IT201800020230A1

IT201800020230A1 - Sistema CRISPR-Cas per la terapia genica.

Info

Publication number: IT201800020230A1
Application number: IT102018000020230A
Authority: IT
Inventors: Alessandra Renieri; Silvestro Conticello; Anna Maria Pinto; Ilaria Meloni; Sergio Daga; Francesco Donati; Susanna Croci; Diego Lopergolo
Original assignee: Univ Degli Studi Di Siena; St Per Lo Studio La Prevenzione E La Rete Oncologica Ispro; Azienda Ospedaliera Univ Senese Aous
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-06-19
Also published as: WO2020127272A1; US20230287368A1; EP3898966A1

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: "Sistema CRISPR-Cas per la terapia genica"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda il campo dell’editing genomico, in particolare un sistema CRISPR-Cas mirato ad una sequenza bersaglio genomica mutantaa che porta una o più mutazioni in una cellula bersaglio, nonché ad una particella virale che comprende tale sistema.

Le malattie monogeniche derivano da mutazioni in un singolo gene. Sebbene relativamente rare come entità singole, queste malattie collettivamente colpiscono milioni di persone in tutto il mondo. Finora non sono disponibili trattamenti curativi per la maggior parte dei disturbi monogenici e gli approcci terapeutici si sono essenzialmente basati sul trattamento sintomatico dei pazienti, con l'obiettivo di migliorare la qualità della vita e l'aspettativa di vita dei pazienti.

Tra i disturbi monogenici, la sindrome di Alport (ATS) è una malattia renale ereditaria caratterizzata da insufficienza renale progressiva, sordità neurosensoriale variabile e anomalie oculari. Tale malattia rappresenta una condizione eterogenea derivante da mutazioni nei geni COL4A3, COL4A4 e COL4A5, che codificano per il collagene di tipo IV. Attualmente, una terapia curativa per ATS non è disponibile e la distruzione funzionale dei podociti può essere recuperata solo in parte da trattamenti sintomatici, essendo la dialisi o il trapianto di rene l'unico intervento finale possibile. Quando i pazienti con sindrome di Alport si sottopongono a trapianto renale, può verificarsi una nefrite antiglomerulare della membrana basale (anti-GBM) post trapianto, causa di insufficienza del trapianto, limitando in tal modo l'applicabilità di questa opzione terapeutica in quei pazienti per i quali non è disponibile un donatore compatibile.

Una malattia genetica estremamente debilitante è la malattia di Pompe o malattia da accumulo del glicogeno di tipo II, una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene GAA. Queste mutazioni impediscono all'enzima acido alfaglucosidasi di scomporre efficacemente il glicogeno con il risultato che questo zucchero si accumula fino a livelli tossici nei lisosomi. L'accumulo di glicogeno danneggia gli organi e i tessuti in tutto il corpo, in particolare il cuore, i muscoli scheletrici, il fegato e il sistema nervoso, portando ai segni e sintomi progressivi della malattia di Pompe. La forma classica della malattia di Pompe ad esordio infantile inizia entro pochi mesi dalla nascita. I neonati con questo disturbo tipicamente soffrono di debolezza muscolare (miopatia), scarso tono muscolare (ipotonia), ingrossamento del fegato (epatomegalia) e difetti cardiaci. Se non trattata, questa forma di malattia di Pompe porta alla morte per insufficienza cardiaca entro il primo anno di vita. Il tipo di malattia di Pompe a esordio tardivo può non manifestarsi fino alla tarda infanzia, adolescenza o età adulta e di solito è più lieve rispetto alla forma di insorgenza infantile. La maggior parte delle persone con malattia di Pompe a insorgenza tardiva sperimenta una progressiva debolezza muscolare, specialmente nelle gambe e nel tronco, compresi i muscoli che controllano la respirazione. Man mano che la malattia progredisce, i problemi respiratori possono portare a insufficienza respiratoria. Una terapia enzimatica sostitutiva (ERT) (Myozyme e Lumizyme approvato dalla FDA) è attualmente disponibile per il trattamento della malattia di Pompe, tuttavia è un trattamento che dura tutta la vita e non è completamente risolutivo poiché è difficile raggiungere concentrazioni efficaci dell'enzima ricombinante in tessuti bersaglio nel sistema nervoso centrale. In particolare, Myozyme non è una terapia a singola dose, richiede una somministrazione per tutta la vita poiché veicolato come infusione una volta ogni due settimane e gli studi clinici condotti finora non risultano conclusivi sui benefici del trattamento della forma ad insorgenza tardiva. Nei pazienti con malattia di Pompe infantile, il glicogeno si accumula nei motoneuroni del tronco encefalico e nei neuroni sensoriali, interneuroni e motoneuroni. Un'assenza sistemica precoce del gene GAA nel topo induce una complessa cascata neuropatologica nel midollo spinale indicativa di una neuropatologia diffusa. Il fenotipo neurologico emergente in alcuni pazienti e la frequente persistenza della debolezza muscolare bulbare possono essere attribuiti a lesioni del SNC, non corrette da ERT a causa della presenza della barriera ematoencefalica.

La sindrome di Rett e disturbi correlati rappresentano la seconda causa più comune di disabilità intellettiva in soggetti di sesso femminile con un'incidenza stimata di 1:10.000 nati vivi. Questo disturbo è causato principalmente da mutazioni nei geni MECP2, FOXG1 o CDKL5 ma un certo numero di nuovi geni sono stati recentemente descritti e altri ancora probabilmente sono ancora in attesa di identificazione, in quanto una percentuale variabile di pazienti risulta negativa allo screening per i geni noti. Attualmente non ci sono trattamenti o terapie modificanti la malattia disponibili per la sindrome di Rett. In passato, il rischio principale previsto per il trasferimento del gene MECP2 mediato da vettori virali in vivo è stata la tossicità correlata alla sovraespressione del MECP2 esogeno nei neuroni trasdotti, delineando l'importanza di una fine regolazione originaria. Secondo Collins A.L. et al, "Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice"; (2004), Hum. Mol. Genet., 13 (21): 2679-2689) topi transgenici che sovraesprimono MECP2 soffrivano di tremori, perdita di peso, aspetto arruffato, barcollamenti, convulsioni, danni tissutali, ipoattività, anomalie dell'andatura e/o morte precoce.

La malattia di Parkinson (PD) è la seconda malattia neurodegenerativa più comune al mondo, caratterizzata clinicamente da sintomi motori e non motori, dovuti principalmente alla perdita dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra. Sebbene la maggior parte dei casi di PD sia sporadica, le forme familiari rare sono causate da mutazioni in singoli geni. Tredici geni sono stati descritti come probabilmente responsabili della PD ereditaria, e sei di loro (LRRK2, VPS35, PRKN, DJ-1, SNCA, PINK1) sono stati collegati con una forma autosomica dominante o recessiva di PD (Kalinderi K. et al, "The genetic background of Parkinson's disease: current progress and future prospects" (2016) Acta Neurol Scand., 134 (5): 314-326). Oltre alle forme monogeniche, è stato identificato un numero di alleli di suscettibilità al PD. Per esempio, le varianti in eterozigosi del gene GBA1, che codifica per l'enzima lisosomiale glucocerebrosidasi, conferiscono un rischio aumentato da cinque a sette volte, risultando il più comune fattore di rischio genetico per PD. Al momento non esiste una cura disponibile per il trattamento del PD. Le terapie farmacologiche per pazienti affetti da questa malattia, basate sulla somministrazione di levodopa o agonisti della dopamina, sono puramente sintomatiche e molti pazienti diventano resistenti al trattamento con levodopa con progressione della malattia e durata della malattia più lunga.

Nell'ultimo decennio, l’editing genomico è stata ampiamente utilizzato per il trattamento dei disturbi monogenici e studi clinici per diverse malattie sono attualmente in corso. La maggior parte delle strategie si basa sulla cosiddetta terapia di sostituzione genica, che prevede l'inserimento di una copia aggiuntiva del gene associato alla malattia in qualche regione del genoma sotto il controllo di un promotore non specifico, e sono basate sul principio che l'aumento del dosaggio genico può essere curativo per la malattia di interesse. Tuttavia, in diversi disturbi monogenici è stato osservato un effetto dominante negativo della proteina codificata dal gene mutato, riducendo in tal modo significativamente l'efficacia della reintroduzione della proteina naturale. Inoltre, in un numero di disturbi come ad esempio la sindrome di Rett, la sovra-espressione genica si è dimostrata tanto dannosa quanto la aploinsufficienza, rendendo estremamente difficile ottenere una modulazione fine dei livelli di espressione genica in una terapia di sostituzione genica.

Gli approcci di terapia genica basati sulla correzione stabile dell’allele/i mutante/i appaiono un'alternativa più promettente per la cura delle malattie monogeniche. In questi approcci, la sequenza genica mutante viene escissa dal genoma e completamente sostituita dalla sequenza di tipo selvatico, che può quindi mantenere la sua regolazione nativa. Fra le tecnologie di "editing genetico" recentemente sviluppate, il sistema "Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR associato (Cas) (CRISPR-Cas)" ha portato notevoli progressi sul campo. Questa tecnologia consente l'introduzione di rotture a doppio filamento nel genoma con un'elevata specificità al fine di mediare la modifica di regioni genomiche selezionate (Luther DC, et al, "Delivery Approaches for CRISPR/Cas9 Therapeutics in-vivo: Advances and Challenges" (2018) Expert Opin Drug Deliv. 15 (9): 905-913). Grazie all'elevata flessibilità, il sistema CRISPR-Cas può essere adattato a varie esigenze, compresa l'inattivazione di un gene specifico (knock out) o la sostituzione di una sequenza genetica mutante con la controparte di tipo selvatico (knock-in). Più specificamente, il sistema CRISPR-Cas agisce inducendo la rottura del doppio filamento (DSB) nel DNA genomico impiegando una breve sequenza di RNA, detta RNA guida (gRNA), che indirizza un enzima endonucleasi verso uno specifico sito bersaglio sul genoma. Tra le endonucleasi impiegate, la più comune è la nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9). Tipicamente, una molecola di gRNA è costituita da due parti: una sequenza nucleotidica complementare al DNA bersaglio ("sequenza nucleotidica guida") e una sequenza nucleotidica che funge da impalcatura di legame per l'enzima endonucleasi ("sequenza nucleotidica scaffold"). Questa molecola viene anche chiamata "RNA guida singolo" (sgRNA) per differenziare tale gRNA dal formato di RNA guida esistente in natura come due molecole "guida" e "scaffold" separate. La DBS indotta da Cas9 viene riparata dai meccanismi cellulari di riparazione del DNA e l’esito dell'attività di CRISPR-Cas dipende dallo specifico meccanismo di riparazione del DBS. La riparazione mediante giunzione non omologa delle estremità (NHEJ) non richiede uno stampo di riparazione e porta occasionalmente alla generazione di piccole inserzioni/delezioni (indel) nel sito di taglio, portando quindi alla rottura del gene bersaglio e all'abrogazione della sua espressione (knock-out). In alternativa, se viene fornito un DNA donatore con omologia al locus bersaglio, il DSB può essere riparato mediante riparazione omologa diretta (HDR), consentendo di effettuare precise sostituzioni delle mutazioni (knock-in). Quando il sgRNA è disegnato per riconoscere in modo specifico un allele mutante di un gene e in presenza di un DNA donatore che porta la sequenza dell'allele di tipo selvaggio, il macchinario HDR determina la correzione della mutazione del gene. Si nota che l'HDR è efficace sia nelle cellule che si dividono che in quelle che non si dividono, come i neuroni o le cellule muscolari terminalmente differenziate e pertanto la correzione genica può essere ottenuta anche nel trattamento di disturbi che interessano i tessuti con limitata capacità di rigenerazione/rinnovamento, incluso il SNC.

Tuttavia, le applicazioni in vivo del sistema CRISPR-Cas, in particolare quale strumento terapeutico, sono ancora ostacolate dall'inefficienza della precisa modifica della base e dall'alta frequenza dei tagli genomici indotti da Cas9 in siti diversi dal bersaglio genomico previsto. Tali effetti fuori bersaglio si verificano poiché Cas9 può tollerare fino a 5 disallineamenti di basi tra il gRNA e la sequenza bersaglio nel genoma, e l'espressione a lungo termine di Cas9 aumenta la frequenza di questi effetti.

La domanda di brevetto internazionale WO2015070083 descrive l'impiego in un sistema CRISPR-Cas di una molecola di gRNA, denominata "governing gRNA molecule", in aggiunta al gRNA diretto verso la specifica sequenza di interesse. Tale "governing gRNA" agisce come regolatore negativo dell'attività di Cas9 essendo mirato alla sequenza codificante per questo enzima, o, in alternativa, essendo mirato ad una regione di controllo, ad esempio un promotore, che regola l'espressione della sequenza codificante di Cas9.

Anche la domanda di brevetto internazionale WO2015070083 descrive la composizione di un sistema CRISPR-Cas autoinattivante che comprende un primo complesso CRISPR diretto verso un DNA bersaglio e un secondo complesso CRISPR diretto verso un polinucleotide codificante un componente del sistema CRISPR-Cas, per cui l'attività del primo sistema CRISPR-Cas può essere controllata e diminuita durante un lasso di tempo.

La domanda di brevetto internazionale WO2018069474 descrive un “Self-Limiting Cas9 circuitry for Enhanced Safety” (SLiCES), che consiste in un'unità di espressione per Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9) insieme ad un primo gRNA verso uno specifico locus genomico e un secondo gRNA Cas9 diretto verso se stessa per disattivare l'attività della nucleasi. Il sistema SLiCES è integrato in un sistema di trasferimento lentivirale (lentiSLiCES) mediante l'inibizione del circuito onde evitare espressione che perde di SpCas9 durante la produzione di particelle virali. Tale integrazione richiede l'introduzione nel vettore di un promotore inducibile e/o un introne nella cornice di lettura aperta di SpCas9.

La domanda di brevetto internazionale WO2016176191 descrive un sistema a due vettori AAV per la correzione mediata da CRISPR-Cas9 di errori genetici in malattie umane, che è mirato verso cellule progenitrici proliferanti e/o staminali in tessuti in sviluppo in modo da popolare questi tessuti con le cellule corrette geneticamente. Nel sistema descritto, la regolazione dell'attività di Cas9 è ottenuta attraverso la diluizione degli elementi Cas durante la proliferazione cellulare.

Nonostante gli sforzi per ridurre gli effetti fuori bersaglio indesiderati, gli approcci finora riportati soffrono di limitazioni significative principalmente legate alla complessità strutturale dei sistemi CRISPR-Cas impiegati, che richiedono l'uso di componenti aggiuntivi appositamente disegnati, quali ulteriori molecole di gRNA, così come l'incorporazione di ulteriori fattori che agiscono in trans e promotori nella costruzione del sistema di trasferimento. Ciò è particolarmente problematico nel caso dei vettori virali adenoassociati (AAV), a causa della loro limitata capacità di clonaggio. In aggiunta, evitare gli effetti fuori bersaglio mediante la diluizione della nucleasi Cas9 basata sulla divisione cellulare impedisce l'uso del sistema CRISPR-Cas per mirare a cellule che non si replicano, limitando in tal modo la sua applicazione terapeutica per il trattamento di disturbi che coinvolgono tali tipi di cellule.

Pertanto, si pone la necessità nell'arte di un sistema CRISPR-Cas che non soffra degli inconvenienti e delle limitazioni della tecnica nota.

In particolare, si pone la necessità di un sistema CRISPR-Cas che sia in grado di controllare la propria attività al fine di abolire o minimizzare gli effetti fuori bersaglio indesiderati, senza compromettere la semplicità, l'affidabilità e l'accuratezza del sistema, consentendo in tal modo l'impiego sicuro di questo sistema nelle applicazioni terapeutiche, particolarmente nella terapia genica.

Queste ed altre necessità sono soddisfatte dal sistema CRISPR-Cas come definito nella rivendicazione 1, e dalla particella virale comprendente il sistema CRISPR-Cas come definito nella rivendicazione 4.

Un altro aspetto della presente invenzione è un metodo in vitro per modificare una sequenza bersaglio genomica mutante in una cellula bersaglio come definito nella rivendicazione 6.

Un ulteriore aspetto dell'invenzione è il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione e/o la particella virale dell'invenzione per l'impiego come medicamento, in particolare nella terapia genica.

Ancora un ulteriore aspetto dell'invenzione è una composizione farmaceutica comprendente il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione o la particella virale dell'invenzione e un veicolo, diluente e/o veicolo farmaceuticamente accettabile.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi della presente invenzione sono definiti nelle annesse rivendicazioni che formano parte integrante della descrizione.

Come illustrato più in dettaglio nella parte che segue, la presente invenzione mette a disposizione un nuovo sistema "CRISPR (Clustered Regolarmente Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR associato (Cas) (CRISPR-Cas)" autolimitante, che può realizzare l'espressione affidabile controllata della nucleasi Cas9 impiegando un disegno semplice e elementi minimi.

Il sistema CRISPR-Cas dell’invenzione non presente in natura o ingegnerizzato è un sistema a doppio vettore disegnato per essere mirato verso una sequenza bersaglio genomica mutante che porta una o più mutazioni in una cellula bersaglio.

Il primo vettore virale di espressione secondo l'invenzione comprende una sequenza nucleotidica codificante per un RNA guida (gRNA) codificante per un RNA guida (gRNA), che comprende una sequenza nucleotidica “scaffold” capace di legare un enzima endonucleasi e una sequenza nucleotidica guida in grado di ibridarsi alla sequenza bersaglio genomica mutantaa.

Come qui usato, il termine " RNA guida (gRNA)" è da intendersi riferirsi al formato di gRNA che combina sia la "sequenza nucleotidica guida" che la "sequenza nucleotidica scaffold" in una singola molecola di RNA.

Come qui usato, il termine “una sequenza nucleotidica codificante per un RNA guida (gRNA)” è da intendersi riferirsi ad una sequenza nucleotidica che viene trascritta in una molecola di gRNA.

Preferibilmente, la sequenza nucleotidica guida è lunga da 17 a 25 nucleotidi, più preferibilmente da 20 a 21 nucleotidi (Cencic R. et al, "Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage" (2014) PLoS One 9 (10): e109213).

Il primo vettore virale di espressione dell'invenzione comprende inoltre una sequenza nucleotidica donatrice che consiste della sequenza di tipo selvatico della sequenza bersaglio genomica mutantaa a cui è mirato il sistema CRISPR-Cas.

Nell’ambito della presente descrizione, il termine "selvatico" indica la forma tipica naturale di una sequenza nucleotidica. Qualsiasi forma di una sequenza nucleotidica diversa da quella selvatica è una sequenza "mutante".

Secondo la presente invenzione, la sequenza nucleotidica donatrice situata sul primo vettore virale di espressione e che consiste della sequenza selvatica della sequenza bersaglio genomica mutante è atta a funzionare come stampo per la riparazione omologa diretta (HDR) per sostituire almeno una delle mutazioni nella sequenza genomica bersaglio.

Come precedentemente indicato, il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione comprende un secondo vettore virale di espressione che comprendente una sequenza nucleotidica codificante per un enzima endonucleasi.

Un enzima endonucleasi, come tal termine è usato qui, si riferisce a una molecola che è capace di interagire con la sequenza nucleotidica “scaffold” della molecola di gRNA e, insieme con la molecola di gRNA, dirigersi verso un sito specifico sul genoma complementare alla sequenza nucleotidica guida del gRNA. Dopo il legame, l'enzima endonucleasi è capace di generare una rottura a doppio filamento nella sequenza genomica bersaglio. Enzimi endonucleasi esemplificativi idonei ad essere impiegati nel sistema CRISPR-Cas dell'invenzione includono, ma non sono limitati a, la nucleasi Cas9 e le sue varianti che riconoscono sequenze Protospacer Adjacent Motif (PAM) diverse. Come è noto nella tecnica, i motivi PAM sono sequenze di 2-5 paia di basi di lunghezza situate in stretta prossimità con la sequenza bersaglio di un sistema CRISPR-Cas, che sono necessario per il taglio di Cas9 (Shah S. et al, "Protospacer recognition motifs Mixed identities and functional diversity (2013) RNA Biology 10 (5): 891-899).

In una forma di realizzazione preferita, l'endonucleasi impiegata nel sistema CRISPR-Cas dell'invenzione è scelta dal gruppo che consiste di Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9), variante D1135E di SpCas9, variante VRC di SpCas9, variante EQR di SpCas9, variante VCV9 di SpCas9, Cas9 di Staphylococcus aureus (SaCas9), Sniper-Cas9 e SpCas9-HF1.

Secondo la presente invenzione, sia la sequenza nucleotidica codificante il gRNA, situata sul primo vettore virale di espressione, sia la sequenza nucleotidica codificante l'enzima endonucleasi, che si trova sul secondo vettore virale di espressione, sono operativamente collegate al sequenze promotore, che guidano la loro trascrizione. Dette sequenze promotore sono situate, rispettivamente, a monte dell'estremità 5’ della sequenza nucleotidica codificante per il gRNA e a monte dell'estremità 5' della sequenza nucleotidica codificante per l’endonucleasi.

Il promotore può essere una qualsiasi sequenza di acido nucleico che mostri attività trascrizionale in una cellula ospite, ivi inclusi promotori costitutivi, promotori inducibili e promotori tessuto-specifici.

In una forma di realizzazione preferita, la sequenza del promotore è scelta dal gruppo che consiste del promotore del citomegalovirus (CMV), promotore di SV40, promotore di MECP2, promotore U6, promotore di H1, promotore della β-actina di pollo (CBA) e promotore della subunità del fattore di allungamento 1α umano (EF1α).

In un'altra forma di realizzazione preferita, la sequenza nucleotidica donatrice situata sul primo vettore di espressione che consiste della sequenza di tipo selvatico della sequenza bersaglio genomica mutante, non è collegata operativamente a nessuna sequenza promotore e quindi non può essere espressa in una cellula ospite.

Secondo la presente invenzione, il secondo vettore virale di espressione comprende inoltre una sequenza nucleotidica bersaglio che consiste della sequenza genomica mutante a cui è mirato il sistema CRISPR-Cas. Detta sequenza bersaglio può essere presente sul vettore di espressione virale in una o due copie. Come singola copia, la sequenza nucleotidica bersaglio è situata tra l'estremità 3' della sequenza promotore operativamente collegata alla sequenza nucleotidica codificante per l'enzima endonucleasi e l'estremità 5' di detta sequenza codificante per l’endonucleasi. Alternativamente, quando la sequenza nucleotidica bersaglio è presente sul vettore virale di espressione in due copie, una prima copia è situata a monte dell'estremità 5' della sequenza promotore operativamente collegata alla sequenza nucleotidica codificante per l'enzima endonucleasi, e una seconda copia è situata a valle dell'estremità 3' di detta sequenza codificante per l’endonucleasi.

In conseguenza delle configurazioni alternative precedentemente descritte del secondo vettore virale di espressione dell'invenzione, il taglio dell’endonucleasi diretto dal gRNA in corrispondenza dell’una o delle due copie della sequenza nucleotidica bersaglio produce un’interruzione nella sequenza interposta tra il promotore e la sequenza nucleotidica codificante per l’endonucleasi o l'escissione dell'intera unità codificante l’endonucleasi, impedendo così l'espressione dell’endonucleasi. Pertanto, nel sistema CRISPR-Cas dell'invenzione, il gRNA specifico per il mutante è capace di indirizzare l’editing genomico mediato dall'endonucleasi nonché un controllo auto-limitante mediato dall'endonucleasi sull'espressione dell’enzima.

Nel secondo vettore virale di espressione, ciascuna copia della sequenza nucleotidica bersaglio è fiancheggiata all'estremità 3' da una sequenza PAM. I precisi requisiti di lunghezza e sequenza per la PAM differiscono a seconda dell'enzima endonucleasi CRISPR impiegato. Ad esempio, una PAM idonea è 5'-NGG per Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9) e la variante D1135E di SpCas9 (dove N è un qualsiasi nucleotide), 5'-NGCG per la variante VRC di SpCas9, 5'-NGAG per la variante EQR di SpCas9, 5'-NGAN o NGNG per la variante VQR di SpCas9, 5'-NNGRRT o NNGRR (N) per Cas9 di Staphylococcus aureus (SaCas9) (dove R è adenina o guanina), 5'-NG per Sniper-Cas9 e 5'-NGG per SpCas9-HF1.

In una forma di realizzazione preferita, il vettore virale di espressione è un vettore adenovirus o di virus adeno-associato (AAV), più preferibilmente un vettore virale adeno-associato di sierotipo 2 (AAV2) o un vettore virale adenoassociato di sierotipo 9 (AAV9).

Gli AAV sono particolarmente adatti quali vettori virali nella presente invenzione poiché sono virus non integrativi che rimangono in uno stato episomico all'interno delle cellule, limitando così il rischio di mutagenesi inserzionale nel genoma delle cellule infettate. Numerosi sierotipi di AAV sono noti nell'arte, i quali differiscono per il loro tropismo tissutale o per il tipo di cellula che infettano. Ad esempio, il virus adeno-associato di sierotipo 2 (AAV2) mostra un tropismo più marcato verso il parenchima renale mentre il virus adenoassociato di sierotipo 9 (AAV9) è particolarmente adatto per mirare a cellule cerebrali o neuronali poiché questo virus è in grado di attraversare la barriera emato-encefalica.

In un'altra forma di realizzazione, il vettore virale di espressione nel sistema CRISPR-Cas dell'invenzione può essere un vettore lentivirale, un vettore retrovirale o un vettore di parvovirus.

Al fine di facilitare l'incapsidamento all’interno di una particella virale, il vettore virale di espressione può comprendere sequenze regolatrici aggiuntive. Esempi di sequenze regolatrici idonee a questo scopo includono, ma non sono limitati a, sequenze di ripetizione terminale invertita (ITR) e sequenze lunghe terminali (LTR), sequenze di segnali di poliadenilazione, segnale di incapsidamento (ε) e sequenze di segnale di impacchettamento (ψ).

Preferibilmente, uno o l’altro o entrambi il primo e secondo vettore virale di espressione contengono un sistema reporter, che è adatto per valutare l'espressione di detti vettori nelle cellule bersaglio trasfettate. Tipicamente, un sistema reporter può contenere uno o più geni che codificano, ad esempio, un enzima, quale ad esempio la luciferasi, o una proteina fluorescente, quale ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP) o la proteina fluorescente rossa mCherry, le cui attività possono essere prontamente dosate dopo la trasfezione. Un sistema reporter preferito nel sistema CRISPR-Cas dell'invenzione è il doppio sistema genico mCherry/GFP.

Secondo l'invenzione, la sequenza genomica mutante a cui è mirato il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione può essere una sequenza codificante, come ad esempio una sequenza codificante una proteina, o una sequenza non codificante, come ad esempio un elemento regolatore, ad esempio un promotore, un potenziatore, un silenziatore, un donatore di splicing o una sequenza accettore.

In una forma di realizzazione, la sequenza bersaglio genomica mutante è scelta dal gruppo che consiste di gene COL4A5 mutante, gene COL4A3 mutante, gene COL4A4 mutante, gene GAA mutante, gene MECP2 mutante, gene FOXG1 mutante, gene CDKL5 mutante, gene LRRK2 mutante, gene VPS35 mutante, gene PRKN mutante, gene DJ-1 mutante, gene SNCA mutante, gene PINK1 mutante e gene GBA1 mutante.

In un'altra forma di realizzazione, l'una o più mutazioni portate dalla sequenza bersaglio genomica nella cellula bersaglio comprendono almeno una mutazione puntiforme. Come qui usato, il termine "mutazione puntiforme" è da intendersi indicare una mutazione genetica in cui una singola base nucleotidica viene variata, inserita o eliminata da una sequenza di DNA.

Secondo la presente invenzione, il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione può essere trasferito nella cellula bersaglio, per esempio, mediante sistemi virali idonei. Il primo e il secondo vettore virale di espressione dell'invenzione possono essere impacchettati in combinazione in una singola particella virale o, in alternativa, in particelle separate.

Pertanto, in un aspetto, la presente invenzione mette a disposizione una particella virale comprendente un sistema CRISPR-Cas come sopra definito. In un altro aspetto, la presente invenzione mette a disposizione un insieme di due particelle virali, in cui una particella virale comprende il primo vettore virale di espressione come sopra definito, e l'altra particella virale comprende il secondo vettore virale di espressione come sopra definito. La particella virale può essere adeguatamente, per esempio, un lentivirus, un retrovirus, un parvovirus, un adenovirus o un virus adeno-associato (AAV). Preferibilmente, la particella virale secondo l'invenzione è AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, più preferibilmente AAV2 o AAV9.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione è un procedimento in vitro per modificare una sequenza bersaglio genomica mutante in una cellula bersaglio, come definito nell’annessa rivendicazione 6. Il procedimento della presente invenzione prevede trasdurre la cellula bersaglio con un sistema CRISPR-Cas come precedentemente definito o con una particella virale come precedentemente definita o con un insieme di due particelle virali come precedentemente definite e porre in coltura la cellula trasdotta in condizioni di coltura cellulare atte all'espressione del gRNA e dell'enzima endonucleasi. La scelta delle condizioni di coltura cellulare più idonee, come ad esempio il terreno, la temperatura e il tempo di incubazione, sono ampiamente alla portata delle persone esperti del settore.

Nel procedimento dell'invenzione, l'espressione intracellulare del primo e del secondo vettore virale di espressione porta alla formazione di un complesso CRISPR-Cas comprendente l'enzima endonucleasi legato alla molecola di gRNA. Come illustrato precedentemente e mostrato nella Figura 1, il gRNA specifico per la mutazione del complesso CRISPR-Cas dell'invenzione indirizza l'endonucleasi verso la sequenza bersaglio genomica mutante sulla base di una regola di accoppiamento basata sulla complementarità, producendo il taglio di detta sequenza. La rottura a doppio filamento nel sito bersaglio genomico viene riparata utilizzando come stampo la sequenza nucleotidica donatrice che consiste della sequenza di tipo selvatico della sequenza bersaglio genomica mutante al fine di correggere stabilmente almeno una delle mutazioni nella sequenza bersaglio e ripristinare la sequenza di tipo selvatico. Nella cellula, la sostituzione della sequenza può essere effettuata, ad esempio, dal meccanismo di correzione mediante riparazione omologa diretta (HDR). Si nota che il procedimento dell'invenzione assicura che la sostituzione di almeno una mutazione nella sequenza bersaglio mutante con la sequenza di tipo selvatico avvenga in corrispondenza del sito naturale sul genoma, consentendo in tal modo alla sequenza sostituita di mantenere la sua regolazione nativa nella cellula bersaglio.

Nonostante venga fatto riferimento al trasferimento mediato da virus, è da intendersi che altri metodi di trasduzione cellulare possono essere impiegati nell'ambito della presente invenzione, come noti nella tecnica. Tali metodi includono, ma non sono limitati a, elettroporazione, formulazioni con liposomi cationici e trasfezione mediante fosfato di calcio.

Come precedentemente illustrato, una sequenza bersaglio del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione è presente anche sul secondo vettore virale di espressione, in una copia o in due copie. Il taglio endonucleasico indirizzato dal gRNA in corrispondenza dell’una o delle due copie della sequenza bersaglio comporta la rottura della struttura dell'unità codificante per l’endonucleasi e, di conseguenza, la soppressione della trascrizione e dell'espressione di questa sequenza codificante.

A tale riguardo, deve intendersi che l’autoinattivazione della sequenza codificante per l’endonucleasi avviene gradualmente nel tempo in modo tale che il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione sia in grado di completare la correzione mediata da editing genico della sequenza bersaglio mutante sul genoma della cellula bersaglio.

Pertanto, il procedimento dell'invenzione fornisce un modo unico e semplice per eseguire in maniera accurata ed efficiente una modifica di una sequenza genomica mutante usando un sistema CRISPR-Cas, evitando allo stesso tempo il pericolo di effetti fuori bersaglio indesiderati senza la necessità di componenti addizionali del sistema.

Un altro aspetto della presente invenzione è una cellula bersaglio isolata che comprende il sistema CRISPR-Cas come precedentemente definito.

A titolo non limitativo, la cellula bersaglio isolata può essere una cellula eucariotica, preferibilmente una cellula di mammifero, più preferibilmente una cellula umana, ancora più preferibilmente una cellula umana affetta da una malattia genetica.

In una forma di realizzazione, la cellula bersaglio isolata umana dell'invenzione è una cellula postmitotica o una cellula in uno stadio post-replicativo del ciclo cellulare.

Nell’ambito della presente descrizione, il termine "post-mitotico" indica una cellula differenziata terminalmente che non è più in grado di subire la mitosi mentre il termine "stadio postreplicativo" indica una cellula nella fase S o G2 del ciclo cellulare.

Come illustrato in precedenza, il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione è vantaggiosamente caratterizzato da una notevole accuratezza e dall'assenza o significativa riduzione del verificarsi di effetti fuori bersaglio. Tali caratteristiche rendono il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione particolarmente idoneo per l'impiego in terapia.

Pertanto, ancora un ulteriore aspetto dell'invenzione è il sistema CRISPR-Cas come sopra definito o la particella virale come sopra definita o l'insieme di due particelle virali come sopra definito, per l'impiego come medicamento.

Preferibilmente, il sistema CRISPR-Cas, la particella virale o l'insieme di due particelle secondo l'invenzione è idoneo per il trattamento terapeutico di una malattia genetica, più preferibilmente di una malattia monogenica, ancora più preferibilmente di una malattia monogenica scelta dal gruppo che consiste di sindrome di Alport, malattia di Pompe, sindrome di Rett e patologie correlate, malattia di Parkinson. glomerulopatie genetiche, disordini lisosomiali e disturbi neurodegenerativi monogenici.

Come qui usato, il termine "malattia genetica" si riferisce a qualsiasi malattia, disturbo o condizione associata a una inserzione, cambiamento o delezione nella sequenza nucleotidica di un locus genomico. Tali malattie possono includere disturbi genetici ereditari e/o non ereditari, nonché malattie e condizioni che possono non manifestare sintomi fisici durante l'infanzia o l'infanzia.

Tra le malattie genetiche, con il termine "malattia monogenica" si intende una malattia causata da mutazioni in un singolo gene. Va inteso che nel presente contesto il termine "malattia di Parkinson" riguarda le forme monogeniche di questo disturbo.

La presente invenzione mette a disposizione anche una composizione farmaceutica comprendente il sistema CRISPR-Cas come sopra definito, la particella virale come sopra definita o l'insieme di due particelle virali come sopra definito, in combinazione con almeno un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.

La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione è atta ad essere somministrata come medicamento, preferibilmente come terapia contro una malattia genetica, più preferibilmente contro una malattia monogenica, a qualsiasi mammifero, inclusi gli esseri umani.

Il termine "farmaceuticamente accettabile" si riferisce a composti e composizioni che possono essere somministrati ai mammiferi senza indebita tossicità a concentrazioni in accordo con l'attività efficace del principio attivo. Idonei vettori farmaceuticamente accettabili (eccipienti) possono essere, ad esempio, riempitivi, disintegranti, glidanti e lubrificanti. Diluenti idonei includono, ma non a titolo limitativo, acqua sterile, tamponi salini, tra cui tampone fosfato salino (PBS) con sorbitolo o glicerolo al 5%, oli fissi quali mono-o di-gliceridi sintetici, polietilenglicoli, glicoli propilenici e glicerina.

La scelta dei veicoli, eccipienti e/o diluenti idonei per la composizione farmaceutica dell'invenzione può essere determinata dal tecnico medio del settore usando le sue normali conoscenze.

La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione è idonea alla somministrazione attraverso una qualsiasi delle vie di somministrazione note, ad es. per via topica, orale, enterale, parenterale, intratecale, epidurale e intranasale.

Come qui usata, la somministrazione parenterale include, ma non a titolo limitativo, la somministrazione di una composizione farmaceutica mediante iniezione sottocutanea e intramuscolare, impianto depot a rilascio prolungato, somministrazione con iniezione endovenosa.

Viene somministrata una quantità terapeuticamente efficace della composizione farmaceutica dell'invenzione, vale a dire una quantità in grado di produrre nel paziente l'effetto desiderato. Naturalmente, la quantità efficace può essere determinata in base a vari fattori, come ad esempio il tipo e la gravità della malattia da trattare, l'età e il peso del paziente da trattare, la via di somministrazione, nonché il regime richiesto.

La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione viene somministrata come singola dose o come dosi multiple, e con la frequenza necessaria e per la durata di tempo necessario a raggiungere l'effetto terapeutico desiderato.

Il tecnico medio del settore è in grado di determinare facilmente un idoneo ciclo di trattamento utilizzando le composizioni farmaceutiche per l'impiego secondo l'invenzione.

La parte sperimentale che segue è fornita a titolo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni. Nella parte sperimentale viene fatto riferimento ai disegni annessi, in cui:

la Figura 1 è una panoramica schematica del meccanismo di editing genico del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione, che fa uso di due vettori virali di espressione per trasferire il sistema di correzione CRISPR-Cas in una cellula bersaglio. A) Rappresentazione schematica del primo vettore virale di espressione (vettore "Donor") e del secondo vettore virale di espressione (vettore “Cas9") che illustra i componenti rilevanti in ciascun vettore. B) I vettori virali di espressione mutazionespecifici vengono incapsidati nelle particelle virali, preferibilmente in virus adeno-associati (AAV). Le cellule bersaglio vengono infettate con le particelle virali e i vettori virali di espressione vengono espressi all'interno delle cellule infettate. Il sgRNA mutazione-specifico guida l'enzima Cas9 verso la sequenza bersaglio genomica dove l'endonucleasi introduce una rottura a doppio filamento (DSB). La DBS viene riparata dal meccanismo di correzione della cellula, che utilizza il DNA donatore come stampo per ripristinare la sequenza di tipo selvaggio mediante riparazione omologa diretta. Oltre al DNA bersaglio mutante, la proteina Cas9 viene indirizzata verso bersagli di auto-taglio, (sequenze di sgRNA PAM, mostrate come rettangoli neri) sul "vettore Cas9" stesso, con conseguente taglio del vettore e spegnimento dell'espressione di Cas9.

La Figura 2 è una rappresentazione schematica della strategia impiegata per validare l'espressione dei vettori virali dopo la trasduzione delle cellule. A) Trasduzione virale di cellule con un vettore donatore come mostrato nella Figura 1, comprendente un sistema reporter mCherry/GFP. Nelle cellule infettate, mCherry è espresso in modo costitutivo e la cellula acquisisce fluorescenza (fluorescenza rossa). La proteina GFP non viene espressa perché la sequenza di sgRNA PAM situata a monte della sua sequenza codificante (indicata come un rettangolo nero) rende quest'ultima fuori dalla cornice. B) Co-infezione delle cellule con il vettore “Donor” e un vettore Cas9 come mostrato nella Figura 1. Quando Cas9 è espressa, essa introduce un'interruzione nella sequenza sgRNA PAM tra le sequenze codificanti mCherry e GFP, ripristinando cornice di lettura di GFP. Di conseguenza, la cellula acquisisce anche fluorescenza verde.

La Figura 3 illustra i risultati dell'analisi FACS condotta su diversi tipi di cellule successivamente all'infezione con virus di controllo AAV2-GFP o AAV9-GFP. Cellule, da sinistra a destra: cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), cellule progenitrici neuronali, fibroblasti, neuroni derivati da iPSC. Per ciascun sierotipo virale, i grafici mostrano la percentuale di cellule infettate che sono GFP positive. In ciascun grafico, l'asse y mostra l’SSC (dispersione laterale) e l'asse x mostra l'intensità della fluorescenza. Il rettangolo tratteggiato rappresenta il “gate” per la cellula positiva e per ciascuna condizione è indicata la percentuale di cellule positive.

La Figura 4 illustra i risultati dell'analisi FACS condotta su elementi della linea cellulare podocitaria che portano mutazione nel gene COL4A5 dopo infezione con virus di controllo AAV2-GFP o AAV9-GFP. L'analisi dimostra una maggiore efficacia delle infezioni con AAV2 rispetto a AAV9.

La Figura 5 illustra i risultati della validazione in vitro dei vettori virali di espressione. I fibroblasti primari sono stati trasfettati con plasmidi ricombinanti per la mutazione c.688C>T - p.Arg230Cys di FOXG1 e la mutazione c.473C>T - p.Thr158Met di MECP2. a) Micrografie rappresentative che mostrano la fluorescenza nei fibroblasti trasfettati con i costrutti FOXG1 dopo 24 ore dalla trasfezione (ingrandimento 40X). b) Grafici che mostrano i risultati dell'analisi FACS condotta dopo 48 ore dalla trasfezione su fibroblasti trasfettati con i costrutti FOXG1 o trasfettati con il plasmide reporter da solo. Questi ultimi sono solo mCherry . In ciascun grafico, l'asse y mostra l’SSC (dispersione laterale) e l'asse x mostra l'intensità di fluorescenza (FL2-A = mCherry; FL1-A = GFP). Per ogni condizione, viene indicata la percentuale di cellule positive.

La Figura 6 mostra che è necessario un flusso di lavoro personalizzato per ottenere i migliori risultati nella modifica di un gene/mutazione specifico. In alcuni casi (numero 1), una idonea combinazione di uno specifico sgRNA, PAM e Cas9 è sufficiente per ottenere un alto livello di HDR, un basso livello di NHEJ e un basso livello di fuori bersaglio. Altri casi possono richiedere la selezione di diversi sgRNA e PAM (numero 2). Altri casi ancora possono richiedere la sostituzione di Cas9 con SaCas9 (numero 3) o con altre specie Cas ad alta fedeltà (numero 4).

La Figura 7 mostra sistemi di somministrazione virale e vie di somministrazione idonee del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione selezionato per specifici disturbi monogenici usando modelli murini di malattia. Sindrome di Alport e disturbi correlati, vettore AAV2, iniezione nell'arteria renale; Sindrome di Rett e morbo di Parkinson, vettore AAV9, iniezione nella vena caudale; Malattia di Pompe, vettore AAV9, iniezione intramuscolare.

La figura 8 mostra i risultati dell'analisi longitudinale del paziente condotta su una specifica coorte di pazienti al fine di identificare la finestra temporale più appropriata per il trattamento terapeutico con il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione.

1. MATERIALI E METODI

Esempio 1.1: biopsia cutanea e riprogrammazione a iPSCs

In seguito alla firma del consenso informato da parte dei pazienti, sono state eseguite biopsie cutanee (circa 3-4 mm3) utilizzando la procedura di Biopsia Punch su pazienti con sindrome di Rett, sindrome di Alport, morbo di Parkinson e malattia di Pompe con una o più mutazioni nei seguenti geni: MECP2, FOXG1 e CDKL5 (sindrome di Rett); COL4A3, COL4A4 e COL4A5 (sindrome di Alport); GAA (malattia di Pompe); LRRK2 e GBA (malattia di Parkinson). I fibroblasti isolati dalle biopsie sono stati coltivati secondo i protocolli standard e regolarmente passati 1:2 con Tripsina-EDTA. I fibroblasti al passaggio 2 o 3 sono stati riprogrammati secondo il protocollo di Hotta e colleghi (Hotta A. et al, "Isolation of human iPS cells using EOS lentiviral vectors to select for pluripotency"; (2009) Nat Methods. 6 (5): 370 -6). In breve, i fibroblasti sono stati infettati da un vettore lentivirale che esprime i fattori di riprogrammazione (OCT-4, SOX-2, c-MYC e KLF-4). Sette giorni dopo l'infezione da lentivirus, i fibroblasti sono stati passati su fibroblasti di embrione di topo inattivato con mitomicina-C (alimentatori). I cloni consolidati che mantenevano una buona morfologia simile a quella di hESCs sono stati trasferiti in condizioni di coltura prive di alimentatori su piastre trattate con Matrigel (BD Biosciences, Milano, Italia) in terreno mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Grenoble, Francia). Da questo momento, le cellule sono state regolarmente passate con Dispasi (Stem Cell Technologies, Grenoble, Francia).

Esempio 1.2: differenziamento neuronale delle iPSCs Cellule staminali pluripotenti indotte sono state differenziate in progenitori neuronali (NPC) e neuroni seguendo il protocollo utilizzato di routine in laboratorio (Patriarchi T. et al, "Imbalance of excitatory/inhibitory synaptic protein expression in iPSC-derived neurons from FOXG1(+/-) patients and in foxg1(+/-) mice"; (2016) Eur J Hum Genet. 24 (6): 871-80). In breve, le colonie cellulari sono state scomposte in singole cellule con Accutase (Merck Millipore®, Burlington, Massachusetts, Stati Uniti) e trasferite nelle piastre Aggrewell (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) per consentire la formazione di strutture tipo corpi embrioidi (EB) in terreno NB (DMEM: F12 con Glutamax integrato con 1% di N2, 4% di B27 senza Vitamina A, 55μM di betamercaptoetanolo e 1% di penicillina/streptomicina), contenente 200 ng/ml di Noggin (Sistema R&D, Minneapolis, Minnesota, Stati Uniti), per due giorni. Gli aggregati cellulari sono stati poi fatti crescere in sospensione per altri due giorni nello stesso mezzo e poi trasferiti su piastre rivestite di matrigel nello stesso terreno per la formazione di rosette neuronali, costituite da cellule neuroepiteliali disposte in una struttura tubolare. Ventiquattro ore più tardi, il mezzo è stato modificato in NB integrato con 200 ng/ml di Noggin, 200 ng/ml di rh-DKK1 (Sistema R&D, Minneapolis, Minnesota, Stati Uniti) e 20 ng/ml di FGF2 (Thermo Fisher Scientific Waltham, Massachusetts , Stati Uniti). Le rosette sono state raccolte manualmente, dissociate ed espanse in terreno NB con l'aggiunta di 10 ng/ml FGF2 e EGF (Thermo Fisher Scientific Waltham, Massachusetts, Stati Uniti). Per la successiva differenziazione neuronale, gli NPC sono stati placcati su piastre Laminina/Poly-L-Ornitina in mezzo di differenziazione terminale (TD) (mezzo neurobasico integrato con 1% N2, 2% B27 con vitamina A, 15mM HEPES pH7,4, L-glutammina 1X , 1X NEAA (AminoAcidi non essenziali), 55μM di betamercaptoetanolo, 1% di penicillina/streptomicina, 200 nM di acido ascorbico, 10 ng/ml di BDNF, 10 ng/ml di GDNF, 10 mM dibutyryl-cAMP) per 30 giorni. Nonostante la presenza di Noggin e DKK che dovrebbero indirizzare la differenziazione verso una destino proencefalico, sono state ottenute colture eterogenee contenenti una percentuale variabile di cellule non neuronali. I progenitori neuronali e le cellule neuronali sono stati isolati per analisi quantitative mediante separazione immunomagnetica delle cellule con anticorpi coniugati con sfere magnetiche rispettivamente contro PSA-NCAM e CD24, (Miltenyi Biotec, Calderara di Reno, Bologna, Italia). Per arricchire le colture cellulari in neuroni post-mitotici, le cellule al giorno 15 della differenziazione neuronale sono state trattate con Mitomicina C da Streptomyces caespitosus (2,5 μg / ml) (Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germania) che ha indotto l'apoptosi nelle cellule in proliferazione ma non ha influito su quelli postmitotici.

Esempio 1.3: differenziamento muscolare dalle iPSCs Per indurre il differenziamento muscolare nelle cellule staminali pluripotenti indotte, le iPSCs sono state coltivate in terreno mTeSR1 (Tecnologie Stem Cells, Grenoble, Francia), su piastre rivestite con Matrigel, con cambiamento del terreno giornaliero, fino a confluenza (~2 giorni). Quindi il differenziamento nella linea cellulare mesodermica è iniziata al giorno 0 coltivando le cellule in presenza di CHIR99021 (5 μM) e BMP-4 (10 ng/ml) in terreno RPMI 1640 con il 2% di B27. Il differenziamento in cellule muscolari lisce sintetiche (SMC) o SMC contrattili è iniziato il terzo giorno. Le SMC sintetiche sono state prodotte coltivando le cellule nelle seguenti condizioni: 25 ng/ml di VEGF-A e di FGFβ in RPMI 1640 e 2% di B27 senza insulina (dal giorno 3 al giorno 7); 25 ng/ml di VEGF-A e di FGFβ in RPMI 1640 e il 2% di B27 (dal giorno 7 al giorno 9), 10 ng/ml di PDGFβ e 3 ng/ml di TGFβ in RPMI 1640 e il 2% di B27 (dal giorno 10 al giorno 14). Le SMC contrattili sono state prodotte coltivando le cellule nelle seguenti condizioni: 25 ng/ml di VEGF-A e di FGFβ in RPMI 1640 e il 2% di B27 senza insulina (dal giorno 3 al giorno 7); 5 ng/ml di PDGFβ e 2,5 ng/ml di TGFβ in RPMI 1640 e il 2% di B27 (dal giorno 7 al giorno 14). Le cellule differenziate sono state arricchite per le SMC mantenendo queste cellule in 4 mM di terreno metabolico RPMI 1640 per 4-6 giorni.

Esempio 1.4: isolamento delle cellule del lignaggio podocitario

Le cellule del lignaggio podocitario sono state isolate dalle urine seguendo il processo in due fasi precedentemente stabilito dai presenti inventori (Daga S. et al., "Urine-derived podocytes-lineage cells: A promising tool for precision medicine in Alport Syndrome"; (2018) Hum Mutat. 39 (2): 302-314.). I campioni di urina sono stati processati entro 4 ore dalla loro raccolta e centrifugati a 400xg per 10 minuti. Il pellet cellulare è stato lavato con 10 ml di tampone di lavaggio (DPBS integrato con 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina e 500 ng/ml di amfotericina B) e centrifugato nuovamente a 200xg per 10 minuti. Dopo la rimozione del supernatante, il pellet è stato risospeso in 250 μl di terreno primario (DMEM/ad alto glucosio e mix di nutrienti Ham F12 (1:1), integrato con 10% (vol/vol) FBS, 100 U/ml di Penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, tutti i supplementi del kit REGM SingleQuot e 2,5 μg/ml di amfotericina B) e piastrato in piastre da coltura trattate con gelatina. Il mezzo primario è stato aggiunto alla coltura per i tre giorni successivi (cioè 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo la piastrazione).

Circa 96 ore dopo la piastrazione, è stato rimosso un terzo del terreno e aggiunto 1 ml di terreno RE/MC. Per preparare RE/MC, il terreno RE e MC sono mescolati in un rapporto 1:1. Il terreno RE contiene la giusta quantità di ciascun flaconcino di supplemento di REGM BulletKit per il terreno basale delle cellule RE contenuto nello stesso kit. Il terreno di proliferazione MC contiene DMEM/ad alto glucosio integrato con 10% (vol/vol) di FBS, 1% (vol/vol) di GlutaMAX, 1% (vol/vol) di NEAA, 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, 5 ng/ml di bFGF, 5 ng/ml di PDGF-AB e 5 ng/ml di EGF. Il terreno di proliferazione è stato cambiato ogni giorno, fino a quando sono stati notati due gruppi di piccole colonie, un primo gruppo di cellule con aspetto più regolare, contorni levigati e morfologie cellulari simili a ciottoli, e un secondo gruppo più organizzato in modo casuale con una maggiore velocità di proliferazione. Le cellule sono state divise circa 9-12 giorni dopo la piastrazione.

Esempio 1.5: disegno dell’sgRNA e clonaggio del vettore ad espressione virale

Per effettuare gli esperimenti in vitro e in vivo illustrati di seguito, i presenti inventori hanno generato primi e secondi vettori di espressione virale in accordo con l'invenzione mirati a specifiche mutazioni associate alla malattia. Il primo vettore virale di espressione, indicato anche come "vettore donatore", è stato costruito sullo scheletro plasmidico di pAAV2.1_CMV_eGFP3 (Auricchio A. et al., "Exchange of surface proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction characteristics: the retina as a model"; (2001) Hum Mol Genet., 15; 10 (26): 3075-81). Il vettore donatore comprende una sequenza nucleotidica codificante per il sgRNA mutante-specifico, sotto il controllo del promotore U6, e una sequenza nucleotidica donatrice come sopra definita che può essere usata dal meccanismo di correzione della cellula come stampo per sostituire la sequenza di tipo selvaggio mediante riparazione omologa diretta. Le sequenze di sgRNA impiegate negli esperimenti, che sono complementari alle sequenze bersaglio genomiche mutanti di interesse, sono state disegnate usando lo strumento di progettazione CRISPR del MIT (http://crispr.mit.edu). Dopo la selezione del sgRNA più adatto per ciascuna sequenza mutante, la sequenza nucleotidica selvaggia corrispondente da utilizzare come stampo donatore è stata disegnata come una sequenza di 120 paia basi centrata sul nucleotide mutante associato alla malattia. La sequenza nucleotidica codificante per il sgRNA e la sequenza nucleotidica donatrice sono state clonate nei siti di restrizione BbsI e AfIII/AII, rispettivamente, nello scheletro del vettore donatore pAAV2.1_CMV_eGFP3. Nella maggior parte degli esperimenti, il vettore donatore conteneva anche un doppio sistema reporter mCherry/GFP, sotto la regolazione di un promotore CMV. L'intera unità codificante per il sistema reporter è stata clonata tra i siti di restrizione univoci NheI/SpeI nel vettore pAAV2.1_CMV_eGFP3. Come illustrato nella figura 2, un inserto comprendente una sequenza nucleotidica complementare al sgRNA specifico per la mutazione fiancheggiato alla sua estremità 3' da una sequenza PAM, è stato interposto sul vettore tra la sequenza codificante mCherry e la sequenza codificante GFP, rendendo quest'ultima fuori cornice. A causa di tale configurazione, soltanto il gene mCherry viene espresso in modo costitutivo quando il vettore entra nella cellula. Dopo la trasfezione cellulare con il vettore codificante Cas9, la nucleasi è guidata dal sgRNA verso la sequenza complementare al sgRNA sequenza PAM situata sul vettore donatore tra i geni mCherry e GFP, e taglia specificamente questa sequenza, riportando la sequenza codificante GFP nella cornice di lettura, consentendo così la produzione di una proteina di fusione mCherry/GFP. Di conseguenza, le due proteine fluorescenti del sistema reporter sono co-espresse solo nelle celle in cui Cas9 è attiva. Inoltre, una sequenza WPRE è stata clonata nel vettore donatore, a valle della sequenza codificante il sistema reporter, per aumentarne l'espressione.

Per la generazione del secondo vettore virale di espressione, indicato anche come "vettore Cas9", i presenti inventori hanno usato lo scheletro plasmidico di PX551 codificante Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9) sotto il controllo del promotore di MECP2 (Swiech L. et al., "In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9" (2014) Nat Biotechnol, 19 ottobre doi: 10.1038 / nbt.3055). In ciascun vettore Cas9 malattia-specifico, sono stati clonati una sequenza nucleotidica costituita dalla sequenza bersaglio genomica mutante (indicata come "sequenza bersaglio"), che è complementare al sgRNA codificato dal rispettivo vettore donatore, insieme a una sequenza PAM situata al suo termine 3', tra il promotore di MECP2 e la sequenza codificante Cas9 utilizzando siti unici restrizione AgeI presenti sul plasmide PX551. A titolo di esempi illustrativi non limitativi, la Tabella 1 mostra i vettori di espressione usati in alcune forme di realizzazione del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione.

Tabella 1. Lista di vettori virali di espressione mutazione-specifici del sistema CRISPR-Cas9

La struttura generale dei vettori pAAV2.1_CMV_eGFP3 elencati nella Tabella 1 è mostrata in Figura 1 e comprende i seguenti elementi in direzione da 5’ a 3’: sequenza nucleotidica donatrice (SEQ ID NO:7, 8 o 9, vedere Tabella 2 sotto); promotore di CMV (SEQ ID NO.10); sequenza codificante (cds) per mCherry (SEQ ID NO.11); sequenza nucleotidica bersaglio (SEQ ID NO.12, 13 o 14, vedere la Tabella 2 di seguito); sequenza PAM 5'-GGG-3' o 5'-TGG-3'; sequenza codificante per GFP (SEQ ID NO.15); promotore U6 (SEQ ID NO.16); sequenza codificante il sgRNA mutante-specifico (SEQ ID NO.17, 18 o 19, vedere la Tabella 2 di seguito) e sequenza WPRE (SEQ ID NO.20).

La struttura generale dei vettori PX551 elencati nella Tabella 1 è mostrata in Figura 1 e comprende i seguenti elementi in direzione da 5’ a 3': promotore di MECP2 (SEQ ID NO.21); sequenza nucleotidica bersaglio che media l'auto-taglio dell'endonucleasi (SEQ ID NO.12, 13 o 14, vedere la Tabella 2 sotto); sequenza PAM 5'-GGG-3 'o 5'-TGG-3' e sequenza codificante Cas9 (SEQ ID NO.22 per SpCas9 o SEQ ID NO.23 per SaCas9).

Tabella 2. Lista delle sequenze donatrici mutazionespecifiche, sequenze bersaglio e sequenze codificanti per sgRNA

La sequenza codificante per sgRNA di SEQ ID NO.17 consiste delle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO.24 (sequenza nucleotidica codificante la sequenza guida) e SEQ ID NO.25 (sequenza nucleotidica codificante la sequenza “scaffold”); la sequenza codificante per sgRNA di SEQ ID NO.18 consiste delle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO.26 (sequenza nucleotidica codificante la sequenza guida) e SEQ ID NO.27 (sequenza nucleotidica codificante la sequenza “scaffold”); la sequenza codificante per sgRNA di SEQ ID NO.19 consiste delle sequenze nucleotidiche SEQ ID NO.28 (sequenza nucleotidica codificante la sequenza guida) e SEQ ID NO.29 (sequenza nucleotidica codificante la sequenza “scaffold”). Il primo e il secondo vettore virale di espressione così generati sono stati trasformati in cellule di Escherichia coli DH5-μ Competenti e cresciuti in terreno Luria-Bentani; i vettori sono stati purificati utilizzando EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Tutti i costrutti sono stati verificati mediante sequenziamento Sanger (GA3130 Genetic Analyzer, Thermo Fisher Scientific).

Esempio 1.6: Elettroporazione cellulare usando Sistema di Trasfezione Neon

Di seguito vengono illustrati i protocolli generali e specifici per il tipo di cellula che sono stati allestiti dai presenti inventori per ottenere la trasfezione cellulare.

Protocollo generale: le cellule sono state passate uno-due giorni prima dell'elettroporazione, in modo da avere culture del 70-90% confluenti nel giorno dell'esperimento. L'elettroporazione è stata eseguita utilizzando il sistema di trasfezione neon® seguendo il protocollo del produttore (Thermo Fisher Scientific®, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti). In breve, le cellule sono state raccolte in terreno di crescita senza antibiotici, contate per determinare la densità cellulare e centrifugate 100-400xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state successivamente lavate con 1x PBS, risospese in Buffer di Risospensione R (Thermo Fisher Scientific) ad una densità finale di 1,0x10<7 >cellule/ml e pipettate delicatamente per ottenere una sospensione a singola cellula. Le piastre di coltura sono state preparate riempiendo i pozzetti con terreno di coltura contenente siero e integratori senza antibiotici e pre-incubati in un incubatore umidificato a 37°C/5% di CO2. Un tubo Neon® con tampone elettrolitico da 3 ml (tampone E per puntali Neon® da 10 μl e tampone E2 per puntali Neon® da 100 μl) (Thermo Fisher Scientific) è stato posizionato nella stazione di pipette Neon® e le condizioni di impulso desiderate (specifiche per ciascun tipo di cella) sono state impostate sul dispositivo. La quantità appropriata di plasmide è stata quindi trasferita in una provetta da 1,5 ml da microcentrifuga sterile e le cellule sono state aggiunte alla provetta. Infine, la miscela di cellule/plasmidi è stata trasferita in un puntale Neon® che è stato inserito nella pipetta Neon® per l'elettroporazione.

Trasfezione dei fibroblasti: i fibroblasti primari sono stati raccolti con soluzione Tripsina (Irvine Scientific Santa Ana, California, Stati Uniti) e contati. Un totale di 4x10<5 >cellule sono state trasfettate utilizzando il Sistema di Trasfezione Neon<® >con 10 ug di DNA (5 μg del primo vettore virale di espressione contenente anche il sistema Reporter -vettore donatore- e 5 μg del secondo vettore virale di espressione contenente la sequenza codificante Cas9 -vettore Cas9-) e i seguenti parametri dello strumento: Voltaggio [V] 1700, Durata impulso [ms] 20, Numero impulso 1. Le cellule non trattate sono state utilizzate come controllo negativo, mentre le cellule elettroporate con un vettore virale di espressione codificante solo EGFP sono state utilizzate come controllo positivo della trasfezione. Dopo il trattamento, le cellule sono state piastrate in piastre da 60 mm con terreno senza antibiotici. L'efficienza di transfezione è stata stabilita con la microscopia a fluorescenza e l'analisi FACS (analisi delle cellule a fluorescenza attivata) 48 ore dopo la trasfezione.

Trasfezione delle cellule del lignaggio podocitario: un totale di 2x10<5 >di podociti derivati dalle urine isolati da pazienti affetti che presentano mutazioni nel gene COL4A3 [(c.1567G>A p.(Gly856Glu))] e nel gene COL4A5 [(c.1871G>A p.(Gly624Asp))] sono stati elettroporati utilizzando il sistema di trasfezione Neon<® >in conformità con il protocollo del produttore. Un totale di 5 μg del primo vettore virale di espressione contenente anche il sistema Reporter (vettore donatore) e 15 μg del secondo vettore virale di espressione contenente la sequenza codificante Cas9 (vettore Cas9) in un rapporto 1:3, sono stati co-trasfettati utilizzando le seguenti impostazioni dello strumento: Voltaggio [V] 1150, Durata impulso [ms] 20, Numero impulso 2. Le cellule non trattate sono state usate come controllo negativo mentre un plasmide codificante solo EGFP è stato usato come controllo positivo per l'efficienza di trasfezione. Dopo trasfezione, le cellule sono state piastrate su 6 piastre a pozzetti rivestite con gelatina umana allo 0,1% (Merck Millipore<®>, Burlington, Massachusetts, Stati Uniti), utilizzando terreno di crescita RE/MC senza penicillina/streptomicina. L'efficienza di trasfezione è stata confermata con microscopia a fluorescenza e analisi FACS 48 ore dopo la trasfezione.

Trasfezione delle cellule iPSCs: Le cellule sono state raccolte con Accutasi (Stem Cell Technologies) e 4x10<5 >cellule sono state trasfettate utilizzando il sistema di trasfezione Neon<® >con 10 μg di DNA (5μg del vettore donatore contenente anche il sistema Reporter e 5μg del vettore Cas9) utilizzando i seguenti parametri dello strumento: Voltaggio [V] 1100, Durata impulso [ms] 30, Numero impulso 1. Le cellule non trattate sono state usate come controllo negativo, mentre le cellule elettroporate con un plasmide codificante solo EGFP sono state utilizzate come controllo positivo della trasfezione. Dopo il trattamento, le cellule sono state piastrate su piastre da 12 pozzetti con terreno senza antibiotici. L'efficienza di transfezione è stata confermata con microscopia a fluorescenza e analisi FACS dopo 48 ore di post-trattamento.

Trasfezione delle cellule precursori neuronali: precursori neuronali (NPC) sono stati trasfettati con un vettore virale di espressione specifico per la mutazione per determinare l'efficienza della trasfezione e la trasduzione di Cas9. Le cellule sono state staccate dalla piastra con Accutasi (Stem Cell Technologies), diluite 1:1 con mezzo Eagle modificato di Dulbecco (GIBCO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti) e la trasfezione è stata eseguita utilizzando il sistema di trasfezione Neon® secondo il protocollo del produttore. Sono stati utilizzati un totale di 4x10<5 >di cellule e 10 μg di DNA (5 μg del vettore donatore contenente anche il sistema Reporter e 5 μg del vettore Cas9) e lo strumento è stato impostato con i seguenti parametri: Voltaggio [V] 1300, Durata impulso [ms] 20, Numero impulso 1. Dopo il trattamento, le cellule sono state piastrate su 12 piastre a pozzetti rivestite con Poly-L-Ornitina e Laminina (Sigma-Aldrich, Merck Millipore<®>, Burlington, Massachusetts, Stati Uniti) con terreno senza antibiotici. L'efficienza di transfezione è stata confermata con microscopia a fluorescenza e analisi FACS dopo 48 ore di post-trattamento.

Esempio 1.7: Trasfezione neuronale usando Lipofectamina

Un totale di 1x10<5 >cellule precursori neuronali (NPC) sono state piastrate su 12 pozzetti rivestiti con poly-L-Ornithine e Laminina (Sigma-Aldrich, Merck Millipore®, Burlington, Massachusetts, Stati Uniti) permettendo di legarsi in mezzo NB (DMEM: F12 senza Glutamax integrato con 1% di N2, 4% di B27 con Vitamina A, 55μM di beta-mercaptoetanolo e 1% di penicillina/streptomicina) per 3-4 ore e quindi il terreno è stato cambiato con terreno TD (terreno neurobasico integrato con 1% di N2 , 2% B27 con Vitamina A, 15 mM HEPES pH7,4, 1X L-Glutammina, 1X NEAA (AminoAcidi non essenziali), 55 μM betamercaptoetanolo, 1% penicillina/streptomicina, 200 nM acido ascorbico, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 10 mM dibutyryl-cAMP). Dopo 2 giorni le cellule sono state trattate con Mitomicina C da Streptomyces caespitosus (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, Stati Uniti) per selezionare positivamente i neuroni post-mitotici. I neuroni sono stati trasfettati con vettori virali di espressione specifici per la mutazione il giorno quindici. La trasfezione è stata eseguita utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, Stati Uniti) in conformità con il protocollo del produttore. L'efficienza di trasfezione è stata confermata con microscopia a fluorescenza e analisi FACS nel periodo da 3 a 8 giorni dopo il trattamento.

Esempio 1.8: Infezione AAV2/AAV9

I vettori virali di espressione secondo l'invenzione sono stati incapsidati presso il Vector Core Facility di TIGEM (http://www.tigem.it/corefacilities/vector-core) per produrre preparati virali adeno-associati. I sierotipi AAV 2 e 9 sono stati prodotti e testati su tutti i tipi di cellule pertinenti.

L'infezione da AAV9 è stata preceduta dal trattamento con Neuraminidasi al fine di esporre il Galattosio N-Linked che agisce come recettore di AAV9. Per questo scopo, le cellule sono state trattate con 50 mU di Endo- α -Sialidasi (Neuraminidasi) per 2 ore a 37°C. Il mezzo contenente Neuraminidase è stato quindi rimosso ed è stato aggiunto un terreno fresco contenente AAV9 e senza FBS e antibiotici. La piastra è stata centrifugata per 1 minuto a 1100 rpm e quindi incubata per 1 ora e 30 minuti a 4°C. Successivamente, è stato aggiunto terreno fresco con FBS e la piastra è stata incubata per una notte a 37 ° C. Dopo 24 ore è stato rimosso il terreno contenente il virus e aggiunto il terreno fresco. Dopo 48 ore la fluorescenza è stata quantificata mediante FACS.

Non è stato necessario alcun pretrattamento per l'infezione AAV2 perché il recettore, il proteoglicano di eparan-solfato associato alla membrana, è naturalmente presente non mascherato sulla superficie cellulare.

Esempio 1.9: Analisi di citometria a flusso e suddivisione delle cellule

Per effettuare l'analisi della citometria a flusso, i presenti inventori hanno utilizzato il citometro a flusso BD FACSaria II (BD Biosciences-US), che ha acquisito 10.000 eventi/pozzetto. I dati sono stati analizzati utilizzando un pacchetto software per citometria a flusso, come FlowJo v7.5. Il gate per le cellule vive era basato su spargimenti davanti (dimensioni) e laterali (granularità); un secondo gate è stato determinato per cellule vive basate su alta positività di mCherry ed EGFP per determinare la percentuale di cellule che sono state trasfettate con entrambi primo (vettore donatore) e secondo vettore virale di espressione (vettore Cas9). Al fine di isolare le cellule EGFP-positive per le analisi successive, le cellule sono state staccate e risospese in PBS/EDTA 20 mM. Le cellule sono state poste in ghiaccio e poi suddivise usando BD FACSAria II. Il DNA è stato estratto dalle cellule EGFP+ usando il kit micro Qiamp DNA (Qiagen, Hilden, Germania).

Esempio 1.10 Sequenziamento Ion Torrent S5

Il kit “Ion AmpliSeq 2.0TM Library” (Life TechnologiesTM, Carlbad, CA) è stato utilizzato per la preparazione di una libreria. Il kit ha permesso di ottenere una libreria con codice a barre dei geni coinvolti nella malattia in analisi, seguendo il protocollo del produttore Life Technologies. Le librerie sono state purificate utilizzando il sistema Agencourt AMPure XP e quantificate utilizzando il reagente Qubit® dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen Corporation, Life TechnologiesTM), unite in un rapporto equimolare, legate a sfere trasportatrici (Ion SphereTM Particles, Life Technologies) ed amplificato clonalmente mediante PCR ad emulsione (emPCR) utilizzando il sistema Ion ChefTM (Ion ChefTM, Life Technologies). I chip Ion 510TM, 520TM o 530TM sono stati caricati con sfere contenenti stampi di DNA a singolo filamento e sequenziati sullo Ion Torrent S5 utilizzando il kit Ion S5TM Sequencing, in conformità con il protocollo del produttore Life Technologies.

Esempio 1.11: Analisi NGS

Per eseguire l'analisi NGS, i file FASTQ per i campioni di cellule trasfettate e i relativi controlli, che vengono restituiti dalla piattaforma di sequenziamento per ciascuna malattia (S5 Torrent Server VM), sono stati caricati nello strumento di analisi online CasAnalyzer (http://www.rgenome.net/cas-analyzer/#!) insieme alle sequenze di sgRNA disegnate per ciascuna mutazione, la sequenza nucleotidica donatrice e la sequenza bersaglio mutante. Si è così ottenuta la percentuale di riparazione per omologia diretta (HDR) raggiunta, considerando un adeguato intervallo di confronto (R) di nucleotidi intorno al sito di taglio.

Il software restituisce una tabella utilizzata per ulteriori analisi bioinformatiche mediante scripts ad hoc (PythonTM Software Foundation License) per il calcolo di inserzioni/delezioni.

I file .bam e .bai, per ciascun campione, sono stati caricati sul software di visualizzazione IGV (Broad Institute, Cambridge, Stati Uniti) per visualizzare con precisione la percentuale di modifica per ogni nucleotide mutato.

Esempio 1.12: Analisi dei fuori bersaglio con GUIDE-Seq

Allo scopo di valutare l'attività fuori bersaglio del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione, i presenti inventori hanno condotto esperimenti dedicati. A tale fine è stata condotta un'analisi Guide-seq come illustrato in Tsai SQ et al, "GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases"; (2015) Nat Biotechnol. 2015 Feb; 33 (2): 187-197), utilizzando come modello in vitro cellule HEK293 che portano mutazioni paziente-specifiche. Le cellule HEK293 sono state coltivate in Advanced DMEM (Life TechnologiesTM, Carlsbad, California, Stati Uniti) addizionate con FBS al 10%, GlutaMax 2 mM (Life TechnologiesTM, Carlsbad, California, Stati Uniti) e penicillina/streptomicina all'1% a 37°C con 5% di CO2. Le cellule sono state seminate in sei pozzetti a 2x10<5 >cellule/pozzetto il giorno prima dell'esperimento. Le cellule HEK293 sono state trasfettate con X-tremeGENE™ HP DNA Transfection Reagent secondo le istruzioni del produttore, utilizzando 250 ng di un primo plasmide codificante per le sequenze sgRNA mutazione-specifiche e donatrici (vettore donatore), 750 ng di un secondo plasmide codificante spCas9 (vettore Cas9) e 10 pmoli di oligodeossinucleotidi appaiati a doppia elica (dsODN) che sono integrati nei siti di taglio generati da Cas9 per mezzo di NHEJ. L'integrazione dsODN consente la successiva identificazione di rotture fuori bersaglio utilizzando l'amplificazione non distorta e il sequenziamento di nuova generazione (vedi sotto). Inoltre, sono stati aggiunti 50 ng di un plasmide PBML4 che codifica per la resistenza alla puromicina e viene utilizzato per selezionare positivamente le cellule trasfettate. La selezione è stata effettuata 48 ore dopo la trasfezione con 1 ug/ml di puromicina. Anche l'efficienza di transfezione è stata valutata utilizzando l'analisi FACS.

Il DNA genomico (gDNA) è stato isolato dalle cellule trasfettate utilizzando il Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega), frammentato con uno strumento Diagenode Bioruptor ad una lunghezza media di 500 bp, utilizzando un totale di 1 μg di gDNA in 100 μl di acqua DNA per soddisfare le specifiche dello strumento. Dopo la quantificazione con Qubit (Invitrogen), il DNA è stato purificato con sfere AMPure XP (Beckman Coulter) secondo il protocollo GUIDE-seq. Un totale di 400 ng di gDNA sono stati usati come partenza per la preparazione della libreria, seguiti da adattatori riparati all'estremità, con coda di A e mezzo-funzionale, che incorporano un indice molecolare casuale da 8-nt. Due cicli di PCR ancorata annidata, con primer complementari al tag oligo, sono stati utilizzati per l'arricchimento del bersaglio. Le librerie sono state ottenute utilizzando Kapa Biosystem Kit e quantificate con il kit Illumina Library Quantification in base alle istruzioni del produttore. Successivamente, le librerie sono state denaturate e caricate sullo strumento Illumina Miseq in base al protocollo standard Illumina per il sequenziamento con un kit di reagenti Miseq Illumina V2-300 Cycle. I dati di sequenziamento sono stati analizzati utilizzando strumenti disponibili in rete gratuiti come Tracking of Indels by Decomposition (TIDE: http://tide.nki.nl) e Interference of CRISPR Edits (ICE: https://ice.synthego.com/#/) per quantificare l'efficacia della modifica e identificare e quantificare simultaneamente le inserzioni e le delezioni (indel) indesiderate predominanti nel gruppo di cellule bersaglio.

Esempio 1.13: Efficienza di modifica

Allo scopo di valutare l'efficienza di editing (modifica) del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione, sono stati impiegati due approcci diversi come descritto di seguito.

Sistema 1: Efficienza di editing (modifica) di LRRK2 (p.(Gly2019Ser)) e GBA (p.(Leu444Pro)) con sistema CRISPR/Cas9-AAV in cellule murine. I neuroni primari dal modello murino di Parkinson (PD) sono stati co-trasdotti con (i) vettore AAV comprendente la sequenza codificante saCas9 (SEQ ID numero NO.6), (ii) vettore AAV comprendente una sequenza nucleotidica codificante per un sgRNA mirato alla mutazione (p.(Gly2019Ser)) ((pAAV2.1_CMV_eGFP3 LRRK2 c.6055G> A di SEQ ID NO.5), o (iii) vettore di controllo AAV comprendente una sequenza codificante lacZ sgRNA. Come indice di risultato, sono stati valutati la riduzione della complessità dei neuriti (analisi di numero e lunghezza dei neuriti utilizzando il software NeuronJ) e l'attività della chinasi LRRK2 (analisi della fosforilazione della chinasi di LRRK2 e del substrato Rab10 mediante immunoblotting) rispetto ai livelli naturali (wild type-WT). Per il CRISPR/Cas9-AAV mirato a GBA p.Leu444Pro, l'attività enzimatica di GBA è stata misurata nei lisati cellulari come precedentemente descritto (Ferrazza R. et al., "LRRK2 deficiency impacts ceramide metabolism in brain"; (2016) Biochem Biophys Res Comm. 23; 478 (3): 1141 -6). E’ stata anche valutata l’efficacia delle cellule con il gene corretto nel recuperare i difetti mitocondriali riportati. Sono stati anche eseguiti procedimenti di sequenziamento per verificare gli effetti fuori bersaglio.

Sistema 2: Efficienza di editing (modifica) con il sistema CRISPR/Cas9 COL4 e GAA nei podociti e nelle cellule muscolari.

Per trasdurre i podociti della sindrome di Alport (ATS) e le cellule muscolari dai pazienti di Pompe, una molteplicità di infezioni (MOI), tra 10<4 >e 10<6>, è stata utilizzata per valutare la specificità del sistema di modifica (editing) della correzione genica per l'infezione in-vitro. I podociti ATS sono stati co-trasfettati con i vettori virali di espressione pAAV2.1_CMV_eGFP3 COL4A5 c.1871G> A (SEQ ID NO.1) e PX551 COL4A5 c.1871G> A spCas9 (SEQ ID NO.2). Per valutare l'efficienza della trasfezione, i presenti inventori hanno impiegato il sistema reporter mCherry/Green, che produce una variazione della fluorescenza da rosso a verde facilmente rilevabile 72 ore dopo l'infezione. L’unica popolazione di cellule fluorescenti verdi è stata recuperata utilizzando la tecnologia di suddivisione FACS allo scopo di eseguire Sanger Sequencing e Whole-Exome Sequencing (WES) per valutare l'efficienza, la specificità di correzione e l'indice dei fuori bersaglio del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione. Si è considerato raggiunto l'obiettivo primario se la correzione in vitro è stata ottenuta in un intervallo tra il 40% e il 50% della popolazione cellulare.

Esempio 1.14: Modelli murini

Trasporto periferico di AAV

I topi sono stati trattati con dosaggi diversi di AAV che alloggiavano i vettori CRISPR/Cas9 di correzione, da 5x10<10 >a 5x10<13>, a diverse età quasi corrispondenti alla finestra terapeutica presa in esame nell'uomo per le diverse malattie trattate.

Le particelle AAV CRISPR/Cas9 sono state somministrate tramite iniezione nella vena della coda. Sono state analizzate diverse dosi virali (approccio dose-escalation); sono state inoltre analizzate iniezioni ripetute con un calendario definito. Gli animali giovani (P1-P6) sono stati sottoposti ad iniezione per simulare le condizioni per uno studio nei pazienti. E’ stata valutata l'efficienza e la specificità della correzione genica con le diverse condizioni di trattamento in diversi tessuti e regioni del cervello (corteccia, ippocampo, striato, cervelletto). A tale scopo, i tessuti sono stati isolati 60 giorni dopo il trattamento (per iniezioni ripetute, è considerata l'ultima) e il DNA estratto da questi tessuti è stato sottoposto sia al dosaggio T7E1 sia al sequenziamento profondo per valutare l'efficienza della correzione e la possibile generazione di indel dovuti a taglio di Cas9 senza correzione diretta da HDR.

È stata eseguita una caratterizzazione accurata dello stato di salute generale dei topi trattati, ivi incluso il monitoraggio regolare del peso corporeo e della chimica ematologica standard. Gli animali sono stati sacrificati 60 giorni dopo il trattamento per eseguire analisi istologiche per la potenziale tossicità epatica e danni ad altri organi. I tessuti degli animali sacrificati sono stati impiegati anche per la caratterizzazione della biodistribuzione del genoma virale in diversi tessuti eseguendo RT-PCR quantitativa. Dosi virali efficaci e il numero di iniezioni nel fenotipo mutante reversibile sono stati determinati confrontando topi Knock-in non trattati e trattati. In particolare, sono stati utilizzati animali dei seguenti gruppi: i) topi KI iniettati con LacZ CRISPR/Cas9-AAV, ii) topi WT iniettati con LacZ CRISPR/Cas9-AAV e iii) topi KI iniettati con AAV CRISPR/Cas9 mutazione-specifico. I topi sono stati inoltre iniettati per via intraperitoneale con dosi di AAV CRISPR/Cas9 che vanno da 10<11 >a 10<15 >genomi virali (vg)/Kg. La distribuzione delle emissioni di fluorescenza GFP è stata visualizzata in tempo reale utilizzando il sistema IVIS Lumina III in combinazione con l'imaging confocale a due fotoni in-vivo. Gli animali sono stati esaminati a 30, 60, 90 e 120 giorni dopo l'iniezione e la dose e la tempistica ottimali sono state identificate e utilizzate per i seguenti esperimenti. La percentuale di cellule corrette è stata determinata mediante imaging GFP di fette di tessuto fissate. Con specifico riferimento al modello murino del morbo di Parkinson, il recupero dei fenotipi associati a LRRK2 in topi geneticamente modificati è stato valutato sulla base della riduzione della complessità dei neuriti mediata dalla mutazione LRRK2. Il numero dei neuriti e la lunghezza dei neuroni dopaminergici sono stati analizzati utilizzando sezioni organotipiche. Fette di cervello (300 nm), nel numero di quattro per ciascun emisfero, che comprendono la via nigro-striatale, sono state fissate e quindi colorate. I neuroni positivi alla GFP e alla tirosina idrossilasi (TH) (almeno 50) sono stati analizzati come sopra descritto. La valutazione effettuata dai presenti inventori era anche basata sul ripristino dell'attività della chinasi LRRK2. L'autofosforilazione di LRRK2 S1292 e la fosforilazione di Rab10 mediata da LRRK2 in cellule del mesencefalo GFP-positive al FACS sono state monitorate mediante immunoblotting (IB). Inoltre, nella presente analisi è stato studiato il recupero dell’accumulo di aSyn fosforilato S129. Mediante IB è stato valutato l’aSyn fosforilato nelle cellule da mesencefalo GFP-positive al FACS.

Nella presente invenzione, è stato valutato il ripristino di fenotipi associati a GBA in animali sottoposti a correzione genica mediante analisi dell'attività di GBA in lisati di tessuti cerebrali e periferici (rene, polmone, fegato) da cellule GFP-selezionate dagli animali. Inoltre, l'accumulo/fosforilazione di aSyn è stato determinato mediante IB e immunoistochimica su diverse regioni del cervello (mesencefalo, striato, corteccia) di animali di 4 mesi (8 settimane dopo l'iniezione) e di 8 mesi (6 mesi dopo l'iniezione) (5 animali per gruppo, per età). Infine, il ripristino dei difetti dei mitocondri mediante somministrazione di L444P GBA CRISPR/Cas9-AAVs è stato valutato in fettine cerebrali da topi sottoposti a editing genomico e di controllo mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di tessuto fissato.

Trasporto di AAV nell'arteria intra-renale nel modello canino.

In questo modello animale, i cani maschi affetti da ATS sono stati trattati a 8 settimane di età, che è l'età generalmente precedente al verificarsi di microalbuminuria, che rappresenta attualmente la prima indicazione clinica della malattia ATS nei cani. Una singola cateterizzazione dell'arteria femorale è stata utilizzata per trasferire in vivo il sistema di correzione basato su wt-AAV2-CRISPR/Cas9 (vettori di SEQ ID NO.1 e 2) o il sistema mut-AAV2-CRISPR/Cas9, iniettando in entrambe le arterie sotto guida fluoroscopica. Questa procedura è stata eseguita con i seguenti due dosaggi: 10<11>-10<12 >e 10<13>-10<14>. Il mut-AAV2-CRISPR/Cas9 è stato usato come controllo negativo. I cani venivano regolarmente esaminati per 15 mesi o fino all'eutanasia, se necessaria a causa di malattia renale allo stadio terminale e/o malattia clinica grave. Ogni 2 settimane è stata eseguita l'analisi delle urine, il rapporto proteina-creatinina urinaria (UPC) e la concentrazione sierica di creatinina (sCr). Una valutazione più completa (emocromo completo, pannello di chimica e clearance di ioexolo) è stata eseguita al basale (8 settimane di età, immediatamente prima del trattamento) e successivamente almeno ogni 3-4 mesi, generalmente corrispondente alla raccolta di biopsie renali. In ogni occasione di prelievo, sono stati raccolti almeno 5 ml di urina e 5 ml di sangue per l’analisi immediata e per l'immagazzinamento a -80°C per potenziali analisi future. Quando doveva essere eseguita la clearance di ioexolo, è stato utilizzato un protocollo di campionamento a 8 punti, con 2 ml di sangue raccolti ad ogni tempo di campionamento (circa 16 ml totali). Le biopsie renali sono state raccolte dopo il primo mese e dopo tre, sei e dodici mesi dall'infezione. Biopsie multiple sono state raccolte in ciascun momento per varie valutazioni patologiche. Il punteggio e la pressione arteriosa sono stati determinati su base mensile a partire dalle 8 settimane di età. L'efficacia della terapia genica è stata valutata in base ai seguenti parametri: i) capacità di innescare la produzione di un eterotrimero α3-α4-α5 corretto e di conseguenza una corretta produzione di GBM da parte dei podociti e ii) recupero (o recupero parziale) della funzione renale dopo la correzione.

La prova della corretta produzione di GBM nelle biopsie renali raccolte è stata valutata mediante immunocolorazione per catene COL4 alfa usando anticorpi COL4A3, COL4A4 e COL4A5 nei specifici punti selezionati post-infezione. Come indicato sopra, la funzione renale è stata regolarmente valutata per monitorare l'evidenza clinica della progressione della malattia. I podociti derivati dalle urine sono stati esaminati mensilmente analizzando la funzione dei podociti e il tasso di perdita dei podociti. La perdita di podociti è stata determinata come rapporto tra numero di podociti nel pellet di urina ottenuto da un volume specifico di urina, normalizzata verso la concentrazione di creatinina nelle urine e/o microematuria (dati personali). La funzione dei podociti è stata valutata utilizzando l'assunzione di albumina e la produzione di VEGF-A, parametri associati a podociti differenziati e funzionali. La terapia è stata considerata parzialmente efficace se l'insorgenza di azotemia (sCr > 1,2 mg/dl) è stata ritardata oltre le 40 settimane di età e/o malattia allo stadio terminale (sCr > 5 mg/dl) è stata ritardata oltre le 60 settimane di età, con almeno parziale recupero della produzione di COL4α3-α4-α5 in assenza di effetti collaterali rilevanti. La terapia è stata ritenuta sostanzialmente efficace se non si è avuto sviluppo di azotemia entro 1 anno dopo il trattamento e/o se è stato determinato nei podociti derivati dall'urina un intervallo di correzione tra il 40% e il 50% nel tempo e la podocituria e la proteinuria erano da lievi ad assenti.

Trasporto intramuscolare di AAV

Topi knockout (KO) GAA neonatali sono stati iniettati con un sistema CRISPR/Cas9 GAA a due vettori bilateralmente nei muscoli gastrocnemi alla nascita e a P1 per massimizzare la quantità di vettore iniettato (7×10<10 >vg totale in 40 μl, 10μl per GA in P0 e a P1), o in entrambi i tricipiti e muscoli gastrocnemi (7×10<10 >vg a 1,6x10<11 >vg totale in 80μl, 10μl per muscolo a P0 e a P1). I topi iniettati sono stati confrontati con topi eterozigoti di età corrispondente per l’attività spontanea a ~100 giorni di età utilizzando un sistema di attimetri (Activmeter; Bioseb, Vitrolles, Francia). Questo apparecchio utilizza le vibrazioni all'interno della gabbia per misurare i sensori di locomozione, e fotocellule a infrarossi per registrare il numero di impennate di movimenti. La distanza percorsa (cm), la velocità media (cm/s) e il numero di impennate di movimenti sono stati misurati su un periodo di 60 minuti. Sono stati calcolati la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier e la curva di peso dei topi knock-out GAA neonatali iniettati in gastrocnemio e in entrambi gastrocnemio e tricipiti.

Esempio 1.15: Studi umani

I presenti inventori hanno effettuato analisi longitudinali di pazienti allo scopo di tradurre l'approccio AAV CRISPR/Cas9 in uno studio pilota.

Per tutte le suddette patologie (Sindrome di Alport, Malattia di Parkinson, Malattia di Pompe, Sindrome di Rett), sono stati condotti studi per valutare la sicurezza, tollerabilità ed efficacia della terapia genica con il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione in pazienti. Per creare un progetto su misura per gli studi che mirano a tradurre clinicamente l'approccio AAV CRISPR/Cas9, è stata assemblata una coorte di pazienti che presentavano mutazioni genomiche associate alla malattia per determinare le caratteristiche cliniche e la progressione naturale della malattia. Una coorte di 190 pazienti (60 con sindrome di Rett, 10 con malattia di Pompe, 80 con sindrome di Alport e 40 con malattia di Parkinson) è stata arruolata per valutare la finestra terapeutica più appropriata per il trasferimento del gene. Alla visita di base sono stati raccolti il consenso informato compilato e firmato, i criteri di inclusione ed esclusione, la storia medica/chirurgica, i farmaci attuali, l’abitudine tabagica, l'altezza e il peso. La valutazione degli esiti clinici nell'ambito del protocollo standard è stata studiata per almeno 20 anni prima per la sindrome di Rett e per la malattia di Pompe e almeno per 50 e 80 anni per la sindrome di Alport e il morbo di Parkinson, rispettivamente.

Il disegno specifico della sperimentazione in termini di dosi virali è stato definito sulla base degli studi precedentemente descritti nei topi o nei cani. È stato preso in considerazione un disegno che prevedeva dosi virali tra 6,7x10<13 >mg/kg e 2,0x10<14 >mg/kg. La pianificazione della sperimentazione clinica comprendeva la definizione di dosaggi virali, a singole o multiple dosi e, in quest'ultimo caso, l'intervallo tra le dosi. Gli effetti terapeutici sono stati valutati per un periodo di almeno dodici mesi. I pazienti sono stati testati al basale e le visite di monitoraggio sono state programmate ai giorni 7, 14, 21, 30 e successivamente una volta al mese fino alla conclusione dello studio. Durante le visite di riferimento e di monitoraggio i pazienti sono stati sottoposti a visita clinica, biochimica e strumentale in base alla specifica malattia. Un'analisi primaria per l'efficacia è stata valutata quando tutti i pazienti hanno raggiunto 12 mesi dopo la dose. Un'analisi di monitoraggio di sicurezza è stata completata nel momento in cui l'ultimo paziente ha raggiunto i 24 mesi dopo la dose. Al completamento del periodo di studio di 2 anni, i pazienti vengono monitorati annualmente secondo lo standard di cura fino a 15 anni.

I pazienti con sindrome di Rett sono stati valutati quando necessario con visite a domicilio. La valutazione comprendeva l'esame clinico, l'analisi EEG, la valutazione della qualità della vita (CHQ), la scala di gravità clinica (CSS) e la valutazione comportamentale motoria (MBA). L'attività basale del recettore GABA è stata valutata e utilizzata sia come biomarcatore della progressione della malattia sia per monitorare l'efficacia del trattamento. L'analisi combinata di tutte le misurazioni precedenti ha permesso di definire il momento migliore per l'inizio del trattamento. È anche essenziale definire i parametri clinici che devono essere considerati prima del trattamento e identificare i test più appropriati e le misure di risposta per la valutazione dell'efficacia del trattamento alla fine dello studio.

I pazienti con malattia di Parkinson portatori di mutazioni associate alla malattia sono stati selezionati e caratterizzati in base a scale di valutazione cliniche dedicate per le caratteristiche motorie e non motorie (ad esempio MDS-UPDRS, questionario sulla malattia di Parkinson, scala di Hoehn-Yahr, scala di valutazione dei sintomi non motori e altri questionari validati disponibili). Le valutazioni cliniche sono state videoregistrate ed eseguite utilizzando una batteria neuropsicologica validata per PD e test per la funzione autonoma cardiovascolare. Tutti i pazienti sono stati sottoposti ad una scansione MRI al basale e una scansione del trasportatore 123I-ioflupano-dopamina (DAT). I pazienti con disautonomia simpatica sono stati sottoposti anche a una scansione con 123I-meta-iodobenzilguanidina (MIBG). Le coorti dei pazienti vengono valutate longitudinalmente ad intervalli annuali per quantificare la progressione naturale della malattia utilizzando gli stessi parametri di valutazione. La scansione DAT ed eventualmente la scansione MIBG vengono ripetute due anni dopo la valutazione basale.

L'efficacia è stata valutata sulla base di esami clinici, biochimici e strumentali. Ulteriori misure specifiche dell’outcome sono state definite sulla base dei risultati dei test effettuati sui topi.

Per quanto riguarda l'ATS, alla visita basale sono stati raccolti i parametri clinici e biochimici (GFR, creatininemia, clearance della creatinina, livelli di microalbuminuria/proteinuria). A ogni visita di controllo sono stati annotati i dati dell'esame fisico comprendenti esame cardiologico dettagliato, peso corporeo, misurazione dell'altezza, ECG, esame ematologico (Hb, Ht, WBC-diff, piastrine), biochimica (ALT, AST, creatinina, clearance della creatinina, livelli di proteinuria/creatinuria), eGFR, test di gravidanza su urine (per donne in età fertile), dieta.

Per quanto riguarda la Malattia di Pompe, alla visita di base, come misura di risposta primaria, è stata misurata la funzione cardiaca attraverso lo Z-score della massa ventricolare sinistra (LVM-Z). I punteggi Z indicano il numero di deviazioni standard (SD) dalla media in una distribuzione normale. Un cambiamento negativo rispetto al basale indica una diminuzione e il cambiamento positivo rispetto al basale indica un aumento del Z-score della LVM. L'intervallo normale è da -2 a 2 e maggiore di 2 può indicare ipertrofia ventricolare sinistra.

Lo stato di sviluppo motorio è stato valutato anche dai punteggi percentuali totali della scala della funzione motoria globale -88 (GMFM-88) e sono state eseguite misure ripetute durante le visite di controllo. GMFM-88 è una misura di 88 elementi per valutare la funzione motoria grossolana. In alternativa, per la malattia a esordio precoce la scala modificata Hammersmith è stata utilizzata per testare la funzione motoria.

2. RISULTATI

Al fine di dimostrare l'efficacia, la sicurezza e il potenziale terapeutico del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione, i presenti inventori hanno condotto studi come prova del concetto utilizzando come modello di malattia quattro diversi disturbi monogenici, vale a dire la sindrome di Alport, la sindrome di Rett, malattia di Pompe e malattia di Parkinson.

Esempio 2.1: AAV2 e AAV9 offrono la massima efficienza di infezione

Per impostare un protocollo di infezione efficiente adatto ai vari tipi di cellule isolate dal paziente, cellule diverse sono state infettate con virus di controllo che esprimono solo la proteina EGFP (vettore di espressione virale pAAV2.1_CMV_eGFP3). In tali esperimenti, sono stati testati entrambi i sierotipi AAV2 e AAV9. Come mostrato in Figura 3, quando è stato utilizzato AAV2, è stato raggiunto un livello di infezione del 24% nelle cellule staminali pluripotenti indotte ed è stato raggiunto un livello di infezione del 67% nei precursori neuronali con una molteplicità di infezione (MOI) di 1x10<5 >e 2x10<5>, rispettivamente. Impiegando AAV9, un livello di infezione del 48% è stato determinato nei fibroblasti e del 17% nei neuroni con una molteplicità di infezione (MOI) di 3x10<5 >(Figura 3).

Poiché uno specifico trofismo renale è stato segnalato sia per AAV2 che AAV9, i presenti inventori hanno testato entrambi i sierotipi su cellule della linea podocitaria per definire il sierotipo più idoneo ad essere utilizzato al fine di ottenere la massima efficienza di trasfezione. Usando il virus AAV2 e una molteplicità di infezioni (MOI) di 10<5>, è stata raggiunta un'efficienza delle infezioni dell'86% nelle cellule della linea podocitaria rispetto a un livello di infezione del solo 40% ottenuto utilizzando un vettore AAV9 (Figura 4). Esempio 2.2: Correzione dei geni mutanti FOXG1 e MECP2 in sistemi cellulari

Per valutare l'efficienza dell’editing genico del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione, sono stati selezionati pazienti con Sindrome di Rett con mutazioni in MECP2 [(c.473C>T (p.(Thr158Met))] o FOXG1 [c.688C>T (p.(Arg230Cys)) o c.765G>A (p.(Trp255*))]. Vettori virali di espressione sono stati generati come descritto nell'esempio 1.5 specifici per ciascuna mutazione, cioè comprendenti una sequenza codificante un gRNA specifico per la mutazione insieme ad una sequenza donatrice costituita dalla sequenza di tipo selvatico, e un test funzionale è stato eseguito dopo l'elettroporazione nelle cellule HEK293L. Questi vettori virali di espressione (vettori donatori) contenevano anche un sistema reporter composto da sequenze codificanti mCherry e GFP. Le cellule HEK293 sono state trasfettate con il vettore donatore da solo o in combinazione con il vettore virale di espressione comprendente la sequenza nucleotidica codificante per Cas9 (vettore Cas9). L'analisi FACS (cellule di selezione attivate fluorescenti) è stata eseguita su cellule transfettate 48 ore dopo la trasfezione. Nelle cellule transfettate con il solo vettore donatore, è stata rilevata l'espressione mCherry ma non l'espressione GFP. Al contrario, nelle cellule trasfettate con entrambi i vettori donatore e Cas9, una percentuale di cellule positive al mCherry ha anche espresso GFP (69,9% e 47,1% rispettivamente), confermando l'attivazione di Cas9. Per confermare ulteriormente l'espressione dei vettori in cellule specifiche del paziente, i fibroblasti primari sono stati trasfettati con i vettori virali di espressione specifici per la mutazione c.473C>T (p.(Thr158Met)) di MECP2 (Vettore donatore di SEQ ID NO.3 e vettore Cas9 di SEQ ID NO.4, rispettivamente) e la mutazione FOXG1 c.688C> T (p. (Arg230Cys)). La fluorescenza è stata visualizzata in vivo 48 ore dopo la trasfezione (ingrandimento 40X) e quantificata mediante FACS, confermando l'espressione del sistema CRISPR-Cas anche in queste cellule (Figura 5).

Dopo aver validato l'espressione, i presenti inventori hanno valutato l'efficienza di correzione della mutazione del sistema CRISPR-Cas dell'invenzione in fibroblasti di pazienti portatori della mutazione c.473C>T (p. (Thr158Met)) di MECP2 o della mutazione c.688C>T (p. (Arg230Cys)) di FOXG1. Le cellule mCherry+/GFP+ co-trasfettate sono state isolate usando BD FACSAria II (BD Biosciences-US). Il DNA totale è stato estratto da queste cellule e analizzato con NGS. L'efficacia della procedura di editing genomico è stata valutata con lo strumento Cas-Analyzer (http://www.rgenome.net/casanalyzer/#!) utilizzando i dati NGS e considerando una regione di 100 nucleotidi intorno al sito di taglio. Per la mutazione c.688C>T (p.(Arg230Cys)) di FOXG1, tenendo conto che il campione originale di cellule era costituito da cellule eterozigoti, i risultati NGS hanno mostrato una variazione nella proporzione dell'allele mutante da circa il 50% al 14% in seguito a editing genomico. Il Cas-analyzer ha indicato che il 22% degli alleli mutanti era stato modificato con successo. Per la mutazione c.473C>T (p.(Thr158Met)) di MECP2, i risultati dell'analisi di sequenziamento hanno dimostrato che la proporzione di alleli di tipo selvatico passa dal 50% al 70-80% e che la modifica è stata completata con successo nel 64% degli alleli.

Esempio 2.3: Analisi GUIDE-seq per la valutazione dei fuori bersaglio

Per determinare l'occorrenza di eventi fuori bersaglio, è stata eseguita l'analisi Guide-seq su cellule HEK293 che presentavano la mutazione c.473C>T (p.(Thr158Met)) di MECP2. A questo scopo, le cellule sono state co-trasfettate con il vettore donatore di SEQ ID NO.3 e il vettore Cas9 di SEQ ID NO.4 insieme a oligodeossinucleotidi a doppio filamento (dsODN) e plasmide PBML4. Dopo la selezione delle cellule co-trasfettate, è stato estratto il DNA e sequenziato sullo strumento Illumina Miseq. Le analisi informatiche condotte sui risultati del sequenziamento hanno dimostrato la presenza di tagli fuori bersaglio in meno dell'1% delle letture. In tutti i casi, i tagli aberranti generati da Cas9 si trovavano in sequenze non codificanti.

Esempio 2.4: Correzione delle mutazioni COL4 nelle cellule di lignaggio podocitario di Alport

Per confermare che il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione è adatto ad essere utilizzato nelle cellule di linea podocitaria di pazienti con Sindrome di Alport, i presenti inventori hanno verificato la correzione da editing genico di specifiche mutazioni bersaglio in cellule derivate da paziente. Due linee cellulari stabili di podociti che presentano la mutazione specifica c.1871G>A (p.(Gly624Asp)) nel gene COL4A5 e la specifica mutazione c.2567G>A (p.(Gly856Glu)) nel gene COL4A3, rispettivamente, sono state trasfettate usando il sistema a doppio vettore dell'invenzione che porta una combinazione Cas9/sgRNA per un taglio mirato sul DNA a doppio filamento insieme ad uno stampo DNA donatore per la neo-sintesi di un frammento di DNA di tipo selvaggio. In particolare, il vettore donatore di SEQ ID NO.1 e il vettore Cas9 di SEQ ID NO.2 sono stati impiegati per mirare alla mutazione c.1871G> A di COL4A5. Anche in questi esperimenti, è stato utilizzato il sistema reporter mCherry/GFP per l'identificazione delle cellule in cui è avvenuta la correzione della mutazione bersaglio. Dopo 48 ore dalla trasfezione, le cellule sono state selezionate utilizzando BD FACSAria II (BD Biosciences-US), per recuperare le cellule doppio positive (fluorescenza rosso/verde). Il DNA totale è stato estratto da queste cellule e analizzato mediante sequenziamento profondo attraverso Ion Torrent S5 (Life TechnologiesTM, Carlsbad, California, Stati Uniti).

I campioni transfettati e i file di controllo FASTQ, restituiti dalla piattaforma di sequenziamento, sono stati caricati nello strumento di analisi online CasAnalyzer (http://www.rgenome.net/cas-analyzer/#!), al fine di ottenere la percentuale di HDR che è stato raggiunto, considerando un intervallo di confronto (R) di 50 nucleotidi attorno al sito di taglio.

I risultati di questa analisi hanno mostrato che il sistema CRISPR-Cas dell'invenzione è estremamente efficace nel ripristinare stabilmente la mutazione causativa nel gene COL4A5 (percentuale del 33,2% HDR) e nel gene COL4A3 (percentuale del 30,4% HDR). Per entrambe le mutazioni corrette, il software di visualizzazione IGV (Broad Institute, Cambridge, Stati Uniti) è stato utilizzato per visualizzare sia l’eliminazione che la sostituzione della base mutante e gli eventi di inserzione/delezione erroneamente presenti nei siti vicini.

Esempio 2.5: Modelli murini

Prova del concetto della trasduzione del sistema nervoso centrale (SNC) mediante iniezione periferica nei topi con sindrome di Rett, Pompe e PD.

Poiché AAV9 è in grado di attraversare la barriera emato-encefalica, i presenti inventori hanno confrontato l'iniezione intracranica per mezzo del sistema di stereotassi con l'iniezione periferica attraverso la vena superficiale della coda. Un esperimento preliminare condotto in-vivo su topi di tipo selvatico ha dimostrato che la somministrazione periferica di vettori AAV9 mediante iniezione endovenosa di genomi virali 2x10<11 >(vg) è stata in grado di raggiungere i neuroni centrali come dimostrato dall'immunoistochimica eseguita dopo 48 ore. L'iniezione endovenosa è stata eseguita in topi di 9 mesi con 5x10<12 >mg/kg. Nel modello della malattia di Pompe, l'iniezione intramuscolare nei muscoli gastrocnemi alla nascita e a P1 per massimizzare la quantità di vettore iniettato (7x10<10 >vg totale in 40μl, 10μl per GA in P0 e in P1) è stata confrontata con l'iniezione muscolare in entrambi i tricipiti e muscoli gastrocnemi (7x10<10 >vg a 1,6x10<11 >vg totale in 80μl, 10μl per muscolo a P0 e a P1). L'iniezione combinata è risultata più efficiente nel raggiungere la localizzazione sia muscolare che del SNC. Mentre l'iniezione intracranica diretta ha comportato un aumento di cinque volte dell'efficienza di editing, l'iniezione periferica per via endovenosa o intramuscolare è stata considerata sufficiente per osservare un effetto fenotipico.

Prova di concetto della correzione in-vivo mediante iniezione in arteria intrarenale in un modello di cane ATS.

Basandosi sui dati in-vitro, i presenti inventori hanno messo a punto uno studio preclinico su un modello naturale di cane ATS. È noto che una delezione di 10 coppie di basi nel gene COL4A5 localizzato sul cromosoma X determina l'incapacità di sintetizzare catene α5 complete dando origine a una nefropatia ereditaria legata all'X (XLHN) in questa colonia di cani. Un singolo cateterismo arterioso femorale è stato utilizzato per trasferire in-vivo il sistema AAV2-CRISPR/Cas9 (vettore donatore di SEQ ID NO.1 e vettore Cas9 di SEQ ID NO.2), iniettando in entrambe le arterie renali. Questa procedura è stata eseguita per due dosaggi: 10<11>-10<12 >e 10<13>-10<14>. Uno dei maschi affetti è stato trattato con 10<11>-10<12 >di wt-AAV2-CRiSPR/Cas9, uno con 10<13>-10<14 >di wt-AAV2-CRiSPR/Cas9 e l'altro con mut-AAV2-CRiSPR/Cas9 come controllo negativo. Al fine di valutare la sicurezza, la specificità e l'efficienza dell'infezione virale, nonché la specificità della mira di CRISPR/Cas9, i cani sono stati trattati a 8 settimane di età, che è tipicamente prima del verificarsi di microalbuminuria, attualmente la prima indicazione clinica di malattia.

Esempio 2.6: Studi umani

Sindrome di Rett

I presenti inventori operano in un Centro di competenza riconosciuto a livello internazionale per la sindrome di Rett e disturbi correlati e quindi hanno una lunga esperienza sul decorso naturale di queste patologie, per le quali non è attualmente disponibile un trattamento. Una coorte di 60 pazienti, per i quali era disponibile un monitoraggio ogni 6 mesi negli ultimi 20 anni, è stata analizzata con l'obiettivo specifico di istituire la finestra terapeutica più appropriata da utilizzare in una sperimentazione clinica. La finestra proposta (la Figura 8 mostra un esempio per i pazienti portatori di mutazioni di MECP2) tiene conto del fatto che, sebbene una terapia tempestiva sia essenziale e desiderabile, la diagnosi clinica è quasi impossibile fino a 3 anni e che la condizione clinica del paziente all'età di 4 anni è altamente variabile e dipendente dal tipo di mutazione e dai trattamenti di riabilitazione.

Malattie di Pompe

Nella malattia di Pompe, l'attuale terapia di sostituzione enzimatica con GAA ricombinante umano (rh) ha dimostrato efficacia nei soggetti con insorgenza tardiva. Tuttavia, non sono stati osservati effetti a lungo termine di rhGAA sulla funzionalità polmonare, probabilmente correlati al rilascio inefficiente di rhGAA ai lisosomi dei muscoli scheletrici e ai deficit associati nel sistema nervoso centrale.

Sono arruolati partecipanti con deficit documentato di enzima GAA da sangue, pelle o tessuto muscolare, nei quali è stata identificata almeno una mutazione patogena, in una finestra temporale in cui i partecipanti non sono ancora stati esposti al trattamento con α-glucosidasi.

Sindrome di Alport

Il laboratorio dei presenti inventori è un centro di riferimento per la diagnosi e la ricerca nella sindrome di Alport. Gli approcci comunemente basati sui farmaci nell'ATS comprendono l'inibitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina e i bloccanti del recettore dell'angiotensina, che sono impiegati per ridurre la proteinuria e quindi ritardare la progressione della malattia renale e la morbilità e la mortalità cardiovascolare. Il trattamento convenzionale è comunemente iniziato per livelli di proteine urinarie/livelli di creatinina urinaria superiori a 0,2 mg. La terapia genica basata su CRISPR/Cas9 nella malattia ATS fornisce un approccio terapeutico che agisce sulle linee cellulari rilevanti per la malattia nella fase più precoce della malattia, prima della necessità di terapie convenzionali.

Donne e uomini sono stati inclusi nella sperimentazione pilota nella proporzione di metà e metà per studiare effetti o fattori confondenti specifici del sesso. Sono stati inclusi anche i bambini di età superiore ai 14 anni. Una coorte di 80 pazienti ATS, per i quali era disponibile un monitoraggio annuale negli ultimi 50 anni, è stata analizzata per identificare individui con una mutazione patogenetica COL4A3 e/o COL4A4 e/o COL4A5, uomini con ereditarietà X-legata, autosomica dominante, autosomica recessiva e digenica e donne con ereditarietà autosomica dominante, autosomica recessiva e digenica tra i 14 e i 60 anni. Questo studio stratificato consente di includere le donne portatrici di una mutazione COL4A5 che può mostrare una progressione della malattia più tardi nella vita. I pazienti sono osservati durante un periodo finestra; maschi con una mutazione COL4A5 e sia maschi che femmine con una mutazione COL4A4 e/o COL4A3 sono arruolati quando, anche in presenza di una normale funzionalità renale (normale GFR/BSA), si osserva una microematuria isolata o in combinazione con podocituria e/o proteine urinarie/creatinina urinaria < 0,2 mg. Le donne portatrici di mutazione COL4A5 sono arruolate in presenza di microematuria e podocituria e/o microalbuminuria, indicative della progressione del danno renale.

Malattia di Parkinson

Nel morbo di Parkinson, quando la deplezione neuronale dopaminergica raggiunge oltre il 50%, i sintomi motori diventano evidenti. Per il trattamento iniziale della malattia precoce, gli inibitori delle monoaminossidasi-B possono essere considerati. Tuttavia, la levodopa, associata alla carbidopa, rimane il gold-standard del trattamento sintomatico. Sfortunatamente, il suo uso a lungo termine è associato a fluttuazioni motorie (“wearing-off”) e discinesie difficili da trattare. Gli agonisti della dopamina forniscono un beneficio sintomatico moderato e ritardano lo sviluppo della discinesia rispetto alla levodopa. I farmaci sintomatici di solito si dimostrano efficaci per circa 4-6 anni. Dopo questo, la disabilità progredisce spesso nonostante la migliore gestione medica, e molti pazienti sviluppano complicanze motorie a lungo termine, tra cui fluttuazioni, discinesie, instabilità posturale e demenza.

Pertanto, la terapia per le malattie in fase avanzata richiede strategie diverse.

LRRK2 è un obiettivo farmacologico ideale e negli ultimi anni è stato sviluppato un numero notevole di inibitori della chinasi LRRK2. Vi sono, tuttavia, importanti problemi di sicurezza associati all'inibizione della chinasi di LRRK2, inclusa la tossicità polmonare, probabilmente dovuta alla difficoltà nel dosare l'inibitore e ai suoi intrinseci effetti fuori bersaglio, come mostrato nei roditori e nei primati non umani.

Poiché i sintomi motori diventano evidenti quando la deplezione neuronale dopaminergica raggiunge oltre il 50%, un approccio di modifica del genoma che mira a ripristinare, anche parzialmente, i geni LRRK2/GBA o i geni del Parkinson prima di questa precisa finestra temporale è una strategia stimolante nel trattamento della PD. I pazienti con PD sono quindi osservati nel tempo e individui maggiori o uguali a 18 anni di età sono arruolati in presenza dei seguenti parametri:

1. segni cardinali come la bradicinesia, più la presenza di almeno uno dei seguenti: tremore a riposo, rigidità o compromissione dei riflessi posturali, e senza altre cause note o sospette di parkinsonismo;

2. uno stadio di Hoehn & Yahr minore o uguale a 3;

3. un punteggio alla Mini Mental State Examination (MMSE) maggiore o uguale a 25;

4. un punteggio alla Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) (Parte III) maggiore o uguale a 10 ma minore o uguale a 30 alla selezione;

5. una scansione DAT che rivela che è stato perso un numero rilevante di neuroni dopaminergici. Criteri di inclusione ed esclusione comuni

Sulla base dei risultati degli studi preclinici, i presenti inventori hanno stabilito i seguenti criteri generali di inclusione ed esclusione:

Criterio di inclusione:

- età da sei mesi a 6 anni nel giorno dell'infusione del vettore per la popolazione pediatrica;

- età da 18 a 70 anni per gli adulti;

- presenza di una delle mutazioni selezionate. Criteri di esclusione:

- infezione virale attiva (compreso HIV o sierologia positiva per epatite B o C);

- qualsiasi uso di supporto ventilatorio invasivo o pulsossimetria con livelli <95% di saturazione;

- malattia concomitante che crea rischi inutili per il trasferimento genico.

- uso concomitante di agenti usati per il trattamento del diabete mellito o terapia immunosoppressiva in corso o terapia immunosoppressiva entro 3 mesi dall'inizio dello studio (ad esempio corticosteroidi, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, ciclofosfamide, immunoglobulina per via endovenosa, rituximab);

- pazienti con titoli anticorpali anti-AAV> 1:50 determinati mediante saggio immunologico di legame ELISA;

- valori di laboratorio anormali considerati clinicamente significativi (GGT> 3xULN, bilirubina - ≥ 3,0 mg/dl, creatinina ≥ 1,8 mg/dl, Hgb <8 o> 18 g/dl; WBC> 20.000 per cmm);

- partecipazione a una recente sperimentazione clinica di trattamento che, a giudizio del PI, crea rischi non necessari per il trasferimento genico;

- la famiglia non vuole rivelare la partecipazione allo studio del paziente con il medico di base e altri operatori sanitari.

SEQUENCE LISTING = LISTA DELLE SEQUENZE

CRISPR-Cas system for gene therapy = Sistema CRISPR-Cas per la terapia genica

Artificial Sequence = Sequenza Artificiale

COL4A5 Donor = Donatore COL4A5

MECP2 Donor = Donatore MECP2

LRRK2 Donor = Donatore LRRK2

Cytomegalovirus = Citomegalovirus

CMV promoter = promotore di CMV

COL4A5 target sequence = sequenza bersaglio COL4A5

MECP2 target sequence = sequenza bersaglio MECP2

LRRK2 target sequence = sequenza bersaglio LRRK2

Human U6 promoter = promotore umano U6

Woodchuck hepatitis virus = Virus dell'epatite della marmotta

WPRE sequence = Sequenza WPRE

Mouse MECP2 promoter = promotore murino di MECP2

COL4A5 c.1871G>A sgRNA cds – guide sequence = COL4A5 c.1871G>A sgRNA cds – sequenza guida

COL4A5 c.1871G>A sgRNA cds – scaffold sequence = COL4A5 c.1871G>A sgRNA cds – sequenza scaffold

MECP2 c.473C>T sgRNA cds – guide sequence = MECP2 c.473C>T sgRNA cds – sequenza guida

MECP2 c.473C>T sgRNA cds – scaffold sequence = MECP2 c.473C>T sgRNA cds – sequenza scaffold

LRRK2 c.6055G>A sgRNA cds – guide sequence = LRRK2 c.6055G>A sgRNA cds – sequenza guida

LRRK2 c.6055G>A sgRNA cds – scaffold sequence = LRRK2 c.6055G>A sgRNA cds – sequenza scaffold

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Sistema “Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR associated (Cas) (CRISPR-Cas)” non presente in natura o ingegnerizzato mirato verso una sequenza bersaglio genomica mutante che porta una o più mutazioni in una cellula bersaglio, il sistema comprendendo un primo vettore virale di espressione ed un secondo vettore virale di espressione, in cui il primo vettore virale di espressione comprende: 1) una sequenza nucleotidica codificante per un RNA guida (gRNA) operativamente collegata ad una sequenza promotore situata sul vettore a monte dell’estremità 5’ di detta sequenza nucleotidica codificante per il gRNA, in cui detto gRNA comprende una sequenza nucleotidica scaffold atta a legare un enzima endonucleasi ed una sequenza nucleotidica guida atta ad ibridarsi alla sequenza bersaglio genomica mutante; e 2) una sequenza nucleotidica donatrice che consiste della sequenza selvatica della sequenza bersaglio genomica mutante; e in cui il secondo vettore virale di espressione comprende: 3) una sequenza nucleotidica codificante per un enzima endonucleasi, detta sequenza nucleotidica essendo operativamente collegata ad una sequenza promotore situata sul vettore a monte dell’estremità 5’ di detta sequenza nucleotidica codificante per l’enzima endonucleasi; e 4) una sequenza nucleotidica bersaglio che consiste della sequenza genomica mutante, detta sequenza nucleotidica bersaglio essendo presente sul vettore virale di espressione in una copia o, alternativamente, in una prima copia e in una seconda copia, in cui, quando detta sequenza nucleotidica bersaglio è presente in una copia, detta una copia è situata tra l’estremità 3’ della sequenza promotore operativamente collegata alla sequenza nucleotidica codificante per l’enzima endonucleasi e l’estremità 5’ di detta sequenza nucleotidica codificante per l’enzima endonucleasi, o, quando detta sequenza nucleotidica bersaglio è presente in una prima copia e in una seconda copia, detta prima copia è situata a monte dell’estremità 5’ della sequenza promotore operativamente collegata alla sequenza nucleotidica codificante per l’enzima endonucleasi e detta seconda copia è situata a valle dell’estremità 3’ di detta sequenza nucleotidica codificante per l’enzima endonucleasi, ciascuna copia della sequenza nucleotidica bersaglio essendo fiancheggiata all’estremità 3’ da una sequenza Protospacer Adjacent Motif (PAM).
2. Sistema CRISPR-Cas secondo la rivendicazione 1, in cui il primo vettore virale di espressione e/o il secondo vettore virale di espressione è un vettore di virus adeno-associato (AAV), preferibilmente un vettore virale adeno-associato di sierotipo 2 (AAV2) o un vettore virale adeno-associato di sierotipo 9 (AAV9).
3. Sistema CRISPR-Cas secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’endonucleasi è un’endonucleasi Cas9, preferibilmente una Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9).
4. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui la sequenza bersaglio genomica mutante nella cellula bersaglio è scelta dal gruppo che consiste di gene COL4A5 mutante, gene COL4A3 mutante, gene COL4A4 mutante, gene GAA mutante, gene MECP2 mutante, gene FOXG1 mutante, gene CDKL5 mutante, gene LRRK2 mutante, gene VPS35 mutante, gene PRKN mutante, gene DJ-1 mutante, gene SNCA mutante, gene PINK1 mutante e gene GBA1 mutante.
5. Particella virale comprendente il sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4.
6. Insieme di due particelle virali, in cui una particella virale comprende il primo vettore virale di espressione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, e l’altra particella virale comprende il secondo vettore virale di espressione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4.
7. Procedimento in vitro per modificare una sequenza bersaglio genomica mutante in una cellula bersaglio, detto procedimento comprendendo i passaggi di: - trasdurre la cellula bersaglio con un sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, o con una particella virale secondo la rivendicazione 5, o con un insieme di due particelle virali secondo la rivendicazione 6, e - porre in coltura la cellula bersaglio trasdotta in condizioni atte a indurre l’espressione dell’enzima endonucleasi e dell’RNA guida (gRNA) e a ottenere la formazione di un complesso macromolecolare comprendente l’enzima endonucleasi associato a detto gRNA.
8. Cellula bersaglio isolata che comprende un sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4.
9. Cellula bersaglio isolata secondo la rivendicazione 8, che è una cellula umana, preferibilmente una cellula umana affetta da una malattia genetica.
10. Sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, o particella virale secondo la rivendicazione 5, o insieme di due particelle virali secondo la rivendicazione 6 per l’impiego come medicamento.
11. Sistema CRISPR-Cas o particella virale o insieme di due particelle virali secondo la rivendicazione 10, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una malattia genetica.
12. Sistema CRISPR-Cas o particella virale o insieme di due particelle virali per l’impiego secondo la rivendicazione 11, in cui la malattia genetica è scelta dal gruppo che consiste di sindrome di Alport, malattia di Pompe, sindrome di Rett e malattia di Parkinson.
13. Composizione farmaceutica comprendente un sistema CRISPR-Cas secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, o una particella virale secondo la rivendicazione 5, o un insieme di due particelle virali secondo la rivendicazione 6, ed almeno un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
14. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 13, per l’impiego come medicamento.
15. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 14, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una malattia genetica.
16. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 15, che è in una forma idonea alla somministrazione per via enterale o parenterale.