WO2017126987A1 - Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства - Google Patents

Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства Download PDF

Info

Publication number
WO2017126987A1
WO2017126987A1 PCT/RU2016/000013 RU2016000013W WO2017126987A1 WO 2017126987 A1 WO2017126987 A1 WO 2017126987A1 RU 2016000013 W RU2016000013 W RU 2016000013W WO 2017126987 A1 WO2017126987 A1 WO 2017126987A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
red blood
blood cells
suspension
solution
washed
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/000013
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ
Владимир Анатольевич ЗАЗУЛЯ
Original Assignee
Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ
Владимир Анатольевич ЗАЗУЛЯ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ, Владимир Анатольевич ЗАЗУЛЯ filed Critical Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ
Priority to PCT/RU2016/000013 priority Critical patent/WO2017126987A1/ru
Publication of WO2017126987A1 publication Critical patent/WO2017126987A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to medicine.
  • the essence of the invention lies in the creation of modified red blood cells in the form of a dosage form for injection in physiological saline of sodium chloride, intended for the controlled delivery of a drug substance in gelatin nanocapsules for the purpose of genetic treatment using CRISPR / Cas9 technology.
  • the technical result of the invention is to create a drug in the form of a liquid isotonic suspension of washed red blood cells, containing a gelatin nanocapsule with a drug substance, which allows prolonging the release of the drug, ensuring the effective direction of the drug to the organ or cells, or selective accumulation. 2 sec and 7 z.p. crystals., 1 tablet, 1 ill.
  • a known technique is when red blood cells in an isotonic solution are exposed to a pulsed electric field of high intensity of several kilovolts for a microsecond. Multiple pores appear in the lipid layer of the membrane as a result of breakdowns.
  • the suspension of red blood cells is mixed with the drug and produce a single exposure to current at a temperature of 25 ° C.
  • the result of electrical breakdown is the osmotic lysis of red blood cells.
  • stachiosis tetrasaccharide or proteins are introduced into the suspension.
  • the disadvantage of this technique is that when the osmotic pressure is equalized outside and outside, the pores of the cells can remain open for several days, while the included drug may leak out of them, as well as technical difficulties in reproducing the technology [1].
  • a known method of exposure to red blood cells by ultraviolet radiation in order to increase the permeability of membranes Washed red blood cells are exposed to ultraviolet radiation with a wavelength of 360 nm for one hour.
  • the disadvantage of this technique is the spherical transformation of red blood cells, an increase in the degree of aggregation, and an increase in their regidity [2].
  • a known technique for reversible hypoosmotic lysis of cells with the formation of pores in the cell membrane For this purpose, 1 volume of red blood cells and 10-20 volumes of hypotonic buffer are placed in the dialysate. After 2 hours, either hypertonic buffer is added, or red blood cells are placed in an isotonic solution. In this case, the drug necessary for the saturation of red blood cells is placed initially in the dialysate or 2 hours later before restoring the tonicity of the solution.
  • the disadvantage of this technique is a noticeable damage to red blood cells during prolonged and traumatic for cell procedures [3].
  • the object of the present invention is a liquid suspension of modified red blood cells in an isotonic aqueous sodium chloride buffer (0.9% NaCI solution), which, when injected, provides a mechanism for the gradual release of a drug substance from gelatin nanocapsules, which ensure the effective cumulative orientation of the drug into an organ or cells, or selective accumulation, which are devoid of the disadvantages noted above.
  • the modification of the erythrocyte nanostructure according to the claimed invention is based on the process of pinocytosis of cells. It is known that the process of pinocytosis is constantly carried out by all eukaryotic cells. The active inducer of pinocytosis is gelatin. Gelatin is easily and quickly absorbed even in case of severe hematopoiesis disorders, is non-toxic and has no adverse reactions. The cycle of pinocytosis begins in certain areas of the plasma membrane, called "bordered pits.” b
  • Bordered pits account for about 1-2% of the total area of the cell membrane. Fringed pits are drawn into the cell, narrowed at the base, separated from the membrane, forming pinocytotic vesicles with a diameter of up to 2 microns. The life time of the bordered pits is small, they form within a minute, then complete a cycle of pinocytosis. The outer membrane of the red blood cell is directly involved in the continuous exchange between the interstitial fluid and the rest of the cells.
  • the technical result of the claimed invention is achieved by modifying erythrocytes, it includes venous blood sampling, performing three-fold washing of red blood cells in physiological saline, resuspension of red blood cells in an isotonic solution of low ionic strength Liss with nanocapsulated gelatin containing a drug in the middle, succussed with a suspension of erythrocyte hard elastic surface, by the addition of antibodies of a specific specificity, incubation of the tube in an thermostat at t at a temperature of 36, ° C, performing three-fold washing of red blood cells in physiological saline, resuspension of red blood cells in an isotonic sodium chloride solution, infusion at a suspension temperature of 36, ° C.
  • the suspension of washed modified red blood cells may contain minor amounts of a buffering agent in relation to pH, a stabilizer.
  • the composition of the suspension must correspond to the method of injection of modified red blood cells into the body: intravenous, intraarterial, intramuscular, intraosseous.
  • the whole process of red blood cell modification must be carried out under sterile conditions.
  • Blood is drawn from the cubital vein using a vacuinter in 3.8% sodium citrate. To isolate the erythrocyte mass, the blood is centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm. The platelet-leukocyte film is removed.
  • Red blood cells are washed three times: centrifuged in physiological saline for 10 minutes at 3000 rpm, at a temperature of 36.3-36.9 ° C, preferably 36 ° C, the pH of the solution should be 7.00 - 7.40 preferably pH 7.35. After each washing of the red blood cells, the supernatant is removed to prevent other blood cells from entering, and again, for every 1.0 ml of the suspension of red blood cells, 5.0 ml of isotonic sodium chloride solution is added. After the third wash, the supernatant is removed and the remaining erythrocyte suspension is poured into a cylindrical tube equipped with a strain gauge dacha.
  • the magnitude of the pressure increase during a hydraulic shock to the bottom of the erythrocyte suspension vessel is controlled by a strain gauge dacha working in conjunction with a loop oscilloscope, the pressure is 2.2-2.4 kPa, preferably 2.3 kPa.
  • the succussion time of the erythrocyte suspension is from 30 seconds to 2 minutes, preferably 1 minute. After succussion, antibodies of a certain specificity are added to a suspension of red blood cells in a Liss solution, carefully mixing. The tube is then incubated in an incubator for 15 minutes to 1 hour, preferably 30 minutes at a temperature of 36, ° C.
  • the shelf life of washed red blood cells is not more than 1 day, at a temperature of + 1-° C, due to the risk of bacterial contamination.
  • the red blood cells subjected to cryopreservation in a cryoprotectant at a temperature of -195 ° C or -80 ° C have a shelf life of 10 years according to regulatory documents, repeated cryopreservation is not allowed.
  • Nanocapsulation of gelatin with a drug is carried out using standard methods well-known to specialists: physical, chemical or physico-chemical, allowing to enclose drug molecules for gene therapy in the middle of a nanocapsule.
  • the size of gelatin nanocapsules is less than 1 micron.
  • modified red blood cells After infusion of a suspension of erythrocyte carriers, modified red blood cells will circulate in the body, delivering the drug to the target organ, conjugated antibodies of a specific specificity to the surface of the erythrocyte membrane.
  • Gelatin nanocapsules enter the bloodstream after biodegradation of erythrocytes and, thanks to the cells of the reticuloendothelial system, they, like colloidal systems, are concentrated in the liver, spleen, lungs, lymph nodes, and bone marrow, where they have a prolonged effect.
  • the drug substance is released from nanocapsules as a result of gelatin proteolysis. For these reasons, it is promising to produce a pharmaceutical preparation of a suspension of modified washed red blood cells, with the gradual release and absorption of the active drug substance for the functions of gene therapy.
  • the above example is intended to illustrate the invention.
  • sgRNAs MicroRNA molecules
  • Cas9 protein DNA sequence for insertion
  • Two sgRNAs based on the principle of complementarity, aimed at a single gene, with the help of Cas9 nuclease, carry out a double-strand break in certain places of phosphodiester bonds and remove a site in the DNA chain. After that, repair of the cut DNA will go through homology directed repair (HDR) if the ends of the inserted DNA are complementary to the ends of the cut DNA.
  • HDR homology directed repair
  • a disadvantage of the known technology is that the CRISPR cassette is packaged in an adeno-associated virus, which when introduced into the body causes an immune response.
  • the activity of neutralizing antibodies after injection does not allow the CRISPR / Cas9 system to provide effective targeting to an organ or cells.
  • Gelatin nanocapsules are prepared by suspension polymerization.
  • a packaged CRISPR cassette is placed in the middle of the gelatin nanocapsules.
  • the CRISPR cassette for transfection consists of commercially available parts: Cas9 protein, microRNAs (sgRNAs) and four transcription factors Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, Klf4 for reprogramming human skin fibroblasts into induced pluripotent stem cells by the Yamanake cocktail [16].
  • Nanocapsulated gelatin is mixed in an isotonic solution of low ionic strength Low Ionic Strength Solution (Liss), and an 8% solution is obtained.
  • Low Ionic Strength Solution Low Ionic Strength Solution
  • Blood for therapy is taken from a cubital vein volunteer using a vacuinter in 3.8% sodium citrate. To isolate the erythrocyte mass, the blood is centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm. The platelet-leukocyte film is removed.
  • the red blood cells are washed three times: centrifuged in physiological saline for 10 minutes at 3000 rpm, at a temperature of 36, ° C, pH 7.35. After each washing of the red blood cells, the supernatant is removed to prevent other blood cells from entering, and again, for every 1.0 ml of the suspension of red blood cells, 5.0 ml of isotonic sodium chloride solution is added.
  • the closed tube is subjected to repeated mechanical action: shake vertically, performing succussion by striking a hard elastic surface ( Figure 1).
  • the magnitude of the pressure increase during hydraulic shock against the bottom of the erythrocyte suspension vessel is controlled by a strain gauge pressure gauge, the pressure is 2.3 kPa.
  • the time of succussion erythrocyte suspension is 30 seconds.
  • the tube is incubated in an incubator for 30 minutes at a temperature of 36.6 ° C.
  • Red blood cells are washed three times: centrifuged in saline for 10 minutes at 3000 rpm, at a temperature of 36.6 ° C, pH 7.35. After each washing of the red blood cells, the supernatant is removed and 5.0 ml of isotonic sodium chloride solution is added again for every 1.0 ml of the suspension of red blood cells. J. Hemolysis of red blood cells.
  • Red blood cells hemolize in distilled water The ratio of red blood cells and distilled water is 1: 1, at a temperature of 36.6 ° C.
  • the hemolysate and fibroblasts of the skin of the volunteer are mixed in an isotonic sodium chloride solution, gently mixing at a temperature of 36.6 ° C.
  • the hemolysate is placed on a commercial Matrigel substrate with mTeSr growth medium containing all the necessary factors to maintain a pluripotent state at a temperature of ⁇ , 6 ° ⁇ .
  • the size of the obtained induced pluripotent stem cells is about 20 microns, a high ratio of nucleus-cytoplasm is observed, nucleoli are clearly visible, the perinuclear arrangement of mitochondria is characteristic, and the level of mitochondrial DNA is low.
  • teratomas in 20 SCID (immunodeficient) mice with the introduction of the resulting induced human pluripotent stem cells.
  • SCID immunodeficient mice
  • intestinal epithelium endoderm
  • cartilage cartilage
  • bone smooth muscles
  • neural epithelium ectoderm

Abstract

Лекарственное средство в форме жидкой суспензии отмытых модифицированных эритроцитов, предназначенной для инъекционного применения технологии CRISPR/Cas9 в варианте трансфекции или/и вирусном варианте вектора. Модификация наноструктуры эритроцитов по заявленому изобретению, базируеться на процессе пиноцитоза клеток. Известно, что процесс пиноцитоза постоянно осуществляют все эукариотические клетки. Актиным индуктором пиноцитоза является желатин. Посредством суккуссии суспензии отмытых эритроцитов, участки клеточной мембраны исскуственно приводят в контакт с нанокапсулами желатина для фиксации на эритроцитах, вследствие чего осуществляется мембранное слияние пиноцитоза нанокапсул с включеным внутри лекарственным препаратом CRISPR/Cas9.

Description

ЭРИТРОЦИТЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА
Настоящее изобретение имеет отношение к медицине. Сущность изобретения заключается в создании модифицированных эритроцитов в виде лекарственной формы для инъекций в физиологическом растворе натрия хлорида, предназначенной для регулируемой доставки лекарственного вещества в желатиновых нанокапсулах с целью генетического лечения по технологии CRISPR/Cas9.
Технический результат изобретения заключается в создании препарата в виде жидкой изотонической суспензии отмытых эритроцитов, заключающих в себе нанокапсулу желатина с лекарственным веществом, позволяющих пролонгировать высвобождение лекарственного препарата, обеспечивающих эффективную направленность лекарства в орган или клетки, или избирательное накопление. 2 с. и 7 з.п. ф-лы., 1 табл.,1 ил.
В желудочно-кишечном тракте, во внеклеточной жидкости, в том числе в плазме крови, присутствуют ферменты, разрушающие ДНК, РНК поэтому лекарственное средство с нуклеиновыми кислотами должно перемещаться внутри организма защищенным. Для безопасной транспортировки лекарственного средства с функцией генной терапии, наиболее перспективно применять аутологичные эритроциты. Использование эритроцитарных носителей, конъюгированных с антителами для доставки к органу-мишени, в частности, с антителами к коллагену, увенчались успехом в опытах Samo Khin с соавторами (1983). Установлено, что при длительном введении эритроцитарных носителей экскреторная функция почек и печени не нарушаеться, а также не стимулируется образования антител в крови. При введении лекарства в эритроцитарных носителях резко возрастает абсолютная степень его биодоступности для тканей органов-мишеней: печени, селезенки, лёгких [13]. Преимуществом отмытых аутологичных эритроцитов являеться биосовместимость с организмом, отсутствие опасности трансмиссионного синдрома, аллергических или анафилактических реакций.
Известна методика, когда находящиеся в изотоническом растворе эритроциты подвергают в течение микросекунды импульсному воздействию электрического поля высокой напряжённости в несколько киловольт. В липидном слое мембраны в результате пробоев возникают множественные поры. Суспензию эритроцитов смешивают с лекарственным препаратом и производят одиночное воздействие током при температуре 25°С. Результатом электрического пробоя являеться осмотический лизис эритроцитов. Для предотвращения осмотического набухания клеток в суспензию вводят тетрасахарид стахиоза или белки. Недостаток методики заключается в том, что при выравнивании вне и снаружи осмотического давления, поры клеток могут остаться открытыми несколько дней, при этом возможно вытекание из них включённого лекарственного препарата, а также технические трудности воспроизведения технологии[1].
Известена методика воздействия на эритроциты ультрофиолетовым облучением с целью повышения проницаемости мембран. Воздействию ультрофиолетовым облучением с длиной волны 360 нм в течение часа подвергают отмытые эритроциты. Недостатком методики являеться сферическая трансформация эритроцитов, увеличение степени агрегации, повышение их регидности [2].
Известна методика обратимого гипоосмотического лизиса клеток с образованием пор в клеточной мембране. Для этой цели в диализат помещают 1 объем эритроцитов и 10-20 объемов гипотонического буфера. Спустя 2 часа или добавляют гипертонический буфер, или эритроциты помещают в изотонический раствор. При этом препарат, необходимый для насыщения эритроцитов, помещают изначально в диализат или спустя 2 часа перед восстановлением тоничности раствора. Недостатком методики является заметное повреждение эритроцитов в ходе длительных и травматичных для клеток процедур [3]. Известна осмотическая пул ье- методика с использованием изотонического раствора с добавлением диметилсульфоксида. Диметилсульфоксид имеет уникальную растворяющую способность. В результате такого воздействия открываются каналы на мембране эритроцита, и лекарственный препарат попадает внутрь клеток. Недостатком данного метода является то, что диметилсульфоксид вместе с лекарственным средством попадает в клетку и при инфузии пациенту может ингибировать спаривание молекул ДНК, возможно развитие нежелательных побочных эффектов [4].
Известна методика, в ходе которой используют аппаратуру стандартного гемодиализа для процедуры экстракорпорального насыщения эритроцитов лекарственными препаратами. В ходе данного метода были получены так называемые розовые тени - жизнеспособные клетки, которые при реинфузии сохраняют свои свойева. В результате данной методике обработки эритроцитов увеличилась степень насыщения эритроцитов лекарством. Недостатками методики являются: длительное время для проведения насыщения лекарственным препаратом, необходимость специального оборудования [5].
Известен патент RU 2195270 А61К31/00, А61КЗЗ/00, А61К35/78 2002, способ получения гомеопатического средства, характеризующийся тем, что водно-спиртовые или водные извлечения или тритурации индивидуального активного вещества потенцируют один и более раз, создавая движение "закручивающаяся воронка" в течение 2-3 мин, при этом предпоследнее разведение осуществляют в сахарном сиропе, и затем активное вещество наносят на сахарную крупку. Недостатком данной методики приготовления лекарств является отсутствие нагревания воды до 36,6°С при суккуссии от ударов работающего провизора, вследствие перехода кинетической энергии воды в тепловую и нагревания пробирки от руки. При температуре 36,6°С у воды, как хорошо известно, наблюдается минимум теплоемкости при постоянном давлении. В окрестности температур Зб-37°С происходит скачок центра ОН полосы в спектре комбинационного рассеяния в дистиллированной воде, в этих пределах термодинамические параметры воды проходят через экстремум. Этот скачок интерпретирован как проявление фазового перехода второго рода, отражающего перестройку структуры сетки водородных связей в области температур особых точек, т.е. изменение наноструктуры воды [8]. Сугубо квантовые спин-спиновые и магнитные взаимодействия индуцируют конверсию орто и пара-изомеров протонов, эти не имеющие классического аналога резонансы энергий с эффектом сверхтекучести воды на молекулярном уровне, могут проявляться, как было установлено, именно в окрестностях температур особых точек воды Зб-37°С. Существенное влияние на динамическую микроструктуру водной среды оказывает молекулярный кислород, поскольку его удаление из воды приводит к исчезновению наблюдаемых особенностей [9].
Показано, что суккуссия при температуре 25°С не дает достоверных результатов биологической силы разведений в дистиллированной воде потенцированого гомеопатического лекарственного средства [10].
Эксперименты на изолированных тканевых клетках, продемонстрировали результаты сопоставимые с эффектом плацебо, при тестировании воздействия гомеопатического лекарственного препарата, изготовленного в дистиллированной воде при комнатной температуре, о чём сообщили практически все газеты и журналы, включая «Time» и «Newsweek» [11].
Известно, что был обнаружен скачок 0-100% «текучести» эритроцитов человека в капилляре при отборе пробы пипеткой с диаметром канала 1.3±0.2 мкм, обеспечивающей перепад давления 2.3 кПа. Было установлено, что при температуре 36.6±0.3°С, эритроцит диаметром 7-8 мкм сжимаеться и втягиваеться в капилляр диаметром 1.3±0.2 мкм, проскакивает его с большой скоростью, при этом объем эритроцита в капилляре уменьшаеться более чем вдвое. Это уменьшение объёма сопровождаеться эффектом сверхтекучести воды и её потерей до 55% через водные каналы белка аквапорина в мембране эритроцита. Вне капиляра в изотоническом растворе происходит востановление формы и объёма деформированного эритроцита [12]. Очевидно, что скачок текучести эритроцитов может приосходить только при условии, при котором параметры воды имеют определённые значения, а именно температуры 36.6±0.3°С.
Наиболее близкой по достигаемому результату, к заявленому изобретению, являеться методика фармакологически стимулированного эндоцитоза клеток, открытый Ginn с соавторами [6]. На основе фармакологически стимулированного эндоцитоза, разработана методика позволяющая включать в эритроциты молекулы ДНК [7]. Недостатком известных методик являеться присутствие при фармакологически стимулированном эндоцитозе токсичных химических препаратов, таких как примахин, винбластин, хлорпромазин, пропанол, тетракаин вследствие чего, возможно развитие нежелательных побочных эффектов.
Объектом настоящего изобретения является жидкая суспензия модифицированных эритроцитов в изотоническом водном буфере натрия хлорида (0,9% раствора NaCI), обеспечивающих при инъекционном введении механизм постепенного высвобождения лекарственного вещества из нанокапсул желатина, обеспечивающих эффективную кумулятивную направленность лекарства в орган или клетки, или избирательное накопление, которые лишены недостатков отмеченых выше.
Модификация наноструктуры эритроцитов по заявленому изобретению, базируеться на процессе пиноцитоза клеток. Известно, что процесс пиноцитоза постоянно осуществляют все эукариотические клетки. Актиным индуктором пиноцитоза являеться желатин. Желатин легко и быстро усваивается даже при тяжелых нарушениях со стороны гемопоэза, не токсичен и не оказывает побочных реакций. Цикл пиноцитоза начинается в определённых участках плазматической мембраны, называемых "окаймлённые ямки". б
На долю окаймлённых ямок приходится около 1-2% общей площади мембраны клетки. Окаймлённые ямки втягиваются в клетку, сужаются у основания, отделяются от мембраны, образуя пиноцитозные пузырьки диаметром до 2 мкм. Время жизни окаймлённых ямок невелико, они формируются в течение минуты, затем совершают цикл пиноцитоза. Наружная мембрана эритроцита принимает непосредственное участие в непрерывном обмене между интерстициальной жидкостью и остальными клетками.
Технический результат заявленого изобретения достигают модификацией эритроцитов, он включает забор венозной крови, проведение трёх кратной отмывки эритроцитов в физиологическом растворе, ресуспензирование эритроцитов в изотоническом растворе низкой ионной силы Liss с нанокапсулированным желатином содержащий в середине лекарственный препарат, суккуссию суспензии эритроцитов в закрытой пробирке посредством ударов о твёрдую эластичную поверхность, добавлением антител определенной специфичности, инкубацию пробирки в термостате при температуре 36,б°С, проведение трёх кратной отмывки эритроцитов в физиологическом растворе, ресуспензирование эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, инфузией при температуре суспензии 36,б°С. Посредством суккуссии участки клеточной мембраны исскуственно приводят в контакт с нанокапсулами желатина для фиксации на эритроцитах, вследствие чего осуществляется мембранное слияние пиноцитоза нанокапсул с включёным внутри лекарственным препаратом CRISPR/Cas9 .
Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов, если необходимо, может содержать незначительные количества средства с буферным действием в отношении рН, стабилизатор. Состав суспензии должен соответствовать способу инъекционного пути введения в организм модифицированных эритроцитов: внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, внутрикостный. Весь процесс модификации эритроцитов необходимо проводить в стерильных условиях. Кровь забирают из кубитальной вены с помощью вакутайнера в 3,8 % цитрат натрия. Для выделения эритроцитарной массы центрифугируют кровь в течение 10 минут при 3000 об/мин. Удаляют тромбоцитарно-лейкоцитарную пленку. Отмывают эритроциты три раза: центрифугируют в физиологическом растворе в течение 10 минут при 3000 об/мин, при температуре 36,3-36,9°С, предпочтительно 36,б°С, рН раствора должно быть равным 7,00 - 7,40, предпочтительно рН 7,35. После каждой проведенной отмывки эритроцитов удаляют надосадочную жидкость для исключения попадания других форменных элементов крови и вновь добавляют на каждые 1,0 мл суспензии эритроцитов 5,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. После третей отмывки удаляют супернатант и разливают оставшуюся суспензию эритроцитов, в цилиндрическую пробирку оснащённую тензометрическим дачиком. Далее в пробирку с эритроцитарной массой добавляют 8% раствор нанокапсулированного желатина с включённым в середину лекарственным средством в изотоническом растворе низкой ионной силы Low Ionic Strength Solution (Liss). При этом соотношение эритроцитов и раствора Liss составляет 1 : 1.2, при температуре 36,6°С, рН 7,35. Закрытую пробирку, заполненную по объёму на 1/2-2/3 суспензией эритроцитов, подвергают многократному механическому воздействию: вертикально встряхивают, осуществляяя суккуссию посредством ударов о твёрдую эластичную поверхность (Иллюстрация 1). Величину повышения давления при гидравлическом ударе о дно сосуда суспензии эритроцитов, контролируют тензометрическим дачиком работающим в комплекте со шлейфовым осциллографом, давление составляет 2,2-2,4 кПа, предпочтительно 2.3 кПа. Время суккуссии суспензии эритроцитов от 30 секунд до 2 минут, предпочтительно 1 минута. После суккуссии в суспензию эритроцитов в растворе Liss добавляют, антитела определенной специфичности, осторожно перемешивая. Далее инкубируют пробирку в термостате от 15 минут до 1 часа, предпочтительно 30 минут при температуре 36,б°С. После отмывают эритроциты три раза, центрифугируют в физиологическом растворе в течение 10 минут при 3000 об/мин, при температуре Зб,3-36,9°С и помещают в контейнер. В контейнер с модифицированными эритроцитами перед инфузией вводиться в соотношении 1: 1 изотонический раствор хлорида натрия, рН 7,00 - 7,40, предпочтительно рН 7,35, при температуре 36,6°С, осторожно перемешивая.
Срок годности отмытых эритроцитов не более 1 суток, при температуре +1-б°С, из-за риска бактериальной контаминации. Эритроциты, подвергшиеся криоконсервации в криопротекторе при температуре -195°С или -80°С имеют срок годности согласно нормативным документам 10 лет, повторная криоконсервация не допускается.
Нанокапсулирование желатина с лекарственным средством реализуют с помощью извесных специалистам стандартных методов: физических, химических или физико-химических, позволяющих заключить в середину нанокапсулы молекулы лекарственного препарата для генной терапии. Размер желатиновых нанокапсул менее 1 мкм.
После инфузии суспензии эритроцитарных носителей, модифицированные эритроциты будут циркулировать в организме, доставляя лекарственное средство к органу-мишени, к поверхности мембраны эритроцитов конъюгированны антитела определенной специфичности. Желатиновые нанокапсулы попадают в кровяное русло после биодеградации эритоцитов и благодаря клеткам ретикулоэндотелиальной системы, они как коллоидные системы концентрируются в печени, селезенке, легких, лимфатических узлах, костном мозге, где и оказывают свое пролонгированное действие. Лекарственное вещество выделяется из нанокапсул в результате протеолиза желатина. По этим причинам является перспективным производство фармацевтического препарата суспензии модифицированных отмытых эритроцитов, с постепенным высвобождением и всасыванием активного лекарственного вещества для функций генной терапии. Приведённый пример предназначен для пояснения изобретения.
Из уровня техники известна технология редактирования генома ДНК в клетке CRISPR/Cas9 [15]. В данной технологии используется механизм двойного РНК-управляемого разрыва ДНК. В клетку вводиться молекулы микроРНК (sgRNAs), белок Cas9 и последовательность ДНК для внедрения. Две sgRNAs по принципу комплементарности нацеленные на один ген, с помощью нуклеазы Cas9 осуществляют двухнитевой разрыв в определённых местах фосфодиэфирных связей и убирают участок в цепи ДНК. После этого репарация разрезанной ДНК пойдёт путём гомологичного сращивания концов (homology directed repair, HDR), если концы встраемой ДНК будут комплементарны концам разрезанного участка ДНК. Недостатком известной технологии является то, что CRISPR-кассета упаковывается в аденоассоциированный вирус, который при введении в организм вызывает иммунный ответ. Активность нейтрализующих антител после инъекции, не позволяет системе CRISPR/Cas9 обеспечивать эффективную направленность в орган или клетки.
По этим причинам, является перспективным производство фармацевтического препарата для редактирования генома ДНК в клетке технологией CRISPR/Cas9 суспензией модифицированных эритроцитов, обеспечивающих эффективную направленность лекарства в орган или клетки и постепенным высвобождением CRISPR-кассеты.
3
10
Пример 1.
A. Производство нанокапсул желатина.
Нанокапсулы желатина получают методом полимеризации в суспензии. В середину нанокапсулы желатина помещают упаковыванную CRISPR-кассету. CRISPR-кассету для трансфекции составляют из комерчески доступных частей: белок Cas9, микроРНК (sgRNAs) и четыре транскрипционных фактора Oct3/4, Sox2, с-Мус, Klf4 для репрограммирования фибробластов кожи человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки коктелем Яманаке [16].
B. Смешивание нанокапсул желатина в жидком растворе Liss.
Смешивают в изотоническом растворе низкой ионной силы Low Ionic Strength Solution (Liss) нанокапсулированный желатин, получают 8% раствор.
C. Выделение эритроцитарной массы.
Кровь для терапии забирают у добровольца из кубитальной вены с помощью вакутайнера в 3,8 % цитрат натрия. Для выделения эритроцитарной массы центрифугируют кровь в течение 10 минут при 3000 об/мин. Удаляют тромбоцитарно-лейкоцитарную пленку.
D. Отмывание эритроцитов.
Отмывают эритроциты три раза: центрифугируют в физиологическом растворе в течение 10 минут при 3000 об/мин, при температуре 36,б°С, рН 7,35. После каждой проведенной отмывки эритроцитов удаляют надосадочную жидкость для исключения попадания других форменных элементов крови и вновь добавляют на каждые 1,0 мл суспензии эритроцитов 5,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. P T/RU2016/000013
11
E. Смешивание эритроцитарной массы с раствором нанокапсулированного желатина в изотоническом растворе Liss.
В пробирку с эритроцитарной массой добавляют 8% раствор нанокапсулированного желатина в изотоническом растворе низкой ионной силы Low Ionic Strength Solution (Liss). При этом соотношение эритроцитов и раствора Liss составляет 1 : 1.2, при температуре 36,б°С, рН 7,35. Пробирку заполняют по объёму на 2/3 суспензией эритроцитов.
F. Суккуссия посредством ударов.
Закрытую пробирку подвергают многократному механическому воздействию: вертикально встряхивают, осуществляяя суккуссию посредством ударов о твёрдую эластичную поверхность (Иллюстрация 1). Величину повышения давления при гидравлическом ударе о дно сосуда суспензии эритроцитов, контролируют тензометрическим дачиком, давление составляет 2.3 кПа. Время суккуссии суспензии эритроцитов 30 секунд.
G. Добавление антител.
В суспензию эритроцитов в растворе Liss добавляют антитела 0.1 мл, специфичные к коллагену RAH СИ, осторожно перемешивая.
H. Инкубация пробирки в термостате.
Пробирку инкубируют в термостате 30 минут при температуре 36,6°С.
I. Отмывание эритроцитов.
Отмывают эритроциты три раза: центрифугируют в физиологическом растворе в течение 10 минут при 3000 об/мин, при температуре 36,6°С, рН 7,35. После каждой проведенной отмывки эритроцитов удаляют надосадочную жидкость и вновь добавляют на каждые 1,0 мл суспензии эритроцитов 5,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. J. Гемолизирование эритроцитов.
Эритроциты гемолизируют в дистиллированной воде. При этом соотношение эритроцитов и дистиллированной воды составляет 1 : 1, при температуре 36,6°С.
К. Смешивают гемолизат и фибробласты кожи добровольца в изотоническом растворе натрия хлорида, осторожно перемешивая при температуре 36,6°С.
L. Помещение гемолизата на подложку.
Гемолизат помещают на коммерческую подложку Matrigel с ростовой средой mTeSr, содержащей все необходимые факторы для поддержания плюрипотентного состояния при температуре Зб,6°С.
М. Исследование клеток под микроскопом спустя 15 дней после трансфекции.
Размер полученых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток составляет около 20 микрон, наблюдают высокое соотношение ядро-цитоплазма, хорошо видны ядрышки, характерно перинуклеарное расположение митохондрий, низкий уровень содержания митохондриальной ДНК.
N. Спонтанная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток in vitro.
В отсутствие фидера из мышиных эмбриональных фибробластов, при культивировании полученых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, происходит спонтанное образование эмбриоидных тел. При культивировании 60 дней в дифференцирующихся клетках обнаруживают экспрессию маркеров энтодермы, мезодермы и эктодермы. О. Тест на плюрипотентность in vivo.
Образование тератом у 20 мышей линии SCID (иммунодефицитные), при введении полученых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. В тератомах обнаруживают кишечный эпителий (энтодерма), хрящ, кость и гладкие мышцы (мезодерма); нейральный эпителий (эктодерма).
Р. Таблица 1. Характеристики полученых ИПС клеток человека.
Характеристики Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека плюрипотентность да хромосомный набор нормальный возможность исправления да
генетических дефектов
пациентоспецифичность да
(56) Список документов, цитированных в отчёте о поиске:
[I] . Kinosita К. Jr., Tsong T.Y. Ibid., 1978, v. 272(5650), p. 258-260.
[2]. Левин Г.Я. , Соснина Л.Н. Исследование реологических свойств эритроцитов, модифицированных для направленного транспорта лекарственных веществ. Фундаментальные исследования. 2013. 1\1°2.
[3]. Klibansky, С.1959. Ph.D. Thesis, Hebrew University, Jerusalem, Israel.
[4]. Franco. R., Barker. R., and Weiner. M. 1987. The nature and kinetics of redcell membrane changes during the osmotic pulse method of incorporating xenobiotics into viable red cells. Adv. Biosci. (series) 67:63-72.
[5]. Ropars, C, Nicolau, C, and Chassaigne, M. 1982. French Patent No. 82. 11749; 1983. European Patent No. 83. 401364-1.
[6]. Ginn F.L., Hochstein P., Trump F.P. Science, 1969, v. 164(881), p. 843- 845.
[7]. Ihler M.G. Bibl. Haemotol., 1985, v. 51, p. 127-133.
[8]. Bunkin A.F. and Pershin S.M. Temperature anomalies of liquid water stretching vibrations Raman band envelope // Physics of Vibrations, 1997, V.61(3), 158-164;
[9]. СМ. Першин. Орто/пара конверсия H20 в воде и скачок
«текучести» эритроцитов через микрокапилляр при температуре
36.6±0.3 °С
http://www.biophys.ru/archive/congress2009/pro-p87.htm
[10]. Jones R.L., Jenkins М D 1983 Effects of hand and machine succession on the in vitro activity of potencies of Pulsatilla. British Homoeopathic Journal 72: 217-223.
[II] . https://www.youtube.com/watch?v=qhbM8H3wEUI
[12]. G.M. Artmann, C. Kelemen, D. Porst, G. Buldt, and S. Chien, Biophys. J., 75 3179 (1998).
[13] . Генинг Т.П. Эритроциты млекопитающих в направленном транспорте биологически активных веществ. - Ульяновск: УлГУ, 1996.
[14]. Патент RU 2195270 A61K31/00, A61K33/00, А61К35/78 2002.
[15]. Nakata et al. J. Bacterid., 1989; J. Doudna, E. Charpentier. Science.
28.11.2014: Vol. 346 no. 6213.
[16]. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, Т., Tomoda, K., Yamanaka, S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, 861-872.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

Формула изобретения.
1. Лекарственное средство в форме жидкой суспензии отмытых модифицированных эритроцитов, предназначенной для инъекционного применения, с замедленным регулируемым высвобождением в организме лекарственного препарата и обеспечивающих эффективную направленность лекарства, отличающаяся тем, что производят проведение трёх кратной отмывки эритроцитов в физиологическом растворе, ресуспензирование эритроцитов в изотоническом растворе низкой ионной силы нанокапсулированного желатина содержащий в середине микроРНК (sgRNAs), белок Cas9 и последовательность ДНК для внедрения, суккуссию суспензии эритроцитов в закрытой пробирке с тензометрическим датчиком посредством ударов о твёрдую эластичную поверхность, добавление антител определенной специфичности, инкубацию пробирки в термостате, проведение трёх кратной отмывки эритроцитов в физиологическом растворе, ресуспензирование модифицированных эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида.
2. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что в центре нанокапсулированного желатина заключаеться упаковываная в вирус CRISPR/Cas9 - кассета, включающая молекулы микроРНК (sgRNAs), белок Cas9 и последовательность ДНК для внедрения.
3. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что в пробирку с эритроцитарной массой добавляют 8% раствор нанокапсулированного желатина в изотоническом растворе низкой ионной силы Low Ionic Strength Solution (Liss) при температуре 36,3-Зб,9°С, предпочтительно 36,б°С, рН раствора должно быть равным 7,00 - 7,40, предпочтительно рН 7,35.
4. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что пробирку, заполнят по объёму на 1/2-2/3 суспензией эритроцитов.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
5. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что производят суккуссию суспензии посредством ударов о твёрдую эластичную поверхность, при температуре 36,3-36,9°С, предпочтительно 36,6°С, величину повышения давления при гидравлическом ударе о дно сосуда суспензии эритроцитов, контролируют тензометрическим дачиком работающим в комплекте со шлейфовым осциллографом, давление составляет 2,2-2,4 кПа, предпочтительно 2.3 кПа, время суккуссии суспензии эритроцитов от 30 секунд до 2 минут, предпочтительно 30 секунд.
6. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что в изотонический раствор низкой ионной силы 8% нанокапсулированного желатина, добавляют антитела определенной специфичности, инкубируют в термостате от 15 минут до 1 часа, предпочтительно 30 минут при температуре 36,6°С.
7. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что отмывают эритроциты по три раза : центрифугируют в физиологическом растворе в течение 10 минут при 3000 об/мин, при температуре 36,3-36,9°С, предпочтительно 36,6°С, рН раствора должно быть равным 7,00 - 7,40, предпочтительно рН 7,35.
8. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по п.1, отличающаяся тем, что инфузия пациенту производится при температуре суспензии 36,6°С.
9. Суспензия отмытых модифицированных эритроцитов по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что применяют аутологичные эритроциты.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2016/000013 2016-01-18 2016-01-18 Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства WO2017126987A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2016/000013 WO2017126987A1 (ru) 2016-01-18 2016-01-18 Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2016/000013 WO2017126987A1 (ru) 2016-01-18 2016-01-18 Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017126987A1 true WO2017126987A1 (ru) 2017-07-27

Family

ID=59361926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/000013 WO2017126987A1 (ru) 2016-01-18 2016-01-18 Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017126987A1 (ru)

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
RU2683322C1 (ru) * 2018-01-26 2019-03-28 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN111658772A (zh) * 2020-07-22 2020-09-15 南通大学 一种自然光诱导控释药物及其制备方法与应用
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995015761A1 (fr) * 1993-12-09 1995-06-15 Labo'life Solutions de type homeopathique contenant un acide nucleique
WO2007097934A2 (en) * 2006-02-17 2007-08-30 Elusys Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using erythrocytes as carriers for delivery of drugs
RU2454667C1 (ru) * 2011-04-20 2012-06-27 Негосударственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский медицинский институт (НОУ СМИ "РЕАВИЗ") Способ приготовления суспензии эритроцитов для определения деформируемости эритроцитарных мембран
WO2014204726A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
RU2014112958A (ru) * 2011-09-21 2015-10-27 Йиссум Ресерч Девелопмент Компани оф де Хебрю Юниверсити оф Джерусалем Лтд. Наносистемы доставки для мирнк

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995015761A1 (fr) * 1993-12-09 1995-06-15 Labo'life Solutions de type homeopathique contenant un acide nucleique
WO2007097934A2 (en) * 2006-02-17 2007-08-30 Elusys Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using erythrocytes as carriers for delivery of drugs
RU2454667C1 (ru) * 2011-04-20 2012-06-27 Негосударственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский медицинский институт (НОУ СМИ "РЕАВИЗ") Способ приготовления суспензии эритроцитов для определения деформируемости эритроцитарных мембран
RU2014112958A (ru) * 2011-09-21 2015-10-27 Йиссум Ресерч Девелопмент Компани оф де Хебрю Юниверсити оф Джерусалем Лтд. Наносистемы доставки для мирнк
WO2014204726A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANDER J. D. ET AL.: "CRISPR-Cas systems for genome editing, regulation and targeting", NAT BIOTECHNOL., vol. 32, no. 4, 2014, pages 347 - 355, XP055294952 *
YAN MING ET AL.: "Modulation of Gene Expression by Polymer Nanocapsule Delivery of DNA Cassettes Encoding Small RNAs", PLOS ONE, vol. 10, no. 6, 2015, pages e0127986, XP055319413 *
УЛАШИК B.C.: "Направленный транспорт лекарственных средств и лечебные фиэические факторы. Вопросы курортолгии", ФИЭИОТЕРАПИИ И ЛЕЧЕБНОЙ ФИЭИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ, 2014, pages 52 - 61 *

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
RU2683322C1 (ru) * 2018-01-26 2019-03-28 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN111658772A (zh) * 2020-07-22 2020-09-15 南通大学 一种自然光诱导控释药物及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017126987A1 (ru) Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства
Wilbie et al. Delivery aspects of CRISPR/Cas for in vivo genome editing
Zhao et al. Highly efficient in vivo cancer therapy by an implantable magnet triboelectric nanogenerator
Li et al. Cell‐based delivery systems: emerging carriers for immunotherapy
Piffoux et al. Modification of extracellular vesicles by fusion with liposomes for the design of personalized biogenic drug delivery systems
Ng et al. Scalable production of extracellular vesicles and its therapeutic values: a review
JP2017530158A (ja) 筋ジストロフィーの処置における心筋球由来細胞およびこのような細胞によって分泌されたエキソソーム
BRPI0917993B1 (pt) composições de célula-tronco mesenquimal purificada
Boone et al. Active microneedle administration of plant virus nanoparticles for cancer in situ vaccination improves immunotherapeutic efficacy
Bahmani et al. Different sourced extracellular vesicles and their potential applications in clinical treatments
KR20070058478A (ko) 적혈구에 활성 성분을 내재화시키는 용해/재결합 방법 및장치
KR102581296B1 (ko) 막 지질 코팅된 나노입자 및 사용 방법
JP6474499B2 (ja) 癌治療用細胞治療剤およびその併用療法
Esteves et al. MicroRNA-124-3p-enriched small extracellular vesicles as a therapeutic approach for Parkinson’s disease
CN106754723B (zh) 一种具有抗肿瘤功能的免疫细胞及其应用
Wang et al. Spinal cord injury target-immunotherapy with TNF-α autoregulated and feedback-controlled human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosomes remodelled by CRISPR/Cas9 plasmid
Liang et al. An integrated nanoaircraft carrier modulating antitumor immunity to enhance immune checkpoint blockade therapy
Liu et al. Cell membrane-engineered nanoparticles for cancer therapy
Yang et al. A nanotherapy of octanoic acid ameliorates cardiac arrest/cardiopulmonary resuscitation-induced brain injury via RVG29-and neutrophil membrane-mediated injury relay targeting
Zhu et al. Strategies for engineering exosomes and their applications in drug delivery
Yong et al. Therapeutic potential of anti-HIV RNA-loaded exosomes
Feng et al. Exosomes: Applications in respiratory infectious diseases and prospects for coronavirus disease 2019 (COVID-19)
US20220354802A1 (en) Process of making membrane lipid coated nanoparticles
Tang et al. Red blood cell-mimicking liposomes loading curcumin promote diabetic wound healing
CN116515762A (zh) 一种促进糖尿病创面愈合的工程化改造外泌体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16886668

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16886668

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1