部位积累，从而与细胞中的其他组分隔离，达到解毒的 效果；第三，络合机制，植物体内物质与重金属络合，包括与无机物络合形成 硫化物，与小分子有机物如GSH、草酸、组氨酸和柠檬酸等络合后在液泡中聚 集，与大分子的金属鏊合蛋白络合。但目前，野生重金属富集植株存在耐性有 限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊、以及重金属重返等问题。基因工程 技术是目前土壤重金属修复研究中最具前景的高新生物技术，因此，将植物的 重金属超富集基因克隆并转移到生物量大、生产迅速的植物上以提高植物修复 的能力，是解决土壤重金属污染问题的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集 转基因工程油菜的创制及应用，解决野生重金属富集植株存在耐性有限、成长 缓慢、生物量小、生长环境特殊、以及重金属重返等问题。

为实现上述目的，本发明提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属 超富集转基因工程油菜的创制，具体指重金属超富集转基因工程油菜的构建方 法，包括：

(1)重金属超富集基因的克隆，克隆日本晴水稻中OsNramp5基因。研究 结果表明，OsNramp5蛋白对镉、锰等重金属离子具有较强的吸附能力，是水稻 富集镉等重金属的关键基因，过量表达该基因能够显著提高水稻对镉等重金属 的吸附能力；

(2)超量表达双元载体的构建，以植物表达载体为基础，构建包含强启动 子、筛选基因的转化载体，将步骤(1)克隆得到的OsNramp5基因通过同源重 组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；

(3)重金属超富集转基因植株构建，将步骤(2)所得的超量表达双元载 体通过根癌农杆菌转入油菜下胚轴切段中，用筛选培养基进行筛选培养，获得 的转基因抗性油菜下胚轴切段经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽， 筛选重金属超富集转基因阳性植株；

其中，所述OsNramp5基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述油菜品 种为甘蓝型油菜K407。

较佳地，所述步骤(1)中，克隆日本晴水稻中OsNramp5基因的方法为：

以日本晴水稻的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的 序列为引物进行PCR扩增，得到OsNramp5基因。

较佳地，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为 Ubiquitin启动子，所述筛选基因为Bar筛选基因，所述转化载体还包括3×Flag 标签。采用包含Ubiquitin启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性 好，实际应用前景突出，且强化了目标基因的高转化，有望获得目标基因高效 转化的转基因材料。另外，添加的3×Flag标签，可方便在蛋白水平进行转化效 率及遗传稳定性分析，有望为应用实践筛选出具有持久稳定遗传的转基因株系。

较佳地，上述所述转化载体的构建方法包括以下步骤：

(a)在所述pCAMBIA1301载体多克隆位点Kpn I和Sac I之间添加所述 3×Flag标签；

(b)采用PCR扩增反应克隆所述pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基 因；

(c)使用内切酶Xho I酶切步骤(a)中获得的载体，并将所述Bar筛选基 因与酶切后的载体进行同源重组；

(d)采用Hind III和BamH I酶切pUN1301载体上的Ubiquitin启动子；

(e)使用内切酶Hind III和BamH I酶切步骤(c)中获得的重组载体，并将 所述Ubiquitin启动子与酶切后的重组载体连接。

具体地，所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述Bar 筛选基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述3×Flag标签的核苷酸序列如 SEQ ID NO：6所示。

较佳地，步骤(b)中，所述克隆pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基 因的PCR引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

较佳地，所述筛选培养基包含草铵膦。

较佳地，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为 2×CaMV35S启动子，所述筛选基因为HYG筛选基因。采用包含2×CaMV35S 启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出， 且强化了目标基因的高转化，有望获得目标基因高效转化的转基因材料。

较佳地，所述HYG筛选基因为所述pCAMBIA1301载体自带的筛选基因， 所述转化载体的构建方法包括以下步骤：

(a)使用内切酶Hind III和Pst I酶切所述pCAMBIA1301载体；

(b)使用内切酶Hind III和BamH I酶切所述pCAMBIA1301载体，获得 CaMV35S启动子；

(c)根据CaMV35S启动子的核苷酸序列设计含有内切酶Hind III和Pst I 酶切位点的引物，并以CaMV35S启动子为模板进行PCR扩增反应，获得含有 Hind III和Pst I酶切位点的CaMV35S启动子，并使用内切酶Hind III和Pst I对 PCR获得的CaMV35S启动子进行酶切；

(d)将步骤(c)中获得的酶切产物进行回收，并与步骤(a)中获得的酶 切载体连接。

具体地，所述2×CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所 述HYG筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

较佳地，所述筛选培养基含有潮霉素。

较佳地，步骤(2)中，所述超量表达双元载体的构建包括以下步骤：

采用PCR扩增反应克隆OsNramp5基因，所述克隆OsNramp5基因的同源 重组PCR引物包含BamH I酶切位点。

较佳地，所述克隆OsNramp5基因的同源重组PCR引物序列如SEQ ID NO：12和SEQID NO：13所示。

较佳地，所述根癌农杆菌为GV3101。

本发明还提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工 程油菜的创制中所得的重金属超富集转基因植株在土壤重金属修复中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富 集转基因工程油菜的创制具有如下几方面的优点：第一、选择转化的目标基因 功能明确，对镉、锰等重金属离子具有较强的吸附能力，是水稻富集镉等重金 属的关键基因，过量表达该基因能够显著提高水稻对镉等重金属的吸附能力， 因此能够获得可供实践使用的超富集转基因植株；第二、构建包含强启动子的 转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出；第三、采 用强启动子启动目标基因，强化了目标基因的高转化，因此有望获得目标基因 高效转化的转基因材料；第四、受体材料品种选择特殊，本发明选用的油菜品种为甘蓝型油菜K407，遗传转化效果好，并且生物量大，适应性广，可在南北 方广大地区使用，因此在土壤修复中的应用前景广阔。

附图说明

图1为OsNramp5基因电泳图；

图2为克隆OsNramp5基因菌落PCR电泳图；

图3为OsNramp5基因超量表达双元载体酶切验证图；

图4为pUb-OsNramp5-Bar超量表达双元载体图；

图5为p2×35S-OsNramp5-HYG超量表达双元载体图；

图6为OsNramp5转基因遗传转化阶段图；

图7为OsNramp5转基因阳性植株鉴定图；

图8为OsNramp5转基因植株重金属吸附水平鉴定图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具 体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明 做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的 材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

实施例1 OsNramp5基因克隆

将日本晴水稻幼苗使用液氮研磨成粉末状，使用Trizol法提取其RNA，使 用TOYOBO反转录试剂盒将其反转录成cDNA，根据NCBI提供的OsNramp5 基因的cDNA序列使用Primer5设计其上下游引物，并合成引物，设计引物的核 苷酸序列为：

上游序列：5′CTGAATTCCGAGAGAGCAG 3′(如SEQ ID NO：2所示)；

下游序列：5′GCGATAGAGAGCACAAATA 3′(如SEQ ID NO：3所示)。 待引物合成后，使用1×TE进行溶解，接着进行PCR扩增，以日本晴水稻cDNA 为模板，使用高保真酶GXL Premix对其进行扩增，将扩增产物使 用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，将目标条带切下，使用胶回收试剂盒进行回收， 扩增产物电泳图如图1所示，箭头所指条带为目的条带。然后将回收产物与 PMD19-T(simple)载体进行过夜连接，将连接产物使用热激法转化大肠杆菌感 受态Top10，挑单克隆做菌液PCR，扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶 电泳，电泳图如图2所示，图中箭头所指1-5号菌液为阳性菌液。将阳性菌株进 行测序，测序正确后将菌液接入LB-Amp培养基摇菌，提质粒备用。

实施例2重金属超富集转基因植物的转化载体的构建

(1)包含Ubiquitin启动子、Bar筛选基因和3×Flag标签转化载体的构建基 于实验室自有的pCAMBIA1301-3×Flag载体，通过以下步骤进行改造后获得：

①获取Bar筛选基因：pCAMBIA3301载体含有Bar筛选基因和CaMV35S 启动子，在本实施例中，利用pCAMBIA3301载体自带的CaMV35S启动子启动 Bar筛选基因，可增强目的基因的高效转化，CaMV35S启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO：9所示。使用Xho I内切酶切割pCAMBIA3301载体，将酶切产物进 行1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收小条带(608bp)。根据pCAMBIA1301载体 序列以及Bar基因序列设计同源重组引物，设计引物的核苷酸序列为：

上游序列：5‘ACAAATCTATCTCTCTCGAGTCTACCATGAGCCCAGAACG3’；

下游序列：5‘TTATTATGGAGAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCA3’。

其中，上游序列如SEQ ID NO：10所示，下游序列如SEQ ID NO：11所示。 随后以回收的片段为模板，用Bar同源重组引物进行PCR扩增，回收片段后备 用。用Xho I内切酶切割pCAMBIA1301-3×Flag载体，将酶切产物进行1％的琼 脂糖凝胶进行电泳，回收大条带。将之前回收到的小条带和大条带进行同源重 组，将同源重组后的产物使用热激法转化大肠杆菌感受态Top10，挑单克隆做菌 液PCR，然后将阳性菌株送测序公司测序，Bar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5 所示，测序正确后将菌液接入LB-Kan培养基摇菌，提质粒备用，中间载体 pCAMBIA1301-3×Flag-Bar构建成功。

②获取Ubiquitin启动子：将含有pUN1301载体的菌株接入LB-Kan的培养 基中，摇菌提取质粒。使用Hind III和BamH I酶切pUN1301，酶切产物进行1％ 的琼脂糖凝胶进行电泳，回收小条带(约2000bp)。小条带为Ubiquitin启动子。

③构建转化载体：将之前构建好的pCAMBIA1301-3×Flag-Bar使用Hind III 和BamH I进行酶切，将酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收大条带。 将之前准备好的Ubiquitin启动子使用T4连接酶与之进行连接，将连接产物使 用热激法转化大肠杆菌感受态Top10，挑取单克隆进行菌液PCR，将阳性菌株 接入LB-Kan培养基摇菌，提质粒使用BamH I和Hind III再次进行酶切验证。将 验证正确的菌进行摇菌提取质粒备用，pUb-3×Flag-Bar转化载体构建完成。

(2)包含2×CaMV35S启动子和HYG筛选基因的转化载体的构建基于实 验室自有的pCAMBIA1301载体，通过以下步骤进行改造后获得：

①使用Hind III和BamH I酶切pCAMBIA1301将酶切产物进行1％的琼脂糖 凝胶进行电泳，回收小条带(877bp)备用。

②根据CaMV35S启动子序列设计含Hind III和Pst I内切酶引物，以上一步 回收的条带为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，将PCR产物进行1％的琼脂 糖凝胶进行电泳，回收条带。并使用Hind III和Pst I内切酶对回收产物酶切，并 对酶切产物进行胶回收。

③使用Hind III和Pst I内切酶对pCAMBIA1301酶切，并对酶切产物进行胶 回收。

④将②中的回收产物与③中的回收产物使用T4连接酶进行连接。将连接产 物使用热激法转化大肠杆菌感受态Top10，挑取单克隆进行菌液PCR，将阳性 菌株接入LB-Kan培养基摇菌，提质粒使用BamH I和Hind III再次进行酶切验证。 将验证正确的菌进行摇菌提取质粒备用，p2×CaMV35S-HYG转化载体构建完 成。2×CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQID NO：7所示，HYG筛选基因核 苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

实施例3重金属超富集转基因植株的OsNramp5基因超量表达双元载体

根据OsNramp5基因的ORF区两端设计同源重组引物，设计的同源重组引 物的核苷酸序列为：

上游序列(如SEQ ID NO：12所示)：

5‘TTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGGAGATTGAGAGAGAGAGCAG TGAGAG3’；

下游序列(如SEQ ID NO：13所示)：

5‘CTTTGTAGTCGGTACCCGGGGATCCCCTTGGGAGCGGGATGTCGG 3’。

以含有OsNramp5的19T载体为模板使用高保真酶进行PCR扩增。将PCR 产物进行1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带，备用。分别将构建好的 pUb-3×Flag-Bar转化载体和p2×CaMV35S-HYG转化载体使用BamH I单酶切， 将酶切产物直接进行胶回收，备用。将同源重组片段与酶切后的载体进行同源 重组。将同源重组产物使用热激法转化大肠杆菌感受态Top10，挑取单克隆进行 菌液PCR，将阳性菌株接入LB-Kan培养基摇菌，提质粒使用BamH I进行单酶 切验证，酶切验证图如图3所示，图中为pUb-OsNramp5-Bar超量表达转化载体 的酶切验证图，其中箭头所指条带为目的条带，即质粒1-4为阳性质粒。将验证 正确的质粒送测序公司测序。将测序正确的质粒通过电转法转入根癌农杆菌 GV3101，将转化后的菌液涂布在Yep-Kan平板上，待其长出来单克隆菌落时， 挑取单克隆摇菌，做菌液PCR，将阳性菌株保存备用。构建成功的OsNramp5 基因超量表达双元载体，pUb-OsNramp5-Bar转化载体图谱如图4所示， p2×35S-OsNramp5-HYG转化载体图谱如图5所示。

实施例4转基因植株遗传转化

选取饱满、均匀、色泽正常的K407油菜种子，使用乙醇和次氯酸钠消毒后， 置于营养培养基上，使其发芽。5-7天后切下油菜的下胚轴，将其切成5-8毫米 的小段，使用之前准备好的根癌农杆菌GV3101菌株进行侵染，侵染之后置于 共培养培养基上2天，之后将其置于含草铵膦(浓度为：5mg/L)或潮霉素(浓 度为：35mg/L)的筛选培养基上，其中，pUb-OsNramp5-Bar转化载体的使用含 草铵膦的筛选培养基，p2×35S-OsNramp5-HYG转化载体的使用含潮霉素的筛选 培养基。随后，每隔15-20天后更换一次筛选培养基直至愈伤组织分化出再生芽。 将再生芽切下，置于生根培养基上，每隔15-20天后更换一次生根培养基，直至 其长出根，然后将再生苗移栽到营养土上进行土培，获得阳性转基因植株。 OsNramp5转基因油菜遗传转化阶段图如图6所示，图中A为侵染下胚轴图，B 为诱导愈伤组织图，C为诱导愈伤组织生根图，D为获得的转基因植株图。

实施例5阳性转基因植株鉴定及吸附水平测定

对转基因植株进行鉴定，获得转基因阳性植株，将获得的转基因阳性植株 用镉重金属进行处理，检测其中重金属含量，并与对照处理进行比较，分析其 吸附能力。阳性转基因植株鉴定图如图7所示，图中，WT：野生型植株；1-11： 转基因植株。从图中可以看出，野生型植株中检测不到目的条带，而检测的转 基因株系中除了3，其余株系均具有目的基因表达条带，且是转基因阳性植株。 根据阳性植株鉴定结果，挑选部分转化水平高且表达稳定的转基因株系进行重 金属吸附水平鉴定，结果如图8所示。图中，WT：野生型植株，其他为阳性转 基因植株。从图中可以看出，阳性转基因植株对重金属镉的积累量高于野生型 对照植株，其中，转基因植株OE-5的积累量最高，其次为转基因植株OE-4。 综合数据结果得出，本发明提供的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集 转基因工程油菜的创制是解决重金土壤污染问题的有效方法。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 西安泽睿环境科技有限公司

<120> 转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制及应用

<141> 2018-01-30

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggagattg agagagagag cagtgagaga gggagcatca gctggtgaag agctagtgcg 60

gcacatgatc aagatgccaa gaagctcgac gcagatgatc agctgctaat gaaggagcct 120

gcatggaaaa ggttccttgc ccatgttggt cctggattca tggtgtcttt agcctacttg 180

gatcctggca atttggaaac cgatctgcaa gccggagcca accacagata tgagctgctc 240

tgggtgattc tgattggact catcttcgca cttatcatac agtcgctagc agctaatctt 300

ggagtggtta cagggaggca tctggctgag atctgcaaga gtgagtaccc caagttcgtc 360

aagattttcc tatggctgct ggcagagttg gccgtcatcg ctgcagatat cccagaagtt 420

atagggacgg cctttgcttt caacatattg ttccatattc cggtgtgggt cggcgtcctc 480

atcaccggca ccagcactct actgcttctt ggccttcaaa aatacggggt gaggaagctg 540

gagtttctga tatcgatgct ggtgttcgtg atggcggcgt gcttcttcgg ggagctgagc 600

atcgtgaagc cgccggcgaa ggaggtgatg aaggggctct tcatccccag gctcaacggc 660

gacggcgcca ccgccgacgc cattgccctc ctcggagctc ttgtcatgcc ccacaatctg 720

ttcttgcatt ctgccttggt gctatcgagg aagacaccgg catcagtcag aggaatcaag 780

gacgggtgca ggttcttcct gtacgagagc gggttcgcgc tgttcgtggc gctgctgata 840

aacatcgccg tcgtctccgt ctccggcacc gcctgctcct ccgccaacct ctcccaagag 900

gacgccgaca agtgcgccaa cctcagcctc gacacctcct ccttccttct caagaacgtg 960

ctgggcaagt cgagtgcgat cgtgtacggc gtggcactgt tggcatctgg gcagagctcc 1020

actattaccg gcacatacgc tggacagtac atcatgcagg gtttcttgga catcaggatg 1080

aggaagtggc ttcggaacct gatgacaaga accatcgcca tcgcgccgag cctcatcgtc 1140

tccatcatcg gcggctccag gggcgccggc cgcctcatca tcatcgcttc gatgatactg 1200

tccttcgagc tgccgtttgc tctcatccct cttctcaagt tcagcagcag taagagcaag 1260

atggggcccc acaagaaccc tatctatata atagtgttct cgtggttcct gggtctgctc 1320

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gacctcccca agtacgccaa cgtgctcgtc ggcgccgccg tcttcccgtt catgctcgtc 1440

tacatcgtcg ccgtcgtcta cctcaccatc aggaaggact ccgtcgtcac cttcgtcgcc 1500

gactcctccc tcgccgccgt cgtcgacgcc gagaaggccg acgccggcga cctcgccgtc 1560

gacgacgacg agcccttgcc gtaccgcgac gacctggccg acatcccgct cccaaggtag 1620

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgaattccg agagagcag 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgatagaga gcacaaata 19

<210> 4

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 60

tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 120

tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta 180

caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 240

aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc 300

cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 360

tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc 420

tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 480

tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat 540

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cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcaccgg cagctacggg ggattccttt 840

cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca 900

ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca 960

aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc 1020

tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt 1080

tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga 1140

tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa 1200

tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg 1260

ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt 1320

cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg 1380

tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga 1440

tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat 1500

cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt 1560

tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc 1620

ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg 1680

tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt 1740

atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc 1800

atatgctcta accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt 1860

tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc 1920

tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg 1980

tttggtgtta cttctgcagg tcgactctag a 2011

<210> 5

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagattt ga 552

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca tcgactacaa ggatgacgat 60

gacaag 66

<210> 7

<211> 1700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtccccagat tagccttttc aatttcagaa agaatgctaa cccacagatg gttagagagg 60

cttacgcagc aggtctcatc aagacgatct acccgagcaa taatctccag gaaatcaaat 120

accttcccaa gaaggttaaa gatgcagtca aaagattcag gactaactgc atcaagaaca 180

cagagaaaga tatatttctc aagatcagaa gtactattcc agtatggacg attcaaggct 240

tgcttcacaa accaaggcaa gtaatagaga ttggagtctc taaaaaggta gttcccactg 300

aatcaaaggc catggagtca aagattcaaa tagaggacct aacagaactc gccgtaaaga 360

ctggcgaaca gttcatacag agtctcttac gactcaatga caagaagaaa atcttcgtca 420

acatggtgga gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat caaagataca gtctcagaag 480

accaaagggc aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc cggaaacctc ctcggattcc 540

attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga aaaggaaggt ggctcctaca 600

aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga tgcctctgcc gacagtggtc 660

ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt 720

cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac gcacaatccc 780

actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagagaacac 840

gggggacctg caggtcccca gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag 900

atggttagag aggcttacgc agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc 960

caggaaatca aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac 1020

tgcatcaaga acacagagaa agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg 1080

acgattcaag gcttgcttca caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag 1140

gtagttccca ctgaatcaaa ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa 1200

ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag 1260

aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat 1320

acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac 1380

ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa 1440

ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct 1500

gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac 1560

gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat 1620

gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat 1680

ttggagagaa cacgggggac 1700

<210> 8

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca 780

cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

aaatag 1026

<210> 9

<211> 781

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agagatagat ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa 60

cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 120

cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 180

ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 240

gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct tccttttcta 300

ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata 360

ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat 420

tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc acatcaatcc acttgctttg 480

aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt 540

tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc 600

atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc 660

aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt 720

ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca 780

t 781

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acaaatctat ctctctcgag tctaccatga gcccagaacg 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttattatgga gaaactcgag tcaaatctcg gtgacgggca 40

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttctgcaggt cgactctaga ggatccatgg agattgagag agagagcagt gagag 55

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctttgtagtc ggtacccggg gatccccttg ggagcgggat gtcgg 45

Claims (15)

1.一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，包括：

(1)重金属超富集基因的克隆

克隆日本晴水稻中OsNramp5基因；

(2)超量表达双元载体的构建

以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将步骤(1)克隆得到的OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；

(3)重金属超富集转基因植株构建

将步骤(2)所得的超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入油菜下胚轴切段中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性油菜下胚轴切段经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选重金属超富集转基因阳性植株；

其中，所述OsNramp5基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述油菜品种为甘蓝型油菜K407。

2.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述步骤(1)中，克隆日本晴水稻中OsNramp5基因的方法为：

以日本晴水稻的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列为引物对进行PCR扩增，得到OsNramp5基因。

3.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为Ubiquitin启动子，所述筛选基因为Bar筛选基因，所述转化载体还包括3×Flag标签。

4.如权利要求3所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述转化载体的构建方法包括以下步骤：

(a)在所述pCAMBIA1301载体多克隆位点Kpn I和Sac I之间添加所述3×Flag标签；

(b)采用PCR扩增反应克隆所述pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因；

(c)使用内切酶Xho I酶切步骤(a)中获得的载体，并将所述Bar筛选基因与酶切后的载体进行同源重组；

(d)采用Hind III和BamH I酶切pUN1301载体上的Ubiquitin启动子；

(e)使用内切酶Hind III和BamH I酶切步骤(c)中获得的重组载体，并将所述Ubiquitin启动子与酶切后的重组载体连接。

5.如权利要求4所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述Bar筛选基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述3×Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

6.如权利要求4所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，步骤(b)中，所述克隆pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因的PCR引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

7.如权利要求3所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述筛选培养基包含草铵膦。

8.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为2×CaMV35S启动子，所述筛选基因为HYG筛选基因。

9.如权利要求8所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述HYG筛选基因为所述pCAMBIA1301载体自带的筛选基因，所述转化载体的构建方法包括以下步骤：

(a)使用内切酶Hind III和Pst I酶切所述pCAMBIA1301载体；

(b)使用内切酶Hind III和BamH I酶切所述pCAMBIA1301载体，获得CaMV35S启动子；

(c)根据CaMV35S启动子的核苷酸序列设计含有内切酶Hind III和Pst I酶切位点的引物，并以CaMV35S启动子为模板进行PCR扩增反应，获得含有Hind III和Pst I酶切位点的CaMV35S启动子，并使用内切酶Hind III和Pst I对PCR获得的CaMV35S启动子进行酶切；

(d)将步骤(c)中获得的酶切产物进行回收，并与步骤(a)中获得的酶切载体连接。

10.如权利要求8所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述2×CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述HYG筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

11.如权利要求8所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述筛选培养基含有潮霉素。

12.如权利要求3或8所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，步骤(2)中，所述超量表达双元载体的构建包括以下步骤：

采用PCR扩增反应克隆OsNramp5基因，所述克隆OsNramp5基因的同源重组PCR引物包含BamH I酶切位点。

13.如权利要求12所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述克隆OsNramp5基因的同源重组PCR引物序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示。

14.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制，其特征在于，所述根癌农杆菌为GV3101。

15.如权利要求1～14任一项所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制中所得的重金属超富集转基因植株在土壤重金属修复中的应用。