IT201600102542A1 - Plasmide e sistema lentivirale contenente un circuito autolimitante della Cas9 che ne incrementa la sicurezza. - Google Patents

Description

DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:

PLASMIDE CON CIRCUITERIA DI CAS9 AUTOLIMITANTE PER UNA SICUREZZA MIGLIORATA (SELF-LIMITING CAS9 CIRCUITRY FOR ENHANCED SAFETY [SLICES]) E RELATIVO SISTEMA LENTIVIRALE

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce al campo della biotecnologia, in particolare a un’unità di espressione per la tecnologia CRISPR/Cas9 e particelle lentivirali correlate.

STATO DELLA TECNICA

L’applicazione in vivo della tecnologia CRISPR/Cas9 è ancora limitata dai tagli genomici indesiderati di Cas9. L’espressione a lungo termine di Cas9 aumenta il numero di loci genomici tagliati aspecificamente dalla nucleasi.

La modifica del genoma tramite la tecnologia CRISPR/Cas9 ha un potenziale enorme per le applicazioni sia di base sia cliniche grazie alla sua semplicità, alla plasticità di adattamento al target e alla capacità di bersagliamento multiplo. Il limite principale nell’utilizzo di CRISPR/Cas9 è rappresentato dalle mutazioni indotte in corrispondenza di siti che differiscono dal target previsto. Ciò è di fondamentale importanza per le applicazioni in vivo poiché alterazioni indesiderate potrebbero portare a risultati clinici sfavorevoli.

Un fattore importante che influenza il numero di modifiche off target è rappresentato dalla quantità e persistenza di espressione di SpCas9 nelle cellule target: viene riportato che concentrazioni elevate della nucleasi aumentano il taglio non-specifico (off-target), mentre l’abbassamento delle quantità di SpCas9 aumenta la specificità. L’espressione transiente di SpCas9 è infatti sufficiente per modificare in modo permanente il locus genomico bersaglio con un’attività off-target diminuita, come dimostrato dall’aumentata specificità ottenuta tramite una trasporto diretto dei complessi SpCas9-sgRNA ricombinanti nelle cellule target (Kim, S., et al., Genome Res. 2014, 24, 1012–1019; Ramakrishna, S. et al., Genome Res.2014, 24, 1020– 1027; Zuris, J. A. et al., Nat. Biotechnol.2015, 33, 73–80) o dall’uso di una variante di SpCas9 attivata dalle inteine (Davis, K. M., et al., Nat. Chem. Biol.2015, 11, 316– 318). Verosimilmente, qualsiasi proteina Cas9 presente dopo che il locus bersaglio sia stato modificato ha una sostanziale probabilità di modificare siti aggiuntivi. Anche se l’introduzione diretta dei complessi ribonucleoproteici SpCas9-sgRNA può diminuire gli effetti off target, essa è estremamente inefficiente e inadatta per gli approcci in vivo.

Slaymaker, I. M. et al. (Science 2016, 351, 84–88) descrive nucleasi Cas9 ingegnerizzate razionalmente con specificità migliorata.

Sebbene i vettori virali rappresentino strumenti di trasporto ottimali, essi generano un’espressione stabile dei fattori trasferiti che non è necessariamente benefica per le applicazioni di CRISPR/Cas9. È noto che la quantità e la persistenza di Cas9 portano a un accumulo off-target e che Cas9 distribuita permanentemente tramite un sistema lentivirale porta a un aumento temporale consistente di indel in corrispondenza dei siti off-target.

Approcci volti a controllare l’attività di Cas9 sono stati recentemente sviluppati sfruttando vari sistemi inducibili (Nuñez, J. K., et al., ACS Chem. Biol. 2016, 11, 681–688). Nondimeno, gli approcci riportati fino ad ora risentono di numerose limitazioni che vanno da una diminuzione dell’attività catalitica generata dalla divisione in due parti della nucleasi (Wright, A. V. et al., Proc. Natl. Acad.2015, 291 Sci. U. S. A.112, 2984–2989) o dalla modifica chimica della nucleasi stessa (Davis, K. M., et al., Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 316–318), al mantenimento di una attività residua (Nihongaki, Y., et al., Nat. Biotechnol. 2015, 33, 755–760) o al tempo prolungato dell’induzione necessaria (Zetsche, B., et al., Nat. Biotechnol. 2015, 33, 139–142).

Kiani S., et al. (Nat Methods. 2015, 12(11): 1051–1054) hanno illustrato che alterando la lunghezza dell’RNA guida (gRNA) associato a Cas9 è possibile controllare l’attività nucleasica di Cas9 e contemporaneamente effettuare la modifica del genoma e la regolazione trascrizionale con una singola proteina Cas9. WO2015/070083 descrive molecole di gRNA (gRNA anti-Cas) che bersagliano una sequenza di acido nucleico che codifica la molecola di Cas9. Vengono descritti anche acidi nucleici comprendenti: a) una prima sequenza di acido nucleico che codifica una molecola di gRNA governante; e b) una seconda sequenza di acido nucleico che codifica una molecola di Cas9; in cui la molecola di gRNA governante comprende una molecola di gRNA che bersaglia una molecola di Cas9 (gRNA anti-Cas).

Proteggere le cellule target dall’attività di Cas9 residua sta diventando un requisito urgente per migliorare i margini di sicurezza della tecnologia CRISPR/Cas9 in vista della sua implementazione negli studi in vivo.

Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire sequenze nucleotidiche per regolare negativamente l’espressione di Cas9. Un ulteriore scopo dell’invenzione è quello di fornire un’unità di espressione per la tecnologia CRISPR/Cas9 in cui l’espressione di Cas9 viene inattivata dopo la modifica del genoma. Un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire un sistema lentivirale per la tecnologia CRISPR/Cas9 che consegue l’efficienza di trasporto su base virale e contemporaneamente limita la quantità di SpCas9 dopo la trasduzione e l’integrazione virale. Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo per impedire l’espressione funzionale di Cas9 o gRNA nei batteri e/o nelle cellule di impaccamento. Lo scopo della presente invenzione è anche quello di fornire un metodo per produrre un sistema di trasporto virale completamente funzionale della tecnologia CRISPR/Cas9 con una limitazione all’ammontare di SpCas9 dopo la trasduzione.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

Nella presente è descritta una nuova tecnologia che consente la modifica (editing) del genoma tramite un approccio Cas9 “hit and go”, che abbiamo denominato circuiteria di Cas9 autolimitante per una sicurezza migliorata (Self-Limiting Cas9 circuitry for Enhanced Safety [SLiCES]).

L’oggetto della presente invenzione è un plasmide SLiCES CRISPR/CAS9 comprendente:

una cassetta di espressione per una molecola di Cas9;

una prima sequenza nucleotidica che codifica un sgRNA che bersaglia la molecola di Cas9 (sgRNA anti-Cas9); e

una seconda sequenza nucleotidica che codifica un sgRNA che bersaglia un locus genomico selezionato (sgRNA target);

in cui

la cassetta di espressione per una molecola di Cas9 e/o la sequenza che codifica sgRNA anti-Cas9 comprende almeno un introne, e/o

la cassetta di espressione per la molecola di Cas9 e/o la sequenza codificante sgRNA anti-Cas9 è preceduta da una sequenza includente un promotore inducibile. L’argomento oggetto della presente invenzione è anche un sistema di distribuzione virale o artificiale comprendente il plasmide come descritto sopra.

Un ulteriore argomento oggetto dell’invenzione è il plasmide o il sistema virale o artificiale come descritto sopra per l’uso come medicinale, in particolare nella terapia genica.

Un ulteriore argomento oggetto dell’invenzione è anche l’uso in vitro del plasmide o del sistema virale o artificiale come descritto sopra in ingegneria genomica, ingegneria cellulare, espressione proteica o biotecnologia.

L’argomento oggetto dell’invenzione è anche una composizione farmaceutica comprendente il plasmide, o il sistema virale o artificiale come descritto sopra e almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.

Un ulteriore argomento oggetto della presente invenzione è anche un processo per preparare il sistema virale come descritto sopra, il processo comprendente:

trasformare un batterio con il plasmide come descritto sopra, detto batterio in cui l’espressione di Cas9 e/o sgRNA è impedita dalla presenza dell’introne o dall’espressione di un repressore specifico per il promotore inducibile o da un altro sistema atto a evitare l’espressione di Cas9 e/o sgRNA; e/o

trasfettare una cellula con il plasmide come descritto sopra, detta cellula esprimente un repressore specifico per il promotore inducibile o detta cellula comprendente un sistema per regolare l’espressione di gRNA Cas9 e/o anti-Cas9, detta cellula preferibilmente essendo trasfettata con plasmidi per produrre un vettore virale, preferibilmente un vettore lentivirale (vale a dire ∆R8.9, pCMV-VSV-G).

Il principale vantaggio dello SLiCES è rappresentato dalla natura transiente di Cas9 che impedisce il protrarsi dell’attività nucleasica oltre il completamento della modifica target del DNA. In aggiunta, lo SLiCES offre una varietà di vantaggi:

• Attività off-target limitata;

• Trasporto efficiente tramite sistemi virali, in particolare sistemi lentivirali (lentiSLiCES);

• Adattabilità a diverse nucleasi guidate da RNA.

• Adattabilità a diversi vettori virali.

Sorprendentemente, controllare i livelli di Cas9 con il circuito autolimitante comporta una specificità aumentata della modifica del genoma. Per il suo utilizzo in vivo, ha avuto esito positivo l’integrazione dello SLiCES in un sistema di trasporto lentivirale (lentiSLiCES) tramite l’inibizione del circuito per ottenere la produzione di particelle virali. A seguito del suo trasporto nelle cellule target, il circuito lentiSLiCES viene attivato per modificare il locus genomico previsto mentre porta avanti la propria neutralizzazione tramite l’inattivazione di SpCas9. Proteggendo le cellule target dall’attività nucleasica residua, il nostro sistema hit and go aumenta i margini di sicurezza per la modifica del genoma.

Nel complesso, la natura “hit and go” dello SLiCES e la sua adattabilità a nuove tecniche Cas9 emergenti, combinata all’implementazione del trasporto virale, consente procedure di modifica del genoma maggiormente controllabili con una limitata attività off target indesiderata di Cas9.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un metodo per impedire l’espressione di una proteina Cas9 tossica in un batterio, detto metodo comprendente introdurre almeno un introne nella sequenza nucleotidica codificante detta proteina Cas9. L’uso di almeno un introne per impedire l’espressione di una proteina tossica in un batterio potrà essere applicato anche a proteine tossiche diverse da Cas9.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Il plasmide secondo l’invenzione preferibilmente comprende almeno un introne; e una sequenza codificante un promotore inducibile. Più preferibilmente, l’introne è dentro la open reading frame (ORF) della cassetta di espressione per la molecola di Cas9 per formare una cassetta di espressione suddivisa in due o più esoni. In modo massimamente preferibile l’introne è soltanto uno.

Il plasmide secondo l’invenzione, più preferibilmente, è quello in cui la cassetta di espressione per la molecola di Cas9 e la sequenza codificante sgRNA anti-Cas9 sono entrambe precedute da una sequenza includente un promotore inducibile.

Preferibilmente, il gRNA viene espresso con un promotore riconosciuto da Pol-III. Preferibilmente, il gRNA viene espresso con un promotore U6 o H1. Preferibilmente il sgRNA viene espresso con un promotore U6 o H1 umano. Il gRNA può essere espresso con un promotore di tRNA (Mefferd AL et al., 2015, RNA, 21, 1683-9). Il gRNA può essere espresso con un promotore di Pol-II (Nissim L et al., 2014 Mol Cell, 54, 698-710). Il sgRNA può essere processato mediante una eso- o endo-RNAsi (ad esempio Csy4).

Secondo la presente invenzione, è possibile usare molecole di Cas9 di diverse specie nei metodi e nelle composizioni descritti nella presente. Sebbene gran parte della presente descrizione usi molecole di Cas9 di S. pyogenes e S. thermophilus, molecole di Cas9 derivanti dalle altre specie possono sostituirle, per esempio molecole di Cas9 di Staphylococcus aureus e Neisseria meningitidis. Specie aggiuntive di Cas9 includono: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., cycliphilus denitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus Puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, gamma Proteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., o Verminephrobacter eiseniae.

Una molecola di Cas9, come questo termine viene usato nella presente, si riferisce a una molecola che può interagire con una molecola di gRNA e, di concerto con la molecola di gRNA, localizzarsi (per esempio bersagliare o ospitare) in un sito che comprende un dominio target e una sequenza PAM. La molecola di Cas9 è in grado di tagliare una molecola di acido nucleico target.

Molecole di Cas9 presenti in natura esemplificative sono descritte in Chylinski et al, RNA Biology 2013; 10:5, 727-737.

Molecole di Cas9 presenti in natura esemplificative includono una molecola di Cas9 di una famiglia batterica del cluster 1. Esempi includono una molecola di Cas9 di: S. pyogenes (per esempio, ceppo SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 e SSI-1), S. thermophilus (per esempio, ceppo LMD-9), S. pseudoporcinus (per esempio, ceppo SPIN 20026), S. mutans (per esempio, ceppo UA159, NN2025), S. macacae (per esempio, ceppo NCTC11558), S. gallolyticus (per esempio, ceppo UCN34, ATCC BAA-2069), S. equines (per esempio, ceppo ATCC 9812, MGCS 124), S. dysdalactiae (per esempio, ceppo GGS 124), S. bovis (per esempio, ceppo ATCC 700338), S. anginosus (per esempio, ceppo F0211), S. agalactiae (per esempio, ceppo NEM316, A909), Listeria monocytogenes (per esempio, ceppo F6854), Listeria innocua (L. innocua, per esempio, ceppo Clipl l262), Enterococcus italicus (per esempio, ceppo DSM 15952), or Enterococcus faecium (per esempio, ceppo 1,231,408). Molecole di Cas9 esemplificative aggiuntive sono una molecola di Cas9 di Neisseria meningitidis (Hou et al. PNAS Prima edizione 2013, 1-6) e una molecola di Cas9 di S. aureus.

In una forma di realizzazione, una molecola di Cas9, comprende una sequenza amminoacidica:

che ha il 60%, il 65%, il 70%, il 75%, l’80%, l’85%, il 90%, il 95%, il 96%, il 97%, il 98%, o il 99% di omologia con o che è identica a una qualsiasi sequenza di molecola di Cas9 descritta nella presente o a una sequenza di molecola di Cas9 presente in natura, per esempio una molecola di Cas9 derivante da una specie elencata nella presente o descritta in Chylinski et al., RNA Biology 2013, 10:5, 727-737; Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6.

Cas9 può anche essere una molecola di Cas9 ingegnerizzata come recentemente sviluppato (Kleinstiver B. P., et al., Nature.2016.529,490-5; Slaymaker I. M., et al., Science. 2016. 351, 84-8. Nuñez J. K., et al., ACS Chem. Biol. 2016. 11, 681–688; Wright A. V., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2015. 112, 2984–2989. Nihongaki Y., et al., Nat. Biotechnol. 2015. 33, 755–760. Zetsche, B., et al., Nat. Biotechnol.

2015.33, 139–142).

La molecola di Cas9 può anche essere mutata o ingegnerizzata per essere una “nickase” (per esempio i domini mutanti D10A, D10A/D839A/H840A e D10A/D839A/H840A/N863A), un mutante dei domini della nucleasi Cas9 incapaci di clivare il DNA (per esempio i domini mutanti D10A, D10A/D839A/H840A, e D10A/D839A/H840A/N863A), una fusione con un dominio nucleasico (per esempio Fok-I) o un dominio di modifica dell’acido nucleico (per esempio una DNA deamminasi).

La molecola di Cas9 può essere sostituita con un sottotipo e una classe differenti di nucleasi guidate da RNA come AsCpf1 e LbCpf1. Gli esempi sono inclusi in Shmakov S., et al., Mol Cell 2015, 60, 385-397.

Le nucleasi guidate da RNA possono essere sostituite con nucleasi guidate da DNA (per esempio Natronobacterium gregory Argonaute), recentemente descritte per la modifica del genoma in Gao F., Nature Biotechnology.2016. 34, 768-773.

Secondo l’invenzione il sgRNA target può essere un qualsiasi DNA target noto nella tecnica; il gRNA di bersagliamento può essere modificato affinché abbia un’affinità differente per la molecola di Cas9; il gRNA di bersagliamento può essere modificato affinché sia più stabile nelle cellule bersagliate; il gRNA di bersagliamento può essere modificato chimicamente (vale a dire fosforotioato RNA, deamminazione dell’RNA); il gRNA di bersagliamento può essere fuso a domini di RNA aggiuntivi in corrispondenza delle sue estremità 5’ e 3’ (vale a dire ripetizioni MS2, forcine di RNA); il gRNA può essere formato da molecole di RNA differenti analogamente a crRNA e tracr-RNA; è particolarmente preferito un sgRNA target che bersaglia un locus di interesse terapeutico. I loci di sgRNA target sono geni o sequenze intergeniche aventi effetti sulla crescita o sulla vitalità delle cellule somatiche, staminali o cancerose, come singolo target o in combinazione (vale a dire una letalità sintetica). Un sgRNA target può codificare i geni implicati nel metabolismo cellulare. I loci di sgRNA target possono codificare geni essenziali per la persistenza o la replicazione di un’infezione virale. Loci particolarmente preferiti possono essere, per esempio, HBG1, HBG2, HBB, Prp, HTT, PCSK9, SERPINA1, LEDGF/p75; CCR5, CXCR4, TCR, BCR, VEGFA, ZSCAN, EMX1, ROSA26, AAV1, β-globina, CFTR.

Il target di sgRNA può essere una sequenza di DNA di origine virale (van Diemen F.R. et al., PLoS Pathog. 2016. 12(6):e1005701; Seeger C e Sohn J.A Molecular Therapy—Nucleic Acids (2014) 3, e216). L’applicazione dello SLiCES può essere destinata a eliminare il virus dalle cellule infettate bersagliando elementi genetici virali importanti per la vitalità e la replicazione del virus. Specifici loci virali preferiti possono essere per esempio:

- il genoma di HIV-1, di preferenza regioni conservate, LTR, proteasi, integrasi, Gag e GagPol;

- il genoma retrovirale, di preferenza regioni conservate, LTR, proteasi, integrasi, Gag e GagPol;

- il genoma di HBV, di preferenza regioni conservate, RT, Ag di superficie, geni del ”core”;

- il genoma del virus dell’herpes simplex (HSV), di preferenza le regioni conservate; - il genoma di citomegalovirus umano (HCMV), di preferenza le regioni conservate; - il genoma del virus Epstein-Barr (EBV), di preferenza le regioni conservate;

- genoma ed episomi di Papillomavirus umano, di preferenza E6 o E7.

L’applicazione dello SLiCES a elementi genetici virali può essere destinata a facilitare l’ingegnerizzazione di virus ricombinanti (Suenaga T et al., Microbiol Immunol. 2014. 58, 513-22; Bi Y et al., LoS Pathog 10(5):e1004090).

Un sistema di trasporto virale comprendente il plasmide SLiCES dell’invenzione può essere un virus a DNA o a RNA, di preferenza un lentivirus, un retrovirus, un SIV, un EIAV, un AAV, un adenovirus o un virus dell’herpes. Preferibilmente, secondo l’invenzione il sistema di distribuzione virale è un sistema lentivirale (lentiSLiCES). Di seguito nella presente è riportato un esempio di sistema lentivirale comprendente il plasmide SLiCES dell’invenzione; per retrovirus, SIV, EIAV il sistema può essere fotocopiato identico; per AAV, adenovirus o virus dell’herpes il sistema può essere adattato in base allo stesso principio.

Per un aspetto, la presente invenzione si riferisce a un microrganismo geneticamente modificato, preferibilmente un batterio, comprendente il plasmide come descritto sopra.

Per un aspetto, la presente invenzione si riferisce a una cellula, preferibilmente una cellula di mammifero, trasfettata con il plasmide come descritto sopra.

Un batteriofago può codificare il proprio sistema CRISPR/Cas (Seed KD et al., Nature. 2013. 28, 489-91; Bellas C et al., Frontiers in Microbiology 2015. 6, 656). Un batteriofago potrebbe essere ingegnerizzato semplicemente affinché costituisca un sistema di trasporto virale per lo SLiCES per controllare la tempistica e aumentare la specificità della formazione delle rotture del doppio filamento bersagliate in una specifica popolazione batterica. Il sistema SLiCES introdotto mediante batteriofagi può essere usato per esempio per modificare la composizione di una popolazione batterica eterogenea, oppure per rimuovere specifici fagi dauna popolazione batterica. Per operare contro un batteriofago, il sistema SLiCES non potrà contenere introni eucariotici poiché gli SLiCES devono essere completamente funzionali nei batteri che non sono in grado di processarli.

Potranno essere usate cellule batteriche per introdurre il circuito SLiCES ad altre cellule batteriche (vale a dire una coniugazione batterica che distribuisce DNA, RNA o una proteina di SLiCES) o a cellule di mammifero (infezione delle cellule di mammifero mediante Trypanosoma cruzi e Plasmodium falciparum ingegnerizzati che contengono il circuito SLiCES e distribuiscono DNA, RNA o una proteina di SLiCES).

Un sistema di delivery artificiale comprendente il plasmide SLiCES dell’invenzione può essere rappresentato per esempio da veicoli organici o inorganici (cellule artificiali o fantasma, liposomi, vescicole, esosomi, vescicole della membrana batterica esterna, goccioline di acido grasso, proteine, peptidi, composti di sintesi, particelle e nanoparticelle metalliche e non metalliche, fullerene, nanotubi di carbonio), dispositivi meccanici (compressione microfluidica, microiniezione, nanomacchine, micromacchine), iniezione idrodinamica, elettroporazione.

Di conseguenza, il sistema plasmidico, virale e artificiale dell’invenzione può risultare utile nel trattamento di svariati disturbi monogenici in cui la modifica del genoma potrà essere usata appieno come: fibrosi cistica, SCID (sindrome da immunodeficienza combinata grave), sindrome di Wiskott–Aldrich, emofilia A e B, sindrome di Hurler, sindrome di Hunter, morbo di Gaucher, corea di Huntington, distrofia muscolare di Duchenne, atrofia muscolare spinale, morbo di Canavan, malattia granulomatosa cronica, ipercolesterolemia familiare, anemia di Fanconi, deficit di purina nucleoside fosforilasi, deficit di ornitina transcarbamilasi, deficienza di adesione leucocitaria, atrofia di Gyrate, morbo di Fabry, malattia di Pompe, malattia di Tay Sachs, Nieman-Pick A, B, sindrome di Sly, morbo di Sanfilippo, morbo di Maroteaux-Lamy, aspartilglucosamminuria, sclerosi amiotrofica laterale, epidermolisi bollosa giunzionale, disturbo da adesione leucocitaria, morbo di Farber, morbo di Krabbe, morbo di Wolman.

Altre malattie che potrebbero potenzialmente beneficiare dall’invenzione potranno essere, in via non limitativa: colesterolo elevato, deficit di antitripsina, cancro, diabete, malattie infettive batteriche e virali. Alcuni esempi sono inclusi in Maeder M.L e Gersbach C. A. Molecular Therapy 2016, 24, 430-446.

SLiCES limita il ri-taglio da parte di Cas9 di un locus di DNA target dopo l’HDR (riparazione per omologia), aumentando la probabilità di una HDR accurata. Una HDR accurata è essenziale nella maggior parte delle applicazioni di modifica del genoma in biologia cellulare e in medicina molecolare. Per risolvere questo problema è stata sviluppata una procedura complicata e dispendiosa in termini di tempo (Paquet D. et al., Nature 2016, 533, 125-9). SLiCES e lentiSLiCES possono essere introdotti insieme a un DNA donatore per indurre l’HDR. L’auto-inattivazione di Cas9 impedisce l’ulteriore taglio dei loci genetici corretti senza richiedere le mutazioni protettive aggiuntive attualmente necessarie per evitare il ri-taglio da parte di Cas9. Una mutazione protettiva è un appaiamento errato tra il DNA donatore e il locus bersagliato, il quale è situato all’interno della sequenza di bersagliamento del gRNA o all’interno della sequenza PAM riconosciuta da Cas9. Le inserzioni di mutazioni protettive devono essere evitate o limitate, poiché possono influenzare in modo imprevedibile la corretta funzione di un locus target. Lo screening dei knockout genici su tutto il genoma, usando per esempio le librerie Brunello, Brie e GeCKO, potrebbe trarre vantaggio da SLiCES e lenti-SLiCES per ridurre gli effetti off-target che possono influenzare l’accuratezza e la riproducibilità dello screening.

Secondo l’invenzione, il sgRNA anti-Cas9 può essere un qualsiasi sgRNA in grado di bersagliare una molecola di Cas9; per esempio, un sgRNA anti-Cas9 come illustrato in WO2015/070083. Preferibilmente, secondo l’invenzione i sgRNA anti-Cas9 sono quelli codificati da una sequenza di 17-23 nucleotidi, preferibilmente partendo da G. Preferibilmente, la sequenza codificante un sgRNA anti-Cas9 è una sequenza avente almeno un’omologia del 60% rispetto a una sequenza selezionata nel gruppo costituito dalle SEQ ID N. 1-6. Più preferibilmente, una sequenza codificante un sgRNA anti-Cas9 è una sequenza avente almeno un’omologia del 70%, dell’80%, del 90%, del 100% rispetto a una sequenza selezionata nel gruppo costituito dalle SEQ ID N. 1-6. In modo massimamente preferibile, una sequenza codificante un sgRNA anti-Cas9 è una sequenza identica a una sequenza selezionata nel gruppo costituito dalle SEQ ID N.1-3 per bersagliare una molecola di Cas9 di S. pyogenes, oppure è una sequenza identica a una sequenza selezionata nel gruppo costituito dalle SEQ ID N.4-6 per bersagliare una molecola di Cas9 di S. thermophilus.

Preferibilmente, il plasmide secondo l’invenzione comprende, in posizione successiva e adiacente rispetto alla sequenza codificante il sgRNA anti-Cas9 e/o il sgRNA target, una sequenza codificante uno scheletro di gRNA oppure codificante uno scheletro di gRNA ottimizzato. Preferibilmente, la sequenza codificante il sgRNA anti-Cas9 è adiacente a una sequenza codificante uno scheletro di gRNA ottimizzato e la sequenza codificante il sgRNA target è seguita da una sequenza codificante uno scheletro di gRNA. Preferibilmente, la sequenza codificante uno scheletro di gRNA è la SEQ ID N.7 e la sequenza codificante uno scheletro di gRNA ottimizzato è la SEQ ID N.8.

Per evitare l’espressione non voluta di SpCas9, e la conseguente degradazione di DNA durante la preparazione del plasmide nei batteri, è stato introdotto un introne nella ORF di SpCas9 per formare una cassetta di espressione suddivisa in due esoni (esone 1 e 2, schematizzato nella figura 8). Poiché nei batteri non si verifica splicing, i prodotti trascritti vengono tradotti in batteri come frammento di SpCas9 cataliticamente inattivo. Come introne è possibile introdurre una qualsiasi sequenza nucleotidica che viene rimossa mediante splicing dell’RNA durante la maturazione del prodotto di RNA finale. Sono idonei, per esempio:

- introni di pre-mRNA nucleari (introni spliceosomali), che sono caratterizzati da specifiche sequenze introniche situate in corrispondenza dei confini tra introni ed esone (sito di splicing 5’, punto di ramificazione, tratto polipirimidinico, sito di splicing 3’);

- introni nei geni dell’RNA di trasferimento che vengono rimossi dalle proteine (introni del tRNA);

- introni di auto-splicing che vengono rimossi mediante la catalisi dell’RNA.

- ribozimi di RNA.

Preferibilmente, l’introne è derivato dall’introne della regione V del precursore della catena pesante di immunoglobulina di topo. Più preferibilmente, l’introne è identico alla SEQ ID N.9. Un introne preferito è anche l’introne 2 della β-globina di coniglio. La maggior parte dei differenti introni presenti nei geni eucariotici potrà essere usata per impedire l’espressione di Cas9 nei batteri e alcuni di essi potranno essere usati anche per limitare l’espressione di Cas9 a tessuti eucariotici specifici.

Potrà essere usato un introne anche per impedire l’espressione corretta del gRNA, in particolare del gRNA di auto-bersagliamento, nei batteri. L’introne potrà essere introdotto in regioni variabili o costanti del gRNA. Analogamente, un introne potrà essere introdotto nel crRNA o nel tracrRNA.

Per evitare l’espressione non voluta di Cas9 nei batteri, la sua espressione potrà essere regolata mediante un promotore inducibile in sostituzione di un introne all’interno del gene di Cas9. Ciò potrà impedire l’espressione di Cas9 mentre il plasmide di DNA viene amplificato (per esempio DH5alfa-Z1, che reca i geni codificanti il repressore Lac e il repressore Tet guidati dai promotori costitutivi, rispettivamente, Placiq e PN25); si veda anche di seguito per i promotori inducibili. Analogamente, potranno essere usati promotori inducibili per impedire l’espressione del gRNA, in particolare del gRNA di auto-bersagliamento, nei batteri (per esempio il promotore H1-TetO).

Per impedire l’espressione dispersiva di Cas9 nei batteri, potranno essere usati riboswitch (elementi di RNA in un mRNA che controllano l’espressione genica in cis in risposta ai loro ligandi specifici) per guidare la traduzione di Cas9 ed essi potranno essere usati anche in sostituzione di un introne all’interno del gene di Cas9. Per impedire l’espressione di Cas9 nei batteri, potranno essere usati riboswitch e IRES sia regolati naturalmente sia sintetici, di preferenza controllati da ligandi (vale a dire teofillina, flavina mononucleotide, tetraciclina, dossiciclina e solforodamina B). L’espressione di Cas9 e del gRNA nei batteri potrà essere controllata anche mediante l’uso di nucleotidi antisenso che agiscono sull’RNA o sul DNA codificante il gene di Cas9 e il gRNA.

Per aggirare l’attività di auto-taglio durante la produzione del vettore lentivirale, sono stati introdotti promotori inducibili per regolare preferibilmente l’espressione dei sgRNA sia di Cas9 sia anti-Cas9s. Il promotore inducibile preferibilmente è selezionato nel gruppo costituito da promotori inducibili da tetraciclina (TetO), AARE (elementi di risposta amminoacidica), promotore LacO, promotore LexA, promotore dello shock termico, promotore inducibile dalla luce, promotore responsivo all’ecdisone.

Il promotore inducibile viene regolato negativamente mediante uno specifico repressore corrispondente, che viene espresso nelle cellule di produzione. Il promotore TetO viene regolato negativamente da un repressore specifico, TetR, che viene espresso nelle cellule di produzione e, in assenza di doxiciclina, inibisce la trascrizione tramite il legame alle sequenze dell’operatore tetraciclina situate all’interno della regione di promotore (schematizzata nella figura 8b). Il sistema di espressione degli AARE (elementi di risposta amminoacidica), attivato rapidamente da una dieta con carenza di un EAA (amminoacido essenziale); le cellule di impaccamento devono essere cresciute in presenza di EAA per impedire l’espressione (Chaveroux C., et al., Nat Biotech. 2016. 34, 746-751). Il promotore LacO, regolato negativamente dal repressore LacI; inibisce la trascrizione in assenza di IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside). Operatore LexA, repressore di LexA; inibizione della trascrizione a meno che non siano presenti RecA e un danno al DNA. Promotori dello shock termico, sono repressi salvo temperature “elevate”. Promotori inducibili dalla luce. Muristerone A e ponasterone A, analoghi del recettore dell’ecdisone e di un promotore responsivo all’ecdisone, che guidano l’espressione del gene di interesse.

Come descritto per i batteri, anche nelle cellule di impaccamento per aggirare l’attività di auto-taglio durante la produzione del vettore lentivirale potranno essere introdotti un riboswitch o un IRES inducibile per regolare preferibilmente l’espressione di Cas9 o del gRNA.

Analogamente, potranno essere usati nucleotidi antisenso per regolare l’espressione di Cas9 e del gRNA nelle cellule di impaccamento per aggirare l’attività di auto-clivaggio durante la produzione del vettore lentivirale.

I metodi descritti per impedire l’espressione di gRNA potranno essere estesi ai gRNA non di auto-bersagliamento associati, di preferenza qualora la loro espressione fosse tossica/dannosa e diminuisse l’efficienza o la sicurezza della preparazione dei vettori lenti-SLiCES.

Il plasmide dell’invenzione può comprendere inoltre una sequenza nucleotidica utile per la selezione o l’isolamento della particella virale o delle cellule trasdotte oppure avere un effetto aggiuntivo sulle cellule trasdotte, come per esempio contenendo uno o più:

IRES (sito interno di entrata del ribosoma, di preferenza di origine virale come un IRES di ECMV, o un IRES non virale, sono di particolare interesse gli IRES tessutospecifici come un IRES di FGF-2, oppure un IRES e riboswitch artificiali, di preferenza controllati da ligandi, vale a dire teofillina, flavina mononucleotide, tetraciclina, doxiciclina e solforodamina B) vicino al suo gene regolato, vale a dire il gene di resistenza alla blasticidina,

- gene reporter (GFP, luciferasi, beta-galattosidasi),

- fusioni proteiche con tag amminoacidici ingegnerizzati, tag accettori di biotina, - un gene utile per controllare la crescita e la sopravvivenza delle cellule bersagliate (per esempio una timidina chinasi),

- un gene esprimente una proteina terapeutica, che può potenziare la sopravvivenza/vitalità delle cellule trasdotte e non trasdotte oppure avere un effetto biologico (vale a dire, controllo della risposta immunitaria, effetto metabolico, rimodellamento vascolare) sulle cellule bersagliate o non bersagliate (IL-2, IL-8, GM-CSF, insulina, VEGFA).

Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione, il plasmide dell’invenzione comprende una LTR 5’, una LTR-SIN 3’, un promotore hU6, uno scheletro di gRNA, un sgRNA target, un promotore hH1TetO, una sequenza di sgRNA anti-Cas9, uno scheletro di gRNA ottimizzato, un promotore CMV-TetO, FLAG-NLSSpCas9-NLS, un introne, ECMV-IRES, un gene di resistenza alla blasticidina, un WPRE. Tale sequenza è esemplificata dalla SEQ ID N.10.

Per migliorare ulteriormente la strategia SLiCES, potranno essere usati vettori lentivirali integrasi-difettivi (IDLV) per mantenere l’efficienza su base virale nella distribuzione cellulare, potenziando contemporaneamente la natura transiente di tipo a picco dell’espressione di Cas9.

Per trasferire SLiCES in un vettore retrovirale è sufficiente trasferire i transgeni presenti nel LentiSLiCES nel vettore di trasferimento retrovirale.

Per trasferire SLiCES in un vettore EIAV è sufficiente trasferire i transgeni presenti nel LentiSLiCES nel vettore di trasferimento di EIAV.

Per trasferire SLiCES in un vettore SIV è sufficiente trasferire i transgeni presenti nel LentiSLiCES nel vettore di trasferimento di SIV.

Per trasferire SLiCES in un vettore AAV potrà essere usata una Cas9 con una dimensione di pochi nucleotidi, come SaCas9, includente un introne all’interno del suo gene e avente un promotore inducibile su Cas9 e/o sul gRNA di autobersagliamento.

Per trasferire SLiCES in un vettore adenovirale è sufficiente trasferire i transgeni presenti nello SLiCES nei vettori adenovirali usando tecniche di ricombinazione o di clonaggio standard per creare vettori competenti per la replicazione, difettivi per la replicazione e helper-dipendenti.

Per trasferire SLiCES in un vettore di herpes è sufficiente trasferire i transgeni presenti nello SLiCES nei vettori di herpes usando tecniche standard per l’inserimento del transgene.

Per un aspetto della presente invenzione, l’argomento oggetto è inoltre un sgRNA anti-Cas9 codificato da una sequenza di acido nucleico selezionata nel gruppo costituito dalle SEQ ID N.1-6.

Le cellule di impaccamento secondo la presente illustrazione includono una qualsiasi cellula in cui gli acidi nucleici estranei possono essere introdotti ed espressi come descritto nella presente. Occorre comprendere che i concetti di base della presente invenzione non sono limitati dal tipo cellulare. Le cellule secondo la presente invenzione includono cellule eucariotiche, cellule procariotiche, cellule animali, cellule vegetali, cellule fungine, cellule archeali, cellule eubatteriche e simili.

Le cellule includono cellule eucariotiche come cellule di lievito, cellule vegetali, e cellule animali. Le particolari cellule includono le cellule di mammifero.

Preferibilmente, le cellule di impaccamento per produrre Lenti-SLiCES sono cellule di mammifero, in particolare cellule HEK-293, le quali potranno essere modificate per esprimere un repressore per impedire l’attivazione spuria dell’attività di SLiCES. Viceversa, le cellule di impaccamento potranno essere ingegnerizzate affinché siano prive di un gene necessario per l’attivazione di SLiCES.

Le cellule di impaccamento potranno essere inoltre sistemi artificiali o in vitro per l’espressione di proteine di RNA.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE FIGURA 1. L’espressione a lungo termine di Cas9 distribuita tramite un vettore lentivirale è correlata all’accumulo dei clivaggi off target. (a) Curve di andamento temporale delle percentuali di cellule 293-iEGFP non fluorescenti ottenute mediante la trasduzione con un vettore lentivirale (lentiCRISPR) esprimente SpCas9 insieme a un sgRNA perfettamente corrispondente (sgGFP-W) o a due sgRNA differenti contenenti uno o due appaiamenti errati con la sequenza target (rispettivamente, sgGFP-M e –MM). Un vettore esprimente un sgRNA irrilevante è stato usato come controllo (sgCtr). (b) Come in (a) usando un vettore lentivirale esprimente una variante di SpCas9 con fedeltà aumentata (eSpCas9(1.1)). (c) Specificità delle modifiche del DNA, definita come il rapporto di frequenza degli indel (inserzioni-delezioni) tra on target e off target, dopo l’espressione a lungo termine di SpCas9 con sgRNA che bersagliano i loci endogeni di VEGFA e ZSCAN. La percentuale di modifica dei siti off target precedentemente validati è stata quantificata mediante un’analisi TIDE una settimana e 21 giorni posttrasduzione. Per tutti gli esperimenti, le cellule sono state selezionate con puromicina al fine di eliminare le cellule non trasdotte. Nei pannelli (a-c) i dati vengono presentati come

media ± s.e.m. per n = 2 esperimenti indipendenti.

FIGURA 2. Il circuito SLiCES. (a) Schema del circuito SLiCES. SpCas9 viene espressa insieme agli sgRNA diretti alla propria cornice di lettura aperta (ORF) per auto-limitare l’attività e a una sequenza target selezionata. (b) Regolazione dell’espressione di SpCas9 e del gene target EGFP mediante il circuito SLiCES.

Analisi western blot di cellule 293T co-trasfettate con plasmidi esprimenti EGFP, SpCas9 e sgRNA completamente (sgGFP-W) o parzialmente corrispondenti (sgGFP-M) alla sequenza codificante EGFP in combinazione con tre sgRNA che bersagliano la ORF di SpCas9 (sgCas-a, -b, -c) oppure con un sgRNA di controllo (sgCtr), come indicato. La corsia (-) corrisponde a un campione di riferimento contenente soltanto il sgCtr non di bersagliamento. L’efficienza di trasfezione è stata normalizzata usando il plasmide di espressione di MHC-Iα con tag roTag (Trasf-ctr). SpCas9 è stata rilevata usando un anticorpo anti-FLAG. Il grafico in basso riporta il rapporto tra le percentuali dei diminuiti livelli di EGFP ottenuti usando un sgGFP-W (on target) e le percentuali ottenute con sgGFP-M (off target) in presenza di sgCasa, -b, -c come indicato. (c) Specificità per il target dell’attività di SpCas9 usando circuiti SLiCES differenti. I rapporti on/off target sono stati ottenuti dalla percentuale di cellule EGFP-negative dopo il bersagliamento di una singola copia cromosomiale del gene EGFP (cellule 293-iEGFP) con sgGFP-W (on target) rispetto a sgGFP-M (off target) in combinazione con circuiti SLiCES differenti (sgCas-a, -b o -c) o con un sgRNA non di bersagliamento (sgCtr), come indicato nel grafico. (d) Specificità per il target dell’attività di SpCas9 espressa come rapporti on/off target come in (c) usando sgRNA ottimizzati, come indicato nel grafico. (e) Specificità per il target dell’attività di SpCas9 espressa come rapporti on/off target usando differenti circuiti auto-limitanti applicati a un modello di sostituzione genica. I rapporti on/off target sono stati ottenuti dalla percentuale di cellule EGFP-positive generate mediante la riparazione per omologia da parte di SpCas9 della mutazione EGFP-Y66S con il sgRNA di sgGFP-M (on target) rispetto a quello di sgGFP-W (off target) in combinazione con un plasmide di DNA (recante la sequenza di EGFP di tipo selvaggio) in

cellule 293-iY66S contenenti una singola copia di un gene EGFP mutato. (f) Formazione di indel indotta dal circuito SLiCES (sgCas-a-opt) che bersaglia i loci di VEGFA, ZSCAN2, EMX1 e i loro rispettivi siti off target validati. L’aumento di un determinato numero di volte (F.I.) dei rapporti on/off target con il sgCasa-opt rispetto al sgCtr è riportato sotto i grafici per ciascun sito off target. La percentuale di modifica è stata quantificata mediante un’analisi TIDE. Le barre di errore rappresentano s.e.m. per n ≥ 2.

FIGURA 3. Regolazione dell’espressione di SpCas9 ed EGFP-Y66S mediante il circuito SLiCES. Western blot di cellule co-trasfettate con plasmidi esprimenti sgRNA di EGFP-Y66S e SpCas9 perfettamente corrispondenti (sgGFP-M) o contenenti un appaiamento errato (sgGFP-W) alla sequenza target di EGFP-Y66S insieme a sgRNA specifici per la ORF di SpCas9 (sgCas-a, -b, -c) oppure a un sgRNA di controllo (sgCtr), come indicato. La corsia (-) corrisponde a un campione di riferimento contenente soltanto il sgCtr non di bersagliamento. L’efficienza di trasfezione è stata normalizzata usando il plasmide di espressione di MHC-Ia con tag roTag (Trasf-ctr). SpCas9 è stata rilevata usando un anticorpo anti-FLAG. Il grafico in basso riporta il rapporto tra le percentuali dei livelli di diminuzione della EGFP-Y66S ottenuti usando un sgGFP-M (on target) e le percentuali ottenute con sgGFP-W (off target) in presenza di sgCas-a, -b, -c come indicato.

FIGURA 4. Distruzione di EGFP da parte dei circuiti SLiCES. (a) Percentuale di cellule 293-iEGFP non fluorescenti ottenute dopo l’espressione di differenti circuiti di SpCas9 auto-limitanti. Le cellule sono state trasfettate con sgRNA perfettamente corrispondenti (sgGFP-W) o contenenti un appaiamento errato (sgGFP-M) alla ORF di EGFP insieme a tre sgRNA che bersagliano la ORF di SpCas9 (sgCas-a, -b, -c) oppure a un sgRNA di controllo (sgCtr), come indicato. La linea tratteggiata rappresenta il valore medio delle cellule EGFP-negative. Le barre di errore rappresentano s.e.m. per n =2. I dati sono presentati come media ± s.e.m. per n = 2 esperimenti indipendenti. (b) Saggio rappresentativo di T7 Endonucleasi derivanti da cellule che esprimono circuiti SLiCES differenti. Il rapporto on/off target è stato calcolato misurando la formazione di indel nel gene EGFP in presenza di sgGFP-W o sgGFP-M insieme a un sgRNA di controllo o ai tre sgRNA che bersagliano la ORF di SpCas9 (sgCas-a, -b, -c). La corsia (-) corrisponde a un campione di riferimento contenente soltanto il sgCtr non di bersagliamento. (*) Indica la banda prevista ottenuta dall’attività della T7 endonucleasi.

FIGURA 5. Effetto dell’ottimizzazione dei sgRNA sul circuito SLiCES. (a) Percentuale di cellule 293-iEGFP non fluorescenti ottenute dopo la trasfezione di SpCas9 con sgRNA che bersagliano EGFP (sgGFP-W o sgGFP-W-opt, se ottimizzati) o contenenti un singolo appaiamento errato (sgGFP-M o sgGFP-M-opt, se ottimizzati) insieme al sgCas-a. La versione ottimizzata del sgRNA di SLiCES (sgCas-a-opt) è stata analizzata con sgRNA che bersagliano EGFP sia standard sia ottimizzati, come indicato. I dati sono presentati come media ± s.e.m. per n = 2 esperimenti indipendenti. (b) Percentuale di cellule 293-iEGFP non fluorescenti ottenute dopo la trasfezione di SpCas9 con sgRNA che bersagliano EGFP (sgGFP-W) o contenenti un singolo appaiamento errato (sgGFP-M) insieme al sgCas-c o al sgCas-c-opt, se ottimizzati. I dati sono presentati come media ± s.e.m. per n = 2 esperimenti indipendenti. (c) Analisi western blot di cellule 293T co-trasfettate con SpCas9 e sgCas9-a o sgCas-a-opt e sgCas9-c o sgCas-c-opt. SpCas9 è stata rilevata usando un anticorpo anti-FLAG. L’efficienza di trasfezione è stata normalizzata usando il plasmide di espressione di MHC-Iα con tag roTag (Trasf-ctr).

FIGURA 6. Specificità della riparazione per omologia mediata da SLiCES.

Percentuale di cellule 293-iY66S fluorescenti ottenute dopo la trasfezione con un plasmide di DNA donatore (recante un frammento non fluorescente di wt-EGFP), SpCas9, insieme a sgRNA corrispondenti (sgGFP-M) o contenenti un appaiamento errato alla sequenza target di EGFP-Y66S (sgGFP-W) e a tre sgRNA che bersagliano la ORF di SpCas9 (sgCas-a, -b, -c o sgCas-a-opt) oppure a un sgRNA di controllo (sgCtr), come indicato. I dati sono presentati come media ± s.e.m. per n = 2 esperimenti indipendenti. La riparazione per omologia in assenza di sgGFP-M o sgGFP-W era di circa lo 0,01%.

FIGURA 7. Attività di SLiCES con CRISPR1/Cas9 di Streptococcus thermophilus. (a) Rappresentazione schematica del reporter NHEJ basato su SV5-GFP. La sequenza target riconosciuta dal sgRNA di interesse è inserita tra il tag SV5 e le sequenze codificanti EGFP, con la ORF di EGFP posizionata fuori cornice di lettura rispetto al codone di avvio ATG per la ORF del tag SV5. Un codone di arresto è stato aggiunto alla cornice di lettura del SV5, immediatamente dopo la sequenza target, per arrestare la sua traduzione. Dopo il taglio mediato da SpCas9 della sequenza target e la riparazione mediante NHEJ, vengono inserite in modo casuale mutazioni di inserzioni e delezioni in corrispondenza del punto di rottura, consentendo lo spostamento della ORF di EGFP nella stessa cornice di lettura della ORF del tag SV5. L’espressione del SV5-EGFP viene analizzata mediante la rilevazione in fluorescenza o mediante analisi western blot. (b) Valutazione dell’attività di St1Cas9 espressa attraverso il sistema SLiCES. Western blot di cellule 293T trasfettate con St1Cas9, il reporter NHEJ recante una sequenza target che si appaia completamente al sgRep-SV5 (NHEJ-Rep.W) o includente un appaiamento errato (NHEJ-Rep.M), il sgRNA di sgRep-SV5 e tre sgRNA differenti che bersagliano St1Cas9 (sgCas- St1, -2, -3). I tagli mediati da St1Cas9 vengono rilevati mediante lo spostamento di cornice lettura della ORF di EGFP e dall’espressione di SV5-EGFP da parte del reporter NHEJ come descritto in (a). La corsia (sgCtr) corrisponde a un campione trasfettato con sgRNA non di autobersagliamento; la corsia (-) corrisponde a un campione trasfettato con un sgRNA non di bersagliamento. St1Cas9 è stata rilevata usando un anticorpo anti-FLAG. Il Western blot è rappresentativo di n = 2 esperimenti indipendenti. (c) La modulazione dell’espressione di St1Cas9 mediante circuiti auto-limitanti aumenta la specificità on target. Rapporti on/off target calcolati da livelli di espressione di SV5-EGFP ottenuti da cellule trasfettate con NHEJRep. W o NHEJ-Rep.M insieme a sgRep-SV5 in combinazione con sgRNA che bersagliano St1Cas9 (sgCas-St1, -2, -3) o con sgRNA non di auto-bersagliamento sgCtr come in (b). I dati sono presentati come media ± s.e.m. per n = 2 esperimenti indipendenti.

FIGURA 8. Il sistema lentiSLiCES. (a) Rappresentazione grafica del vettore virale lentiSLiCES. (b) Fasi necessarie per la produzione dei vettori virali lentiSLiCES. L’espressione di SpCas9 viene impedita nelle cellule batteriche per consentire l’amplificazione del plasmide tramite l’introduzione di un introne di mammifero all’interno della cornice di lettura di SpCas9. La produzione di particelle virali lentiSLiCES viene ottenuta nelle cellule che esprimono stabilmente il repressore di tetraciclina (TetR) per impedire l’espressione di SpCas9 e del sgRNA auto-limitante sgCas guidata dai promotori reprimibili da Tet. Nelle cellule target l’assenza del TetR consente l’espressione del circuito lentiSLiCES che porta alla modifica del genoma target e alla simultanea regolazione negativa di SpCas9.

FIGURA 9. Comportamento del circuito lentiSLiCES nelle cellule di impaccamento del vettore virale. Analisi western blot di cellule 293TR trasfettate con EGFP e vettori di trasferimento auto-limitanti o non auto-limitanti recanti sgGFP-W (rispettivamente, lentiSLiCES-W o lentiCtr-W) o con lentiSLiCES recante un sgRNA non di bersagliamento (lentiSLiCES-Ctr). Le colture sono state trattate come indicato con doxiciclina per regolare positivamente l’espressione di SpCas9 e del sgCas-a di auto-bersagliamento. SpCas9 è stata rilevata usando un anticorpo anti-FLAG. Il Western blot è rappresentativo di n = 2 esperimenti indipendenti.

FIGURA 10. Modifica del genoma con vettori lentiSLiCES. (a) Silenziamento di EGFP da parte dei vettori lentiSLiCES. Curve di andamento temporale delle percentuali di cellule 293-multiEGFP EGFP-negative, a seguito della trasduzione con un vettore lentivirale recante sgRNA di auto-bersagliamento (lentiSLiCES) o non di auto-bersagliamento (lentiCtr) in combinazione con sgRNA di sgGFP-W (on target) o di sgGFP-M (off target), come indicato nel grafico. (b) Specificità per il target di SpCas9 trasportata tramite il lentiSLiCES. I rapporti on/off target sono stati calcolati dalle percentuali di cellule EGFP-negative riportate in (a). Al di sotto dei grafici è riportato l’aumento di un determinato numero di volte (F.I.) della specificità calcolato dai rapporti on/off target in corrispondenza di ciascun punto temporale. (c) Formazione di indel indotta dai vettori lentiSLiCES in corrispondenza dei loci di ZSCAN e VEGFA e in corrispondenza dei loro siti off target validati. La percentuale di modifica è stata quantificata mediante un’analisi TIDE su DNA genomico raccolto 20 giorni post-trasduzione e mediante selezione con blasticidina. I valori indicano i rapporti on/off target calcolati da indel ottenuti con ciascun sito off target. (d) Livelli di espressione di SpCas9 ai punti temporali indicati dopo la trasduzione con lentiSLiCES o con lentiCtr. SpCas9 è stata rilevata usando un anticorpo anti-FLAG. (e) Attività di SpCas9 monitorata mediante i livelli di proteina SV5-EGFP prodotti dal plasmide reporter NHEJ trasfettato in cellule 293-multiEGFP prima o 28 giorni dopo la trasduzione e rilevati 2 giorni o 30 giorni post-trasduzione, come indicato, con lentiSLICES che bersagliano (lentiSLiCES-W) o non bersagliano EGFP (lentiSLiCES-Ctr). L’attività del vettore lentiCtr-W non auto-limitante che bersaglia EGFP è stata monitorata a punti temporali identici per comparazione. Le barre di errore rappresentano s.e.m. per n =2.

SEZIONE SPERIMENTALE DISCUSSIONE

Per valutare l’attività off-target prodotta dall’espressione a lungo termine di SpCas9, cellule 293-iEGFP recanti una singola copia cromosomiale di EGFP sono state trasdotte con un vettore lentivirale esprimente SpCas9 insieme a sgRNA che possono appaiarsi completamente (sgGFP-W) o parzialmente (sgGFP-M o sgGFP-MM) a EGFP. La tolleranza di SpCas9 per singoli (sgGFP-M) o doppi (sgGFP-MM) appaiamenti errati nel taglio di EGFP consente la quantificazione della specificità della nucleasi. Sebbene la percentuale di cellule EGFP-negative ottenuta con il sgRNA on-target raggiungesse rapidamente un plateau 10 giorni post-infezione, i due sgRNA disappaiati hanno generato knock-out di EGFP aspecifici che si accumulavano nel tempo (Figura 1A). Il trasporto della variante più specifica eSpCas9(1.1) recentemente sviluppata (Slaymaker, I. M. et al. Science 2016, 351, 84–88) guidata dagli stessi sgRNA provoca soltanto parzialmente la reversione dell’accumulo dipendente dal tempo dei tagli off-target (Figura 1B). Sistematicamente, l’analisi di due loci genomici (ZSCAN e VEGFA) e dei siti offtarget correlati (Kleinstiver, B. P. et al. Nature 2016, doi:10.1038/nature16526), indicava che i rapporti on/off-target diminuivano nel tempo, confermando pertanto un aumento dei tagli off-target (Figura 1C). Questi risultati mostrano chiaramente che la distribuzione di SpCas9 tramite un sistema lentivirale convenzionale è correlata a un aumento dell’attività off-target e ciò è particolarmente evidente nel tempo per via dell’espressione prolungata di SpCas9.

Per generare un picco di attività di SpCas9 transitorio nelle cellule target secondo la presente invenzione, è stata sviluppata una circuiteria di Cas9 autolimitante per una sicurezza migliorata (SLiCES) (schematizzata nella Figura 2a). La circuiteria SpCas9 auto-limitante è stata impostata nelle cellule esprimenti EGFP usando tre sgRNA differenti che bersagliano tre regioni della sequenza codificante SpCas9 (sgCas-a, -b e -c) (si veda la Discussione supplementare di seguito) che, secondo quanto mostrato, regolano negativamente in modo efficiente i livelli di SpCas9 quando co-espressi con SpCas9 (Figura 2b, pannello superiore). La co-espressione di uno qualsiasi dei tre sgRNA di auto-bersagliamento (sgCas-a,-b o –c) insieme a un sgRNA che si appaia completamente alla sequenza target di EGFP (sgGFP-W) ha ridotto la EGFP intracellulare a livelli (4-10% di proteina residua) simili al contenuto di EGFP rilevato nelle cellule co-trasfettate con lo stesso sgGFP-W e con un sgRNA di controllo (sgCtr) (Figura 2b). Questi risultati dimostrano che l’attività di modifica del DNA non è compromessa quando SpCas9 viene inattivato tramite la circuiteria SLiCES. Un esperimento simile effettuato usando un sgRNA che bersaglia EGFP con un singolo appaiamento errato all’interno della regione di discendenza in corrispondenza dell’ultimo nucleotide prima della sequenza PAM (motivo adiacente protospaziatore) (sgGFPM) ha mostrato una regolazione negativa aspecifica di EGFP, con una diminuzione quasi del 60% dei livelli intracellulari di EGFP. Questo effetto era meno pronunciato (~25-55% di riduzione) nelle cellule in cui l’espressione di SpCas9 veniva regolata negativamente tramite la circuiteria di Cas9 autolimitante (sgCas-a, -b o –c) (Figura 2b). I differenti livelli di regolazione negativa aspecifica di EGFP riflettevano strettamente la capacità da parte di un singolo sgRNA di diminuire i livelli intracellulari di SpCas9: sgCas-a, che generava la regolazione negativa aspecifica di EGFP più bassa (73% di EGFP residua, Figura 2b), mostrava l’attività di distruzione di SpCas9 più elevata (Figura 2b, pannello superiore). Risultati simili sono stati ottenuti con un esperimento reciproco in cui le cellule venivano trasfettate transitoriamente con un target EGFP mutato caratterizzato da una sostituzione di un singolo nucleotide (EGFP-Y66S) che era completamente appaiato alla sequenza di sgGFP-M (Figura 3). La specificità per il target migliorata di circa 2-3 volte (Figura 1b, pannello inferiore) come definito dal rapporto tra l’attività di SpCas9 nelle cellule bersagliate dal sgRNA completamente appaiato rispetto al sgRNA disappaiato trasportato da SLiCES, è stata confermata anche in cellule 293-iEGFP recanti una singola copia cromosomiale del gene EGFP (miglioramento di 5 volte) (Figura 2C e Figura 4). Per verificare se l’ottimizzazione dei sgRNA può migliorare ulteriormente la specificità on target, i sgRNA sono stati modificati strutturalmente per aumentare la loro trascrizione e l’interazione con SpCas9 (Chen, B. et al. Cell 2013, 155, 1479–1491). L’ottimizzazione del sgRNA che bersaglia SpCas9, che potenzia l’efficienza della rimozione della nucleasi, ha prodotto un miglioramento significativo nella specificità di taglio (Figura 2d e Figura 5a) di circa 9 volte. Sistematicamente, l’ottimizzazione del sgRNA di SpCas9 auto-inattivante meno attivo (sgCas-c) determinava un’attività off-target ridotta parallelamente a un’ulteriore diminuzione nei livelli intracellulari di SpCas9 (Figura 5b e c). Al contrario, l’ottimizzazione del sgRNA diretto verso il sito target (sgGFP-W-opt e sgGFP-M-opt) non aumentava la specificità in combinazione con sgCas9-a o con sgCas9-a-opt (Figura 2d e Figura 5a). Presumibilmente, la regolazione negativa potenziata di EGFP guidata da sgGFP-W-opt, che era anche correlata all’aumento dei tagli off-target indotti dal sgRNA di sgGFP-M-opt, non poteva essere contrastata da una regolazione negativa di SpCas9 sufficientemente rapida mediata da entrambe le versioni del sgRNA di SpCas9 auto-limitante (Figura 2d e Figura 5a). In conclusione, la circuiteria SLiCES produceva la specificità per il target più elevata quando composta da un sgRNA ottimizzato diretto verso SpCas9 (sgCas-a-opt) regolando negativamente in modo efficiente SpCas9, in combinazione con un sgRNA non ottimizzato che bersaglia il sito di interesse (sgGFP-W/M). È stato effettuato un esperimento parallelo volto a validare la specificità on-target della circuiteria auto-limitante di SpCas9 in cellule recanti una singola copia cromosomiale di una EGFP non fluorescente (Y66S). In queste cellule, 293-iY66S, l’attività di SpCas9 è stata misurata mediante il recupero della fluorescenza di EGFP a seguito della sostituzione del gene mutato con un allele di tipo naturale tramite la riparazione per omologia mediata da SpCas9 in presenza di un plasmide donatore co-trasfettato recante un frammento non fluorescente di EGFP di tipo naturale. Rispetto all’approccio con SpCas9 convenzionale (sgCtr), la specificità per il target per la riparazione per omologia di EGFP veniva migliorata di 4 volte usando la circuiteria SLiCES (sgCas-a) (Figura 2e e Figura 6). Un ulteriore miglioramento (di 7,5 volte) è stato ottenuto con la versione ottimizzata di sgCas-a (sgCas-a-opt) (Figura 2e e Figura 6), come precedentemente osservato negli esperimenti di silenziamento.

Per dimostrare che la metodologia SLiCES è facilmente trasferibile ad altre nucleasi guidate da RNA, uno SLiCES è stato adattato a Cas9 derivante da Streptococcus thermophilus (St1Cas9) usando sgRNA specifici (sgCas-St1-1, -2 e -3) per indurre la regolazione negativa di St1Cas9 (Figura 7). Successivamente, la specificità per il target della SpCas9 convenzionale e del circuito SLiCES (sgCas-a) per le sequenze endogene è stata analizzata comparativamente. Quattro siti genomici (VEGFA, ZSCAN e due target nel locus EMX1) e due siti off target validati precedentemente (Kleinstiver, B. P. et al. Nature 2016, doi:10.1038/nature16526) per ciascun sgRNA sono stati analizzati mediante tracciatura degli indel tramite decomposizione (TIDE) (Brinkman, E. K., et al., Nucleic Acids Res.2014, 42, e168) rivelando che l’approccio SLiCES migliorava la specificità del clivaggio di approssimativamente 1,5-2,5 volte (Figura 2f).

La circuiteria SpCas9/sgRNA auto-limitante con il miglior sgRNA auto-limitante selezionato (sgCas-a-opt) è stata successivamente trasferita in un sistema lentivirale (Figura 8) per generare lentiSLiCES. Per evitare l’espressione dispersiva di SpCas9, e la conseguente degradazione di DNA durante la preparazione del plasmide nei batteri, è stato introdotto un introne nella cornice di lettura aperta di SpCas9 per formare una cassetta di espressione suddivisa in due esoni (esone 1 e 2, schematizzato nella figura 8). Poiché nei batteri non si verifica splicing, i trascritti prodotti vengono traslati in batteri come frammento di SpCas9 cataliticamente inattivo. Successivamente, per aggirare l’attività di auto-clivaggio durante la produzione del vettore lentivirale, sono stati introdotti promotori inducibili da tetraciclina (TetO) per regolare l’espressione sia di SpCas9 sia del sgRNA di autobersagliamento. Il promotore TetO viene regolato negativamente da un repressore specifico, TetR, che viene espresso nelle cellule di produzione e, in assenza di doxiciclina, inibisce la trascrizione tramite il legame alle sequenze dell’operatore tetraciclina situate all’interno della regione di promotore (schematizzata nella figura 8b). La diminuzione nei livelli intracellulari di SpCas9 nelle cellule di produzione osservata con l’attivazione della circuiteria auto-limitante con doxiciclina dimostra il requisito stringente dei promotori reprimibili in corrispondenza delle fasi di produzione virale al fine di ottenere particelle di lentiSLiCES inalterate (Figura 9). Per valutare l’attività on/off-target del lentiSLiCES, la percentuale di cellule 293-multiEGFP EGFP-negative è stata seguita a punti temporali differenti dopo la trasduzione con vettori lentivirali auto-limitanti recanti lo specifico sgRNA sgGFP-W (lentiSLiCES-W) o il sgGFP-M disappaiato (lentiSLiCES-M) e comparata all’effetto ottenuto con vettori lentivirali non auto-limitanti recanti gli stessi sgRNA diretti verso EGFP (lentiCtr-W o –M). Sia lentiCtr-W sia lentiSLICES-W mostravano un’attività on-target analogamente stabile a tutti i punti temporali all’interno di un periodo di 3 settimane (Figura 10a). Al contrario, la percentuale di cellule di EGFP bersagliate in modo aspecifico dal sgGFP-M aumentava nel tempo con il sistema di distribuzione lentiCtr; questo evento non è stato osservato con lo stesso sgRNA distribuito tramite lentiSLiCES per tutto il periodo di 3 settimane (Figura 10a). Pertanto, lentiSLiCES non generava alcun accumulo off target nel tempo (comparare il giorno 7 e il giorno 21, Figura 10b). Sistematicamente, al punto finale abbiamo osservato la differenza maggiore tra i rapporti tra le cellule EGFP-negative ottenute con il sgGFP-W rispetto al sgGFP-M distribuito tramite il lentiSLICES (rapporto on/off target ~5) o con i sistemi lentiCtr (rapporto on/off-target ~2) (Figura 10b). In accordo con questi risultati, la specificità per il target del lentiSLiCES verso le sequenze endogene (loci ZSCAN e VEGFA) mostrava un miglioramento significativo rispetto al lentiCtr non auto-limitante (approssimativamente 2-4 volte) (Figura 10c).

Questi dati suggeriscono che l’espressione diminuita di SpCas9 ottenuta tramite il circuito SLiCES migliora la specificità di modifica. Infatti, a punti temporali precoci (2 giorni post-trasduzione) la proteina SpCas9 era già molto meno presente nelle cellule trattate con il lentiSLiCES rispetto alle cellule trattate con il controllo lentivirale non auto-limitante (lentiCtr) (Figura 10d). In particolare, nelle cellule trattate con lentiCtr i livelli di SpCas9 rimanevano stabili e più elevati rispetto alle cellule trattate con lentiSLiCES in cui non era possibile rilevare nucleasi a un qualsiasi punto temporale successivo. Per valutare funzionalmente il livello di attività di SpCas9 distribuita tramite il lentiSLiCES, è stato impiegato un plasmide reporter del riparo del DNA tramite unione delle estremità non omologhe (NHEJ) (NHEJ-Rep.W) esprimente il tag 5 di virus di scimmia fuso con EGFP (SV5-EGFP) solo a seguito dell’attività della nucleasi di precisione (schematizzato nella Figura 7a). Il NHEJ-Rep.W ha rivelato che SpCas9 distribuita tramite il lentiCtr era attiva in corrispondenza di tutti i punti temporali a seguito della trasduzione, mentre l’attività di SpCas9 recata dal lentiSLiCES veniva rilevata 2 giorni dopo la trasduzione, ma non poteva essere rilevata a punti temporali successivi (30 giorni) (Figura 10e).

Le limitazioni delle applicazioni di SpCas9 in vivo emergono chiaramente dai dati della presente invenzione, i quali mostrano che l’espressione a lungo termine della nucleasi distribuita tramite i sistemi lentivirali porta all’accumulo di tagli indesiderati. Questo effetto dannoso non poteva essere superato neppure con la variante più specifica recentemente sviluppata di SpCas9, eSpCas9(1.1) (Slaymaker, I. M. et al. Science 2016, 351, 84–88). La strategia con circuiteria auto-limitante, lentiSLiCES, della presente invenzione sfrutta l’efficienza della trasporto su base virale e contemporaneamente limita la quantità di SpCas9 dopo la trasduzione e l’integrazione virale. Limitando l’espressione di Cas9 in termini di tempo e abbondanza, SLiCES evita l’accumulo di tagli off target che invece vengono osservati con l’uso degli approcci di trasporto di Cas9 convenzionali. Per migliorare ulteriormente la strategia SLiCES, potranno essere usati vettori lentivirali integrasidifettivi (IDLV) (Chick, H. E. et al. Hum. Gene Ther. 2012, 23, 1247–1257) per mantenere l’efficienza su base virale nel trasporto cellulare, potenziando contemporaneamente la natura transiente di tipo a picco dell’espressione di Cas9. Sarà possibile migliorare una varietà di applicazioni di Cas9, come la regolazione dell’espressione genica ottenuta mediante la combinazione con i domini di attivazione della trascrizione (Konermann, S. et al., Nature 2015, 517, 583–588; Mali, P. et al., Nat. Biotechnol.2013, 31, 833–838; Hilton, I. B. et al., Nat. Biotechnol.

2015, 33, 510–517) tramite il loro adattamento a lentiSLiCES. Infatti, questi approcci, così come la modulazione perfezionata dell’espressione genica ottenuta con un circuito di interruttore d’emergenza genetico (Moore, R. et al., Nucleic Acids Res. 2015, 43, 1297–1303; Kiani, S. et al. Nat. Methods 2015, 12, 1051–1054) potranno essere potenziati mediante un approccio auto-limitante regolabile per limitare nel tempo la produzione mediata da Cas9 dei promotori cellulari bersagliati. Infine, lo SLiCES può migliorare significativamente alcune procedure di ingegnerizzazione del genoma di Cas9 recentemente sviluppate che sono sensibili a un’attività nucleasica continua. Per esempio, le tecniche attuali per sostituire in modo efficiente le sequenze genomiche usano Cas9 per aumentare la velocità di riparazione per omologia; tuttavia, queste tecniche sono sovente limitate dal continuo ri-taglio da parte di Cas9 della sequenza genomica appena sostituita (Paquet, D. et al., Nature 2016, 533, 125–129), cosa che potrà essere facilmente superata mediante l’inattivazione della nucleasi.

DISCUSSIONE SUPPLEMENTARE

L’origine di Cas9 dalle cellule procariotiche, anche dopo l’ottimizzazione dei codoni all’uomo, consente di selezionare facilmente svariati possibili sgRNA non ripetitivi (come sgCas-a, -b, -c) con pochissimi siti off target probabili nel genoma eucariotico. Ciò implica che la possibilità di generare nuovi siti off target potenziali data la presenza di un secondo sgRNA potrà essere considerata pressoché trascurabile.

Come dimostrato dalla prestazione migliorata ottenuta con St1Cas9 integrata all’interno del circuito auto-limitante, è dimostrato che lo SLiCES viene adattato facilmente alle nuove varianti emergenti di nucleasi (Esvelt, K. M. et al. Nat. Methods 2013, 10, 1116–1121; Zetsche, B. et al. Cell 2015, 163, 759–771; Ran, F. A. et al. Nature 2015, 520, 186–191; Kleinstiver, B. P. et al. Nature 2016, doi:10.1038/nature16526; Slaymaker, I. M. et al. Science 2016, 351, 84–88) e di sgRNA (Fu, Y., et al. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 279–284) per una modifica del genoma più sicura.

Il sistema SLiCES può essere applicato potenzialmente anche ad altri vettori virali usati per distribuire le nucleasi guidate da RNA, aumentando la specificità della modifica del genoma attraverso i differenti sistemi di delivery. Un esempio è rappresentato dai vettori AAV sfruttati per le varianti di Cas9 di piccole dimensioni (come SaCas9) (Friedland, A. E. et al. Genome Biol.2015, 16, 257) per le quali è concepibile un approccio AAV-SLICES unico semplicemente trasferendo le tecnologie sviluppate per il lentiSLiCES. Tenendo in considerazione l’elevata propensione dei vettori AAV a trasdurre le cellule con molteplicità di infezione elevata (Ruozi, G. et al. Nat. Commun. 2015, 6, 7388), è possibile progettare una strategia di distribuzione per il sistema SLiCES per nucleasi di dimensioni cospicue, come SpCas9, StCas9 o AsCpf1, basata su una miscela di due AAV: uno soltanto per distribuire la nucleasi e un secondo vettore recante i gRNA auto-limitanti e di bersagliamento. Questo approccio sarà simile al sistema muliplasmidico presentato nella Figura 2.

METODI

Plasmidi e oligonucleotidi.

Il Cas9 di S. pyogenes con tag 3XFLAG è stato espresso dal plasmide pX-Cas9, che è stato ottenuto mediante la rimozione di un frammento di NdeI includente la cassetta di espressione del sgRNA derivante da pX330 (un dono di Feng Zhang, Addgene #42230) (Cong, L. et al., Science 2013, 339, 819–823). I sgRNA sono stati trascritti da una cassetta guidata dal promotore U6, derivata da px330 e clonata in pUC19. Gli oligonucleotidi di sgRNA sono stati clonati usando un sito BbsI doppio inserito prima della porzione constante di sgRNA mediante una strategia di clonaggio precedentemente pubblicata (Cong, L. et al., Science 2013, 339, 819– 823). I plasmidi esprimenti Cas9 di S. thermophilus con tag FLAG (pJDS246-CMV-St1-Cas9) e il gRNA di S. thermophilus (pMLM3636-U6-+103gRNA_St1Cas9) erano un dono di Claudio Mussolino (Müller, M. et al. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 2016, 24, 636–644). Gli oligonucleotidi di sgRNA di S. thermophilus sono stati

clonati in pMLM3636-U6-+103gRNA_St1Cas9 usando BsmBI e trascritti da un

promotore U6. L’elenco dei sgRNA e dei siti target impiegati in questo studio è

disponibile nella Tabella 1.

TABELLA 1. Sequenze degli oligonucleotidi usati per costruire i plasmidi di

espressione di sgRNA e le sequenze dei relativi siti target

SpCas9 nome protospaziatore (*) target (**)

gCTCGTGACCACCCTGACCTA accCTCGTGACCACCCTGACCTACGGcgt<GFPW>(SEQ ID N.11) (SEQ ID N.12)

agcCTCGTGACCACCCTGACCTACGGagt<Rep. SV5>(SEQ ID N.13)

gCTCGTGACCACCCTGACCTC

<GFPM>((SEQ ID N.14)

gCTCGTCACCACCCTGACCTC

<GFPMM>(SEQ ID N.15)

GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG gtgGGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGGggt<VEGFA>(SEQ ID N.16) (SEQ ID N.17)

gtgAGTGAGTGAGTGTGTGTGTGGGGggg<VEGFA OT1>(SEQ ID N.18)

atgTGTGGGTGAGTGTGTGCGTGAGGaca<VEGFA OT2>(SEQ ID N.19)

GTGCGGCAAGAGCTTCAGCC catGTGCGGCAAGAGCTTCAGCCGGGgct<ZSCAN>(SEQ ID N.20) (SEQ ID N.21)

ggaGTGTGGCAAGGGCTTCAGCCAGGcct<ZSCAN OT1>(SEQ ID N.22)

ttcATGGGGAAAGAGCTTCAGCCTGGgct<ZSCAN OT2>(SEQ ID N.23)

GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA cctGAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGGctc<EMX1-k>(SEQ ID N.24) (SEQ ID N.25)

caaGAGTCTAAGCAGAAGAAGAAGAGag EMX1-k c<OT2>(SEQ ID N.26)

EMX1-k tcaGAGTTAGAGCAGAAGAAGAAAGGcat<OT1>(SEQ ID N.27)

GGCCTCCCCAAAGCCTGGCCA cagGCCTCCCCAAAGCCTGGCCAGGGagt<EMX1-r>(SEQ ID N.28) (SEQ ID N.29)

EMX1-r aagACCTCCCCATAGCCTGGCCAGGGagg<OT1>(SEQ ID N.30)

EMX1-r cacTCCTCCCCACAGCCTGGCCAGGGgaa<OT2>(SEQ ID N.31)

gTACGCCGGCTACATTGACGG ggcTACGCCGGCTACATTGACGGcgg<Cas-a>(SEQ ID 1) (SEQ ID N.32)

GATCCTTGTAGTCTCCGTCG catGATCCTTGTAGTCTCCGTCGTGGtcc<Cas-b>(SEQ ID 2) (SEQ ID N.33)

GGCTACGCCGGCTACATTGA aacGGCTACGCCGGCTACATTGACGGcgg<Cas-c>(SEQ ID 3) (SEQ ID N.34)

GGGTCTTCGAGAAGACCT

controllo (SEQ ID N.35)

STh1Cas

9

agaGTCCCCTCCACCCCACAGTGCAAGAA NHEJ- GTCCCCTCCACCCCACAGTG Atcc

Rep.W (SEQ ID N.36) (SEQ ID N.37)

agaGTCCCCTCCACCCAACAGTGCAAGAA NHEJ- Atcc

<Rep.M>(SEQ ID N.38)

cagGGCAGAAGGCTGACCCGGCGGAAGA GGCAGAAGGCTGACCCGGCG AAcac

<STh1-1>(SEQ ID 4) (SEQ ID N.39)

agcGCCTACAGAAGCGAGGCCCTGAGAA gGCCTACAGAAGCGAGGCCC Tcct

<STh1-2>(SEQ ID 5) (SEQ ID N.40)

cgcGAGACTAACGAGGACGACGAGAAGA gAGACTAACGAGGACGACGA AAgcc

<STh1-3>(SEQ ID 6) (SEQ ID N.41)

GAGACGATTAATGCGTCTC

controllo (SEQ ID N.42)

(*) La lettera minuscola indica un 5’g aggiuntivo non appaiato.

(**) Gli appaiamenti errati sono evidenziati in grigio, PAM è in grassetto. Le sequenze di contesto intorno al sito target sono in lettere minuscole.

Il plasmide pcDNA5-FRT-TO-EGFP è stato ottenuto subclonando EGFP da pEGFP-N1 in un vettore precedentemente pubblicato (Vecchi, L., et al. J. Biol. Chem.2012, 287, 20007–20015) derivato da pcDNA5-FRT-TO (Invitrogen). pcDNA5-FRT-TO-EGFP-Y66S è stato ottenuto mediante la mutagenesi sito-diretta di pcDNA5-FRT-TO-EGFP. Un frammento troncato non fluorescente di EGFP resistente a sgRNA (1-T203K-stop), ottenuto mediante la mutagenesi sito-diretta del plasmide pcDNA5-FRT-TO-EGFP, è stato amplificato mediante PCR e inserito in sostituzione di EGFP nel plasmide pcDNA5-FRT-TO-EGFP, producendo il plasmide donatore pcDNA5-FRT-TO-rEGFP(1-T203K-stop).

I reporter NHEJ basati su SV5-EGFP impiegati in questa domanda (Rep. SV5, NHEJ-REP.W e NHEJ-Rep.M) sono stati generati mediante il clonaggio nei siti NheI/BspEI degli oligonucleotidi di dsDNA corrispondenti alla sequenza target completa (includente PAM) riconosciuta da un sgRNA di interesse. Il target viene inserito tra il tag SV5 e le sequenze codificanti EGFP, con la sequenza di EGFP posizionata fuori cornice di lettura rispetto al codone di inizio ATG della cornice di lettura aperta (ORF) del tag SV5. Un codone di arresto viene inserito nella cornice di SV5, immediatamente dopo la sequenza target. Il plasmide pcDNA3 MHC-I-roTag è descritto in Petris, G., et al., PloS One 2014, 9, e96700. Le informazioni sulle sequenze del DNA plasmidico prodotte per gli esperimenti descritti in questa applicazione si trovano in Sequenze supplementari e in Elenco delle sequenze. Coltura cellulare e trasfezioni.

Le cellule 293T/17 sono state ottenute da ATCC. Le cellule 293TR, esprimenti costitutivamente il repressore Tet (TetR), sono state generate mediante la trasduzione lentivirale di cellule 293T/17 parentali usando il vettore pLenti-CMV-TetR-Blast (un dono da Eric Campeau, Addgene # 17492) (Campeau, E. et al. PloS One 2009, 4, e6529) e sono state selezionate in pool con 5 µg/ml di blasticidina (Life Technologies). Le cellule 293-multiEGFP sono state generate mediante la trasfezione stabile di pEGFP-IRES-Puromicina e selezionate con 1 µg/ml di puromicina. Le cellule 293-iEGFP e 293-iY66S (sistema Flp-In T-REx; Life Technologies) sono state generate mediante la ricombinazione mediata da Flp usando, rispettivamente, pcDNA5-FRT-TO-EGFP o pcDNA5-FRT-TO-EGFP-Y66S come plasmidi donatore, in cellule recanti un singolo sito FRT genomico ed esprimenti stabilmente il repressore di tetraciclina (293 T-Rex Flp-In, coltivate in terreno di selezione contenente 15 μg/ml di blasticidina e 100 μg/ml di zeocina - Life Technologies). 293-iEGFP e 293-iY66S sono state coltivate in terreno di selezione contenente 15 μg/ml di blasticidina e 100 μg/ml di igromicina (Life Technologies). I cloni di 293-iEGFP e 293-iY66S selezionati sono stati analizzati per quanto riguarda la specificità di integrazione mediante la perdita di resistenza alla zeocina. Tutte le linee cellulari sono state coltivate in DMEM integrato con FBS 10%, L-Gln 2 mM, 10 U/ml di penicillina, e 10 μg/ml di streptomicina e gli antibiotici appropriati indicati sopra.

Le cellule 293T, 293-iEGFP o 293-iY66S sono state trasfettate in 12 o 24 multipozzetti con 250-500 ng di pX-Cas9 e 250-500 ng del plasmide pUC19-sgRNA desiderato usando TransIT-LT1 (Mirus Bio), secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state raccolte 2-4 giorni dopo la trasfezione oppure come indicato.

Nelle cellule 293-iEGFP e 293-iY66S l’espressione di EGFP è stata indotta mediante trattamento con 100 ng/ml di doxiciclina (Cayman Chemical) per 20 ore prima della misurazione della fluorescenza.

Vettori lentiSLiCES.

Il lentiSLiCES è stato preparato dal vettore di trasferimento lentiCRISPRv1 sostituendo la cassetta EFS-SpCas9-2A-Puro con un frammento SpCas9(introne)-IRES-Blasticidina insieme a un promotore CMV-TetO. L’introne introdotto in SpCas9 (vedere Informazioni di Sequenza Supplementari) deriva dall’introne della regione V del precursore della catena pesante di immunoglobulina di topo (GenBank ID: M12880.1), precedentemente usato con differenti esoni fiancheggianti (Vecchi, L., et al., J. Biol. Chem. 2012, 287, 20007–20015; Petris, G., et al., PloS One 2014, 9, e96700; Li, E. et al. Protein Eng.1997, 10, 731–736). L’EMCV-IRES che regola la traslazione di un gene di resistenza alla blasticidina è stato clonato a valle rispetto a SpCas9 per consentire la selezione tramite antibiotico delle cellule trasdotte, anche dopo la generazione delle mutazioni di spostamento di cornice di lettura a seguito dell’auto-clivaggio mediante Cas9 del vettore integrato. sgCtr-opt o sgCas9-a-opt sono stati assemblati con un promotore H1-TetO all’interno del plasmide pUC19, amplificati con PCR e successivamente clonati in un sito EcoRI esclusivo in lentiCRISPRv1 e selezionati per l’orientamento desiderato. I sgRNA che bersagliano il locus selezionato sono stati clonati nella cassetta di sgRNA di lentiCRISPRv1 usando i due siti BsmBI, seguendo procedure standard (Brinkman, E. K., et al., Nucleic Acids Res.2014, 42, e168).

Le informazioni sulle sequenze di DNA di lentiSLiCES si possono trovare in Sequenze Supplementari e in Elenco delle Sequenze.

Produzione del vettore lentivirale.

Le particelle lentivirali sono state prodotte seminando 4x10<6>cellule 293T o 293TR in una piastra da 10 cm, per la produzione rispettivamente di lentiCRISPR o lentiSLiCES. Il giorno dopo, le piastre sono state trasfettate con 10 μg di ciascun vettore di trasferimento insieme a 6,5 μg di vettore di impaccamento pCMV-deltaR8.91 e a 3,5 μg di pMD2.G usando il metodo con polietilenimmina (PEI) (Casini, A., etal., J. Virol. 2015, 89, 2966–2971). Dopo un’incubazione per tutta la notte, il terreno è stato sostituito con DMEM completo fresco e 48 ore dopo il surnatante contenente le particelle virali è stato raccolto, centrifugato a 500 xg per 5 minuti e filtrato attraverso un filtro PES da 0,45 μm.

Dopo la raccolta, i vettori virali lentiSLiCES sono stati concentrati usando polietilenglicole (PEG) 6000 (Sigma). In breve, una soluzione di PEG 6000 al 40% in acqua è stata miscelata in un rapporto 1:3 con il surnatante contenente il vettore e incubata da 3 ore a tutta la notte a 4 °C. Successivamente, la miscela è stata centrifugata per 45 minuti a 2000 xg in una centrifuga refrigerata. I pellet sono stati quindi risospesi in un volume idoneo di terreno DMEM completo. I vettori lentiCRISPR sono stati usati non concentrati. Il titolo dei vettori lentivirali (unità di trascrittasi inversa, RTU) è stato misurato usando il saggio della trascrittasi inversa potenziato dal prodotto (PERT) (Francis, A. C. et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 2014, 30, 717–726).

Infezioni e rilevazione della fluorescenza di EGFP. Un giorno prima della trasduzione, 10<5>cellule 293T, 293-iEGFP o 293-multiEGFP sono state seminate in una piastra a 24 pozzetti. Per i vettori lentiSLiCES, le cellule sono state trasdotte centrifugando 2 RTU/pozzetto per 2 ore a 1600 xg a 16 °C, e successivamente lasciando incubare i vettori con le colture per tutta la notte. A partire da 24 ore posttrasduzione in avanti, le colture sono state selezionate con 5 µg/ml di blasticidina, laddove necessario. Per i vettori lentiCRISPR, sono state usate 0,5 RTU/pozzetto seguendo lo stesso protocollo di trasduzione e le cellule sono state selezionate con 0,5 µg/ml di puromicina.

Quando venivano bersagliate le sequenze EGFP genomiche, le cellule sono state raccolte e analizzate usando un citometro a flusso FACSCanto (BD Biosciences) per quantificare la percentuale di perdita o di induzione di EGFP (esperimenti di sostituzione genica).

Western blot. Le cellule sono state lisate in tampone NEHN (HEPES 20 mM a pH 7,5, NaCl 300 mM, NP400,5%, NaCl, EDTA 1 mM, glicerolo 20% integrato con l’1% di cocktail di inibitori delle proteasi (Pierce)). Gli estratti cellulari sono stati separati mediante SDS-PAGE usando i PageRuler Plus Protein Standard come marcatori di massa molecolare standard (Thermo Fisher Scientific). Dopo l’elettroforesi, i campioni sono stati trasferiti in membrane PVDF di 0,22 μm (GE Healthcare). Le membrane sono state incubate con anti-FLAG di topo (Sigma) per rilevare SpCas9 e St1Cas9, anti-α-tubulina di topo (Sigma), anti-GFP di coniglio (Santa Cruz Biotechnology), mAb anti-roTag di topo (Petris, G., et al., PloS One 2014, 9, e96700) e con gli anticorpi secondari appropriati di capra anti-topo (KPL) o di capra anti-coniglio (Santa Cruz Biotechnology) coniugati a HRP per la rilevazione tramite ECL. Sono state acquisite le immagini e le bande sono state quantificate usando il sistema di rilevazione UVItec Alliance.

Rilevazione di mutazioni genomiche indotte da Cas9. Il DNA genomico è stato isolato 72 ore dopo la trasfezione o come indicato per gli esperimenti di trasduzione, usando il Blood and Tissue Kit DNeasy® (Qiagen). Le reazioni PCR per amplificare i loci genomici sono state effettuate usando la DNA polimerasi Phusion High-Fidelity (Thermo Fisher). I campioni sono stati amplificati usando gli oligonucleotidi elencati nella Tabella 2. I prodotti PCR purificati sono stati analizzati mediante sequenziamento e applicazione dello strumento TIDE (Chen, B., et al. Cell 2013, 155, 1479-1491) oppure mediante il saggio con T7 Endonucleasi 1 (T7E1) (New England Biolabs). In quest’ultimo caso, gli ampliconi di PCR sono stati denaturati e re-ibridizzati prima della digestione con T7E1 per 30 minuti a 37 °C. Il materiale digerito è stato separato usando un gel di agarosio standard e quantificato usando il software ImageJ. La formazione di indel è stata calcolata secondo la seguente equazione: % di modifica genica = 100 x (1 – (1- frazione clivata)<1/2>).

TABELLA 2 - Sequenze degli oligonucleotidi usati per amplificare EGFP, i loci genomici (VEGF-A, ZSCAN, EMX) e i relativi siti off target.

locus oligo1 oligo2

ACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA AGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATC

GFP (SEQ ID N.43) (SEQ ID N.44)

GCATACGTGGGCTCCAACAGGT CCGCAATGAAGGGGAAGCTCGA

VEGFA (SEQ ID N.45) (SEQ ID N.46)

CAGGCGCCTTGGGCTCCGTCA CCCCAGGATCCGCGGGTCAC

VEGFA OT1 (SEQ ID N.47) (SEQ ID N.48)

AGTCAGCCCTCTGTATCCCTGGA GAGATATCTGCACCCTCATGTTCAC VEGFA OT2 (SEQ ID N.49) (SEQ ID N.50)

GACTGTGGGCAGAGGTTCAGC TGTATACGGGACTTGACTCAGACC

ZSCAN (SEQ ID N.51) (SEQ ID N.52)

CACGACTGCAGGCTCATGAGC GAAGCGCTTACCACACACATCAC

ZSCAN OT1 (SEQ ID N.53) (SEQ ID N.54)

AGTCACATGCTGCCTGGATTGAC GTGGAGGAGATTTCTCTAGGAGAG ZSCAN OT2 (SEQ ID N.55) (SEQ ID N.56)

CTGCCATCCCCTTCTGTGAATGT GGAATCTACCACCCCAGGCTCT

EMX1 (SEQ ID N.57) (SEQ ID N.58)

CTGCTGTTTCCTGAAGCTGCCACT CTGCCATGGAAATTCCAGAGGGAAC EMX1-k OT2 (SEQ ID N.59) (SEQ ID N.60)

TGTGGGGAGATTTGCATCTGTGGA TTGAGACATGGGGATAGAATCATGAAC EMX1-k OT1 (SEQ ID N.61) (SEQ ID N.62)

TGAACGAATCAGGTCTGAGAGGATC GAGCTTCACTCCAGAGAGGCTGT

EMX1-r OT1 (SEQ ID N.63) (SEQ ID N.64)

TGCTACTGCTGGCTGCAGAGATG GCATTCGTTTTGGGAGGCAGAGGA EMX1-r OT2 (SEQ ID N.65) (SEQ ID N.66)

Sequenze supplementari

Una sottoserie di nuovi plasmidi prodotti per questo manoscritto:

- Rep. SV5-EGFP (SEQ ID N.67)

- pcDNA5-FRT-TO-rEGFP(1-T203K-stop) donatore (SEQ ID N.68)

- LentiSLiCES (SEQ ID N.10)

Rep. SV5-EGFP (i siti di restrizione NheI e BspEI per clonare la sequenza target sono sottolineati, il codone di arresto in cornice di lettura è in grassetto).

SV5, target, linker, rEGFP [questa CDS di EGFP, resistente a specifici sgRNA che bersagliano EGFP (sgGFP-W, -M) per la quale le sequenze bersaglio sono state inizialmente clonate nella regione target del reporter, è stata ottenuta introducendo le mutazioni sinonime per impedire il suo bersagliamento che sono indicate in grassetto in lettere minuscole ]

SEQ ID N.67:

ATGGGCAAGCCTATCCCCAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGGCTAGCC TCGTGACCACCCTGACCTCCGGAGTGTAggaggaggaggaggcagcggcggaggcgga agcgggCGGCCGCTAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGC CCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGT CCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA TCTGCACCACaGGaAAaCTcCCtGTcCCtTGGCCaACtCTgGTcACtACaCTtACaT aCGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTT CTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTC AAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGAC ACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGC AACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATA TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCA CAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACAC

CCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC

CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCT

GCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTA

CAAATAA

Plasmide donatore pcDNA5-FRT-TO-rEGFP(1-T203K-stop)

donatore rEGFP(1-T203K-stop), i codoni sinonimici impiegati per impedire il ribersaglimento da parte del sgRNA dopo la ricombinazione omologa sono evidenziati in lettere minuscole in grassetto, la modifica nucleotidica principale per ripristinare la fluorescenza di EGFP inducendo la reversione della mutazione Y66S è sottolineata. L’estremità terminale del braccio di omologia 3’ di 410 pb (corrispondente a T203K-stop) è evidenziato in grigio.

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTC

GAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGG

CGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACa GGaAAaCTcCCtGTcCCtTGGCCaACtCTgGTcACtACaCTtACaTaCGGCGTGCA

GTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCC

GCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGAC

GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTG

AACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTG

GGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCG

ACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA

GGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGG

CGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAAGTAA

LentiSLiCES

LTR 5’, promotore hU6, frammento stuffer, scheletro di gRNA, promotore hH1TetO, Sequenza spaziatrice Cas-a, scheletro di gRNA ottimizzato, promotore CMV-TetO, FLAG-NLSSpCas9-NLS, introne, ECMV-IRES, gene di resistenza alla blasticidina, WPRE, LTR-SIN 3’.

TTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGT

TAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGG

AAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGAC

35 ATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGT GCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTG GGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTG CCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTA GAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC CGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCA GGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTG GTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGT GCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAAT TCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGG CAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATC AGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGA TCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCAT CAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAG AGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGAC CTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAA GTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAG TGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTT CTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGT ACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGA GGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAA GCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAG CTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGC CTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACG ACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTC CTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGG AATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTG TGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATA GTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTA TCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCAGGAGGGCCTATTTC CCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTA GAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAA AGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTA TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT GTGGAAAGGACGAAACACCGGAGACGGTTGTAAATGAGCACACAAAATACAC ATGCTAAAATATTATATTCTATGACCTTTATAAAATCAACCAAAATCTTCTTTTT AATAACTTTAGTATCAATAATTAGAATTTTTATGTTCCTTTTTGCAAACTTTTAAT AAAAATGAGCAAAATAAAAAAACGCTAGTTTTAGTAACTCGCGTTGTTTTCTTC ACCTTTAATAATAGCTACTCCACCACTTGTTCCTAAGCGGTCAGCTCCTGCTT CAATCATTTTTTGAGCATCTTCAAATGTTCTAACTCCACCAGCTGCTTTAACTA AAGCATTGTCTTTAACAACTGACTTCATTAGTTTAACATCTTCAAATGTTGCAC CTGATTTTGAAAATCCTGTTGATGTTTTAACAAATTCTAATCCAGCTTCAACAG CTATTTCACAAGCTTTCATGATTTCTTCTTTTGTTAATAAACAATTTTCCATAAT ACATTTAACAACATGTGATCCAGCTGCTTTTTTTACAGCTTTCATGTCTTCTAA AACTAATTCATAATTTTTGTCTTTTAATGCACCAATATTTAATACCATATCAATT TCTGTTGCACCATCTTTAATTGCTTCAGAAACTTCGAATGCTTTTGTAGCTGTT GTGCATGCACCTAGAGGAAAACCTACAACATTTGTTATTCCTACATTTGTGCC TTTTAATAATTCTTTACAATAGCTTGTTCAATATGAATTAACACAAACTGTTGCA AAATCAAATTCAATTGCTTCATCACATAATTGTTTAATTTCAGCTTTCGTAGCAT CTTGTTTTAATAATGTGTGATCTATATATTTGTTTAGTTTCATTTTTTCTCCTATA TATTCATTTTTAATTTTAATTCTTTAATAATTTCGTCTACTTTAACTTTAGCGTTT TGAACAGATTCACCAACACCTATAAAATAAATTTTTAGTTTAGGTTCAGTTCCA CTTGGGCGAACAGCAAATCATGACTTATCTTCTAAATAAAATTTTAGTAAGTCT TGTCCTGGCATATTATACATTCCATCGATGTAGTCTTCAACATTAACAACTTTA AGTCCAGCAATTTGAGTTAAGGGTGTTGCTCTCAATGATTTCATTAATGGTTC AATTTTTAATTTCTTTTCTTCTGGTTTAAAATTCAAGTTTAAAGTGAAAGTGTAA TATGCACCCATTTCTTTAAATAAATCTTCTAAATAGTCTACTAATGTTTTATTTT GTTTTTTATAAAATCAAGCAGCCTCTGCTATTAATATAGAAGCTTGTATTCCAT CTTTATCTCTAGCTGAGTCATCAATTACATATCCATAACTTTCTTCATAAGCAA AAACAAAATTTAATCCGTTATCTTCTTCTTTAGCAATTTCTCTACCCATTCATTT AAATCCAGTTAAAGTTTTTACAATATTAACTCCATATTTTTCATGAGCGATTCTA TCACCCAAATCACTTGTTACAAAACTTGAATATAGAGCCGGATTTTTTGGAATG CTATTTAAGCGTTTTAGATTTGATAATTTTCAATCAATTAAAATTGGTCCTGTTT GATTTCCATCTAATCTTACAAAATGACCATCATGTTTTATTGCCATTCCAAATC TGTCAGCATCTGGGTCATTCATAATAATAATATCTGCATCATGTTTAATACCAT ATTCAAGCGGTATTTTTCATGCAGGATCAAATTCTGGATTTGGATTTACAACAT TTTTAAATGTTTCATCTTCAAATGCATGCTCTTCAACCTCAATAACGTTATATCC TGATTCACGTAATATTTTTGGGGTAAATTTAGTTCCTGTTCCATTAACTGCGCT AAAAATAATTTTTAAATCTTTTTTAGCTTCTTGCTCTTTTTTGTACGTCTCTGTTT TAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGaattctagtagaattgaggtaccAATATTTGC ATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATCCCTATCAGtGAT AGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATAGAGACACCgTACGCCGGCTACATT GACGGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCT AGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTcAATTCT AGATCTTGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGG ATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACA TACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTT ATTACAGGGACAGCAGAGATCCACTTTGGCGCCGGCtcgagGTTGACATTGATT ATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATA TATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAA CGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACT GCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCAT GGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCA CGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGC ACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTC CCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGCTC GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAggatcCGCCACCATGGATTACAAA GACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCA CGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCA CCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGC AAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAA CCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCC GGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATC TGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAG CTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCA CGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACG AGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACC GACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAG TTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGA CGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGA GGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTG CCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCC GGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGG CCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACT GCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCC AGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCG ACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAG GCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGA CCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAA AGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGG CGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAA GATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGC TGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCAC CTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTC CTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCC CTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGA CCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTG GACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGAT AAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGA GTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGG AATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGG ACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAG GACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTG GAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATT ATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGA AGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGA ACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCT GAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATC AACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAA GTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAG CCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTAAGGGGCTCACAGT AGCAGGCTTGAGGTCTGGACATATATATGGGTGACAATGACATCCACTTTG CCTTTCTCTCCACAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATT GCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGT GAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGA ACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAG AAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCT GGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGA ACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGG ACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCG TGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCA GAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGT CGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGA TTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTG AGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCG GCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTA AGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTG AAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGC GCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTC GTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGT GTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCG AGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCA TGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGC GGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAG GGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAA TATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTA TCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGG GACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTG CTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGT GAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGA ATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACC TGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGA AGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCC CTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAG CTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACA GCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAA GAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAA CAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACC TGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACAC CACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCA CCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGT CTCAGCTGGGAGGCGACAAGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTGGTCAA GCTAAGAAAAAGAAAGctagcTGATAATGTACACGCGTGTTATTTTCCACCAT ATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTG ACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTG TTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACA ACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAG GTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGG CACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAAT GGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTA CCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTG TTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGT TTTCCTTTGAAAAACACGATGATAACCGGTATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGA AGAATCCACCCTCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCT CTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTT CACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGG TGCTGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCG CGATCGGAAATGAGAACAGGGGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGCCGAC AGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTGAAGGACAGTGA TGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTG TGGGAGGGCTAAACGCGTTAAGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTT GTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGA TACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCAT TTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGC CCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCC CCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGC TTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGC TGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCG GGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTC TGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCT TCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTT CGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCGTCGACTT TAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAA AAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTT TTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTC TGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTG CTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCT CAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAG

Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI 1. Plasmide con circuiteria di Cas9 autolimitante per una sicurezza migliorata (Self-Limiting Cas9 circuitry for Enhanced Safety [SLiCES]) comprendente: una cassetta di espressione per una molecola di Cas9; una sequenza nucleotidica che codifica un sgRNA che bersaglia la molecola di Cas9 (sgRNA anti-Cas9); e una sequenza nucleotidica che codifica un sgRNA che bersaglia un locus genomico selezionato (sgRNA target); in cui la cassetta di espressione per una molecola di Cas9 e/o la sequenza nucleotidica che codifica un sgRNA anti-Cas9 comprende almeno un introne; e/o la cassetta di espressione per la molecola di Cas9 e/o la sequenza codificante sgRNA anti-Cas9 è preceduta da una sequenza includente un promotore inducibile.
2. 2. Plasmide secondo la rivendicazione 1, in cui l’sgRNA anti-Cas9 viene codificato da una sequenza di 17-23 nucleotidi, preferibilmente partendo da G.
3. 3. Plasmide secondo la rivendicazione 2, in cui la sequenza codificante un sgRNA anti-Cas9 è una sequenza avente almeno un’omologia del 60% rispetto a una sequenza selezionata nel gruppo costituito dalle SEQ ID N.1-6.
4. 4. Plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui la cassetta di espressione per una molecola di Cas9 e/o la sequenza nucleotidica che codifica un sgRNA anti-Cas9 comprende almeno un introne; e la cassetta di espressione per la molecola di Cas9 e/o la sequenza codificante sgRNA anti-Cas9 è preceduta da una sequenza includente un promotore inducibile.
5. 5. Plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui la cassetta di espressione per la molecola di Cas9 e la sequenza codificante sgRNA anti-Cas9 sono entrambe precedute da una sequenza includente un promotore inducibile.
6. 6. Plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui la cassetta di espressione per la molecola di Cas9 comprende almeno un introne nella cornice di lettura aperta (ORF) per formare una cassetta di espressione suddivisa in due o più esoni.
7. 7. Microrganismo geneticamente modificato comprendente il plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
8. 8. Cellula trasfettata con il plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
9. 9. Sistema di delivery virale o artificiale comprendente il plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
10. 10. Plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 o sistema virale o artificiale secondo la rivendicazione 9 per l’uso come medicinale.
11. 11. Plasmide o sistema virale o artificiale per l’uso secondo la rivendicazione 10, nel trattamento di disturbi monogenici, colesterolo elevato, deficit di antitripsina, cancro, diabete, malattie infettive batteriche e virali.
12. 12. Uso in vitro del plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 o del sistema virale o artificiale secondo la rivendicazione 9 in ingegneria genomica, ingegneria cellulare, espressione proteica o biotecnologia.
13. 13. Composizione farmaceutica comprendente il plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 o il sistema virale o artificiale secondo la rivendicazione 9 e almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
14. 14. Processo per preparare il sistema virale secondo la rivendicazione 9, il processo comprendente trasformare un batterio con il plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, detto batterio in cui l’espressione di Cas9 e/o sgRNA è impedita dalla presenza dell’introne o dall’espressione di un repressore specifico per il promotore inducibile o da un altro sistema atto a evitare l’espressione di Cas9 e/o sgRNA; e/o trasfettare una cellula con il plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, detta cellula esprimendo un repressore specifico per il promotore inducibile o detta cellula comprendendo un altro sistema per regolare l’espressione di gRNA Cas9 e/o anti-Cas9.
15. 15. Metodo per impedire l’espressione di una proteina tossica in un batterio, detto metodo comprendendo introdurre almeno un introne nella sequenza nucleotidica codificante detta proteina tossica.
16. 16. Metodo secondo la rivendicazione 15, in cui la proteina tossica è una proteina Cas9.
17. 17. Metodo per impedire il ribersagliamento delle sequenze con modifica genomica di Cas9, detto metodo comprendendo usare un plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.