JP2023537093A - Ｗｗｏｘ関連疾患の治療方法 - Google Patents

Ｗｗｏｘ関連疾患の治療方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＷＷドメイン含有オキシドリダクターゼ（ＷＷＯＸ）関連ＣＮＳ疾患の治療のための方法及び組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、対象の脳において異種ＷＷＯＸ遺伝子を発現させることを含み、また、様々な実施形態において、ニューロンにおいて異種ＷＷＯＸ遺伝子を発現させて、ＷＯＲＥＥ症候群及びＳＣＡＲ１２などの病態を治療または改善することを含む。

Description

本開示は、ＷＷＯＸ関連疾患の治療方法を包含する。
ＷＷドメイン含有オキシドリダクターゼ（ＷＷＯＸ）の生殖細胞変異は、てんかん、運動失調及び性発達障害（ＤＳＤ）患者で報告されている。最近では、診断されたアルツハイマー病の遺伝子メタ分析により、ＷＷＯＸ遺伝子が新規リスク遺伝子座として特定されている。ＷＷＯＸ発現が中枢神経系（ＣＮＳ）の正常な発達と機能に必要であり、ＷＷＯＸの変異がＷＷＯＸ関連てんかん性脳症（ＷＯＲＥＥ）症候群として現在知られている乳児の神経障害を引き起こすことが、いくつかのエビデンスから強く示唆されている。
ＷＯＲＥＥでは、常染色体劣性ＷＷＯＸナンセンス変異、部分的及び完全な欠失が、極めて重篤な疾患に関連しており、非常に早期の死亡をもたらす。ＷＷＯＸの単一変異対立遺伝子を有するヘテロ接合体の親は、表現型の症状を示さない。これらの保因者が成人てんかんにかかりやすいかどうかはまだ不明である。ＷＯＲＥＥを特徴とする患者のほとんどは、ＷＷＯＸの複合ヘテロ接合変異を保有しているため、各変異を個別に標的とすることが困難である。この疾患の軽度の形態は、ＷＷＯＸミスセンス変異に関連しており、常染色体劣性脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡＲ１２）と呼ばれる。ＷＷＯＸがＣＮＳの恒常性を調節するメカニズムはほとんど知られていない。ＷＷＯＸが、てんかんや他の形態の神経障害に拮抗する他の主要なエフェクターの下流にあるかどうかもまた不明である。
また、最近のエビデンスでは、ＷＷＯＸのわずかな変異が自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）と関連付けられている。ＷＷＯＸとオーバーラップするコピー数バリアント（ＣＮＶ）が、ＡＳＤ候補遺伝子としてＷＷＯＸを定義する正常範囲に近い、より軽度の表現型とＩＱレベルを特徴とする多くのＡＳＤ罹患者で報告された。ＷＷＯＸを継承したＣＮＶは、低浸透度のＡＳＤリスク因子であると判定された。さらに、多発性硬化症患者試料のメガ分析により、ＷＷＯＸのバリアントを含む２００を上回る常染色体性感受性バリアントが明らかとなった。したがって、ＷＷＯＸの摂動は単一の神経疾患を超えており、ＷＷＯＸがいくつかの神経疾患の重要なプレーヤーであることを示唆している。
本開示は、ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、対象の脳において異種ＷＷＯＸ遺伝子を発現させることを含み、様々な実施形態において、ニューロンにおいて異種ＷＷＯＸ遺伝子を発現させて、ＷＯＲＥＥ症候群及びＳＣＡＲ１２などの病態を治療または改善することを含む。
いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ遺伝子は、ニューロンにおけるＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターを含む１つ以上の調節エレメントを含む。例えば、プロモーターは、ユニバーサルプロモーターまたはニューロン特異的プロモーターであり得る。例示的なニューロン特異的プロモーターは、シナプシンＩプロモーターである。様々な実施形態において、ＷＷＯＸ遺伝子は、野生型遺伝子または機能的誘導体であり、ｍＲＮＡの安定性を高める非翻訳配列（例えば、３’－ＵＴＲ内の）を含む。
いくつかの実施形態では、治療される個体は、小児患者または新生児患者（例えば、ＷＯＲＥＥまたはＳＣＡＲ１２を有する患者）である。いくつかの実施形態では、早期治療は、疾患のいくつかの臨床パラメータの発現を予防する。いくつかの実施形態では、個体は成人患者（例えば、ＷＯＲＥＥまたはＳＣＡＲ１２を有する）であり、治療は、てんかん発作などの１つ以上の臨床パラメータを改善することができる。様々な実施形態において、治療は、てんかん発作の頻度及び／または重症度を実質的に減少させる。
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２の治療方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする患者の脳に、シナプシンＩプロモーターの制御下のＷＷＯＸ野生型遺伝子を含むＡＡＶ９遺伝子送達系を投与することを含む。ＡＡＶ９送達系は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、及び／または配列番号５に記載のヌクレオチド配列を実質的に含む。
他の態様では、本開示は、ニューロン特異的プロモーターの発現制御下にあるＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を含む発現構築物を提供する。例示的なニューロン特異的プロモーターは、シナプシンＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、及び／または５に記載の配列を実質的に含む。様々な実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達系などのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、発現構築物はＡＡＶ９送達系である。
本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び実施例によって明白となろう。
脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。Ｐ１８でのＷｗｏｘ ｎｕｌｌ（ＫＯ）及び野生型（ＷＴ）マウスの代表的な画像。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。時間の関数としての重量（グラム単位，ｇ）の増加を示すグラフ。Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌの成長の遅延は、野生型と比較して４日以降明らかである。データ点は、マウスの平均体重を表す（ＷＴ，ｎ＝３；ＫＯ，ｎ＝３）。エラーバーは±ＳＥＭを表す（＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，スチューデントｔ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。３～４週齢までのＷｗｏｘ ｎｕｌｌの生後致死率を示すカプランマイヤー生存曲線（ＷＴ，ｎ＝１０；ＫＯ，ｎ＝１１）。（Ｐ＝０．００２３，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。神経幹細胞／神経前駆細胞におけるＷｗｏｘ遺伝子の条件付き欠失は、対照マウス（Ｎ－対照）と比較して、Ｎ－ＫＯの全体的な発達遅延を示している。Ｐ１７に示されているこれらのマウスの代表的な画像。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。Ｎ－ＫＯマウスは、Ｎ－対照に比べて体重の減少を示す。データ点は、遺伝子型あたり４匹のマウスの平均体重を表す。エラーバーは±ＳＥＭを表す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。Ｎ－対照（ｎ＝１２）と比較したＮ－ＫＯにおける生後３～４週齢までの死亡率を示すカプランマイヤー生存曲線（ｎ＝１４）。（Ｐ＝０．０００２，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。（Ｇ）成長遅延及び（Ｈ）体重の減少（データ点はマウスの平均体重を表す（各遺伝子型あたり４匹のマウス）。エラーバーは±ＳＥＭを表す ＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，スチューデントｔ検定）及び（Ｉ）早期死亡（Ｓ－対照 ｎ＝１３，Ｓ－ＫＯ ｎ＝１５）を示す、ニューロン（Ｓ－ＫＯ）のＷｗｏｘの条件付き切除を伴うマウス（Ｐ１７）の代表的な画像。（Ｐ値０．０００１，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。（Ｇ）成長遅延及び（Ｈ）体重の減少（データ点はマウスの平均体重を表す（各遺伝子型あたり４匹のマウス）。エラーバーは±ＳＥＭを表す ＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，スチューデントｔ検定）及び（Ｉ）早期死亡（Ｓ－対照 ｎ＝１３，Ｓ－ＫＯ ｎ＝１５）を示す、ニューロン（Ｓ－ＫＯ）のＷｗｏｘの条件付き切除を伴うマウス（Ｐ１７）の代表的な画像。（Ｐ値０．０００１，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。（Ｇ）成長遅延及び（Ｈ）体重の減少（データ点はマウスの平均体重を表す（各遺伝子型あたり４匹のマウス）。エラーバーは±ＳＥＭを表す ＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，スチューデントｔ検定）及び（Ｉ）早期死亡（Ｓ－対照 ｎ＝１３，Ｓ－ＫＯ ｎ＝１５）を示す、ニューロン（Ｓ－ＫＯ）のＷｗｏｘの条件付き切除を伴うマウス（Ｐ１７）の代表的な画像。（Ｐ値０．０００１，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（Ｇ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘの条件付き除去は、Ｏ－ＫＯまたはＧ－ＫＯマウスのいずれにおいても、対応する対照群（Ｇ－対照，Ｏ－対照）と比較して、発達遅延（Ｊ及びＭ，Ｐ１７に示す）、体重減少（Ｋ及びＮ）、及び出生後致死（Ｌ及びＯ）のような表現型の異常を引き起こさない（Ｋ及びＬでは、Ｏ－対照 ｎ＝１１及びＯ－ＫＯ ｎ＝１０、Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）（Ｎ及びＭでは、Ｇ対照 ｎ＝８，Ｇ－ＫＯ ｎ＝９匹のマウスを使用した。Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（Ｇ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘの条件付き除去は、Ｏ－ＫＯまたはＧ－ＫＯマウスのいずれにおいても、対応する対照群（Ｇ－対照，Ｏ－対照）と比較して、発達遅延（Ｊ及びＭ，Ｐ１７に示す）、体重減少（Ｋ及びＮ）、及び出生後致死（Ｌ及びＯ）のような表現型の異常を引き起こさない（Ｋ及びＬでは、Ｏ－対照 ｎ＝１１及びＯ－ＫＯ ｎ＝１０、Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）（Ｎ及びＭでは、Ｇ対照 ｎ＝８，Ｇ－ＫＯ ｎ＝９匹のマウスを使用した。Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（Ｇ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘの条件付き除去は、Ｏ－ＫＯまたはＧ－ＫＯマウスのいずれにおいても、対応する対照群（Ｇ－対照，Ｏ－対照）と比較して、発達遅延（Ｊ及びＭ，Ｐ１７に示す）、体重減少（Ｋ及びＮ）、及び出生後致死（Ｌ及びＯ）のような表現型の異常を引き起こさない（Ｋ及びＬでは、Ｏ－対照 ｎ＝１１及びＯ－ＫＯ ｎ＝１０、Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）（Ｎ及びＭでは、Ｇ対照 ｎ＝８，Ｇ－ＫＯ ｎ＝９匹のマウスを使用した。Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（Ｇ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘの条件付き除去は、Ｏ－ＫＯまたはＧ－ＫＯマウスのいずれにおいても、対応する対照群（Ｇ－対照，Ｏ－対照）と比較して、発達遅延（Ｊ及びＭ，Ｐ１７に示す）、体重減少（Ｋ及びＮ）、及び出生後致死（Ｌ及びＯ）のような表現型の異常を引き起こさない（Ｋ及びＬでは、Ｏ－対照 ｎ＝１１及びＯ－ＫＯ ｎ＝１０、Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）（Ｎ及びＭでは、Ｇ対照 ｎ＝８，Ｇ－ＫＯ ｎ＝９匹のマウスを使用した。Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（Ｇ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘの条件付き除去は、Ｏ－ＫＯまたはＧ－ＫＯマウスのいずれにおいても、対応する対照群（Ｇ－対照，Ｏ－対照）と比較して、発達遅延（Ｊ及びＭ，Ｐ１７に示す）、体重減少（Ｋ及びＮ）、及び出生後致死（Ｌ及びＯ）のような表現型の異常を引き起こさない（Ｋ及びＬでは、Ｏ－対照 ｎ＝１１及びＯ－ＫＯ ｎ＝１０、Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）（Ｎ及びＭでは、Ｇ対照 ｎ＝８，Ｇ－ＫＯ ｎ＝９匹のマウスを使用した。Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 脳細胞におけるマウスＷｗｏｘの条件付き欠失の表現型を示す研究の概要を示す。オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（Ｇ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘの条件付き除去は、Ｏ－ＫＯまたはＧ－ＫＯマウスのいずれにおいても、対応する対照群（Ｇ－対照，Ｏ－対照）と比較して、発達遅延（Ｊ及びＭ，Ｐ１７に示す）、体重減少（Ｋ及びＮ）、及び出生後致死（Ｌ及びＯ）のような表現型の異常を引き起こさない（Ｋ及びＬでは、Ｏ－対照 ｎ＝１１及びＯ－ＫＯ ｎ＝１０、Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）（Ｎ及びＭでは、Ｇ対照 ｎ＝８，Ｇ－ＫＯ ｎ＝９匹のマウスを使用した。Ｐ値１．０、有意性なし、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 Ｓ－ＫＯ新皮質における新皮質過興奮性を示す研究の概要を示す。Ｓ－対照、Ｓ－ＨＴ及びＳ－ＫＯに由来するｉｎ ｖｉｖｏでの記録（Ｐ１３～Ｐ１７）であり、ヘテロ接合体（Ｓ－ＨＴ、青で示す）及びＳ－対照（黒で示す）と比較した、Ｓ－ＫＯ（赤で示す）におけるバースト活性を示す。 Ｓ－ＫＯ新皮質における新皮質過興奮性を示す研究の概要を示す。表在新皮質に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏでの記録（Ｐ１３～Ｐ１７）であり、単離された新皮質切片標本における自発的な新皮質バーストを示している。挿入図は、Ｓ－ＫＯの例に由来する１つのバースト事象の拡大されたトレースを示す。脳全体の挿入図は、ｉｎ ｖｉｖｏでの記録電極の位置を示す。１１匹のＳ－対照、７匹のＳ－対照、１４匹のＳ－ＨＴ及び２４匹のＳ－ＫＯ動物由来の１１枚のＳ－対照、２３枚のＳ－ＨＴ及び４２枚のＳ－ＫＯ切片から得られた自発活動及び電気刺激アーチファクトの両方を含んでいたすべてのデータの評価のうち、０枚のＳ－対照切片がバーストを示し（０％）、３匹のＳ－ＨＴ動物由来の４枚の切片がバーストを示し（約２０％）、２０匹のＳ－ＫＯ動物由来の３６枚の切片がバーストを示した（約８４％）。 Ｓ－ＫＯ新皮質における新皮質過興奮性を示す研究の概要を示す。ｉｎ ｖｉｖｏでの記録とその時間－周波数スペクトログラムの第２の例。 Ｓ－ＫＯ新皮質における新皮質過興奮性を示す研究の概要を示す。刺激アーチファクトのないデータから取得したＳ－対照、Ｓ－ＨＴ及びＳ－ＫＯのｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏデータセットのパワースペクトル解析。灰色のバーは、周波数ごとに識別された重要な領域を示す。ｉｎ ｖｉｖｏ １２～２０ＨｚではＳ－ＨＴと比較してＳ－ＫＯで、７～１５ＨｚではＳ－対照と比較してＳ－ＫＯで、パワーの上昇を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ３～１３ＨｚではＳ－ＨＴ及びＳ－対照と比較して、Ｓ－ＫＯのパワーの上昇が示された。３２０～４００Ｈｚの平均及び標準偏差に正規化されたｉｎ ｖｉｔｒｏデータのｚスコア。箱ひげ図は、横軸に示される周波数帯域で正規化されたパワーを示す。０～４．９Ｈｚ及び５～９Ｈｚでは、Ｓ－対照のみと比較して、Ｓ－ＫＯのパワーが有意に上昇していた（ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｓ－対照，ｎ＝５対象；Ｓ－ＫＯ，ｎ＝７対象；Ｓ－ＨＴ，ｎ＝７対象，＊Ｐ＜０．０５；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１スチューデントｔ検定，Ｓ－対照及びＳ－ＨＴと比較したＳ－ＫＯ，Ｓ－対照，ｎ＝１１切片，７動物，Ｓ－ＨＴ，ｎ＝１１切片，８匹，Ｓ－ＫＯ，ｎ＝３４切片，２０対象）。 Ｓ－ＫＯ新皮質における新皮質過興奮性を示す研究の概要を示す。新皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層で記録される、第Ｖ層からの電気刺激に対する応答。矢印は第１のピーク応答の停止と開始を示し、キャレット記号は１００ｕＡ刺激強度での第２のピーク応答の停止と開始を示す。 Ｓ－ＫＯ新皮質における新皮質過興奮性を示す研究の概要を示す。第１と第２のピーク応答の振幅（第１のピーク：＊Ｐ＝０．０１２７。第２のピーク：＊＊Ｐ＝０．００８，＊Ｐ＝０．０２０２；ウィルコクソン順位和検定 Ｓ－対照 ｎ＝６切片，３対象；Ｓ－ＨＴ，ｎ＝８切片，５対象；Ｓ－ＫＯ，ｎ＝８切片，６対象）。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及びオリゴデンドロサイト成熟を損なうことを示す研究の概要を示す。皮質領域の３つの同一切片由来のＣＮＰ及びＭＢＰの蛍光合計強度の定量化は、Ｓ－対照（ｎ＝３）と比較して、Ｓ－ＫＯの強度の低下を示している（ｎ＝３）。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及びオリゴデンドロサイト成熟を損なうことを示す研究の概要を示す。抗ＣＮＰ及び抗ＭＢＰで免疫染色した小脳由来脳切片の代表的な画像を示す。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及びオリゴデンドロサイト成熟を損なうことを示す研究の概要を示す。ＣＮＰ及びＭＢＰの蛍光強度の定量化は、Ｓ－対照と比較してＳ－ＫＯにおいて低い強度が示される。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及びオリゴデンドロサイト成熟を損なうことを示す研究の概要を示す。ＣＣ１及び抗ＰＤＧＦＲαについて免疫染色した脳組織の矢状断面。Ｐ１７でのＳ－対照と比較して、Ｓ－ＫＯにおいて脳梁内の成熟オリゴデンドロサイト数が減少することを示す画像（白い点線でマークし、拡大した領域を白い四角で示す）。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及びオリゴデンドロサイト成熟を損なうことを示す研究の概要を示す。脳梁内のＣＣ１及びＰＤＧＦＲα陽性細胞の定量化であり、Ｓ－対照と比較して、ＳＫ－ＯにおいてＣＣ１陽性細胞が有意に減少し、ＰＤＧＦＲα陽性細胞の数が増加したことを示す。データ点は、Ｓ－対照（ｎ＝３）及びＳ－ＫＯマウス（ｎ＝３）の３つの独立した切片に由来する、面積（０．５ｍｍ２）内でカウントした細胞数を表す。エラーバーは±ＳＥＭを表す（＊Ｐ≦０．０１，＊＊Ｐ≦０．００１）。スケールバー Ａ）５０μｍ，Ｂ）２μｍ及びＣ）５０μｍ。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及び軸索伝導性を低下させることを示す研究の概要を示す。Ｐ１７でのＳ－対照（ｎ＝３）と比較した、Ｓ－ＫＯ（ｎ＝３）の視神経におけるより少ない数の有髄軸索及びより多くの無髄軸索を示す、脳梁の中部矢状断面由来の電子顕微鏡（ＥＭ）写真。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及び軸索伝導性を低下させることを示す研究の概要を示す。Ｓ－対照とＳ－ＫＯにおける視野あたりの脳梁の有髄軸索及び視神経の無髄軸索の数の定量化。グラフは、脳梁における有髄軸索（Ｓ－対照，ｎ＝２５００及びＳ－ＫＯ，ｎ＝１２００）及び視神経における無髄軸索（Ｓ－対照 ｎ＝５００及びＳ－ＫＯ，ｎ＝３０００）を表し、ＦＯＶ（視野）ごとにＥＭ画像からカウントした。エラーバーは±ＳＥＭを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１，スチューデントｔ検定）。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及び軸索伝導性を低下させることを示す研究の概要を示す。Ｓ－対照（ｎ＝３）と比較した、Ｓ－ＫＯ（ｎ＝３）における脳梁及び視神経における軸索のミエリン厚の減少を示すｇ比分析。軸索の直径とミエリンの厚さは、脳梁の電子顕微鏡写真画像から計算した（ｎ＝各遺伝子型ごとに３００）及び視神経（ｎ＝遺伝子型ごとに３００）（＊＊＊Ｐ≦０．００１，スチューデントｔ検定）。 Ｗｗｏｘのニューロン欠失が髄鞘形成及び軸索伝導性を低下させることを示す研究の概要を示す。脳梁刺激からの誘発反応の代表的な例、（ｉ）刺激装置から２５０μｍの垂直距離で記録。挿入図は、電極と刺激の配置を示す。（Ｎ１ ＊Ｐ＝０．０１０４；Ｎ２＝０．５７３７ ウィルコクソン順位和検定）（ｉｉ）刺激の開始からＮ１及びＮ２までの潜時。（ｉｉ）Ｎ１の振幅とＮ２の振幅の比。（Ｎ１／Ｎ２）。（＊＊Ｐ＝０．００３０；ウィルコクソンの順位和 ｎ＝８切片，５対象；Ｓ－対照；ｎ＝８切片 ６対象 Ｓ－ＫＯ）。 ＯＰＣ分化におけるＷＷＯＸの非細胞自律機能を示す研究の概要を示す。有髄化前、有髄化、及び分解されたオリゴデンドロサイトのカウントの定量化（直径１４ｍｍをカバーする領域）。２つの独立した実験の結果を箱ひげ図に示す（ＷＴ－ＤＲＧｓ＋ＷＴ－ＯＰＣｓ，ｎ＝４；ＫＯ－ＤＲＧｓ＋ＷＴ－ＯＰＣｓ，ｎ＝４）。（＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．有意差なし）。スケールバー Ａ）１００μｍ，Ｄ）５０μｍ。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。オリゴ皮質スフェロイド切片セットアップの模式図。電極を局所集合電位（ＬＦＰ）の記録に使用し、第２の電極を全細胞パッチ記録に使用する。電極は、切片の端から１５０μｍ、１０～１５μｍ離して配置する。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。１５週目でのＯＳ－ＷＴ及びＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯオルガノイドの全細胞パッチクランプ記録における細胞の静止膜電位（ＯＳ－ＷＴ ｎ＝３，ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ ｎ＝４；ＯＳ－ＷＴ ＲＭＰ＝－５２．１±０．９０ｍＶ，ＯＳ－ＷＷＷＯＸ－ＫＯ ＲＭＰ＝－２１．２８±６．９１ｍＶ）。（＊Ｐ＜０．０１，スチューデントｔ検定）。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。ベースライン条件での１５週目のＯＳ－ＷＴ及びＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯオルガノイドの平均スペクトルパワー（ＯＳ－ＷＴについてはｎ＝９切片，３オルガノイド，ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯについてはｎ＝６切片，２オルガノイド；ＯＳ－ＷＴ ＡＵＣ＝０．０２８５±０．００９７，ＯＳ－ＷＷＷＯＸ－ＫＯ ＡＵＣ＝０．０５４１±０．００９３。（＊Ｐ＜０．０５，スチューデントｔ検定）。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。δ及びθ範囲（０．５～７．９Ｈｚ）の（Ｃ）の平均スペクトルパワーの曲線下面積。（＊Ｐ＜０．０５，スチューデントｔ検定）。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。ＣＮＰ（ＯＬｓ）及びＭＢＰ（ＯＬｓ）について染色した３０週目のＯＳ。右側の画像は、左側の四角で囲まれた部分を拡大したものである。（ＯＳ－ＷＴ，ｎ＝５；ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ，ｎ＝５）。スケールバー １００μｍ。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。３７週目のオルガノイドにおけるＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ（ｎ＝３）と比較して、より多くの有髄軸索ＯＳ－ＷＴ（ｎ＝３）を示す代表的な電子顕微鏡画像。ボックス内に示される拡大領域。スケールバー １００μｍ。 ＷＷＯＸ欠損オリゴ皮質スフェロイドが過興奮性及び髄鞘形成不全を示すことを示す研究の概要を示す。棒グラフは、ＯＳ－ＷＴ（ｎ＝２）及びＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ（ｎ＝３）における有髄軸索及び無髄軸索の割合を表す。スケールバー ４０μｍ。 シナプシンＩ陽性ニューロンにおけるＷＷＯＸの回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長を改善し、それらの寿命を延ばすことを示す研究の概要を示す。ヒトシナプシンＩプロモーター下のマウスＷｗｏｘ遺伝子を含むプラスミドベクター構築物の図。Ｗｗｏｘ遺伝子配列の後には、ＩＲＥＳプロモーター及びＥＧＦＰ遺伝子配列が続く。 シナプシンＩ陽性ニューロンにおけるＷＷＯＸの回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長を改善し、それらの寿命を延ばすことを示す研究の概要を示す。Ｐ１７でＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ（対照ウイルス）またはＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰウイルスのいずれかを注射した野生型（ＷＴ）、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌの物理的外観。 シナプシンＩ陽性ニューロンにおけるＷＷＯＸの回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長を改善し、それらの寿命を延ばすことを示す研究の概要を示す。指定された日のマウスの体重を示すグラフ。エラーバーは±ＳＥＭを表す（遺伝子型ごとにｎ＝４マウス）。 シナプシンＩ陽性ニューロンにおけるＷＷＯＸの回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長を改善し、それらの寿命を延ばすことを示す研究の概要を示す。指定された日のマウスの血糖値を示すグラフ。エラーバーは±ＳＥＭを表す（遺伝子型ごとにｎ＝４マウス）。 シナプシンＩ陽性ニューロンにおけるＷＷＯＸの回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長を改善し、それらの寿命を延ばすことを示す研究の概要を示す。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率グラフは、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰを注射するか（ｎ＝６）または注射なし（ｎ＝１０）のマウスと比較した、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ（ｎ＝１８）を注射したＷｗｏｘノックアウトマウスの寿命の延長を示す（ｐ値＜０．０００１，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 シナプシンＩ陽性ニューロンにおけるＷＷＯＸの回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長を改善し、それらの寿命を延ばすことを示す研究の概要を示す。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率グラフは、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰを注射するか（ｎ＝４）または注射なし（ｎ＝８）のマウスと比較した、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｈＷＷＯＸ（ｎ＝６）［中央値９２日］を注射したＷｗｏｘノックアウトマウスの寿命の延長を示す（ｐ値＝０．０００１，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。 ＷＷＯＸのニューロン回復が新皮質におけるてんかん活動を低下させることを示す研究の概要を示す。ＷＴ、ＫＯ、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘで処理したＫＯ［ＫＯ＋Ａ－Ｗｗｏｘ］の仔マウスで実施したＰ２０～２１日での細胞接着記録の代表的なトレース。トレースは、自発的な新皮質活動を表す（活動電位を示す）。パネルは、０．５秒間隔のズームインを示す挿入図で１２秒の記録を表す。ＫＯ脳の明確な活動亢進がこれらの代表的なトレースで観察され、ＫＯは活動電位のバーストを示す。グラフは、ＷＴの仔マウス（ｎ＝２）由来の２０個のニューロン、ＫＯ＋Ａ－Ｗｗｏｘの仔マウス（ｎ＝２）由来の２０個のニューロン及びＫＯの仔マウス（ｎ＝２）由来の３０個のニューロンの平均を示す（＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１，スチューデントｔ検定）。 ＷＷＯＸのニューロン回復が新皮質におけるてんかん活動を低下させることを示す研究の概要を示す。ＷＴ及びＫＯ＋Ａ－Ｗｗｏｘ成体マウス（６か月齢）で実施した細胞接着記録の代表的なトレース。トレースは、自発的な新皮質活動を示す（活動電位）。パネルは、０．５秒間隔のズームインを示す挿入図で１２秒の記録を示す。グラフは、ＷＴ成体マウス（ｎ＝３）由来の６０個のニューロン及びＫＯ＋Ａ－Ｗｗｏｘ成体マウス（ｎ＝３）由来の６０個のニューロンの平均を示す。ＷＴとＫＯ＋Ａ－Ｗｗｏｘ成体マウスの平均発火率に有意差は観察されない。 Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌにおけるＯＰＣ分化を促進することによって、ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復が髄鞘形成を改善することを示す研究の概要を示す。示されたマウス由来の、Ｐ１７で抗ＭＢＰで免疫標識した全脳矢状切片の画像（各群ごとにｎ＝３）。皮質、海馬及び小脳におけるＭＢＰ染色を示す（上部パネルから拡大）。 Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌにおけるＯＰＣ分化を促進することによって、ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復が髄鞘形成を改善することを示す研究の概要を示す。ＣＣ１及びＰＤＧＦＲαについて免疫染色した脳（Ｐ１７）組織の矢状切片。ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰウイルスを注射したＷｗｏｘ ｎｕｌｌと比較した、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘで処理した後のＷｗｏｘ ｎｕｌｌの脳梁における成熟オリゴデンドロサイト数の増加を示す画像。 Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌにおけるＯＰＣ分化を促進することによって、ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復が髄鞘形成を改善することを示す研究の概要を示す。グラフは、ＷＴ（ｎ＝３），ＫＯ（ｎ＝３）及びＫＯ＋Ａ－Ｗｗｏｘ（ｎ＝３）の脳梁（面積０．５ｍｍ２）における、各遺伝子型のマウスあたり３つの同様の脳矢状切片からカウントしたＣＣ１及びＰＤＧＦＲα陽性細胞の定量化を表す。エラーバーは±ＳＥＭを表す（＊ｐ値＜０．０１，＊＊ｐ値＜０．００１，＊＊＊ｐ値＜０．０００１）。スケールバー（Ａ）２ｍｍ（上部パネル），２５０μｍ（中央及び下部パネル）、（Ｂ）２５０μｍ（上部パネル），５０μｍ（中央及び下部パネル）。 ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの異常行動表現型を逆転させることを示す研究の概要を示す。８～１０週でのＷＴ（メス，ｎ＝７，オス ｎ＝６）及びＡＡＶｍＷｗｏｘを注射したＫＯマウス（メス ｎ＝７，オス ｎ＝５）の追跡パターンを示すオープンフィールド試験の代表的な画像（周辺及び中央）。 ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの異常行動表現型を逆転させることを示す研究の概要を示す。グラフは、オープンフィールド追跡からの移動速度及び移動距離（ｃｍ）を表す。 ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの異常行動表現型を逆転させることを示す研究の概要を示す。グラフは、オープンフィールド追跡からの移動速度及び移動距離（ｃｍ）を表す。 ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの異常行動表現型を逆転させることを示す研究の概要を示す。ＷＴ及びＫＯ＋ＡＡＶ－Ｗｗｏｘマウス（８～１０週齢）の高架式十字迷路試験のマウス追跡画像。左のマウス追跡画像上に、Ｏ．Ａ．（オープンアーム）Ｃ．Ｏ．（クローズドアーム）を白い点線のボックスで示す。グラフは、ＷＴ（メス，ｎ＝７，オス ｎ＝６）及びＫＯ＋ＡＡＶ－Ｗｗｏｘ（メス ｎ＝７，オス ｎ＝５）のクローズドアーム（ｉ）及びオープンアーム（ｉｉ）における滞在時間（秒）を表す。 ニューロンにおけるＷＷＯＸ回復がＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの異常行動表現型を逆転させることを示す研究の概要を示す。グラフは、様々な試験でロータロッドから落下するマウス（ＷＴ及び８～１０週間でレスキューされたマウス）の潜時（秒）を表す。メス（ＷＴ，ｎ＝７；ＫＯ＋－ｍＷｗｏｘ，ｎ＝５）及びオス（ＷＴ，ｎ＝５；ＫＯ＋－ｍＷｗｏｘ，ｎ＝５）を別々に示す（＊＊＊ｐ値＜０．０００１）。 ＷＷＯＸノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定に関する研究の概要を示す。１０週目のＣＯを、ＷＷＯＸ及び汎放射状グリアマーカーＳＯＸ２と共に、心室放射状グリア（ｖＲＧ）マーカーＣＲＹＡＢについて染色した。右の画像は四角で囲まれた部分を拡大したものである。破線は、心室空間を画定する（ＷＴ：ｎ＝８ ３つのバッチに由来，ＫＯ：ｎ＝８ ３つのバッチに由来）。スケール＝５０μｍ（左），２５μｍ（右）。 ＷＷＯＸノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定に関する研究の概要を示す。脳室様帯（ＶＺ）、脳室下帯（ＳＶＺ）、及び皮質板（ＣＰ）からなる様々な集団を表すマーカーの定量化。ＮｅｕＮは成熟ニューロンを示し、ＴＢＲ２は中間前駆細胞（ＩＰ）を示し、ＳＯＸ２は心室放射状グリア（ｖＲＧ）を示す。箱ひげ図は、第１及び第３の四分位数を表し、ひげは最小点と最大点を示し、中央の帯は中央値を表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝８ ３つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝８ ３つのバッチ由来；Ｗ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。 ＷＷＯＸノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定に関する研究の概要を示す。１５週間のＣＯにおける様々な神経マーカーの発現レベルを評価するためのｑＰＣＲ分析：ＳＯＸ２及びＰＡＸ６（前駆細胞）、ＴＵＢＢ３（汎ニューロン）、ＳＬＣ１７Ａ６及びＳＬＣ１７Ａ７（ＶＧＬＵＴ２及びＶＧＬＵＴ１；グルタミン酸作動性ニューロン）、ならびにＧＡＤ１及びＧＡＤ２（ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５；ＧＡＢＡ作動性ニューロン）。ｙ軸は、相対的な発現倍率の変化を示す。データを、平均ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。 ＷＷＯＸノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定に関する研究の概要を示す。１０週目のＣＯにおけるグルタミン酸作動性ニューロンマーカーＶＧＬＵＴ１及びＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカーＧＡＤ６７（ＧＡＤ１）の免疫蛍光（ＩＦ）染色（ＷＴ：ｎ＝８ ３つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝８ ３つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。スケール＝１００μｍ。画像の定量化を示す。ＶＧＬＵＴ１及びＧＡＤ６７を、染色によって覆われた表面積として定量化し、各画像の核の数に対して正規化した。箱ひげ図は、第１及び第３の四分位数を表し、ひげは最小点と最大点を示し、中央の帯は中央値を表す。サンプルが正規分布していなかったため、Ｄｕｎｎの多重比較検定を使用したＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して統計的有意性を決定した。ＲＯＵＴ検定によって外れ値を除外した（Ｑ＝１％）。データ情報：ｎ．ｓ（有意ではない）、＊Ｐ≦０．０５、及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドが過興奮性及びてんかん様活性を示したことを示す研究の概要を示す。７週齢のｈＥＳＣ由来の脳オルガノイド（ＣＯ）由来のサンプル記録。サンプルのトレース結果は、局所集合電位の目視可能な差異を示しており、ベースライン条件（左）及び１００μＭ ４－ＡＰの存在下（右）において、ＷＴと比較してＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯは、活性の増加を示す。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドが過興奮性及びてんかん様活性を示したことを示す研究の概要を示す。７週齢のｈＥＳＣ由来の脳オルガノイド（ＣＯ）由来のサンプル記録。ベースライン条件での７週目のＷＴ及びＫＯ ＣＯの平均スペクトルパワー。線は、０．２５～１Ｈｚの周波数範囲を示す。統計的有意性は、両側独立ウェルチｔ検定を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝１４切片，５オルガノイド，及び３バッチ；ＫＯ：ｎ＝１４切片，８オルガノイド，及び３バッチ）。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドが過興奮性及びてんかん様活性を示したことを示す研究の概要を示す。７週齢のｈＥＳＣ由来の脳オルガノイド（ＣＯ）由来のサンプル記録。０．２５～１Ｈｚの周波数範囲の（Ｂ）における平均スペクトルパワーの正規化された曲線下面積。平均ＳＥＭで表されるデータ。両側独立ウェルチｔ検定を使用して、統計的有意性を決定した。すべてのバーの数字は、分析した切片とオルガノイド（すなわち、切片（オルガノイド））の数を示す。 レンチウイルス形質導入を使用して、ＷＷＯＸのコード配列を６週目のＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯに再導入した（レンチ－ＷＷＯＸ）。レンチウイルス感染後のＷＷＯＸ－ＫＯオルガノイドの異なる集団におけるＷＷＯＸ発現を示す免疫蛍光染色。ＮＴ＝未処理。スケール＝５０μｍ。 レンチウイルス形質導入を使用して、ＷＷＯＸのコード配列を６週目のＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯに再導入した（レンチ－ＷＷＯＸ）。ベースライン条件での７週目のＷＴ系統、２つのＫＯ系統、及びレンチ－ＷＷＯＸに感染させた２つのＫＯ系統の平均スペクトルパワーの０．２５～１Ｈｚの周波数範囲についての正規化された曲線下面積。平均ＳＥＭで表されるデータ。すべてのバーの数字は、分析した切片とオルガノイド（すなわち、切片（オルガノイド））の数を示す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した。データ情報：＊＊＊Ｐ≦０．００１及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドがアストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示したことを示す研究の概要を示す。１５週目及び２４週目のＣＯを、星状細胞及び放射状グリアマーカーＧＦＡＰ、及び星状細胞特異的マーカーＳ１００ｂについて染色した（ＷＴ Ｗ１５：ｎ＝９ ３つのバッチ由来；ＫＯ Ｗ１５：ｎ＝１６ ３つのバッチ由来；Ｗ－ＡＡＶ Ｗ１５：ｎ＝４オルガノイド １つのバッチ由来；ＷＴ Ｗ２４：ｎ＝１０ ４つのバッチ由来 ＫＯ Ｗ２４：ｎ＝９ ３つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ Ｗ２４：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。スケール＝１００μｍ。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドがアストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示したことを示す研究の概要を示す。１５週目のＣＯのアストロサイトマーカーのｑＰＣＲ分析。ｙ軸は、相対的な発現倍率の変化を示す。データを、平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドがアストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示したことを示す研究の概要を示す。２４週目のＣＯにおけるアストロサイトマーカーのｑＰＣＲ分析。ｙ軸は、相対的な発現倍率の変化を示す。データを、平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝４ ２つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝３ ２つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝３ １つのバッチ由来）。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドがアストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示したことを示す研究の概要を示す。ＶＺの周囲におけるアストロサイトマーカーについての６週目のＣＯのＩＦ染色（ＷＴ：ｎ＝６ ２バッチ由来、及びＫＯ：ｎ＝６ ２バッチ由来）。スケール＝１００μｍ（左）及び５０μｍ（右）。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドがアストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示したことを示す研究の概要を示す。汎放射状グリアマーカーＳＯＸ２と共に、生理学的条件での６週目のＣＯのＶＺにおける細胞の核におけるＤＮＡ損傷マーカーｃＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１の染色（ＷＴ：ｎ＝８ ３つの個別のバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝１２ ３つの個別のバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。スケール＝５０μｍ（左），２５μｍ（右）。 ＷＷＯＸ－ＫＯ脳オルガノイドがアストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示したことを示す研究の概要を示す。ＶＺの最内層を構成する細胞の核におけるｃＨ２ＡＸ（上）及び５３ＢＰ１病巣（下）の定量化であり、この層の核の総数に対して正規化されている。箱ひげ図は、第１及び第３の四分位数を表し、ひげは最小点と最大点を示し、中央の帯は中央値を表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝８オルガノイド ３つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝１２オルガノイド ３つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。データ情報：ｎ．ｓ（有意ではない）、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 脳オルガノイドＲＮＡ配列決定が主要な分化欠損を明らかにしたことを示す研究の概要を示す。１５週目のＣＯのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）及びトランスクリプトーム解析（ＷＴ：ｎ＝２，ＫＯ：ｎ＝４）。ＲＮＡ配列決定の結果を検証する選択されたＷｎｔ標的遺伝子のｑＰＣＲ分析。ｙ軸は、相対的な発現倍率の変化を示す。データを、平均＿ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。 脳オルガノイドＲＮＡ配列決定が主要な分化欠損を明らかにしたことを示す研究の概要を示す。１５週目のＣＯのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）及びトランスクリプトーム解析（ＷＴ：ｎ＝２，ＫＯ：ｎ＝４）。１６週目のＣＯを、細胞質（Ｃ）及び核（Ｎ）画分に細分した。実験は、合計２つのＷＴオルガノイドと４つのＫＯオルガノイド（各ＫＯ系統に２つ）を使用して２回実行した。ＫＡＰ－１は核を示し、ＨＳＰ９０は細胞質を示す。下部の数字は、細胞質画分に対して正規化されたｂ－カテニンバンド強度の核画分の定量化である［ｂ－Ｃ（Ｎ／Ｃ）］。 脳オルガノイドＲＮＡ配列決定が主要な分化欠損を明らかにしたことを示す研究の概要を示す。１５週目のＣＯのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）及びトランスクリプトーム解析（ＷＴ：ｎ＝２，ＫＯ：ｎ＝４）。１５週目のオルガノイドにおける最も深い層から最も表面的な層までのヒト皮質の６つの異なる層のマーカー：ＴＢＲ１、ＢＣＬ１１Ｂ（ＣＴＩＰ２）、ＳＡＴＢ２、ＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）、ＣＵＸ１、及びＲＥＬＮの発現レベルを示すヒートマップ。 脳オルガノイドＲＮＡ配列決定が主要な分化欠損を明らかにしたことを示す研究の概要を示す。１５週目のＣＯのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）及びトランスクリプトーム解析（ＷＴ：ｎ＝２，ＫＯ：ｎ＝４）。深層皮質マーカーＣＴＩＰ２（ＢＣＬ１１Ｂ）及びＴＢＲ１、ならびに表層マーカーＳＡＴＢ２（ＷＴ：ｎ＝３；ＫＯ：ｎ＝４；及びＷ－ＡＡＶ：ｎ＝４）のレベルの低下を検証する１５週目のＣＯにおけるＩＦ染色。スケール＝５０μｍ。 脳オルガノイドＲＮＡ配列決定が主要な分化欠損を明らかにしたことを示す研究の概要を示す。１５週目のＣＯのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）及びトランスクリプトーム解析（ＷＴ：ｎ＝２，ＫＯ：ｎ＝４）。核の総数に正規化されている、Ｇに認められる皮質マーカーの定量化。ｙ軸は、ＷＴ ＣＯの平均と比較した倍率変化を示す。箱ひげ図は、第１及び第３の四分位数を表し、ひげは最小点と最大点を示し、中央の帯は中央値を表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＴ：ｎ＝９ ３つのバッチ由来；ＫＯ：ｎ＝１６ ３つのバッチ由来；及びＷＡＡＶ：ｎ＝４オルガノイド １つのバッチ由来）。データ情報：＊Ｐ≦０．０５，＊＊Ｐ≦０．０１，＊＊＊Ｐ≦０．００１，及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症脳オルガノイドがニューロン異常を再現することを示す研究の概要を示す。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＷＯＲＥＥ症候群の患者とその健康な両親から単離し、ｉＰＳＣに再プログラムし、その後ＣＯに分化させた。前駆細胞マーカーＳＯＸ２、ニューロンマーカーｂ３－チューブリン、及びＷＷＯＸについて染色した１０週目のＷＳＭ ＣＯ（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝２ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝２ １つのバッチ由来）。スケール＝５０μｍ。 ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症脳オルガノイドがニューロン異常を再現することを示す研究の概要を示す。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＷＯＲＥＥ症候群の患者とその健康な両親から単離し、ｉＰＳＣに再プログラムし、その後ＣＯに分化させた。ＷＳＭ Ｐ、ＷＳＭ Ｓ、及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶの７週目のＣＯのニューロンから記録された自発的なスパイクの代表的なトレース。各記録の長さは１２秒であり、ズームインは０．５秒である（右側のボックス）。 ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症脳オルガノイドがニューロン異常を再現することを示す研究の概要を示す。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＷＯＲＥＥ症候群の患者とその健康な両親から単離し、ｉＰＳＣに再プログラムし、その後ＣＯに分化させた。ＷＳＭ Ｐ ＣＯ（４オルガノイド）由来の２４ニューロン、ＷＳＭ Ｓ ＣＯ由来の４１ニューロン（３オルガノイド）、及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶオルガノイド（３オルガノイド）由来の４０ニューロンの平均発火率。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した。バーは平均＿ＳＥＭを表す。 ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症脳オルガノイドがニューロン異常を再現することを示す研究の概要を示す。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＷＯＲＥＥ症候群の患者とその健康な両親から単離し、ｉＰＳＣに再プログラムし、その後ＣＯに分化させた。１０週目のＷＳＭ ＣＯにおけるＧＡＤ６７及びＶＧＬＵＴ１免疫染色（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝２ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝２ １つのバッチ由来）。スケール＝５０μｍ。 ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症脳オルガノイドがニューロン異常を再現することを示す研究の概要を示す。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＷＯＲＥＥ症候群の患者とその健康な両親から単離し、ｉＰＳＣに再プログラムし、その後ＣＯに分化させた。図１５Ｄに示すデータの定量化。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝２ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝２ １つのバッチ由来）。データ情報：ｎｓ（有意ではない）、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 ＷＷＯＸ関連のてんかん性脳症が、ＷＷＯＸの完全喪失と同様の分子異常を示すことを示す研究の概要を示す。アストロサイトマーカーＧＦＡＰ及びＳ１００ｂについて染色した１５週目のＷＳＭ ＣＯ。（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝３ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝２ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝２ １つのバッチ由来）。スケール＝５０μｍ。 ＷＷＯＸ関連のてんかん性脳症が、ＷＷＯＸの完全喪失と同様の分子異常を示すことを示す研究の概要を示す。ＷＯＲＥＥ由来オルガノイドにおけるＤＮＡ損傷応答の障害。ＳＯＸ２は、ＶＺの放射状グリアを示す（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝４ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。スケール＝５０μｍ（左）及び２５μｍ（右）。 ＷＷＯＸ関連のてんかん性脳症が、ＷＷＯＸの完全喪失と同様の分子異常を示すことを示す研究の概要を示す。ｃＨ２ＡＸ（左）及び５３ＢＰ１（右）で示す、６週目のＷＳＭ ＣＯのＶＺ内の細胞の核におけるＤＮＡ損傷病巣の定量化。箱ひげ図は、第１及び第３の四分位数を表し、ひげは最小点と最大点を示し、中央の帯は中央値を表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝４ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝４ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。 ＷＷＯＸ関連のてんかん性脳症が、ＷＷＯＸの完全喪失と同様の分子異常を示すことを示す研究の概要を示す。１０週目のＷＳＭ ＣＯにおいて選択されたＷｎｔ標的遺伝子のｑＰＣＲ分析。ｙ軸は、相対的な発現倍率の変化を示す。データを、平均ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＳＭ Ｐ：ｎ＝６ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ：ｎ＝４ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶ：ｎ＝４ １つのバッチ由来）。 ＷＷＯＸ関連のてんかん性脳症が、ＷＷＯＸの完全喪失と同様の分子異常を示すことを示す研究の概要を示す。皮質層のマーカーＣＴＩＰ２及びＳＡＴＢ２について染色した１５週目のＷＳＭ ＣＯ。（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝３ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝２ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝２ １つのバッチ由来）。スケール＝５０μｍ。 ＷＷＯＸ関連のてんかん性脳症が、ＷＷＯＸの完全喪失と同様の分子異常を示すことを示す研究の概要を示す。Ｅで示された染色の定量化。箱ひげ図は、第１及び第３の四分位数を表し、ひげは最小点と最大点を示し、中央の帯は中央値を表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した（ＷＳＭ Ｆ１：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｍ２：ｎ＝３ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ２：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５：ｎ＝２ １つのバッチ由来；ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３：ｎ＝２ １つのバッチ由来；及びＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ６：ｎ＝２ １つのバッチ由来）。データ情報：＊Ｐ≦０．０５，＊＊Ｐ≦０．０１，＊＊＊Ｐ≦０．００１，及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
本開示は、ＷＷドメイン含有オキシドリダクターゼ（ＷＷＯＸ）関連ＣＮＳ疾患の治療のための方法及び組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、対象の脳において異種ＷＷＯＸ遺伝子を発現させることを含み、また、様々な実施形態において、ニューロンにおいて異種ＷＷＯＸ遺伝子を発現させて、ＷＯＲＥＥ症候群及びＳＣＡＲ１２などの病態を治療または改善することを含む。
用語「ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患」とは、突然変異したＷＷＯＸ遺伝子または異常なＷＷＯＸ発現に起因するかまたは関連する疾患を指す。突然変異は、タンパク質の損失または短縮化をもたらす完全または部分的なゲノムの欠失（ナンセンス突然変異）、またはより軽度の条件ではミスセンス突然変異を生じさせ得る。これらの疾患は、ＣＮＳに現れる疾患である。そのような疾患の例は、ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症（ＷＯＲＥＥ）症候群、脊髄小脳失調症、常染色体劣性１２（ＳＣＡＲ１２）、多発性硬化症、アルツハイマー病、ウエスト症候群、自閉症、及び性分化疾患（ＤＳＤ）である。
特定の態様では、本発明は、ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする患者の脳に、脳内にＷＷＯＸの発現をもたらす調節エレメント（複数可）の制御下にあるＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を投与することを含む。様々な実施形態において、ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患は、ＷＯＲＥＥ症候群、ＳＣＡＲ１２、アルツハイマー病、ウエスト症候群、自閉症、多発性硬化症及びＤＳＤから選択される。
いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患は、ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２である。いくつかのそのような実施形態では、患者は、ＷＷＯＸの複合ヘテロ接合変異を有する。
本開示に関する用語「治療」または「治療すること」とは、疾患に関連する少なくとも１つの臨床パラメータを改善することを指し、疾患（または疾患の１つ以上の臨床パラメータ）の発現の予防をさらに含む。用語「治療」または「治療すること」はまた、生存率、成長、てんかん発作の数または頻度、認知機能、社会的機能（例えば、自閉症における）生殖能力、運動失調、網膜症、精神遅滞、及び小頭症など、疾患の少なくとも１つの症状または態様を改善する（非治療対象と比較して）ことも指す。
用語「ＷＷＯＸ野生型遺伝子」とは、配列番号１によって表されるＷＷＯＸコード配列または配列番号２によって表されるＷＷＯＸコード配列を含む遺伝子を指す。用語「ＷＷＯＸ野生型遺伝子」は、ｃＤＮＡ配列（配列番号１によって表される）をさらに含むか、または１つ以上のイントロンを有する遺伝子配列を含む。例えば、イントロンを含む完全な遺伝子配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００１６．１０で表される。用語「ＷＷＯＸ野生型遺伝子」はさらに、疾患またはＷＷＯＸの機能もしくは発現の喪失に関連しない、ヒト集団における天然のヌクレオチド多型またはアミノ酸修飾（それぞれ、配列番号１または配列番号２に関して）を含む。様々な実施形態において、ＷＷＯＸ遺伝子は、ＷＷＯＸ野生型遺伝子の機能的等価体であり得、すなわち、ＷＷＯＸ遺伝子は、挿入、欠失、または置換から独立して選択され、ＷＷＯＸの活性または発現（例えば、ニューロンにおける）に有意な影響を与えない１つ以上のアミノ酸改変（１、２、３、４、または５つのアミノ酸改変など）をコードし得る。一般に、機能的誘導体は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、プロモーターならびに５’及び３’非翻訳領域を含む調節エレメントをさらに含み得るが、これらの調節エレメントは、天然のＷＷＯＸ遺伝子配列に限定されないが、代わりに、所望のレベルのｍＲＮＡ発現もしくはターンオーバー、及び／または所望の細胞特異性の遺伝子発現を達成するように選択され得る。いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、実質的な非翻訳領域を含まず、すなわち、ＷＷＯＸコード配列から本質的になるか、またはそれからなり得る。本発明の実施形態によれば、ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、少なくとも異種プロモーターを含む。本明細書中で使用される場合、「異種プロモーター」は、非天然の位置に、例えば、天然においては制御しないコード配列の発現を制御する位置に配置されるプロモーターである。
いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子はｃＤＮＡ配列であり、いくつかの実施形態では、そのｃＤＮＡ配列は、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
用語「プロモーター」とは、ＲＮＡの発現、例えば、ＷＷＯＸ野生型遺伝子の転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、遺伝子発現を制御するための少なくとも近位エレメントを含み、任意選択で、より遠位の上流エレメントをさらに含んでもよく、後者のエレメントは多くの場合、エンハンサーと呼ばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であるか、あるいはプロモーターの生来のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントである。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、または自然界に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントからなり得るか、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえある。さらに、調節配列の正確な境界が完全に定義されていない場合があり、したがって、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有している場合があることが認識されている。
いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ニューロンにおけるＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターを含む。例えば、プロモーターは、ユニバーサルプロモーターであり得る。ユニバーサルプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、Ｅ２Ｆ１プロモーター、及びＵ１ｓｎＲＮＡプロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターはユニバーサルプロモーターであり、構築物はニューロンに特異的または選択的に送達される。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ニューロンで特異的に発現するプロモーター（ニューロン特異的プロモーター）である。例示的なニューロン特異的プロモーターとしては、シナプシンＩプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＮＳＥプロモーター、及びＨｂ９プロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、グリア細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、オリゴデンドロサイト及び／または星状細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する。
いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ニューロン特異的発現を指示するためのシナプシンＩプロモーター、またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６９５０（配列番号４）によって表されるシナプシンＩプロモーターであり、このプロモーターは、高度にニューロン特異的かつ長期的な導入遺伝子の発現を付与する。シナプシンＩプロモーターの構造は、Ｓｃｈｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｔｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（６）：３３１７－３３２３（１９９６）に記載されている。様々な実施形態において、シナプシンＩプロモーターは、ニューロン特異的発現を付与するＮＲＳＥ／ＲＥ－１配列を含む機能的誘導体である。様々な実施形態において、シナプシンＩプロモーターは、配列番号４の３’末端の少なくとも約２５０ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約３５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。シナプシンＩプロモーター（またはその部分）は、プロモーターのニューロン特異的またはニューロン選択的発現が維持される限り、最大約２０％、または最大約１０％、または最大約５％のヌクレオチド修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、調節エレメントの制御下にあるＷＷＯＸ野生型遺伝子、またはその機能的誘導体は、配列番号５に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態では、調節エレメントは、オリゴデンドロサイトにおいてＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターである。例示的なプロモーターとしては、ＭＢＰプロモーター、ＰＬＰ１プロモーター、及びＣＮＰプロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、星状細胞においてＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターを含む。例示的なプロモーターとして、ＧＦＡＰプロモーターまたはＳ１００ｂプロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはプロモーターは、シナプシンＩプロモーターまたは他のニューロン特異的プロモーターの遠位部分を含み得る１つ以上のエンハンサー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニューロンにおける発現レベルを増加させるための１つ以上のニューロン特異的またはニューロン選択的エンハンサーを含む。例えば、Ｃｈａｒｒｏｎ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（５１）：３０６４－３０６１０（１９９５）を参照のこと。
様々な実施形態において、ＷＷＯＸ野生型遺伝子または機能的誘導体は、ｍＲＮＡの安定性を高める非翻訳配列（例えば、３’－ＵＴＲ）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、β－グロビンｍＲＮＡ ３’－ＵＴＲ、またはｍＲＮＡ安定性を付与するβ－グロビンｍＲＮＡ ３’－ＵＴＲの構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、ニューロンにおいて低いターンオーバーを示すｍＲＮＡ由来の３’非翻訳配列を含む。いくつかの実施形態では、転写されたＷＷＯＸヌクレオチド配列は、安定性を高めることができる１つ以上のウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態におけるＷＰＲＥは、ＷＷＯＸ遺伝子の３’ＵＴＲに含まれる。
いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子を、ＷＷＯＸ含有発現構築物の発現の可視化を可能にする、ＧＦＰまたはＲＦＰなどの蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない１つ以上の検出可能な標識と共に送達する。
いくつかの態様では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体（またはその断片）を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ酵素またはＣａｓエンドヌクレアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと共に送達して、ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその部分の挿入を誘導または増強する。いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患は、ＷＷＯＸにおける既知の突然変異によって特徴付けられる。そのような実施形態では、変異領域に相補的なｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと共に送達する。これらの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、Ｃａｓ９）によって切断された突然変異配列を置換するためのＷＷＯＸ野生型遺伝子の断片であってもよい。
例えば、個体におけるＷＷＯＸ遺伝子の正確な突然変異が知られている場合、その個体の脳にＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）酵素及び突然変異配列を標的とするｇＲＮＡを投与することによって、その個体を治療し、それにより、変異配列を編集して、変異領域を切断することにより、及び／または変異領域の配列を野生型領域の配列に置換することにより、野生型に戻すことができる。いくつかの変異では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる突然変異配列の切断だけで、機能的なＷＷＯＸ遺伝子が得られる。他の突然変異については、突然変異配列を切断するだけでなく、それを野生型配列（ＷＷＯＸ野生型遺伝子の断片）で置き換える必要がある。そのような場合、この方法はまた、ＷＷＯＸ野生型遺伝子の断片に対応するドナーＤＮＡ配列を投与して、突然変異配列を置換することも含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を、タンパク質として脳細胞に投与してもよく、または脳細胞（例えば、ニューロン）において発現可能な酵素をコードするポリヌクレオチドとして投与してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、本明細書に記載されるように、ニューロン特異的プロモーター（例えば、シナプシンＩプロモーター）を介して発現させる。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼをｍＲＮＡとして送達し、したがってトランスフェクトされた細胞において転写を必要としない。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用する場合、ＷＷＯＸ遺伝子について本明細書に記載されるプロモーター及び送達ベクターを使用してもよく、またはより長いポリヌクレオチドを送達することができる送達ベクター（Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの送達に、より好適であり得る）、例えば、ＡＡＶ６及びレンチウイルスベクターを使用してもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼをタンパク質として送達する場合、脳への（例えば、ニューロンへの）その送達に、送達粒子、リポソームなどを使用してもよい。
同様に、ＷＷＯＸ遺伝子について本明細書に記載される送達系及びプロモーター系を使用して、ｇＲＮＡを、ＲＮＡ分子として、またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ分子として送達してもよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをニューロン特異的プロモーターを介して発現させる。
突然変異したＤＮＡを置換するためのＷＷＯＸポリヌクレオチドを、別個の配列として投与することができ、またはＣａｓエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードする配列を含むベクターの一部として送達することができる。そのような場合、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのサポートを受けてベクターから平滑末端を有するドナーを切り離すことができる「ドナー特異的」ガイドＲＮＡの第２のセットを使用することによって、ドナーＤＮＡをベクターから切り離すことができる。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９を含む、様々な種のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）分子を、本明細書に記載の方法及び組成物において使用することができる。他のＣａｓエンドヌクレアーゼは、米国特許公開第２０１６００１００７６号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。本明細書に記載の構築物及び方法は、Ｃａｓ９酵素を含む任意のＣａｓエンドヌクレアーゼ、及びそれらに対応するｇＲＮＡまたは互換性のある他のｇＲＮＡの使用を含み得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ ＣＲＩＳＰＲ１系のＣａｓ９は、ヒト細胞において機能することが示されている。（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９（２０１３）を参照のこと）。
一般的に、ガイドＲＮＡには２つの異なる系が存在し、Ｃａｓ９による切断をガイドするために一緒に機能する個別のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを使用する系１、及び単一の系で２つの個別のｇＲＮＡを組み合わせたキメラｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを使用する系２である（シングルガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと呼ばれる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２；３３７：８１６－８２１も参照のこと）。ｔｒａｃｒＲＮＡは可変的に短縮化することができ、個別の系（系１）とキメラｇＲＮＡ系（系２）の両方において、様々な長さで機能することが示されている。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、５’末端にゲノムＤＮＡ標的部位の相補鎖に相補的な１７～２０ｎｔを有するｇＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡを使用して、配列ＮＧＧの追加のプロトスペーサー隣接モチーフを有する特異的な１７～２０ｎｔのゲノム標的にガイドされ得る。したがって、実施形態は、標的配列に相補的な、例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、ＮＧＧ、ＮＡＧ、またはＮＮＧＧのすぐ５’側の、標的配列に対する相補鎖の２５～１７、任意選択で２０以下のヌクレオチド（ｎｔ）、例えば、２０、１９、１８、または１７ｎｔ、好ましくは１７または１８ｎｔの配列を５’末端に有する、通常トランスコードされるｔｒａｃｒＲＮＡに融合されたｃｒＲＮＡを含むシングルガイドＲＮＡ、例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８２３－６に記載のシングルＣａｓ９ガイドＲＮＡを使用することができる。ｇＲＮＡには、Ｃａｓ９へのリボ核酸の結合を妨害しない任意の配列であり得るＸ．Ｎを含めることができ、Ｎ（ＲＮＡ中の）は、０～２００、例えば、０～１００、０～５０、または０～２０であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端に１つ以上のアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ転写を終結させるための終結シグナルとして使用される１つ以上のＴの任意の存在の結果として、分子の３’末端に１つ以上のＵ、例えば、１～８またはそれ以上のＵを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、オフターゲット効果を最小限に抑えるために、ゲノムの残りの任意の配列と少なくとも３つ以上のミスマッチで異なっている部位を標的とする。ロックド核酸（ＬＮＡ）などの修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドをより好ましい（安定した）立体構造にロックすることにより、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションの特異性を高めることが示されている。したがって、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に記載の短縮型ガイドＲＮＡ分子は、標的配列に相補的なガイドＲＮＡの領域の１つ、いくつかまたはすべてが修飾されており、例えば、ロックド（２’－Ｏ－４’－Ｃメチレン架橋）、５’－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、またはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖で置換されている（ペプチド核酸）、例えば合成リボ核酸である。
ｇＲＮＡは、それ自体として、または発現ベクターで提供してもよい。ｇＲＮＡを発現させるためのベクターには、ｇＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含めることができる。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後の哺乳動物細胞でｇＲＮＡを発現させることができる。あるいは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためにＴ７プロモーターを使用してもよく、ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させて精製することができる。短いＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または他の低分子ＲＮＡの発現に適したベクターを使用することができる。
配列（プロモーター及び遺伝子、及び任意選択で追加の配列）の送達は、ＣＮＳへの直接送達または全身送達のいずれかによる、ＣＮＳへの送達に適した任意の送達系によって行うことができる。様々な実施形態において、ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ウイルスベクター、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、脂質ナノ粒子、またはエキソソームを使用して送達する。いくつかの実施形態では、ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ウイルスベクターによって送達する。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達系であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ送達系は、他のＡＡＶ血清型よりも良好に血液脳関門を通過するＡＡＶ９である。使用してもよいさらなるウイルス送達系としては、レンチウイルス及び単純ヘルペスウイルス送達系が挙げられる。
ＣＮＳのための別の好適な送達ビヒクルは、一般的に２００ｎｍ未満、または約１５０ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満のサイズを有するナノ粒子を含む。これらには、脂質ベースのナノ粒子、ポリマーナノ粒子、デンドリマー、及び無機ナノ粒子が含まれる場合があり、その一部は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するように調整され得る。いくつかの実施形態では、送達系は、トランスポーターまたは受容体のリガンドを使用することにより、送達を積極的に標的として、ＢＢＢを介したナノ粒子の取り込みを増強する。このアプローチの好ましい経路は、受容体（またはトランスポーター）を介したトランスサイトーシスであり、それによってカーゴ（例えば、ナノ粒子）が脳のＥＣの頂端面と側底面の間で輸送される。例えば、低密度リポタンパク質が、受容体を介したプロセスによってＥＣを介してトランスサイトーシスを受け、リソソームコンパートメントをバイパスして、脳側の側底面で放出される。さらに、ＢＢＢにはアミノ酸へのトランスポーターが含まれているため、天然のアルギニントランスポーターを送達に使用することは、脳へ送達するための１つのアプローチである。
脳送達のための別の媒体は、細胞によって分泌される小さな細胞外小胞であるエキソソームである。他の合成ナノ粒子に対するエキソソームの主な利点は、その非免疫原性であり、長く安定した循環をもたらす。
いくつかの実施形態では、脳への送達に化合物または電気刺激を使用し、ＢＢＢを一時的に開き、全身投与した高濃度のポリヌクレオチドを脳に到達させることができる。そのような化合物の例は、セレポート（ブラジキニン類似体）またはレガデノソン（アデノシン受容体アゴニスト）である。浸透を高める別の方法は、超音波によるものであり、これは、薬物がＢＢＢを通過しやすくするための魅力的な技術である。非侵襲的技術であるマイクロバブル強化超音波診断法（ＭＥＵＳ）は、薬剤のＢＢＢ通過を効果的に支援する。別のアプローチは、経頭蓋磁気刺激法（ＴＭＳ）であり、これは、ニューロンの活動を刺激し、グルタミン酸の放出を増加させ、ＢＢＢを介した送達を促進する。（Ｘｉａｏｗｅｉ Ｄｏｎ．２０１８；８（６）：１４８１－１４９による概説－参照によりその全体が本明細書に援用される）。
所望の送達ビヒクルの投与経路は、（本質的にＢＢＢに進入する粒子またはウイルスベクターを使用して）さらなる操作なしの全身送達であってもよく、または、一時的にＢＢＢを開くための様々な操作（マイクロバブル強化超音波診断法（ＭＥＵＳ）、経頭蓋磁気刺激法（ＴＭＳ）など）に関連して全身的であってもよい。他の実施形態では、送達は経鼻投与による。
さらに他の実施形態では、脳への送達は、脳室内経路を介した脳脊髄液への送達による。別のオプションは、注射の大槽経路への送達であり、これは脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達の代替方法であり、ＣＮＳ全体に広範に遺伝子を送達する。いくつかの実施形態では、投与は、実質への直接注射または脳室内を介した脳脊髄液への注射、及び髄腔内（大槽または腰部）経路によるものである。
いくつかの実施形態では、治療される個体は、小児患者または新生児患者（例えば、ＷＯＲＥＥまたはＳＣＡＲ１２を有する患者）である。いくつかの実施形態では、早期治療は、成長障害、てんかん発作、認知機能障害、及び精神遅滞などの疾患のいくつかの臨床パラメータの発現を予防する。いくつかの実施形態では、個体は成人患者（例えば、ＷＯＲＥＥまたはＳＣＡＲ１２を有する）であり、治療は、てんかん発作などの１つ以上の臨床パラメータを改善することができる。様々な実施形態において、個体または患者は、成長障害、てんかん発作、認知機能障害、社会的機能障害、生殖能力障害、運動失調、網膜症、精神遅滞、及び小頭症から選択される１つ以上の症状を示す。様々な実施形態において、治療は、ＷＯＲＥＥまたはＳＣＡＲ１２を有する患者のてんかん発作の頻度及び／または重症度を実質的に減少させる。
様々な実施形態において、個体への投与エピソードは、１０回、９回、８回、７回、６回、５回、または４回を超えない。様々な実施形態において、投与エピソードは３回以下である。いくつかの実施形態では、投与エピソードは２回以下である。例えば、様々な実施形態において、投与エピソードは１回である。
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２の治療方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする患者の脳に、シナプシンＩプロモーターの制御下のＷＷＯＸ野生型遺伝子（すなわち、配列番号２のポリペプチドをコードする）を含むＡＡＶ９遺伝子送達系を投与することを含む。ＡＡＶ９送達系は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、及び／または配列番号５に記載のヌクレオチド配列を実質的に含む。
他の態様では、本開示は、ニューロン特異的プロモーターの発現制御下にあるＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を含む発現構築物を提供する。例示的なニューロン特異的プロモーターとしては、シナプシンＩプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＮＳＥプロモーター、及びＨｂ９プロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。様々な実施形態において、プロモーターは、既に記載したシナプシンＩまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５及び／または５に実質的に記載される配列を含む。
様々な実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達系などのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、発現構築物はＡＡＶ９送達系である。そのようなベクターの特定の例を図７Ａに示す。
いくつかの実施形態では、発現構築物を、脳への投与のための医薬組成物に含有させる。組成物は、脳もしくはＣＮＳへの直接注射、または全身投与を含む注射に適した薬学的に許容される担体をさらに含む。
さらに他の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に医薬組成物を投与することを含む、ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２の治療方法を提供する。したがって、本発明は、ＷＯＲＥＥまたはＳＣＡＲ１２の治療における医薬組成物の使用を提供する。
定義
本出願をより完全に理解するために、いくつかの定義を以下に記載する。そのような定義は、文法上の同等物を包含することを意図している。
用語「ａ」または「ａｎ」とは、その実体の１つ以上を指し、すなわち、複数の指示対象を指し得る。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同じ意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、要素が１つだけ存在することが文脈上明らかに必要でない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除するものではない。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する用語「同一性」とは、以下に記載する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査によって測定されるように、最大の対応付けについて比較し、アラインする場合に、同一である特定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。
用語「約」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、関連する値の±１０％を意味する。
実施例１：ＷＯＲＥＥ症候群に関連するＷｗｏｘのニューロン欠失は、てんかん及びミエリン欠損を引き起こす
ＷＷドメインを含むオキシドリダクターゼ（ＷＷＯＸ）遺伝子は、最も活発な染色体脆弱部位の１つであるＦＲＡ１６Ｄを包含する染色体１６ｑ２３．１－ｑ２３．２にマッピングされる。１，２ＷＷＯＸは、４６ｋＤａのタンパク質をコードしており、そのタンパク質間相互作用の能力により、いくつかのタイプのがんで腫瘍抑制機能が示されている。３，４実際、ＷＷＯＸは、足場タンパク質として働き、そのパートナーの局在化、安定性及び機能を調節する。５複数のエビデンスから、ＷＷＯＸ機能は、ゲノム安定性、細胞代謝、及び細胞骨格組織の維持と関連付けられている。１，３，６，７驚くべきことに、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞内で高発現レベルのＷＷＯＸが観察されており８，９、ＣＮＳ生物学におけるＷＷＯＸの重要な役割が示唆されている。しかしながら、ＣＮＳの開発と疾患におけるＷＷＯＸの正確な役割は不明である。
近年、ＷＷＯＸ遺伝子における生殖細胞系劣性突然変異（ミスセンス、ナンセンス、部分欠失／完全欠失）が、ＳＣＡＲ１２（脊髄小脳失調症、常染色体劣性－１２、ＯＭＩＭ６１４３２２）及びＷＯＲＥＥ症候群（ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症）と関連しており、後者は早期乳児てんかん性脳症－２８（ＥＩＥＥ２８、ＯＭＩＭ６１６２１１）としても知られる。１０，１１この疾患の重症度は、突然変異の種類とそのＷＷＯＸ発現への影響に大きく依存すると推論された。例えば、最も深刻な表現型は、ＷＯＲＥＥ症候群の小児で観察され、ＷＷＯＸが完全に失われ、難治性発作や出生前または出生後の致死をもたらした。１０主にＷＷＯＸのミスセンス変異に起因するＳＣＡＲ１２患者は、運動失調やてんかんなどの軽度の表現型を示した。１０，１１最近、不整脈を伴う癲癇性けいれんを特徴とするウエスト症候群の患者でもＷＷＯＸ変異が発見された１２，１３。ＷＷＯＸに変異を有する小児の脳磁気共鳴画像（ＭＲＩ）からは、ほとんどの場合で、脳梁の形成不全、進行性脳萎縮、髄鞘形成の遅延及び視神経萎縮などの異常が明らかになった。１０，１４－１８ＷＷＯＸにおける欠損がどのようにしてこれらの神経学的異常を引き起こすかは、ほとんどわかっていない。
マウスＷｗｏｘの標的欠失及びＬｄｅラットにおけるＷｗｏｘ自然突然変異は、てんかん発作、成長遅延、運動失調及び出生後の致死を含む複雑なヒトの神経学的表現型を表現型模写した１１，１９－２１。Ｗｗｏｘモデル及びヒト疾患における主要な細胞プレーヤー及び分子プレーヤーにさらに光を当てるために、神経幹細胞及び前駆細胞（ネスチン－Ｃｒｅ；Ｎ－ＫＯを使用）、成熟ニューロン（シナプシンＩ－Ｃｒｅ；Ｓ－ＫＯ）、オリゴデンドロサイト（Ｏｌｉｇ２－Ｃｒｅ；Ｏ－ＫＯ）または星状細胞（ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ；Ｇ－ＫＯ）のいずれかにＷｗｏｘ欠損を有するマウスモデルを条件付きで生成し、以前に記載したＷｗｏｘ－ｎｕｌｌマウスと共に、それらの表現型及び疾患メカニズムを研究した。１９，２０驚くべきことに、神経幹細胞及び前駆細胞（Ｎ－ＫＯ）またはニューロン細胞（Ｓ－ＫＯマウス）のいずれかにおけるＷｗｏｘの欠損により、３～４週間までに重度のてんかん、運動失調、及び早期死亡が示され、Ｗｗｏｘ－ｎｕｌｌマウスで観察された表現型が再現されることが判明した。Ｓ－ＫＯマウスの分子的及び細胞的変化の特徴決定により、ＷＷＯＸの非細胞自律機能に起因する顕著な髄鞘形成不全及び成熟オリゴデンドロサイト数の減少が明らかになった。さらに、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）におけるＷＷＯＸの完全な喪失とヒトオリゴ皮質スフェロイド（ＯＳ）の生成をモデル化することにより、てんかん及び髄鞘形成不全におけるＷＷＯＸの役割がさらに確認された。これらの調査結果は、ＣＮＳ生物学におけるＷＷＯＸの中心的な役割と、ＷＷＯＸ関連神経障害の治療におけるその治療可能性を強調するものである。
材料及び方法
細胞培養及びプラスミド
ＦＧＦ／ＫＯＳＲ条件下、放射線照射したＤＲ４マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダープレート上で、ＷｉＢＲ３ ｈＥＳ細胞を５％ＣＯ２条件下で維持した：１５％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＯＳＲ，Ｇｉｂｃｏ；１０８２８－０２８）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ；３５０５０－０３８）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０１－３４０－１Ｂ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０４２－１Ｂ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０３１－１１３）、及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；１００－１８Ｂ）を補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ；２１３３１－０２０またはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０１－１７０－１Ａ）。培地は毎日交換し、Ｃ型トリプシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０５３－１Ｂ）によるトリプシン処理により、培養物を５～７日ごとに継代した。トリプシン処理後２４～４８時間、ｈＥＳＣを１０μＭ濃度のＲｈｏ関連キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ、Ｙ２７６３２としても知られる）（Ｃａｙｍａｎ；１０００５５８３）で処理した。ｈＥＳＣのトランスフェクションのために、エレクトロポレーションの２４時間前に細胞を１０μＭ ＲＯＣＫｉで培養した。トリプシンＣ溶液を使用して細胞を剥離させ、合計１００μｇのＤＮＡ構築物（エキソン１を標的とするｓｇＲＮＡを含むｐｘ３３０プラスミドをｐＮＴＫ－ＧＦＰと１：５の比で混合された）と混合したＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含有する）中に再懸濁し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；２５０Ｖ，５００μＦ，０．４ｃｍキュベット）でエレクトロポレーションした。続いて、細胞を上記の条件でＭＥＦフィーダー層にプレーティングした。４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞を選別し、続いて約１０日後に、コロニー分離のためにＭＥＦフィーダープレート上にまばらに（１０ｃｍプレートあたり２，０００細胞）播種した。
マウス
Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの生成は以前に報告されており１９、これらのマウスをＦＶＢバックグラウンドで維持した。Ｗｗｏｘゲノム遺伝子座のエキソン１に隣接する２つのｌｏｘｐ部位を保有するマウス（Ｗｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）は、以前に記載されている２２。現在の研究では、これらのマウスを使用して、ＣＮＳ細胞のＷＷＯＸ発現を条件付きで除去した。ネスチンのプロモーター下でトランスジェニックＣｒｅリコンビナーゼを保有するマウス（起源Ｊａｘ系統株：００３７７１、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｎｅｓ－ｃｒｅ）１Ｋｌｎ／Ｊ）は、ヘブライ大学ハダサー歯科大学医学部のＴａｌ Ｂｕｒｓｔｙｎ－Ｃｏｈｅｎ博士からの寛大な贈り物である。シナプシンＩ－Ｃｒｅ（ストック：００３９６６，Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｓｙｎ１－ｃｒｅ）６７１Ｊｘｍ／Ｊ）、Ｏｌｉｇ２－Ｃｒｅ（ストック：０２５５６７，Ｂ６．１２９－Ｏｌｉｇ２ｔｍ１．１（ｃｒｅ）Ｗｄｒ／Ｊ）及びＧＦＡＰ－Ｃｒｅ（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇｆａｐ－ｃｒｅ）７７．６Ｍｖｓ／２Ｊ）マウス系統は、米国ジャクソン研究所から購入した。トランスジェニックＣｒｅリコンビナーゼを保有するＷｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスは、Ｗｗｏｘのホモ接合条件付き欠損と見なされ、Ｎ－ＫＯ（Ｗｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ネスチン－Ｃｒｅ＋）、Ｓ－ＫＯ（Ｗｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；シナプシン－Ｃｒｅ＋）、Ｏ－ＫＯ（Ｗｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｏｌｉｇ２ｃｒｅ／＋）及びＧ－ＫＯ（Ｗｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ＋）として表される。すべてのマウスは、特定のプライマーを使用して尾／耳のＤＮＡを抽出することにより、ＰＣＲ遺伝子型を決定した。すべての条件付きモデルは、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ；１２９ｓｖ混合遺伝的バックグラウンドで維持した。すべての条件付きモデルは、Ｒｏｓａ２６－ｌｏｘｐ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター対立遺伝子を含んでいた。動物は、ＳＰＦユニット内で、１２時間の明／暗サイクルで、食物と水を自由に摂取させて維持した。すべての動物関連の実験は、ヘブライ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＵ－ＩＡＣＵＣ）の事前承認に従って行われた。
ＤＲＧ－ＯＰＣ共培養
ＤＲＧニューロンとＯＰＣの共培養実験は、以前に公開されたプロトコル２３に従って実施した。簡潔に述べると、ＤＲＧニューロンを、Ｅ１３．５でマウス胚から単離した。胚の遺伝子型を決定し、ＤＲＧを冷Ｌ－１５培地中で回収した。組織を０．２５％トリプシンで解離させ、粉砕し、遠心分離し、ＮＢ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｂ２７サプリメント、０．５ｍＭのＬ－グルタミン、及びペニシリン－ストレプトマイシン）中に再懸濁した。事前に洗浄した直径１３ｍｍのガラスカバースリップを４ウェルディッシュに入れ、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングし（室温で１時間）、次いでポリ－Ｄ－リジンでコーティングした（室温で３０分）。細胞を４０，０００細胞／１３ｍｍカバーガラスの密度でＮＢ培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持した。ＤＩＶ２、４及び６に培養物をフルオロデオキシウリジンで処理して、非ニューロン細胞を除去した。細胞培地の５０％を３日ごとに交換し、ＤＩＶ１５において、ＯＰＣを加えた。ＯＰＣは、それぞれＰ０～Ｐ２齢の仔マウスから単離した。皮質を氷冷Ｌ－１５培地中に単離し、シリンジ（マウス組織では１９Ｇに続いて２１Ｇ）を使用して解離させ、摩砕し、遠心分離し、ＰＤＬコーティングされたフラスコ上のグリア播種培地（１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）中に再懸濁した。グリア細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持し、細胞培地の５０％を３日ごとに交換した。ＤＩＶ１０において、フラスコを激しく振った後に培養皿（３７℃で１０分×３回）にすばやく接着させて星状細胞を枯渇させることによってＯＰＣを単離するか、または精製したＯＰＣ（２００，０００／カバースリップ）をＤＲＧニューロン培養物に播種し、共培養培地（Ｂ２７及びＮ２サプリメント、５ｍｇ／ｍｌのＮ－アセチル－システイン、５ｍＭのフォルスコリン、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）中で維持した。９～１１日間、隔日で培地を交換した後、培養物を固定し、分析のために染色した。
オリゴ皮質スフェロイドの生成及び培養
脳オルガノイドは、以前に記載されたようにｈＥＳＣから生成した。２４簡潔に述べると、ヒトＷｉＢＲ３細胞を有糸分裂不活化ＭＥＦで維持した。プロトコル開始の４～７日前に、細胞をＭＥＦコーティングした６０ｍｍプレートに継代し、７０～８０％の集密度に達するまで増殖させた。０日目に、０．７ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ溶液（Ｓｉｇｍａ；１１０８８８５８００１）を用いてｈＥＳＣコロニーをＭＥＦから剥離させ、Ｃ型トリプシンを２分間使用して、単一細胞懸濁液に解離させた。解離後、細胞を計数し、２０％ＫＯＳＲ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％ＮＥＡＡ、１％Ｐ／Ｓ及び１００μＭの２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ；Ｍ３１４８）を補充し、１０μＭドルソモルフィン（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５４９９）または１００ｎｍ ＬＤＮ－１９３１８９（Ａｘｏｎ ｍｅｄｃｈｅｍ；Ａｘｏｎ１５０９）、ならびに１０μＭ ＳＢ－４３１５４２（Ｓｉｇｍａ；Ｓ４３１７）及び１０μＭ Ｒｏｃｋｉを補充し、０．２２μｍフィルターで滅菌したＤＭＥＭ／Ｆ１２からなるｈＥＳＣ培地に懸濁した。胚様体（ＥＢ）形成のために、超低接着（ＵＬＡ）９６ｖウェルプレート（Ｓ－Ｂｉｏ Ｐｒｉｍｅ；ＭＳ－９０９６ＶＺ）の各ウェルに１０，０００個の細胞を播種した。新鮮なドルソモルフィン／ＬＤＮ－１９３１８９及びＳＢ－４３１５４２の添加と共に、培地の半分を吸引して交換することにより、６日目までＥＢを毎日供給した（ウェルあたり約１００μｌ）。
７～５０日目において、使用したすべての培地は、０．２２μｍフィルターで滅菌した、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ；２１１０３０４９またはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０６－１０５５－１１０－１Ａ）、２％Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ；１７５０４０４４）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％Ｐ／Ｓ、そして２７日目からは１％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３５６２３１）からなるＮｅｕｒａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＮＭ）に基づいていた。７日目に、約７５％の培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ－２及び２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；ＡＦ－１００－１５）を補充したＮＭからなるＥＢ増殖（ＥＢＸ）培地で交換した。ＥＢＸ培地の半量を１５日目まで毎日交換し、その後、培地の半量を１日おきに交換した。２０日目頃に、スフェロイドが９６ウェルプレートを超えて増殖したため、２４ウェルＵＬＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３４７３）に移し、２６日目まで１日おきに半量の培地交換を行った。２７日目に、スフェロイドを滅菌９０ｍｍ未処理培養皿（Ｍｉｎｉｐｌａｓｔ；８２５－０９０－１５－０１７）に移し、培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；４５０－０２）及び２０ｎｇ／ｍｌのＮＴ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；４５０－０３）を補充したＮＭからなる神経分化培地（ＮＤＭ）に変更した。４１日目に、培地を補充なしのＮＭに変更した。
５１日目以降、すべての培地は、１％Ｂ２７サプリメント、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％Ｐ／Ｓ、及び１％Ｍａｔｒｉｇｅｌを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含有するオリゴ成熟培地（ＯＭＭ）に基づき、２日ごとに培地の半量を交換した。ＯＰＣ増殖については、５１日目に培地を、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；２２１－ＡＡ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；２９１－Ｇ１）を補充したＯＭＭからなるＯＰＣ増殖培地（ＯＥＭ）に変更し、２日ごとに培地の半量を交換した。オリゴデンドロサイトの分化のために、ＯＭＭに４０ｎｇ／ｍｌのＴ３（Ｓｉｇｍａ；Ｔ２８７７）を補充し、オリゴ分化培地（ＯＤＭ）を構成した。最後に、７１日目以降、スフェロイドをＯＭＭ中で培養し、２日ごとに完全な培地交換を行った。
プロトコル全体を通して、スフェロイドは３７℃及び５％ＣＯ２の静的条件で培養し、培地交換の前に、成長因子及びサイトカインを新たに添加し、少なくとも３０日ごとに１回、スフェロイドを新鮮なプレートに移した。特に明記しない限り、すべての分析で同じバッチのオルガノイドを使用した。
免疫蛍光
異なる遺伝子型（Ｐ１７－Ｐ１８）のマウスをＣＯ２で安楽死させ、２％ＰＦＡ／ＰＢＳで経心臓的に灌流した。解剖した脳を氷上で３０分間固定した。免疫蛍光検査のために、脳を４℃で一晩、３０％スクロース中でインキュベートし、その後、ＯＣＴに包埋し、クライオスタットを使用して切片（１２～１４μｍ）にした。矢状切片をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する５％ヤギ血清をブロッキングし、次いで室温で１時間インキュベートした後、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、対応するＡｌｅｘａフルオロフォアでタグ付けされた二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、封入剤でマウントした。
オリゴ皮質スフェロイドの固定及び免疫染色は、以前に記載されたように実施した２５。簡潔に述べると、オルガノイドをＰＢＳで３回洗浄し、次いで固定のために４％氷冷パラホルムアルデヒド中に４５分間移し、冷ＰＢＳで３回洗浄し、３０％スクロース溶液中で一晩平衡化して凍結保護した。翌日、スフェロイドをＯＣＴに包埋し、ドライアイスでスナップ凍結し、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０クライオスタットで１０μｍに切片化した。免疫蛍光染色のために、切片を室温に温め、再水和のためにＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ（ＰＢＴ）で透過処理し、次いで、ＰＢＴ中の５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、０．５％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液中で１時間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に切片を４℃で一晩インキュベートした。翌日、続いて切片を０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で振盪しながら３回洗浄し、二次抗体と共に１．５時間インキュベートした。スライドを振盪しながらＰＢＳＴで４回洗浄し、次いでＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ；ｓ３０２３）を使用して封入した。
Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ染色
Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ（ＬＦＢ）染色は、Ｎｏｖａ Ｕｌｔｒａ Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ染色キットを使用して、以前に公開されたプロトコル２３に従って実施した。簡潔に述べると、各遺伝子型の少なくとも３匹のマウスに由来するパラフィン包埋脳切片（６μｍ）を脱ロウし、続いて９５％エタノールに再水和した後、切片をＬＦＢ溶液（９５％エタノール中の０．１％ＬＦＢ／０．５％酢酸）中で、５６℃にて一晩インキュベートした。次いで、切片を９５％エタノール及びｄｄＨ２Ｏで、続いて０．０５％炭酸リチウムで３０秒間洗浄し、次いで灰白質が無色になり、白質が青色に見えるまで７０％エタノールで洗浄した。次いで切片をｄｄＨ２Ｏですすいだ後、予熱した０．１％酢酸Ｃｒｅｓｙｌ Ｖｉｏｌｅｔ溶液で３０～４０秒間、対比染色した。最後に、切片をｄｄＨ２Ｏですすぎ、１００％エタノール及びキシレンで脱水し、樹脂培地でマウントした。
電子顕微鏡法
マウスを麻酔し、４％ＰＦＡ、２．５％グルタルアルデヒド、及び０．１Ｍカコジル酸緩衝液を含有する固定液で灌流した。脳を単離し、室温で一晩固定液中でインキュベートし、以前に記載されたように処理した。２６ それぞれ、ＸＦ４１６ ＴＶＩＰカメラまたはＵＳ４０００ Ｇａｔａｎカメラを搭載したＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２透過型電子顕微鏡またはＴｅｃｎａｉ Ｆ２０ Ｓ／ＴＥＭを使用して試料を検査した。コンピューター支援ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを使用してＥＭ顕微鏡写真を分析した。ｇ比を計算するには、脳梁または視神経のいずれかに由来するＥＭ画像の有髄軸索（約６００、マウスあたり１００軸索、遺伝子型あたりｎ＝３）を、軸索の内径を総軸索の直径で割ることによって分析した。
画像の取得及び分析
ＬＦＢ染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナー（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）を使用して画像化した。免疫染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナーまたはＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡またはＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋共焦点顕微鏡を使用して画像化した。皮質及び小脳におけるＣＮＰ及びＭＢＰ染色の蛍光合計強度は、ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して計算した。取得した画像は、関連する顕微鏡ソフトウェアプログラム、すなわちＣａｓｅＶｉｅｗｅｒ、Ｆ－１０－ＡＳＷビューアー、ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓを使用して処理する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を分析した。画像は遺伝子型を盲検化して分析し、処理には明るさとコントラストの全体的な変化が含まれる。
自然発作の記録
動物施設でマウスをモニタリングする際に、自然発作を起こしているマウスをモバイルカメラを使用して記録した。Ｗｗｏｘ突然変異マウスでは、自然発作または異常な活動（暴走）が観察された。自然発作の持続時間（秒単位）を計算し、示した。ｎ＝６。
電気生理学
シナプシン－Ｃｒｅリコンビナーゼを使用してニューロンのＷｗｏｘを条件付きで欠損させたマウスにおいて、電気生理学的記録を行った。これらの実験のために、Ｓ－対照（Ｗｗｏｘ＋／＋；Ｓｙｎａｐｓｉｎ－Ｃｒｅ＋）、Ｓ－ＨＴ（Ｗｗｏｘ＋／ｆｌｏｘ；Ｓｙｎａｐｓｉｎ－Ｃｒｅ＋）及びＳ－ＫＯ（Ｗｗｏｘｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｓｙｎａｐｓｉｎ－Ｃｒｅ＋）のＰ１３～Ｐ１７のオスまたはメスのいずれかのマウスを、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）によって概説されたガイドラインに従って人道的に殺処分した。すべての外科的処置は、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋのガイドラインに従って承認され、実施された。
ｉｎ ｖｉｖｏ調製。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したケタミン－キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジン）をマウスに腹腔内注射した。ペダル反射を使用して、麻酔の深さを判定した。マウスが深く麻酔されたら、定位フレームに配置した。局所麻酔薬（リドカン）を頭蓋骨の切開部位のすぐ上に注射し、次いで、短時間（約５分）後、皮膚を取り除き、頭蓋骨を露出させた。ドリルを使用して頭蓋骨に切れ込みを付け、次いでピンセットを使用して頭蓋骨を剥がし、皮質組織を露呈させた。垂直プラーを使用して、薄壁のガラス電極（直径１．５、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を引いた。これらはＰＢＳで満たした。電極を、ブレグマの後方１．６～２ｍｍ、正中線の外側４ｍｍに配置した。電極を複数の深さに配置し、各深さで３分間、新皮質の皮質下脳と海馬の活動を記録した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ調製。ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを麻酔した。ペダル反射を使用して、麻酔の深さを試験した。マウスを深く麻酔したら、迅速に断頭し、脳を取り出した。小脳及び嗅球を除去し、残りの組織を、（ｍＭで）：２４８スクロース、２６ＮａＨＣＯ３、１０グルコース、２ＫＣｌ、３ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、１ＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏを含有する氷冷スクロースの溶液中のプラットフォーム上に尾側を下にして配置した。Ｌｅｉｃａ １２００ ｖｉｂｒａｔｏｍｅを使用して、新皮質を厚さ４００～５００ｕｍ（速度０．６ｍｍ／秒、振幅１ｍｍ）で冠状に切断した。この後、（ｍＭで）１２３ＮａＣｌ、２５ＮａＨＣＯ３、１０グルコース、３．５ＫＣｌ、１．３ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、１．２ＮａＨ２ＰＯ４、１．５ＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．３～７．４を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中で切片をインキュベートした。切片を３４℃で３０分間保持した後、実験前に少なくとも６０分間、室温に移した。ＡＣＳＦを含有する局所集合電位（ＬＦＰ）ガラス電極（１．５ｍｍ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、垂直プラー（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，日本ＰＰ－８３）を使用して引き、新皮質第ＩＩ層及び第ＩＩＩ層または海馬のＣＡ３領域に配置した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡（ＯＬＹ－１５０ＩＲカメラ－ビデオモニターユニット）を、適切な電極配置のガイダンスとして使用した。ネットワークの興奮性を評価するために、第ＩＩ／ＩＩＩ層からの記録と同じ垂直列に沿って配置された双極同心タングステン電極を使用して、第Ｖ層皮質または歯状回刺激を実施した。光電刺激分離ユニットに接続したＧＲＡＳＳ Ｓ８８刺激装置を使用して、様々な強度の持続時間０．１ミリ秒の電流パルスを３０秒ごとに印加した。Ｓ－対照、Ｓ－ＨＴ、及びＳ－ＫＯマウス（１００μＡ）の最大定常状態応答の振幅を比較した。
パワースペクトル分析
最初に、最終的なサンプリング周波数が１０００Ｈｚになるようにデータをデシメートした。次に、データを、６０Ｈｚ及びその倍音でノッチフィルター処理した。ＭＡＴＬＡＢで高速フーリエ変換及び１Ｈｚのビンサイズを使用してスペクトルパワーを分析した。各動物について、５秒のオーバーラップを有する１０秒のウインドウを使用して、深さ３００μｍで２．５分間にわたってパワースペクトルを平均化した。パワースペクトルを、すべての対象の平均としてプロットした。
オリゴ皮質スフェロイドからの電気生理学的記録
指定された時点でのオルガノイドを、３％低温ゲル化アガロースに包埋し（約３６℃で）、氷上で５分間インキュベートした後、それらをＬｅｉｃａ １２００Ｓ Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを使用して、スクロース溶液（ｍＭで：８７ＮａＣｌ、２５ＮａＨＣＯ３、２．５ＫＣｌ、２５グルコース、０．５ＣａＣｌ２、７ＭｇＣｌ２、１．２５ＮａＨＰＯ４、７５スクロース）中で４℃にて４００μｍに切片化した。切片を人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ，ｍＭで：１２５ＮａＣｌ、２５ＮａＨＣＯ３、２．５ＫＣｌ、１０グルコース、２．５ＣａＣｌ２、１．５ＭｇＣｌ２；ｐＨ７．３８、３００ｍＯｓｍ））中で、３７℃にて３０分間、続いて室温で１時間インキュベートした。記録中、切片は、ベースライン条件で、灌流カーボゲン（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）と共に、３７℃にてＡＣＳＦ中でインキュベートした。局所集合電位（ＬＦＰ）及び全細胞パッチクランプ記録は、ホウケイ酸キャピラリーガラスから引き出し、各切片の外縁から深さ１５０μｍに配置した電極を使用して実施した（図６Ａを参照のこと）。ＬＦＰ電極をＡＣＳＦで満たし、一方、パッチ電極を内部溶液で満たした。２５，０００ＨｚのサンプリングレートでＭｕｌｔｉＣｌａｍｐソフトウェアを使用してデータを記録した。ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使用してデータを分析した。（１）６０ノッチフィルター（５倍音）を使用してノイズを除去し、（２）０．１ＨｚハイパスＩＩＲフィルターを使用して記録セットアップからの変動を除去し、トレースをフィルター処理した。
統計解析
すべてのグラフまたは統計解析は、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５のいずれかを使用して実行した。実験の結果は、平均±ＳＥＭとして示した。両側独立スチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を試験した。結果は、Ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなされ、それ以外の場合はｎｓ（有意性なし）として表された。データ解析は、遺伝子型に対して非盲検で実施した。
結果
神経幹細胞／前駆細胞またはニューロン細胞におけるＷｗｏｘの条件付き欠損は、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ表現型を再現する
Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスはメンデル比で生まれ、野生型の同腹子と見分けがつかない。１９，２０生後数日以内に、マウスは生後３～４週齢までに死亡するまで、発達遅延と発作の兆候を示し始める（図１Ａ～Ｃ）。これらの表現型は、ほとんどが２～４歳で死亡するＷＯＲＥＥ／ＥＩＥＥ２８患者において観察される表現型に非常に類似している。１０中枢神経系におけるＷＷＯＸの正確な機能をよりよく理解するために、様々な領域での胚性脳発達中のＷＷＯＸの高発現を考慮して、脳の条件付きマウスモデルを作成した。８これを達成するために、Ｗｗｏｘｆｌ／ｆｌマウス（ｌｏｘＰ部位を保有する）２２を、胚段階Ｅ１０．５で発現し、Ｎ－ＫＯマウスを生成するマウス脳の神経幹細胞／前駆細胞におけるＷＷＯＸ切除を促進するラットネスチン（Ｎｅｓ）２７のプロモーター及びエンハンサー下にＣｒｅリコンビナーゼを保有するトランスジェニックマウスと交雑させた。Ｎ－ＫＯの脳において免疫蛍光法を使用してＷＷＯＸ切除を検証した。Ｎ－ＫＯマウスをモニタリングすると、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの表現型との類似性が明らかになった。Ｎ－ＫＯマウスはメンデル比で生まれ、Ｐ７において明らかな全体的な発達遅延を示し始める生後２～３日まで肉眼的異常は見られなかった（図１Ｄ，Ｅ）。さらに、Ｎ－ＫＯマウスは、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスで観察されたような振戦／発作及び運動失調（後肢クラスピング試験における調整の欠如）を示した。すべて（１００％）のＮ－ＫＯマウスが生後４週齢までに死亡した（図１Ｆ）。Ｗｗｏｘのインタクトな対立遺伝子を１つ保有するマウス（Ｗｗｏｘ＋／ｆｌ，ネスチン－Ｃｒｅ＋）は、目に見える異常な表現型を示さなかったが、これはヒト個体におけるヘテロ接合保因者に神経学的症状がないことと一致していた。これらの表現型は、ＣＮＳにおけるＷＷＯＸの重要な役割を示しており、ネスチン陽性細胞及びその子孫におけるその除去が、ＷＷＯＸげっ歯類モデル及びヒト患者で観察される複雑な表現型の原因であることを意味している。
ネスチンプロモーターは、神経細胞及びグリア細胞の前駆体で発現するため、ニューロンとグリア細胞で別々にＷＷＯＸ除去の効果を分析した。まず、Ｅ１２．５で発現し、特にほとんどの分化ニューロンでＷｗｏｘの欠失をもたらす、シナプシンＩ遺伝子２８のプロモーター下にＣｒｅリコンビナーゼを保有するトランスジェニックマウス系統を使用して、ニューロン細胞のＷｗｏｘを条件付きで欠失させた。ニューロンにおいて特異的だが他の細胞ではそうではないＷＷＯＸの切除を、Ｓ－ＫＯ脳組織のオリゴデンドロサイト（ＯＬ）（ＣＣ１で染色）において、インタクトなＷＷＯＸレベルが対照マウスに匹敵することを観察することによって検証した。ニューロン細胞におけるＷＷＯＸの条件付き切除の表現型分析により、３～４週齢までの成長遅延（図１Ｇ、Ｈ）、及び早死（図１Ｉ）が明らかとなり、これはＮ－ＫＯ及び Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスが表現型模写されたものである。Ｓ－ＫＯマウスはまた、Ｐ９から始まり、数秒～数分（６８．５±１３．４秒；Ｐ１４～Ｐ１８のｎ＝６）の範囲の無秩序な自発的強直間代発作を示した。さらに、これらのマウスは、協調運動の欠如と運動失調の表現型を示した。Ｗｗｏｘのインタクトな対立遺伝子を１つ保有しているヘテロ接合体（Ｗｗｏｘ＋／ｆｌ，シナプシンＣｒｅ＋）マウスは、異常な表現型を示さず、対照マウスと行動的に区別できなかった。Ｓ－ＫＯモデルの表現型は、ＷＷＯＸがニューロンにおいて重要な役割を果たしており、その欠損が劇的な神経学的表現型をもたらすことを強く示している。
特定のニューロン細胞のＷＷＯＸ機能を確認するために、オリゴデンドロサイト（Ｏｌｉｇ２－Ｃｒｅ＋／－を使用して）２９及び星状細胞（ＧＦＡＰ－Ｃｒｅを使用して）３０でのＷＷＯＸ発現の除去の結果を調べたが、表現型の異常は観察されなかった（図１Ｊ～Ｏ）。オリゴデンドロサイト及び星状細胞におけるＷＷＯＸの条件付き欠失の検証結果を、それぞれＣＣ１及びＧＦＡＰの免疫蛍光染色によって示す。まとめると、これらの発見は、ＷＷＯＸは、星状細胞、オリゴデンドロサイト、及びニューロンで発現するが、ニューロンにおけるその機能が動物の生存とＣＮＳ恒常性にとって重要であることを示している。
Ｗｗｏｘのニューロン欠失はてんかん発作を引き起こす
Ｓ－ＫＯ脳のてんかん活動を特徴決定するために、対照（Ｓ－対照）及びヘテロ接合体（Ｓ－ＨＴ）と共に、脳からの電気生理学的記録を行った（図２Ａ～Ｆ）。このために、マウスを麻酔下に置き、開頭術を行って、感覚皮質の上の脳の領域を露出させた。生理食塩水を含有する局所集合電位（ＬＦＰ）電極を使用して、皮質の様々な深さにおいて受動的に記録した。具体的には、新皮質の表層で、Ｓ－ＫＯはＳ－対照には存在しなかった大振幅のバースト活動を示した（図２Ａ）。これらのバーストは皮質下構造では観察されず、バースト生成の新皮質起源が示唆された。ｉｎ ｖｉｖｏでの記録深度３００μｍでの活動のさらなる特徴決定により、２．０６ｍＶ（２．０１～３．０９ｍＶ，２５パーセンタイル及び７５パーセンタイル）のピークから谷までの振幅、及び８．６２秒のバースト間間隔（６．２５～２１．２７秒、２５～７５パーセンタイル）で、３５０ミリ秒のてんかんバースト持続時間（２０６～４７２ミリ秒、２５パーセンタイル及び７５パーセンタイル）中央値が示された。
これらのバーストは、急性新皮質脳切片から得られたＬＦＰ記録でも観察され（図２Ｂ）、新皮質がこれらの異常なバースト放電の発生源であることを示している。合計で、０％のＳ－対照切片がバーストを示し（７匹の動物にわたるｎ＝１１の切片のうち、０）、Ｓ－ＨＴ動物由来切片の１７％がバーストを示し（１４匹の動物にわたるｎ＝２３の切片のうちの４）、Ｓ－ＫＯ動物の８６％の切片がバーストを示した（２４匹の動物にわたるｎ＝４２の切片のうちの３６）。
Ｓ－ＫＯマウスは大振幅の活動を示したが、これは、新皮質回路の興奮性の増加に起因すると考えられる。これを評価するために、自発的な電場活動（図２Ｃ、Ｄ）でパワースペクトル分析を実行し、第Ｖ層における電気的に誘発された刺激に対する新皮質の第ＩＩ／ＩＩＩ層電場応答を記録した（図２Ｅ、Ｆ）。自発的な活動を有していたトレースは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、δ（＜５Ｈｚ）、θ（５～９Ｈｚ）、α（１０～１５Ｈｚ）、及びβ（１５～３０Ｈｚ）リズムを含有する広い周波数帯域内でスペクトルパワーの増加を示した（図２Ｃ、Ｄ）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの電気生理学的誘発電場応答は、Ｓ－対照及びＳ－ＨＴと比較してＳ－ＫＯにおいて、より大きかった（図２Ｅ、Ｆ）。より大きな誘発反応とスペクトルパワーの増加は過興奮性のバイオマーカーであるため、これらの結果は、Ｓ－ＫＯマウスの新皮質興奮性の増強を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータは生来の皮質過興奮性の増加を示唆している。
ＲＮＡ－ｓｅｑ及び単核ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）は、Ｗｗｏｘ突然変異モデルにおける髄鞘形成及び細胞交替のトランスクリプトーム変化を明らかにした
ＷＷＯＸのニューロン欠失時に観察された表現型の根底にある分子変化を分析するために、Ｐ１７におけるＳ－ＫＯ及びＳ－対照マウスの全皮質及び海馬由来のバルクＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した。分析により、オリゴデンドロサイトに特異的ないくつかの既知の遺伝子と、星状細胞の活性化を含む、てんかん発作中に誘発される遺伝子との示差的発現を強調する、２つの遺伝子型間の７３０個の上方制御された遺伝子と５７９個の下方制御された遺伝子の総数が明らかになった（Ｐ値＜０．０１，倍率変化＞１．５）３１，３２。重要なことに、遺伝子オントロジー（ＧＯ）ターム分析により、神経細胞の髄鞘形成及び被覆に関連する遺伝子の有意な下方制御が示された。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）もまた、Ｓ－対照と比較して、Ｓ－ＫＯにおいて髄鞘形成に関連する遺伝子を濃縮することにより、下方制御されることを明らかにした。Ｓ－ＫＯマウスの皮質及び海馬由来のＲＮＡ－ｓｅｑデータの詳細な分析により、Ｓ－対照と比較して、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）の成熟（Ｇｊｂ１、Ｇｊｃ２及びＯｌｉｇ１）、ミエリン発達、維持及び機能性に関与する遺伝子の有意な下方制御が示された３１，３３－３６（Ｅｒｍｎ，Ｕｇｔ８ａ，Ｐｌｐ１，Ｏｔｕｄ７ｂ，Ｍａｌ，Ｅｍｌ１，Ｍｏｂｐ，Ｈｉｓｔ１ｈ２ｂｅ，Ｃｌｄｎ１１，Ｍｂｐ，Ｇａｌ３ｓｔ１，Ｆａ２ｈ，Ｇｓｎ，Ａｄａｍｔｓ４，Ｃｎｐ，Ｍｏｇ，Ｏｐｌａｌｉｎ，Ｅｎｐｐ，Ｍａｇ及びＭｙｒｆ。これらの調査結果は、ＷＷＯＸのニューロン細胞内切除が髄鞘形成プロセスに影響を与える可能性があることを示した。
観察された分子変化がＷＷＯＸ機能と直接関連しているかどうかを試験し、結果をさらに検証するために、Ｗｗｏｘ－ｎｕｌｌ及びＮ－ＫＯモデルの海馬組織全体でバルクＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、それらをＳ－ＫＯモデルと比較した。３つのモデルの教師なしクラスタリング分析により、ミエリン関連遺伝子、ならびにＯＬの発生、成熟、及び髄鞘形成プロセスに関与する遺伝子の有意な下方制御が明らかとなった一方、ＣｒｅリコンビナーゼのプロモーターではなくＷＷＯＸの状態に従って試料をグループ化した。上位２５のＤＥＧは、Ｃｎｐ、Ｕｇｔ８ａ、Ｐｌｐ１、Ｅｒｍｎ、Ｏｔｕｄ７ｂ、Ｍｅｔｔｌ７ａ１、Ｐｒｒ１８、Ａｄａｍｔｓ４、Ｋｌｈｄｃ７ａ、Ｍｏｂｐ、Ｃｌｄｎ１１、及びＭｂｐを含む、髄鞘形成に関連する転写産物の下方制御を実際に示した。ＧＳＥＡ及びＧＯターム分析により、髄鞘形成、ニューロンの鞘形成及び軸索鞘形成に関連する有意な負のＦＤＲ値が示された。
ＷＷＯＸのニューロン喪失の分子効果をさらに分析するために、Ｓ－ＫＯ及びＳ－対照マウスの海馬で単核ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を実施した。各細胞型またはサブタイプに特異的な遺伝子セットの発現レベルに基づいて、異なる細胞集団クラスターを同定した３７－４１。一様多様体の近似と射影（ＵＭＡＰ）分析により、Ｓ－対照と比較してＳ－ＫＯにおいて、成熟した有髄形成オリゴデンドロサイト細胞（１５％）、ＣＯＰ（運命決定されたオリゴデンドロサイト前駆細胞）（６８％）の数の減少及びより多くの数（１５０％）のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）が明らかになった。全体として、バルクＲＮＡ－ｓｅｑ及びｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ分析の両方により、オリゴデンドロサイトの成熟障害が明らかになり、ＷＷＯＸのニューロン細胞欠失の潜在的な非細胞自律効果が示された。
ニューロンのＷＷＯＸ切除は、髄鞘形成不全、オリゴデンドロサイト成熟の減少及び軸索伝導障害をもたらす。
次に、ＯＬ特異的遺伝子のトランスクリプトーム変化が、Ｓ－ＫＯマウスの脳及び他のＷｗｏｘ突然変異モデルの髄鞘形成に影響を与えるかどうかを調べた。これを試験するために、Ｐ１８で得られた脳の矢状切片を、ＣＮＰａｓｅ（ＣＮＰ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などのミエリンマーカーについて免疫染色した。免疫蛍光分析は、年齢が一致したＳ－対照と比較して、Ｓ－ＫＯ脳組織における髄鞘形成不全を示す両方のミエリンマーカーの顕著な染色の減少を示した。Ｓ－対照と比較して、Ｓ－ＫＯの皮質、小脳、尾状核被殻、海馬采及び脳弓を含む脳の様々な領域で、ミエリン染色の減少が認められた。ＣＮＰ及びＭＢＰ染色の蛍光強度の定量化により、Ｓ－ＫＯの皮質及び小脳の有意な減少が明らかになった（図３Ａ、Ｃ）。さらに、Ｐ１８の年齢でのＳ－ＫＯ脳のＬｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ（ＬＦＢ）染色は、年齢が一致した対照と比較して、白質トラックの髄鞘形成不全を示した。さらに、対応する対照組織と比較して、Ｐ１８での皮質における定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって評価されるように、ＯＬ成熟及び髄鞘形成遺伝子の発現レベルはＳ－ＫＯにおいて減少した。特に、Ｐｄｇｆｒａ及びＣｓｐｇ４などの初期のＯＰＣマーカー遺伝子はわずかに高く、ＯＬの成熟に特異的な欠損を示唆している。
次に、Ｓ－ＫＯの脳組織における髄鞘形成不全に関連する細胞の変化を評価した。ＣＣ１（成熟ＯＬのマーカー）及び抗ＰＤＧＦＲα（ＯＰＣ）による免疫染色は、ＣＣ１陽性細胞の２倍の減少を示し、年齢が一致した対照と比較して、Ｓ－ＫＯ脳の脳梁（図３Ｅ）において有意により多くのＯＰＣを示した。さらに、ＮＧ２及びＣＣ１の脳切片を免疫染色して、ＯＰＣから成熟ＯＬへの移行を試験し、Ｓ－ＫＯ組織の脳梁及び小脳における二重陽性細胞の数の減少を発見し、ＯＰＣの成熟ＯＬへの分化の欠損をさらに確認した。注目すべきことに、ＣＣ１及び切断されたカスパーゼ３について染色した場合、Ｓ－ＫＯ組織において有意なＯＬ細胞死は観察されなかった。Ｎ－ＫＯの脳組織及びＷｗｏｘ ｎｕｌｌ脳組織では、同様の髄鞘形成不全及びＯＬ成熟の欠損の結果が観察された。
Ｓ－ＫＯマウスで観察された髄鞘形成不全の表現型をさらに評価するために、Ｐ１７における脳梁と視神経の電子顕微鏡検査を実施した。電子顕微鏡画像は、同齢のＳ－対照と比較したＳ－ＫＯの脳梁内の有髄軸索の数の実質的な減少（約３．５～４倍）、及び視神経における有意により多い数（約６倍）の無髄軸索を示している（図４Ａ）。脳梁内の有髄軸索（Ｓ－対照，平均＝１８０±４０，Ｓ－ＫＯ，平均＝５５±３５）及び視神経内の無髄軸索（Ｓ－対照，平均＝５５±２０，Ｓ－ＫＯ，平均＝２７０±６０）の数を視野（ＦＯＶ）ごとにカウントし、図４Ｂに示す。さらに、有髄軸索のｇ比を計算し、Ｓ－ＫＯ脳梁と視神経において同齢の対照と比較して有意に高い比率が観察されたことから、ミエリンの厚さが減少したことが示された（図４Ｃ）。
観察された髄鞘形成不全が軸索伝導を遅延させ、機能障害をもたらすかどうかを試験するために４２，４３、脳梁を刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切片標本内の新皮質第Ｖ層から記録した。対照と比較して、Ｓ－ＫＯにおける神経伝導の有意な潜時が認められ（図４Ｄ－ｉ）、これは、髄鞘形成障害と一致している。図４Ｄに認められるように、Ｎ１とＮ２の振幅比は、軸索伝播のより長い応答潜時（図４Ｄ－ｉｉ、ｉｉｉ）及び誘発電位の有意に低いピーク振幅を示した。
ニューロンのＷＷＯＸは、ＯＰＣから成熟オリゴデンドロサイトへの分化を促進する
これまでのところ、本発明者らの結果は、成熟ニューロンにおけるＷＷＯＸの切除がＯＰＣの分化障害による髄鞘形成不全をもたらすことを示唆している。ニューロンのＷＷＯＸの非細胞自律機能がｉｎ ｖｉｔｒｏでＯＰＣから成熟ＯＬへの分化を調節するかどうかをさらに試験するために、野生型ＯＰＣとＷＴまたはＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスのいずれかから単離した後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンとの共培養アッセイを行った。驚くべきことに、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ ＤＲＧで培養したＯＰＣは、ＷＴ－ＤＲＧに播種したＯＰＣと比較して、有髄化ＯＬへの分化が有意に減少していた（図５）。興味深いことに、代償効果を示唆する可能性が高いこれらの条件下で、有髄化前のＯＬの数が増加することが観察された（図５）。
これらの結果は、オリゴデンドロサイト（Ｏ－ＫＯ）におけるＷｗｏｘ特異的欠失が生後早期の髄鞘形成の変化をもたらすかどうかを判定することを促進した。この目的のために、Ｐ１７においてＯ－ＫＯ及び対照同腹仔のＭＢＰ染色を調べたところ、大きな変化は認められなかった。全体として、これらの調査結果は、ニューロン細胞のＷＷＯＸ切除が髄鞘形成不全を引き起こすことを示している。
ヒトオリゴ皮質スフェロイドにおけるＷＷＯＸ欠失のモデリングは、過興奮性と髄鞘形成不全を明らかにする
次に、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のＷＷＯＸ損失をモデル化し、オリゴ皮質スフェロイド（ＯＳ）として知られるヒト脳オルガノイドを生成することにより、調査結果のヒトとの関連性を評価した。これらのスフェロイドは、脳の細胞構築と集団間相互作用をモデル化し、ヒトで観察される自然な髄鞘形成プロセスを模倣する機能的なニューロンとグリアからなる。ヒトのニューロン活動と髄鞘形成に対するＷＷＯＸ喪失の影響を研究するために、ＷｉＢＲ３ ｈＥＳＣ系統でＷＷＯＸをノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を利用した。ＷＴ（ＯＳ－ＷＴ）及びＷＷＯＸ－ＫＯ ｈＥＳＣ（ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ）の両方に由来するＯＳを、最近公開されたプロトコル２４に従って生成した。
ＯＳの機能特性を特徴決定するために、１５週齢のオルガノイド切片で全細胞パッチ及び局所集合電位（ＬＦＰ）記録を実行した（方法において記載したように）。電場と単一細胞の記録を比較するために、ＬＦＰとパッチ電極を１０～１５μｍ離して配置した（図６Ａ）。ＯＳ－ＷＴ及びＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ系統の両方に由来する、パッチを適用した細胞の静止膜電位（ＲＭＰ）は、一般的な成熟ニューロンに比べて負ではないことが判明したが、これは、これらの細胞がまだ発生過程にあることを示唆している（図６Ｂ）。Ｐｒｅ ｅｔ ａｌ４４が以前に指摘したように、ｉＰＳＣ由来ニューロンのＲＭＰは成熟中にさらに負になり、２Ｄ培養で増殖させた場合、４８～５５日目に健康な細胞で－５０ｍＶに達する。比較すると、本発明者らのスフェロイドは、１０５日目（１５週目）頃に同様のＲＭＰを示した。－５０ｍＶに到達するのにかかる時間の違いは、３Ｄスフェロイドと２Ｄ培養の発達の違いによる可能性がある。ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ細胞は、対応するＷＴ細胞よりも有意に多くの脱分極ＲＭＰを示し、ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯの発達遅延を示唆している。ＬＦＰ記録から、０．５～７．９Ｈｚの低周波数範囲に顕著なピークが観察された。振動活動を、曲線下面積によって定量化したが（図６Ｃ、Ｄ）、これは目的の周波数よりもＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯの方が有意に高かった。試料の記録とそれに対応する時間－周波数スペクトログラムに示されているように、信号特性の差異も観察された。全体として、特にＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯのδ及びθ範囲で低周波活動が増加しており、この範囲はＯＳ－ＷＴには存在しない。低周波活動の増加は、一般に発作様のてんかん様活動４５に起因しており、これは発生中のスフェロイドにおけるＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯ表現型の初期徴候を明らかにすると共に、ヒト患者及びＷｗｏｘ欠損マウス表現型由来のデータと一致している。
オリゴデンドロサイトの状態を評価するために、以前に記載されたように、オリゴデンドロサイトとミエリンの発達と成熟のタイムラインに従った。最初に、成熟ＯＬが観察される最初の時点である１４週目のＯＳにおいて、ＣＣ１及び抗ＰＤＧＦＲαについて免疫染色した。染色により、ＯＰＣが同様の割合であることが明らかになったが、ＣＣ１＋の数はＯＳ－ＷＴと比較してＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯでは減少していた。次に、ミエリンタンパク質ＣＮＰとＯＰＣマーカーＮＧ２の染色によってミエリンが予想される最初の時点である２０週目に、ＯＬとＯＰＣを試験した。ＣＮＰ＋細胞の顕著な減少が認められ、これはＮＧ２＋細胞では明白でなく、ＯＬの数と髄鞘形成不全の減少の両方が示唆された。最後に、コンパクトかつ成熟したミエリンが記述された時点である３０週のＯＳを試験した。２４ＯＳ－ＷＴでは、Ｔｕｊ＋細胞でＷＷＯＸ発現が顕著であった。この段階で、ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯはＭＢＰとＣＮＰの両方の染色の有意な減少を示し（図６Ｅ）、これは転写レベルによっても裏付けられた。興味深いことに、ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯでは、ＳＯＸ１０、及びＰＤＧＦＲαなどの初期のＯＰＣマーカーのＲＮＡレベルがわずかに増加していることが判明した。さらに、電子顕微鏡画像により、３７週で試験した場合に、ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯと比較してＯＳ－ＷＴにおいて有髄軸索がより多いことが示された（図６Ｆ，Ｇ）。全体として、本発明者らのヒトモデルにおけるこれらの調査結果は、脳内のＷＷＯＸ損失の影響に関するマウスデータと一致しており、ミエリンの生理学的発達とてんかんの病理学的発達におけるその重要な役割を支持するものである。
考察
いくつかのエビデンスにより、ＷＷＯＸが脳の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていることが示唆されているが、ＣＮＳにおけるＷＷＯＸの正確な細胞の役割はまだ解明されていない。現在の研究では、複雑な表現型に起因するＷＷＯＸのこれまで知られていなかった細胞の役割を明らかにした。
ＷＷＯＸの発現は、ＣＮＳのニューロン、オリゴデンドロサイト及び星状細胞において認められる。４６Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの欠損に寄与する細胞型を特定するために、異なる神経集団で遺伝子を体系的に変異させることにした。神経幹細胞及び前駆細胞または成熟ニューロンのいずれかにおけるＷＷＯＸの条件付き欠失は、成長遅延、てんかん発作、運動失調及び早死を含むＷｗｏｘ ｎｕｌｌ表現型を再現した。ＷＷＯＸ患者で記録されたＥＥＧ記録と一致して１０，１３－１８、ＷＷＯＸのニューロン欠失が新皮質の過興奮性及び自然てんかん活動に関連していることが明らかとなった。
ＷＷＯＸのニューロン欠失の分析における最も大きな発見の１つは、顕著な髄鞘形成不全の表現型である。この注目すべき表現型は、最初は大量のＲＮＡ－ｓｅｑとｓｎＲＮＡ－ｓｅｑを使用して観察されたが、後には豊富な核転写産物に限定された。これらの観察結果は、様々な組織コンパートメントの免疫蛍光及び電子顕微鏡写真を使用してさらに確認された。全体として、これらの結果は、ＭＲＩ画像で観察されたほとんどのＷＯＲＥＥの小児の白質トラックで記述された遅延髄鞘形成及び薄い脳梁と一致している。１０，１３－１８細胞レベルでは、この髄鞘形成の欠損は、成熟ＯＬの数が減少した結果であることが判明した。この減少は、ニューロン細胞特異的なＷｗｏｘノックアウト脳においてＯＰＣの数の増加も検出したため、分化欠損を表している可能性が高い。興味深いことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＯＰＣから成熟有髄ＯＬへの分化を正に調節することにおけるＷＷＯＸの非細胞自律機能のエビデンスが示されている。
ＷＷＯＸ機能がニューロンにとって最も重要であることをさらに検証するために、オリゴデンドロサイトまたは星状細胞においてＷｗｏｘを特異的に切除した。興味深いことに、どちらの細胞型でもＷｗｏｘを欠失させても、これらの表現型は生じなかった。まとめると、これらの調査結果は、他の神経疾患でのオリゴデンドロサイトまたは星状細胞におけるＷＷＯＸの細胞自律機能を排除することはできないが、ニューロンにおけるＷＷＯＸの非細胞自律的役割がＯＰＣからオリゴデンドロサイトへの分化に何らかの影響を与えることを示している。全体として、この調査結果は、ＣＮＳ生物学におけるニューロンＷＷＯＸの重要かつ新規の役割を強調している。
本発明者らの結果は、Ｗｗｏｘ突然変異マウスにおいて、ニューロンの過興奮性と髄鞘形成不全が主要な欠損であることを明確に示している。これらの２つの表現型は、必ずしも相互に排他的ではあるとは限らない。てんかんにおける白質イメージングの最近の概説では、異常なミエリン含有量に関連する神経障害は、てんかん発作に対するより高い感受性を伴うことが提唱された。４７脱髄または髄鞘形成不全は、実際、難治性の小児てんかん及び動物てんかんモデルでよくみられる所見である。４８髄鞘形成不全または脱髄が局所過興奮性を引き起こす理由は依然として不明である。ＷＷＯＸ欠損症は、ニューロン活動の不均衡やＷＯＲＥＥ症候群の観察された複雑な表現型を生じさせる髄鞘形成など、ＣＮＳのいくつかの機能に影響を与える可能性があると考えられる。
ＯＰＣからオリゴデンドロサイトへの分化は、ＣＮＳの多数の内在性及び外来性因子によって調整される。４９－５１より多くのエビデンスが、ニューロン活動とグルタミン酸シグナル伝達が、発生中のＯＰＣの移動、増殖、分化、及び髄鞘形成を促進することができることを示している。５２，５３ニューロンのＷＷＯＸが、ニューロンの活動または別のメカニズムによってオリゴデンドロサイトの分化に影響を与えるかどうかは、まだ未解明である。ＷＷＯＸは、主要タンパク質との物理的相互作用を介してＷｎｔ／β－カテニン５４－５６、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ５７，５８及びＤＮＡ損傷応答６，５９を含む多くのシグナル伝達経路を調節することがわかっているため、ＷＷＯＸの機能喪失がこれらの重要な経路の調節を解除し、ＣＮＳ恒常性に影響を与えるかどうかはまだ未調査である。
近年、脳オルガノイドは、ヒトの疾患をモデル化する能力があることから、科学界から多くの関心を集めている。６０－６４脳オルガノイドにおけるＷＷＯＸ欠損のモデリングでは、Ｗｗｏｘ突然変異マウスで観察されたいくつかの表現型が再現された。これにより、てんかん様活動をモデル化することが可能となったが、これは、低周波範囲でのパワーの増加として示された。この範囲は、てんかんに関与しているδ波とθ波に対応している。４５細胞パッチの記録により、ＯＳ－ＷＷＯＸ－ＫＯニューロンの脱分極ＲＭＰが明らかとなったが、これは発達の遅延を意味しており、興奮の増加を説明するものである可能性がある。興味深いことに、文献ではまだミエリンが不足していると記載されていた時点である１５週目という早い時期に、ニューロンの変化が観察された。これらのデータは、過興奮性の調節におけるＷＷＯＸの役割を示唆しており、疾患の発症においてニューロン内のＷＷＯＸ発現が重要な役割を担っているという概念を支持するものである。
ＷＷＯＸ欠損脳オルガノイドはまた、Ｗｗｏｘ突然変異マウスで観察された髄鞘形成不全も再現した。表現型は進行性であることが判明し、最終的にミエリン染色の明らかな減少と、髄鞘形成不全を示唆する無髄軸索の増加をもたらした。全体として、この系での結果は、ＯＬにおけるＷＷＯＸの機能及びヒトにおける髄鞘形成をさらに支持するものである。
まとめると、本発明者らの調査結果は、ニューロン細胞のＷＷＯＸ欠損が過興奮性と髄鞘形成の欠損をもたらすことを示している。
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１７． Ａｂｄｅｌ－Ｓａｌａｍ Ｇ， Ｔｈｏｅｎｅｓ Ｍ， Ａｆｉｆｉ ＨＨ， Ｋｏｒｂｅｒ Ｆ， Ｓｗａｎ Ｄ， Ｂｏｌｚ ＨＪ． Ｔｈｅ ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ＷＷＯＸ ｉｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ａｎ ｅａｒｌｙ ｌｅｔｈａｌ ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｗｉｔｈ ｅｐｉｌｅｐｓｙ， ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ． ２０１４；９：１２． ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５０－１１７２－９－１２
１７５０－１１７２－９－１２ ［ｐｉｉ］
１８． Ｍｉｇｎｏｔ Ｃ， Ｌａｍｂｅｒｔ Ｌ， Ｐａｓｑｕｉｅｒ Ｌ， ｅｔ ａｌ． ＷＷＯＸ－ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ： ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ． Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ． Ｊａｎ ２０１５；５２（１）：６１－７０． ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｍｅｄｇｅｎｅｔ－２０１４－１０２７４８
ｊｍｅｄｇｅｎｅｔ－２０１４－１０２７４８ ［ｐｉｉ］
１９． Ａｑｅｉｌａｎ ＲＩ， Ｔｒａｐａｓｓｏ Ｆ， Ｈｕｓｓａｉｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｗｏｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． Ｍａｒｃｈ ６， ２００７ ２００７；１０４（１０）：３９４９－３９５４．
２０． Ａｑｅｉｌａｎ ＲＩ， Ｈａｓｓａｎ ＭＱ， ｄｅ Ｂｒｕｉｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＷＷＯＸ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｏｓｔ－ｎａｔａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ａｕｇ １ ２００８；２８３（３１）：２１６２９－３９．
２１． Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ， Ｋａｔａｙａｍａ Ｋ， Ｔａｋｅｎａｋａ Ｍ， Ａｍａｋａｓｕ Ｋ， Ｓａｉｔｏ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ． Ａ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｗｏｘ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｕｄｉｏｇｅｎｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｌｅｔｈａｌ ｄｗａｒｆｉｓｍ ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ． Ｇｅｎｅｓ， ｂｒａｉｎ， ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ． Ｍａｙ ２０ ２００９；ｄｏｉ：ＧＢＢ５０２ ［ｐｉｉ］
１０．１１１１／ｊ．１６０１－１８３Ｘ．２００９．００５０２．ｘ
２２． Ａｂｄｅｅｎ ＳＫ， Ｄｅｌ Ｍａｒｅ Ｓ， Ｈｕｓｓａｉｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｗｗｏｘ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｕｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ， Ｎ．Ｉ．Ｈ．， Ｅｘｔｒａｍｕｒａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ， Ｎｏｎ－Ｕ．Ｓ． Ｇｏｖ’ｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｊｕｌ ２０１３；２２８（７）：１３７７－８２． ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｐ．２４３０８
２３． Ｅｌａｚａｒ Ｎ， Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎ Ａ， Ｇｏｌａｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ａｘｏｇｌｉａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｙ Ｃａｄｍ４ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＣＮＳ Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ． Ｎｅｕｒｏｎ． Ｊａｎ １６ ２０１９；１０１（２）：２２４－２３１ ｅ５． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．１１．０３２
２４． Ｍａｄｈａｖａｎ Ｍ， Ｎｅｖｉｎ ＺＳ， Ｓｈｉｃｋ ＨＥ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｓｅｐ ２０１８；１５（９）：７００－７０６． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１８－００８１－４
２５． Ｍａｎｓｏｕｒ ＡＡ， Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ＪＴ， Ｂｌｏｙｄ ＣＷ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊｕｎ ２０１８；３６（５）：４３２－４４１． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４１２７
２６． Ｙａｎｇ ＨＪ， Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎ Ａ， Ｍａｉｋ－Ｒａｃｈｌｉｎｅ Ｇ， Ｐｅｌｅｓ Ｅ． Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３７ ｉｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｒ １０ ２０１６；７：１０８８４． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０８８４
２７． Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ， Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ Ｃ， Ｋｒｅｔｚ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｎｘｉｅｔｙ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． Ｓｅｐ １９９９；２３（１）：９９－１０３． ｄｏｉ：１０．１０３８／１２７０３
２８． Ｚｈｕ Ｙ， Ｒｏｍｅｒｏ ＭＩ， Ｇｈｏｓｈ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｌｉｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ． Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ａｐｒ １ ２００１；１５（７）：８５９－７６． ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．８６２１０１
２９． Ｌｕ ＱＲ， Ｓｕｎ Ｔ， Ｚｈｕ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｏｌｉｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ／ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ． Ａｐｒ ５ ２００２；１０９（１）：７５－８６． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ００９２－８６７４（０２）００６７８－５
３０． Ｇｒｅｇｏｒｉａｎ Ｃ， Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｊ， Ｌｅ Ｂｅｌｌｅ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｔｅｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｆｅｂ １１ ２００９；２９（６）：１８７４－８６． ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．３０９５－０８．２００９
３１． Ｃａｈｏｙ ＪＤ， Ｅｍｅｒｙ Ｂ， Ｋａｕｓｈａｌ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ， ｎｅｕｒｏｎｓ， ａｎｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ： ａ ｎｅｗ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｊａｎ ２ ２００８；２８（１）：２６４－７８． ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．４１７８－０７．２００８
３２． Ｈａｎｓｅｎ ＫＦ， Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ， Ｐｅｌｚ Ｃ， Ｉｍｐｅｙ Ｓ， Ｏｂｒｉｅｔａｎ Ｋ． Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｔａｔｕｓ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． Ｎｏｖ ６ ２０１４；４：６９３０． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０６９３０
３３． Ｖｅｊａｒ Ｓ， Ｏｙａｒｚｕｎ ＪＥ， Ｒｅｔａｍａｌ ＭＡ， Ｏｒｔｉｚ ＦＣ， Ｏｒｅｌｌａｎａ ＪＡ． Ｃｏｎｎｅｘｉｎ ａｎｄ Ｐａｎｎｅｘｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１９；１３：３． ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１９．００００３
３４． Ｄｕｇａｓ ＪＣ， Ｔａｉ ＹＣ， Ｓｐｅｅｄ ＴＰ， Ｎｇａｉ Ｊ， Ｂａｒｒｅｓ ＢＡ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｏｃｔ ２５ ２００６；２６（４３）：１０９６７－８３． ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．２５７２－０６．２００６
３５． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＳ， Ｐｏｗｅｌｌ ＢＬ， Ｃｈａｎ ＪＲ． Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｓｉｇｎａｌｓ： ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ｄｅｃ ２００７；６４（２３）：３０５９－６８． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ０００１８－００７－７２６５－ｘ
３６． Ｅｍｅｒｙ Ｂ， Ａｇａｌｌｉｕ Ｄ， Ｃａｈｏｙ ＪＤ， ｅｔ ａｌ． Ｍｙｅｌｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＣＮＳ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ． Ｊｕｌ １０ ２００９；１３８（１）：１７２－８５． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００９．０４．０３１
３７． Ｈａｂｉｂ Ｎ， Ｌｉ Ｙ， Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｖ－Ｓｅｑ： Ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｕｓ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｒａｒｅ ａｄｕｌｔ ｎｅｗｂｏｒｎ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． Ａｕｇ ２６ ２０１６；３５３（６３０２）：９２５－８． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ７０３８
３８． Ｈａｂｉｂ Ｎ， Ａｖｒａｈａｍ－Ｄａｖｉｄｉ Ｉ， Ｂａｓｕ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｕｓ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｗｉｔｈ ＤｒｏＮｃ－ｓｅｑ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｏｃｔ ２０１７；１４（１０）：９５５－９５８． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．４４０７
３９． Ｚｅｉｓｅｌ Ａ， Ｍｕｎｏｚ－Ｍａｎｃｈａｄｏ ＡＢ， Ｃｏｄｅｌｕｐｐｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ．Ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｍａｒ ６ ２０１５；３４７（６２２６）：１１３８－４２． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ１９３４
４０． Ｍａｒｑｕｅｓ Ｓ， Ｚｅｉｓｅｌ Ａ， Ｃｏｄｅｌｕｐｐｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｊｕｎ １０ ２０１６；３５２（６２９１）：１３２６－１３２９． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ６４６３
４１． Ａｒｔｅｇｉａｎｉ Ｂ， Ｌｙｕｂｉｍｏｖａ Ａ， Ｍｕｒａｒｏ Ｍ， ｖａｎ Ｅｓ ＪＨ， ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ Ａ， Ｃｌｅｖｅｒｓ Ｈ． Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｎｉｃｈｅ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． Ｄｅｃ １２ ２０１７；２１（１１）：３２７１－３２８４． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１７．１１．０５０
４２． Ｂａｒａｋ Ｂ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｌｉｕ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｔｆ２ｉ， ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ， ｃａｕｓｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｃｕａｂｌｅ ｂｙ ａ ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｒｕｇ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍａｙ ２０１９；２２（５）：７００－７０８． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１９－０３８０－９
４３． Ｃｉｃｃｉａｒｅｌｌｉ Ｊ， Ｔｅｒａｓａｋｉ ＰＩ． ＤＲ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ． Ｄｅｃ １９８８；２０（６）：１０８２－３．
４４． Ｐｒｅ Ｄ， Ｎｅｓｔｏｒ ＭＷ， Ｓｐｒｏｕｌ ＡＡ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （ｉＰＳＣｓ）． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４；９（７）：ｅ１０３４１８． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０３４１８
４５． Ｃｌｅｍｅｎｓ Ｂ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｔａ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｇｅｎｅｒａｌｉｓｅｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ． Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． Ｊｕｎ ２００４；１１５（６）：１４３６－４１． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｌｉｎｐｈ．２００４．０１．０１８
４６． Ｔｏｃｈｉｇｉ Ｙ， Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｙ， Ｎａｋａｎｅ Ｊ， Ｎａｋａｉ Ｒ， Ｋａｔａｙａｍａ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ． Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｗｗｏｘ Ｃａｕｓｅｓ Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｃｏｒｔｅｘ ｗｉｔｈ Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｌｅｔｈａｌ Ｄｗａｒｆｉｓｍ ｗｉｔｈ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． Ｊｕｌ ２３ ２０１９；２０（１４）ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２０１４３５９６
４７． Ｄｒｅｎｔｈｅｎ ＧＳ， Ｂａｃｋｅｓ ＷＨ， Ａｌｄｅｎｋａｍｐ ＡＰ， Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ＲＪ， Ｋｌｉｎｋｅｎｂｅｒｇ Ｓ， Ｊａｎｓｅｎ ＪＦＡ． Ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｒｉｔｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｙｅｌｉｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｅｐｉｌｅｐｓｙ， ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｍａｙ １５ ２０２０；３３８：１０８６８７． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｎｅｕｍｅｔｈ．２０２０．１０８６８７
４８． Ｇｉｂｓｏｎ ＥＭ， Ｇｅｒａｇｈｔｙ ＡＣ， Ｍｏｎｊｅ Ｍ． Ｂａｄ ｗｒａｐ： Ｍｙｅｌｉｎ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｆｅｂ ２０１８；７８（２）：１２３－１３５． ｄｏｉ：１０．１００２／ｄｎｅｕ．２２５４１
４９． Ｚｕｃｈｅｒｏ ＪＢ， Ｂａｒｒｅｓ ＢＡ． Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｅｃ ２０１３；２３（６）：９１４－２０． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２０１３．０６．００５
５０． Ｓｉｍｏｎｓ Ｍ， Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ Ｋ． Ｎｅｕｒｏｎ－ｇｌｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． Ｎｏｖ １ ２００６；１１９（Ｐｔ ２１）：４３８１－９． ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．０３２４２
５１． Ｅｍｅｒｙ Ｂ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｎｏｖ ５ ２０１０；３３０（６００５）：７７９－８２． ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１９０９２７
５２． Ｂａｒｒｅｓ ＢＡ， Ｒａｆｆ ＭＣ． Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｘｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ． Ｊａｎ ２１ １９９３；３６１（６４０９）：２５８－６０． ｄｏｉ：１０．１０３８／３６１２５８ａ０
５３． Ｂｅｒｇｌｅｓ ＤＥ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＤ， Ｓｏｍｏｇｙｉ Ｐ， Ｊａｈｒ ＣＥ． Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｏｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ． Ｍａｙ １１ ２０００；４０５（６７８３）：１８７－９１． ｄｏｉ：１０．１０３８／３５０１２０８３
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実施例２：新生児ニューロンＷＷＯＸ遺伝子治療はＷＷＯＸ ｎｕｌｌ表現型をレスキューする
近年、ＷＷＯＸ機能を中枢神経系（ＣＮＳ）の恒常性の調節に関連付けるエビデンスが提案されている。９，１０生殖細胞系劣性突然変異（ＷＷＯＸ遺伝子のミスセンス、ナンセンス及び部分／完全欠失）は、２つの主要な表現型、すなわち、ＳＣＡＲ１２（脊髄小脳失調症、常染色体劣性－１２、ＯＭＩＭ６１４３２２）及びＷＯＲＥＥ症候群（ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症）と関連していることが判明した。後者は、発達性及びてんかん性脳症－２８（ＤＥＥ２８、ＯＭＩＭ６１６２１１）としても知られる。９ＷＯＲＥＥは、初期の未成熟停止コドンまたはＷＷＯＸの完全な喪失を有する小児に認められる、複雑で壊滅的な神経障害である。１１ＷＯＲＥＥの臨床スペクトルには、重度の発達遅滞、様々な発作症状（強直性、間代性、強直間代性、ミオクロニー性、点頭てんかん及び欠神）を伴う重度てんかんの早期発症が含まれる。影響を受けた患者のほとんどはアイコンタクトをとらず、座る、話す、または歩くことができない。９ＷＯＲＥＥ症候群は現在の抗けいれん薬に難治性であるため、ＷＯＲＥＥ症候群の小児を助けるための代替治療法を緊急に開発する必要がある。主にＷＷＯＸのミスセンス変異に起因するＳＣＡＲ１２を有する小児は、運動失調やてんかんなどの軽度の表現型を示す。１２ＳＣＡＲ１２のてんかんは抗けいれん薬で治療することができるが、小児は依然として運動失調を示し、知的障害がある。さらに、不整脈を伴うてんかん性けいれんを特徴とするウエスト症候群の患者では、ＷＷＯＸ突然変異が報告されている。１３ＷＷＯＸ遺伝子変異を有する小児の脳は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で評価すると、異常であることが判明した。脳梁の形成不全、進行性脳萎縮、髄鞘形成の遅延、視神経萎縮などの脳の異常が、ほとんどの場合に報告されている。ＷＷＯＸの突然変異またはＷＷＯＸ機能の喪失が、これらのＣＮＳ関連異常にどのようにつながるかはほとんどわかっていない。
ヒトＷＷＯＸ（ｈＷＷＯＸ）とマウスＷＷＯＸ（ｍＷｗｏｘ）との間には顕著な類似性がある。実際、ヒトのＷＷＯＸタンパク質配列は、マウスのＷＷＯＸタンパク質配列と９３％同一であり、９５％相同である。驚くべきことに、げっ歯類モデル（マウス及びラット）においてＷｗｏｘ機能を標的化喪失させると、重度のてんかん発作、成長遅延、運動失調及び早死を含む複雑なヒトの神経学的表現型が表現型模写される。１２，１４，１５Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスはまた、骨代謝障害とステロイド産生に関連する表現型も示す。１６，１７本開示の実施例１は、神経幹細胞及び前駆細胞（Ｎ－ＫＯ）またはニューロン細胞（Ｓ－ＫＯマウス）のいずれかにおいてマウスＷｗｏｘを条件付き切除すると、３～４週間で重度のてんかん、運動失調及び早期死亡がもたらされたことを示しており、これは、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスで観察された表現型を再現している。これらの結果から、ニューロン機能におけるＷＷＯＸの重要な役割が強調されると共に、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスのニューロンコンパートメントにおいてＷＷＯＸ発現を回復させることにより、観察された表現型が逆転し得るかどうかを試験することが促された。この目的のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してＷＷＯＸ発現を回復させた。ｍＷｗｏｘまたはｈＷＷＯＸのオープンリーディングフレームを有し、ヒトニューロンシナプシンＩプロモーターによって駆動されるＡＡＶベクターが、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ表現型を逆転させることができることが示された。ＡＡＶ９－シナプシンＩ－ＷＷＯＸの単回脳室内（ＩＣＶ）注射により、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの成長遅延、てんかん発作、運動失調、及び早期死亡がレスキューされた。さらに、ＷＷＯＸの修復により、髄鞘形成が改善し、ＷＷＯＸ ｎｕｌｌマウスの異常な行動変化が逆転した。全体として、これらの注目すべき結果は、ＷＷＯＸ遺伝子治療がＷＯＲＥＥ及びＳＣＡＲ１２の小児に対する有望な治癒アプローチとなり得ることを示している。
結果
ニューロンのＷＷＯＸの修復は、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ突然変異マウスの成長遅延及び出生後致死をレスキューする
実施例１では、ニューロンにおいてＷＷＯＸを条件付き切除すると、成長遅延、自然てんかん発作、運動失調及び３～４週間での早期死亡を含むＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの表現型が模写されることが示される。これらの結果は、ＷＷＯＸがＣＮＳの恒常性を調節する重要なニューロン遺伝子であることを示唆している。これらの注目すべき調査結果に促されて、本発明者らは、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスにおけるニューロン細胞特異的なＷＷＯＸの発現が、これらのマウスの致死性とそれに関連する表現型をレスキューすることができるかどうかについて取り組みたいと考えた。ヒトシナプシン－Ｉ（ｈＳｙｎＩ）プロモーターによって駆動されるマウスＷｗｏｘ（ｍＷｗｏｘ）またはヒトＷＷＯＸ（ｈＷＷＯＸ）ｃＤＮＡを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを設計し（図８Ａ）、これを、ＣＮＳ向性が高く、ＣＮＳベースの遺伝子治療試験で使用されているＡＡＶ９血清型にパッケージングした。２２，２４ ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ配列をＷｗｏｘ／ＷＷＯＸ配列の下流にクローニングして、発現を追跡できるようにした。ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ）の送達が成功すると、シナプシンＩ陽性非分裂性／成熟ニューロンにおいてインタクトなＷＷＯＸタンパク質が発現するはずである。対照として、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰを使用した。ＷＷＯＸ及びＧＦＰの発現を、最初に、一次Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにウイルス粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることによって検証した。
次に、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶの発現と機能を評価した。ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘまたはＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰのウイルス粒子（２×１０１０／半球）を出生時（Ｐ０）にＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの脳室内領域に注射して、脳全体に広範なニューロンの形質導入を達成した。２５，２６導入遺伝子の発現がニューロンで成功したが、オリゴデンドロサイト（ＣＣ１陽性細胞）では成功しなかったことを、抗ＮｅｕＮ及び抗ＷＷＯＸ抗体を使用した免疫蛍光法によって確認した。
処置マウスのモニタリングにより、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘを注射したマウスは正常に成長し（図７Ｂ）、徐々に体重が増加し（図７Ｃ）、生後６～８週までに野生型と区別がつかないことが明らかとなった。ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰを注射したマウスは、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスと同様の表現型を示した（図７Ｃ）。注目すべきことに、野生型マウスと比較して、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰを注射したマウスは、２週間目から死亡するまで低血糖であった一方で、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘを注射したマウスは、正常な血糖値であった（図７Ｄ）。驚くべきことに、レスキューされたすべてのマウスは、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌまたはＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰを注射したＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスと比較して、より長寿命であり、生存期間中央値は２４０日であった（ｐ値＜０．０００１）（図７Ｅ）。ｍＷｗｏｘをｈＷＷＯＸ ｃＤＮＡに置き換えると、同様の結果及び転帰が得られたが、これまでのところ、これらのマウスを最大１００日間しか追跡していない（図７Ｆ）。特に、レスキューされたマウスは活発であり、オスとメスの両方で繁殖力が高かった。Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスは、精巣ライディッヒ細胞を欠くことが以前に示されていたため１６、次に、ＷＷＯＸニューロン細胞の修復がこの表現型をレスキューするかどうかを判定したところ、実際にＰ１７でのＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ処置マウスにおいてインタクトなライディッヒ細胞が認められた。Ｗｗｏｘ突然変異マウスにおいて、骨の成長障害も以前に報告されていたことから１７，２７－３０、レスキューされたマウスの骨を調べたところ、皮質骨はＷＴマウスと同等のサイズと厚さであることが観察された。これらの結果は、ニューロンでのＷＷＯＸの修復が、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの異常な表現型をレスキューするのに十分であり得ることを示唆している。
ニューロンでのＷＷＯＸの修復は、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの過興奮性を低下させる
Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ突然変異体は、自然再発性発作を示す。１２，１４，１８，３１レスキューされたマウスにおいて自然発作が観察されなかったため、次に、細胞に接続された電気生理学的記録を実行することによって、Ｐ２１～２２での野生型（ＷＴ）、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ（ＫＯ）、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘを注射したＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウス（ＫＯ＋ＡＡＶ９－Ｗｗｏｘ）の脳におけるてんかん活動を測定した。予想通り、ＫＯの仔マウスは重度の活動亢進を示した。活動電位の自発発火を伴う代表的なトレースを図８Ａに示す。代表的なトレース（ＷＴ、ＫＯ＋ＡＡＶ９－Ｗｗｏｘ、及びＫＯ）から明らかな過興奮性が認められる。ＫＯ脳の活動は、通常、活動電位のバーストを生じさせ、全体的に発火率が劇的に増加した。２０ＷＴ、２０ＫＯ＋ＡＡＶ－Ｗｗｏｘ及び３０ＫＯ以上の平均発火率が記録されたニューロンは、ＷＴの仔マウスと比較して、ＫＯの仔マウスで約６倍高かった（ｐ＝２．６ｅ－７）。ＫＯ＋ＡＡＶ－ＷｗｏｘとＷＴの仔マウスの間の平均発火率に有意差は認められなかった。
ＫＯマウスは４週間以内に死亡したため、成体ＫＯマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの記録は実行できなかった。したがって、細胞接着のｉｎ ｖｉｖｏでの記録を、成体のＷＴ及びＫＯ＋ＡＡＶ９－Ｗｗｏｘマウスでのみ実施した（図８Ｂ）。ＷＴ及びＫＯ＋ＡＡＶ９－ｍＷｗｏｘについての代表的なトレースを示すと共に、６０ＷＴ及び６０ＫＯ＋ＡＡＶ９－ｍＷｗｏｘニューロンの平均発火率を示す（図８Ｂ）。成体ＷＴとＫＯ＋ＡＡＶ９－ｍＷｗｏｘ皮質ニューロンの発火率に有意差はなかった。これらの知見は、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘがＷＷＯＸ喪失に起因するてんかん発作を予防することができることを示している。
ニューロンでのＷＷＯＸの修復は、おそらくＯＰＣ分化を促進することにより、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの髄鞘形成を促進する
実施例１は、ＷＷＯＸ喪失と髄鞘形成不全を関連付けるものであった。実際、ニューロンでのＷＷＯＸ切除により、非細胞自律機能がもたらされ、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の分化が損なわれることが示された。したがって、次に、ＡＡＶを使用してニューロンのＷＷＯＸを修復することにより、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの髄鞘形成不全表現型がレスキューされ得るかどうかを試験した。抗ＭＢＰ抗体を用いてＰ１７矢状脳組織を免疫蛍光分析することにより、対照ウイルスを注射したＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスと比較して、レスキューされたＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ処置マウスの脳のすべての部分（皮質、海馬及び小脳）において髄鞘形成が改善されたことが明らかとなった（図９Ａ）。さらに、この髄鞘形成の改善が、ニューロンのＷＷＯＸの非細胞自律機能による成熟オリゴデンドロサイトへのＯＰＣの分化の増加と関連しているかどうかを試験した。予想どおり、ＣＣ１（成熟オリゴデンドロサイトのマーカー）及び抗ＰＤＧＦＲα（ＯＰＣのマーカー）による免疫染色によって評価されるように、ニューロンにおいてＡＡＶ９を介してＷＷＯＸを発現させることにより、成熟オリゴデンドロサイトへのＯＰＣの分化が増加した（図９Ｂ）。脳梁中のＣＣ１及びＯＰＣを定量化することにより、Ｐ１７に対照ウイルスを注射したＫＯマウスと比較して、レスキューされたマウスにおける成熟オリゴデンドロサイト数の有意な増加が示された（図９Ｃ）。
ニューロンでのＷＷＯＸの修復後に髄鞘形成の改善が認められたことをさらに検証するために、Ｐ１７及び成体マウスにおいて脳梁の電子顕微鏡（ＥＭ）分析を実施した。驚くべきことに、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘを使用したニューロンでのＷＷＯＸの修復により、脳梁においてＰ１７でＫＯと比較して有髄軸索の数が増加していた。さらに、計算したｇ比からは、対照ＫＯマウスと比較して、ニューロンでのＷＷＯＸ修復時にミエリンの厚さが増加したことが示された。さらに、レスキューされた成体（６か月）マウスの脳梁と視神経のＥＭ画像から、髄鞘形成の改善が示された。注目すべきことに、Ｐ１７及び６か月目でのＫＯ＋ＡＡＶ－ＷｗｏｘとＷＴの脳梁のミエリン厚さを比較する場合、ｇ比にいくつかの差異が観察された。
ニューロンでのＷＷＯＸの修復は、不安を軽減し、運動機能を改善する
次に、ニューロンにおいてＷＷＯＸを修復した後のＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの行動の変化を調べた。残念ながら、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスは状態が悪く、早死にするため、行動を評価することができなかった。本発明者らは、レスキューされたマウスにおける不安及び運動協調性を調べるために、オープンフィールド高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験及びロータロッド試験を実施した（図１０Ａ～Ｅ）。驚くべきことに、８～１０週目において、レスキューされたマウス（オスとメス）において、野生型で認められるパターンと同様の追跡パターンがオープンフィールドで観察され、ＷＷＯＸ修復によってＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの不安が軽減されることが示された。さらに、オープンフィールドトラックを移動した速度と総距離は、ＷＴマウスのものと非常に類似していた（図１０Ｂ、Ｃ）。さらに、レスキューされたメス及びオスのマウスは、ＥＰＭでほぼ正常な行動を示した（図１０Ｄ）。ロータロッド試験は、レスキューされたマウスの運動協調性をチェックするために実施した。その結果から、試験３においてレスキューされたマウスがＷＴマウスと同様の運動協調性を有していたことが明らかとなり、これはマウスの学習能力を示すものであった。全体として、これらの結果は、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスのニューロンにおいてＷＷＯＸを再発現させることにより、活動と正常な行動が回復することを示唆している。
考察
本実施例では、ニューロンにおいてＷＷＯＸを修復し、この修復による治療可能性を評価することを目的とした。この研究では、成熟ニューロンへのＷＷＯＸの標的遺伝子送達を行うためにＡＡＶ９ベクターを使用して、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスモデルにおける複雑な神経障害を治療した。ニューロンプロモーターシナプシン－Ｉ下のｍＷｗｏｘまたはｈＷＷＯＸ ｃＤＮＡを新生Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの脳に注射し、この治療がＷＷＯＸ欠損症の表現型を逆転させることができることを示した。
ＣＮＳ恒常性の調節におけるＷＷＯＸの役割は、ＷＷＯＸ遺伝子の重要な機能として注目されている。ＷＷＯＸの欠損は、多くの神経疾患に関連している。９，１０ 特に興味深いのはＷＯＲＥＥ症候群であり、生存期間中央値が１～４年の早死をもたらす重篤で複雑な神経疾患である。９，１０ＷＯＲＥＥを有する小児は、現在の抗てんかん薬（ＡＥＤ）に難治性であるため、医学界及び科学界が新規治療戦略を開発することに挑戦している。ＷＯＲＥＥ症候群患者の脳にＡＡＶ９－ＷＷＯＸを送達することは、これらの患者を助ける新規遺伝子治療アプローチになり得ると考えられる。
ＡＡＶ９－ＳｙｎＩ－ＷＷＯＸをＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの脳に送達することの効果は顕著であった。第一に、ＷＷＯＸニューロンの送達は、自然発作や運動失調の発生を伴わずに、マウスの正常な成長及び生存率を回復させた。さらに、ニューロンでのＷＷＯＸの修復が、細胞接着記録における過興奮性を低下させることが示された。第二に、ニューロンにおいてＷＷＯＸを修復することにより、脳の全領域の髄鞘形成が改善し、ＯＰＣ成熟に対するＷＷＯＸのニューロンでの非細胞自律機能の以前の観察結果がさらに確認された（実施例１）。注目すべき点は、レスキューされたマウスとＷＴマウスの間には、髄鞘形成プロセスの調節におけるオリゴデンドロサイト特異的なＷＷＯＸ機能に起因し得るいくつかの差異が依然として存在することである。第三に、ＷＷＯＸ修復により、レスキューされたマウスの全体的な行動が改善された。これらの調査結果は、自閉症９－１１，３３，３４及びおそらく他の行動関連障害の調節におけるＷＷＯＸの提唱された役割が、ＷＷＯＸの適切なニューロン機能によって駆動されることを示唆している可能性がある。
ニューロンでのＷＷＯＸ送達の別の興味深い結果は、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスのＷＷＯＸ欠損に関連する低血糖の可逆性である。３５，３６これらの結果は、ＣＮＳでのグルコース代謝及びおそらく他の代謝機能におけるＷＷＯＸの中心的な役割と一致している。３７－４０興味深いことに、骨格筋においてＷｗｏｘを標的化欠失させると、グルコース恒常性の障害が生じ４１、この効果は、ＷＷＯＸの細胞自律機能に関連していた。
別の奇妙な観察結果は、レスキューされたマウスも繁殖力があり、繁殖することができたということである。Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスがステロイド産生障害を示すことが示されたことを考えると１６，２９，４２、現在の知見からは、ＣＮＳにおけるＷＷＯＸの機能がその組織レベルの機能を重ね合わせていることが示唆される。全体として、これらの調査結果は、ＷＷＯＸが臓器レベルと生物レベルの両方で多面的な機能を有している可能性があることを示唆している。
ＷＷＯＸは、すべての脳領域で遍在的に発現している。１０，４３，４４現在の観察結果は、星状細胞やオリゴデンドロサイトなどの他の脳細胞型でのＷＷＯＸ発現が不要であることを意味するものではない。ＷＷＯＸ機能をオリゴデンドロサイトの病理と関連付けるエビデンスが出現し始めている４５－４９が、オリゴデンドロサイトにおけるＷＷＯＸの細胞自律機能についてはほとんど知られていない。ニューロンにおけるＷＷＯＸ発現がオリゴデンドロサイトの成熟を調節し、アストログリオーシスに拮抗するという事実５０は、ＣＮＳ生理学及び病態生理学におけるＷＷＯＸの複雑な機能を示唆しており、さらなる詳細な分析が必要である。
ＷＷＯＸ遺伝子は当初、推定腫瘍抑制因子としてクローニングされた。５１，５２実際、様々な動物モデルにおける多くの研究活動（１５で概説されている）及びヒトがん患者における観察１，２７，３９，５３－５７から、ＷＷＯＸは腫瘍抑制因子として提唱された。ＷＷＯＸの修復が脳に限定されることを考えると、ＷＷＯＸ発現を欠く他の組織は腫瘍の発生をより受けやすいと想定された。注目すべきことに、試験した、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘで処理した限られた数の成体Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウス（６～８か月齢、ｎ＝６）において、肉眼的な腫瘍形成は検出されなかった。いくつかの組織における体細胞でのＷｗｏｘの欠失には、動物モデルにおける腫瘍形成を促進するための他のヒットが必要であったことを考えると、これは驚くべきことではない。２８，３９，５８，５９
Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスは、寿命が限定的であり、状態が良くなかったため、これらのマウスを生存期間の非常に早い段階（Ｐ０）で治療することを余儀なくされた。しかしながら、出生後のＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスを治療する試みは、将来的に調査されるべきである。本発明者らの現在の調査結果は、ＡＡＶベクターを使用した新生児マウスのＷＷＯＸ修復が、ＷＷＯＸ欠損症に関連する表現型を逆転させ得ることを示している。この概念実証は、壊滅的で多くの場合に難治性であるＷＯＲＥＥ症候群に罹患した小児に対して、遺伝子治療の臨床試験の可能性についての基礎を築くと考えられる。
材料及び方法
プラスミドベクター
マウスＷｗｏｘまたはヒトＷＷＯＸ ｃＤＮＡを、ｐＡＡＶのヒトシナプシンＩプロモーター下にクローニングし、このベクターをＡＡＶ９血清型にパッケージングした（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，米国）。カスタムメイドのＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｈＷＷＯＸ－２Ａ－ＥＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰウイルス粒子は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓまたはエルサレムのヘブライ大学のＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。
マウス
Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ（－／－）マウス（ＫＯ）の生成は、以前に報告されており１６、これらのマウスをＦＶＢバックグラウンドで維持した。ヘテロ接合体（＋／－）マウスを繁殖に使用して、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスを取得した。動物は、ＳＰＦユニット内で、１２時間の明／暗サイクルで、食物と水を自由に摂取させて維持した。すべての動物関連の実験は、ヘブライ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＵ－ＩＡＣＵＣ）の事前承認に従って行われた。
Ｐ０ Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスへのＡＡＶ粒子の脳室内（ＩＣＶ）注射
Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスへのＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ｍＷｗｏｘ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（ＡＡＶ９－ＷＷＯＸ）またはＡＡＶ９－ｈＳｙｎＩ－ＥＧＦＰ（ＡＡＶ９－ＧＦＰ）のフリーハンド頭蓋内注射を、公開されたプロトコルに従って実施した。２５簡潔に述べると、新生児の出生時に、ＰＣＲ遺伝子型を決定してＷｗｏｘ ｎｕｌｌマウスを識別した。Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌ新生児には、乾燥した平らな冷たい表面に配置することによって麻酔をかけた。麻酔をかけた仔マウスの頭部を、７０％エタノールに浸した綿棒でやさしく拭いた。分注液を可視化できるように、０．１％トリパンブルーをウイルスに添加した。注射部位は、ラムダ縫合糸から各眼までの距離の２／５の位置であった。頭蓋骨の表面に対して垂直に注射器（ウイルスをプレロードした）を保持し、針をおよそ３ｍｍの深さまで挿入した。およそ１μｌ（２×１０１０ＧＣ／半球）のウイルスを、３３Ｇベベル針（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＮａｎｏＦｉｌシリンジを使用して分配した。他方の半球にも同じ方法で注射した。注射された仔マウスを、目が覚めるまで加温パッドに置き、次いで母親のケージに移した。注射された各マウスを、成長、可動性、発作、運動失調及び全身状態について注意深くモニタリングして、表現型を評価した。
体重及び血糖値
図に示すように、マウスの体重を定期的に測定した。血糖値をモニタリングするために、マウスの尻尾の先端をはさみで破り、Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｃｋ血糖値測定器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を使用して測定するために少量の血液を採取した（ｍｇ／ｄＬ）。
免疫蛍光
異なる遺伝子型及び治療群（Ｐ１７～Ｐ１８）のマウスをＣＯ２で安楽死させ、２％ＰＦＡ／ＰＢＳで経心臓的に灌流した。解剖した脳を氷上で３０分間後固定し、次いで３０％スクロース中で４℃にて一晩インキュベートした。次いで、それらをＯＣＴに包埋し、クライオスタットを使用して切片化した（１２～１４μｍ）。矢状切片をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する５％ヤギ血清をブロッキングし、次いで室温で１時間インキュベートした後、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、対応するＡｌｅｘａフルオロフォアでタグ付けされた二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、封入剤でマウントした。
電気生理学のための外科手術
マウスには、ケタミン／メデトミジン（腹腔内；それぞれ１００及び８３ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔をかけた。足指ピンチ反射（ｔｏｅ－ｐｉｎｃｈ ｒｅｆｌｅｘ）がないことによって、麻酔の有効性を確認した。初回用量の４分の１を使用して、約１時間ごとに追加用量を投与して、電気生理学的処置中の麻酔を維持した。すべての手術及び実験の間、加熱パッド（３７℃）を使用して体温を維持した。皮膚を除去して頭蓋骨を露出させた。カスタムメイドの金属ピンを歯科用セメントを使用して頭蓋骨に固定し、カスタムステージに接続した。生検パンチ（Ｍｉｌｔｅｘ，ＰＡ）を使用して頭蓋骨に小さな穴（直径３ｍｍの開頭術）を作成した。
細胞接着記録
細胞接着記録を、ブラインドパッチクランプ記録法で取得した。電極（約７ＭＯｈｍ）を、垂直２段プラー（ＰＣ－１２、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、ＥａｓｔＭｅａｄｏｗ，ＮＹ）で、フィラメント状の薄壁のホウケイ酸ガラス（外径１．５ｍｍ、内径０．８６ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｌｓｆｅｌｄ，ドイツ）から引き出した。電極を、以下を含有する内部溶液で満たし：１４０ｍＭのＫ－グルコン酸塩、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａ２－ホスホクレアチン、及び０．５ｍＭのＥＧＴＡ、ＫＯＨでｐＨ７．２５に調整した。電極を４５°で挿入し、３００μｍの深さに到達させた。電極の配置は、ブレグマの後方１．６～２ｍｍ、正中線の外側４ｍｍに位置する脳表面を標的にした。電極を配置している間、ピペットの抵抗が１０～２００ＭＯｈｍに増加すると、ほとんどの場合、活動電位（スパイク）が発生した。単一のスパイクの検出は、記録を開始する基準であった。すべての記録は、電流クランプモードの細胞内アンプ（ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で取得し、１０ｋＨｚのサンプリングレートで取得し（ＣＥＤ Ｍｉｃｒｏ１４０１－３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ハイパスフィルターでフィルター処理した。平均発火率の計算では、記録した細胞ごとに４分間の記録時間にわたる発火率を計算した。２サンプルｔ検定を使用して、記録した群間の統計的有意性を評価した。
電子顕微鏡法
マウスを麻酔し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３中に２％パラホルムアルデヒド及び２．５％グルタルアルデヒド（ＥＭグレード）を含有する固定液で灌流した。脳を単離し、同じ固定液で室温にて２時間インキュベートし、次いでそれらを処理するまで４℃で保存した。回収した組織（脳梁、視神経）をカコジル酸ナトリウムで４回洗浄し、カコジル酸ナトリウム中の１％四酸化オスミウム、１．５％フェリシアン化カリウムで１時間、後固定し、同じ緩衝液で４回洗浄した。次いで、一連の段階的なエタノール溶液（３０、５０、７０、８０、９０、９５％）を用いて組織試料を各々１０分間脱水し、次いで１００％エタノールを用いて各々２０分間３回、続いてプロピレンオキシドで２回交換した。次いで、組織試料に一連のエポキシ樹脂（２５、５０、７５、１００％）を各々２４時間浸透させ、オーブン内で６０℃、４８時間重合させた。ブロックをウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅ，Ｒｉｅｃｈｅｒｔ－Ｊｕｎｇ）で切片化し、８０ｎｍの切片を取得し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。Ｊｅｏｌ ＪＥＭ １４００ Ｐｌｕｓ透過型電子顕微鏡を使用して切片を観察し、Ｇａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ ＣＣＤカメラを使用して写真を撮影した。ＥＭ顕微鏡写真を、コンピューター支援ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを使用して分析した。ｇ比を計算するために、脳梁由来のＥＭ画像の有髄軸索（約３００、マウスあたり１００軸索、遺伝子型あたりｎ＝３）を、軸索の内径を総軸索の直径で割ることによって分析した。
オープンフィールド試験
オープンフィールド試験は、以前に公開されたプロトコルに従って実施した。６０簡潔に述べると、マウスを５０×５０×３３ｃｍのアリーナの隅に配置し、６分間自由に探索させた。アリーナの中心は、アリーナの真ん中にある２５×２５ｃｍの正方形として定義された。中央及びアリーナの円周における速度及び費やされた時間を測定した。オープンフィールドで試験したマウスは、追跡ソフトウェア（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ１２）を備えたコンピューターに接続されたビデオカメラを使用して記録した。
高架十字迷路試験
試験装置は、互いに向かい合って高さ１ｃｍの縁で縁取りされ、１６ｃｍの縁で縁取られた２つのクローズドアームに垂直な２つのオープンアーム（３０×５ｃｍ）からなり、すべて床から７５ｃｍの高さであった。マウスを迷路に入れ、５分間探索させた。オープンアーム及びクローズドアームの両方における滞在期間を記録した。６０
ロータロッド試験
各動物を、回転速度を５回転毎分（ｒｐｍ）から４０ｒｐｍに増加させた回転ロッドに９９秒間配置した。各動物の試験は、２０分間隔での３回の試行からなっていた。装置から落下するまでの時間（潜時）を、各動物の試行ごとに記録した。試験開始から２４０秒以内に動物が装置から落下しなかった場合、試験を終了した。６１
画像の取得及び分析
免疫染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナーまたはＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡またはＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋共焦点顕微鏡を使用して画像化した。取得した画像は、関連する顕微鏡ソフトウェアプログラム、すなわち、それぞれ、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒ、Ｆ－１０－ＡＳＷビューアー、及びＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓを使用して処理した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を分析した。画像は遺伝子型を盲検化して分析し、処理には明るさとコントラストの全体的な変化が含まれていた。
統計解析
すべてのグラフ及び統計解析は、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５のいずれかを使用して実行した。実験の結果は、平均±ＳＥＭとして示した。両側独立スチューデントｔ検定を使用して、統計的有意性を試験した。結果は、Ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなされ、それ以外の場合はｎｓ（有意性なし）として表された。データ解析は、遺伝子型に対して非盲検で実施した。サンプルサイズとｐ値を、図の凡例中に示す。
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２２． Ｗａｎｇ， Ｄ．， Ｔａｉ， Ｐ．Ｗ．Ｌ．， ａｎｄ Ｇａｏ， Ｇ． （２０１９）． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８， ３５８－３７８． １０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００１２－９．
２３． Ｎａｋａｉ， Ｈ．， Ｙａｎｔ， Ｓ．Ｒ．， Ｓｔｏｒｍ， Ｔ．Ａ．， Ｆｕｅｓｓ， Ｓ．， Ｍｅｕｓｅ， Ｌ．， ａｎｄ Ｋａｙ， Ｍ．Ａ． （２００１）． Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｒｅ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５， ６９６９－６９７６． １０．１１２８／ＪＶＩ．７５．１５．６９６９－６９７６．２００１．
２４． Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ， Ｇ．Ｒ． （２０１４）． Ｂａｓｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４， ８６－１００． １０．２１７４／１５６６５２３２１４６６６１４０３０２１９３７０９．
２５． Ｋｉｍ， Ｊ．Ｙ．， Ｇｒｕｎｋｅ， Ｓ．Ｄ．， Ｌｅｖｉｔｅｓ， Ｙ．， Ｇｏｌｄｅ， Ｔ．Ｅ．， ａｎｄ Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ， Ｊ．Ｌ． （２０１４）． Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｖｉｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｆｏｒ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｄ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， ５１８６３． １０．３７９１／５１８６３．
２６． Ｇｈｏｌｉｚａｄｅｈ， Ｓ．， Ｔｈａｒｍａｌｉｎｇａｍ， Ｓ．， Ｍａｃａｌｄａｚ， Ｍ．Ｅ．， ａｎｄ Ｈａｍｐｓｏｎ， Ｄ．Ｒ． （２０１３）． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ａｎｄ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４， ２０５－２１３． １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．０７６．
２７． Ｋｕｒｅｋ， Ｋ．Ｃ．， Ｄｅｌ Ｍａｒｅ， Ｓ．， Ｓａｌａｈ， Ｚ．， Ａｂｄｅｅｎ， Ｓ．， Ｓａｄｉｑ， Ｈ．， Ｌｅｅ， Ｓ．Ｈ．， Ｇａｕｄｉｏ， Ｅ．， Ｚａｎｅｓｉ， Ｎ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｋ．Ｂ．， ＤｅＹｏｕｎｇ， Ｂ．， Ａｍｉｒ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＷＷＯＸ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ＲＵＮＸ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０， ５５７７－５５８６． ０００８－５４７２．ＣＡＮ－０９－４６０２ ［ｐｉｉ］１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０９－４６０２．
２８． Ｄｅｌ Ｍａｒｅ， Ｓ．， Ｈｕｓａｎｉｅ， Ｈ．， Ｉａｎｃｕ， Ｏ．， Ａｂｕ－Ｏｄｅｈ， Ｍ．， Ｅｖａｎｇｅｌｏｕ， Ｋ．， Ｌｏｖａｔ， Ｆ．， Ｖｏｌｉｎｉａ， Ｓ．， Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ．， Ａｍｉｒ， Ｇ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｊ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｇ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． ＷＷＯＸ ａｎｄ ｐ５３ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ ｔｏ Ｄｒｉｖｅ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７６， ６１０７－６１１７． １０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１６－０６２１．
２９． Ｌｕｄｅｓ－Ｍｅｙｅｒｓ， Ｊ．Ｈ．， Ｋｉｌ， Ｈ．， Ｐａｒｋｅｒ－Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇ， Ｊ．， Ｋｕｓｅｗｉｔｔ， Ｄ．Ｆ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍ．Ｔ．， ａｎｄ Ａｌｄａｚ， Ｃ．Ｍ． （２００９）． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｗｏｘ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４， ｅ７７７５． １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７７７５．
３０． Ａｂｄｅｅｎ， Ｓ．Ｋ．， Ｄｅｌ Ｍａｒｅ， Ｓ．， Ｈｕｓｓａｉｎ， Ｓ．， Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， Ｓａｌａｈ， Ｚ．， Ｈａｇａｎ， Ｊ．， Ｒａｗａｈｎｅｈ， Ｍ．， Ｐｕ， Ｘ．Ａ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｓ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｇ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｗｗｏｘ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｎｕｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２２８， １３７７－１３８２． １０．１００２／ｊｃｐ．２４３０８．
３１． Ｃｈｅｎｇ， Ｙ．Ｙ．， Ｃｈｏｕ， Ｙ．Ｔ．， Ｌａｉ， Ｆ．Ｊ．， Ｊａｎ， Ｍ．Ｓ．， Ｃｈａｎｇ， Ｔ．Ｈ．， Ｊｏｕ， Ｉ．Ｍ．， Ｃｈｅｎ， Ｐ．Ｓ．， Ｌｏ， Ｊ．Ｙ．， Ｈｕａｎｇ， Ｓ．Ｓ．， Ｃｈａｎｇ， Ｎ．Ｓ．， Ｌｉｏｕ， Ｙ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｗｗｏｘ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３ｂｅｔａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ ８， ６． １０．１１８６／ｓ４０４７８－０２０－０８８３－３．
３２． Ｐａｔｔａｌｉ， Ｒ．， Ｍｏｕ， Ｙ．， ａｎｄ Ｌｉ， Ｘ．Ｊ． （２０１９）． ＡＡＶ９ Ｖｅｃｔｏｒ： ａ Ｎｏｖｅｌ ｍｏｄａｌｉｔｙ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２６， ２８７－２９５． １０．１０３８／ｓ４１４３４－０１９－００８５－４．
３３． Ｐｅｔｅｒ， Ｂ．， Ｄｉｎｕ， Ｖ．， Ｌｉｕ， Ｌ．， Ｈｕｅｎｔｅｌｍａｎ， Ｍ．， Ｎａｙｍｉｋ， Ｍ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｈ．， Ｖｏｓｅ， Ｃ．， ａｎｄ Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ， Ｉ． （２０１９）． Ｅｘｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｔｗｏ Ｓｉｂｌｉｎｇｓ ｗｉｔｈ Ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｕｔｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｅ Ｓｐｅｅｃｈ Ｓｏｕｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｓｕｇｇｅｓｔｓ Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｂｅｈａｖ Ｇｅｎｅｔ ４９， ３９９－４１４． １０．１００７／ｓ１０５１９－０１９－０９９５７－８．
３４． Ｍｉｇｎｏｔ， Ｃ．， Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｌ．， Ｐａｓｑｕｉｅｒ， Ｌ．， Ｂｉｅｎｖｅｎｕ， Ｔ．， Ｄｅｌａｈａｙｅ－Ｄｕｒｉｅｚ， Ａ．， Ｋｅｒｅｎ， Ｂ．， Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｊ．， Ｓａｕｎｉｅｒ， Ａ．， Ａｌｌｏｕ， Ｌ．， Ｒｏｔｈ， Ｖ．， Ｖａｌｄｕｇａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． ＷＷＯＸ－ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ： ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ． Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ５２， ６１－７０． １０．１１３６／ｊｍｅｄｇｅｎｅｔ－２０１４－１０２７４８ｊｍｅｄｇｅｎｅｔ－２０１４－１０２７４８ ［ｐｉｉ］．
３５． Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， Ｓｅｅｗａｌｄｔ， Ｖ．Ｌ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１４）． ＷＷＯＸ ｌｏｓｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ ａｅｒｏｂｉｃ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．
３６． Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１４）． Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＷＷＯＸ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｖｉａ ＨＩＦ１ａｌｐｈａ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２１， １８０５－１８１４． １０．１０３８／ｃｄｄ．２０１４．９５．
３７． Ｉａｔａｎ， Ｉ．， Ｃｈｏｉ， Ｈ．Ｙ．， Ｒｕｅｌ， Ｉ．， Ｒｅｄｄｙ， Ｍ．Ｖ．， Ｋｉｌ， Ｈ．， Ｌｅｅ， Ｊ．， Ａｂｕ Ｏｄｅｈ， Ｍ．， Ｓａｌａｈ， Ｚ．， Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， Ｗｅｉｓｓｇｌａｓ－Ｖｏｌｋｏｖ， Ｄ．， Ｎｉｋｋｏｌａ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｔｈｅ ＷＷＯＸ Ｇｅｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ＨＤＬ ａｎｄ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １０．１１６１／ＣＩＲＣＧＥＮＥＴＩＣＳ．１１３．０００２４８．
３８． Ｌｅｅ， Ｊ．Ｃ．， Ｗｅｉｓｓｇｌａｓ－Ｖｏｌｋｏｖ， Ｄ．， Ｋｙｔｔａｌａ， Ｍ．， Ｄａｓｔａｎｉ， Ｚ．， Ｃａｎｔｏｒ， Ｒ．Ｍ．， Ｓｏｂｅｌ， Ｅ．Ｍ．， Ｐｌａｉｓｉｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｅｎｇｅｒｔ， Ｊ．Ｃ．， ｖａｎ Ｇｒｅｅｖｅｎｂｒｏｅｋ， Ｍ．Ｍ．， Ｋａｎｅ， Ｊ．Ｐ．， Ｍａｌｌｏｙ， Ｍ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２００８）． ＷＷ－ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｐｌａｓｍａ ＨＤＬ－Ｃ ｌｅｖｅｌｓ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８３， １８０－１９２． Ｓ０００２－９２９７（０８）００３９９－６ ［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ａｊｈｇ．２００８．０７．００２．
３９． Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， Ｋｈａｌａｉｌｅｈ， Ａ．， Ｐｉｋａｒｓｋｙ， Ｅ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１８）． ＷＷＯＸ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｈｅｐａｔｉｃ ＨＩＦ１ａｌｐｈａ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｉａ． Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ ９， ５１１． １０．１０３８／ｓ４１４１９－０１８－０５１０－４．
４０． Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１５）． Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ （Ｍａｙｗｏｏｄ） ２４０， ３４５－３５０． １０．１１７７／１５３５３７０２１４５６１９５６．
４１． Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ， Ｍ．， Ａｋｋａｗｉ， Ｒ．， Ｋｎａｎｉ， Ｉ．， Ｕｄｉ， Ｓ．， Ｐａｃｏｌｄ， Ｍ．Ｅ．， Ｔａｍ， Ｊ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１９）． ＷＷＯＸ ｓｏｍａｔｉｃ ａｂｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ａｌｔｅｒｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ ２２， １３２－１４０． １０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｔ．２０１９．０１．０１０．
４２． Ｓａｌｕｄａ－Ｇｏｒｇｕｌ， Ａ．， Ｓｅｔａ， Ｋ．， Ｎｏｗａｋｏｗｓｋａ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂｅｄｎａｒｅｋ， Ａ．Ｋ． （２０１１）． ＷＷＯＸ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ－－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ． Ｃ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６６， ７３－８２．
４３． Ｃｈｅｎ， Ｓ．Ｔ．， Ｃｈｕａｎｇ， Ｊ．Ｉ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．Ｐ．， Ｔｓａｉ， Ｍ．Ｓ．， Ｌｉ， Ｈ．， ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， Ｎ．Ｓ． （２００４）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＷＯＸ１ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｕｒｉｎｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２４， ８３１－８３９． １０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００３．１２．０３６．
４４． Ｃｈｉａｎｇ， Ｍ．Ｆ．， Ｃｈｅｎ， Ｓ．Ｔ．， Ｌｏ， Ｃ．Ｐ．， Ｓｚｅ， Ｃ．Ｉ．， Ｃｈａｎｇ， Ｎ．Ｓ．， ａｎｄ Ｃｈｅｎ， Ｙ．Ｊ． （２０１３）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＷＯＸ１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｔｕｍｏｒｓ． Ａｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ （Ａｍｓｔ） ３６， １３３－１４７． １０．３２３３／ＡＣＰ－１４００８７．
４５． Ｊａｋｅｌ， Ｓ．， Ａｇｉｒｒｅ， Ｅ．， Ｍｅｎｄａｎｈａ Ｆａｌｃａｏ， Ａ．， ｖａｎ Ｂｒｕｇｇｅｎ， Ｄ．， Ｌｅｅ， Ｋ．Ｗ．， Ｋｎｕｅｓｅｌ， Ｉ．， Ｍａｌｈｏｔｒａ， Ｄ．， Ｆｆｒｅｎｃｈ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｃ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ａ．， ａｎｄ Ｃａｓｔｅｌｏ－Ｂｒａｎｃｏ， Ｇ． （２０１９）． Ａｌｔｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５６６， ５４３－５４７． １０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９０３－２．
４６． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃ．， Ｂｅｅｃｈａｍ， Ａ．Ｈ．， Ｐａｔｓｏｐｏｕｌｏｓ， Ｎ．Ａ．， Ｘｉｆａｒａ， Ｄ．Ｋ．， Ｄａｖｉｓ， Ｍ．Ｆ．， Ｋｅｍｐｐｉｎｅｎ， Ａ．， Ｃｏｔｓａｐａｓ， Ｃ．， Ｓｈａｈ， Ｔ．Ｓ．， Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｃ．， Ｂｏｏｔｈ， Ｄ．， Ｇｏｒｉｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｌｏｃｉ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ４８ ｎｅｗ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４５， １３５３－１３６０． １０．１０３８／ｎｇ．２７７０．
４７． Ｚｉｌｉｏｔｔｏ， Ｎ．， Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ， Ｇ．， Ｓｃａｐｏｌｉ， Ｃ．， Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ， Ｍ．， Ｍｅｎｅｇｈｅｔｔｉ， Ｓ．， Ｂｅｎａｚｚｏ， Ａ．， Ｌｕｎｇｈｉ， Ｂ．， Ｂａｌｅｓｔｒａ， Ｄ．， Ｌａｉｎｏ， Ｌ．Ａ．， Ｂｏｚｚｉｎｉ， Ｎ．， Ｇｕｉｄｉ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｃ６ｏｒｆ１０ Ｌｏｗ－Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ Ｒａｒｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｉｔａｌｉａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ １０， ５７３． １０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１９．００５７３．
４８． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃ． （２０１９）． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｍａｐ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５． １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７１８８．
４９． Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ， Ｔ．， Ｍａｄｉｒｅｄｄｙ， Ｌ．， Ｓｐｒｅｎｇｅｒ， Ｔ．， Ｋｈａｎｋｈａｎｉａｎ， Ｐ．， Ｍａｇｏｎ， Ｓ．， Ｎａｅｇｅｌｉｎ， Ｙ．， Ｃａｖｅｒｚａｓｉ， Ｅ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ｒ．Ｌ．， Ｋａｐｐｏｓ， Ｌ．， Ｈａｕｓｅｒ， Ｓ．Ｌ．， Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂｒａｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｇｅｎｅｓ， ｂｒａｉｎ， ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ １４， ２１７－２２７． １０．１１１１／ｇｂｂ．１２１９０．
５０． Ｈｕｓｓａｉｎ， Ｔ．， Ｋｉｌ， Ｈ．， Ｈａｔｔｉａｎｇａｄｙ， Ｂ．， Ｌｅｅ， Ｊ．， Ｋｏｄａｌｉ， Ｍ．， Ｓｈｕａｉ， Ｂ．， Ａｔｔａｌｕｒｉ， Ｓ．， Ｔａｋａｔａ， Ｙ．， Ｓｈｅｎ， Ｊ．， Ａｂｂａ， Ｍ．Ｃ．， Ｓｈｅｔｔｙ， Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｗｗｏｘ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅｄ ＧＡＢＡ－ｅｒｇｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ １２１， １６３－１７６． １０．１０１６／ｊ．ｎｂｄ．２０１８．０９．０２６．
５１． Ｂｅｄｎａｒｅｋ， Ａ．Ｋ．， Ｌａｆｌｉｎ， Ｋ．Ｊ．， Ｄａｎｉｅｌ， Ｒ．Ｌ．， Ｌｉａｏ， Ｑ．， Ｈａｗｋｉｎｓ， Ｋ．Ａ．， ａｎｄ Ａｌｄａｚ， Ｃ．Ｍ． （２０００）． ＷＷＯＸ， ａ ｎｏｖｅｌ ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １６ｑ２３．３－２４．１， ａ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０， ２１４０－２１４５．
５２． Ｒｉｅｄ， Ｋ．， Ｆｉｎｎｉｓ， Ｍ．， Ｈｏｂｓｏｎ， Ｌ．， Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｍ．， Ｄａｙａｎ， Ｓ．， Ｎａｎｃａｒｒｏｗ， Ｊ．Ｋ．， Ｗｏｏｌｌａｔｔ， Ｅ．， Ｋｒｅｍｍｉｄｉｏｔｉｓ， Ｇ．， Ｇａｒｄｎｅｒ， Ａ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｄ．， Ｂａｋｅｒ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｃｏｍｍｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｆｒａｇｉｌｅ ｓｉｔｅ ＦＲＡ１６Ｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＦＯＲ ｇｅｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ＦＲＡ１６Ｄ ａｎｄ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ９， １６５１－１６６３．
５３． Ａｂｄｅｅｎ， Ｓ．Ｋ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１９）． Ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ＷＷＯＸ ａｎｄ ｐ５３ ｉｎ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ １８， １１７７－１１８６． １０．１０８０／１５３８４１０１．２０１９．１６１６９９８．
５４． Ｋｈａｗａｌｅｄ， Ｓ．， Ｎｉｇｉｔａ， Ｇ．， Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ， Ｒ．， Ｏｓｔｅｒ， Ｓ．， Ｓｕｈ， Ｓ．Ｓ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｙ．， Ｋｈａｌａｉｌｅｈ， Ａ．， Ｐｅｎｇ， Ｙ．， Ｃｒｏｃｅ， Ｃ．Ｍ．， Ｇｅｉｇｅｒ， Ｔ．， Ｓｅｅｗａｌｄｔ， Ｖ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＷＷＯＸ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ ５， ４３． １０．１０３８／ｓ４１３９２－０２０－０１３６－８．
５５． Ｋｈａｗａｌｅｄ， Ｓ．， Ｓｕｈ， Ｓ．Ｓ．， Ａｂｄｅｅｎ， Ｓ．Ｋ．， Ｍｏｎｉｎ， Ｊ．， Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ， Ｒ．， Ｎｉｇｉｔａ， Ｇ．， Ｃｒｏｃｅ， Ｃ．Ｍ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１９）． ＷＷＯＸ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７９， １７８４－１７９８． １０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１８－０６１４．
５６． Ｇａｒｄｅｎｓｗａｒｔｚ， Ａ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１４）． ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ’ｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｍｙｒｉａｄ ｃａｎｃｅｒｓ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３９， ２５３－２６３． １０．１１７７／１５３５３７０２１３５１９２１３．
５７． Ｂａｒｙｌａ， Ｉ．， Ｓｔｙｃｚｅｎ－Ｂｉｎｋｏｗｓｋａ， Ｅ．， ａｎｄ Ｂｅｄｎａｒｅｋ， Ａ．Ｋ． （２０１５）． Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＷＷＯＸ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｉｅｗ． Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ （Ｍａｙｗｏｏｄ） ２４０， ３０５－３１４． １０．１１７７／１５３５３７０２１４５６１９５３．
５８． Ａｂｄｅｅｎ， Ｓ．Ｋ．， Ｓａｌａｈ， Ｚ．， Ｋｈａｗａｌｅｄ， Ｓ．， ａｎｄ Ａｑｅｉｌａｎ， Ｒ．Ｉ． （２０１３）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＷＷＯＸ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２２８， １３９１－１３９６． １０．１００２／ｊｃｐ．２４３１０．
５９． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｂ．Ｗ．， Ｇａｏ， Ｘ．， Ｋｉｌ， Ｈ．， Ｌｅｅ， Ｊ．， Ｂｅｎａｖｉｄｅｓ， Ｆ．， Ａｂｂａ， Ｍ．Ｃ．， ａｎｄ Ａｌｄａｚ， Ｃ．Ｍ． （２０１２）． Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｗｗｏｘ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｗｏ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７， ｅ３６６１８． １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３６６１８．
６０． Ｗｏｌｆ， Ｇ．， Ｌｉｆｓｃｈｙｔｚ， Ｔ．， Ｂｅｎ－Ａｒｉ， Ｈ．， Ｔａｔａｒｓｋｙｙ， Ｐ．， Ｍｅｒｚｅｌ， Ｔ．Ｋ．， Ｌｏｔａｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｌｅｒｅｒ， Ｂ． （２０１８）． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｕｎｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｕｎｄｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｈｉ１ ｇｅｎｅ： ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ． Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８， １２４． １０．１０３８／ｓ４１３９８－０１８－０１７１－１．
６１． Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ， Ｌ．， Ｌｉｆｓｃｈｙｔｚ， Ｔ．， Ｚｏｚｕｌｉｎｓｋｙ， Ｐ．， Ｂｒｏｎｅｒ， Ｅ．Ｃ．， Ｓｌｏｎｉｍｓｋｙ， Ａ．， Ｋｏｈｎ， Ｙ．， ａｎｄ Ｌｅｒｅｒ， Ｂ． （２０１２）． Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＲＧＳ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｔｒａｐｙｒａｍｉｄａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ａ ｍｕｔａｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． Ｅｕｒ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ２２， ３７９－３８６． １０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｏｎｅｕｒｏ．２０１１．０９．００６．
実施例３：脳オルガノイドを用いた遺伝性てんかん性脳症のモデル化
序文
てんかんは、再発性発作を発症する慢性的な素因を特徴とする神経障害である（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ａａｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２０１７）。てんかんは、世界中で約５，０００万人が罹患しており、小児において最も頻度の高い慢性神経疾患と考えられている（Ａａｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｂｌｕｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１７）。生後早期の発作のおよそ４０％は、以前は早期乳児てんかん性脳症（ＥＩＥＥ）として知られていた発達性てんかん性脳症（ＤＥＥ）が原因である（Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０２１）。これらは発達中の脳の病理であり、難治性のてんかん様活動と脳機能及び認知機能の障害を特徴としている（Ｌａｄｏ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｓｈａｏ ＆ Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ，２０１６；Ｎａｓｈａｂａｔ ｅｔ ａｌ，２０１９；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０２１）。いくつかの遺伝子がＤＥＥの原因に関連すると考えられている（ＭｃＴａｇｕｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）。近年、ＷＷＯＸ遺伝子の常染色体劣性変異について、ＤＥＥの病因におけるその役割がますます認識されている（Ｐｉａｒｄ ｅｔ ａｌ，２０１８；Ｎａｓｈａｂａｔ ｅｔ ａｌ，２０１９）。染色体の脆弱部位ＦＲＡ１６Ｄにまたがる腫瘍抑制因子であるＷＷＯＸは脳において高度に発現しており、中枢神経系（ＣＮＳ）の恒常性における重要な役割が示唆されている（Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１５）。２０１４年に、ＷＷＯＸは、常染色体劣性脊髄小脳失調症－１２（ＳＣＡＲ１２）（Ｇｒｉｂａａ ｅｔ ａｌ，２００７；Ｍａｌｌａｒｅｔ ｅｔ ａｌ，２０１４）、及びＷＷＯＸ関連てんかん性脳症（ＷＯＲＥＥ症候群、ＤＥＥ２８とも呼ばれる）（Ａｂｄｅｌ－Ｓａｌａｍ ｅｔ ａｌ， ２０１４；Ｂｅｎ－Ｓａｌｅｍ ｅｔ ａｌ，２０１５；Ｍｉｇｎｏｔ ｅｔ ａｌ，２０１５）に関連するとされた。どちらの障害も、発作、知的障害、発達遅延、及び痙縮などの様々な神経学的症状に関連しているが、重症度、発症、及び根底にある突然変異の種類が異なる。ＷＯＲＥＥ症候群は、より攻撃的であると考えられており、生後１．５か月という早い時期に現れ、より極端な遺伝子変化と関連している（Ｂａｎｎｅ ｅｔ ａｌ，２０２１）。この観察結果は、両方の症候群が連続体と見なすことができることを示唆している可能性がある。発作に加えて、ＷＯＲＥＥ症候群の患者は、全体的な発達遅延、進行性小頭症、特定のＣＮＳ成分の萎縮、及び早期死亡を呈する場合がある。しかしながら、ＷＯＲＥＥ症候群の表現型の範囲は広く、患者によって症状が異なることに留意することが重要である。例えば、一部の患者には小頭症が認められるが、他の多くの患者にはこの病態は認められなかい（Ｐｉａｒｄ ｅｔ ａｌ，２０１８）。
げっ歯類のＷＷＯＸ機能喪失のモデル化により、哺乳類の脳におけるＷＷＯＸの役割が明らかになった（Ａｑｅｉｌａｎ ｅｔ ａｌ，２００７，２００８；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｍａｌｌａｒｅｔ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｔａｎｎａ ＆ Ａｑｅｉｌａｎ，２０１８；Ｔｏｃｈｉｇｉ ｅｔ ａｌ，２０１９）ものの、特定の患者の遺伝的バックグラウンドと脳の発達は、マウスにおいてモデル化することはできないが、患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に内在し、保持される。ＷＷＯＸ突然変異を有する患者のものを含む、ＤＥＥ脳試料の利用可能性の包括的な欠如を回避するために、ゲノム編集及び再プログラミング技術を利用して、ＷＯＲＥＥ及びＳＣＡＲ１２症候群の患者に認められる遺伝子変化をヒトＰＳＣにおいて再現した。次いで、脳の空間組織と細胞型の形成の多くを再現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでニューロン機能を有する脳オルガノイド、３Ｄニューロン培養物を生成した（Ａｍｉｎ ＆ Ｐａｓｃａ，２０１８；Ｓｉｄｈａｙｅ ＆ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０２０）。これにより、２Ｄ細胞培養よりもｉｎ ｖｉｖｏでのヒトの生理学をより代表する系において、ＣＮＳとその複雑な回路の発達と成熟の特徴をモデル化することができた。このプラットフォームを使用して、ニューロン細胞集団、皮質形成、及び電気的活動の重大な欠損を特定し、可能なレスキュー戦略を試験した。このアプローチは、ＣＮＳにおけるＷＷＯＸの生理学と病態生理学のより深い理解をもたらし、より適切な治療法を開発するための基礎を築き、他のヒトてんかん疾患のモデリングにヒト脳オルガノイドを使用するという概念を支持する。
結果
ＷＷＯＸノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定
ＤＥＥの病因に光を当てるために、脳オルガノイドを使用したプロトタイプモデルとしてＷＯＲＥＥ症候群を研究した。制御された遺伝的バックグラウンドにおけるヒト脳の発達におけるＷＷＯＸの役割を、ＷｉＢＲ３ ｈＥＳＣ系統のＷＷＯＸノックアウト（ＫＯ）クローンをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して生成することによって調べた（Ａｂｄｅｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）。免疫ブロット分析を使用して、これらの系統におけるＷＷＯＸ発現を評価した。検証を通じて一貫して検出不可能なタンパク質レベルのＷＷＯＸを示した２つのクローン、ＷＷＯＸ－ＫＯ系統１Ｂ（ＷＫＯ－１Ｂ、以降、ＫＯ１）及びＷＫＯ－Ａ２（以降、ＫＯ２）を選択して、研究を継続した。これらのクローンを、それぞれ核型分析と奇形腫アッセイを使用して、遺伝的安定性と多能性について評価した。サンガー配列決定により、エキソン１でのＷＷＯＸの編集を確認した。さらに、ＷＷＯＸの細胞自律機能を確認するために、ＷＷＯＸ ｃＤＮＡをＷＷＯＸ－ＫＯ１ ｈＥＳＣ系統の内在性ＡＡＶＳ遺伝子座に復元し、表現型の可逆性を調べた。ＫＯ１－ＡＡＶ４系統は、検証全体で強力で安定したＷＷＯＸの発現を有するＣＯを生成するために選択され、以降ではＷ－ＡＡＶと呼ぶ。これらの系統は、培養期間全体の形態及び増殖に関して、親細胞系統（ＷｉＢＲ３ ＷＴ）と実質的に区別がつかなかった。
ＷＷＯＸの枯渇が３Ｄコンテキストで脳の発達にどのように影響するかを調査するために、確立されたプロトコルを使用して、ｈＥＳＣを脳オルガノイド（ＣＯ）に分化させた（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＆ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０１４）。すべての遺伝子型由来のＣＯは、すべての段階で同等の肉眼的な形態及び発達を示した。次に、オルガノイドに認められる２つの主要な集団であるニューロン前駆細胞とニューロンのマーカーと共染色することにより、様々な時点での発達中の脳におけるＷＷＯＸの発現パターンを調査した。１０週目には、ＷＷＯＸの発現は、脳の前駆細胞である放射状グリア細胞（ＲＧ）に対応するＳＯＸ２＋細胞からなる心室様帯（ＶＺ）に特異的に局在しており、周囲の細胞には局在していなかった。この調査結果は、マウスの皮質発達の初期段階で限定されたＷＷＯＸ発現を示す以前の研究と一致している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４）。ＶＺ内のＷＷＯＸ発現細胞の同一性を確認するために、脳室放射状グリア細胞（ｖＲＧ）で特異的に発現するクリスタリンαＢ（ＣＲＹＡＢ）について共染色し（Ｐｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１５）、これらの細胞においてＷＷＯＸ発現を確認した（図１１Ｂ）。さらに、ＶＺ構造が失われる２４週目などの後の時点でさえも、ＷＷＯＸの発現は主にＳＯＸ２＋細胞において認められる。重要なことに、ＷＷＯＸ－ＫＯ系統から生成されたＣＯにおいてＷＷＯＸ発現は認められなかったが、他のマーカー、例えば、ＳＯＸ２及びニューロン特異的クラスＩＩＩβ－チューブリン（ＴＵＢＢ３またはＴＵＪ１）の、同様のレベルの発現が観察された（図１１Ｂ）。興味深いことに、ＷＷＯＸ発現がヒトユビキチンプロモーター（ＵＢＰ）によって駆動されるＷ－ＡＡＶ ＣＯは、予想どおり、ＶＺにおいて高いＷＷＯＸレベルを示したが、他の細胞集団も顕著なＷＷＯＸ発現を示した。
次に、一部の患者で観察された小頭症の表現型に対処するために、培養期間を通じてオルガノイドの直径を測定したが、有意差は示されなかった。この結果、組織学的脳構造の発達を調べることとなった。ＷＴオルガノイドでは、ＳＯＸ２＋細胞からなるＶＺは、中間前駆細胞（ＩＰ；ＴＢＲ２＋細胞、ＥＯＥＭＳとも呼ばれる）に囲まれており、これは脳室下帯（ＳＶＺ）の存在を示している。この層の外側は皮質板（ＣＰ）であり、主にニューロン（ＮｅｕＮ＋細胞）からなる。１０週目のＣＯでは、ＶＺ及び周囲構造の組成または形成において、目に見える差異は観察されず（図１１Ｃ）、これらの集団が同様の割合であることが示唆された。これは、前駆細胞マーカー（ＳＯＸ２及びＰＡＸ６）ならびにニューロンマーカーＴＵＢＢ３のＲＮＡ発現レベルを測定することによっても裏付けられた（図１１Ｃ）。この驚くべき観察により、ＣＯに認められる２つの主要なニューロン部分集団であるグルタミン酸作動性ニューロン（小胞グルタミン酸トランスポーター１、ＶＧＬＵＴ１によって示される）及びＧＡＢＡ作動性ニューロン（グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７、ＧＡＤ６７によって示される）をさらに調べることとなった。免疫染色により、ＷＴと比較してＫＯ ＣＯにおいて、ＶＧＬＵＴ１の発現は同様のままであったが、ＧＡＤ６７の発現は顕著な増加が観察されたことが明らかになった。対照的に、ＷＷＯＸ修復（Ｗ－ＡＡＶ）は、この不均衡を有意に逆転させた（図１１Ｄ）。ＳＬＣ１７Ａ６（ＶＧＬＵＴ２）、ＳＬＣ１７Ａ７（ＶＧＬＵＴ１）、ＧＡＤ１（ＧＡＤ６７）及びＧＡＤ２（ＧＡＤ６５）のＲＮＡレベルは同じ傾向を示した。
これらの調査結果は、ヒト胚発生中、ＷＷＯＸ発現はＶＺの頂端層の細胞に限定され、ＷＷＯＸの枯渇はＶＺ－ＳＶＺ－ＣＰ構造に影響を与えなかったが、グルタミン酸作動性ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンの間のバランスを乱したことを示唆している。
ＷＷＯＸが枯渇した脳オルガノイドは、過興奮性及びてんかん様活動を示した
脳オルガノイドは、電気生理学的機能が以前に示されたニューロンを生み出す（Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ，２０１９）。ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯの機能特性を特徴決定するために、７週目のＣＯ切片で局所集合電位（ＬＦＰ）記録を実施した。電極を、切片の端から１５０μｍ離して配置し（データは示さず）、切片の調製によって損傷を受ける可能性のある領域を避けた。ＷＴ及びＫＯ ＣＯのサンプルトレースは、ベースライン条件下での２つの系統間の目に見える差異を明らかにした（図１２Ａ、左）。電場記録の平均スペクトルパワーは、通常、徐波振動（ＳＷＯ、＜１Ｈｚ）とラベル付けされる０．２５～１ＨｚでのＫＯ ＣＯのパワーの全体的な増加（図１２Ｂ）、及び３０～７９．９Ｈｚの高周波範囲での減少を示した。振動パワー（ＯＰ）を曲線下面積によって定量化し、これはベースライン条件下でＷＴ系統よりも有意に高かった（図１２Ｃ）。時間が経つにつれて、ＫＯ系統のＯＰは有意に減少したが、ＷＴ系統のＯＰは同じままであり、ＫＯ系統の発達の遅れが示唆された。
ＫＯ系統の過興奮性をさらに測定するために、発作誘発に一般的に使用される痙攣薬である１００μＭ ４－ＡＰを記録中に切片に塗布した。４－ＡＰがＷＴ系統とＫＯ系統の両方のＬＦＰ記録において変化を示した（図１２Ａ、右）一方で、ＫＯ系統は有意に増加した活性を示したが、これはＷＴトレースでは認められなかった。スペクトルパワーに対する４－ＡＰの効果は、その添加の５分後に明らかになった。４－ＡＰの存在下でのＷＴ及びＫＯ系統の両方についてのサンプルトレースの交差周波数カップリングにより、δ：ＨＦＯ周波数ペア（発作の準安定状態を特徴付けて分類するために以前に使用された属性（Ｇｕｉｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ，２０１３））の増加が明らかとなった。重要なことに、ＷＷＯＸ ｃＤＮＡを含むレンチウイルスの形質導入は、平均パワースペクトル密度に関して、ＫＯ系統の回復をもたらした（図１２Ｄ及びＥ）。
ＷＷＯＸが枯渇した脳オルガノイドは、アストロジェネシス及びＤＮＡ損傷応答の障害を示した
脳内の興奮性活動と抑制性活動の間の不均衡が発作の主要なメカニズムであることは広く受け入れられているが、これは必ずしもニューロンが、関与する唯一の集団であることを意味するわけではない。てんかん患者の脳試料が炎症、星状細胞の活性化、及びグリオーシスの徴候を示すことはよく知られており（Ｃｏｈｅｎ－Ｇａｄｏｌ ｅｔ ａｌ，２００４；Ｔｈｏｍ，２００９）、いくつかの場合ではこれが唯一の組織病理学的所見であり得る（Ｂｌｕｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１７）。この現象が急性発作の結果なのか、発作の原因なのかはまだ議論の余地がある（Ｖｅｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１１；Ｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１５；Ｒｏｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１９）。さらに、最近の研究では、Ｗｗｏｘ ｎｕｌｌマウスの脳にアストログリオーシスが存在することが示された（Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１９）。
これに対処するために、免疫蛍光染色を使用して、１５週目と２４週目のＣＯで星状細胞マーカーのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）とＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ（Ｓ１００β）を可視化した（図１３Ａ～Ｃ）。これにより、ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯにおける星状細胞の著しい増加が時間の経過と共に進行することが明らかになり、これはＷ－ＡＡＶ ＣＯでは部分的に逆転した。これは、２０週目のＣＯの免疫ブロット分析によってさらに裏付けられた。ＧＦＡＰがＲＧも示すことは注目に値し（Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ，２０１０）、ＲＧは１５週目には豊富であるが、２４週目には数が減少し、初期段階でのノイズの原因となり得る。
星状細胞は、脳内の２つの異なる細胞集団：神経発生からアストロジェネシスにスイッチするＲＧ細胞、または星状細胞前駆細胞（ＡＰＣ）から発生する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６；Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ，２０１８）。星状細胞マーカーのこれらの差異を追跡するために、６週齢及び１０週齢のＣＯを比較した。ＷＴオルガノイドで星状細胞マーカーが検出されなかった６週目のＣＯでは、ＶＺでＳ１００βの有意な発現が観察されたことが判明した（図１３Ｄ）。１０週目に、ＷＴオルガノイドとＫＯオルガノイドの両方でＳ１００βの発現が観察されたが、細胞増殖マーカーＫｉ６７で共染色を行った場合、同様のグリア増殖を示唆する二重陽性細胞に有意差は検出されなかった。Ｋｉ６７＋核をＳＯＸ２＋核と共に定量化したところ、ＳＯＸ２の割合はＷＷＯＸ－ＫＯと比較してＷＴにおいてインタクトなままであったが（ＷＴでは１８．５％、９５％ＣＩ＝１４．２～２２．８１；ＫＯでは１９．５％、９５％ＣＩ＝１５．２９～２２．８１）、増殖細胞（ＷＴでは９．５％、９５％ＣＩ＝６．６３～１２．３５；ＫＯでは４．９％、９５％ＣＩ＝２．７６～７．１３）及びＫｉ６７＋／ＳＯＸ２＋二重陽性細胞（ＷＴでは５１．８３％、９５％ＣＩ＝４１．１８～６２．４８；ＫＯでは２７．０９％、９５％ＣＩ＝１４．１～４０．１）の割合は減少していた。これらの調査結果は、ＷＷＯＸの損失時にＳＯＸ２＋細胞の全体的な増殖は減少するものの、ＶＺの外側のＲＧの総量は影響を受けないことを意味しており、星状細胞の供給源に関して疑問が生じる。
ＫＯ ＣＯにおけるｖＲＧのこの特異な挙動により、ＷＷＯＸが直接関与することが知られているシグナル伝達経路である生理的ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を調べることで、その機能を詳しく調べることができた（Ａｂｕ－Ｏｄｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１４ｂ；Ａｂｕ－ｏｄｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１６）。この目的のために、ＤＮＡ二本鎖切断の代理マーカーであるγＨ２ＡＸと５３ＢＰ１について染色を行った。ＶＺの最内層においてＳＯＸ２＋細胞の核内にγＨ２ＡＸと５３ＢＰ１病巣の顕著な蓄積が認められ、それぞれ、ＷＷＯＸ－ＫＯにおいて平均１．５病巣／核［９５％ＣＩ＝１．３３～１．７４］及び１．２病巣／核［９５％ＣＩ＝１～１．３８］であった。これは、同齢のＷＴ ＣＯにおける０．７８ γＨ２ＡＸ病巣／核［９５％ＣＩ＝０．５５～１．０２］及び０．６２ ５３ＢＰ１病巣／核、ならびに同齢のＷ－ＡＡＶ ＣＯにおける０．５８病巣／核［９５％ＣＩ＝０．３８～０．７７］及び０．５６病巣／核［９５％ＣＩ＝０．３７～０．７６］（図１３Ｅ及びＦ）と比較される。これらの調査結果は、ＤＤＲシグナル伝達におけるＷＷＯＸの直接的な役割と一致している（Ａｑｅｉｌａｎ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｈａｚａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６）。重要なことに、Ｗ－ＡＡＶ ＣＯはＤＤＲの向上を示した。興味深いことに、ＶＺにおいて高度に増殖している細胞では、より多数のγＨ２ＡＸ病巣が認められ、これはＫｉ６７との共染色によって観察され、ＳＯＸ２＋細胞の１８．６％がＫＯ ＣＯにおいて二重陽性であった（１１．９％［９５％ＣＩ＝８～１５％］と比較して［９５％ＣＩ＝１５～２２％］）。これにより、損傷した細胞の継続的な増殖にはアポトーシスの減少が伴う可能性があり、これはチェックポイント阻害の喪失を示している可能性があると推測された。この仮説は、ＶＺにおいて切り離されたカスパーゼ－３を染色することにより解決され、それによると、ＷＷＯＸ－ＫＯ時にこれらの細胞のアポトーシスが減少することが明らかになったが、これはＷ－ＡＡＶ ＣＯではレスキューされた。
結論として、ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯでは、おそらくＲＧの分化の増強、及び神経前駆細胞におけるＤＮＡ損傷の増加により、星状細胞の数が漸増する。
ＷＷＯＸ枯渇脳オルガノイドのＲＮＡ配列決定により、主要な分化欠損が明らかになった
分子特性を調べるために、１５週目のＷＴ及びＫＯ ＣＯで全トランスクリプトームＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を実施した。脳オルガノイドの既知の不均一性にもかかわらず、主成分分析（ＰＣＡ）は、サンプルを２つの異なるクラスターに分離した。この分析により、１５，３７０個の示差的に発現する遺伝子が明らかになり、そのうち１，２４６個の遺伝子がＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯにおいて上方制御されており、１．２超の倍率変化（ＦＣ＞１．２）と有意なＰ値（Ｐ＜０．０１）を示し、また、１，０２１個の遺伝子が下方制御されていた（ＦＣ＜１／１．２，Ｐ＜０．０１）。上方制御された上位１００の遺伝子の中で、ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＤ１、ＧＲＭ７、ＬＨＸ５）及び星状細胞（ＡＧＴ、Ｓ１００Ａ１、ＧＪＡ１、ＯＴＸ２）などの神経集団、ならびにカルシウムシグナル伝達（ＨＲＣ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＥＲＢＢ３、Ｐ２ＲＸ３、ＨＴＲ２Ｃ、ＰＤＧＦＲＡ）及び軸索ガイダンス（ＧＡＴＡ３、ＤＲＧＸ、ＡＴＯＨ１、ＮＴＮ１、ＳＨＨ、ＲＥＬＮ、ＯＴＸ２、ＳＬＩＴ３、ＧＢＸ２、ＬＨＸ５）などのニューロンプロセスに関連する遺伝子を見出した。下方制御された上位１００の遺伝子では、ＧＡＢＡ受容体（ＧＡＢＲＢ３、ＧＡＢＲＢ２）、オートファジー（ＩＦＩ１６、ＭＤＭ２、ＲＢ１、ＰＬＡＴ、ＲＢ１ＣＣ１）、及びｍＴＯＲ経路（ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＢ１ＣＣ１）に関連する遺伝子があった。
上位３，０００の示差的に発現する遺伝子の遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）及び遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析により、とりわけ、ＡＴＰ合成共役電子伝達及び酸化的リン酸化に関連するプロセスの阻害が明らかになったが、これらはすべて、マウスモデルにおいて以前に報告されたＷＷＯＸの機能と一致している（Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ ＆ Ａｑｅｉｌａｎ，２０１４，２０１５；Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１８）。以前に報告されたチェックポイント阻害の減少と一致する、細胞周期の負の調節に関連する遺伝子の下方制御が認められた（Ａｂｕ－Ｏｄｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１４ｂ；Ａｂｕ－ｏｄｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１６）。一方、領域形成、ニューロン運命決定及び運命特定、軸の特定（腹側－背側及び前側－後側）、ならびに解糖及び糖新生に関連する経路において顕著な濃縮が認められ、それらのいくつかは過去の研究でも支持されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２０１２；Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ ＆ Ａｑｅｉｌａｎ，２０１４）。予想されるように、上方制御された遺伝子は、Ｗｎｔ経路（例えば、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＬＥＦ１、ＡＸＩＮ２、ＧＢＸ２、ＲＯＲ２、ＬＲＰ４、ＮＫＤ１、ＩＲＸ３、ＣＤＨ１）及びＳｈｈ経路（例えば、ＳＨＨ、ＧＬＩ１、ＬＲＰ２、ＰＴＣＨ１、ＨＨＩＰ、ＰＡＸ１、ＰＡＸ２）などの発生経路に関連していた。
ＷＷＯＸは、以前にＷｎｔシグナル伝達経路に関与するとされていたため（Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ａｂｕ－Ｏｄｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１４ａ；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，２０２０；Ｋｈａｗａｌｅｄ ｅｔ ａｌ，２０２０）、これを本発明者らのＣＯモデルでさらに調査することにした。まず、ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、ＷＮＴシグナル伝達経路（ＷＮＴ１、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ８Ｂなど）、標準的な標的（Ａｘｉｎ２、ＴＣＦ７Ｌ２、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１など）、脳特異的標的（ＩＲＸ３、ＩＴＧＡ９、ＧＡＴＡ２、ＦＲＡＳ１、ＳＰ５）、及び受容体（ＲＯＲ２、ＦＺＤ２、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ１）の様々なメンバーの発現を調べた。次に、ｑＰＣＲを使用してこれらの遺伝子のいくつかを検証した（図１４Ａ）。また、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ１、及びＲＯＲ２を含む、Ｗ－ＡＡＶ ＣＯにおけるＷｎｔ関連遺伝子のいくつかの下方制御も観察された（図１４Ａ）。さらに、Ｗｎｔ活性化を証明するために、標準的なＷｎｔ経路の特徴であるβ－カテニンの核への移行を示した。この目的のために、１６週目のＣＯを細胞質画分と核画分に細分し、免疫ブロッティングした（図１４Ｂ）。ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯの核内のβ－カテニンの正規化された強度において、およそ１．７倍の増加が認められ、これはＷＷＯＸの喪失後のＷｎｔ経路活性化の概念を支持するものであった。これは、６～２４週目にいくつかのＷｎｔ関連遺伝子（ＷＮＴ３、ＡＸＩＮ２、ＬＥＦ１、及びＴＣＦ７）の動的発現を調べることによっても裏付けられ、ＷＴ ＣＯの漸減と比較して、ＫＯ ＣＯの慢性的なＷｎｔ活性化が明らかになった。
最近のエビデンスでは、発達中の前脳オルガノイドにおけるＷｎｔの活性化により、ニューロンの特定及び皮質層形成の乱れが生じることが示されている（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０２０）。これがＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯで発生するかどうかを調べるために、ＲＮＡ－ｓｅｑデータで皮質層マーカーの発現レベルを調べた（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６）。興味深いことに、６層すべてで変化が観察され、第Ｉ～ＩＶ層（ＴＢＲ１、ＢＣＬ１１Ｂ、ＳＡＴＢ２、ＰＯＵ３Ｆ２で示される）では発現の減少が示され、表層Ｖ～ＶＩ（ＣＵＸ１及びＲＥＬＮで示される）では顕著な増加が示された。このパターンは、ｑＰＣＲによっても確認された。興味深いことに、免疫蛍光染色を使用してタンパク質レベルを調べたところ、ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯにおいて、障害性の発現パターン及び階層化、ならびにＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋（ＢＣＬ１１Ｂ）、及びＳＡＴＢ２＋ニューロンの混合も観察された（図１７Ｄ及びＥ）。この欠損は進行性で、２４週目に悪化した。驚くべきことに、異所性ＷＷＯＸ発現の影響を調べると、あまり明確でない表現型が観察された。ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯと比較してＷ－ＡＡＶ ＣＯではＣＴＩＰ２＋細胞及びＳＡＴＢ２＋細胞の数が回復し、階層化が改善されたが、ＲＮＡレベルは部分的にしか改善されなかった。対照的に、ＷＷＯＸ－ＫＯにおいて上方制御された表層マーカーＣＵＸ１及びＲＥＬＮの発現は、上層マーカーＰＯＵ３Ｆ２（ＢＲＮ２）と共にＷ－ＡＡＶにおいて減少していた。重要なことに、ＣＯの背側及び腹側遺伝子の発現を調べると、高いＲＮＡ読み取り数によって評価されるように、オルガノイドが背側の同一性であることが観察された。注目すべきことに、これらのマーカーの発現において、ＷＴとＫＯの間に統計的に有意な差は観察されなかった。
全体として、ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＷＷＯＸ－ＫＯ ＣＯにおける空間パターン形成、軸形成、及び皮質層形成の障害を明らかにしたが、これは、細胞経路の混乱及びＷｎｔシグナル伝達の活性化と相関している。ＷＷＯＸの再導入は、これらの変化をある程度防ぎ、遺伝子治療におけるその可能な意義がさらに支持される。
患者由来のＷＷＯＸ関連の発達性及びてんかん性脳症の脳オルガノイド
ＣＲＩＳＰＲで編集された細胞を使用した疾患モデリングは広く使用されているツールであるが、ヒトの患者の完全な遺伝的バックグラウンドをモデル化していないという批判がある。したがって、重症度が異なるＷＷＯＸ関連疾患を有する２つの家族から提供された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を再プログラムした。第１の家族は、ホモ接合患者にＷＯＲＥＥ症候群（ＤＥＥ２８）表現型をもたらすｃ．５１７－２Ａ＞Ｇスプライス部位変異（Ｗｅｉｓｚ－Ｈｕｂｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ，２０１９）を保有し（ＷＳＭファミリーと呼ばれる）、第２の家族は、ホモ接合患者にＳＣＡＲ１２表現型をもたらすｃ．１１１４Ｇ＞Ｃ（Ｇ３７２Ｒ）変異（Ｍａｌｌａｒｅｔ ｅｔ ａｌ，２０１４）を保有する（ＷＰＭファミリーと呼ばれる）。すべてのｉＰＳＣ系統は、プライミングされたｈＰＳＣと自己再生能力の正常な形態を示し、これらを多能性マーカーの発現について評価した。
次いで、ＷＳＭファミリーの健康なヘテロ接合体の親（父親はＷＳＭ Ｆ１と呼ばれ、母親はＷＳＭ Ｍ２と呼ばれ、まとめてＷＳＭ Ｐと呼ばれる）及び疾患を有するホモ接合体の息子（系統ＷＳＭ Ｓ２及びＳ５、まとめてＷＳＭ Ｓと呼ばれる）から単離したｉＰＳＣからＣＯを生成した。さらに、Ｗ－ＡＡＶ ＣＯについて記載したレスキューアプローチを採用し、ＷＳＭ Ｓ５系統にＷＷＯＸを再導入した（ＷＳＭ Ｓ５ Ｗ－ＡＡＶ３及びＷ－ＡＡＶ６と呼ばれ、まとめてＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶと呼ばれる）。次いで、これらのオルガノイドをニューロン分化及びＶＺ形成について検証した（図１５Ａ）。ｈＥＳＣ由来のＣＯと同様に、ＷＷＯＸは、主にＷＳＭ Ｆ１及びＷＳＭ Ｍ２のＶＺで発現していた。β３チューブリン＋陽性細胞とＳＯＸ２＋陽性細胞の数は同程度であり、ＷＳＭ Ｓ ＣＯは検出可能なレベルの ＷＷＯＸを示さず、ＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶ ＣＯは全体的にＷＷＯＸを発現していた。
次に、ＷＳＭ Ｓ ＣＯのニューロン過興奮性を評価するために、４１個のＷＳＭ Ｓ ＣＯのニューロン、ならびにＷＳＭ Ｐ ＣＯ由来の２４個のニューロン及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶオルガノイド由来の４０個のニューロンの細胞接着記録を実施した。ＷＳＭ Ｓ、ＷＳＭ Ｐ、及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶ ＣＯ由来の活動電位の自然発火でサンプルをトレースすると、同じ条件下で記録された３群間の目に見える差異が明らかになった。ＷＳＭ Ｓ ＣＯは、ＷＳＭ Ｐ及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶオルガノイドと比較して、活動電位のバースト及び全体的なニューロン活動の上昇を示した（図１５Ｂ）。ＷＳＭ Ｓ ＣＯのニューロンを、ＷＳＭ Ｐ（Ｐ＜０．０００１）及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶ（Ｐ＜０．０００１）ＣＯのニューロンと比較した（図１５Ｃ）。ＷＳＭ ＰとＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶ ＣＯのニューロンの発火率に有意差はなかった（Ｐ＝０．７６８１）。重要なことに、ＷＳＭ Ｆ１系統のＣＯをＷＳＭ Ｍ２系統と比較しても、有意差は観察されなかった（Ｐ＝０．０９５２）。全体として、これらの結果は、両親と比較して、ＷＯＲＥＥ症候群の患者に由来する７週齢のオルガノイドにおけるニューロン過興奮性を示している。
他の調査結果と一致して、第１０週のＷＳＭ Ｓ ＣＯは、ＷＳＭ Ｆ１及びＷＳＭ Ｍ２と比較してＧＡＤ６７の発現増加を示し、この表現型はＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶ ＣＯにおいては逆転した（図１５Ｄ及びＥ）ＶＧＬＵＴ１の発現は、異なる系統間で変化しなかった。次に、星状細胞マーカーの発現を評価し、同齢の対照と比較してＷＳＭ ＳにおいてＧＦＡＰ及びＳ１００βの発現が増加していることを見出した（図１６Ａ）。ＷＳＭ Ｓ ＣＯのｖＲＧにおけるＤＤＲ欠損も明らかであった（図１６Ｂ及びＣ）。Ｗｎｔ経路の状態もｑＰＣＲを用いて評価し、同齢のＷＳＭ Ｐ及びＷＳＭ Ｓ Ｗ－ＡＡＶと比較して、１０週目のＷＳＭ Ｓ ＣＯにおける活性化を示唆する所見が得られた（図１６Ｄ）。最後に、免疫蛍光を使用して皮質の層状化を評価し、ＷＳＭ Ｓ ＣＯにおいて皮質マーカーＣＴＩＰ２＋及びＳＡＴＢ２＋の発現の減少を見出した（図１６Ｅ及びＦ）。
表現型の大部分がＣＯの皮質領域で観察されたため、皮質におけるＷＷＯＸの実証された役割を考慮して、皮質固有のプロトコルを採用し、前脳オルガノイド（ＦＯ）を生成することにした（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，２０１８）。まず、再現性を検証するために、ＷＳＭ Ｆ１とＷＳＭ Ｓ５からＦＯを生成し、ＷＳＭ ＣＯの同等の表現型を見出した。
次に、患者の表現型がより軽度であるＷＰＭ ＳＣＡＲ１２ファミリーが、ＷＯＲＥＥ症候群のＣＯ及びＦＯと同様の表現型を示すかどうかを調査しようとした。健康なヘテロ接合体の父と母（ＷＰＭ Ｆ２及びＷＰＭ Ｍ３）と、その影響を受けたホモ接合体の娘と息子（ＷＰＭ Ｄ１及びＷＰＭ Ｓ１）からＦＯを生成した。予想どおり、ＦＯは、形態、成長、ならびにβ３チューブリン及びＳＯＸ２の発現の点で区別がつかなかったが、ＷＰＭ Ｆ２とＷＰＭ Ｍ３のＶＺではＷＷＯＸが検出された一方で、ＷＰＭ Ｄ１及びＳ１ではほとんどシグナルが観察されず、これはｉＰＳＣのＷＷＯＸレベルと一致していた。背側前脳の同一性を、ＰＡＸ６の染色によって検証した。驚くべきことに、ニューロンマーカーの転写産物発現レベルでは、グルタミン酸作動性ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンの比率において明らかな差異が示されなかった。同様の遺伝子型を有する系統由来のＦＯ間でいくつかの差異が認められたが、健康なｉＰＳＣ系統（ＷＰＭ Ｆ２及びＷＰＭ Ｍ３）と疾患を有する系統（ＷＰＭ Ｄ１及びＷＰＭ Ｓ１）の間で皮質層のマーカー発現が同等レベルであったことにより、正常なニューロン及び皮質の発達の概念が裏付けられた。興味深いことに、Ｗｎｔ遺伝子のＲＮＡレベルは、Ｗｎｔ経路の活性化を示唆するパターンを示し、より軽度の疾患の病因におけるその役割に関する疑問が生じた。さらに、星状細胞レベルについての免疫染色及びｑＰＣＲ分析では、有意差は明らかにならなかった。最後に、ＦＯのＶＺでのＤＤＲシグナル伝達を分析したところ、健康なＳＣＡＲ１２個体と疾患のＳＣＡＲ１２個体の間でＤＮＡ損傷病巣の蓄積に大きな差異は認められなかった。全体として、これらのデータは、ＳＣＡＲ１２とＷＯＲＥＥ症候群由来のオルガノイドの間で発達結果が異なることを示唆している。
考察
ＤＥＥは、根底にある分子病理が不明な重度の神経学的症候群の群である（Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０２１）。ヒト試料へのアクセスの欠如と合わせて、現在の医療が不足していることは驚くべきことではない。本発明者らの研究は、重度のＷＯＲＥＥ症候群におけるＷＷＯＸの役割と共に、発生生物学における主要な技術的進歩を利用して、組織に関連した状況でヒトの難治性ＤＥＥをモデル化することに着手した。遺伝子操作と再プログラミングを電気生理学と共に利用することにより、ＷＷＯＸをＣＲＩＳＰＲで編集した脳オルガノイドと患者由来の脳オルガノイドの両方で過興奮性が観察され、てんかん様活動がうまく示された。次いで、疾患の病態生理学の考え得るメカニズムを強調する細胞及び分子の変化をさらに調べた。まず、ニューロン集団は量的にはほとんどインタクトであったが、ＧＡＢＡ作動性マーカーが著しく増加していることに気付いた。ＲＮＡ－ｓｅｑで認められるＧＡＢＡ受容体成分の減少を考慮すると、この発見はさらに驚くべきものである。これは、これらのオルガノイドで観察される電気的活動の増加を裏付ける、正常でバランスの取れたニューロンネットワークの発達の乱れを示している可能性がある。発達中にＧＡＢＡ作動性シナプスが脱分極効果を有することがいくつかのエビデンスから示唆されていることに留意すべきである（Ｏｂａｔａ ｅｔ ａｌ，１９７８；Ｂｅｎ－Ａｒｉ ｅｔ ａｌ，２００７；Ｍｕｒａｔａ ＆ Ｃｏｌｏｎｎｅｓｅ，２０２０）。発達性てんかんにおける発作のダイナミクスは、ＧＡＢＡＡ受容体の活性化による過分極ではなく、特に、脱分極塩化物反転電位をもたらす細胞内塩化物の蓄積によるＧＡＢＡ応答の脱分極に依存することが知られている（Ｋｈａｌｉｌｏｖ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｂｅｎ－Ａｒｉ ｅｔ ａｌ，２００７）。ＷＷＯＸ枯渇ＣＯ及びＷＳＭ ＦＯにおける平均スペクトルパワーの増加、及びＷＷＯＸを含むレンチウイルスの存在下でのその回復のエビデンスは、脱分極ＧＡＢＡが発作感受性において重要な役割を果たすという考えをさらに強化する。これらの調査結果は、未成熟ニューロンに対する一般的な抗けいれん療法の効力の欠如に新たな光を当て（Ｋｈａｌｉｌｏｖ ｅｔ ａｌ，２００５；Ｍｕｒａｔａ ＆ Ｃｏｌｏｎｎｅｓｅ，２０２０）、ＷＷＯＸ枯渇ＣＯは、興奮性ＧＡＢＡ作動性応答を標的とする新規治療法を試験し、研究するための有用なモデルとなる。ＳＷＯの増加は、発作サイクルの様々な段階（発症、発作中、及び終結）に以前から関連していた（Ｂｒａｇｉｎ ＆ Ｅｎｇｅｌ，２００８）。以前の研究では、ＳＷＯが皮質の興奮性を調節し（Ｖａｎｈａｔａｌｏ ｅｔ ａｌ，２００４）、発作前の期間に発作開始ゾーンを局在化することができることも示されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２００７）。さらに、満期産児及び早産児の脳波発作活動の特徴として徐波が特定されている（Ｐａｔｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ，２００３）。発作発生時のＳＷＯのメカニズムはよくわかっていない。しかしながら、いくつかの仮説により、細胞外カリウムの増加、ｐＨ、グリア細胞の機能不全、及び／または血液脳関門機能の変化が示唆されている（Ｂｒａｇｉｎ ＆ Ｅｎｇｅｌ，２００８）。そのメカニズムを調査することは本紙の範囲を超えるものであるが、これらを将来調査することは興味深い方向性である。
他方、図１２Ａ～Ｃは、より高い周波数の活動、すなわち、ベータ（１２～３０Ｈｚ）及びガンマ（＞３０Ｈｚ）振動の減少を示している。より高い周波数の活動、特にガンマ振動は、特定の病巣域で発作が始まる前に増加することが知られており、てんかん発生の決定因子の可能性として研究されてきた（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ ｅｔ ａｌ，２０１１）が、本発明者らのデータはＷＷＯＸ関連の発作についてこれを支持しない。これについて考えられる説明の１つは、７週齢のＣＯの成熟度である。ガンマ振動は機能的結合に関連しており、脳構造内及び脳構造全体でニューラルネットワークを統合する（Ｋｈｅｉｒｉ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ａｈｎａｏｕ ｅｔ ａｌ，２０１７）。これらの高周波数範囲での低出力は、ＷＷＯＸ－ＫＯオルガノイドの発達の遅れと機能的結合の低下が原因である可能性がある。１２週目のＷＳＭ ＦＯにおける興味深い観察結果は、ＷＳＭ Ｓ５ ＦＯの活動が高周波数範囲で増強されたことである。この対比性は、年齢、発達プロトコル、または検出されたてんかん様活動の根底にあるメカニズムが原因である可能性がある。これら、特に根底にあるメカニズムを、詳細な単一細胞分析を使用し、標的化されたチャネル遮断薬と薬物を使用してさらに調査する必要がある。
次に、脳オルガノイドに認められる他の集団を詳細に調べたところ、星状細胞マーカーの増加が認められたが、高レベルのＷＷＯＸを発現するＲＧ集団は正常な比率を維持しているように思われた。このパターンは早い段階で検出され、ＡＰＣではなくｖＲＧに由来するようであった。考えられる説明は、ＷＷＯＸが枯渇したオルガノイドで観察される障害性のＤＤＲシグナル伝達である。ＥＳＣ由来及び初代マウス神経幹細胞（ＮＳＣ）の両方における以前の研究では、核内またはミトコンドリアＤＮＡ内のＤＮＡ損傷病巣の蓄積が、ＮＳＣを星状細胞への分化に移行させることがわかった（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１３）。ＣＮＳにおいて、生理的ＤＮＡ切断は、複製ストレス（主に前駆細胞の分裂における）、活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積の結果としての酸化及び代謝ストレス、さらにはニューロン活動（発達過程及び学習の一部として）によって形成され得る（Ｓｕｂｅｒｂｉｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１５）。これらの切断の修復障害は、ＣＮＳの病理学及び神経変性の発生と関連している（Ｓｕｂｅｒｂｉｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｓｈａｎｂｈａｇ ｅｔ ａｌ，２０１９）。この調査結果は、ｖＲＧにおけるＷＷＯＸの恒常的な役割を示唆しており、ＷＷＯＸは生理学的条件で適切なＤＤＲシグナル伝達を維持し、分化障害に関連するＤＮＡ損傷の蓄積を予防する。ＤＤＲ分析ではｖＲＧに焦点を当てることを選択したが、それらはＷＷＯＸを高度に発現するため、データはこれらの切断がｖＲＧにおいて特に蓄積し、子孫に持続する可能性があることを示唆していないことに留意することは重要である。
機能的なシナプスと複雑なニューラルネットワークのダイナミクスを開発する脳オルガノイドの能力は、集中的な研究を通じて急速に確立されている（Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ，２０１９；Ｓｉｄｈａｙｅ ＆ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０２０）が、てんかん様活動をモデル化する能力は、最近研究されたばかりである（前刷り：Ｓａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１９；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１９）。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ（２０１９）は、脳オルガノイドを利用して、ＵＢＥ３Ａ－ＫＯ ｈＥＳＣを使用してエンジェルマン症候群をモデル化し、２Ｄ及びマウスモデルで観察された過活動ニューロン発火、異常なネットワーク同期、及び根底にあるチャネル障害を再現した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１９）。Ｓａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ（２０１９）は、オルガノイド融合法を利用して、レット症候群患者のｉＰＳＣから抑制性介在ニューロンが豊富なオルガノイドを生成した。疾患を有するオルガノイドでは、過興奮性に対する感受性、マイクロ回路クラスターの減少、反復するてんかん様スパイク、及び周波数振動の変化が観察されたが、これらは、機能不全の抑制性ニューロンにまで遡る（前刷り：Ｓａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１９）。さらに、このモデルを使用して、変異オルガノイドをバルプロ酸（ＶＰＡ）またはＴＰ５３阻害剤であるピフィスリン－α（ＰＦＴ）で処置することにより、治療オプションを試験したところ、ビヒクルでの処置と比較してニューロン活動の改善が示され、ＶＰＡよりもＰＦＴを使用した方が良好な結果が得られた。これらの研究は先駆的ではあるが、疾患モデリングオルガノイドに認められる電気生理学的変化に焦点を当てた。機械的研究を指示するための、てんかん患者において肉眼的な神経組織学的変化がないことを考慮して（Ｂｌｕｍｃｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１７）、本発明者らの研究では、てんかんの分子研究のための脳オルガノイドの利用を強化しようとした。この目標は、バルクＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって強調され、領域同一性獲得の欠損、皮質層の混乱、及びＷｎｔシグナル伝達の活性化を示している。後者は、発作誘発性の脳への影響の調節因子としてのＷｎｔシグナル伝達経路の意図された役割に照らして特に興味深いものであり、したがって治療の標的となり得る（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６；Ｑｕ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｈｏｄｇｅｓ ＆ Ｌｕｇｏ，２０１８）。前述の皮質形成不全は皮質異形成を連想させ、これは薬剤耐性てんかんの病因においてよく知られている役割を有している（Ｔａｓｓｉ ｅｔ ａｌ，２００２；Ｆａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｋｏｂｏｗ ｅｔ ａｌ，２０１９）。
この調査結果と一致して、ＷＯＲＥＥ症候群に罹患している胎児の脳組織を調べた最近の研究では、皮質の分子層内の外部顆粒層の異常な移動が報告されたが、これは、ＷＷＯＸ自然突然変異ラットモデルでも検証された表現型である（Ｉａｃｏｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ，２０２０）。この観察結果は、ｓｈＲＮＡを使用してＷＷＯＸをサイレンシングした後、ヒトニューロン前駆細胞（ｈＮＰＣ）に対して行ったＫｏｓｌａ ｅｔ ａｌ（２０１９）によるトランスクリプトーム解析によってさらに裏付けられている。この研究では、ＷＷＯＸをノックダウンすると、ＷＴ ｈＮＰＣに存在する神経堤の分化と移動、及び細胞間接着に関連する遺伝子の濃縮がｈＮＰＣから失われることがわかった。著者らは、ミトコンドリアの酸化還元電位の低下、成長表面への細胞接着の強化、ならびにＭＭＰ２及びＭＭＰ９の発現の低下も報告している。Ｉａｃｏｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）は、ニューロン細胞の移動と分化に関連する遺伝子に焦点を当てて、このトランスクリプトームデータを再分析し、微小管タンパク質及びキネシンファミリータンパク質など、いくつかの神経移動関連遺伝子の発現低下を見出した。特に、皮質層形成は、結合パートナーを介してＷＷＯＸが関係している経路であるＷｎｔ経路の状態によって影響を受けることがわかった（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０２０）。例えば、ＷＷＯＸはＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄタンパク質Ｄｖｌ１及びＤｖｌ２に結合することがわかっており、後者はＷＷＯＸによって阻害されるため、Ｗｎｔ経路が減衰する（Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ，２００９；Ａｂｕ－Ｏｄｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１４ａ）。本発明者らの研究は、以前に説明された現象である、Ｗｎｔ活性化とＤＮＡ損傷の間のクロストークの可能性をさらに強調するものである（Ｅｌｙａｄａ ｅｔ ａｌ，２０１１）。これは、以前に説明されたＷＷＯＸの多面的機能（Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１５）、及びＲＮＡ－ｓｅｑで認められる細胞周期とＭＤＭ２レベルの負の調節の減少と非常に一致している。ＫＯ ＣＯのＶＺにおいてＫｉ６７＋細胞にＤＮＡ切断の蓄積が認められたが、これは、増殖とおそらく複製ストレスを促進するＷｎｔ活性化によって説明される可能性がある。
脳オルガノイドにおける疾患モデリングに加えて、ＷＷＯＸをｈＥＳＣゲノムに再導入することによって認められる表現型をレスキューすることを試みた。これにより、ＣＯにおいて認められるすべての細胞集団でＷＷＯＸの超生理学的発現と部分的なレスキューがもたらされた。これらの結果は、表現型を修正し、おそらく治療的介入の手段として、ＷＷＯＸの再導入を成功させるための概念実証を提供する。それでも、これらの調査結果は、ＷＯＲＥＥ症候群患者の遺伝子治療アプローチを成功させるには、集団を標的とした送達を最適化し、発現レベルを微調整することが重要であることを示唆している。
最後に、ＷＯＲＥＥ症候群（ＷＳＭ）と比較的軽度の表現型であるＳＣＡＲ１２（ＷＰＭ）に罹患する患者からＦＯを生成した。本発明者らの調査結果は、脳オルガノイド培養プロトコル（ＣＯ及びＦＯ）の両方が同様の結果をもたらし、ＷＷＯＸ欠損の表現型を検証し、それが皮質に由来することを示している。興味深いことに、ＳＣＡＲ１２のファミリーをモデル化する際に、ＷＯＲＥＥオルガノイドと同じ発生異常は観察されなかった。ＳＣＡＲ１２ ＦＯは、前脳ニューロン集団の発生、星状細胞の発生、及びＤＤＲシグナル伝達において、あるとしても非常に軽度の差異を示した。これにより、症候群間で認められる差異をモデル化する系の能力が強化され、まれなＳＣＡＲ１２症候群とＷＷＯＸの多面的機能を詳しく調べる必要性が指摘されている（Ａｂｕ－Ｒｅｍａｉｌｅｈ ｅｔ ａｌ，２０１５；Ｂａｎｎｅ ｅｔ ａｌ，２０２１）。異なる家族の健康なヘテロ接合体の親ではＷＷＯＸ発現に顕著な差異があるが、罹患したホモ接合体患者で観察されるレベルには非常に小さな差異しかないことは注目に値する。これらの結果は、疾患の重症度が、総発現レベルではなくＷＷＯＸの機能レベルと相関しているかどうかという疑問を生じさせる。
全体として、本発明者らのデータは、脳オルガノイドが小児てんかん性脳症をモデル化する能力を示す一方で、ＷＷＯＸの生殖細胞突然変異を有する患者に認められる病理学的変化と治療開発の可能なアプローチを解明している。
材料及び方法
細胞培養及びプラスミド
ＦＧＦ／ＫＯＳＲ条件下、放射線照射したＤＲ４マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上で、ＷｉＢＲ３ ｈＥＳ細胞株及び生成したｉＰＳ細胞株を５％ＣＯ２条件下で維持した：１５％ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＯＳＲ，Ｇｉｂｃｏ；１０８２８－０２８）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ；３５０５０－０３８）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０１－３４０－１Ｂ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０４２－１Ｂ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０３１－１１３）、及び８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；１００－１８Ｂ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ；２１３３１－０２０またはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０１－１７０－１Ａ）。培地は毎日交換し、手動かまたはＣ型トリプシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０５３－１Ｂ）によるトリプシン処理のいずれかにより、培養物を５～７日ごとに継代した。１０μＭ濃度で継代した後の最初の２４～４８時間、Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ、Ｙ２７６３２としても知られる）（Ｃａｙｍａｎ；１０００５５８３）を添加した。
ｈＥＳＣのトランスフェクションのために、エレクトロポレーションの２４時間前に細胞を１０μＭ ＲＯＣＫｉ中で培養した。トリプシンＣ溶液を使用して細胞を剥離させ、合計１００μｇのＤＮＡ構築物と混合したＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含有する）中に再懸濁し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；２５０Ｖ，５００μＦ，０．４ｃｍキュベット）でエレクトロポレーションした。その後、ＲＯＣＫｉを補充したＦＧＦ／ＫＯＳＲ培地中のＭＥＦフィーダー層に細胞を播種した。ＷＷＯＸ－ＫＯの場合、エキソン１を標的とするｓｇＲＮＡを含むｐｘ３３０プラスミドを、ｐＮＴＫ－ＧＦＰと共に比率１：５で同時エレクトロポレーションし、４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞を選別し、続いて約１０日後にコロニー単離のためにＭＥＦフィーダープレート上にまばらに播種した（１０ｃｍプレートあたり２，０００細胞）。ＷＷＯＸ再導入のために、ＷＷＯＸコード配列を保有するようにクローニングされたｐＡＡＶＳ－２ａＮｅｏ－ＵＢｐ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドを、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするｐｘ３３０と同時エレクトロポレーションし（Ｇｕｅｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ，２０１６）、ＧＦＰについて選別し、コロニー単離のために０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。遺伝子編集は、ウエスタンブロッティングによって検証した。ｓｇＲＮＡ配列を、表ＥＶ３に記載する。
ＲＮＡまたはタンパク質を単離するために、ｈＰＳＣを上記のようにＭａｔｒｉｇｅｌをコーティングしたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３５６２３１）上で継代し、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０５－１００－１Ａ）中で培養した。
脳オルガノイドの生成、培養、及びレンチウイルス感染
脳オルガノイドを、前述のようにｈＥＳＣから、以下の変更を加えた上で生成した（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＆ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０１４；Ｂａｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１８）：
ヒトＷｉＢＲ３細胞とＷＳＭ ｉＰＳＣは、有糸分裂不活性化ＭＥＦで維持した。プロトコル開始の４～７日前に、ＭＥＦまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；ＦＡＬ３５６２３１）をコーティングした６０ｍｍプレートに細胞を継代し、７０～８０％の集密度に達するまで増殖させた。０日目に、ｈＥＳＣコロニーを０．７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ溶液（Ｓｉｇｍａ；１１０８８８５８００１）を用いてＭＥＦから剥離させ、Ｃ型トリプシンによる２分間の迅速な処理を使用して単一細胞懸濁液に解離させた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養した細胞については、コラゲナーゼＤ処理はスキップし、細胞をすぐにＣ型トリプシンで解離させ、この時点以降ではプロトコルに他のバリエーションはなかった。経験的に観察されただけであるが、最終結果に大きな差異は認められなかった。しかしながら、ＭＥＦ培養したｈＰＳＣは、神経誘導の成功率が高かったようであり、それゆえに優先的に使用した。
解離後、細胞を計数し、２０％ＫＯＳＲ、３％ＵＳＤＡ認定ｈＥＳＣ品質ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ＮＥＡＡ、１００μＭの２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ；Ｍ３１４８）、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び１０μＭのＲｏｃｋｉを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２からなるｈＥＳＣ培地中に懸濁した。胚様体（ＥＢ）形成のために、９，０００個の細胞を超低接着Ｖ底９６ウェルプレート（Ｓ－Ｂｉｏ Ｐｒｉｍｅ；ＭＳ－９０９６ＶＺ）の各ウェルに播種した。ＥＢには、さらに５日間隔日で栄養供給し、最初の交換では新鮮なｂＦＧＦとＲＯＣＫｉを添加した。６日目に、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２，１％Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ；１７５０２０４８）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ、及び１μｇ／ｍｌヘパリン溶液（Ｓｉｇｍａ；Ｈ３１４９）からなるＮｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ＮＩ）培地（Ｂａｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１７）に交換した。神経上皮が確立されるまで（通常は１１～１２日目）、ＮＩ培地を１日おきに交換し、その場合、示されるように品質管理を実施し（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＆ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０１４；Ｂａｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１７）、十分に発達したＥＢをＭａｔｒｉｇｅｌ液滴に包埋した（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＆ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０１４；Ｂａｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１７）。液滴を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏ－ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ；２１１０３０４９またはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０６－１０５５１１０－１Ａ）の１：１の混合物、０．５％Ｎ２サプリメント、ビタミンＡを含まない１％Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ；１２５８７０１０）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５％ＮＥＡＡ、５０μＭの２－メルカプトエタノール、２．５μｇ／ｍｌのヒト組換えインスリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；４１－９７５－１００）、及び３μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ；１３８６）からなるＣｅｒｅｂｒａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＭ）を含む９０ ｍｍの滅菌未処理の培養皿（Ｍｉｎｉｐｌａｓｔ；８２５－０９０－１５－０１７）に移した。培地は一日おきに交換した。１６日目以降、オルガノイドをオービタルシェーカー上で、ＣＤＭと同様に構成され、Ｂ２７サプリメントからビタミンＡ（Ｇｉｂｃｏ；１７５０４０４４）を含有するＢ２７サプリメントに変更し、ＣＨＩＲ－９９０２１は含まず、４００μＭのビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ；Ａ４４０３）及び１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；０３－０２５－１Ｂ）を含有するＣｅｒｅｂｒａｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭＭ）（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１８）中で、３７℃及び５％ＣＯ２にて培養した。培地は２～４日ごとに交換した。６週目から、培地に１％Ｍａｔｒｉｇｅｌを添加した。汚染の可能性を減らすために、３０日ごとにオルガノイドを新鮮な滅菌プレートに移した。記載されているすべての培地は、０．２２μｍフィルターで濾過し、使用するまで４℃で保存した。特に明記しない限り、すべての分析で同じバッチのオルガノイドを使用した。
ＷＷＯＸのレンチウイルス形質導入は、以前に公開されたとおりに実施した（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６；Ｋｈａｗａｌｅｄ ｅｔ ａｌ，２０１９）。簡潔に述べると、ＷＷＯＸを保有するウイルスを、ｐＤＥＳＴ１２．２ＴＭデスティネーションベクター（Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から生成した。超遠心分離後、２９３Ｔ細胞を感染させることによって力価を経験的に決定した。培養３５日目に、個々のＣＯを、ＣＭＭならびに１：１００のウイルス含有培地及び５μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｍｅｒｃｋ；ＴＲ－１００３－６）を含有するエッペンドルフチューブに移し、一晩インキュベートした。翌日、オルガノイドを新鮮な培地で振盪培養に戻した。
体細胞の再プログラミング
ＷＯＲＥＥ及びＳＣＡＲ１２症候群に罹患した家族由来の血液試料は、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認の下、すべてのヒト対象からインフォームド コンセントを得て研究目的のみに提供され、すべての実験はＷＭＡ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｂｅｌｍｏｎｔ Ｒｅｐｏｒｔに定められた原則に準拠した。
製造業者の指示に従って、Ｙａｍａｎａｋａ因子及びセンダイウイルスＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｋｉｔを感染させることにより、ＰＢＭＣから直接ｉＰＳＣを誘導した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣ由来の血液試料をＦｉｃｏｌｌ勾配によって単離し、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ；１０６３９－０１１）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；３００－０７）、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ－３リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３０８－ＦＫＥ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；２００－０３）、及び１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－６（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；２００－０６）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ；１０６３９－０１１）で培養した。２４時間後、培地の半量を交換した。さらに２４時間後、プロトコルの０日目に、細胞を６ウェルプレートに移し、再プログラミングウイルス混合物を加え、プレートを室温で１，０００×ｇで３０分間遠心分離した。細胞を再懸濁し、インキュベーター内に一晩戻した。翌日、残りのウイルスを取り除くために、細胞を遠心分離して洗浄し、完全に補充されたＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に再懸濁し、２日目に追加の培地を添加した。３日目に、細胞を１０ｃｍのＭＥＦコーティングプレートに移し、培地の半量を、サイトカインを含まない完全ＳｔｅｍＰｒｏ－３４に交換し、培地の半量を１日おきに交換した。７日目までに、再プログラミングの様々な段階にある細胞が認められ、再プログラミング関連のアポトーシスを防ぐために、培地を１０μＭのＲＯＣＫｉを補充したｍＴｅＳＲに徐々に変更した。１６日目に、正常な形態と成長率を有するコロニーを採取し、増殖させ、多能性マーカーの発現を検証し、ＷＷＯＸ変異について配列決定した。
前脳オルガノイドの生成及び培養
前脳オルガノイドを、以下に記載する変更点を加えた上で、以前に記載されたようにｉＰＳＣから生成した（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，２０１８）：
ｉＰＳＣ細胞は、有糸分裂不活性化ＭＥＦ上で維持した。プロトコル開始の４～７日前に、細胞をＭＥＦコーティング６０ｍｍプレート上で継代し、最大７０～８０％の集密度まで培養した。０日目に、ｉＰＳＣコロニーをＣＯと同様に、剥離させ、解離させ、計数し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ＫＯＳＲ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００μＭの２－メルカプトエタノールを含有するｈＰＳＣ培地に再懸濁した。ウェルあたり９，０００個の細胞をＶ底９６ウェルプレートに播種した。１日目に、培地を、２μＭのＡ８３（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ；１４２１）と１００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ；１５２７）を新たに補充したｈＰＳＣ培地であるＮｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＮＥＭ）に変更し、これを１日おきに交換した。５日目と６日目に、培地の半量を吸引し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％Ｎ２サプリメント、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＮＥＡＡ、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、１μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ；１３８６）、及び１μＭのＳＢ－４３１５４２（Ｓｉｇｍａ；Ｓ４３１７）からなるＮｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＮＩＭ）に置き換えた。７日目に、示されたように品質管理及びＭａｔｒｉｇｅｌ包埋を実施し（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）、１日おきに培地を交換しながらＥＢをＮＩＭ中で培養し続けた。１４日目に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ除去を実施し（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，２０１８）、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％Ｎ２サプリメント、ビタミンＡを含む１％Ｂ２７、１％ＮＥＡＡ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭの２－メルカプトエタノール、及び２．５μｇ／ｍｌのインスリンからなるＦｏｒｅｂｒａｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＤＭ）に変更し、３７℃及び５％ＣＯ２のオービタルシェーカーに移した。培地は２～３日ごとに交換した。７１日目に、培地を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、ビタミンＡを含む１％Ｂ２７サプリメント、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭの２－メルカプトエタノール、２００μＭのビタミンＣ、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏ－Ｔｅｃｈ；４５０－０２）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；４５０－１０）、１μＭのジブチリル－ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｄ０６２７）、及び１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；１００－２１Ｃ）を含有するＦｏｒｅｂｒａｉｎ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＭＭ）に変更した。培地は２～３日ごとに交換した。
免疫蛍光
オルガノイドの固定と免疫染色は、以前に記載されたとおりに実施した（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ，２０１８）。簡潔に述べると、オルガノイドをＰＢＳで３回洗浄し、次いで固定のために４％氷冷パラホルムアルデヒド中に４５分間移し、冷ＰＢＳで３回洗浄し、３０％スクロース溶液中で一晩平衡化して凍結保護した。翌日、オルガノイドをＯＣＴに包埋し、ドライアイスでスナップ凍結し、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０クライオスタットで１０μｍに切片化した。
免疫蛍光染色のために、切片を室温に温め、再水和のためにＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＰＢＴ）で透過処理し、次いで、ＰＢＴ中の５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）及び０．５％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液中で１時間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に切片を４℃で一晩インキュベートした。翌日、続いて切片を０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で振盪しながら３回洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液と共に室温で１．５時間インキュベートした。スライドを振盪しながらＰＢＳＴで４回洗浄し、Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ；ｓ３０２３）を使用してカバースリップを封入した。切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化し、付属のＯｌｙｍｐｕｓ ＦＬＵＯＶＩＥＷソフトウェアを使用して処理した。γＨ２ＡＸ陽性の核を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪを使用して手動で計数し、後述のように統計的に解析した。
電気生理学的記録
オルガノイドを３％低温ゲル化アガロースに包埋し（約３６℃で）、氷上で５分間インキュベートした後、Ｌｅｉｃａ １２００Ｓ Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを使用して、スクロース溶液（ｍＭで：８７ＮａＣｌ、２５ＮａＨＣＯ３、２．５ＫＣｌ、２５グルコース、０．５ＣａＣｌ２、７ＭｇＣｌ２、１．２５ＮａＨＰＯ４、及び７５スクロース）中で４℃にて４００μｍに切片化した。切片を、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、ｍＭで：１２５ＮａＣｌ、２５ＮａＨＣＯ３、２．５ＫＣｌ、１０グルコース、２．５ＣａＣｌ２、１．５ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３８、及び３００ｍＯｓｍ）中で３７℃にて３０分間、続いて室温で１時間インキュベートした。記録中、切片は、ベースライン条件で、灌流カーボゲン（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）と共に、３７℃にてＡＣＳＦ中でインキュベートした。局所集合電位（ＬＦＰ）及び全細胞パッチクランプ記録は、ホウケイ酸キャピラリーガラスから引き出し、各切片の外縁から深さ１５０μｍに配置した電極を使用して実施した。ＬＦＰ電極をＡＣＳＦで満たし、一方、パッチ電極を内部溶液で満たした。２５，０００ＨｚのサンプリングレートでＭｕｌｔｉＣｌａｍｐソフトウェアを使用してデータを記録した。ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使用してデータを分析した。（ｉ）６０ノッチフィルター（５倍音）を使用してノイズを除去し、（ｉｉ）０．１ＨｚハイパスＩＩＲフィルターを使用して記録セットアップからの変動を除去し、トレースをフィルター処理した。次いで、トレンド除去機能（ハミングウインドウを使用）を使用して信号の大きな変動を除去し、高速フーリエ変換を使用して正規化されたスペクトルパワーを計算した。パワースペクトル密度プロットの曲線下面積を、特定の周波数範囲でビン化された周波数の合計を取得することによって計算した。
細胞接着記録
細胞接着記録を、ブラインドパッチクランプ記録法で取得した。オルガノイドのニューロン集団由来の自発的なニューロン活動を記録した。電極（約７ＭＯｈｍ）を、垂直２段プラー（ＰＣ－１２、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）で、フィラメント状の薄壁のホウケイ酸ガラス（外径１．５ｍｍ、内径０．８６ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ ＧｍｂＨ）から引き出した。電極を、以下のもの（ｍＭで）：１４０Ｋ－グルコン酸塩、１０ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、１０Ｎａ２－ホスホクレアチン、及び０．５ＥＧＴＡを含有する内部溶液で満たし、ＫＯＨでｐＨ７．２５に調整した。
オルガノイドの表面に対して４５°で電極を挿入した。記録中、オルガノイドを、３５℃でＭａｔｒｉｇｅｌを含まないＣＭＭ中に保持した。ピペットの抵抗が１０～２００ＭＯｈｍに増加すると、ほとんどの場合、スパイクが発生した。単一のスパイクの検出は、記録を開始する基準であった。すべての記録は、電流クランプモードの細胞内アンプ（ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で取得し、１０ｋＨｚのサンプリングレートで取得し（ＣＥＤ Ｍｉｃｒｏ１４０１－３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ハイパスフィルターでフィルター処理して、集合電位を排除し、ニューロンのスパイクを保持した。
細胞接着記録のデータ分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）でカスタム作成されたコードを使用して実行した。細胞接着モードで記録されたスパイクは、閾値を適用することによって生の電圧トレースから抽出した（スパイクの閾値は、バックグラウンドノイズレベルのピークよりもかなり上に配置した）。平均発火率の計算では、記録した細胞ごとに４分間の記録時間にわたる発火率を計算した。
イムノブロット分析と細胞内分画
全タンパク質について、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ならびにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を補充した０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）を含有する溶解緩衝液でオルガノイドを均一化した。細胞質画分を分離するために、１ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＴならびにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を補充した低張溶解緩衝液［１０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ］でオルガノイドを粉砕した。細胞を氷上で１５分間膨潤させた後、０．５％ＮＰ－４０を添加し、ボルテックスによって細胞を溶解した。遠心分離後、細胞質画分を回収した。その後、残余のペレットを、１ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＴを補充した高張核抽出緩衝液［２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．４２ｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ］で、振盪しながら４℃にて１５分間インキュベートすることにより、核画分を得た。試料を遠心分離し、液相を回収した。
各試料に４０～５０μｇのタンパク質を使用して、標準条件下でウエスタンブロッティングを実施した。実験ごとに２～３回、ブロットを繰り返し、Ｂｉｏ－ＲａｄのＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアで定量化した。
ＲＮＡ抽出、逆転写ＰＣＲ、及びｑＰＣＲ
フェノール／クロロホルムベースの方法について製造業者によって説明されているように、Ｂｉｏ－Ｔｒｉ試薬（Ｂｉｏｌａｂ；９０１０２３３１００）を使用して全ＲＮＡを単離した。０．５～１μｇのＲＮＡを使用して、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ；９５０４７）を使用してｃＤＮＡを合成した。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＢ４３６７６５９）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。すべての測定を３回実施し、ＨＰＲＴまたはＵＢＣのいずれかのレベルに標準化した。
ライブラリの調製及びＲＮＡ配列決定
ライブラリの調製及びＲＮＡ配列決定は、標準的な手順に従って、ヘブライ大学Ｃｏｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＦａｃｉｌｉｔｙのＧｅｎｏｍｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって実行した。簡潔に述べると、ＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；５０６７－５５７６）、Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；５０６７－５５８２）、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ＲＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｑ３２８５２）、及び Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；３２８５４）を使用して、ＲＮＡの品質を評価した。
ｍＲＮＡライブラリの調製では、試料あたり１μｇのＲＮＡをＫＡＰＡ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｍＲＮＡ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＫＫ８４２１）を使用して処理した。ライブラリを２０μｌの溶出緩衝液で溶出し、１０ｍＭに調整した後、各試料から１０μｌ（５０％）を回収し、１つのチューブにプールした。マルチプレックス試料プール（１．５ｐＭ，１．５％ＰｈｉＸを含む）をＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２ Ｋｉｔ（７５サイクル）カートリッジ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；ＦＣ－４０４－１００５）にロードし、７５サイクル及びシングルリード配列決定条件でＮｅｘｔＳｅｑ ５００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードした。
ライブラリの品質管理のために、Ｆａｓｔｑファイルを、ＦａｓｔＱＣ（ｖｅｒ．０．１１．８）で試験し、残りのアダプター、低品質の塩基（Ｑ＝２０）、及び読み取り長（２０塩基）についてトリミングした。トリミングは、ｔｒｉｍ ｇａｌｏｒｅ（ｖｅｒ．０．６．１）で実施した。読み取りカウントはサンプルあたり約３０～５０Ｍと高く、フィルタリング後はほとんど減少しなかった。Ｓａｌｍｏｎ（ｖｅｒ．１．２．１）を使用して、検証マッピングモードとｇｃバイアス補正の両方をオンにして、マッピングベースモードでトランスクリプトームマッピングを実施した。アラインメントの前に、２５のｋｍｅｒサイズを使用して、ＨＳ ＧＲＣｈ３８ ＣＤＮＡ ｒｅｌｅａｓｅ ９９（２０１９年１１月）に基づいてＳａｌｍｏｎインデックスを作成した。Ｓａｌｍｏｎマッピングでは、生の転写産物のカウント数とＴＰＭのカウント数の両方が報告される。得られるマッピング率は、８０％～９０％と高い。合計８つのＣＯサンプル（４つのＷＴ ＣＯと４つのＫＯ ＣＯ）を配列決定した。１つのＷＴサンプルは、予備的な品質管理に合格しなかった（低い読み取り数と低いトランスクリプトームマッピング率）。他のサンプルのいずれともクラスター化されなかった別のＷＴサンプル（ＷＷＯＸ－ＫＯでもＷＴでもない）は、ＰＣＡとデンドログラム分析の両方で明らかであった。これらの２つのサンプルを、さらなる分析から抽出し、合計６つのサンプルをさらなる分析に使用した。示差的に発現する遺伝子の決定（ＫＯ対ＷＴ）では、未加工の転写カウント数を６つのサンプルすべてで最小の全体カウント１０でフィルター処理し、Ｒパッケージｔｘｉｍｐｏｒｔ（ｖｅｒ．１．１６．１）でインポートしてＤＥｅｑ２（ｖｅｒ．１．２８．１）で分析した。カウント数をＤＥＳｅｑ２によって正規化し、示差的に発現する遺伝子をフィルター処理し、αを０．０１に設定した。ａｐｅｇｌｍ（ｖｅｒ．１．１０．０）に基づいて、平均ベースの倍率変化、及び収縮ベースの倍率変化を計算した。
図１６Ａ及びＣに示すヒートマップを作成するために、示差的に発現する遺伝子のリストを、上方制御された（ＷＷＯＸ－ＫＯ発現がＷＴ発現より高かった）サブリスト及び下方制御されたサブリストに分けた。各サブリストを倍率変化値でソートし、各サブリストから上位１００個の遺伝子を選択した。選択した各遺伝子について、ｌｏｇ２正規化カウントをスケーリングし、Ｒパッケージｇｐｌｏｔｓ（ｖｅｒ．３．０．３）のｈｅａｔｍａｐ．２を使用してヒートマップに示した。
図１４Ｆに認められるヒートマップでは、６つの皮質層遺伝子マーカーのそれぞれのｌｏｇ２正規化カウントをスケーリングし、Ｒパッケージｇｐｌｏｔｓのｈｅａｔｍａｐ．２を使用してヒートマップ形式で示した。遺伝子セットの濃縮分析は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＧＳＥＡソフトウェア（ｖｅｒ．４．０．３）を使用して実施した。入力には、倍率変化のｌｏｇ２でランク付けした１５，３４８の遺伝子が含まれていた。ＧＯセットは Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅセットｃ５．ａｌｌ．ｖ７．０である。許容されるセットは、遺伝子が１５個以上５００個以下のセットである。遺伝子セットは、ＧＯ生物学的プロセスである。この分析で許容されるセットは、遺伝子が１０個以上５００個以下のセットである。最初の２つの成分のＰＣＡプロットを計算し、ベースＲ関数でプロットした。計算は、疑似カウント１を追加した、ｌｏｇ２変換及びｌｏｇ２正規化したカウントに基づいている。
統計
実験結果を、平均±ＳＥＭとして、または第１及び第３の四分位数、最小値と最大値、ならびに中央値を示す箱ひげ図で表現した。最初に、Ｗｉｌｋ－Ｓｈａｐｉｒｏ検定を使用して正規性を決定し、正規分布したサンプルの場合、ウェルチの補正を使用した両側独立スチューデントｔ検定を使用して、試験サンプルと対照サンプルの値を比較した。非正規分布のサンプルについては、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用した。２つ以上のサンプル間の比較には、一元配置分散分析を使用し、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用して多重比較を修正した。正規分布していないサンプルについては、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定をＤｕｎｎの多重比較検定と共に使用した。速度論的実験では、ＳＤが等しいと仮定せずに、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ法を使用して多重ｔ検定に対して分析を修正した。統計的に有意な結果のＰ値カットオフは以下のとおりである：ｎ．ｓ（有意でない）、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して、統計解析と視覚的なデータ表示を行った。この研究では、無作為化や盲検化は適用しなかった。実験は、いくつかの生物学的複製で実施し、各遺伝子型について少なくとも２つのｈＰＳＣ系統を使用した（ＷｉＢＲ３ ＷＴ系統を除く）。特に明記しない限り、実験はオルガノイドの複数のバッチで実行した。
参考文献
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Ｂｌｕｍｃｋｅ Ｉ， Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ Ｒ， Ｈａａｋｅｒ Ｇ， Ｃｏｒａｓ Ｒ， Ｋｏｂｏｗ Ｋ， Ｂｉｅｎ ＣＧ， Ｐｆａｆｆｌｉｎ Ｍ， Ｅｌｇｅｒ Ｃ， Ｗｉｄｍａｎ Ｇ， Ｓｃｈｒａｍｍ Ｊ ｅｔ ａｌ （２０１７） Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７： １６４８－１６５６
Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅ Ｎ， Ｄｒｉｏｕｃｈ Ｋ， Ｅｌ ＨＰ， Ｓｉｎ Ｓ， Ｆｏｒｍｓｔｅｃｈｅｒ Ｅ， Ｃａｍｏｎｉｓ Ｊ， Ｌｉｄｅｒｅａｕ Ｒ， Ｌａｌｌｅｍａｎｄ Ｆ （２００９） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｔｈｅ ＷＷＯＸ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２８： ２５６９－２５８０
Ｂｒａｇｉｎ Ａ， Ｅｎｇｅｌ Ｊ （２００８） Ｓｌｏｗ ｗａｖｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｉｚｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ ｅｐｉｌｅｐｓｙ， Ｓｏｌｔｅｓｚ Ｉ， Ｓｔａｌｅｙ Ｋ （ｅｄｓ）， ｐｐ ４４０－４５３． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｃｈｅｎ Ｓ， Ｃｈｕａｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｔｓａｉ Ｍ， Ｌｉ Ｈ， Ｃｈａｎｇ Ｎ （２００４） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＷＯＸ１ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｕｒｉｎｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２４： ８３１－８３９
Ｃｈｅｎｇ Ｙ－Ｙ， Ｃｈｏｕ Ｙ－Ｔ， Ｌａｉ Ｆ－Ｊ， Ｊａｎ Ｍ－Ｓ， Ｃｈａｎｇ Ｔ－Ｈ， Ｊｏｕ Ｉ－Ｍ， Ｃｈｅｎ Ｐ－Ｓ， Ｌｏ Ｊ－Ｙ， Ｈｕａｎｇ Ｓ－Ｓ， Ｃｈａｎｇ Ｎ－Ｓ ｅｔ ａｌ （２０２０） Ｗｗｏｘ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ ８： ６
Ｃｏｈｅｎ－Ｇａｄｏｌ ＡＡ， Ｐａｎ ＪＷ， Ｋｉｍ ＪＨ， Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＤ， Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ ＨＨ （２００４） Ｍｅｓｉａｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ： ａ ｐｒｏｔｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ａ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０１： ６１３－６２０
Ｄｅｖｅｒｍａｎ ＢＥ， Ｐｒａｖｄｏ ＰＬ， Ｓｉｍｐｓｏｎ ＢＰ， Ｋｕｍａｒ ＳＲ， Ｃｈａｎ ＫＹ， Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ， Ｗｕ Ｗ－Ｌ， Ｙａｎｇ Ｂ， Ｈｕｂｅｒ Ｎ， Ｐａｓｃａ ＳＰ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｃｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４： ２０４－２０９
Ｅｌｙａｄａ Ｅ， Ｐｒｉｂｌｕｄａ Ａ， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＲＥ， Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ Ｙ， Ｂｒａｃｈｙａ Ｇ， Ｃｏｊｏｃａｒｕ Ｇ， Ｓｎｉｒ－Ａｌｋａｌａｙ Ｉ， Ｂｕｒｓｔａｉｎ Ｉ， Ｈａｆｆｎｅｒ－Ｋｒａｕｓｚ Ｒ， Ｊｕｎｇ Ｓ ｅｔ ａｌ （２０１１） ＣＫＩα ａｂｌａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐ５３ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７０： ４０９－４１３
Ｆａｕｓｅｒ Ｓ， Ｈｕｐｐｅｒｔｚ ＨＪ， Ｂａｓｔ Ｔ， Ｓｔｒｏｂｌ Ｋ， Ｐａｎｔａｚｉｓ Ｇ， Ａｌｔｅｎｍｕｅｌｌｅｒ ＤＭ， Ｆｅｉｌ Ｂ， Ｒｏｎａ Ｓ， Ｋｕｒｔｈ Ｃ， Ｒａｔｉｎｇ Ｄ ｅｔ ａｌ （２００６） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｆｏｃａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ： ａ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ １２０ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｒａｉｎ １２９： １９０７－１９１６
Ｆｉｓｈｅｒ ＲＳ， Ａｃｅｖｅｄｏ Ｃ， Ａｒｚｉｍａｎｏｇｌｏｕ Ａ， Ｂｏｇａｃｚ Ａ， Ｃｒｏｓｓ ＪＨ， Ｅｌｇｅｒ ＣＥ， Ｅｎｇｅｌ Ｊ， Ｆｏｒｓｇｒｅｎ Ｌ， Ｆｒｅｎｃｈ ＪＡ， Ｇｌｙｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ （２０１４） ＩＬＡＥ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｒｅｐｏｒｔ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ５５： ４７５－４８２
Ｇｒｉｂａａ Ｍ， Ｓａｌｉｈ Ｍ， Ａｎｈｅｉｍ Ｍ， Ｌａｇｉｅｒ－Ｔｏｕｒｅｎｎｅ Ｃ， Ｈ’ｍｉｄａ Ｄ， Ｄｒｏｕｏｔ Ｎ， Ｍｏｈａｍｅｄ Ａ， Ｅｌｍａｌｉｋ Ｓ， Ｋａｂｉｒａｊ Ｍ， Ａｌ－Ｒａｙｅｓｓ Ｍ ｅｔ ａｌ （２００７） Ａ ｎｅｗ ｆｏｒｍ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｏｎｓｅｔ， ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ａｔ １６ｑ２１－ｑ２３．Ｂｒａｉｎ １３０： １９２１－１９２８
Ｇｕｅｒｎｅｔ Ａ， Ｍｕｎｇａｍｕｒｉ Ｓ， Ｃａｒｔｉｅｒ Ｄ， Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ Ｒ， Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ Ａ， Ａｄｒｉｏｕｃｈ Ｓ， Ｖｅｚａｉｎ Ｍ， Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒ Ｆ， Ｒｏｈｋｉｎ Ｇ， Ｃｏｕｔａｎｔ Ｓ ｅｔ ａｌ （２０１６） ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｄｒｉｖｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６３： ５２６－５３８
Ｇｕｉｒｇｉｓ Ｍ， Ｃｈｉｎｖａｒｕｎ Ｙ， Ｃａｒｌｅｎ ＰＬ， Ｂａｒｄａｋｊｉａｎ ＢＬ （２０１３） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｌｔａ－ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｉｚｕｒｅ ｓｔａｔｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ＥＭＢＳ ｐｐ ６５９５－６５９８
Ｈａｚａｎ Ｉ， Ｈｏｆｍａｎｎ ＴＧ， Ａｑｅｉｌａｎ ＲＩ （２０１６） Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｆｒａｇｉｌｅ ｓｉｔｅｓ ａｒｅ ａｃｔｉｖｅ ｐｌａｙｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １２： １－１９
Ｈｏｄｇｅｓ ＳＬ， Ｌｕｇｏ ＪＮ （２０１８） Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ １４６： ９－１６
Ｈｏｗｅｌｌ ＫＢ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＪＬ， Ｍａｃｋａｙ ＭＴ， Ｆａｈｅｙ ＭＣ， Ａｒｃｈｅｒ Ｊ， Ｂｅｒｋｏｖｉｃ ＳＦ， Ｃｈａｎ Ｅ， Ｄａｂｓｃｈｅｃｋ Ｇ， Ｅｇｇｅｒｓ Ｓ， Ｈａｙｍａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ （２０２１） Ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ： ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ６２： ３５８－３７０
Ｈｕｓｓａｉｎ Ｔ， Ｋｉｌ Ｈ， Ｈａｔｔｉａｎｇａｄｙ Ｂ， Ｌｅｅ Ｊ， Ｋｏｄａｌｉ Ｍ， Ｓｈｕａｉ Ｂ， Ａｔｔａｌｕｒｉ Ｓ， Ｔａｋａｔａ Ｙ， Ｓｈｅｎ Ｊ， Ａｂｂａ ＭＣ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｗｗｏｘ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅｄ ＧＡＢＡ－ｅｒｇｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ １２１： １６３－１７６
Ｉａｃｏｍｉｎｏ Ｍ， Ｂａｌｄａｓｓａｒｉ Ｓ， Ｔｏｃｈｉｇｉ Ｙ， Ｋｏｓｌａ Ｋ， Ｂｕｆｆｅｌｌｉ Ｆ， Ｔｏｒｅｌｌａ Ａ， Ｓｅｖｅｒｉｎｏ Ｍ， Ｐａｌａｄｉｎｉ Ｄ， Ｍａｎｄａｒａ Ｌ， Ｒｉｖａ Ａ ｅｔ ａｌ （２０２０） Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｗｗｏｘ ｐｅｒｔｕｒｂｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｓ ｅａｒｌｙ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｎｉｎｓ．２０２０．００６４４
Ｋｈａｌｉｌｏｖ Ｉ， Ｌｅ Ｖａｎ ＱＭ， Ｇｏｚｌａｎ Ｈ， Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ （２００５） Ｅｐｉｌｅｐｔｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＧＡＢＡ ａｎｄ ｆａｓｔ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｎｅｕｒｏｎ ４８： ７８７－７９６
Ｋｈａｗａｌｅｄ Ｓ， Ｎｉｇｉｔａ Ｇ， Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ Ｒ， Ｏｓｔｅｒ Ｓ， Ｓｕｈ Ｓ－Ｓ， Ｓｍｉｔｈ Ｙ， Ｋｈａｌａｉｌｅｈ Ａ， Ｐｅｎｇ Ｙ， Ｃｒｏｃｅ ＣＭ， Ｇｅｉｇｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ （２０２０） Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＷＷＯＸ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ ５： １－１０
Ｋｈａｗａｌｅｄ Ｓ， Ｓｕｈ ＳＳ， Ａｂｄｅｅｎ ＳＫ， Ｍｏｎｉｎ Ｊ， Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ Ｒ， Ｎｉｇｉｔａ Ｇ， Ｃｒｏｃｅ ＣＭ， Ａｑｅｉｌａｎ ＲＩ （２０１９） ＷＷＯＸ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７９： １７８４－１７９８
Ｋｈｅｉｒｉ Ｆ， Ｂｒａｇｉｎ Ａ， Ｅｎｇｅｌ Ｊ （２０１３） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｒａｉｎ ａｒｅａｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇａｍｍａ ｗａｖｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１４： １８４－１９１
Ｋｏｂｏｗ Ｋ， Ｚｉｅｍａｎｎ Ｍ， Ｋａｉｐａｎａｎｉｃｋａｌ Ｈ， Ｋｈｕｒａｎａ Ｉ， Ｍｕｈｌｅｂｎｅｒ Ａ， Ｆｅｕｃｈｔ Ｍ， Ｈａｉｎｆｅｌｌｎｅｒ ＪＡ， Ｃｚｅｃｈ Ｔ， Ａｒｏｎｉｃａ Ｅ， Ｐｉｅｐｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｃａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ．Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ６０： １０９１－１１０３
Ｋｏｓｌａ Ｋ， Ｐｌｕｃｉｅｎｎｉｋ Ｅ， Ｓｔｙｃｚｅｎ－Ｂｉｎｋｏｗｓｋａ Ｅ， Ｎｏｗａｋｏｗｓｋａ Ｍ， Ｏｒｚｅｃｈｏｗｓｋａ Ｍ， Ｂｅｄｎａｒｅｋ ＡＫ （２０１９） Ｔｈｅ ＷＷＯＸ ｇｅｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３： ３９１
Ｌａｄｏ ＦＡ， Ｒｕｂｂｏｌｉ Ｇ， Ｃａｐｏｖｉｌｌａ Ｐ， Ａｖａｎｚｉｎｉ Ｇ， Ｍｏｓｈｅ ＳＬ （２０１３） Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ５４： ６－１３
Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＭＡ， Ｃｏｒｓｉｎｉ ＮＳ， Ｗｏｌｆｉｎｇｅｒ Ｓ， Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ ＥＨ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＡＷ， Ｂｕｒｋａｒｄ ＴＲ， Ｏｔａｎｉ Ｔ， Ｌｉｖｅｓｅｙ ＦＪ， Ｋｎｏｂｌｉｃｈ ＪＡ （２０１８） Ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｆ－ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｐｌａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５： ６５９－６６６
Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＭＡ， Ｋｎｏｂｌｉｃｈ ＪＡ （２０１４） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９： ２３２９－２３４０
Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＭＡ， Ｒｅｎｎｅｒ Ｍ， Ｍａｒｔｉｎ Ｃ， Ｗｅｎｚｅｌ Ｄ， Ｂｉｃｋｎｅｌｌ ＬＳ， Ｈｕｒｌｅｓ ＭＥ， Ｈｏｍｆｒａｙ Ｔ， Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ ＪＭ， Ｊａｃｋｓｏｎ ＡＰ， Ｋｎｏｂｌｉｃｈ ＪＡ （２０１３） Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｍｏｄｅｌ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５０１： ３７３－３７９
Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ Ｒ， Ｇａｏ Ｆ， Ｐｆｅｎｎｉｎｇ Ａ， Ｐａｎ Ｌ， Ｙａｍａｋａｗａ Ｓ， Ｓｅｏ Ｊ， Ｒｕｅｄａ Ｒ， Ｐｈａｎ ＴＸ， Ｙａｍａｋａｗａ Ｈ， Ｐａｏ Ｐ－Ｃ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ ｂｒｅａｋｓ ｇｏｖｅｒｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅａｒｌｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １６１： １５９２－１６０５
Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ Ｒ， Ｐａｎ Ｌ， Ｔｓａｉ Ｌ－Ｈ （２０１４） ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｎｋｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ ８３： ２６６－２８２
Ｍａｌｌａｒｅｔ Ｍ， Ｓｙｎｏｆｚｉｋ Ｍ， Ｌｅｅ Ｊ， Ｓａｇｕｍ ＣＡ， Ｍａｈａｊｎａｈ Ｍ， Ｓｈａｒｋｉａ Ｒ， Ｄｒｏｕｏｔ Ｎ， Ｒｅｎａｕｄ Ｍ， Ｋｌｅｉｎ ＦＡＣ， Ａｎｈｅｉｍ Ｍ ｅｔ ａｌ （２０１４） Ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ＷＷＯＸ ｉｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ ｗｉｔｈ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ １３７： ４１１－４１９
Ｍａｎｓｏｕｒ ＡＡ， Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ＪＴ， Ｂｌｏｙｄ ＣＷ， Ｌｉ Ｈ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ Ｓ， Ｑｕａｎｇ Ｄ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｓ， Ｐａｒｙｌａｋ ＳＬ， Ｊｉｎ Ｘ， Ｇａｇｅ ＦＨ （２０１８） Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６： ４３２－４４１
ＭｃＴａｇｕｅ Ａ， Ｈｏｗｅｌｌ ＫＢ， Ｃｒｏｓｓ ＪＨ， Ｋｕｒｉａｎ ＭＡ， Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ＩＥ （２０１６） Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ １５： ３０４－３１６
Ｍｅｄｖｅｄｅｖ ＡＶ， Ｍｕｒｒｏ ＡＭ， Ｍｅａｄｏｒ ＫＪ （２０１１） Ａｂｎｏｒｍａｌ ｉｎｔｅｒｉｃｔａｌ ｇａｍｍａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍａｙ ｍａｎｉｆｅｓｔ ａ ｓｅｉｚｕｒｅ ｏｎｓｅｔ ｚｏｎｅ ｉｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｙｓｔ ２１： １０３－１１４
Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ Ｊ， Ｂｏｅｒ Ｋ， Ｓｌｕｉｊｓ ＪＡ， Ｄｅ ＦＬ， Ｅｎｃｈａ－ｒａｚａｖｉ Ｆ， Ｖｅｓｃｏｖｉ ＡＬ， Ｓｗａａｂ ＤＦ， Ａｒｏｎｉｃａ Ｅ， Ｈｏｌ ＥＭ （２０１０） ＧＦＡＰｄｅｌｔａ ｉｎ ｒａｄｉａｌ ｇｌｉａ ａｎｄ ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｅｘ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３２１： ３１３－３２１
Ｍｉｇｎｏｔ Ｃ， Ｌａｍｂｅｒｔ Ｌ， Ｐａｓｑｕｉｅｒ Ｌ， Ｂｉｅｎｖｅｎｕ Ｔ， Ｄｅｌａｈａｙｅ－Ｄｕｒｉｅｚ Ａ， Ｋｅｒｅｎ Ｂ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｊ， Ｓａｕｎｉｅｒ Ａ， Ａｌｌｏｕ Ｌ， Ｒｏｔｈ Ｖ ｅｔ ａｌ （２０１５） ＷＷＯＸ－ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ： ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ５２： ６１－７０
Ｍｉｌｌｅｒ ＪＷ， Ｋｉｍ Ｗ， Ｈｏｌｍｅｓ ＭＤ， Ｖａｎｈａｔａｌｏ Ｓ （２００７） Ｉｃｔａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｕｒｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｒａｓｌｏｗ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＤＣ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｓｃａｌｐ ＥＥＧ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ．ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ ３５： ５８３－５９７
Ｍｕｒａｔａ Ｙ， Ｃｏｌｏｎｎｅｓｅ ＭＴ （２０２０） ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ ｅｘｃｉｔｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｓｃｉ Ａｄｖ ６： ｅａｂａ１４３０
Ｎａｓｈａｂａｔ Ｍ， Ａｌ Ｑａｈｔａｎｉ ＸＳ， Ａｌｍａｋｄｏｂ Ｓ， Ａｌｔｗａｉｊｒｉ Ｗ， Ｂａ－Ａｒｍａｈ ＤＭ， Ｈｕｎｄａｌｌａｈ Ｋ， Ａｌ Ｈａｓｈｅｍ Ａ， Ａｌ Ｔａｌａ Ｓ， Ｍａｄｄｉｒｅｖｕｌａ Ｓ， Ａｌｋｕｒａｙａ ＦＳ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｔｈｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｉｎ ａ ｃｏｎｓａｎｇｕｉｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｅｉｚｕｒｅ ６９： １５４－１７２
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Ｐａｔｅｌ ＤＣ， Ｔｅｗａｒｉ ＢＰ， Ｃｈａｕｎｓａｌｉ Ｌ， Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ Ｈ （２０１９） Ｎｅｕｒｏｎ－ｇｌｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０： ２８２－２９７
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Ｐｉａｒｄ Ｊ， Ｈａｗｋｅｓ Ｌ， Ｍｉｌｈ Ｍ， Ｖｉｌｌａｒｄ Ｌ， Ｂｏｒｇａｔｔｉ Ｒ， Ｒｏｍａｎｉｅｌｌｏ Ｒ， Ｆｒａｄｉｎ Ｍ， Ｃａｐｒｉ Ｙ， Ｈｅｒｏｎ Ｄ， Ｎｏｕｇｕｅｓ Ｍ－Ｃ ｅｔ ａｌ （２０１８） Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ＷＷＯＸ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ： ２０ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＷＯＲＥＥ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ２１： １３０８－１３１８
Ｐｏｌｌｅｎ Ａ， Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉ Ｔ， Ｃｈｅｎ Ｊ， Ｒｅｔａｌｌａｃｋ Ｈ， Ｓａｎｄｏｖａｌ－Ｅｓｐｉｎｏｓａ Ｃ， Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃ， Ｓｈｕｇａ Ｊ， Ｌｉｕ Ｓ， Ｏｌｄｈａｍ Ｍ， Ｄｉａｚ Ａ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉａｌ ｇｌｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ １６３： ５５－６７
Ｑｉａｎ Ｘ， Ｊａｃｏｂ Ｆ， Ｓｏｎｇ ＭＭ， Ｎｇｕｙｅｎ ＨＮ， Ｓｏｎｇ Ｈ， Ｍｉｎｇ ＧＬ （２０１８） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １３： ５６５－５８０
Ｑｉａｎ Ｘ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｈ， Ｓｏｎｇ Ｍ， Ｈａｄｉｏｎｏ Ｃ， Ｏｇｄｅｎ Ｓ， Ｈａｍｍａｃｋ Ｃ， Ｙａｏ Ｂ， Ｈａｍｅｒｓｋｙ Ｇ， Ｊａｃｏｂ Ｆ， Ｚｈｏｎｇ Ｃ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｂｒａｉｎ－ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｎｉ－ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ＺＩＫＶ ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｃｅｌｌ １６５： １２３８－１２５４
Ｑｉａｎ Ｘ， Ｓｕ Ｙ， Ａｄａｍ ＣＤ， Ｄｅｕｔｓｃｈｍａｎｎ ＡＵ， Ｐａｔｈｅｒ ＳＲ， Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＥＭ， Ｓｕ Ｋ， Ｌｉ Ｓ， Ｌｕ Ｌ， Ｊａｃｏｂ Ｆ ｅｔ ａｌ （２０２０） Ｓｌｉｃｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｌａｙｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２６： ７６６－７８１．ｅ９
Ｑｕ Ｚ， Ｓｕ Ｆ， Ｑｉ Ｘ， Ｓｕｎ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｑｉａｏ Ｚ， Ｚｈａｏ Ｈ， Ｚｈｕ Ｙ （２０１７） Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｋａｉｎｉｃ ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｆｕｎｃｔ ３５： ４７２－４７６
Ｒｅｐｕｄｉ Ｓ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＤＪ， Ｅｌａｚａｒ Ｎ， Ｂｒｅｔｏｎ ＶＬ， Ａｑｕｉｌｉｎｏ ＭＳ， Ｓａｌｅｅｍ Ａ， Ａｂｕ－Ｓｗａｉ Ｓ， Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎ Ａ， Ｅｓｈｅｄ－Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ Ｙ， Ｖｉｊａｙａｒａｇａｖａｎ Ｂ ｅｔ ａｌ （２０２１） Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｗｏｘ， ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＷＯＲＥＥ ｓｙｎｄｒｏｍｅ， ｃａｕｓｅｓ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎ ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｂｒａｉｎ ａｗａｂ１７４
Ｒｏｂｅｌ Ｓ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ ＳＣ， Ｂｏｎｉ ＪＬ， Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＳＬ， Ｄａｎｂｏｌｔ ＮＣ， Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ Ｔ， Ｓｕｔｏｒ Ｂ， Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ Ｈ （２０１５） Ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｉｚｕｒｅｓｒｅａｃｔｉｖｅ ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｉｚｕｒｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５： ３３３０－３３４５
Ｒｏｓｓｉｎｉ Ｌ， Ｇａｒｂｅｌｌｉ Ｒ， Ｇｎａｔｋｏｖｓｋｙ Ｖ， Ｄｉｄａｔｏ Ｇ， Ｖｉｌｌａｎｉ Ｆ， Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ Ｒ， Ｄｅｌｅｏ Ｆ， Ｌｏ Ｒｕｓｓｏ Ｇ， Ｔｒｉｎｇａｌｉ Ｇ， Ｇｏｚｚｏ Ｆ ｅｔ ａｌ （２０１７） Ｓｅｉｚｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｅｒ ｓｅ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄａｍａｇｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｆｏｃａｌ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ８２： ３３１－３４１
Ｓａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ ＲＡ， Ｍｉｒａｎｄａ ＯＡ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓ， Ｆｅｒａｎｄｏ Ｉ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ， Ｂｕｔｈ ＪＥ， Ｋｕｒｄｉａｎ Ａ， Ｇｏｌｓｈａｎｉ Ｐ， Ｐｌａｔｈ Ｋ， Ｌｏｗｒｙ ＷＥ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８２０１８３ ［ＰＲＥＰＲＩＮＴ］
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｌ， Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ Ｓ， Ｆａｖａｒｏ Ｒ， Ｐｉｓａｔｉ Ｆ， Ｒｏｎｃａｇｌｉａ Ｐ， Ｔｅｓｔａ Ｇ， Ｎｉｃｏｌｉｓ ＳＫ， Ｆｉｎｏｃｃｈｉａｒｏ Ｇ， Ｄ’Ａｄｄａ Ｄｉ Ｆａｇａｇｎａ Ｆ （２０１３） ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＢＭＰ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １： １２３－１３８
Ｓｈａｎｂｈａｇ ＮＭ， Ｅｖａｎｓ ＭＤ， Ｍａｏ Ｗ， Ｎａｎａ ＡＬ， Ｓｅｅｌｅｙ ＷＷ， Ａｄａｍｅ Ａ， Ｒｉｓｓｍａｎ ＲＡ， Ｍａｓｌｉａｈ Ｅ， Ｍｕｃｋｅ Ｌ （２０１９） Ｅａｒｌｙ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ ７： １ － １８
Ｓｈａｏ Ｌ， Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ ＣＥ （２０１６） Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ： ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２３： ９８－１０７
Ｓｉｄｈａｙｅ Ｊ， Ｋｎｏｂｌｉｃｈ ＪＡ （２０２０） Ｂｒａｉｎ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ： ａｎ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｏｆ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２８： ５２－６７
Ｓｕｂｅｒｂｉｅｌｌｅ Ｅ， Ｓａｎｃｈｅｚ ＰＥ， Ｋｒａｖｉｔｚ ＡＶ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｈｏ Ｋ， Ｅｉｌｅｒｔｓｏｎ Ｋ， Ｄｅｖｉｄｚｅ Ｎ， Ｋｒｅｉｔｚｅｒ ＡＣ， Ｍｕｃｋｅ Ｌ （２０１３） Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｂｒａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃａｕｓｅｓ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ， ｗｉｔｈ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ ｂｙ ａｍｙｌｏｉｄ－β．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６： ６１３－６２１
Ｓｕｎ ＡＸ， Ｙｕａｎ Ｑ， Ｆｕｋｕｄａ Ｍ， Ｙｕ Ｗ， Ｙａｎ Ｈ， Ｌｉｍ ＧＧＹ， Ｎａｉ ＭＨ， Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ＧＡ， Ｔｒａｎ Ｈ－Ｄ， Ｉｔａｈａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６： １４８６－１４９２
Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ， Ｋａｔａｙａｍａ Ｋ， Ｔａｋｅｎａｋａ Ｍ， Ａｍａｋａｓｕ Ｋ， Ｓａｉｔｏ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ （２００９） Ａ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｗｏｘ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｕｄｉｏｇｅｎｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｌｅｔｈａｌ ｄｗａｒｆｉｓｍ ａｎｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｇｅｎｅｓ， Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ ８： ６５０－６６０
Ｔａｎｎａ Ｍ， Ａｑｅｉｌａｎ ＲＩ （２０１８） Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ＷＷＯＸ ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ： ｗｈａｔ ｈａｖｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｅｄ？Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ８ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１８．００４２０
Ｔａｓｓｉ Ｌ， Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｎ， Ｇａｒｂｅｌｌｉ Ｒ， Ｆｒａｎｃｉｏｎｅ Ｓ， Ｌｏ Ｒｕｓｓｏ Ｇ， Ｍａｉ Ｒ， Ｃａｒｄｉｎａｌｅ Ｆ， Ｃｏｓｓｕ Ｍ， Ｆｅｒｒａｒｉｏ Ａ， Ｇａｌｌｉ Ｃ ｅｔ ａｌ （２００２） Ｆｏｃａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ： ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ， ＥＥＧ， ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｂｒａｉｎ １２５： １７１９－１７３２
Ｔｈｏｍ Ｍ （２００９） Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｓｉｎｃｅ ｓｏｍｍｅｒ．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９： ５６５－５７２
Ｔｏｃｈｉｇｉ Ｙ， Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｙ， Ｎａｋａｎｅ Ｊ， Ｎａｋａｉ Ｒ， Ｋａｔａｙａｍａ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ （２０１９） Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｗｗｏｘ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｄｗａｒｆｉｓｍ ｗｉｔｈ ｅｐｉｌｅｐｓｙ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０： ３５９６
Ｔｒｕｊｉｌｌｏ ＣＡ， Ｇａｏ Ｒ， Ｎｅｇｒａｅｓ ＰＤ， Ｇｕ Ｊ， Ｂｕｃｈａｎａｎ Ｊ， Ｐｒｅｉｓｓｌ Ｓ， Ｗａｎｇ Ａ， Ｗｕ Ｗ， Ｈａｄｄａｄ ＧＧ， Ｃｈａｉｍ ＩＡ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ｗａｖｅｓ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｍｏｄｅｌ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２５： ５５８－５６９．ｅ７
Ｖａｎｈａｔａｌｏ Ｓ， Ｐａｌｖａ ＪＭ， Ｈｏｌｍｅｓ ＭＤ， Ｍｉｌｌｅｒ ＪＷ， Ｖｏｉｐｉｏ Ｊ， Ｋａｉｌａ Ｋ （２００４） Ｉｎｆｒａｓｌｏｗ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｉｃｔａｌ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｔｅｘ ｄｕｒｉｎｇ ｓｌｅｅｐ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１： ５０５３－５０５７
Ｖｅｚｚａｎｉ Ａ， Ｆｒｅｎｃｈ Ｊ， Ｂａｒｔｆａｉ Ｔ， Ｂａｒａｍ ＴＺ （２０１１） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ７： ３１－４０
Ｗａｎｇ Ｈ－Ｙ， Ｊｕｏ Ｌ－Ｉ， Ｌｉｎ Ｙ－Ｔ， Ｈｓｉａｏ Ｍ， Ｌｉｎ Ｊ－Ｔ， Ｔｓａｉ Ｃ－Ｈ， Ｔｚｅｎｇ Ｙ－Ｈ， Ｃｈｕａｎｇ Ｙ－Ｃ， Ｃｈａｎｇ Ｎ－Ｓ， Ｙａｎｇ Ｃ－Ｎ ｅｔ ａｌ （２０１２） ＷＷ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｖｉａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３Β．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ １９： １０４９－１０５９
Ｗａｎｇ Ｗ， Ｅｓｂｅｎｓｅｎ Ｙ， Ｋｕｎｋｅ Ｄ， Ｓｕｇａｎｔｈａｎ Ｒ， Ｒａｃｈｅｋ Ｌ， Ｂｊｏｒａｓ Ｍ， Ｅｉｄｅ Ｌ （２０１１） Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｌｅｖｅｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｔｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１： ９７４６－９７５１
Ｗｅｉｓｚ－Ｈｕｂｓｈｍａｎ Ｍ， Ｍｅｉｒｓｏｎ Ｈ， Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ－Ｃｏｈｅｎ Ｒ， Ｂｅｅｒｉ Ｒ， Ｔｚｕｒ Ｓ， Ｂｏｒｍａｎｓ Ｃ， Ｍｏｄａｉ Ｓ， Ｓｈｏｍｒｏｎ Ｎ， Ｓｈｉｌｏｎ Ｙ， Ｂａｎｎｅ Ｅ ｅｔ ａｌ （２０１９） Ｎｏｖｅｌ ＷＷＯＸ ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｃａｕｓｅ ｅａｒｌｙ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ， ｓｅｖｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｅｌａｙ ａｎｄ ｄｙｓｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｍｏｎｇ Ｙｅｍｅｎｉｔｅ Ｊｅｗｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２３： ４１８－４２６
Ｙａｎｇ Ｊ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｗｕ Ｙ， Ｚｈａｏ Ｂｏ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｐａｎ Ｙ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｄｉｎｇ Ｙ， Ｑｉｕ Ｍ， Ｗａｎｇ Ｙ－Ｚ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｅｉｚｕｒｅ－ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｐｅｎｔｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｚｏｌｅ－ｋｉｎｄｌｉｎｇ．Ｇｌｉａ ６４： １０８３－１０９１
Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｓｌｏａｎ Ｓ， Ｃｌａｒｋｅ Ｌ， Ｃａｎｅｄａ Ｃ， Ｐｌａｚａ Ｃ， Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ Ｐ， Ｖｏｇｅｌ Ｈ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｇ， Ｅｄｗａｒｄｓ Ｍ， Ｌｉ Ｇ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｕｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ ８９： ３７－５３
配列
配列番号１：ヒトＷＷＯＸ ｃＤＮＡ（コーディング）配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１６３７３．４）
ａｔｇｇｃ ａｇｃｇｃｔｇｃｇｃ ｔａｃｇｃｇｇｇｇｃ ｔｇｇａｃｇａｃａｃ ｇｇａｃａｇｔｇａｇ ｇａｃｇａｇｃｔｇｃ ｃｔｃｃｇｇｇｃｔｇ ｇｇａｇｇａｇａｇａ ａｃｃａｃｃａａｇｇ ａｃｇｇｃｔｇｇｇｔ ｔｔａｃｔａｃｇｃｃ ａａｔｃａｃａｃｃｇ
ａｇｇａｇａａｇａｃ ｔｃａｇｔｇｇｇａａ ｃａｔｃｃａａａａａ ｃｔｇｇａａａａａｇ ａａａａｃｇａｇｔｇ ｇｃａｇｇａｇａｔｔ
ｔｇｃｃａｔａｃｇｇ ａｔｇｇｇａａｃａａ ｇａａａｃｔｇａｔｇ ａｇａａｃｇｇａｃａ ａｇｔｇｔｔｔｔｔｔ ｇｔｔｇａｃｃａｔａ
ｔａａａｔａａａａｇ ａａｃｃａｃｃｔａｃ ｔｔｇｇａｃｃｃａａ ｇａｃｔｇｇｃｇｔｔ ｔａｃｔｇｔｇｇａｔ ｇａｔａａｔｃｃｇａ
ｃｃａａｇｃｃａａｃ ｃａｃｃｃｇｇｃａａ ａｇａｔａｃｇａｃｇ ｇｃａｇｃａｃｃａｃ ｔｇｃｃａｔｇｇａａ ａｔｔｃｔｃｃａｇｇ ｇｃｃｇｇｇａｔｔｔ ｃａｃｔｇｇｃａａａ ｇｔｇｇｔｔｇｔｇｇ ｔｃａｃｔｇｇａｇｃ ｔａａｔｔｃａｇｇａ ａｔａｇｇｇｔｔｃｇ ａａａｃｃｇｃｃａａ ｇｔｃｔｔｔｔｇｃｃ ｃｔｃｃａｔｇｇｔｇ ｃａｃａｔｇｔｇａｔ ｃｔｔｇｇｃｃｔｇｃ ａｇｇａａｃａｔｇｇ
ｃａａｇｇｇｃｇａｇ ｔｇａａｇｃａｇｔｇ ｔｃａｃｇｃａｔｔｔ ｔａｇａａｇａａｔｇ ｇｃａｔａａａｇｃｃ ａａｇｇｔａｇａａｇ ｃａａｔｇａｃｃｃｔ ｇｇａｃｃｔｃｇｃｔ ｃｔｇｃｔｃｃｇｔａ ｇｃｇｔｇｃａｇｃａ ｔｔｔｔｇｃｔｇａａ ｇｃａｔｔｃａａｇｇ
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配列番号２：ヒトＷＷＯＸアミノ酸配列
ＭＡＡＬＲＹＡＧＬＤＤＴＤＳＥＤＥＬＰＰＧＷＥＥＲＴＴＫＤＧＷＶＹＹＡＮＨＴＥＥＫＴＱＷＥＨＰＫＴＧＫＲＫＲＶＡＧＤＬＰＹＧＷＥＱＥＴＤＥＮＧＱＶＦＦＶＤＨＩＮＫＲＴＴＹＬＤＰＲＬＡＦＴＶＤＤＮＰＴＫＰＴＴＲＱＲＹＤＧＳＴＴＡＭＥＩＬＱＧＲＤＦＴＧＫＶＶＶＶＴＧＡＮＳＧＩＧＦＥＴＡＫＳＦＡＬＨＧＡＨＶＩＬＡＣＲＮＭＡＲＡＳＥＡＶＳＲＩＬＥＥＷＨＫＡＫＶＥＡＭＴＬＤＬＡＬＬＲＳＶＱＨＦＡＥＡＦＫＡＫＮＶＰＬＨＶＬＶＣＮＡＡＴＦＡＬＰＷＳＬＴＫＤＧＬＥＴＴＦＱＶＮＨＬＧＨＦＹＬＶＱＬＬＱＤＶＬＣＲＳＡＰＡＲＶＩＶＶＳＳＥＳＨＲＦＴＤＩＮＤＳＬＧＫＬＤＦＳＲＬＳＰＴＫＮＤＹＷＡＭＬＡＹＮＲＳＫＬＣＮＩＬＦＳＮＥＬＨＲＲＬＳＰＲＧＶＴＳＮＡＶＨＰＧＮＭＭＹＳＮＩＨＲＳＷＷＶＹＴＬＬＦＴＬＡＲＰＦＴＫＳＭＱＱＧＡＡＴＴＶＹＣＡＡＶＰＥＬＥＧＬＧＧＭＹＦＮＮＣＣＲＣＭＰＳＰＥＡＱＳＥＥＴＡＲＴＬＷＡＬＳＥＲＬＩＱＥＲＬＧＳＱＳＧ
配列番号３：ヒトＷＷＯＸ ｃＤＮＡ（全体）
ＧＣＡＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＣＣＣＧＡＣＧＣＧＣＧＣＧＧＧＴＣＴＣＧＴＴＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＣＡＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＴＴＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＴＧＴＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＴＣＡＣＧＴＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＣＴＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＴＡＡＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣＧＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＧＣＡＡＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＣＡＴＡＧＧＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＧＴＴＣＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＣＴＡＣＴＴＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＡＣＧＣＡＧＡＡＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＡＧＡＣＴＣＣＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＧＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＧＡＴＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＴＡＴＡＴＡＣＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＴＡＧＴＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＴＡＴＧＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＣＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡ
配列番号４：ヒトシナプシンＩプロモーターの配列
ａｃ ｔａｃａａａｃｃｇａ ｇｔａｔｃｔｇｃａｇ ａｇｇｇｃｃｃｔｇｃ ｇｔａｔｇａｇｔｇｃ ａａｇｔｇｇｇｔｔｔ ｔａｇｇａｃｃａｇｇ ａｔｇａｇｇｃｇｇｇ ｇｔｇｇｇｇｇｔｇｃ ｃｔａｃｃｔｇａｃｇ ａｃｃｇａｃｃｃｃｇ ａｃｃｃａｃｔｇｇａ ｃａａｇｃａｃｃｃａ ａｃｃｃｃｃａｔｔｃ ｃｃｃａａａｔｔｇｃ ｇｃａｔｃｃｃｃｔａ ｔｃａｇａｇａｇｇｇ ｇｇａｇｇｇｇａａａ ｃａｇｇａｔｇｃｇｇ ｃｇａｇｇｃｇｃｇｔ ｇｃｇｃａｃｔｇｃｃ ａｇｃｔｔｃａｇｃａ ｃｃｇｃｇｇａｃａｇ ｔｇｃｃｔｔｃｇｃｃ ｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃ ｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃ ａｃｃｇｃｃｇｃｃｔ ｃａｇｃａｃｔｇａａ ｇｇｃｇｃｇｃｔｇａ ｃｇｔｃａｃｔｃｇｃ ｃｇｇｔｃｃｃｃｃｇ ｃａａａｃｔｃｃｃｃ ｔｔｃｃｃｇｇｃｃａ ｃｃｔｔｇｇｔｃｇｃ ｇｔｃｃｇｃｇｃｃｇ ｃｃｇｃｃｇｇｃｃｃ ａｇｃｃｇｇａｃｃｇ ｃａｃｃａｃｇｃｇａ ｇｇｃｇｃｇａｇａｔ ａｇｇｇｇｇｇｃａｃ ｇｇｇｃｇｃｇａｃｃ ａｔｃｔｇｃｇｃｔｇ ｃｇｇｃｇｃｃｇｇｃ ｇａｃｔｃａｇｃｇｃ ｔｇｃｃｔｃａｇｔｃ ｔｇｃｇｇｔｇｇｇｃ ａｇｃｇｇａｇｇａｇ ｔｃｇｔｇｔｃｇｔｇ ｃｃｔｇａｇａｇｃｇ ｃａｇｃｔｇｔｇｃｔ ｃｃｔｇｇｇｃａｃｃ ｇｃｇｃａｇｔｃｃｇ ｃｃｃｃｃｇｃｇｇｃ ｔｃｃｔｇｇｃｃａｇ ａｃｃａｃｃｃｃｔａ ｇｇａｃｃｃｃｃｔｇ ｃｃｃｃａａｇｔｃｇ ｃａｇｃｃｔｔｃｇａ
配列番号５：シナプシン１／ＷＷＯＸ ｃＤＮＡ構築物（太字フォント－最小ＳｙｎＩプロモーター、下線－ヒトＷＷＯＸ ｃＤＮＡ、通常フォント－ＡＡＶ９ベクター）
Figure 2023537093000001
Figure 2023537093000002
Figure 2023537093000003

Claims (48)

  1. ＷＷドメイン含有オキシドリダクターゼ（ＷＷＯＸ）関連ＣＮＳ疾患の治療方法であって、前記方法が、そのような治療を必要とする患者の脳に、前記脳内でＷＷＯＸを発現させる調節エレメントの制御下のＷＷＯＸ野生型遺伝子、またはその機能的誘導体を投与することを含む、前記治療方法。
  2. 前記ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患が、ＷＷＯＸ関連てんかん性脳症（ＷＯＲＥＥ）症候群、脊髄小脳失調症、常染色体劣性１２（ＳＣＡＲ１２）、アルツハイマー病、ウエスト症候群、自閉症、多発性硬化症及び性分化疾患（ＤＳＤ）から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＷＷＯＸ関連ＣＮＳ疾患が、ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記患者が、ＷＷＯＸの複合ヘテロ接合変異を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記調節エレメントが、ニューロンにおいて前記ＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記プロモーターがユニバーサルプロモーターである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、Ｅ２Ｆ１プロモーター、及びＵ１ｓｎＲＮＡプロモーター、またはそれらの誘導体である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記調節エレメントが、ニューロンで特異的に発現するプロモーターである、請求項５に記載の方法。
  9. 前記プロモーターが、シナプシンＩプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＮＳＥプロモーター、及びＨｂ９プロモーター、またはそれらの誘導体から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記プロモーターが、グリア細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記プロモーターが、オリゴデンドロサイト及び／または星状細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記調節エレメントが、シナプシンＩプロモーターまたはその誘導体である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記調節エレメントが、オリゴデンドロサイトにおいて前記ＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記プロモーターが、ＭＢＰプロモーター、ＰＬＰ１プロモーター、及びＣＮＰプロモーター、またはそれらの誘導体から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記調節エレメントが、星状細胞において前記ＷＷＯＸ遺伝子の発現を指示するプロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記プロモーターが、ＧＦＡＰプロモーターもしくはＳ１００ｂプロモーター、またはそれらの誘導体である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記プロモーターが、１つ以上のエンハンサー配列をさらに含む、請求項５～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記ＷＷＯＸ遺伝子が、ｍＲＮＡの安定性を高める非翻訳配列を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子を、１つ以上の検出可能な標識と共に送達する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記検出可能な標識が、コード化された蛍光タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、リポナノ粒子、またはエキソソームを使用して送達する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、Ｃａｓ酵素またはＣａｓ酵素をコードするポリヌクレオチド、及びｇＲＮＡまたは前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと共に送達して、前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその部分の挿入を指示する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ウイルスベクターによって送達する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達系である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＡＡＶ送達系がＡＡＶ９である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子が、１つ以上のイントロンを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子がｃＤＮＡである、請求項２６に記載の方法。
  29. 調節エレメントの制御下にある前記ＷＷＯＸ野生型遺伝子またはその機能的誘導体が、配列番号１または３に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記投与が、実質への直接注射、脳室内を介した脳脊髄液への注射、及び髄腔内（大槽または腰部）経路から選択される経路による、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 個体が、小児患者または新生児患者である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記個体が成人患者である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記患者が、成長障害、てんかん発作、認知機能障害、社会的機能障害、生殖障害、運動失調、網膜症、精神遅滞、及び小頭症から選択される１つ以上の症状を示す、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 投与エピソードが３回以下である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 投与エピソードが２回以下である、請求項３４に記載の方法。
  36. 投与エピソードが１回である、請求項３４に記載の方法。
  37. ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２の治療方法であって、前記方法が、そのような治療を必要とする患者の脳に、シナプシン－１プロモーターの制御下にあるＷＷＯＸ野生型遺伝子を含むＡＡＶ９遺伝子送達系を投与することを含む、前記治療方法。
  38. 前記ＡＡＶ９送達系が、配列番号１または配列番号３に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. ニューロン特異的プロモーターの発現制御下にあるＷＷＯＸ野生型遺伝子、またはその機能的誘導体を含む、発現構築物。
  40. 前記プロモーターが、シナプシン１プロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＮＳＥプロモーター、及びＨｂ９プロモーター、またはそれらの誘導体から選択される、請求項３９に記載の発現構築物。
  41. 前記プロモーターが、シナプシン１またはその誘導体である、請求項４０に記載の発現構築物。
  42. 配列番号１、３、４、または５に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の発現構築物。
  43. 前記発現構築物がウイルスベクターである、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の発現構築物。
  44. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４３に記載の発現構築物。
  45. 前記ＡＡＶがＡＡＶ９である、請求項４４に記載の発現構築物。
  46. 請求項３９～４５のいずれか１項に記載の発現構築物、及び脳への直接注射に適した薬学的に許容される担体を含む、前記脳への直接投与のための医薬組成物。
  47. 請求項４６に記載の医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含む、ＷＯＲＥＥ症候群またはＳＣＡＲ１２の治療方法。
  48. 前記ＷＯＲＥＥまたは前記ＳＣＡＲ１２の治療における、請求項４６に記載の医薬組成物の使用。
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