JP2023537093A - Wwox関連疾患の治療方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、WWドメイン含有オキシドリダクターゼ(WWOX)関連CNS疾患の治療のための方法及び組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、対象の脳において異種WWOX遺伝子を発現させることを含み、また、様々な実施形態において、ニューロンにおいて異種WWOX遺伝子を発現させて、WOREE症候群及びSCAR12などの病態を治療または改善することを含む。
Description
本開示は、WWOX関連疾患の治療方法を包含する。
WWドメイン含有オキシドリダクターゼ(WWOX)の生殖細胞変異は、てんかん、運動失調及び性発達障害(DSD)患者で報告されている。最近では、診断されたアルツハイマー病の遺伝子メタ分析により、WWOX遺伝子が新規リスク遺伝子座として特定されている。WWOX発現が中枢神経系(CNS)の正常な発達と機能に必要であり、WWOXの変異がWWOX関連てんかん性脳症(WOREE)症候群として現在知られている乳児の神経障害を引き起こすことが、いくつかのエビデンスから強く示唆されている。
WOREEでは、常染色体劣性WWOXナンセンス変異、部分的及び完全な欠失が、極めて重篤な疾患に関連しており、非常に早期の死亡をもたらす。WWOXの単一変異対立遺伝子を有するヘテロ接合体の親は、表現型の症状を示さない。これらの保因者が成人てんかんにかかりやすいかどうかはまだ不明である。WOREEを特徴とする患者のほとんどは、WWOXの複合ヘテロ接合変異を保有しているため、各変異を個別に標的とすることが困難である。この疾患の軽度の形態は、WWOXミスセンス変異に関連しており、常染色体劣性脊髄小脳失調症12(SCAR12)と呼ばれる。WWOXがCNSの恒常性を調節するメカニズムはほとんど知られていない。WWOXが、てんかんや他の形態の神経障害に拮抗する他の主要なエフェクターの下流にあるかどうかもまた不明である。
また、最近のエビデンスでは、WWOXのわずかな変異が自閉症スペクトラム障害(ASD)と関連付けられている。WWOXとオーバーラップするコピー数バリアント(CNV)が、ASD候補遺伝子としてWWOXを定義する正常範囲に近い、より軽度の表現型とIQレベルを特徴とする多くのASD罹患者で報告された。WWOXを継承したCNVは、低浸透度のASDリスク因子であると判定された。さらに、多発性硬化症患者試料のメガ分析により、WWOXのバリアントを含む200を上回る常染色体性感受性バリアントが明らかとなった。したがって、WWOXの摂動は単一の神経疾患を超えており、WWOXがいくつかの神経疾患の重要なプレーヤーであることを示唆している。
本開示は、WWOX関連CNS疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、対象の脳において異種WWOX遺伝子を発現させることを含み、様々な実施形態において、ニューロンにおいて異種WWOX遺伝子を発現させて、WOREE症候群及びSCAR12などの病態を治療または改善することを含む。
いくつかの実施形態では、WWOX遺伝子は、ニューロンにおけるWWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターを含む1つ以上の調節エレメントを含む。例えば、プロモーターは、ユニバーサルプロモーターまたはニューロン特異的プロモーターであり得る。例示的なニューロン特異的プロモーターは、シナプシンIプロモーターである。様々な実施形態において、WWOX遺伝子は、野生型遺伝子または機能的誘導体であり、mRNAの安定性を高める非翻訳配列(例えば、3’-UTR内の)を含む。
いくつかの実施形態では、治療される個体は、小児患者または新生児患者(例えば、WOREEまたはSCAR12を有する患者)である。いくつかの実施形態では、早期治療は、疾患のいくつかの臨床パラメータの発現を予防する。いくつかの実施形態では、個体は成人患者(例えば、WOREEまたはSCAR12を有する)であり、治療は、てんかん発作などの1つ以上の臨床パラメータを改善することができる。様々な実施形態において、治療は、てんかん発作の頻度及び/または重症度を実質的に減少させる。
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、WOREE症候群またはSCAR12の治療方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする患者の脳に、シナプシンIプロモーターの制御下のWWOX野生型遺伝子を含むAAV9遺伝子送達系を投与することを含む。AAV9送達系は、配列番号1、配列番号3、配列番号4、及び/または配列番号5に記載のヌクレオチド配列を実質的に含む。
他の態様では、本開示は、ニューロン特異的プロモーターの発現制御下にあるWWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を含む発現構築物を提供する。例示的なニューロン特異的プロモーターは、シナプシンIプロモーターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号1、3、4、及び/または5に記載の配列を実質的に含む。様々な実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス(AAV)送達系などのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、発現構築物はAAV9送達系である。
本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び実施例によって明白となろう。
本開示は、WWドメイン含有オキシドリダクターゼ(WWOX)関連CNS疾患の治療のための方法及び組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、対象の脳において異種WWOX遺伝子を発現させることを含み、また、様々な実施形態において、ニューロンにおいて異種WWOX遺伝子を発現させて、WOREE症候群及びSCAR12などの病態を治療または改善することを含む。
用語「WWOX関連CNS疾患」とは、突然変異したWWOX遺伝子または異常なWWOX発現に起因するかまたは関連する疾患を指す。突然変異は、タンパク質の損失または短縮化をもたらす完全または部分的なゲノムの欠失(ナンセンス突然変異)、またはより軽度の条件ではミスセンス突然変異を生じさせ得る。これらの疾患は、CNSに現れる疾患である。そのような疾患の例は、WWOX関連てんかん性脳症(WOREE)症候群、脊髄小脳失調症、常染色体劣性12(SCAR12)、多発性硬化症、アルツハイマー病、ウエスト症候群、自閉症、及び性分化疾患(DSD)である。
特定の態様では、本発明は、WWOX関連CNS疾患の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする患者の脳に、脳内にWWOXの発現をもたらす調節エレメント(複数可)の制御下にあるWWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を投与することを含む。様々な実施形態において、WWOX関連CNS疾患は、WOREE症候群、SCAR12、アルツハイマー病、ウエスト症候群、自閉症、多発性硬化症及びDSDから選択される。
いくつかの実施形態では、WWOX関連CNS疾患は、WOREE症候群またはSCAR12である。いくつかのそのような実施形態では、患者は、WWOXの複合ヘテロ接合変異を有する。
本開示に関する用語「治療」または「治療すること」とは、疾患に関連する少なくとも1つの臨床パラメータを改善することを指し、疾患(または疾患の1つ以上の臨床パラメータ)の発現の予防をさらに含む。用語「治療」または「治療すること」はまた、生存率、成長、てんかん発作の数または頻度、認知機能、社会的機能(例えば、自閉症における)生殖能力、運動失調、網膜症、精神遅滞、及び小頭症など、疾患の少なくとも1つの症状または態様を改善する(非治療対象と比較して)ことも指す。
用語「WWOX野生型遺伝子」とは、配列番号1によって表されるWWOXコード配列または配列番号2によって表されるWWOXコード配列を含む遺伝子を指す。用語「WWOX野生型遺伝子」は、cDNA配列(配列番号1によって表される)をさらに含むか、または1つ以上のイントロンを有する遺伝子配列を含む。例えば、イントロンを含む完全な遺伝子配列は、NCBI参照配列NC_000016.10で表される。用語「WWOX野生型遺伝子」はさらに、疾患またはWWOXの機能もしくは発現の喪失に関連しない、ヒト集団における天然のヌクレオチド多型またはアミノ酸修飾(それぞれ、配列番号1または配列番号2に関して)を含む。様々な実施形態において、WWOX遺伝子は、WWOX野生型遺伝子の機能的等価体であり得、すなわち、WWOX遺伝子は、挿入、欠失、または置換から独立して選択され、WWOXの活性または発現(例えば、ニューロンにおける)に有意な影響を与えない1つ以上のアミノ酸改変(1、2、3、4、または5つのアミノ酸改変など)をコードし得る。一般に、機能的誘導体は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。WWOX野生型遺伝子は、プロモーターならびに5’及び3’非翻訳領域を含む調節エレメントをさらに含み得るが、これらの調節エレメントは、天然のWWOX遺伝子配列に限定されないが、代わりに、所望のレベルのmRNA発現もしくはターンオーバー、及び/または所望の細胞特異性の遺伝子発現を達成するように選択され得る。いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子は、実質的な非翻訳領域を含まず、すなわち、WWOXコード配列から本質的になるか、またはそれからなり得る。本発明の実施形態によれば、WWOX野生型遺伝子は、少なくとも異種プロモーターを含む。本明細書中で使用される場合、「異種プロモーター」は、非天然の位置に、例えば、天然においては制御しないコード配列の発現を制御する位置に配置されるプロモーターである。
いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子はcDNA配列であり、いくつかの実施形態では、そのcDNA配列は、配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列を含む。
用語「プロモーター」とは、RNAの発現、例えば、WWOX野生型遺伝子の転写を制御することができるDNA配列を指す。プロモーター配列は、遺伝子発現を制御するための少なくとも近位エレメントを含み、任意選択で、より遠位の上流エレメントをさらに含んでもよく、後者のエレメントは多くの場合、エンハンサーと呼ばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるDNA配列であるか、あるいはプロモーターの生来のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントである。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、または自然界に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントからなり得るか、または合成DNAセグメントを含むことさえある。さらに、調節配列の正確な境界が完全に定義されていない場合があり、したがって、いくつかのバリエーションのDNA断片が同一のプロモーター活性を有している場合があることが認識されている。
いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ニューロンにおけるWWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターを含む。例えば、プロモーターは、ユニバーサルプロモーターであり得る。ユニバーサルプロモーターの例としては、CMVプロモーター、E2F1プロモーター、及びU1snRNAプロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターはユニバーサルプロモーターであり、構築物はニューロンに特異的または選択的に送達される。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ニューロンで特異的に発現するプロモーター(ニューロン特異的プロモーター)である。例示的なニューロン特異的プロモーターとしては、シナプシンIプロモーター、CamKIIプロモーター、MeCP2プロモーター、NSEプロモーター、及びHb9プロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、グリア細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、オリゴデンドロサイト及び/または星状細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する。
いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ニューロン特異的発現を指示するためのシナプシンIプロモーター、またはその機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、GeneBank登録番号NM_006950(配列番号4)によって表されるシナプシンIプロモーターであり、このプロモーターは、高度にニューロン特異的かつ長期的な導入遺伝子の発現を付与する。シナプシンIプロモーターの構造は、Schloch et al.,Neutron-specific Gene Expression of Synapsin I,J.Biol.Chem.271(6):3317-3323(1996)に記載されている。様々な実施形態において、シナプシンIプロモーターは、ニューロン特異的発現を付与するNRSE/RE-1配列を含む機能的誘導体である。様々な実施形態において、シナプシンIプロモーターは、配列番号4の3’末端の少なくとも約250ヌクレオチド、または少なくとも約300ヌクレオチド、または少なくとも約350ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。シナプシンIプロモーター(またはその部分)は、プロモーターのニューロン特異的またはニューロン選択的発現が維持される限り、最大約20%、または最大約10%、または最大約5%のヌクレオチド修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、調節エレメントの制御下にあるWWOX野生型遺伝子、またはその機能的誘導体は、配列番号5に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態では、調節エレメントは、オリゴデンドロサイトにおいてWWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターである。例示的なプロモーターとしては、MBPプロモーター、PLP1プロモーター、及びCNPプロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、星状細胞においてWWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターを含む。例示的なプロモーターとして、GFAPプロモーターまたはS100bプロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子またはプロモーターは、シナプシンIプロモーターまたは他のニューロン特異的プロモーターの遠位部分を含み得る1つ以上のエンハンサー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニューロンにおける発現レベルを増加させるための1つ以上のニューロン特異的またはニューロン選択的エンハンサーを含む。例えば、Charron G.et al.,Multiple Neuron-specific Enhancers in the Gene Coding for the Human Neurofilament Light Chain. J.Biol.Chem.270(51):3064-30610(1995)を参照のこと。
様々な実施形態において、WWOX野生型遺伝子または機能的誘導体は、mRNAの安定性を高める非翻訳配列(例えば、3’-UTR)を含む。例えば、いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子は、β-グロビンmRNA 3’-UTR、またはmRNA安定性を付与するβ-グロビンmRNA 3’-UTRの構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子は、ニューロンにおいて低いターンオーバーを示すmRNA由来の3’非翻訳配列を含む。いくつかの実施形態では、転写されたWWOXヌクレオチド配列は、安定性を高めることができる1つ以上のウッドチャック肝炎転写後調節エレメント(WPRE)を含む。いくつかの実施形態におけるWPREは、WWOX遺伝子の3’UTRに含まれる。
いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子を、WWOX含有発現構築物の発現の可視化を可能にする、GFPまたはRFPなどの蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない1つ以上の検出可能な標識と共に送達する。
いくつかの態様では、WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体(またはその断片)を、Casエンドヌクレアーゼ酵素またはCasエンドヌクレアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、及びガイドRNA(gRNA)またはgRNAをコードするポリヌクレオチドと共に送達して、WWOX野生型遺伝子またはその部分の挿入を誘導または増強する。いくつかの実施形態では、WWOX関連CNS疾患は、WWOXにおける既知の突然変異によって特徴付けられる。そのような実施形態では、変異領域に相補的なgRNA、または前記gRNAをコードするDNA配列を、Casエンドヌクレアーゼと共に送達する。これらの実施形態では、WWOX野生型遺伝子は、Casエンドヌクレアーゼ酵素(例えば、Cas9)によって切断された突然変異配列を置換するためのWWOX野生型遺伝子の断片であってもよい。
例えば、個体におけるWWOX遺伝子の正確な突然変異が知られている場合、その個体の脳にCasエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)酵素及び突然変異配列を標的とするgRNAを投与することによって、その個体を治療し、それにより、変異配列を編集して、変異領域を切断することにより、及び/または変異領域の配列を野生型領域の配列に置換することにより、野生型に戻すことができる。いくつかの変異では、Casエンドヌクレアーゼによる突然変異配列の切断だけで、機能的なWWOX遺伝子が得られる。他の突然変異については、突然変異配列を切断するだけでなく、それを野生型配列(WWOX野生型遺伝子の断片)で置き換える必要がある。そのような場合、この方法はまた、WWOX野生型遺伝子の断片に対応するドナーDNA配列を投与して、突然変異配列を置換することも含む。
いくつかの実施形態では、Casエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)を、タンパク質として脳細胞に投与してもよく、または脳細胞(例えば、ニューロン)において発現可能な酵素をコードするポリヌクレオチドとして投与してもよい。いくつかの実施形態では、Casエンドヌクレアーゼを、本明細書に記載されるように、ニューロン特異的プロモーター(例えば、シナプシンIプロモーター)を介して発現させる。いくつかの実施形態では、CasエンドヌクレアーゼをmRNAとして送達し、したがってトランスフェクトされた細胞において転写を必要としない。
Casエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用する場合、WWOX遺伝子について本明細書に記載されるプロモーター及び送達ベクターを使用してもよく、またはより長いポリヌクレオチドを送達することができる送達ベクター(Casエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの送達に、より好適であり得る)、例えば、AAV6及びレンチウイルスベクターを使用してもよい。Casエンドヌクレアーゼをタンパク質として送達する場合、脳への(例えば、ニューロンへの)その送達に、送達粒子、リポソームなどを使用してもよい。
同様に、WWOX遺伝子について本明細書に記載される送達系及びプロモーター系を使用して、gRNAを、RNA分子として、またはgRNAをコードするDNA分子として送達してもよい。いくつかの実施形態では、gRNAをニューロン特異的プロモーターを介して発現させる。
突然変異したDNAを置換するためのWWOXポリヌクレオチドを、別個の配列として投与することができ、またはCasエンドヌクレアーゼ及びgRNAをコードする配列を含むベクターの一部として送達することができる。そのような場合、例えば、Casエンドヌクレアーゼのサポートを受けてベクターから平滑末端を有するドナーを切り離すことができる「ドナー特異的」ガイドRNAの第2のセットを使用することによって、ドナーDNAをベクターから切り離すことができる。
S.pyogenes及びS.thermophilus Cas9を含む、様々な種のCasエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)分子を、本明細書に記載の方法及び組成物において使用することができる。他のCasエンドヌクレアーゼは、米国特許公開第20160010076号(参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されている。本明細書に記載の構築物及び方法は、Cas9酵素を含む任意のCasエンドヌクレアーゼ、及びそれらに対応するgRNAまたは互換性のある他のgRNAの使用を含み得る。Streptococcus thermophilus LMD-9 CRISPR1系のCas9は、ヒト細胞において機能することが示されている。(Cong et al.,Science 339,819(2013)を参照のこと)。
一般的に、ガイドRNAには2つの異なる系が存在し、Cas9による切断をガイドするために一緒に機能する個別のcrRNAとtracrRNAを使用する系1、及び単一の系で2つの個別のgRNAを組み合わせたキメラcrRNA-tracrRNAハイブリッドを使用する系2である(シングルガイドRNAまたはsgRNAと呼ばれる(Jinek et al.,Science 2012;337:816-821も参照のこと)。tracrRNAは可変的に短縮化することができ、個別の系(系1)とキメラgRNA系(系2)の両方において、様々な長さで機能することが示されている。
Casエンドヌクレアーゼは、5’末端にゲノムDNA標的部位の相補鎖に相補的な17~20ntを有するgRNA、例えばsgRNAまたはtracrRNA/crRNAを使用して、配列NGGの追加のプロトスペーサー隣接モチーフを有する特異的な17~20ntのゲノム標的にガイドされ得る。したがって、実施形態は、標的配列に相補的な、例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば、NGG、NAG、またはNNGGのすぐ5’側の、標的配列に対する相補鎖の25~17、任意選択で20以下のヌクレオチド(nt)、例えば、20、19、18、または17nt、好ましくは17または18ntの配列を5’末端に有する、通常トランスコードされるtracrRNAに融合されたcrRNAを含むシングルガイドRNA、例えば、Mali et al.,Science 2013 Feb.15;339(6121):823-6に記載のシングルCas9ガイドRNAを使用することができる。gRNAには、Cas9へのリボ核酸の結合を妨害しない任意の配列であり得るX.Nを含めることができ、N(RNA中の)は、0~200、例えば、0~100、0~50、または0~20であり得る。
いくつかの実施形態では、gRNAは、3’末端に1つ以上のアデニン(A)またはウラシル(U)ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、gRNAは、RNA PolIII転写を終結させるための終結シグナルとして使用される1つ以上のTの任意の存在の結果として、分子の3’末端に1つ以上のU、例えば、1~8またはそれ以上のUを含む。
いくつかの実施形態では、gRNAは、オフターゲット効果を最小限に抑えるために、ゲノムの残りの任意の配列と少なくとも3つ以上のミスマッチで異なっている部位を標的とする。ロックド核酸(LNA)などの修飾RNAオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドをより好ましい(安定した)立体構造にロックすることにより、RNA-DNAハイブリダイゼーションの特異性を高めることが示されている。したがって、本明細書に開示されるgRNAは、1つ以上の修飾RNAオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に記載の短縮型ガイドRNA分子は、標的配列に相補的なガイドRNAの領域の1つ、いくつかまたはすべてが修飾されており、例えば、ロックド(2’-O-4’-Cメチレン架橋)、5’-メチルシチジン、2’-O-メチル-シュードウリジン、またはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖で置換されている(ペプチド核酸)、例えば合成リボ核酸である。
gRNAは、それ自体として、または発現ベクターで提供してもよい。gRNAを発現させるためのベクターには、gRNAの発現を駆動するRNA Pol IIIプロモーター、例えば、H1、U6または7SKプロモーターを含めることができる。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後の哺乳動物細胞でgRNAを発現させることができる。あるいは、例えばin vitro転写のためにT7プロモーターを使用してもよく、RNAをin vitroで転写させて精製することができる。短いRNA、例えばsiRNA、shRNA、または他の低分子RNAの発現に適したベクターを使用することができる。
配列(プロモーター及び遺伝子、及び任意選択で追加の配列)の送達は、CNSへの直接送達または全身送達のいずれかによる、CNSへの送達に適した任意の送達系によって行うことができる。様々な実施形態において、WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ウイルスベクター、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、脂質ナノ粒子、またはエキソソームを使用して送達する。いくつかの実施形態では、WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ウイルスベクターによって送達する。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)送達系であり得る。いくつかの実施形態では、AAV送達系は、他のAAV血清型よりも良好に血液脳関門を通過するAAV9である。使用してもよいさらなるウイルス送達系としては、レンチウイルス及び単純ヘルペスウイルス送達系が挙げられる。
CNSのための別の好適な送達ビヒクルは、一般的に200nm未満、または約150nm未満、または約100nm未満のサイズを有するナノ粒子を含む。これらには、脂質ベースのナノ粒子、ポリマーナノ粒子、デンドリマー、及び無機ナノ粒子が含まれる場合があり、その一部は血液脳関門(BBB)を通過するように調整され得る。いくつかの実施形態では、送達系は、トランスポーターまたは受容体のリガンドを使用することにより、送達を積極的に標的として、BBBを介したナノ粒子の取り込みを増強する。このアプローチの好ましい経路は、受容体(またはトランスポーター)を介したトランスサイトーシスであり、それによってカーゴ(例えば、ナノ粒子)が脳のECの頂端面と側底面の間で輸送される。例えば、低密度リポタンパク質が、受容体を介したプロセスによってECを介してトランスサイトーシスを受け、リソソームコンパートメントをバイパスして、脳側の側底面で放出される。さらに、BBBにはアミノ酸へのトランスポーターが含まれているため、天然のアルギニントランスポーターを送達に使用することは、脳へ送達するための1つのアプローチである。
脳送達のための別の媒体は、細胞によって分泌される小さな細胞外小胞であるエキソソームである。他の合成ナノ粒子に対するエキソソームの主な利点は、その非免疫原性であり、長く安定した循環をもたらす。
いくつかの実施形態では、脳への送達に化合物または電気刺激を使用し、BBBを一時的に開き、全身投与した高濃度のポリヌクレオチドを脳に到達させることができる。そのような化合物の例は、セレポート(ブラジキニン類似体)またはレガデノソン(アデノシン受容体アゴニスト)である。浸透を高める別の方法は、超音波によるものであり、これは、薬物がBBBを通過しやすくするための魅力的な技術である。非侵襲的技術であるマイクロバブル強化超音波診断法(MEUS)は、薬剤のBBB通過を効果的に支援する。別のアプローチは、経頭蓋磁気刺激法(TMS)であり、これは、ニューロンの活動を刺激し、グルタミン酸の放出を増加させ、BBBを介した送達を促進する。(Xiaowei Don.2018;8(6):1481-149による概説-参照によりその全体が本明細書に援用される)。
所望の送達ビヒクルの投与経路は、(本質的にBBBに進入する粒子またはウイルスベクターを使用して)さらなる操作なしの全身送達であってもよく、または、一時的にBBBを開くための様々な操作(マイクロバブル強化超音波診断法(MEUS)、経頭蓋磁気刺激法(TMS)など)に関連して全身的であってもよい。他の実施形態では、送達は経鼻投与による。
さらに他の実施形態では、脳への送達は、脳室内経路を介した脳脊髄液への送達による。別のオプションは、注射の大槽経路への送達であり、これは脳脊髄液(CSF)への送達の代替方法であり、CNS全体に広範に遺伝子を送達する。いくつかの実施形態では、投与は、実質への直接注射または脳室内を介した脳脊髄液への注射、及び髄腔内(大槽または腰部)経路によるものである。
いくつかの実施形態では、治療される個体は、小児患者または新生児患者(例えば、WOREEまたはSCAR12を有する患者)である。いくつかの実施形態では、早期治療は、成長障害、てんかん発作、認知機能障害、及び精神遅滞などの疾患のいくつかの臨床パラメータの発現を予防する。いくつかの実施形態では、個体は成人患者(例えば、WOREEまたはSCAR12を有する)であり、治療は、てんかん発作などの1つ以上の臨床パラメータを改善することができる。様々な実施形態において、個体または患者は、成長障害、てんかん発作、認知機能障害、社会的機能障害、生殖能力障害、運動失調、網膜症、精神遅滞、及び小頭症から選択される1つ以上の症状を示す。様々な実施形態において、治療は、WOREEまたはSCAR12を有する患者のてんかん発作の頻度及び/または重症度を実質的に減少させる。
様々な実施形態において、個体への投与エピソードは、10回、9回、8回、7回、6回、5回、または4回を超えない。様々な実施形態において、投与エピソードは3回以下である。いくつかの実施形態では、投与エピソードは2回以下である。例えば、様々な実施形態において、投与エピソードは1回である。
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、WOREE症候群またはSCAR12の治療方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする患者の脳に、シナプシンIプロモーターの制御下のWWOX野生型遺伝子(すなわち、配列番号2のポリペプチドをコードする)を含むAAV9遺伝子送達系を投与することを含む。AAV9送達系は、配列番号1、配列番号3、配列番号4、及び/または配列番号5に記載のヌクレオチド配列を実質的に含む。
他の態様では、本開示は、ニューロン特異的プロモーターの発現制御下にあるWWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を含む発現構築物を提供する。例示的なニューロン特異的プロモーターとしては、シナプシンIプロモーター、CamKIIプロモーター、MeCP2プロモーター、NSEプロモーター、及びHb9プロモーター、またはそれらの誘導体が挙げられる。様々な実施形態において、プロモーターは、既に記載したシナプシンIまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5及び/または5に実質的に記載される配列を含む。
様々な実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス(AAV)送達系などのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、発現構築物はAAV9送達系である。そのようなベクターの特定の例を図7Aに示す。
いくつかの実施形態では、発現構築物を、脳への投与のための医薬組成物に含有させる。組成物は、脳もしくはCNSへの直接注射、または全身投与を含む注射に適した薬学的に許容される担体をさらに含む。
さらに他の態様では、本発明は、治療を必要とする患者に医薬組成物を投与することを含む、WOREE症候群またはSCAR12の治療方法を提供する。したがって、本発明は、WOREEまたはSCAR12の治療における医薬組成物の使用を提供する。
定義
本出願をより完全に理解するために、いくつかの定義を以下に記載する。そのような定義は、文法上の同等物を包含することを意図している。
本出願をより完全に理解するために、いくつかの定義を以下に記載する。そのような定義は、文法上の同等物を包含することを意図している。
用語「a」または「an」とは、その実体の1つ以上を指し、すなわち、複数の指示対象を指し得る。したがって、用語「a」(または「an」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」は、本明細書では同じ意味で使用される。さらに、不定冠詞「a」または「an」による「要素」への言及は、要素が1つだけ存在することが文脈上明らかに必要でない限り、2つ以上の要素が存在する可能性を排除するものではない。
2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する用語「同一性」とは、以下に記載する配列比較アルゴリズム(例えば、BLASTP及びBLASTNまたは当業者が利用可能な他のアルゴリズム)のうちの1つを用いて、または目視検査によって測定されるように、最大の対応付けについて比較し、アラインする場合に、同一である特定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。
用語「約」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、関連する値の±10%を意味する。
実施例1:WOREE症候群に関連するWwoxのニューロン欠失は、てんかん及びミエリン欠損を引き起こす
WWドメインを含むオキシドリダクターゼ(WWOX)遺伝子は、最も活発な染色体脆弱部位の1つであるFRA16Dを包含する染色体16q23.1-q23.2にマッピングされる。1,2WWOXは、46kDaのタンパク質をコードしており、そのタンパク質間相互作用の能力により、いくつかのタイプのがんで腫瘍抑制機能が示されている。3,4実際、WWOXは、足場タンパク質として働き、そのパートナーの局在化、安定性及び機能を調節する。5複数のエビデンスから、WWOX機能は、ゲノム安定性、細胞代謝、及び細胞骨格組織の維持と関連付けられている。1,3,6,7驚くべきことに、中枢神経系(CNS)の細胞内で高発現レベルのWWOXが観察されており8,9、CNS生物学におけるWWOXの重要な役割が示唆されている。しかしながら、CNSの開発と疾患におけるWWOXの正確な役割は不明である。
WWドメインを含むオキシドリダクターゼ(WWOX)遺伝子は、最も活発な染色体脆弱部位の1つであるFRA16Dを包含する染色体16q23.1-q23.2にマッピングされる。1,2WWOXは、46kDaのタンパク質をコードしており、そのタンパク質間相互作用の能力により、いくつかのタイプのがんで腫瘍抑制機能が示されている。3,4実際、WWOXは、足場タンパク質として働き、そのパートナーの局在化、安定性及び機能を調節する。5複数のエビデンスから、WWOX機能は、ゲノム安定性、細胞代謝、及び細胞骨格組織の維持と関連付けられている。1,3,6,7驚くべきことに、中枢神経系(CNS)の細胞内で高発現レベルのWWOXが観察されており8,9、CNS生物学におけるWWOXの重要な役割が示唆されている。しかしながら、CNSの開発と疾患におけるWWOXの正確な役割は不明である。
近年、WWOX遺伝子における生殖細胞系劣性突然変異(ミスセンス、ナンセンス、部分欠失/完全欠失)が、SCAR12(脊髄小脳失調症、常染色体劣性-12、OMIM614322)及びWOREE症候群(WWOX関連てんかん性脳症)と関連しており、後者は早期乳児てんかん性脳症-28(EIEE28、OMIM616211)としても知られる。10,11この疾患の重症度は、突然変異の種類とそのWWOX発現への影響に大きく依存すると推論された。例えば、最も深刻な表現型は、WOREE症候群の小児で観察され、WWOXが完全に失われ、難治性発作や出生前または出生後の致死をもたらした。10主にWWOXのミスセンス変異に起因するSCAR12患者は、運動失調やてんかんなどの軽度の表現型を示した。10,11最近、不整脈を伴う癲癇性けいれんを特徴とするウエスト症候群の患者でもWWOX変異が発見された12,13。WWOXに変異を有する小児の脳磁気共鳴画像(MRI)からは、ほとんどの場合で、脳梁の形成不全、進行性脳萎縮、髄鞘形成の遅延及び視神経萎縮などの異常が明らかになった。10,14-18WWOXにおける欠損がどのようにしてこれらの神経学的異常を引き起こすかは、ほとんどわかっていない。
マウスWwoxの標的欠失及びLdeラットにおけるWwox自然突然変異は、てんかん発作、成長遅延、運動失調及び出生後の致死を含む複雑なヒトの神経学的表現型を表現型模写した11,19-21。Wwoxモデル及びヒト疾患における主要な細胞プレーヤー及び分子プレーヤーにさらに光を当てるために、神経幹細胞及び前駆細胞(ネスチン-Cre;N-KOを使用)、成熟ニューロン(シナプシンI-Cre;S-KO)、オリゴデンドロサイト(Olig2-Cre;O-KO)または星状細胞(GFAP-Cre;G-KO)のいずれかにWwox欠損を有するマウスモデルを条件付きで生成し、以前に記載したWwox-nullマウスと共に、それらの表現型及び疾患メカニズムを研究した。19,20驚くべきことに、神経幹細胞及び前駆細胞(N-KO)またはニューロン細胞(S-KOマウス)のいずれかにおけるWwoxの欠損により、3~4週間までに重度のてんかん、運動失調、及び早期死亡が示され、Wwox-nullマウスで観察された表現型が再現されることが判明した。S-KOマウスの分子的及び細胞的変化の特徴決定により、WWOXの非細胞自律機能に起因する顕著な髄鞘形成不全及び成熟オリゴデンドロサイト数の減少が明らかになった。さらに、ヒト胚性幹細胞(hESC)におけるWWOXの完全な喪失とヒトオリゴ皮質スフェロイド(OS)の生成をモデル化することにより、てんかん及び髄鞘形成不全におけるWWOXの役割がさらに確認された。これらの調査結果は、CNS生物学におけるWWOXの中心的な役割と、WWOX関連神経障害の治療におけるその治療可能性を強調するものである。
材料及び方法
細胞培養及びプラスミド
FGF/KOSR条件下、放射線照射したDR4マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダープレート上で、WiBR3 hES細胞を5%CO2条件下で維持した:15%Knockout Serum Replacement(KOSR,Gibco;10828-028)、1%GlutaMax(Gibco;35050-038)、1%MEM非必須アミノ酸(NEAA,Biological Industries;01-340-1B)、1%ピルビン酸ナトリウム(Biological Industries;03-042-1B)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S,Biological Industries;03-031-113)、及び8ng/mLのbFGF(Peprotech;100-18B)を補充したDMEM-F12(Gibco;21331-020またはBiological Industries;01-170-1A)。培地は毎日交換し、C型トリプシン(Biological Industries;03-053-1B)によるトリプシン処理により、培養物を5~7日ごとに継代した。トリプシン処理後24~48時間、hESCを10μM濃度のRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi、Y27632としても知られる)(Cayman;10005583)で処理した。hESCのトランスフェクションのために、エレクトロポレーションの24時間前に細胞を10μM ROCKiで培養した。トリプシンC溶液を使用して細胞を剥離させ、合計100μgのDNA構築物(エキソン1を標的とするsgRNAを含むpx330プラスミドをpNTK-GFPと1:5の比で混合された)と混合したPBS(Ca2+及びMg2+を含有する)中に再懸濁し、Gene Pulser Xcell System(Bio-Rad;250V,500μF,0.4cmキュベット)でエレクトロポレーションした。続いて、細胞を上記の条件でMEFフィーダー層にプレーティングした。48時間後、GFP陽性細胞を選別し、続いて約10日後に、コロニー分離のためにMEFフィーダープレート上にまばらに(10cmプレートあたり2,000細胞)播種した。
細胞培養及びプラスミド
FGF/KOSR条件下、放射線照射したDR4マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダープレート上で、WiBR3 hES細胞を5%CO2条件下で維持した:15%Knockout Serum Replacement(KOSR,Gibco;10828-028)、1%GlutaMax(Gibco;35050-038)、1%MEM非必須アミノ酸(NEAA,Biological Industries;01-340-1B)、1%ピルビン酸ナトリウム(Biological Industries;03-042-1B)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S,Biological Industries;03-031-113)、及び8ng/mLのbFGF(Peprotech;100-18B)を補充したDMEM-F12(Gibco;21331-020またはBiological Industries;01-170-1A)。培地は毎日交換し、C型トリプシン(Biological Industries;03-053-1B)によるトリプシン処理により、培養物を5~7日ごとに継代した。トリプシン処理後24~48時間、hESCを10μM濃度のRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi、Y27632としても知られる)(Cayman;10005583)で処理した。hESCのトランスフェクションのために、エレクトロポレーションの24時間前に細胞を10μM ROCKiで培養した。トリプシンC溶液を使用して細胞を剥離させ、合計100μgのDNA構築物(エキソン1を標的とするsgRNAを含むpx330プラスミドをpNTK-GFPと1:5の比で混合された)と混合したPBS(Ca2+及びMg2+を含有する)中に再懸濁し、Gene Pulser Xcell System(Bio-Rad;250V,500μF,0.4cmキュベット)でエレクトロポレーションした。続いて、細胞を上記の条件でMEFフィーダー層にプレーティングした。48時間後、GFP陽性細胞を選別し、続いて約10日後に、コロニー分離のためにMEFフィーダープレート上にまばらに(10cmプレートあたり2,000細胞)播種した。
マウス
Wwox nullマウスの生成は以前に報告されており19、これらのマウスをFVBバックグラウンドで維持した。Wwoxゲノム遺伝子座のエキソン1に隣接する2つのloxp部位を保有するマウス(Wwoxflox/flox)は、以前に記載されている22。現在の研究では、これらのマウスを使用して、CNS細胞のWWOX発現を条件付きで除去した。ネスチンのプロモーター下でトランスジェニックCreリコンビナーゼを保有するマウス(起源Jax系統株:003771、B6.Cg-Tg(Nes-cre)1Kln/J)は、ヘブライ大学ハダサー歯科大学医学部のTal Burstyn-Cohen博士からの寛大な贈り物である。シナプシンI-Cre(ストック:003966,B6.Cg-Tg(Syn1-cre)671Jxm/J)、Olig2-Cre(ストック:025567,B6.129-Olig2tm1.1(cre)Wdr/J)及びGFAP-Cre(B6.Cg-Tg(Gfap-cre)77.6Mvs/2J)マウス系統は、米国ジャクソン研究所から購入した。トランスジェニックCreリコンビナーゼを保有するWwoxflox/floxマウスは、Wwoxのホモ接合条件付き欠損と見なされ、N-KO(Wwoxflox/flox;ネスチン-Cre+)、S-KO(Wwoxflox/flox;シナプシン-Cre+)、O-KO(Wwoxflox/flox;Olig2cre/+)及びG-KO(Wwoxflox/flox;Gfap-Cre+)として表される。すべてのマウスは、特定のプライマーを使用して尾/耳のDNAを抽出することにより、PCR遺伝子型を決定した。すべての条件付きモデルは、C57BL6/J;129sv混合遺伝的バックグラウンドで維持した。すべての条件付きモデルは、Rosa26-loxp-STOP-tdTomatoレポーター対立遺伝子を含んでいた。動物は、SPFユニット内で、12時間の明/暗サイクルで、食物と水を自由に摂取させて維持した。すべての動物関連の実験は、ヘブライ大学のInstitutional Animal Care Use Committee(HU-IACUC)の事前承認に従って行われた。
Wwox nullマウスの生成は以前に報告されており19、これらのマウスをFVBバックグラウンドで維持した。Wwoxゲノム遺伝子座のエキソン1に隣接する2つのloxp部位を保有するマウス(Wwoxflox/flox)は、以前に記載されている22。現在の研究では、これらのマウスを使用して、CNS細胞のWWOX発現を条件付きで除去した。ネスチンのプロモーター下でトランスジェニックCreリコンビナーゼを保有するマウス(起源Jax系統株:003771、B6.Cg-Tg(Nes-cre)1Kln/J)は、ヘブライ大学ハダサー歯科大学医学部のTal Burstyn-Cohen博士からの寛大な贈り物である。シナプシンI-Cre(ストック:003966,B6.Cg-Tg(Syn1-cre)671Jxm/J)、Olig2-Cre(ストック:025567,B6.129-Olig2tm1.1(cre)Wdr/J)及びGFAP-Cre(B6.Cg-Tg(Gfap-cre)77.6Mvs/2J)マウス系統は、米国ジャクソン研究所から購入した。トランスジェニックCreリコンビナーゼを保有するWwoxflox/floxマウスは、Wwoxのホモ接合条件付き欠損と見なされ、N-KO(Wwoxflox/flox;ネスチン-Cre+)、S-KO(Wwoxflox/flox;シナプシン-Cre+)、O-KO(Wwoxflox/flox;Olig2cre/+)及びG-KO(Wwoxflox/flox;Gfap-Cre+)として表される。すべてのマウスは、特定のプライマーを使用して尾/耳のDNAを抽出することにより、PCR遺伝子型を決定した。すべての条件付きモデルは、C57BL6/J;129sv混合遺伝的バックグラウンドで維持した。すべての条件付きモデルは、Rosa26-loxp-STOP-tdTomatoレポーター対立遺伝子を含んでいた。動物は、SPFユニット内で、12時間の明/暗サイクルで、食物と水を自由に摂取させて維持した。すべての動物関連の実験は、ヘブライ大学のInstitutional Animal Care Use Committee(HU-IACUC)の事前承認に従って行われた。
DRG-OPC共培養
DRGニューロンとOPCの共培養実験は、以前に公開されたプロトコル23に従って実施した。簡潔に述べると、DRGニューロンを、E13.5でマウス胚から単離した。胚の遺伝子型を決定し、DRGを冷L-15培地中で回収した。組織を0.25%トリプシンで解離させ、粉砕し、遠心分離し、NB培地(Neurobasal、B27サプリメント、0.5mMのL-グルタミン、及びペニシリン-ストレプトマイシン)中に再懸濁した。事前に洗浄した直径13mmのガラスカバースリップを4ウェルディッシュに入れ、Matrigelでコーティングし(室温で1時間)、次いでポリ-D-リジンでコーティングした(室温で30分)。細胞を40,000細胞/13mmカバーガラスの密度でNB培地に播種し、37℃、5%CO2の加湿インキュベーター内で維持した。DIV2、4及び6に培養物をフルオロデオキシウリジンで処理して、非ニューロン細胞を除去した。細胞培地の50%を3日ごとに交換し、DIV15において、OPCを加えた。OPCは、それぞれP0~P2齢の仔マウスから単離した。皮質を氷冷L-15培地中に単離し、シリンジ(マウス組織では19Gに続いて21G)を使用して解離させ、摩砕し、遠心分離し、PDLコーティングされたフラスコ上のグリア播種培地(10%ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM)中に再懸濁した。グリア細胞を、37℃及び5%CO2の加湿インキュベーター内で維持し、細胞培地の50%を3日ごとに交換した。DIV10において、フラスコを激しく振った後に培養皿(37℃で10分×3回)にすばやく接着させて星状細胞を枯渇させることによってOPCを単離するか、または精製したOPC(200,000/カバースリップ)をDRGニューロン培養物に播種し、共培養培地(B27及びN2サプリメント、5mg/mlのN-アセチル-システイン、5mMのフォルスコリン、ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM)中で維持した。9~11日間、隔日で培地を交換した後、培養物を固定し、分析のために染色した。
DRGニューロンとOPCの共培養実験は、以前に公開されたプロトコル23に従って実施した。簡潔に述べると、DRGニューロンを、E13.5でマウス胚から単離した。胚の遺伝子型を決定し、DRGを冷L-15培地中で回収した。組織を0.25%トリプシンで解離させ、粉砕し、遠心分離し、NB培地(Neurobasal、B27サプリメント、0.5mMのL-グルタミン、及びペニシリン-ストレプトマイシン)中に再懸濁した。事前に洗浄した直径13mmのガラスカバースリップを4ウェルディッシュに入れ、Matrigelでコーティングし(室温で1時間)、次いでポリ-D-リジンでコーティングした(室温で30分)。細胞を40,000細胞/13mmカバーガラスの密度でNB培地に播種し、37℃、5%CO2の加湿インキュベーター内で維持した。DIV2、4及び6に培養物をフルオロデオキシウリジンで処理して、非ニューロン細胞を除去した。細胞培地の50%を3日ごとに交換し、DIV15において、OPCを加えた。OPCは、それぞれP0~P2齢の仔マウスから単離した。皮質を氷冷L-15培地中に単離し、シリンジ(マウス組織では19Gに続いて21G)を使用して解離させ、摩砕し、遠心分離し、PDLコーティングされたフラスコ上のグリア播種培地(10%ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM)中に再懸濁した。グリア細胞を、37℃及び5%CO2の加湿インキュベーター内で維持し、細胞培地の50%を3日ごとに交換した。DIV10において、フラスコを激しく振った後に培養皿(37℃で10分×3回)にすばやく接着させて星状細胞を枯渇させることによってOPCを単離するか、または精製したOPC(200,000/カバースリップ)をDRGニューロン培養物に播種し、共培養培地(B27及びN2サプリメント、5mg/mlのN-アセチル-システイン、5mMのフォルスコリン、ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM)中で維持した。9~11日間、隔日で培地を交換した後、培養物を固定し、分析のために染色した。
オリゴ皮質スフェロイドの生成及び培養
脳オルガノイドは、以前に記載されたようにhESCから生成した。24簡潔に述べると、ヒトWiBR3細胞を有糸分裂不活化MEFで維持した。プロトコル開始の4~7日前に、細胞をMEFコーティングした60mmプレートに継代し、70~80%の集密度に達するまで増殖させた。0日目に、0.7mg/mlのコラゲナーゼD溶液(Sigma;11088858001)を用いてhESCコロニーをMEFから剥離させ、C型トリプシンを2分間使用して、単一細胞懸濁液に解離させた。解離後、細胞を計数し、20%KOSR、1%GlutaMax、1%NEAA、1%P/S及び100μMの2-メルカプトエタノール(Sigma;M3148)を補充し、10μMドルソモルフィン(Sigma;P5499)または100nm LDN-193189(Axon medchem;Axon1509)、ならびに10μM SB-431542(Sigma;S4317)及び10μM Rockiを補充し、0.22μmフィルターで滅菌したDMEM/F12からなるhESC培地に懸濁した。胚様体(EB)形成のために、超低接着(ULA)96vウェルプレート(S-Bio Prime;MS-9096VZ)の各ウェルに10,000個の細胞を播種した。新鮮なドルソモルフィン/LDN-193189及びSB-431542の添加と共に、培地の半分を吸引して交換することにより、6日目までEBを毎日供給した(ウェルあたり約100μl)。
脳オルガノイドは、以前に記載されたようにhESCから生成した。24簡潔に述べると、ヒトWiBR3細胞を有糸分裂不活化MEFで維持した。プロトコル開始の4~7日前に、細胞をMEFコーティングした60mmプレートに継代し、70~80%の集密度に達するまで増殖させた。0日目に、0.7mg/mlのコラゲナーゼD溶液(Sigma;11088858001)を用いてhESCコロニーをMEFから剥離させ、C型トリプシンを2分間使用して、単一細胞懸濁液に解離させた。解離後、細胞を計数し、20%KOSR、1%GlutaMax、1%NEAA、1%P/S及び100μMの2-メルカプトエタノール(Sigma;M3148)を補充し、10μMドルソモルフィン(Sigma;P5499)または100nm LDN-193189(Axon medchem;Axon1509)、ならびに10μM SB-431542(Sigma;S4317)及び10μM Rockiを補充し、0.22μmフィルターで滅菌したDMEM/F12からなるhESC培地に懸濁した。胚様体(EB)形成のために、超低接着(ULA)96vウェルプレート(S-Bio Prime;MS-9096VZ)の各ウェルに10,000個の細胞を播種した。新鮮なドルソモルフィン/LDN-193189及びSB-431542の添加と共に、培地の半分を吸引して交換することにより、6日目までEBを毎日供給した(ウェルあたり約100μl)。
7~50日目において、使用したすべての培地は、0.22μmフィルターで滅菌した、Neurobasal培地(Gibco;21103049またはBiological Industries;06-1055-110-1A)、2%B27サプリメント(Gibco;17504044)、1%GlutaMax、1%P/S、そして27日目からは1%Matrigel(Corning;356231)からなるNeural Medium(NM)に基づいていた。7日目に、約75%の培地を、20ng/mlのFGF-2及び20ng/mlのEGF(Peprotech;AF-100-15)を補充したNMからなるEB増殖(EBX)培地で交換した。EBX培地の半量を15日目まで毎日交換し、その後、培地の半量を1日おきに交換した。20日目頃に、スフェロイドが96ウェルプレートを超えて増殖したため、24ウェルULA(Corning;3473)に移し、26日目まで1日おきに半量の培地交換を行った。27日目に、スフェロイドを滅菌90mm未処理培養皿(Miniplast;825-090-15-017)に移し、培地を、20ng/mlのBDNF(Peprotech;450-02)及び20ng/mlのNT-3(Peprotech;450-03)を補充したNMからなる神経分化培地(NDM)に変更した。41日目に、培地を補充なしのNMに変更した。
51日目以降、すべての培地は、1%B27サプリメント、1%GlutaMax、1%P/S、及び1%Matrigelを補充したNeurobasal培地を含有するオリゴ成熟培地(OMM)に基づき、2日ごとに培地の半量を交換した。OPC増殖については、51日目に培地を、10ng/mlのPDGF-AA(R&D systems;221-AA)及び10ng/mlのIGF-1(R&D systems;291-G1)を補充したOMMからなるOPC増殖培地(OEM)に変更し、2日ごとに培地の半量を交換した。オリゴデンドロサイトの分化のために、OMMに40ng/mlのT3(Sigma;T2877)を補充し、オリゴ分化培地(ODM)を構成した。最後に、71日目以降、スフェロイドをOMM中で培養し、2日ごとに完全な培地交換を行った。
プロトコル全体を通して、スフェロイドは37℃及び5%CO2の静的条件で培養し、培地交換の前に、成長因子及びサイトカインを新たに添加し、少なくとも30日ごとに1回、スフェロイドを新鮮なプレートに移した。特に明記しない限り、すべての分析で同じバッチのオルガノイドを使用した。
免疫蛍光
異なる遺伝子型(P17-P18)のマウスをCO2で安楽死させ、2%PFA/PBSで経心臓的に灌流した。解剖した脳を氷上で30分間固定した。免疫蛍光検査のために、脳を4℃で一晩、30%スクロース中でインキュベートし、その後、OCTに包埋し、クライオスタットを使用して切片(12~14μm)にした。矢状切片をPBSで洗浄し、0.5%TritonX-100を含有する5%ヤギ血清をブロッキングし、次いで室温で1時間インキュベートした後、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで洗浄し、対応するAlexaフルオロフォアでタグ付けされた二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、封入剤でマウントした。
異なる遺伝子型(P17-P18)のマウスをCO2で安楽死させ、2%PFA/PBSで経心臓的に灌流した。解剖した脳を氷上で30分間固定した。免疫蛍光検査のために、脳を4℃で一晩、30%スクロース中でインキュベートし、その後、OCTに包埋し、クライオスタットを使用して切片(12~14μm)にした。矢状切片をPBSで洗浄し、0.5%TritonX-100を含有する5%ヤギ血清をブロッキングし、次いで室温で1時間インキュベートした後、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで洗浄し、対応するAlexaフルオロフォアでタグ付けされた二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、封入剤でマウントした。
オリゴ皮質スフェロイドの固定及び免疫染色は、以前に記載されたように実施した25。簡潔に述べると、オルガノイドをPBSで3回洗浄し、次いで固定のために4%氷冷パラホルムアルデヒド中に45分間移し、冷PBSで3回洗浄し、30%スクロース溶液中で一晩平衡化して凍結保護した。翌日、スフェロイドをOCTに包埋し、ドライアイスでスナップ凍結し、Leica CM1950クライオスタットで10μmに切片化した。免疫蛍光染色のために、切片を室温に温め、再水和のためにPBSで洗浄し、PBS中の0.1%TritonX(PBT)で透過処理し、次いで、PBT中の5%正常ヤギ血清(NGS)、0.5%BSAを含有するブロッキング緩衝液中で1時間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に切片を4℃で一晩インキュベートした。翌日、続いて切片を0.05%Tween-20を含有するPBS(PBST)中で振盪しながら3回洗浄し、二次抗体と共に1.5時間インキュベートした。スライドを振盪しながらPBSTで4回洗浄し、次いでImmunofluorescence Mounting Medium(DAKO;s3023)を使用して封入した。
Luxol Fast Blue染色
Luxol Fast Blue(LFB)染色は、Nova Ultra Luxol Fast Blue染色キットを使用して、以前に公開されたプロトコル23に従って実施した。簡潔に述べると、各遺伝子型の少なくとも3匹のマウスに由来するパラフィン包埋脳切片(6μm)を脱ロウし、続いて95%エタノールに再水和した後、切片をLFB溶液(95%エタノール中の0.1%LFB/0.5%酢酸)中で、56℃にて一晩インキュベートした。次いで、切片を95%エタノール及びddH2Oで、続いて0.05%炭酸リチウムで30秒間洗浄し、次いで灰白質が無色になり、白質が青色に見えるまで70%エタノールで洗浄した。次いで切片をddH2Oですすいだ後、予熱した0.1%酢酸Cresyl Violet溶液で30~40秒間、対比染色した。最後に、切片をddH2Oですすぎ、100%エタノール及びキシレンで脱水し、樹脂培地でマウントした。
Luxol Fast Blue(LFB)染色は、Nova Ultra Luxol Fast Blue染色キットを使用して、以前に公開されたプロトコル23に従って実施した。簡潔に述べると、各遺伝子型の少なくとも3匹のマウスに由来するパラフィン包埋脳切片(6μm)を脱ロウし、続いて95%エタノールに再水和した後、切片をLFB溶液(95%エタノール中の0.1%LFB/0.5%酢酸)中で、56℃にて一晩インキュベートした。次いで、切片を95%エタノール及びddH2Oで、続いて0.05%炭酸リチウムで30秒間洗浄し、次いで灰白質が無色になり、白質が青色に見えるまで70%エタノールで洗浄した。次いで切片をddH2Oですすいだ後、予熱した0.1%酢酸Cresyl Violet溶液で30~40秒間、対比染色した。最後に、切片をddH2Oですすぎ、100%エタノール及びキシレンで脱水し、樹脂培地でマウントした。
電子顕微鏡法
マウスを麻酔し、4%PFA、2.5%グルタルアルデヒド、及び0.1Mカコジル酸緩衝液を含有する固定液で灌流した。脳を単離し、室温で一晩固定液中でインキュベートし、以前に記載されたように処理した。26 それぞれ、XF416 TVIPカメラまたはUS4000 Gatanカメラを搭載したFEI Tecnai T12透過型電子顕微鏡またはTecnai F20 S/TEMを使用して試料を検査した。コンピューター支援ImageJ分析ソフトウェアを使用してEM顕微鏡写真を分析した。g比を計算するには、脳梁または視神経のいずれかに由来するEM画像の有髄軸索(約600、マウスあたり100軸索、遺伝子型あたりn=3)を、軸索の内径を総軸索の直径で割ることによって分析した。
マウスを麻酔し、4%PFA、2.5%グルタルアルデヒド、及び0.1Mカコジル酸緩衝液を含有する固定液で灌流した。脳を単離し、室温で一晩固定液中でインキュベートし、以前に記載されたように処理した。26 それぞれ、XF416 TVIPカメラまたはUS4000 Gatanカメラを搭載したFEI Tecnai T12透過型電子顕微鏡またはTecnai F20 S/TEMを使用して試料を検査した。コンピューター支援ImageJ分析ソフトウェアを使用してEM顕微鏡写真を分析した。g比を計算するには、脳梁または視神経のいずれかに由来するEM画像の有髄軸索(約600、マウスあたり100軸索、遺伝子型あたりn=3)を、軸索の内径を総軸索の直径で割ることによって分析した。
画像の取得及び分析
LFB染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナー(3DHISTECH)を使用して画像化した。免疫染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナーまたはOlympus FV1000共焦点レーザー走査顕微鏡またはNikon A1R+共焦点顕微鏡を使用して画像化した。皮質及び小脳におけるCNP及びMBP染色の蛍光合計強度は、NIS elementsソフトウェアを使用して計算した。取得した画像は、関連する顕微鏡ソフトウェアプログラム、すなわちCaseViewer、F-10-ASWビューアー、NIS elementsを使用して処理する。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析した。画像は遺伝子型を盲検化して分析し、処理には明るさとコントラストの全体的な変化が含まれる。
LFB染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナー(3DHISTECH)を使用して画像化した。免疫染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナーまたはOlympus FV1000共焦点レーザー走査顕微鏡またはNikon A1R+共焦点顕微鏡を使用して画像化した。皮質及び小脳におけるCNP及びMBP染色の蛍光合計強度は、NIS elementsソフトウェアを使用して計算した。取得した画像は、関連する顕微鏡ソフトウェアプログラム、すなわちCaseViewer、F-10-ASWビューアー、NIS elementsを使用して処理する。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析した。画像は遺伝子型を盲検化して分析し、処理には明るさとコントラストの全体的な変化が含まれる。
自然発作の記録
動物施設でマウスをモニタリングする際に、自然発作を起こしているマウスをモバイルカメラを使用して記録した。Wwox突然変異マウスでは、自然発作または異常な活動(暴走)が観察された。自然発作の持続時間(秒単位)を計算し、示した。n=6。
動物施設でマウスをモニタリングする際に、自然発作を起こしているマウスをモバイルカメラを使用して記録した。Wwox突然変異マウスでは、自然発作または異常な活動(暴走)が観察された。自然発作の持続時間(秒単位)を計算し、示した。n=6。
電気生理学
シナプシン-Creリコンビナーゼを使用してニューロンのWwoxを条件付きで欠損させたマウスにおいて、電気生理学的記録を行った。これらの実験のために、S-対照(Wwox+/+;Synapsin-Cre+)、S-HT(Wwox+/flox;Synapsin-Cre+)及びS-KO(Wwoxflox/flox;Synapsin-Cre+)のP13~P17のオスまたはメスのいずれかのマウスを、Canadian Council of Animal Care(CCAC)によって概説されたガイドラインに従って人道的に殺処分した。すべての外科的処置は、Animal Care Committee of the University Health Networkのガイドラインに従って承認され、実施された。
シナプシン-Creリコンビナーゼを使用してニューロンのWwoxを条件付きで欠損させたマウスにおいて、電気生理学的記録を行った。これらの実験のために、S-対照(Wwox+/+;Synapsin-Cre+)、S-HT(Wwox+/flox;Synapsin-Cre+)及びS-KO(Wwoxflox/flox;Synapsin-Cre+)のP13~P17のオスまたはメスのいずれかのマウスを、Canadian Council of Animal Care(CCAC)によって概説されたガイドラインに従って人道的に殺処分した。すべての外科的処置は、Animal Care Committee of the University Health Networkのガイドラインに従って承認され、実施された。
in vivo調製。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したケタミン-キシラジン(100mg/kgケタミン及び10mg/kgキシラジン)をマウスに腹腔内注射した。ペダル反射を使用して、麻酔の深さを判定した。マウスが深く麻酔されたら、定位フレームに配置した。局所麻酔薬(リドカン)を頭蓋骨の切開部位のすぐ上に注射し、次いで、短時間(約5分)後、皮膚を取り除き、頭蓋骨を露出させた。ドリルを使用して頭蓋骨に切れ込みを付け、次いでピンセットを使用して頭蓋骨を剥がし、皮質組織を露呈させた。垂直プラーを使用して、薄壁のガラス電極(直径1.5、World Precision Instruments)を引いた。これらはPBSで満たした。電極を、ブレグマの後方1.6~2mm、正中線の外側4mmに配置した。電極を複数の深さに配置し、各深さで3分間、新皮質の皮質下脳と海馬の活動を記録した。
in vitro調製。ペントバルビタール(50mg/kg)でマウスを麻酔した。ペダル反射を使用して、麻酔の深さを試験した。マウスを深く麻酔したら、迅速に断頭し、脳を取り出した。小脳及び嗅球を除去し、残りの組織を、(mMで):248スクロース、26NaHCO3、10グルコース、2KCl、3MgSO4-7H2O、1.25NaH2PO4、1CaCl2-2H2Oを含有する氷冷スクロースの溶液中のプラットフォーム上に尾側を下にして配置した。Leica 1200 vibratomeを使用して、新皮質を厚さ400~500um(速度0.6mm/秒、振幅1mm)で冠状に切断した。この後、(mMで)123NaCl、25NaHCO3、10グルコース、3.5KCl、1.3MgSO4-7H2O、1.2NaH2PO4、1.5CaCl2-2H2O、pH7.3~7.4を含有する人工脳脊髄液(ACSF)中で切片をインキュベートした。切片を34℃で30分間保持した後、実験前に少なくとも60分間、室温に移した。ACSFを含有する局所集合電位(LFP)ガラス電極(1.5mm,World Precision Instruments)を、垂直プラー(Narishige,日本PP-83)を使用して引き、新皮質第II層及び第III層または海馬のCA3領域に配置した。Olympus BX51顕微鏡(OLY-150IRカメラ-ビデオモニターユニット)を、適切な電極配置のガイダンスとして使用した。ネットワークの興奮性を評価するために、第II/III層からの記録と同じ垂直列に沿って配置された双極同心タングステン電極を使用して、第V層皮質または歯状回刺激を実施した。光電刺激分離ユニットに接続したGRASS S88刺激装置を使用して、様々な強度の持続時間0.1ミリ秒の電流パルスを30秒ごとに印加した。S-対照、S-HT、及びS-KOマウス(100μA)の最大定常状態応答の振幅を比較した。
パワースペクトル分析
最初に、最終的なサンプリング周波数が1000Hzになるようにデータをデシメートした。次に、データを、60Hz及びその倍音でノッチフィルター処理した。MATLABで高速フーリエ変換及び1Hzのビンサイズを使用してスペクトルパワーを分析した。各動物について、5秒のオーバーラップを有する10秒のウインドウを使用して、深さ300μmで2.5分間にわたってパワースペクトルを平均化した。パワースペクトルを、すべての対象の平均としてプロットした。
最初に、最終的なサンプリング周波数が1000Hzになるようにデータをデシメートした。次に、データを、60Hz及びその倍音でノッチフィルター処理した。MATLABで高速フーリエ変換及び1Hzのビンサイズを使用してスペクトルパワーを分析した。各動物について、5秒のオーバーラップを有する10秒のウインドウを使用して、深さ300μmで2.5分間にわたってパワースペクトルを平均化した。パワースペクトルを、すべての対象の平均としてプロットした。
オリゴ皮質スフェロイドからの電気生理学的記録
指定された時点でのオルガノイドを、3%低温ゲル化アガロースに包埋し(約36℃で)、氷上で5分間インキュベートした後、それらをLeica 1200S Vibratomeを使用して、スクロース溶液(mMで:87NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、25グルコース、0.5CaCl2、7MgCl2、1.25NaHPO4、75スクロース)中で4℃にて400μmに切片化した。切片を人工脳脊髄液(ACSF,mMで:125NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、10グルコース、2.5CaCl2、1.5MgCl2;pH7.38、300mOsm))中で、37℃にて30分間、続いて室温で1時間インキュベートした。記録中、切片は、ベースライン条件で、灌流カーボゲン(95%O2、5%CO2)と共に、37℃にてACSF中でインキュベートした。局所集合電位(LFP)及び全細胞パッチクランプ記録は、ホウケイ酸キャピラリーガラスから引き出し、各切片の外縁から深さ150μmに配置した電極を使用して実施した(図6Aを参照のこと)。LFP電極をACSFで満たし、一方、パッチ電極を内部溶液で満たした。25,000HzのサンプリングレートでMultiClampソフトウェアを使用してデータを記録した。MATLABソフトウェアを使用してデータを分析した。(1)60ノッチフィルター(5倍音)を使用してノイズを除去し、(2)0.1HzハイパスIIRフィルターを使用して記録セットアップからの変動を除去し、トレースをフィルター処理した。
指定された時点でのオルガノイドを、3%低温ゲル化アガロースに包埋し(約36℃で)、氷上で5分間インキュベートした後、それらをLeica 1200S Vibratomeを使用して、スクロース溶液(mMで:87NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、25グルコース、0.5CaCl2、7MgCl2、1.25NaHPO4、75スクロース)中で4℃にて400μmに切片化した。切片を人工脳脊髄液(ACSF,mMで:125NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、10グルコース、2.5CaCl2、1.5MgCl2;pH7.38、300mOsm))中で、37℃にて30分間、続いて室温で1時間インキュベートした。記録中、切片は、ベースライン条件で、灌流カーボゲン(95%O2、5%CO2)と共に、37℃にてACSF中でインキュベートした。局所集合電位(LFP)及び全細胞パッチクランプ記録は、ホウケイ酸キャピラリーガラスから引き出し、各切片の外縁から深さ150μmに配置した電極を使用して実施した(図6Aを参照のこと)。LFP電極をACSFで満たし、一方、パッチ電極を内部溶液で満たした。25,000HzのサンプリングレートでMultiClampソフトウェアを使用してデータを記録した。MATLABソフトウェアを使用してデータを分析した。(1)60ノッチフィルター(5倍音)を使用してノイズを除去し、(2)0.1HzハイパスIIRフィルターを使用して記録セットアップからの変動を除去し、トレースをフィルター処理した。
統計解析
すべてのグラフまたは統計解析は、ExcelまたはGraphPad Prism5のいずれかを使用して実行した。実験の結果は、平均±SEMとして示した。両側独立スチューデントt検定を使用して、統計的有意性を試験した。結果は、P<0.05の場合に有意であるとみなされ、それ以外の場合はns(有意性なし)として表された。データ解析は、遺伝子型に対して非盲検で実施した。
すべてのグラフまたは統計解析は、ExcelまたはGraphPad Prism5のいずれかを使用して実行した。実験の結果は、平均±SEMとして示した。両側独立スチューデントt検定を使用して、統計的有意性を試験した。結果は、P<0.05の場合に有意であるとみなされ、それ以外の場合はns(有意性なし)として表された。データ解析は、遺伝子型に対して非盲検で実施した。
結果
神経幹細胞/前駆細胞またはニューロン細胞におけるWwoxの条件付き欠損は、Wwox null表現型を再現する
Wwox nullマウスはメンデル比で生まれ、野生型の同腹子と見分けがつかない。19,20生後数日以内に、マウスは生後3~4週齢までに死亡するまで、発達遅延と発作の兆候を示し始める(図1A~C)。これらの表現型は、ほとんどが2~4歳で死亡するWOREE/EIEE28患者において観察される表現型に非常に類似している。10中枢神経系におけるWWOXの正確な機能をよりよく理解するために、様々な領域での胚性脳発達中のWWOXの高発現を考慮して、脳の条件付きマウスモデルを作成した。8これを達成するために、Wwoxfl/flマウス(loxP部位を保有する)22を、胚段階E10.5で発現し、N-KOマウスを生成するマウス脳の神経幹細胞/前駆細胞におけるWWOX切除を促進するラットネスチン(Nes)27のプロモーター及びエンハンサー下にCreリコンビナーゼを保有するトランスジェニックマウスと交雑させた。N-KOの脳において免疫蛍光法を使用してWWOX切除を検証した。N-KOマウスをモニタリングすると、Wwox nullマウスの表現型との類似性が明らかになった。N-KOマウスはメンデル比で生まれ、P7において明らかな全体的な発達遅延を示し始める生後2~3日まで肉眼的異常は見られなかった(図1D,E)。さらに、N-KOマウスは、Wwox nullマウスで観察されたような振戦/発作及び運動失調(後肢クラスピング試験における調整の欠如)を示した。すべて(100%)のN-KOマウスが生後4週齢までに死亡した(図1F)。Wwoxのインタクトな対立遺伝子を1つ保有するマウス(Wwox+/fl,ネスチン-Cre+)は、目に見える異常な表現型を示さなかったが、これはヒト個体におけるヘテロ接合保因者に神経学的症状がないことと一致していた。これらの表現型は、CNSにおけるWWOXの重要な役割を示しており、ネスチン陽性細胞及びその子孫におけるその除去が、WWOXげっ歯類モデル及びヒト患者で観察される複雑な表現型の原因であることを意味している。
神経幹細胞/前駆細胞またはニューロン細胞におけるWwoxの条件付き欠損は、Wwox null表現型を再現する
Wwox nullマウスはメンデル比で生まれ、野生型の同腹子と見分けがつかない。19,20生後数日以内に、マウスは生後3~4週齢までに死亡するまで、発達遅延と発作の兆候を示し始める(図1A~C)。これらの表現型は、ほとんどが2~4歳で死亡するWOREE/EIEE28患者において観察される表現型に非常に類似している。10中枢神経系におけるWWOXの正確な機能をよりよく理解するために、様々な領域での胚性脳発達中のWWOXの高発現を考慮して、脳の条件付きマウスモデルを作成した。8これを達成するために、Wwoxfl/flマウス(loxP部位を保有する)22を、胚段階E10.5で発現し、N-KOマウスを生成するマウス脳の神経幹細胞/前駆細胞におけるWWOX切除を促進するラットネスチン(Nes)27のプロモーター及びエンハンサー下にCreリコンビナーゼを保有するトランスジェニックマウスと交雑させた。N-KOの脳において免疫蛍光法を使用してWWOX切除を検証した。N-KOマウスをモニタリングすると、Wwox nullマウスの表現型との類似性が明らかになった。N-KOマウスはメンデル比で生まれ、P7において明らかな全体的な発達遅延を示し始める生後2~3日まで肉眼的異常は見られなかった(図1D,E)。さらに、N-KOマウスは、Wwox nullマウスで観察されたような振戦/発作及び運動失調(後肢クラスピング試験における調整の欠如)を示した。すべて(100%)のN-KOマウスが生後4週齢までに死亡した(図1F)。Wwoxのインタクトな対立遺伝子を1つ保有するマウス(Wwox+/fl,ネスチン-Cre+)は、目に見える異常な表現型を示さなかったが、これはヒト個体におけるヘテロ接合保因者に神経学的症状がないことと一致していた。これらの表現型は、CNSにおけるWWOXの重要な役割を示しており、ネスチン陽性細胞及びその子孫におけるその除去が、WWOXげっ歯類モデル及びヒト患者で観察される複雑な表現型の原因であることを意味している。
ネスチンプロモーターは、神経細胞及びグリア細胞の前駆体で発現するため、ニューロンとグリア細胞で別々にWWOX除去の効果を分析した。まず、E12.5で発現し、特にほとんどの分化ニューロンでWwoxの欠失をもたらす、シナプシンI遺伝子28のプロモーター下にCreリコンビナーゼを保有するトランスジェニックマウス系統を使用して、ニューロン細胞のWwoxを条件付きで欠失させた。ニューロンにおいて特異的だが他の細胞ではそうではないWWOXの切除を、S-KO脳組織のオリゴデンドロサイト(OL)(CC1で染色)において、インタクトなWWOXレベルが対照マウスに匹敵することを観察することによって検証した。ニューロン細胞におけるWWOXの条件付き切除の表現型分析により、3~4週齢までの成長遅延(図1G、H)、及び早死(図1I)が明らかとなり、これはN-KO及び Wwox nullマウスが表現型模写されたものである。S-KOマウスはまた、P9から始まり、数秒~数分(68.5±13.4秒;P14~P18のn=6)の範囲の無秩序な自発的強直間代発作を示した。さらに、これらのマウスは、協調運動の欠如と運動失調の表現型を示した。Wwoxのインタクトな対立遺伝子を1つ保有しているヘテロ接合体(Wwox+/fl,シナプシンCre+)マウスは、異常な表現型を示さず、対照マウスと行動的に区別できなかった。S-KOモデルの表現型は、WWOXがニューロンにおいて重要な役割を果たしており、その欠損が劇的な神経学的表現型をもたらすことを強く示している。
特定のニューロン細胞のWWOX機能を確認するために、オリゴデンドロサイト(Olig2-Cre+/-を使用して)29及び星状細胞(GFAP-Creを使用して)30でのWWOX発現の除去の結果を調べたが、表現型の異常は観察されなかった(図1J~O)。オリゴデンドロサイト及び星状細胞におけるWWOXの条件付き欠失の検証結果を、それぞれCC1及びGFAPの免疫蛍光染色によって示す。まとめると、これらの発見は、WWOXは、星状細胞、オリゴデンドロサイト、及びニューロンで発現するが、ニューロンにおけるその機能が動物の生存とCNS恒常性にとって重要であることを示している。
Wwoxのニューロン欠失はてんかん発作を引き起こす
S-KO脳のてんかん活動を特徴決定するために、対照(S-対照)及びヘテロ接合体(S-HT)と共に、脳からの電気生理学的記録を行った(図2A~F)。このために、マウスを麻酔下に置き、開頭術を行って、感覚皮質の上の脳の領域を露出させた。生理食塩水を含有する局所集合電位(LFP)電極を使用して、皮質の様々な深さにおいて受動的に記録した。具体的には、新皮質の表層で、S-KOはS-対照には存在しなかった大振幅のバースト活動を示した(図2A)。これらのバーストは皮質下構造では観察されず、バースト生成の新皮質起源が示唆された。in vivoでの記録深度300μmでの活動のさらなる特徴決定により、2.06mV(2.01~3.09mV,25パーセンタイル及び75パーセンタイル)のピークから谷までの振幅、及び8.62秒のバースト間間隔(6.25~21.27秒、25~75パーセンタイル)で、350ミリ秒のてんかんバースト持続時間(206~472ミリ秒、25パーセンタイル及び75パーセンタイル)中央値が示された。
S-KO脳のてんかん活動を特徴決定するために、対照(S-対照)及びヘテロ接合体(S-HT)と共に、脳からの電気生理学的記録を行った(図2A~F)。このために、マウスを麻酔下に置き、開頭術を行って、感覚皮質の上の脳の領域を露出させた。生理食塩水を含有する局所集合電位(LFP)電極を使用して、皮質の様々な深さにおいて受動的に記録した。具体的には、新皮質の表層で、S-KOはS-対照には存在しなかった大振幅のバースト活動を示した(図2A)。これらのバーストは皮質下構造では観察されず、バースト生成の新皮質起源が示唆された。in vivoでの記録深度300μmでの活動のさらなる特徴決定により、2.06mV(2.01~3.09mV,25パーセンタイル及び75パーセンタイル)のピークから谷までの振幅、及び8.62秒のバースト間間隔(6.25~21.27秒、25~75パーセンタイル)で、350ミリ秒のてんかんバースト持続時間(206~472ミリ秒、25パーセンタイル及び75パーセンタイル)中央値が示された。
これらのバーストは、急性新皮質脳切片から得られたLFP記録でも観察され(図2B)、新皮質がこれらの異常なバースト放電の発生源であることを示している。合計で、0%のS-対照切片がバーストを示し(7匹の動物にわたるn=11の切片のうち、0)、S-HT動物由来切片の17%がバーストを示し(14匹の動物にわたるn=23の切片のうちの4)、S-KO動物の86%の切片がバーストを示した(24匹の動物にわたるn=42の切片のうちの36)。
S-KOマウスは大振幅の活動を示したが、これは、新皮質回路の興奮性の増加に起因すると考えられる。これを評価するために、自発的な電場活動(図2C、D)でパワースペクトル分析を実行し、第V層における電気的に誘発された刺激に対する新皮質の第II/III層電場応答を記録した(図2E、F)。自発的な活動を有していたトレースは、in vivo及びin vitroの両方で、δ(<5Hz)、θ(5~9Hz)、α(10~15Hz)、及びβ(15~30Hz)リズムを含有する広い周波数帯域内でスペクトルパワーの増加を示した(図2C、D)。さらに、in vitroでの電気生理学的誘発電場応答は、S-対照及びS-HTと比較してS-KOにおいて、より大きかった(図2E、F)。より大きな誘発反応とスペクトルパワーの増加は過興奮性のバイオマーカーであるため、これらの結果は、S-KOマウスの新皮質興奮性の増強を示し、in vitroデータは生来の皮質過興奮性の増加を示唆している。
RNA-seq及び単核RNA-seq(snRNA-seq)は、Wwox突然変異モデルにおける髄鞘形成及び細胞交替のトランスクリプトーム変化を明らかにした
WWOXのニューロン欠失時に観察された表現型の根底にある分子変化を分析するために、P17におけるS-KO及びS-対照マウスの全皮質及び海馬由来のバルクRNA配列決定(RNA-seq)を実施した。分析により、オリゴデンドロサイトに特異的ないくつかの既知の遺伝子と、星状細胞の活性化を含む、てんかん発作中に誘発される遺伝子との示差的発現を強調する、2つの遺伝子型間の730個の上方制御された遺伝子と579個の下方制御された遺伝子の総数が明らかになった(P値<0.01,倍率変化>1.5)31,32。重要なことに、遺伝子オントロジー(GO)ターム分析により、神経細胞の髄鞘形成及び被覆に関連する遺伝子の有意な下方制御が示された。遺伝子セット濃縮分析(GSEA)もまた、S-対照と比較して、S-KOにおいて髄鞘形成に関連する遺伝子を濃縮することにより、下方制御されることを明らかにした。S-KOマウスの皮質及び海馬由来のRNA-seqデータの詳細な分析により、S-対照と比較して、オリゴデンドロサイト(OL)の成熟(Gjb1、Gjc2及びOlig1)、ミエリン発達、維持及び機能性に関与する遺伝子の有意な下方制御が示された31,33-36(Ermn,Ugt8a,Plp1,Otud7b,Mal,Eml1,Mobp,Hist1h2be,Cldn11,Mbp,Gal3st1,Fa2h,Gsn,Adamts4,Cnp,Mog,Oplalin,Enpp,Mag及びMyrf。これらの調査結果は、WWOXのニューロン細胞内切除が髄鞘形成プロセスに影響を与える可能性があることを示した。
WWOXのニューロン欠失時に観察された表現型の根底にある分子変化を分析するために、P17におけるS-KO及びS-対照マウスの全皮質及び海馬由来のバルクRNA配列決定(RNA-seq)を実施した。分析により、オリゴデンドロサイトに特異的ないくつかの既知の遺伝子と、星状細胞の活性化を含む、てんかん発作中に誘発される遺伝子との示差的発現を強調する、2つの遺伝子型間の730個の上方制御された遺伝子と579個の下方制御された遺伝子の総数が明らかになった(P値<0.01,倍率変化>1.5)31,32。重要なことに、遺伝子オントロジー(GO)ターム分析により、神経細胞の髄鞘形成及び被覆に関連する遺伝子の有意な下方制御が示された。遺伝子セット濃縮分析(GSEA)もまた、S-対照と比較して、S-KOにおいて髄鞘形成に関連する遺伝子を濃縮することにより、下方制御されることを明らかにした。S-KOマウスの皮質及び海馬由来のRNA-seqデータの詳細な分析により、S-対照と比較して、オリゴデンドロサイト(OL)の成熟(Gjb1、Gjc2及びOlig1)、ミエリン発達、維持及び機能性に関与する遺伝子の有意な下方制御が示された31,33-36(Ermn,Ugt8a,Plp1,Otud7b,Mal,Eml1,Mobp,Hist1h2be,Cldn11,Mbp,Gal3st1,Fa2h,Gsn,Adamts4,Cnp,Mog,Oplalin,Enpp,Mag及びMyrf。これらの調査結果は、WWOXのニューロン細胞内切除が髄鞘形成プロセスに影響を与える可能性があることを示した。
観察された分子変化がWWOX機能と直接関連しているかどうかを試験し、結果をさらに検証するために、Wwox-null及びN-KOモデルの海馬組織全体でバルクRNA-seqを実施し、それらをS-KOモデルと比較した。3つのモデルの教師なしクラスタリング分析により、ミエリン関連遺伝子、ならびにOLの発生、成熟、及び髄鞘形成プロセスに関与する遺伝子の有意な下方制御が明らかとなった一方、CreリコンビナーゼのプロモーターではなくWWOXの状態に従って試料をグループ化した。上位25のDEGは、Cnp、Ugt8a、Plp1、Ermn、Otud7b、Mettl7a1、Prr18、Adamts4、Klhdc7a、Mobp、Cldn11、及びMbpを含む、髄鞘形成に関連する転写産物の下方制御を実際に示した。GSEA及びGOターム分析により、髄鞘形成、ニューロンの鞘形成及び軸索鞘形成に関連する有意な負のFDR値が示された。
WWOXのニューロン喪失の分子効果をさらに分析するために、S-KO及びS-対照マウスの海馬で単核RNA-seq(snRNA-seq)分析を実施した。各細胞型またはサブタイプに特異的な遺伝子セットの発現レベルに基づいて、異なる細胞集団クラスターを同定した37-41。一様多様体の近似と射影(UMAP)分析により、S-対照と比較してS-KOにおいて、成熟した有髄形成オリゴデンドロサイト細胞(15%)、COP(運命決定されたオリゴデンドロサイト前駆細胞)(68%)の数の減少及びより多くの数(150%)のオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)が明らかになった。全体として、バルクRNA-seq及びsnRNA-seq分析の両方により、オリゴデンドロサイトの成熟障害が明らかになり、WWOXのニューロン細胞欠失の潜在的な非細胞自律効果が示された。
ニューロンのWWOX切除は、髄鞘形成不全、オリゴデンドロサイト成熟の減少及び軸索伝導障害をもたらす。
次に、OL特異的遺伝子のトランスクリプトーム変化が、S-KOマウスの脳及び他のWwox突然変異モデルの髄鞘形成に影響を与えるかどうかを調べた。これを試験するために、P18で得られた脳の矢状切片を、CNPase(CNP)及びミエリン塩基性タンパク質(MBP)などのミエリンマーカーについて免疫染色した。免疫蛍光分析は、年齢が一致したS-対照と比較して、S-KO脳組織における髄鞘形成不全を示す両方のミエリンマーカーの顕著な染色の減少を示した。S-対照と比較して、S-KOの皮質、小脳、尾状核被殻、海馬采及び脳弓を含む脳の様々な領域で、ミエリン染色の減少が認められた。CNP及びMBP染色の蛍光強度の定量化により、S-KOの皮質及び小脳の有意な減少が明らかになった(図3A、C)。さらに、P18の年齢でのS-KO脳のLuxol fast blue(LFB)染色は、年齢が一致した対照と比較して、白質トラックの髄鞘形成不全を示した。さらに、対応する対照組織と比較して、P18での皮質における定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)によって評価されるように、OL成熟及び髄鞘形成遺伝子の発現レベルはS-KOにおいて減少した。特に、Pdgfra及びCspg4などの初期のOPCマーカー遺伝子はわずかに高く、OLの成熟に特異的な欠損を示唆している。
次に、S-KOの脳組織における髄鞘形成不全に関連する細胞の変化を評価した。CC1(成熟OLのマーカー)及び抗PDGFRα(OPC)による免疫染色は、CC1陽性細胞の2倍の減少を示し、年齢が一致した対照と比較して、S-KO脳の脳梁(図3E)において有意により多くのOPCを示した。さらに、NG2及びCC1の脳切片を免疫染色して、OPCから成熟OLへの移行を試験し、S-KO組織の脳梁及び小脳における二重陽性細胞の数の減少を発見し、OPCの成熟OLへの分化の欠損をさらに確認した。注目すべきことに、CC1及び切断されたカスパーゼ3について染色した場合、S-KO組織において有意なOL細胞死は観察されなかった。N-KOの脳組織及びWwox null脳組織では、同様の髄鞘形成不全及びOL成熟の欠損の結果が観察された。
S-KOマウスで観察された髄鞘形成不全の表現型をさらに評価するために、P17における脳梁と視神経の電子顕微鏡検査を実施した。電子顕微鏡画像は、同齢のS-対照と比較したS-KOの脳梁内の有髄軸索の数の実質的な減少(約3.5~4倍)、及び視神経における有意により多い数(約6倍)の無髄軸索を示している(図4A)。脳梁内の有髄軸索(S-対照,平均=180±40,S-KO,平均=55±35)及び視神経内の無髄軸索(S-対照,平均=55±20,S-KO,平均=270±60)の数を視野(FOV)ごとにカウントし、図4Bに示す。さらに、有髄軸索のg比を計算し、S-KO脳梁と視神経において同齢の対照と比較して有意に高い比率が観察されたことから、ミエリンの厚さが減少したことが示された(図4C)。
観察された髄鞘形成不全が軸索伝導を遅延させ、機能障害をもたらすかどうかを試験するために42,43、脳梁を刺激し、in vitro切片標本内の新皮質第V層から記録した。対照と比較して、S-KOにおける神経伝導の有意な潜時が認められ(図4D-i)、これは、髄鞘形成障害と一致している。図4Dに認められるように、N1とN2の振幅比は、軸索伝播のより長い応答潜時(図4D-ii、iii)及び誘発電位の有意に低いピーク振幅を示した。
ニューロンのWWOXは、OPCから成熟オリゴデンドロサイトへの分化を促進する
これまでのところ、本発明者らの結果は、成熟ニューロンにおけるWWOXの切除がOPCの分化障害による髄鞘形成不全をもたらすことを示唆している。ニューロンのWWOXの非細胞自律機能がin vitroでOPCから成熟OLへの分化を調節するかどうかをさらに試験するために、野生型OPCとWTまたはWwox nullマウスのいずれかから単離した後根神経節(DRG)ニューロンとの共培養アッセイを行った。驚くべきことに、Wwox null DRGで培養したOPCは、WT-DRGに播種したOPCと比較して、有髄化OLへの分化が有意に減少していた(図5)。興味深いことに、代償効果を示唆する可能性が高いこれらの条件下で、有髄化前のOLの数が増加することが観察された(図5)。
これまでのところ、本発明者らの結果は、成熟ニューロンにおけるWWOXの切除がOPCの分化障害による髄鞘形成不全をもたらすことを示唆している。ニューロンのWWOXの非細胞自律機能がin vitroでOPCから成熟OLへの分化を調節するかどうかをさらに試験するために、野生型OPCとWTまたはWwox nullマウスのいずれかから単離した後根神経節(DRG)ニューロンとの共培養アッセイを行った。驚くべきことに、Wwox null DRGで培養したOPCは、WT-DRGに播種したOPCと比較して、有髄化OLへの分化が有意に減少していた(図5)。興味深いことに、代償効果を示唆する可能性が高いこれらの条件下で、有髄化前のOLの数が増加することが観察された(図5)。
これらの結果は、オリゴデンドロサイト(O-KO)におけるWwox特異的欠失が生後早期の髄鞘形成の変化をもたらすかどうかを判定することを促進した。この目的のために、P17においてO-KO及び対照同腹仔のMBP染色を調べたところ、大きな変化は認められなかった。全体として、これらの調査結果は、ニューロン細胞のWWOX切除が髄鞘形成不全を引き起こすことを示している。
ヒトオリゴ皮質スフェロイドにおけるWWOX欠失のモデリングは、過興奮性と髄鞘形成不全を明らかにする
次に、胚性幹細胞(hESC)のWWOX損失をモデル化し、オリゴ皮質スフェロイド(OS)として知られるヒト脳オルガノイドを生成することにより、調査結果のヒトとの関連性を評価した。これらのスフェロイドは、脳の細胞構築と集団間相互作用をモデル化し、ヒトで観察される自然な髄鞘形成プロセスを模倣する機能的なニューロンとグリアからなる。ヒトのニューロン活動と髄鞘形成に対するWWOX喪失の影響を研究するために、WiBR3 hESC系統でWWOXをノックアウトするCRISPR/Cas9系を利用した。WT(OS-WT)及びWWOX-KO hESC(OS-WWOX-KO)の両方に由来するOSを、最近公開されたプロトコル24に従って生成した。
次に、胚性幹細胞(hESC)のWWOX損失をモデル化し、オリゴ皮質スフェロイド(OS)として知られるヒト脳オルガノイドを生成することにより、調査結果のヒトとの関連性を評価した。これらのスフェロイドは、脳の細胞構築と集団間相互作用をモデル化し、ヒトで観察される自然な髄鞘形成プロセスを模倣する機能的なニューロンとグリアからなる。ヒトのニューロン活動と髄鞘形成に対するWWOX喪失の影響を研究するために、WiBR3 hESC系統でWWOXをノックアウトするCRISPR/Cas9系を利用した。WT(OS-WT)及びWWOX-KO hESC(OS-WWOX-KO)の両方に由来するOSを、最近公開されたプロトコル24に従って生成した。
OSの機能特性を特徴決定するために、15週齢のオルガノイド切片で全細胞パッチ及び局所集合電位(LFP)記録を実行した(方法において記載したように)。電場と単一細胞の記録を比較するために、LFPとパッチ電極を10~15μm離して配置した(図6A)。OS-WT及びOS-WWOX-KO系統の両方に由来する、パッチを適用した細胞の静止膜電位(RMP)は、一般的な成熟ニューロンに比べて負ではないことが判明したが、これは、これらの細胞がまだ発生過程にあることを示唆している(図6B)。Pre et al44が以前に指摘したように、iPSC由来ニューロンのRMPは成熟中にさらに負になり、2D培養で増殖させた場合、48~55日目に健康な細胞で-50mVに達する。比較すると、本発明者らのスフェロイドは、105日目(15週目)頃に同様のRMPを示した。-50mVに到達するのにかかる時間の違いは、3Dスフェロイドと2D培養の発達の違いによる可能性がある。OS-WWOX-KO細胞は、対応するWT細胞よりも有意に多くの脱分極RMPを示し、OS-WWOX-KOの発達遅延を示唆している。LFP記録から、0.5~7.9Hzの低周波数範囲に顕著なピークが観察された。振動活動を、曲線下面積によって定量化したが(図6C、D)、これは目的の周波数よりもOS-WWOX-KOの方が有意に高かった。試料の記録とそれに対応する時間-周波数スペクトログラムに示されているように、信号特性の差異も観察された。全体として、特にOS-WWOX-KOのδ及びθ範囲で低周波活動が増加しており、この範囲はOS-WTには存在しない。低周波活動の増加は、一般に発作様のてんかん様活動45に起因しており、これは発生中のスフェロイドにおけるOS-WWOX-KO表現型の初期徴候を明らかにすると共に、ヒト患者及びWwox欠損マウス表現型由来のデータと一致している。
オリゴデンドロサイトの状態を評価するために、以前に記載されたように、オリゴデンドロサイトとミエリンの発達と成熟のタイムラインに従った。最初に、成熟OLが観察される最初の時点である14週目のOSにおいて、CC1及び抗PDGFRαについて免疫染色した。染色により、OPCが同様の割合であることが明らかになったが、CC1+の数はOS-WTと比較してOS-WWOX-KOでは減少していた。次に、ミエリンタンパク質CNPとOPCマーカーNG2の染色によってミエリンが予想される最初の時点である20週目に、OLとOPCを試験した。CNP+細胞の顕著な減少が認められ、これはNG2+細胞では明白でなく、OLの数と髄鞘形成不全の減少の両方が示唆された。最後に、コンパクトかつ成熟したミエリンが記述された時点である30週のOSを試験した。24OS-WTでは、Tuj+細胞でWWOX発現が顕著であった。この段階で、OS-WWOX-KOはMBPとCNPの両方の染色の有意な減少を示し(図6E)、これは転写レベルによっても裏付けられた。興味深いことに、OS-WWOX-KOでは、SOX10、及びPDGFRαなどの初期のOPCマーカーのRNAレベルがわずかに増加していることが判明した。さらに、電子顕微鏡画像により、37週で試験した場合に、OS-WWOX-KOと比較してOS-WTにおいて有髄軸索がより多いことが示された(図6F,G)。全体として、本発明者らのヒトモデルにおけるこれらの調査結果は、脳内のWWOX損失の影響に関するマウスデータと一致しており、ミエリンの生理学的発達とてんかんの病理学的発達におけるその重要な役割を支持するものである。
考察
いくつかのエビデンスにより、WWOXが脳の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていることが示唆されているが、CNSにおけるWWOXの正確な細胞の役割はまだ解明されていない。現在の研究では、複雑な表現型に起因するWWOXのこれまで知られていなかった細胞の役割を明らかにした。
いくつかのエビデンスにより、WWOXが脳の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていることが示唆されているが、CNSにおけるWWOXの正確な細胞の役割はまだ解明されていない。現在の研究では、複雑な表現型に起因するWWOXのこれまで知られていなかった細胞の役割を明らかにした。
WWOXの発現は、CNSのニューロン、オリゴデンドロサイト及び星状細胞において認められる。46Wwox nullマウスの欠損に寄与する細胞型を特定するために、異なる神経集団で遺伝子を体系的に変異させることにした。神経幹細胞及び前駆細胞または成熟ニューロンのいずれかにおけるWWOXの条件付き欠失は、成長遅延、てんかん発作、運動失調及び早死を含むWwox null表現型を再現した。WWOX患者で記録されたEEG記録と一致して10,13-18、WWOXのニューロン欠失が新皮質の過興奮性及び自然てんかん活動に関連していることが明らかとなった。
WWOXのニューロン欠失の分析における最も大きな発見の1つは、顕著な髄鞘形成不全の表現型である。この注目すべき表現型は、最初は大量のRNA-seqとsnRNA-seqを使用して観察されたが、後には豊富な核転写産物に限定された。これらの観察結果は、様々な組織コンパートメントの免疫蛍光及び電子顕微鏡写真を使用してさらに確認された。全体として、これらの結果は、MRI画像で観察されたほとんどのWOREEの小児の白質トラックで記述された遅延髄鞘形成及び薄い脳梁と一致している。10,13-18細胞レベルでは、この髄鞘形成の欠損は、成熟OLの数が減少した結果であることが判明した。この減少は、ニューロン細胞特異的なWwoxノックアウト脳においてOPCの数の増加も検出したため、分化欠損を表している可能性が高い。興味深いことに、in vitroとin vivoの両方で、OPCから成熟有髄OLへの分化を正に調節することにおけるWWOXの非細胞自律機能のエビデンスが示されている。
WWOX機能がニューロンにとって最も重要であることをさらに検証するために、オリゴデンドロサイトまたは星状細胞においてWwoxを特異的に切除した。興味深いことに、どちらの細胞型でもWwoxを欠失させても、これらの表現型は生じなかった。まとめると、これらの調査結果は、他の神経疾患でのオリゴデンドロサイトまたは星状細胞におけるWWOXの細胞自律機能を排除することはできないが、ニューロンにおけるWWOXの非細胞自律的役割がOPCからオリゴデンドロサイトへの分化に何らかの影響を与えることを示している。全体として、この調査結果は、CNS生物学におけるニューロンWWOXの重要かつ新規の役割を強調している。
本発明者らの結果は、Wwox突然変異マウスにおいて、ニューロンの過興奮性と髄鞘形成不全が主要な欠損であることを明確に示している。これらの2つの表現型は、必ずしも相互に排他的ではあるとは限らない。てんかんにおける白質イメージングの最近の概説では、異常なミエリン含有量に関連する神経障害は、てんかん発作に対するより高い感受性を伴うことが提唱された。47脱髄または髄鞘形成不全は、実際、難治性の小児てんかん及び動物てんかんモデルでよくみられる所見である。48髄鞘形成不全または脱髄が局所過興奮性を引き起こす理由は依然として不明である。WWOX欠損症は、ニューロン活動の不均衡やWOREE症候群の観察された複雑な表現型を生じさせる髄鞘形成など、CNSのいくつかの機能に影響を与える可能性があると考えられる。
OPCからオリゴデンドロサイトへの分化は、CNSの多数の内在性及び外来性因子によって調整される。49-51より多くのエビデンスが、ニューロン活動とグルタミン酸シグナル伝達が、発生中のOPCの移動、増殖、分化、及び髄鞘形成を促進することができることを示している。52,53ニューロンのWWOXが、ニューロンの活動または別のメカニズムによってオリゴデンドロサイトの分化に影響を与えるかどうかは、まだ未解明である。WWOXは、主要タンパク質との物理的相互作用を介してWnt/β-カテニン54-56、TGFβ/SMAD57,58及びDNA損傷応答6,59を含む多くのシグナル伝達経路を調節することがわかっているため、WWOXの機能喪失がこれらの重要な経路の調節を解除し、CNS恒常性に影響を与えるかどうかはまだ未調査である。
近年、脳オルガノイドは、ヒトの疾患をモデル化する能力があることから、科学界から多くの関心を集めている。60-64脳オルガノイドにおけるWWOX欠損のモデリングでは、Wwox突然変異マウスで観察されたいくつかの表現型が再現された。これにより、てんかん様活動をモデル化することが可能となったが、これは、低周波範囲でのパワーの増加として示された。この範囲は、てんかんに関与しているδ波とθ波に対応している。45細胞パッチの記録により、OS-WWOX-KOニューロンの脱分極RMPが明らかとなったが、これは発達の遅延を意味しており、興奮の増加を説明するものである可能性がある。興味深いことに、文献ではまだミエリンが不足していると記載されていた時点である15週目という早い時期に、ニューロンの変化が観察された。これらのデータは、過興奮性の調節におけるWWOXの役割を示唆しており、疾患の発症においてニューロン内のWWOX発現が重要な役割を担っているという概念を支持するものである。
WWOX欠損脳オルガノイドはまた、Wwox突然変異マウスで観察された髄鞘形成不全も再現した。表現型は進行性であることが判明し、最終的にミエリン染色の明らかな減少と、髄鞘形成不全を示唆する無髄軸索の増加をもたらした。全体として、この系での結果は、OLにおけるWWOXの機能及びヒトにおける髄鞘形成をさらに支持するものである。
まとめると、本発明者らの調査結果は、ニューロン細胞のWWOX欠損が過興奮性と髄鞘形成の欠損をもたらすことを示している。
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実施例2:新生児ニューロンWWOX遺伝子治療はWWOX null表現型をレスキューする
近年、WWOX機能を中枢神経系(CNS)の恒常性の調節に関連付けるエビデンスが提案されている。9,10生殖細胞系劣性突然変異(WWOX遺伝子のミスセンス、ナンセンス及び部分/完全欠失)は、2つの主要な表現型、すなわち、SCAR12(脊髄小脳失調症、常染色体劣性-12、OMIM614322)及びWOREE症候群(WWOX関連てんかん性脳症)と関連していることが判明した。後者は、発達性及びてんかん性脳症-28(DEE28、OMIM616211)としても知られる。9WOREEは、初期の未成熟停止コドンまたはWWOXの完全な喪失を有する小児に認められる、複雑で壊滅的な神経障害である。11WOREEの臨床スペクトルには、重度の発達遅滞、様々な発作症状(強直性、間代性、強直間代性、ミオクロニー性、点頭てんかん及び欠神)を伴う重度てんかんの早期発症が含まれる。影響を受けた患者のほとんどはアイコンタクトをとらず、座る、話す、または歩くことができない。9WOREE症候群は現在の抗けいれん薬に難治性であるため、WOREE症候群の小児を助けるための代替治療法を緊急に開発する必要がある。主にWWOXのミスセンス変異に起因するSCAR12を有する小児は、運動失調やてんかんなどの軽度の表現型を示す。12SCAR12のてんかんは抗けいれん薬で治療することができるが、小児は依然として運動失調を示し、知的障害がある。さらに、不整脈を伴うてんかん性けいれんを特徴とするウエスト症候群の患者では、WWOX突然変異が報告されている。13WWOX遺伝子変異を有する小児の脳は、磁気共鳴画像法(MRI)で評価すると、異常であることが判明した。脳梁の形成不全、進行性脳萎縮、髄鞘形成の遅延、視神経萎縮などの脳の異常が、ほとんどの場合に報告されている。WWOXの突然変異またはWWOX機能の喪失が、これらのCNS関連異常にどのようにつながるかはほとんどわかっていない。
近年、WWOX機能を中枢神経系(CNS)の恒常性の調節に関連付けるエビデンスが提案されている。9,10生殖細胞系劣性突然変異(WWOX遺伝子のミスセンス、ナンセンス及び部分/完全欠失)は、2つの主要な表現型、すなわち、SCAR12(脊髄小脳失調症、常染色体劣性-12、OMIM614322)及びWOREE症候群(WWOX関連てんかん性脳症)と関連していることが判明した。後者は、発達性及びてんかん性脳症-28(DEE28、OMIM616211)としても知られる。9WOREEは、初期の未成熟停止コドンまたはWWOXの完全な喪失を有する小児に認められる、複雑で壊滅的な神経障害である。11WOREEの臨床スペクトルには、重度の発達遅滞、様々な発作症状(強直性、間代性、強直間代性、ミオクロニー性、点頭てんかん及び欠神)を伴う重度てんかんの早期発症が含まれる。影響を受けた患者のほとんどはアイコンタクトをとらず、座る、話す、または歩くことができない。9WOREE症候群は現在の抗けいれん薬に難治性であるため、WOREE症候群の小児を助けるための代替治療法を緊急に開発する必要がある。主にWWOXのミスセンス変異に起因するSCAR12を有する小児は、運動失調やてんかんなどの軽度の表現型を示す。12SCAR12のてんかんは抗けいれん薬で治療することができるが、小児は依然として運動失調を示し、知的障害がある。さらに、不整脈を伴うてんかん性けいれんを特徴とするウエスト症候群の患者では、WWOX突然変異が報告されている。13WWOX遺伝子変異を有する小児の脳は、磁気共鳴画像法(MRI)で評価すると、異常であることが判明した。脳梁の形成不全、進行性脳萎縮、髄鞘形成の遅延、視神経萎縮などの脳の異常が、ほとんどの場合に報告されている。WWOXの突然変異またはWWOX機能の喪失が、これらのCNS関連異常にどのようにつながるかはほとんどわかっていない。
ヒトWWOX(hWWOX)とマウスWWOX(mWwox)との間には顕著な類似性がある。実際、ヒトのWWOXタンパク質配列は、マウスのWWOXタンパク質配列と93%同一であり、95%相同である。驚くべきことに、げっ歯類モデル(マウス及びラット)においてWwox機能を標的化喪失させると、重度のてんかん発作、成長遅延、運動失調及び早死を含む複雑なヒトの神経学的表現型が表現型模写される。12,14,15Wwox nullマウスはまた、骨代謝障害とステロイド産生に関連する表現型も示す。16,17本開示の実施例1は、神経幹細胞及び前駆細胞(N-KO)またはニューロン細胞(S-KOマウス)のいずれかにおいてマウスWwoxを条件付き切除すると、3~4週間で重度のてんかん、運動失調及び早期死亡がもたらされたことを示しており、これは、Wwox nullマウスで観察された表現型を再現している。これらの結果から、ニューロン機能におけるWWOXの重要な役割が強調されると共に、Wwox nullマウスのニューロンコンパートメントにおいてWWOX発現を回復させることにより、観察された表現型が逆転し得るかどうかを試験することが促された。この目的のために、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用してWWOX発現を回復させた。mWwoxまたはhWWOXのオープンリーディングフレームを有し、ヒトニューロンシナプシンIプロモーターによって駆動されるAAVベクターが、Wwox null表現型を逆転させることができることが示された。AAV9-シナプシンI-WWOXの単回脳室内(ICV)注射により、Wwox nullマウスの成長遅延、てんかん発作、運動失調、及び早期死亡がレスキューされた。さらに、WWOXの修復により、髄鞘形成が改善し、WWOX nullマウスの異常な行動変化が逆転した。全体として、これらの注目すべき結果は、WWOX遺伝子治療がWOREE及びSCAR12の小児に対する有望な治癒アプローチとなり得ることを示している。
結果
ニューロンのWWOXの修復は、Wwox null突然変異マウスの成長遅延及び出生後致死をレスキューする
実施例1では、ニューロンにおいてWWOXを条件付き切除すると、成長遅延、自然てんかん発作、運動失調及び3~4週間での早期死亡を含むWwox nullマウスの表現型が模写されることが示される。これらの結果は、WWOXがCNSの恒常性を調節する重要なニューロン遺伝子であることを示唆している。これらの注目すべき調査結果に促されて、本発明者らは、Wwox nullマウスにおけるニューロン細胞特異的なWWOXの発現が、これらのマウスの致死性とそれに関連する表現型をレスキューすることができるかどうかについて取り組みたいと考えた。ヒトシナプシン-I(hSynI)プロモーターによって駆動されるマウスWwox(mWwox)またはヒトWWOX(hWWOX)cDNAを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを設計し(図8A)、これを、CNS向性が高く、CNSベースの遺伝子治療試験で使用されているAAV9血清型にパッケージングした。22,24 IRES-EGFP配列をWwox/WWOX配列の下流にクローニングして、発現を追跡できるようにした。AAV9-hSynI-mWwox-IRES-EGFP(AAV9-hSynI-mWwox)の送達が成功すると、シナプシンI陽性非分裂性/成熟ニューロンにおいてインタクトなWWOXタンパク質が発現するはずである。対照として、AAV9-hSynI-EGFPを使用した。WWOX及びGFPの発現を、最初に、一次Wwox null後根神経節(DRG)ニューロンにウイルス粒子をin vitroで感染させることによって検証した。
ニューロンのWWOXの修復は、Wwox null突然変異マウスの成長遅延及び出生後致死をレスキューする
実施例1では、ニューロンにおいてWWOXを条件付き切除すると、成長遅延、自然てんかん発作、運動失調及び3~4週間での早期死亡を含むWwox nullマウスの表現型が模写されることが示される。これらの結果は、WWOXがCNSの恒常性を調節する重要なニューロン遺伝子であることを示唆している。これらの注目すべき調査結果に促されて、本発明者らは、Wwox nullマウスにおけるニューロン細胞特異的なWWOXの発現が、これらのマウスの致死性とそれに関連する表現型をレスキューすることができるかどうかについて取り組みたいと考えた。ヒトシナプシン-I(hSynI)プロモーターによって駆動されるマウスWwox(mWwox)またはヒトWWOX(hWWOX)cDNAを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを設計し(図8A)、これを、CNS向性が高く、CNSベースの遺伝子治療試験で使用されているAAV9血清型にパッケージングした。22,24 IRES-EGFP配列をWwox/WWOX配列の下流にクローニングして、発現を追跡できるようにした。AAV9-hSynI-mWwox-IRES-EGFP(AAV9-hSynI-mWwox)の送達が成功すると、シナプシンI陽性非分裂性/成熟ニューロンにおいてインタクトなWWOXタンパク質が発現するはずである。対照として、AAV9-hSynI-EGFPを使用した。WWOX及びGFPの発現を、最初に、一次Wwox null後根神経節(DRG)ニューロンにウイルス粒子をin vitroで感染させることによって検証した。
次に、in vivoでのAAVの発現と機能を評価した。AAV9-hSynI-mWwoxまたはAAV9-hSynI-EGFPのウイルス粒子(2×1010/半球)を出生時(P0)にWwox nullマウスの脳室内領域に注射して、脳全体に広範なニューロンの形質導入を達成した。25,26導入遺伝子の発現がニューロンで成功したが、オリゴデンドロサイト(CC1陽性細胞)では成功しなかったことを、抗NeuN及び抗WWOX抗体を使用した免疫蛍光法によって確認した。
処置マウスのモニタリングにより、AAV9-hSynI-mWwoxを注射したマウスは正常に成長し(図7B)、徐々に体重が増加し(図7C)、生後6~8週までに野生型と区別がつかないことが明らかとなった。AAV9-hSynI-EGFPを注射したマウスは、Wwox nullマウスと同様の表現型を示した(図7C)。注目すべきことに、野生型マウスと比較して、Wwox null及びAAV9-hSynI-EGFPを注射したマウスは、2週間目から死亡するまで低血糖であった一方で、AAV9-hSynI-mWwoxを注射したマウスは、正常な血糖値であった(図7D)。驚くべきことに、レスキューされたすべてのマウスは、Wwox nullまたはAAV9-hSynI-EGFPを注射したWwox nullマウスと比較して、より長寿命であり、生存期間中央値は240日であった(p値<0.0001)(図7E)。mWwoxをhWWOX cDNAに置き換えると、同様の結果及び転帰が得られたが、これまでのところ、これらのマウスを最大100日間しか追跡していない(図7F)。特に、レスキューされたマウスは活発であり、オスとメスの両方で繁殖力が高かった。Wwox nullマウスは、精巣ライディッヒ細胞を欠くことが以前に示されていたため16、次に、WWOXニューロン細胞の修復がこの表現型をレスキューするかどうかを判定したところ、実際にP17でのAAV9-hSynI-mWwox処置マウスにおいてインタクトなライディッヒ細胞が認められた。Wwox突然変異マウスにおいて、骨の成長障害も以前に報告されていたことから17,27-30、レスキューされたマウスの骨を調べたところ、皮質骨はWTマウスと同等のサイズと厚さであることが観察された。これらの結果は、ニューロンでのWWOXの修復が、Wwox nullマウスの異常な表現型をレスキューするのに十分であり得ることを示唆している。
ニューロンでのWWOXの修復は、Wwox nullマウスの過興奮性を低下させる
Wwox null突然変異体は、自然再発性発作を示す。12,14,18,31レスキューされたマウスにおいて自然発作が観察されなかったため、次に、細胞に接続された電気生理学的記録を実行することによって、P21~22での野生型(WT)、Wwox null(KO)、及びAAV9-hSynI-mWwoxを注射したWwox nullマウス(KO+AAV9-Wwox)の脳におけるてんかん活動を測定した。予想通り、KOの仔マウスは重度の活動亢進を示した。活動電位の自発発火を伴う代表的なトレースを図8Aに示す。代表的なトレース(WT、KO+AAV9-Wwox、及びKO)から明らかな過興奮性が認められる。KO脳の活動は、通常、活動電位のバーストを生じさせ、全体的に発火率が劇的に増加した。20WT、20KO+AAV-Wwox及び30KO以上の平均発火率が記録されたニューロンは、WTの仔マウスと比較して、KOの仔マウスで約6倍高かった(p=2.6e-7)。KO+AAV-WwoxとWTの仔マウスの間の平均発火率に有意差は認められなかった。
Wwox null突然変異体は、自然再発性発作を示す。12,14,18,31レスキューされたマウスにおいて自然発作が観察されなかったため、次に、細胞に接続された電気生理学的記録を実行することによって、P21~22での野生型(WT)、Wwox null(KO)、及びAAV9-hSynI-mWwoxを注射したWwox nullマウス(KO+AAV9-Wwox)の脳におけるてんかん活動を測定した。予想通り、KOの仔マウスは重度の活動亢進を示した。活動電位の自発発火を伴う代表的なトレースを図8Aに示す。代表的なトレース(WT、KO+AAV9-Wwox、及びKO)から明らかな過興奮性が認められる。KO脳の活動は、通常、活動電位のバーストを生じさせ、全体的に発火率が劇的に増加した。20WT、20KO+AAV-Wwox及び30KO以上の平均発火率が記録されたニューロンは、WTの仔マウスと比較して、KOの仔マウスで約6倍高かった(p=2.6e-7)。KO+AAV-WwoxとWTの仔マウスの間の平均発火率に有意差は認められなかった。
KOマウスは4週間以内に死亡したため、成体KOマウスにおけるin vivoでの記録は実行できなかった。したがって、細胞接着のin vivoでの記録を、成体のWT及びKO+AAV9-Wwoxマウスでのみ実施した(図8B)。WT及びKO+AAV9-mWwoxについての代表的なトレースを示すと共に、60WT及び60KO+AAV9-mWwoxニューロンの平均発火率を示す(図8B)。成体WTとKO+AAV9-mWwox皮質ニューロンの発火率に有意差はなかった。これらの知見は、AAV9-hSynI-mWwoxがWWOX喪失に起因するてんかん発作を予防することができることを示している。
ニューロンでのWWOXの修復は、おそらくOPC分化を促進することにより、Wwox nullマウスの髄鞘形成を促進する
実施例1は、WWOX喪失と髄鞘形成不全を関連付けるものであった。実際、ニューロンでのWWOX切除により、非細胞自律機能がもたらされ、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の分化が損なわれることが示された。したがって、次に、AAVを使用してニューロンのWWOXを修復することにより、Wwox nullマウスの髄鞘形成不全表現型がレスキューされ得るかどうかを試験した。抗MBP抗体を用いてP17矢状脳組織を免疫蛍光分析することにより、対照ウイルスを注射したWwox nullマウスと比較して、レスキューされたAAV9-hSynI-mWwox処置マウスの脳のすべての部分(皮質、海馬及び小脳)において髄鞘形成が改善されたことが明らかとなった(図9A)。さらに、この髄鞘形成の改善が、ニューロンのWWOXの非細胞自律機能による成熟オリゴデンドロサイトへのOPCの分化の増加と関連しているかどうかを試験した。予想どおり、CC1(成熟オリゴデンドロサイトのマーカー)及び抗PDGFRα(OPCのマーカー)による免疫染色によって評価されるように、ニューロンにおいてAAV9を介してWWOXを発現させることにより、成熟オリゴデンドロサイトへのOPCの分化が増加した(図9B)。脳梁中のCC1及びOPCを定量化することにより、P17に対照ウイルスを注射したKOマウスと比較して、レスキューされたマウスにおける成熟オリゴデンドロサイト数の有意な増加が示された(図9C)。
実施例1は、WWOX喪失と髄鞘形成不全を関連付けるものであった。実際、ニューロンでのWWOX切除により、非細胞自律機能がもたらされ、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の分化が損なわれることが示された。したがって、次に、AAVを使用してニューロンのWWOXを修復することにより、Wwox nullマウスの髄鞘形成不全表現型がレスキューされ得るかどうかを試験した。抗MBP抗体を用いてP17矢状脳組織を免疫蛍光分析することにより、対照ウイルスを注射したWwox nullマウスと比較して、レスキューされたAAV9-hSynI-mWwox処置マウスの脳のすべての部分(皮質、海馬及び小脳)において髄鞘形成が改善されたことが明らかとなった(図9A)。さらに、この髄鞘形成の改善が、ニューロンのWWOXの非細胞自律機能による成熟オリゴデンドロサイトへのOPCの分化の増加と関連しているかどうかを試験した。予想どおり、CC1(成熟オリゴデンドロサイトのマーカー)及び抗PDGFRα(OPCのマーカー)による免疫染色によって評価されるように、ニューロンにおいてAAV9を介してWWOXを発現させることにより、成熟オリゴデンドロサイトへのOPCの分化が増加した(図9B)。脳梁中のCC1及びOPCを定量化することにより、P17に対照ウイルスを注射したKOマウスと比較して、レスキューされたマウスにおける成熟オリゴデンドロサイト数の有意な増加が示された(図9C)。
ニューロンでのWWOXの修復後に髄鞘形成の改善が認められたことをさらに検証するために、P17及び成体マウスにおいて脳梁の電子顕微鏡(EM)分析を実施した。驚くべきことに、AAV9-hSynI-mWwoxを使用したニューロンでのWWOXの修復により、脳梁においてP17でKOと比較して有髄軸索の数が増加していた。さらに、計算したg比からは、対照KOマウスと比較して、ニューロンでのWWOX修復時にミエリンの厚さが増加したことが示された。さらに、レスキューされた成体(6か月)マウスの脳梁と視神経のEM画像から、髄鞘形成の改善が示された。注目すべきことに、P17及び6か月目でのKO+AAV-WwoxとWTの脳梁のミエリン厚さを比較する場合、g比にいくつかの差異が観察された。
ニューロンでのWWOXの修復は、不安を軽減し、運動機能を改善する
次に、ニューロンにおいてWWOXを修復した後のWwox nullマウスの行動の変化を調べた。残念ながら、Wwox nullマウスは状態が悪く、早死にするため、行動を評価することができなかった。本発明者らは、レスキューされたマウスにおける不安及び運動協調性を調べるために、オープンフィールド高架式十字迷路(EPM)試験及びロータロッド試験を実施した(図10A~E)。驚くべきことに、8~10週目において、レスキューされたマウス(オスとメス)において、野生型で認められるパターンと同様の追跡パターンがオープンフィールドで観察され、WWOX修復によってWwox nullマウスの不安が軽減されることが示された。さらに、オープンフィールドトラックを移動した速度と総距離は、WTマウスのものと非常に類似していた(図10B、C)。さらに、レスキューされたメス及びオスのマウスは、EPMでほぼ正常な行動を示した(図10D)。ロータロッド試験は、レスキューされたマウスの運動協調性をチェックするために実施した。その結果から、試験3においてレスキューされたマウスがWTマウスと同様の運動協調性を有していたことが明らかとなり、これはマウスの学習能力を示すものであった。全体として、これらの結果は、Wwox nullマウスのニューロンにおいてWWOXを再発現させることにより、活動と正常な行動が回復することを示唆している。
次に、ニューロンにおいてWWOXを修復した後のWwox nullマウスの行動の変化を調べた。残念ながら、Wwox nullマウスは状態が悪く、早死にするため、行動を評価することができなかった。本発明者らは、レスキューされたマウスにおける不安及び運動協調性を調べるために、オープンフィールド高架式十字迷路(EPM)試験及びロータロッド試験を実施した(図10A~E)。驚くべきことに、8~10週目において、レスキューされたマウス(オスとメス)において、野生型で認められるパターンと同様の追跡パターンがオープンフィールドで観察され、WWOX修復によってWwox nullマウスの不安が軽減されることが示された。さらに、オープンフィールドトラックを移動した速度と総距離は、WTマウスのものと非常に類似していた(図10B、C)。さらに、レスキューされたメス及びオスのマウスは、EPMでほぼ正常な行動を示した(図10D)。ロータロッド試験は、レスキューされたマウスの運動協調性をチェックするために実施した。その結果から、試験3においてレスキューされたマウスがWTマウスと同様の運動協調性を有していたことが明らかとなり、これはマウスの学習能力を示すものであった。全体として、これらの結果は、Wwox nullマウスのニューロンにおいてWWOXを再発現させることにより、活動と正常な行動が回復することを示唆している。
考察
本実施例では、ニューロンにおいてWWOXを修復し、この修復による治療可能性を評価することを目的とした。この研究では、成熟ニューロンへのWWOXの標的遺伝子送達を行うためにAAV9ベクターを使用して、Wwox nullマウスモデルにおける複雑な神経障害を治療した。ニューロンプロモーターシナプシン-I下のmWwoxまたはhWWOX cDNAを新生Wwox nullマウスの脳に注射し、この治療がWWOX欠損症の表現型を逆転させることができることを示した。
本実施例では、ニューロンにおいてWWOXを修復し、この修復による治療可能性を評価することを目的とした。この研究では、成熟ニューロンへのWWOXの標的遺伝子送達を行うためにAAV9ベクターを使用して、Wwox nullマウスモデルにおける複雑な神経障害を治療した。ニューロンプロモーターシナプシン-I下のmWwoxまたはhWWOX cDNAを新生Wwox nullマウスの脳に注射し、この治療がWWOX欠損症の表現型を逆転させることができることを示した。
CNS恒常性の調節におけるWWOXの役割は、WWOX遺伝子の重要な機能として注目されている。WWOXの欠損は、多くの神経疾患に関連している。9,10 特に興味深いのはWOREE症候群であり、生存期間中央値が1~4年の早死をもたらす重篤で複雑な神経疾患である。9,10WOREEを有する小児は、現在の抗てんかん薬(AED)に難治性であるため、医学界及び科学界が新規治療戦略を開発することに挑戦している。WOREE症候群患者の脳にAAV9-WWOXを送達することは、これらの患者を助ける新規遺伝子治療アプローチになり得ると考えられる。
AAV9-SynI-WWOXをWwox nullマウスの脳に送達することの効果は顕著であった。第一に、WWOXニューロンの送達は、自然発作や運動失調の発生を伴わずに、マウスの正常な成長及び生存率を回復させた。さらに、ニューロンでのWWOXの修復が、細胞接着記録における過興奮性を低下させることが示された。第二に、ニューロンにおいてWWOXを修復することにより、脳の全領域の髄鞘形成が改善し、OPC成熟に対するWWOXのニューロンでの非細胞自律機能の以前の観察結果がさらに確認された(実施例1)。注目すべき点は、レスキューされたマウスとWTマウスの間には、髄鞘形成プロセスの調節におけるオリゴデンドロサイト特異的なWWOX機能に起因し得るいくつかの差異が依然として存在することである。第三に、WWOX修復により、レスキューされたマウスの全体的な行動が改善された。これらの調査結果は、自閉症9-11,33,34及びおそらく他の行動関連障害の調節におけるWWOXの提唱された役割が、WWOXの適切なニューロン機能によって駆動されることを示唆している可能性がある。
ニューロンでのWWOX送達の別の興味深い結果は、Wwox nullマウスのWWOX欠損に関連する低血糖の可逆性である。35,36これらの結果は、CNSでのグルコース代謝及びおそらく他の代謝機能におけるWWOXの中心的な役割と一致している。37-40興味深いことに、骨格筋においてWwoxを標的化欠失させると、グルコース恒常性の障害が生じ41、この効果は、WWOXの細胞自律機能に関連していた。
別の奇妙な観察結果は、レスキューされたマウスも繁殖力があり、繁殖することができたということである。Wwox nullマウスがステロイド産生障害を示すことが示されたことを考えると16,29,42、現在の知見からは、CNSにおけるWWOXの機能がその組織レベルの機能を重ね合わせていることが示唆される。全体として、これらの調査結果は、WWOXが臓器レベルと生物レベルの両方で多面的な機能を有している可能性があることを示唆している。
WWOXは、すべての脳領域で遍在的に発現している。10,43,44現在の観察結果は、星状細胞やオリゴデンドロサイトなどの他の脳細胞型でのWWOX発現が不要であることを意味するものではない。WWOX機能をオリゴデンドロサイトの病理と関連付けるエビデンスが出現し始めている45-49が、オリゴデンドロサイトにおけるWWOXの細胞自律機能についてはほとんど知られていない。ニューロンにおけるWWOX発現がオリゴデンドロサイトの成熟を調節し、アストログリオーシスに拮抗するという事実50は、CNS生理学及び病態生理学におけるWWOXの複雑な機能を示唆しており、さらなる詳細な分析が必要である。
WWOX遺伝子は当初、推定腫瘍抑制因子としてクローニングされた。51,52実際、様々な動物モデルにおける多くの研究活動(15で概説されている)及びヒトがん患者における観察1,27,39,53-57から、WWOXは腫瘍抑制因子として提唱された。WWOXの修復が脳に限定されることを考えると、WWOX発現を欠く他の組織は腫瘍の発生をより受けやすいと想定された。注目すべきことに、試験した、AAV9-hSynI-mWwoxで処理した限られた数の成体Wwox nullマウス(6~8か月齢、n=6)において、肉眼的な腫瘍形成は検出されなかった。いくつかの組織における体細胞でのWwoxの欠失には、動物モデルにおける腫瘍形成を促進するための他のヒットが必要であったことを考えると、これは驚くべきことではない。28,39,58,59
Wwox nullマウスは、寿命が限定的であり、状態が良くなかったため、これらのマウスを生存期間の非常に早い段階(P0)で治療することを余儀なくされた。しかしながら、出生後のWwox nullマウスを治療する試みは、将来的に調査されるべきである。本発明者らの現在の調査結果は、AAVベクターを使用した新生児マウスのWWOX修復が、WWOX欠損症に関連する表現型を逆転させ得ることを示している。この概念実証は、壊滅的で多くの場合に難治性であるWOREE症候群に罹患した小児に対して、遺伝子治療の臨床試験の可能性についての基礎を築くと考えられる。
材料及び方法
プラスミドベクター
マウスWwoxまたはヒトWWOX cDNAを、pAAVのヒトシナプシンIプロモーター下にクローニングし、このベクターをAAV9血清型にパッケージングした(Vector Biolabs,Philadelphia,米国)。カスタムメイドのAAV9-hSynI-mWwox-IRES-EGFP、AAV9-hSynI-hWWOX-2A-EGFP、及びAAV9-hSynI-EGFPウイルス粒子は、Vector Biolabsまたはエルサレムのヘブライ大学のVector Core Facilityから入手した。
プラスミドベクター
マウスWwoxまたはヒトWWOX cDNAを、pAAVのヒトシナプシンIプロモーター下にクローニングし、このベクターをAAV9血清型にパッケージングした(Vector Biolabs,Philadelphia,米国)。カスタムメイドのAAV9-hSynI-mWwox-IRES-EGFP、AAV9-hSynI-hWWOX-2A-EGFP、及びAAV9-hSynI-EGFPウイルス粒子は、Vector Biolabsまたはエルサレムのヘブライ大学のVector Core Facilityから入手した。
マウス
Wwox null(-/-)マウス(KO)の生成は、以前に報告されており16、これらのマウスをFVBバックグラウンドで維持した。ヘテロ接合体(+/-)マウスを繁殖に使用して、Wwox nullマウスを取得した。動物は、SPFユニット内で、12時間の明/暗サイクルで、食物と水を自由に摂取させて維持した。すべての動物関連の実験は、ヘブライ大学のInstitutional Animal Care Use Committee(HU-IACUC)の事前承認に従って行われた。
Wwox null(-/-)マウス(KO)の生成は、以前に報告されており16、これらのマウスをFVBバックグラウンドで維持した。ヘテロ接合体(+/-)マウスを繁殖に使用して、Wwox nullマウスを取得した。動物は、SPFユニット内で、12時間の明/暗サイクルで、食物と水を自由に摂取させて維持した。すべての動物関連の実験は、ヘブライ大学のInstitutional Animal Care Use Committee(HU-IACUC)の事前承認に従って行われた。
P0 Wwox nullマウスへのAAV粒子の脳室内(ICV)注射
Wwox nullマウスへのAAV9-hSynI-mWwox-IRES-EGFP(AAV9-WWOX)またはAAV9-hSynI-EGFP(AAV9-GFP)のフリーハンド頭蓋内注射を、公開されたプロトコルに従って実施した。25簡潔に述べると、新生児の出生時に、PCR遺伝子型を決定してWwox nullマウスを識別した。Wwox null新生児には、乾燥した平らな冷たい表面に配置することによって麻酔をかけた。麻酔をかけた仔マウスの頭部を、70%エタノールに浸した綿棒でやさしく拭いた。分注液を可視化できるように、0.1%トリパンブルーをウイルスに添加した。注射部位は、ラムダ縫合糸から各眼までの距離の2/5の位置であった。頭蓋骨の表面に対して垂直に注射器(ウイルスをプレロードした)を保持し、針をおよそ3mmの深さまで挿入した。およそ1μl(2×1010GC/半球)のウイルスを、33Gベベル針(World Precision Instruments)を備えたNanoFilシリンジを使用して分配した。他方の半球にも同じ方法で注射した。注射された仔マウスを、目が覚めるまで加温パッドに置き、次いで母親のケージに移した。注射された各マウスを、成長、可動性、発作、運動失調及び全身状態について注意深くモニタリングして、表現型を評価した。
Wwox nullマウスへのAAV9-hSynI-mWwox-IRES-EGFP(AAV9-WWOX)またはAAV9-hSynI-EGFP(AAV9-GFP)のフリーハンド頭蓋内注射を、公開されたプロトコルに従って実施した。25簡潔に述べると、新生児の出生時に、PCR遺伝子型を決定してWwox nullマウスを識別した。Wwox null新生児には、乾燥した平らな冷たい表面に配置することによって麻酔をかけた。麻酔をかけた仔マウスの頭部を、70%エタノールに浸した綿棒でやさしく拭いた。分注液を可視化できるように、0.1%トリパンブルーをウイルスに添加した。注射部位は、ラムダ縫合糸から各眼までの距離の2/5の位置であった。頭蓋骨の表面に対して垂直に注射器(ウイルスをプレロードした)を保持し、針をおよそ3mmの深さまで挿入した。およそ1μl(2×1010GC/半球)のウイルスを、33Gベベル針(World Precision Instruments)を備えたNanoFilシリンジを使用して分配した。他方の半球にも同じ方法で注射した。注射された仔マウスを、目が覚めるまで加温パッドに置き、次いで母親のケージに移した。注射された各マウスを、成長、可動性、発作、運動失調及び全身状態について注意深くモニタリングして、表現型を評価した。
体重及び血糖値
図に示すように、マウスの体重を定期的に測定した。血糖値をモニタリングするために、マウスの尻尾の先端をはさみで破り、Accu-Check血糖値測定器(Roche Diagnostics,Mannheim,ドイツ)を使用して測定するために少量の血液を採取した(mg/dL)。
図に示すように、マウスの体重を定期的に測定した。血糖値をモニタリングするために、マウスの尻尾の先端をはさみで破り、Accu-Check血糖値測定器(Roche Diagnostics,Mannheim,ドイツ)を使用して測定するために少量の血液を採取した(mg/dL)。
免疫蛍光
異なる遺伝子型及び治療群(P17~P18)のマウスをCO2で安楽死させ、2%PFA/PBSで経心臓的に灌流した。解剖した脳を氷上で30分間後固定し、次いで30%スクロース中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、それらをOCTに包埋し、クライオスタットを使用して切片化した(12~14μm)。矢状切片をPBSで洗浄し、0.5%TritonX-100を含有する5%ヤギ血清をブロッキングし、次いで室温で1時間インキュベートした後、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで洗浄し、対応するAlexaフルオロフォアでタグ付けされた二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、封入剤でマウントした。
異なる遺伝子型及び治療群(P17~P18)のマウスをCO2で安楽死させ、2%PFA/PBSで経心臓的に灌流した。解剖した脳を氷上で30分間後固定し、次いで30%スクロース中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、それらをOCTに包埋し、クライオスタットを使用して切片化した(12~14μm)。矢状切片をPBSで洗浄し、0.5%TritonX-100を含有する5%ヤギ血清をブロッキングし、次いで室温で1時間インキュベートした後、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで洗浄し、対応するAlexaフルオロフォアでタグ付けされた二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、封入剤でマウントした。
電気生理学のための外科手術
マウスには、ケタミン/メデトミジン(腹腔内;それぞれ100及び83mg/kg)を使用して麻酔をかけた。足指ピンチ反射(toe-pinch reflex)がないことによって、麻酔の有効性を確認した。初回用量の4分の1を使用して、約1時間ごとに追加用量を投与して、電気生理学的処置中の麻酔を維持した。すべての手術及び実験の間、加熱パッド(37℃)を使用して体温を維持した。皮膚を除去して頭蓋骨を露出させた。カスタムメイドの金属ピンを歯科用セメントを使用して頭蓋骨に固定し、カスタムステージに接続した。生検パンチ(Miltex,PA)を使用して頭蓋骨に小さな穴(直径3mmの開頭術)を作成した。
マウスには、ケタミン/メデトミジン(腹腔内;それぞれ100及び83mg/kg)を使用して麻酔をかけた。足指ピンチ反射(toe-pinch reflex)がないことによって、麻酔の有効性を確認した。初回用量の4分の1を使用して、約1時間ごとに追加用量を投与して、電気生理学的処置中の麻酔を維持した。すべての手術及び実験の間、加熱パッド(37℃)を使用して体温を維持した。皮膚を除去して頭蓋骨を露出させた。カスタムメイドの金属ピンを歯科用セメントを使用して頭蓋骨に固定し、カスタムステージに接続した。生検パンチ(Miltex,PA)を使用して頭蓋骨に小さな穴(直径3mmの開頭術)を作成した。
細胞接着記録
細胞接着記録を、ブラインドパッチクランプ記録法で取得した。電極(約7MOhm)を、垂直2段プラー(PC-12、Narishige、EastMeadow,NY)で、フィラメント状の薄壁のホウケイ酸ガラス(外径1.5mm、内径0.86mm、Hilgenberg GmbH,Malsfeld,ドイツ)から引き出した。電極を、以下を含有する内部溶液で満たし:140mMのK-グルコン酸塩、10mMのKCl、10mMのHEPES、10mMのNa2-ホスホクレアチン、及び0.5mMのEGTA、KOHでpH7.25に調整した。電極を45°で挿入し、300μmの深さに到達させた。電極の配置は、ブレグマの後方1.6~2mm、正中線の外側4mmに位置する脳表面を標的にした。電極を配置している間、ピペットの抵抗が10~200MOhmに増加すると、ほとんどの場合、活動電位(スパイク)が発生した。単一のスパイクの検出は、記録を開始する基準であった。すべての記録は、電流クランプモードの細胞内アンプ(MultiClamp 700B、Molecular Devices)で取得し、10kHzのサンプリングレートで取得し(CED Micro1401-3、Cambridge Electronic Design Limited)、ハイパスフィルターでフィルター処理した。平均発火率の計算では、記録した細胞ごとに4分間の記録時間にわたる発火率を計算した。2サンプルt検定を使用して、記録した群間の統計的有意性を評価した。
細胞接着記録を、ブラインドパッチクランプ記録法で取得した。電極(約7MOhm)を、垂直2段プラー(PC-12、Narishige、EastMeadow,NY)で、フィラメント状の薄壁のホウケイ酸ガラス(外径1.5mm、内径0.86mm、Hilgenberg GmbH,Malsfeld,ドイツ)から引き出した。電極を、以下を含有する内部溶液で満たし:140mMのK-グルコン酸塩、10mMのKCl、10mMのHEPES、10mMのNa2-ホスホクレアチン、及び0.5mMのEGTA、KOHでpH7.25に調整した。電極を45°で挿入し、300μmの深さに到達させた。電極の配置は、ブレグマの後方1.6~2mm、正中線の外側4mmに位置する脳表面を標的にした。電極を配置している間、ピペットの抵抗が10~200MOhmに増加すると、ほとんどの場合、活動電位(スパイク)が発生した。単一のスパイクの検出は、記録を開始する基準であった。すべての記録は、電流クランプモードの細胞内アンプ(MultiClamp 700B、Molecular Devices)で取得し、10kHzのサンプリングレートで取得し(CED Micro1401-3、Cambridge Electronic Design Limited)、ハイパスフィルターでフィルター処理した。平均発火率の計算では、記録した細胞ごとに4分間の記録時間にわたる発火率を計算した。2サンプルt検定を使用して、記録した群間の統計的有意性を評価した。
電子顕微鏡法
マウスを麻酔し、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.3中に2%パラホルムアルデヒド及び2.5%グルタルアルデヒド(EMグレード)を含有する固定液で灌流した。脳を単離し、同じ固定液で室温にて2時間インキュベートし、次いでそれらを処理するまで4℃で保存した。回収した組織(脳梁、視神経)をカコジル酸ナトリウムで4回洗浄し、カコジル酸ナトリウム中の1%四酸化オスミウム、1.5%フェリシアン化カリウムで1時間、後固定し、同じ緩衝液で4回洗浄した。次いで、一連の段階的なエタノール溶液(30、50、70、80、90、95%)を用いて組織試料を各々10分間脱水し、次いで100%エタノールを用いて各々20分間3回、続いてプロピレンオキシドで2回交換した。次いで、組織試料に一連のエポキシ樹脂(25、50、75、100%)を各々24時間浸透させ、オーブン内で60℃、48時間重合させた。ブロックをウルトラミクロトーム(Ultracut E,Riechert-Jung)で切片化し、80nmの切片を取得し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。Jeol JEM 1400 Plus透過型電子顕微鏡を使用して切片を観察し、Gatan Orius CCDカメラを使用して写真を撮影した。EM顕微鏡写真を、コンピューター支援ImageJ分析ソフトウェアを使用して分析した。g比を計算するために、脳梁由来のEM画像の有髄軸索(約300、マウスあたり100軸索、遺伝子型あたりn=3)を、軸索の内径を総軸索の直径で割ることによって分析した。
マウスを麻酔し、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.3中に2%パラホルムアルデヒド及び2.5%グルタルアルデヒド(EMグレード)を含有する固定液で灌流した。脳を単離し、同じ固定液で室温にて2時間インキュベートし、次いでそれらを処理するまで4℃で保存した。回収した組織(脳梁、視神経)をカコジル酸ナトリウムで4回洗浄し、カコジル酸ナトリウム中の1%四酸化オスミウム、1.5%フェリシアン化カリウムで1時間、後固定し、同じ緩衝液で4回洗浄した。次いで、一連の段階的なエタノール溶液(30、50、70、80、90、95%)を用いて組織試料を各々10分間脱水し、次いで100%エタノールを用いて各々20分間3回、続いてプロピレンオキシドで2回交換した。次いで、組織試料に一連のエポキシ樹脂(25、50、75、100%)を各々24時間浸透させ、オーブン内で60℃、48時間重合させた。ブロックをウルトラミクロトーム(Ultracut E,Riechert-Jung)で切片化し、80nmの切片を取得し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。Jeol JEM 1400 Plus透過型電子顕微鏡を使用して切片を観察し、Gatan Orius CCDカメラを使用して写真を撮影した。EM顕微鏡写真を、コンピューター支援ImageJ分析ソフトウェアを使用して分析した。g比を計算するために、脳梁由来のEM画像の有髄軸索(約300、マウスあたり100軸索、遺伝子型あたりn=3)を、軸索の内径を総軸索の直径で割ることによって分析した。
オープンフィールド試験
オープンフィールド試験は、以前に公開されたプロトコルに従って実施した。60簡潔に述べると、マウスを50×50×33cmのアリーナの隅に配置し、6分間自由に探索させた。アリーナの中心は、アリーナの真ん中にある25×25cmの正方形として定義された。中央及びアリーナの円周における速度及び費やされた時間を測定した。オープンフィールドで試験したマウスは、追跡ソフトウェア(Ethovision12)を備えたコンピューターに接続されたビデオカメラを使用して記録した。
オープンフィールド試験は、以前に公開されたプロトコルに従って実施した。60簡潔に述べると、マウスを50×50×33cmのアリーナの隅に配置し、6分間自由に探索させた。アリーナの中心は、アリーナの真ん中にある25×25cmの正方形として定義された。中央及びアリーナの円周における速度及び費やされた時間を測定した。オープンフィールドで試験したマウスは、追跡ソフトウェア(Ethovision12)を備えたコンピューターに接続されたビデオカメラを使用して記録した。
高架十字迷路試験
試験装置は、互いに向かい合って高さ1cmの縁で縁取りされ、16cmの縁で縁取られた2つのクローズドアームに垂直な2つのオープンアーム(30×5cm)からなり、すべて床から75cmの高さであった。マウスを迷路に入れ、5分間探索させた。オープンアーム及びクローズドアームの両方における滞在期間を記録した。60
試験装置は、互いに向かい合って高さ1cmの縁で縁取りされ、16cmの縁で縁取られた2つのクローズドアームに垂直な2つのオープンアーム(30×5cm)からなり、すべて床から75cmの高さであった。マウスを迷路に入れ、5分間探索させた。オープンアーム及びクローズドアームの両方における滞在期間を記録した。60
ロータロッド試験
各動物を、回転速度を5回転毎分(rpm)から40rpmに増加させた回転ロッドに99秒間配置した。各動物の試験は、20分間隔での3回の試行からなっていた。装置から落下するまでの時間(潜時)を、各動物の試行ごとに記録した。試験開始から240秒以内に動物が装置から落下しなかった場合、試験を終了した。61
各動物を、回転速度を5回転毎分(rpm)から40rpmに増加させた回転ロッドに99秒間配置した。各動物の試験は、20分間隔での3回の試行からなっていた。装置から落下するまでの時間(潜時)を、各動物の試行ごとに記録した。試験開始から240秒以内に動物が装置から落下しなかった場合、試験を終了した。61
画像の取得及び分析
免疫染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナーまたはOlympus FV1000共焦点レーザー走査顕微鏡またはNikon A1R+共焦点顕微鏡を使用して画像化した。取得した画像は、関連する顕微鏡ソフトウェアプログラム、すなわち、それぞれ、CaseViewer、F-10-ASWビューアー、及びNIS elementsを使用して処理した。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析した。画像は遺伝子型を盲検化して分析し、処理には明るさとコントラストの全体的な変化が含まれていた。
免疫染色切片は、パノラマデジタルスライドスキャナーまたはOlympus FV1000共焦点レーザー走査顕微鏡またはNikon A1R+共焦点顕微鏡を使用して画像化した。取得した画像は、関連する顕微鏡ソフトウェアプログラム、すなわち、それぞれ、CaseViewer、F-10-ASWビューアー、及びNIS elementsを使用して処理した。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析した。画像は遺伝子型を盲検化して分析し、処理には明るさとコントラストの全体的な変化が含まれていた。
統計解析
すべてのグラフ及び統計解析は、ExcelまたはGraphPad Prism5のいずれかを使用して実行した。実験の結果は、平均±SEMとして示した。両側独立スチューデントt検定を使用して、統計的有意性を試験した。結果は、P<0.05の場合に有意であるとみなされ、それ以外の場合はns(有意性なし)として表された。データ解析は、遺伝子型に対して非盲検で実施した。サンプルサイズとp値を、図の凡例中に示す。
すべてのグラフ及び統計解析は、ExcelまたはGraphPad Prism5のいずれかを使用して実行した。実験の結果は、平均±SEMとして示した。両側独立スチューデントt検定を使用して、統計的有意性を試験した。結果は、P<0.05の場合に有意であるとみなされ、それ以外の場合はns(有意性なし)として表された。データ解析は、遺伝子型に対して非盲検で実施した。サンプルサイズとp値を、図の凡例中に示す。
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実施例3:脳オルガノイドを用いた遺伝性てんかん性脳症のモデル化
序文
てんかんは、再発性発作を発症する慢性的な素因を特徴とする神経障害である(Fisher et al,2014;Aaberg et al,2017)。てんかんは、世界中で約5,000万人が罹患しており、小児において最も頻度の高い慢性神経疾患と考えられている(Aaberg et al,2017;Blumcke et al,2017)。生後早期の発作のおよそ40%は、以前は早期乳児てんかん性脳症(EIEE)として知られていた発達性てんかん性脳症(DEE)が原因である(Howell et al,2021)。これらは発達中の脳の病理であり、難治性のてんかん様活動と脳機能及び認知機能の障害を特徴としている(Lado et al,2013;Shao & Stafstrom,2016;Nashabat et al,2019;Howell et al,2021)。いくつかの遺伝子がDEEの原因に関連すると考えられている(McTague et al,2016)。近年、WWOX遺伝子の常染色体劣性変異について、DEEの病因におけるその役割がますます認識されている(Piard et al,2018;Nashabat et al,2019)。染色体の脆弱部位FRA16Dにまたがる腫瘍抑制因子であるWWOXは脳において高度に発現しており、中枢神経系(CNS)の恒常性における重要な役割が示唆されている(Abu-Remaileh et al,2015)。2014年に、WWOXは、常染色体劣性脊髄小脳失調症-12(SCAR12)(Gribaa et al,2007;Mallaret et al,2014)、及びWWOX関連てんかん性脳症(WOREE症候群、DEE28とも呼ばれる)(Abdel-Salam et al, 2014;Ben-Salem et al,2015;Mignot et al,2015)に関連するとされた。どちらの障害も、発作、知的障害、発達遅延、及び痙縮などの様々な神経学的症状に関連しているが、重症度、発症、及び根底にある突然変異の種類が異なる。WOREE症候群は、より攻撃的であると考えられており、生後1.5か月という早い時期に現れ、より極端な遺伝子変化と関連している(Banne et al,2021)。この観察結果は、両方の症候群が連続体と見なすことができることを示唆している可能性がある。発作に加えて、WOREE症候群の患者は、全体的な発達遅延、進行性小頭症、特定のCNS成分の萎縮、及び早期死亡を呈する場合がある。しかしながら、WOREE症候群の表現型の範囲は広く、患者によって症状が異なることに留意することが重要である。例えば、一部の患者には小頭症が認められるが、他の多くの患者にはこの病態は認められなかい(Piard et al,2018)。
序文
てんかんは、再発性発作を発症する慢性的な素因を特徴とする神経障害である(Fisher et al,2014;Aaberg et al,2017)。てんかんは、世界中で約5,000万人が罹患しており、小児において最も頻度の高い慢性神経疾患と考えられている(Aaberg et al,2017;Blumcke et al,2017)。生後早期の発作のおよそ40%は、以前は早期乳児てんかん性脳症(EIEE)として知られていた発達性てんかん性脳症(DEE)が原因である(Howell et al,2021)。これらは発達中の脳の病理であり、難治性のてんかん様活動と脳機能及び認知機能の障害を特徴としている(Lado et al,2013;Shao & Stafstrom,2016;Nashabat et al,2019;Howell et al,2021)。いくつかの遺伝子がDEEの原因に関連すると考えられている(McTague et al,2016)。近年、WWOX遺伝子の常染色体劣性変異について、DEEの病因におけるその役割がますます認識されている(Piard et al,2018;Nashabat et al,2019)。染色体の脆弱部位FRA16Dにまたがる腫瘍抑制因子であるWWOXは脳において高度に発現しており、中枢神経系(CNS)の恒常性における重要な役割が示唆されている(Abu-Remaileh et al,2015)。2014年に、WWOXは、常染色体劣性脊髄小脳失調症-12(SCAR12)(Gribaa et al,2007;Mallaret et al,2014)、及びWWOX関連てんかん性脳症(WOREE症候群、DEE28とも呼ばれる)(Abdel-Salam et al, 2014;Ben-Salem et al,2015;Mignot et al,2015)に関連するとされた。どちらの障害も、発作、知的障害、発達遅延、及び痙縮などの様々な神経学的症状に関連しているが、重症度、発症、及び根底にある突然変異の種類が異なる。WOREE症候群は、より攻撃的であると考えられており、生後1.5か月という早い時期に現れ、より極端な遺伝子変化と関連している(Banne et al,2021)。この観察結果は、両方の症候群が連続体と見なすことができることを示唆している可能性がある。発作に加えて、WOREE症候群の患者は、全体的な発達遅延、進行性小頭症、特定のCNS成分の萎縮、及び早期死亡を呈する場合がある。しかしながら、WOREE症候群の表現型の範囲は広く、患者によって症状が異なることに留意することが重要である。例えば、一部の患者には小頭症が認められるが、他の多くの患者にはこの病態は認められなかい(Piard et al,2018)。
げっ歯類のWWOX機能喪失のモデル化により、哺乳類の脳におけるWWOXの役割が明らかになった(Aqeilan et al,2007,2008;Suzuki et al,2009;Mallaret et al,2014;Tanna & Aqeilan,2018;Tochigi et al,2019)ものの、特定の患者の遺伝的バックグラウンドと脳の発達は、マウスにおいてモデル化することはできないが、患者由来の人工多能性幹細胞(iPSC)に内在し、保持される。WWOX突然変異を有する患者のものを含む、DEE脳試料の利用可能性の包括的な欠如を回避するために、ゲノム編集及び再プログラミング技術を利用して、WOREE及びSCAR12症候群の患者に認められる遺伝子変化をヒトPSCにおいて再現した。次いで、脳の空間組織と細胞型の形成の多くを再現し、in vitroでニューロン機能を有する脳オルガノイド、3Dニューロン培養物を生成した(Amin & Pasca,2018;Sidhaye & Knoblich,2020)。これにより、2D細胞培養よりもin vivoでのヒトの生理学をより代表する系において、CNSとその複雑な回路の発達と成熟の特徴をモデル化することができた。このプラットフォームを使用して、ニューロン細胞集団、皮質形成、及び電気的活動の重大な欠損を特定し、可能なレスキュー戦略を試験した。このアプローチは、CNSにおけるWWOXの生理学と病態生理学のより深い理解をもたらし、より適切な治療法を開発するための基礎を築き、他のヒトてんかん疾患のモデリングにヒト脳オルガノイドを使用するという概念を支持する。
結果
WWOXノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定
DEEの病因に光を当てるために、脳オルガノイドを使用したプロトタイプモデルとしてWOREE症候群を研究した。制御された遺伝的バックグラウンドにおけるヒト脳の発達におけるWWOXの役割を、WiBR3 hESC系統のWWOXノックアウト(KO)クローンをCRISPR/Cas9系を使用して生成することによって調べた(Abdeen et al,2018)。免疫ブロット分析を使用して、これらの系統におけるWWOX発現を評価した。検証を通じて一貫して検出不可能なタンパク質レベルのWWOXを示した2つのクローン、WWOX-KO系統1B(WKO-1B、以降、KO1)及びWKO-A2(以降、KO2)を選択して、研究を継続した。これらのクローンを、それぞれ核型分析と奇形腫アッセイを使用して、遺伝的安定性と多能性について評価した。サンガー配列決定により、エキソン1でのWWOXの編集を確認した。さらに、WWOXの細胞自律機能を確認するために、WWOX cDNAをWWOX-KO1 hESC系統の内在性AAVS遺伝子座に復元し、表現型の可逆性を調べた。KO1-AAV4系統は、検証全体で強力で安定したWWOXの発現を有するCOを生成するために選択され、以降ではW-AAVと呼ぶ。これらの系統は、培養期間全体の形態及び増殖に関して、親細胞系統(WiBR3 WT)と実質的に区別がつかなかった。
WWOXノックアウト脳オルガノイドの生成及び特徴決定
DEEの病因に光を当てるために、脳オルガノイドを使用したプロトタイプモデルとしてWOREE症候群を研究した。制御された遺伝的バックグラウンドにおけるヒト脳の発達におけるWWOXの役割を、WiBR3 hESC系統のWWOXノックアウト(KO)クローンをCRISPR/Cas9系を使用して生成することによって調べた(Abdeen et al,2018)。免疫ブロット分析を使用して、これらの系統におけるWWOX発現を評価した。検証を通じて一貫して検出不可能なタンパク質レベルのWWOXを示した2つのクローン、WWOX-KO系統1B(WKO-1B、以降、KO1)及びWKO-A2(以降、KO2)を選択して、研究を継続した。これらのクローンを、それぞれ核型分析と奇形腫アッセイを使用して、遺伝的安定性と多能性について評価した。サンガー配列決定により、エキソン1でのWWOXの編集を確認した。さらに、WWOXの細胞自律機能を確認するために、WWOX cDNAをWWOX-KO1 hESC系統の内在性AAVS遺伝子座に復元し、表現型の可逆性を調べた。KO1-AAV4系統は、検証全体で強力で安定したWWOXの発現を有するCOを生成するために選択され、以降ではW-AAVと呼ぶ。これらの系統は、培養期間全体の形態及び増殖に関して、親細胞系統(WiBR3 WT)と実質的に区別がつかなかった。
WWOXの枯渇が3Dコンテキストで脳の発達にどのように影響するかを調査するために、確立されたプロトコルを使用して、hESCを脳オルガノイド(CO)に分化させた(Lancaster et al,2013;Lancaster & Knoblich,2014)。すべての遺伝子型由来のCOは、すべての段階で同等の肉眼的な形態及び発達を示した。次に、オルガノイドに認められる2つの主要な集団であるニューロン前駆細胞とニューロンのマーカーと共染色することにより、様々な時点での発達中の脳におけるWWOXの発現パターンを調査した。10週目には、WWOXの発現は、脳の前駆細胞である放射状グリア細胞(RG)に対応するSOX2+細胞からなる心室様帯(VZ)に特異的に局在しており、周囲の細胞には局在していなかった。この調査結果は、マウスの皮質発達の初期段階で限定されたWWOX発現を示す以前の研究と一致している(Chen et al,2004)。VZ内のWWOX発現細胞の同一性を確認するために、脳室放射状グリア細胞(vRG)で特異的に発現するクリスタリンαB(CRYAB)について共染色し(Pollen et al,2015)、これらの細胞においてWWOX発現を確認した(図11B)。さらに、VZ構造が失われる24週目などの後の時点でさえも、WWOXの発現は主にSOX2+細胞において認められる。重要なことに、WWOX-KO系統から生成されたCOにおいてWWOX発現は認められなかったが、他のマーカー、例えば、SOX2及びニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリン(TUBB3またはTUJ1)の、同様のレベルの発現が観察された(図11B)。興味深いことに、WWOX発現がヒトユビキチンプロモーター(UBP)によって駆動されるW-AAV COは、予想どおり、VZにおいて高いWWOXレベルを示したが、他の細胞集団も顕著なWWOX発現を示した。
次に、一部の患者で観察された小頭症の表現型に対処するために、培養期間を通じてオルガノイドの直径を測定したが、有意差は示されなかった。この結果、組織学的脳構造の発達を調べることとなった。WTオルガノイドでは、SOX2+細胞からなるVZは、中間前駆細胞(IP;TBR2+細胞、EOEMSとも呼ばれる)に囲まれており、これは脳室下帯(SVZ)の存在を示している。この層の外側は皮質板(CP)であり、主にニューロン(NeuN+細胞)からなる。10週目のCOでは、VZ及び周囲構造の組成または形成において、目に見える差異は観察されず(図11C)、これらの集団が同様の割合であることが示唆された。これは、前駆細胞マーカー(SOX2及びPAX6)ならびにニューロンマーカーTUBB3のRNA発現レベルを測定することによっても裏付けられた(図11C)。この驚くべき観察により、COに認められる2つの主要なニューロン部分集団であるグルタミン酸作動性ニューロン(小胞グルタミン酸トランスポーター1、VGLUT1によって示される)及びGABA作動性ニューロン(グルタミン酸デカルボキシラーゼ67、GAD67によって示される)をさらに調べることとなった。免疫染色により、WTと比較してKO COにおいて、VGLUT1の発現は同様のままであったが、GAD67の発現は顕著な増加が観察されたことが明らかになった。対照的に、WWOX修復(W-AAV)は、この不均衡を有意に逆転させた(図11D)。SLC17A6(VGLUT2)、SLC17A7(VGLUT1)、GAD1(GAD67)及びGAD2(GAD65)のRNAレベルは同じ傾向を示した。
これらの調査結果は、ヒト胚発生中、WWOX発現はVZの頂端層の細胞に限定され、WWOXの枯渇はVZ-SVZ-CP構造に影響を与えなかったが、グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンの間のバランスを乱したことを示唆している。
WWOXが枯渇した脳オルガノイドは、過興奮性及びてんかん様活動を示した
脳オルガノイドは、電気生理学的機能が以前に示されたニューロンを生み出す(Trujillo et al,2019)。WWOX-KO COの機能特性を特徴決定するために、7週目のCO切片で局所集合電位(LFP)記録を実施した。電極を、切片の端から150μm離して配置し(データは示さず)、切片の調製によって損傷を受ける可能性のある領域を避けた。WT及びKO COのサンプルトレースは、ベースライン条件下での2つの系統間の目に見える差異を明らかにした(図12A、左)。電場記録の平均スペクトルパワーは、通常、徐波振動(SWO、<1Hz)とラベル付けされる0.25~1HzでのKO COのパワーの全体的な増加(図12B)、及び30~79.9Hzの高周波範囲での減少を示した。振動パワー(OP)を曲線下面積によって定量化し、これはベースライン条件下でWT系統よりも有意に高かった(図12C)。時間が経つにつれて、KO系統のOPは有意に減少したが、WT系統のOPは同じままであり、KO系統の発達の遅れが示唆された。
脳オルガノイドは、電気生理学的機能が以前に示されたニューロンを生み出す(Trujillo et al,2019)。WWOX-KO COの機能特性を特徴決定するために、7週目のCO切片で局所集合電位(LFP)記録を実施した。電極を、切片の端から150μm離して配置し(データは示さず)、切片の調製によって損傷を受ける可能性のある領域を避けた。WT及びKO COのサンプルトレースは、ベースライン条件下での2つの系統間の目に見える差異を明らかにした(図12A、左)。電場記録の平均スペクトルパワーは、通常、徐波振動(SWO、<1Hz)とラベル付けされる0.25~1HzでのKO COのパワーの全体的な増加(図12B)、及び30~79.9Hzの高周波範囲での減少を示した。振動パワー(OP)を曲線下面積によって定量化し、これはベースライン条件下でWT系統よりも有意に高かった(図12C)。時間が経つにつれて、KO系統のOPは有意に減少したが、WT系統のOPは同じままであり、KO系統の発達の遅れが示唆された。
KO系統の過興奮性をさらに測定するために、発作誘発に一般的に使用される痙攣薬である100μM 4-APを記録中に切片に塗布した。4-APがWT系統とKO系統の両方のLFP記録において変化を示した(図12A、右)一方で、KO系統は有意に増加した活性を示したが、これはWTトレースでは認められなかった。スペクトルパワーに対する4-APの効果は、その添加の5分後に明らかになった。4-APの存在下でのWT及びKO系統の両方についてのサンプルトレースの交差周波数カップリングにより、δ:HFO周波数ペア(発作の準安定状態を特徴付けて分類するために以前に使用された属性(Guirgis et al,2013))の増加が明らかとなった。重要なことに、WWOX cDNAを含むレンチウイルスの形質導入は、平均パワースペクトル密度に関して、KO系統の回復をもたらした(図12D及びE)。
WWOXが枯渇した脳オルガノイドは、アストロジェネシス及びDNA損傷応答の障害を示した
脳内の興奮性活動と抑制性活動の間の不均衡が発作の主要なメカニズムであることは広く受け入れられているが、これは必ずしもニューロンが、関与する唯一の集団であることを意味するわけではない。てんかん患者の脳試料が炎症、星状細胞の活性化、及びグリオーシスの徴候を示すことはよく知られており(Cohen-Gadol et al,2004;Thom,2009)、いくつかの場合ではこれが唯一の組織病理学的所見であり得る(Blumcke et al,2017)。この現象が急性発作の結果なのか、発作の原因なのかはまだ議論の余地がある(Vezzani et al,2011;Robel et al,2015;Rossini et al,2017;Patel et al,2019)。さらに、最近の研究では、Wwox nullマウスの脳にアストログリオーシスが存在することが示された(Hussain et al,2019)。
脳内の興奮性活動と抑制性活動の間の不均衡が発作の主要なメカニズムであることは広く受け入れられているが、これは必ずしもニューロンが、関与する唯一の集団であることを意味するわけではない。てんかん患者の脳試料が炎症、星状細胞の活性化、及びグリオーシスの徴候を示すことはよく知られており(Cohen-Gadol et al,2004;Thom,2009)、いくつかの場合ではこれが唯一の組織病理学的所見であり得る(Blumcke et al,2017)。この現象が急性発作の結果なのか、発作の原因なのかはまだ議論の余地がある(Vezzani et al,2011;Robel et al,2015;Rossini et al,2017;Patel et al,2019)。さらに、最近の研究では、Wwox nullマウスの脳にアストログリオーシスが存在することが示された(Hussain et al,2019)。
これに対処するために、免疫蛍光染色を使用して、15週目と24週目のCOで星状細胞マーカーのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)とS100カルシウム結合タンパク質B(S100β)を可視化した(図13A~C)。これにより、WWOX-KO COにおける星状細胞の著しい増加が時間の経過と共に進行することが明らかになり、これはW-AAV COでは部分的に逆転した。これは、20週目のCOの免疫ブロット分析によってさらに裏付けられた。GFAPがRGも示すことは注目に値し(Middeldorp et al,2010)、RGは15週目には豊富であるが、24週目には数が減少し、初期段階でのノイズの原因となり得る。
星状細胞は、脳内の2つの異なる細胞集団:神経発生からアストロジェネシスにスイッチするRG細胞、または星状細胞前駆細胞(APC)から発生する(Zhang et al,2016;Blair et al,2018)。星状細胞マーカーのこれらの差異を追跡するために、6週齢及び10週齢のCOを比較した。WTオルガノイドで星状細胞マーカーが検出されなかった6週目のCOでは、VZでS100βの有意な発現が観察されたことが判明した(図13D)。10週目に、WTオルガノイドとKOオルガノイドの両方でS100βの発現が観察されたが、細胞増殖マーカーKi67で共染色を行った場合、同様のグリア増殖を示唆する二重陽性細胞に有意差は検出されなかった。Ki67+核をSOX2+核と共に定量化したところ、SOX2の割合はWWOX-KOと比較してWTにおいてインタクトなままであったが(WTでは18.5%、95%CI=14.2~22.81;KOでは19.5%、95%CI=15.29~22.81)、増殖細胞(WTでは9.5%、95%CI=6.63~12.35;KOでは4.9%、95%CI=2.76~7.13)及びKi67+/SOX2+二重陽性細胞(WTでは51.83%、95%CI=41.18~62.48;KOでは27.09%、95%CI=14.1~40.1)の割合は減少していた。これらの調査結果は、WWOXの損失時にSOX2+細胞の全体的な増殖は減少するものの、VZの外側のRGの総量は影響を受けないことを意味しており、星状細胞の供給源に関して疑問が生じる。
KO COにおけるvRGのこの特異な挙動により、WWOXが直接関与することが知られているシグナル伝達経路である生理的DNA損傷応答(DDR)を調べることで、その機能を詳しく調べることができた(Abu-Odeh et al,2014b;Abu-odeh et al,2016)。この目的のために、DNA二本鎖切断の代理マーカーであるγH2AXと53BP1について染色を行った。VZの最内層においてSOX2+細胞の核内にγH2AXと53BP1病巣の顕著な蓄積が認められ、それぞれ、WWOX-KOにおいて平均1.5病巣/核[95%CI=1.33~1.74]及び1.2病巣/核[95%CI=1~1.38]であった。これは、同齢のWT COにおける0.78 γH2AX病巣/核[95%CI=0.55~1.02]及び0.62 53BP1病巣/核、ならびに同齢のW-AAV COにおける0.58病巣/核[95%CI=0.38~0.77]及び0.56病巣/核[95%CI=0.37~0.76](図13E及びF)と比較される。これらの調査結果は、DDRシグナル伝達におけるWWOXの直接的な役割と一致している(Aqeilan et al,2014;Hazan et al,2016)。重要なことに、W-AAV COはDDRの向上を示した。興味深いことに、VZにおいて高度に増殖している細胞では、より多数のγH2AX病巣が認められ、これはKi67との共染色によって観察され、SOX2+細胞の18.6%がKO COにおいて二重陽性であった(11.9%[95%CI=8~15%]と比較して[95%CI=15~22%])。これにより、損傷した細胞の継続的な増殖にはアポトーシスの減少が伴う可能性があり、これはチェックポイント阻害の喪失を示している可能性があると推測された。この仮説は、VZにおいて切り離されたカスパーゼ-3を染色することにより解決され、それによると、WWOX-KO時にこれらの細胞のアポトーシスが減少することが明らかになったが、これはW-AAV COではレスキューされた。
結論として、WWOX-KO COでは、おそらくRGの分化の増強、及び神経前駆細胞におけるDNA損傷の増加により、星状細胞の数が漸増する。
WWOX枯渇脳オルガノイドのRNA配列決定により、主要な分化欠損が明らかになった
分子特性を調べるために、15週目のWT及びKO COで全トランスクリプトームRNA配列決定(RNA-seq)分析を実施した。脳オルガノイドの既知の不均一性にもかかわらず、主成分分析(PCA)は、サンプルを2つの異なるクラスターに分離した。この分析により、15,370個の示差的に発現する遺伝子が明らかになり、そのうち1,246個の遺伝子がWWOX-KO COにおいて上方制御されており、1.2超の倍率変化(FC>1.2)と有意なP値(P<0.01)を示し、また、1,021個の遺伝子が下方制御されていた(FC<1/1.2,P<0.01)。上方制御された上位100の遺伝子の中で、GABA作動性ニューロン(GAD1、GRM7、LHX5)及び星状細胞(AGT、S100A1、GJA1、OTX2)などの神経集団、ならびにカルシウムシグナル伝達(HRC、GRIN2A、ERBB3、P2RX3、HTR2C、PDGFRA)及び軸索ガイダンス(GATA3、DRGX、ATOH1、NTN1、SHH、RELN、OTX2、SLIT3、GBX2、LHX5)などのニューロンプロセスに関連する遺伝子を見出した。下方制御された上位100の遺伝子では、GABA受容体(GABRB3、GABRB2)、オートファジー(IFI16、MDM2、RB1、PLAT、RB1CC1)、及びmTOR経路(EIF4EBP1、PIK3CA、RB1CC1)に関連する遺伝子があった。
分子特性を調べるために、15週目のWT及びKO COで全トランスクリプトームRNA配列決定(RNA-seq)分析を実施した。脳オルガノイドの既知の不均一性にもかかわらず、主成分分析(PCA)は、サンプルを2つの異なるクラスターに分離した。この分析により、15,370個の示差的に発現する遺伝子が明らかになり、そのうち1,246個の遺伝子がWWOX-KO COにおいて上方制御されており、1.2超の倍率変化(FC>1.2)と有意なP値(P<0.01)を示し、また、1,021個の遺伝子が下方制御されていた(FC<1/1.2,P<0.01)。上方制御された上位100の遺伝子の中で、GABA作動性ニューロン(GAD1、GRM7、LHX5)及び星状細胞(AGT、S100A1、GJA1、OTX2)などの神経集団、ならびにカルシウムシグナル伝達(HRC、GRIN2A、ERBB3、P2RX3、HTR2C、PDGFRA)及び軸索ガイダンス(GATA3、DRGX、ATOH1、NTN1、SHH、RELN、OTX2、SLIT3、GBX2、LHX5)などのニューロンプロセスに関連する遺伝子を見出した。下方制御された上位100の遺伝子では、GABA受容体(GABRB3、GABRB2)、オートファジー(IFI16、MDM2、RB1、PLAT、RB1CC1)、及びmTOR経路(EIF4EBP1、PIK3CA、RB1CC1)に関連する遺伝子があった。
上位3,000の示差的に発現する遺伝子の遺伝子セット濃縮分析(GSEA)及び遺伝子オントロジー(GO)濃縮分析により、とりわけ、ATP合成共役電子伝達及び酸化的リン酸化に関連するプロセスの阻害が明らかになったが、これらはすべて、マウスモデルにおいて以前に報告されたWWOXの機能と一致している(Abu-Remaileh & Aqeilan,2014,2015;Abu-Remaileh et al,2018)。以前に報告されたチェックポイント阻害の減少と一致する、細胞周期の負の調節に関連する遺伝子の下方制御が認められた(Abu-Odeh et al,2014b;Abu-odeh et al,2016)。一方、領域形成、ニューロン運命決定及び運命特定、軸の特定(腹側-背側及び前側-後側)、ならびに解糖及び糖新生に関連する経路において顕著な濃縮が認められ、それらのいくつかは過去の研究でも支持されている(Wang et al, 2012;Abu-Remaileh & Aqeilan,2014)。予想されるように、上方制御された遺伝子は、Wnt経路(例えば、WNT1、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT5A、WNT8B、LEF1、AXIN2、GBX2、ROR2、LRP4、NKD1、IRX3、CDH1)及びShh経路(例えば、SHH、GLI1、LRP2、PTCH1、HHIP、PAX1、PAX2)などの発生経路に関連していた。
WWOXは、以前にWntシグナル伝達経路に関与するとされていたため(Bouteille et al,2009;Wang et al,2012;Abu-Odeh et al,2014a;Cheng et al,2020;Khawaled et al,2020)、これを本発明者らのCOモデルでさらに調査することにした。まず、RNA-seqデータを使用して、WNTシグナル伝達経路(WNT1、WNT3、WNT5A、WNT8Bなど)、標準的な標的(Axin2、TCF7L2、LEF1、TCF7L1など)、脳特異的標的(IRX3、ITGA9、GATA2、FRAS1、SP5)、及び受容体(ROR2、FZD2、FZD10、FZD1)の様々なメンバーの発現を調べた。次に、qPCRを使用してこれらの遺伝子のいくつかを検証した(図14A)。また、WNT3、WNT3A、WNT1、及びROR2を含む、W-AAV COにおけるWnt関連遺伝子のいくつかの下方制御も観察された(図14A)。さらに、Wnt活性化を証明するために、標準的なWnt経路の特徴であるβ-カテニンの核への移行を示した。この目的のために、16週目のCOを細胞質画分と核画分に細分し、免疫ブロッティングした(図14B)。WWOX-KO COの核内のβ-カテニンの正規化された強度において、およそ1.7倍の増加が認められ、これはWWOXの喪失後のWnt経路活性化の概念を支持するものであった。これは、6~24週目にいくつかのWnt関連遺伝子(WNT3、AXIN2、LEF1、及びTCF7)の動的発現を調べることによっても裏付けられ、WT COの漸減と比較して、KO COの慢性的なWnt活性化が明らかになった。
最近のエビデンスでは、発達中の前脳オルガノイドにおけるWntの活性化により、ニューロンの特定及び皮質層形成の乱れが生じることが示されている(Qian et al,2020)。これがWWOX-KO COで発生するかどうかを調べるために、RNA-seqデータで皮質層マーカーの発現レベルを調べた(Qian et al,2016)。興味深いことに、6層すべてで変化が観察され、第I~IV層(TBR1、BCL11B、SATB2、POU3F2で示される)では発現の減少が示され、表層V~VI(CUX1及びRELNで示される)では顕著な増加が示された。このパターンは、qPCRによっても確認された。興味深いことに、免疫蛍光染色を使用してタンパク質レベルを調べたところ、WWOX-KO COにおいて、障害性の発現パターン及び階層化、ならびにTBR1+、CTIP2+(BCL11B)、及びSATB2+ニューロンの混合も観察された(図17D及びE)。この欠損は進行性で、24週目に悪化した。驚くべきことに、異所性WWOX発現の影響を調べると、あまり明確でない表現型が観察された。WWOX-KO COと比較してW-AAV COではCTIP2+細胞及びSATB2+細胞の数が回復し、階層化が改善されたが、RNAレベルは部分的にしか改善されなかった。対照的に、WWOX-KOにおいて上方制御された表層マーカーCUX1及びRELNの発現は、上層マーカーPOU3F2(BRN2)と共にW-AAVにおいて減少していた。重要なことに、COの背側及び腹側遺伝子の発現を調べると、高いRNA読み取り数によって評価されるように、オルガノイドが背側の同一性であることが観察された。注目すべきことに、これらのマーカーの発現において、WTとKOの間に統計的に有意な差は観察されなかった。
全体として、RNA-seqは、WWOX-KO COにおける空間パターン形成、軸形成、及び皮質層形成の障害を明らかにしたが、これは、細胞経路の混乱及びWntシグナル伝達の活性化と相関している。WWOXの再導入は、これらの変化をある程度防ぎ、遺伝子治療におけるその可能な意義がさらに支持される。
患者由来のWWOX関連の発達性及びてんかん性脳症の脳オルガノイド
CRISPRで編集された細胞を使用した疾患モデリングは広く使用されているツールであるが、ヒトの患者の完全な遺伝的バックグラウンドをモデル化していないという批判がある。したがって、重症度が異なるWWOX関連疾患を有する2つの家族から提供された末梢血単核球(PBMC)を再プログラムした。第1の家族は、ホモ接合患者にWOREE症候群(DEE28)表現型をもたらすc.517-2A>Gスプライス部位変異(Weisz-Hubshman et al,2019)を保有し(WSMファミリーと呼ばれる)、第2の家族は、ホモ接合患者にSCAR12表現型をもたらすc.1114G>C(G372R)変異(Mallaret et al,2014)を保有する(WPMファミリーと呼ばれる)。すべてのiPSC系統は、プライミングされたhPSCと自己再生能力の正常な形態を示し、これらを多能性マーカーの発現について評価した。
CRISPRで編集された細胞を使用した疾患モデリングは広く使用されているツールであるが、ヒトの患者の完全な遺伝的バックグラウンドをモデル化していないという批判がある。したがって、重症度が異なるWWOX関連疾患を有する2つの家族から提供された末梢血単核球(PBMC)を再プログラムした。第1の家族は、ホモ接合患者にWOREE症候群(DEE28)表現型をもたらすc.517-2A>Gスプライス部位変異(Weisz-Hubshman et al,2019)を保有し(WSMファミリーと呼ばれる)、第2の家族は、ホモ接合患者にSCAR12表現型をもたらすc.1114G>C(G372R)変異(Mallaret et al,2014)を保有する(WPMファミリーと呼ばれる)。すべてのiPSC系統は、プライミングされたhPSCと自己再生能力の正常な形態を示し、これらを多能性マーカーの発現について評価した。
次いで、WSMファミリーの健康なヘテロ接合体の親(父親はWSM F1と呼ばれ、母親はWSM M2と呼ばれ、まとめてWSM Pと呼ばれる)及び疾患を有するホモ接合体の息子(系統WSM S2及びS5、まとめてWSM Sと呼ばれる)から単離したiPSCからCOを生成した。さらに、W-AAV COについて記載したレスキューアプローチを採用し、WSM S5系統にWWOXを再導入した(WSM S5 W-AAV3及びW-AAV6と呼ばれ、まとめてWSM S W-AAVと呼ばれる)。次いで、これらのオルガノイドをニューロン分化及びVZ形成について検証した(図15A)。hESC由来のCOと同様に、WWOXは、主にWSM F1及びWSM M2のVZで発現していた。β3チューブリン+陽性細胞とSOX2+陽性細胞の数は同程度であり、WSM S COは検出可能なレベルの WWOXを示さず、WSM S W-AAV COは全体的にWWOXを発現していた。
次に、WSM S COのニューロン過興奮性を評価するために、41個のWSM S COのニューロン、ならびにWSM P CO由来の24個のニューロン及びWSM S W-AAVオルガノイド由来の40個のニューロンの細胞接着記録を実施した。WSM S、WSM P、及びWSM S W-AAV CO由来の活動電位の自然発火でサンプルをトレースすると、同じ条件下で記録された3群間の目に見える差異が明らかになった。WSM S COは、WSM P及びWSM S W-AAVオルガノイドと比較して、活動電位のバースト及び全体的なニューロン活動の上昇を示した(図15B)。WSM S COのニューロンを、WSM P(P<0.0001)及びWSM S W-AAV(P<0.0001)COのニューロンと比較した(図15C)。WSM PとWSM S W-AAV COのニューロンの発火率に有意差はなかった(P=0.7681)。重要なことに、WSM F1系統のCOをWSM M2系統と比較しても、有意差は観察されなかった(P=0.0952)。全体として、これらの結果は、両親と比較して、WOREE症候群の患者に由来する7週齢のオルガノイドにおけるニューロン過興奮性を示している。
他の調査結果と一致して、第10週のWSM S COは、WSM F1及びWSM M2と比較してGAD67の発現増加を示し、この表現型はWSM S W-AAV COにおいては逆転した(図15D及びE)VGLUT1の発現は、異なる系統間で変化しなかった。次に、星状細胞マーカーの発現を評価し、同齢の対照と比較してWSM SにおいてGFAP及びS100βの発現が増加していることを見出した(図16A)。WSM S COのvRGにおけるDDR欠損も明らかであった(図16B及びC)。Wnt経路の状態もqPCRを用いて評価し、同齢のWSM P及びWSM S W-AAVと比較して、10週目のWSM S COにおける活性化を示唆する所見が得られた(図16D)。最後に、免疫蛍光を使用して皮質の層状化を評価し、WSM S COにおいて皮質マーカーCTIP2+及びSATB2+の発現の減少を見出した(図16E及びF)。
表現型の大部分がCOの皮質領域で観察されたため、皮質におけるWWOXの実証された役割を考慮して、皮質固有のプロトコルを採用し、前脳オルガノイド(FO)を生成することにした(Qian et al,2016,2018)。まず、再現性を検証するために、WSM F1とWSM S5からFOを生成し、WSM COの同等の表現型を見出した。
次に、患者の表現型がより軽度であるWPM SCAR12ファミリーが、WOREE症候群のCO及びFOと同様の表現型を示すかどうかを調査しようとした。健康なヘテロ接合体の父と母(WPM F2及びWPM M3)と、その影響を受けたホモ接合体の娘と息子(WPM D1及びWPM S1)からFOを生成した。予想どおり、FOは、形態、成長、ならびにβ3チューブリン及びSOX2の発現の点で区別がつかなかったが、WPM F2とWPM M3のVZではWWOXが検出された一方で、WPM D1及びS1ではほとんどシグナルが観察されず、これはiPSCのWWOXレベルと一致していた。背側前脳の同一性を、PAX6の染色によって検証した。驚くべきことに、ニューロンマーカーの転写産物発現レベルでは、グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンの比率において明らかな差異が示されなかった。同様の遺伝子型を有する系統由来のFO間でいくつかの差異が認められたが、健康なiPSC系統(WPM F2及びWPM M3)と疾患を有する系統(WPM D1及びWPM S1)の間で皮質層のマーカー発現が同等レベルであったことにより、正常なニューロン及び皮質の発達の概念が裏付けられた。興味深いことに、Wnt遺伝子のRNAレベルは、Wnt経路の活性化を示唆するパターンを示し、より軽度の疾患の病因におけるその役割に関する疑問が生じた。さらに、星状細胞レベルについての免疫染色及びqPCR分析では、有意差は明らかにならなかった。最後に、FOのVZでのDDRシグナル伝達を分析したところ、健康なSCAR12個体と疾患のSCAR12個体の間でDNA損傷病巣の蓄積に大きな差異は認められなかった。全体として、これらのデータは、SCAR12とWOREE症候群由来のオルガノイドの間で発達結果が異なることを示唆している。
考察
DEEは、根底にある分子病理が不明な重度の神経学的症候群の群である(Howell et al,2021)。ヒト試料へのアクセスの欠如と合わせて、現在の医療が不足していることは驚くべきことではない。本発明者らの研究は、重度のWOREE症候群におけるWWOXの役割と共に、発生生物学における主要な技術的進歩を利用して、組織に関連した状況でヒトの難治性DEEをモデル化することに着手した。遺伝子操作と再プログラミングを電気生理学と共に利用することにより、WWOXをCRISPRで編集した脳オルガノイドと患者由来の脳オルガノイドの両方で過興奮性が観察され、てんかん様活動がうまく示された。次いで、疾患の病態生理学の考え得るメカニズムを強調する細胞及び分子の変化をさらに調べた。まず、ニューロン集団は量的にはほとんどインタクトであったが、GABA作動性マーカーが著しく増加していることに気付いた。RNA-seqで認められるGABA受容体成分の減少を考慮すると、この発見はさらに驚くべきものである。これは、これらのオルガノイドで観察される電気的活動の増加を裏付ける、正常でバランスの取れたニューロンネットワークの発達の乱れを示している可能性がある。発達中にGABA作動性シナプスが脱分極効果を有することがいくつかのエビデンスから示唆されていることに留意すべきである(Obata et al,1978;Ben-Ari et al,2007;Murata & Colonnese,2020)。発達性てんかんにおける発作のダイナミクスは、GABAA受容体の活性化による過分極ではなく、特に、脱分極塩化物反転電位をもたらす細胞内塩化物の蓄積によるGABA応答の脱分極に依存することが知られている(Khalilov et al.2005;Ben-Ari et al,2007)。WWOX枯渇CO及びWSM FOにおける平均スペクトルパワーの増加、及びWWOXを含むレンチウイルスの存在下でのその回復のエビデンスは、脱分極GABAが発作感受性において重要な役割を果たすという考えをさらに強化する。これらの調査結果は、未成熟ニューロンに対する一般的な抗けいれん療法の効力の欠如に新たな光を当て(Khalilov et al,2005;Murata & Colonnese,2020)、WWOX枯渇COは、興奮性GABA作動性応答を標的とする新規治療法を試験し、研究するための有用なモデルとなる。SWOの増加は、発作サイクルの様々な段階(発症、発作中、及び終結)に以前から関連していた(Bragin & Engel,2008)。以前の研究では、SWOが皮質の興奮性を調節し(Vanhatalo et al,2004)、発作前の期間に発作開始ゾーンを局在化することができることも示されている(Miller et al,2007)。さらに、満期産児及び早産児の脳波発作活動の特徴として徐波が特定されている(Patrizi et al,2003)。発作発生時のSWOのメカニズムはよくわかっていない。しかしながら、いくつかの仮説により、細胞外カリウムの増加、pH、グリア細胞の機能不全、及び/または血液脳関門機能の変化が示唆されている(Bragin & Engel,2008)。そのメカニズムを調査することは本紙の範囲を超えるものであるが、これらを将来調査することは興味深い方向性である。
DEEは、根底にある分子病理が不明な重度の神経学的症候群の群である(Howell et al,2021)。ヒト試料へのアクセスの欠如と合わせて、現在の医療が不足していることは驚くべきことではない。本発明者らの研究は、重度のWOREE症候群におけるWWOXの役割と共に、発生生物学における主要な技術的進歩を利用して、組織に関連した状況でヒトの難治性DEEをモデル化することに着手した。遺伝子操作と再プログラミングを電気生理学と共に利用することにより、WWOXをCRISPRで編集した脳オルガノイドと患者由来の脳オルガノイドの両方で過興奮性が観察され、てんかん様活動がうまく示された。次いで、疾患の病態生理学の考え得るメカニズムを強調する細胞及び分子の変化をさらに調べた。まず、ニューロン集団は量的にはほとんどインタクトであったが、GABA作動性マーカーが著しく増加していることに気付いた。RNA-seqで認められるGABA受容体成分の減少を考慮すると、この発見はさらに驚くべきものである。これは、これらのオルガノイドで観察される電気的活動の増加を裏付ける、正常でバランスの取れたニューロンネットワークの発達の乱れを示している可能性がある。発達中にGABA作動性シナプスが脱分極効果を有することがいくつかのエビデンスから示唆されていることに留意すべきである(Obata et al,1978;Ben-Ari et al,2007;Murata & Colonnese,2020)。発達性てんかんにおける発作のダイナミクスは、GABAA受容体の活性化による過分極ではなく、特に、脱分極塩化物反転電位をもたらす細胞内塩化物の蓄積によるGABA応答の脱分極に依存することが知られている(Khalilov et al.2005;Ben-Ari et al,2007)。WWOX枯渇CO及びWSM FOにおける平均スペクトルパワーの増加、及びWWOXを含むレンチウイルスの存在下でのその回復のエビデンスは、脱分極GABAが発作感受性において重要な役割を果たすという考えをさらに強化する。これらの調査結果は、未成熟ニューロンに対する一般的な抗けいれん療法の効力の欠如に新たな光を当て(Khalilov et al,2005;Murata & Colonnese,2020)、WWOX枯渇COは、興奮性GABA作動性応答を標的とする新規治療法を試験し、研究するための有用なモデルとなる。SWOの増加は、発作サイクルの様々な段階(発症、発作中、及び終結)に以前から関連していた(Bragin & Engel,2008)。以前の研究では、SWOが皮質の興奮性を調節し(Vanhatalo et al,2004)、発作前の期間に発作開始ゾーンを局在化することができることも示されている(Miller et al,2007)。さらに、満期産児及び早産児の脳波発作活動の特徴として徐波が特定されている(Patrizi et al,2003)。発作発生時のSWOのメカニズムはよくわかっていない。しかしながら、いくつかの仮説により、細胞外カリウムの増加、pH、グリア細胞の機能不全、及び/または血液脳関門機能の変化が示唆されている(Bragin & Engel,2008)。そのメカニズムを調査することは本紙の範囲を超えるものであるが、これらを将来調査することは興味深い方向性である。
他方、図12A~Cは、より高い周波数の活動、すなわち、ベータ(12~30Hz)及びガンマ(>30Hz)振動の減少を示している。より高い周波数の活動、特にガンマ振動は、特定の病巣域で発作が始まる前に増加することが知られており、てんかん発生の決定因子の可能性として研究されてきた(Medvedev et al,2011)が、本発明者らのデータはWWOX関連の発作についてこれを支持しない。これについて考えられる説明の1つは、7週齢のCOの成熟度である。ガンマ振動は機能的結合に関連しており、脳構造内及び脳構造全体でニューラルネットワークを統合する(Kheiri et al,2013;Ahnaou et al,2017)。これらの高周波数範囲での低出力は、WWOX-KOオルガノイドの発達の遅れと機能的結合の低下が原因である可能性がある。12週目のWSM FOにおける興味深い観察結果は、WSM S5 FOの活動が高周波数範囲で増強されたことである。この対比性は、年齢、発達プロトコル、または検出されたてんかん様活動の根底にあるメカニズムが原因である可能性がある。これら、特に根底にあるメカニズムを、詳細な単一細胞分析を使用し、標的化されたチャネル遮断薬と薬物を使用してさらに調査する必要がある。
次に、脳オルガノイドに認められる他の集団を詳細に調べたところ、星状細胞マーカーの増加が認められたが、高レベルのWWOXを発現するRG集団は正常な比率を維持しているように思われた。このパターンは早い段階で検出され、APCではなくvRGに由来するようであった。考えられる説明は、WWOXが枯渇したオルガノイドで観察される障害性のDDRシグナル伝達である。ESC由来及び初代マウス神経幹細胞(NSC)の両方における以前の研究では、核内またはミトコンドリアDNA内のDNA損傷病巣の蓄積が、NSCを星状細胞への分化に移行させることがわかった(Wang et al,2011;Schneider et al,2013)。CNSにおいて、生理的DNA切断は、複製ストレス(主に前駆細胞の分裂における)、活性酸素種(ROS)の蓄積の結果としての酸化及び代謝ストレス、さらにはニューロン活動(発達過程及び学習の一部として)によって形成され得る(Suberbielle et al,2013;Madabhushi et al,2014;Madabhushi et al,2015)。これらの切断の修復障害は、CNSの病理学及び神経変性の発生と関連している(Suberbielle et al,2013;Madabhushi et al,2014;Shanbhag et al,2019)。この調査結果は、vRGにおけるWWOXの恒常的な役割を示唆しており、WWOXは生理学的条件で適切なDDRシグナル伝達を維持し、分化障害に関連するDNA損傷の蓄積を予防する。DDR分析ではvRGに焦点を当てることを選択したが、それらはWWOXを高度に発現するため、データはこれらの切断がvRGにおいて特に蓄積し、子孫に持続する可能性があることを示唆していないことに留意することは重要である。
機能的なシナプスと複雑なニューラルネットワークのダイナミクスを開発する脳オルガノイドの能力は、集中的な研究を通じて急速に確立されている(Trujillo et al,2019;Sidhaye & Knoblich,2020)が、てんかん様活動をモデル化する能力は、最近研究されたばかりである(前刷り:Samarasinghe et al,2019;Sun et al,2019)。Sun et al(2019)は、脳オルガノイドを利用して、UBE3A-KO hESCを使用してエンジェルマン症候群をモデル化し、2D及びマウスモデルで観察された過活動ニューロン発火、異常なネットワーク同期、及び根底にあるチャネル障害を再現した(Sun et al,2019)。Samarasinghe et al(2019)は、オルガノイド融合法を利用して、レット症候群患者のiPSCから抑制性介在ニューロンが豊富なオルガノイドを生成した。疾患を有するオルガノイドでは、過興奮性に対する感受性、マイクロ回路クラスターの減少、反復するてんかん様スパイク、及び周波数振動の変化が観察されたが、これらは、機能不全の抑制性ニューロンにまで遡る(前刷り:Samarasinghe et al,2019)。さらに、このモデルを使用して、変異オルガノイドをバルプロ酸(VPA)またはTP53阻害剤であるピフィスリン-α(PFT)で処置することにより、治療オプションを試験したところ、ビヒクルでの処置と比較してニューロン活動の改善が示され、VPAよりもPFTを使用した方が良好な結果が得られた。これらの研究は先駆的ではあるが、疾患モデリングオルガノイドに認められる電気生理学的変化に焦点を当てた。機械的研究を指示するための、てんかん患者において肉眼的な神経組織学的変化がないことを考慮して(Blumcke et al,2017)、本発明者らの研究では、てんかんの分子研究のための脳オルガノイドの利用を強化しようとした。この目標は、バルクRNA-seq分析によって強調され、領域同一性獲得の欠損、皮質層の混乱、及びWntシグナル伝達の活性化を示している。後者は、発作誘発性の脳への影響の調節因子としてのWntシグナル伝達経路の意図された役割に照らして特に興味深いものであり、したがって治療の標的となり得る(Yang et al,2016;Qu et al,2017;Hodges & Lugo,2018)。前述の皮質形成不全は皮質異形成を連想させ、これは薬剤耐性てんかんの病因においてよく知られている役割を有している(Tassi et al,2002;Fauser et al,2006;Kobow et al,2019)。
この調査結果と一致して、WOREE症候群に罹患している胎児の脳組織を調べた最近の研究では、皮質の分子層内の外部顆粒層の異常な移動が報告されたが、これは、WWOX自然突然変異ラットモデルでも検証された表現型である(Iacomino et al,2020)。この観察結果は、shRNAを使用してWWOXをサイレンシングした後、ヒトニューロン前駆細胞(hNPC)に対して行ったKosla et al(2019)によるトランスクリプトーム解析によってさらに裏付けられている。この研究では、WWOXをノックダウンすると、WT hNPCに存在する神経堤の分化と移動、及び細胞間接着に関連する遺伝子の濃縮がhNPCから失われることがわかった。著者らは、ミトコンドリアの酸化還元電位の低下、成長表面への細胞接着の強化、ならびにMMP2及びMMP9の発現の低下も報告している。Iacomino et al(2020)は、ニューロン細胞の移動と分化に関連する遺伝子に焦点を当てて、このトランスクリプトームデータを再分析し、微小管タンパク質及びキネシンファミリータンパク質など、いくつかの神経移動関連遺伝子の発現低下を見出した。特に、皮質層形成は、結合パートナーを介してWWOXが関係している経路であるWnt経路の状態によって影響を受けることがわかった(Qian et al,2020)。例えば、WWOXはDisheveledタンパク質Dvl1及びDvl2に結合することがわかっており、後者はWWOXによって阻害されるため、Wnt経路が減衰する(Bouteille et al,2009;Abu-Odeh et al,2014a)。本発明者らの研究は、以前に説明された現象である、Wnt活性化とDNA損傷の間のクロストークの可能性をさらに強調するものである(Elyada et al,2011)。これは、以前に説明されたWWOXの多面的機能(Abu-Remaileh et al,2015)、及びRNA-seqで認められる細胞周期とMDM2レベルの負の調節の減少と非常に一致している。KO COのVZにおいてKi67+細胞にDNA切断の蓄積が認められたが、これは、増殖とおそらく複製ストレスを促進するWnt活性化によって説明される可能性がある。
脳オルガノイドにおける疾患モデリングに加えて、WWOXをhESCゲノムに再導入することによって認められる表現型をレスキューすることを試みた。これにより、COにおいて認められるすべての細胞集団でWWOXの超生理学的発現と部分的なレスキューがもたらされた。これらの結果は、表現型を修正し、おそらく治療的介入の手段として、WWOXの再導入を成功させるための概念実証を提供する。それでも、これらの調査結果は、WOREE症候群患者の遺伝子治療アプローチを成功させるには、集団を標的とした送達を最適化し、発現レベルを微調整することが重要であることを示唆している。
最後に、WOREE症候群(WSM)と比較的軽度の表現型であるSCAR12(WPM)に罹患する患者からFOを生成した。本発明者らの調査結果は、脳オルガノイド培養プロトコル(CO及びFO)の両方が同様の結果をもたらし、WWOX欠損の表現型を検証し、それが皮質に由来することを示している。興味深いことに、SCAR12のファミリーをモデル化する際に、WOREEオルガノイドと同じ発生異常は観察されなかった。SCAR12 FOは、前脳ニューロン集団の発生、星状細胞の発生、及びDDRシグナル伝達において、あるとしても非常に軽度の差異を示した。これにより、症候群間で認められる差異をモデル化する系の能力が強化され、まれなSCAR12症候群とWWOXの多面的機能を詳しく調べる必要性が指摘されている(Abu-Remaileh et al,2015;Banne et al,2021)。異なる家族の健康なヘテロ接合体の親ではWWOX発現に顕著な差異があるが、罹患したホモ接合体患者で観察されるレベルには非常に小さな差異しかないことは注目に値する。これらの結果は、疾患の重症度が、総発現レベルではなくWWOXの機能レベルと相関しているかどうかという疑問を生じさせる。
全体として、本発明者らのデータは、脳オルガノイドが小児てんかん性脳症をモデル化する能力を示す一方で、WWOXの生殖細胞突然変異を有する患者に認められる病理学的変化と治療開発の可能なアプローチを解明している。
材料及び方法
細胞培養及びプラスミド
FGF/KOSR条件下、放射線照射したDR4マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー層上で、WiBR3 hES細胞株及び生成したiPS細胞株を5%CO2条件下で維持した:15%knockout serum replacement(KOSR,Gibco;10828-028)、1%GlutaMAX(Gibco;35050-038)、1%MEM非必須アミノ酸(NEAA,Biological Industries;01-340-1B)、1%ピルビン酸ナトリウム(Biological Industries;03-042-1B)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Biological Industries;03-031-113)、及び8ng/mlのbFGF(PeproTech;100-18B)を補充したDMEM/F12(Gibco;21331-020またはBiological Industries;01-170-1A)。培地は毎日交換し、手動かまたはC型トリプシン(Biological Industries;03-053-1B)によるトリプシン処理のいずれかにより、培養物を5~7日ごとに継代した。10μM濃度で継代した後の最初の24~48時間、Rho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi、Y27632としても知られる)(Cayman;10005583)を添加した。
細胞培養及びプラスミド
FGF/KOSR条件下、放射線照射したDR4マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー層上で、WiBR3 hES細胞株及び生成したiPS細胞株を5%CO2条件下で維持した:15%knockout serum replacement(KOSR,Gibco;10828-028)、1%GlutaMAX(Gibco;35050-038)、1%MEM非必須アミノ酸(NEAA,Biological Industries;01-340-1B)、1%ピルビン酸ナトリウム(Biological Industries;03-042-1B)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Biological Industries;03-031-113)、及び8ng/mlのbFGF(PeproTech;100-18B)を補充したDMEM/F12(Gibco;21331-020またはBiological Industries;01-170-1A)。培地は毎日交換し、手動かまたはC型トリプシン(Biological Industries;03-053-1B)によるトリプシン処理のいずれかにより、培養物を5~7日ごとに継代した。10μM濃度で継代した後の最初の24~48時間、Rho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi、Y27632としても知られる)(Cayman;10005583)を添加した。
hESCのトランスフェクションのために、エレクトロポレーションの24時間前に細胞を10μM ROCKi中で培養した。トリプシンC溶液を使用して細胞を剥離させ、合計100μgのDNA構築物と混合したPBS(Ca2+及びMg2+を含有する)中に再懸濁し、Gene Pulser Xcell System(Bio-Rad;250V,500μF,0.4cmキュベット)でエレクトロポレーションした。その後、ROCKiを補充したFGF/KOSR培地中のMEFフィーダー層に細胞を播種した。WWOX-KOの場合、エキソン1を標的とするsgRNAを含むpx330プラスミドを、pNTK-GFPと共に比率1:5で同時エレクトロポレーションし、48時間後、GFP陽性細胞を選別し、続いて約10日後にコロニー単離のためにMEFフィーダープレート上にまばらに播種した(10cmプレートあたり2,000細胞)。WWOX再導入のために、WWOXコード配列を保有するようにクローニングされたpAAVS-2aNeo-UBp-IRES-GFPプラスミドを、AAVS1遺伝子座を標的とするpx330と同時エレクトロポレーションし(Guernet et al,2016)、GFPについて選別し、コロニー単離のために0.5μg/mlピューロマイシンで選択した。遺伝子編集は、ウエスタンブロッティングによって検証した。sgRNA配列を、表EV3に記載する。
RNAまたはタンパク質を単離するために、hPSCを上記のようにMatrigelをコーティングしたプレート(Corning;356231)上で継代し、NutriStem hPSC XF培地(Biological Industries;05-100-1A)中で培養した。
脳オルガノイドの生成、培養、及びレンチウイルス感染
脳オルガノイドを、前述のようにhESCから、以下の変更を加えた上で生成した(Lancaster et al,2013;Lancaster & Knoblich,2014;Bagley et al,2017;Lancaster et al,2018):
ヒトWiBR3細胞とWSM iPSCは、有糸分裂不活性化MEFで維持した。プロトコル開始の4~7日前に、MEFまたはMatrigel(Corning;FAL356231)をコーティングした60mmプレートに細胞を継代し、70~80%の集密度に達するまで増殖させた。0日目に、hESCコロニーを0.7mg/mlコラゲナーゼD溶液(Sigma;11088858001)を用いてMEFから剥離させ、C型トリプシンによる2分間の迅速な処理を使用して単一細胞懸濁液に解離させた。Matrigel上で培養した細胞については、コラゲナーゼD処理はスキップし、細胞をすぐにC型トリプシンで解離させ、この時点以降ではプロトコルに他のバリエーションはなかった。経験的に観察されただけであるが、最終結果に大きな差異は認められなかった。しかしながら、MEF培養したhPSCは、神経誘導の成功率が高かったようであり、それゆえに優先的に使用した。
脳オルガノイドを、前述のようにhESCから、以下の変更を加えた上で生成した(Lancaster et al,2013;Lancaster & Knoblich,2014;Bagley et al,2017;Lancaster et al,2018):
ヒトWiBR3細胞とWSM iPSCは、有糸分裂不活性化MEFで維持した。プロトコル開始の4~7日前に、MEFまたはMatrigel(Corning;FAL356231)をコーティングした60mmプレートに細胞を継代し、70~80%の集密度に達するまで増殖させた。0日目に、hESCコロニーを0.7mg/mlコラゲナーゼD溶液(Sigma;11088858001)を用いてMEFから剥離させ、C型トリプシンによる2分間の迅速な処理を使用して単一細胞懸濁液に解離させた。Matrigel上で培養した細胞については、コラゲナーゼD処理はスキップし、細胞をすぐにC型トリプシンで解離させ、この時点以降ではプロトコルに他のバリエーションはなかった。経験的に観察されただけであるが、最終結果に大きな差異は認められなかった。しかしながら、MEF培養したhPSCは、神経誘導の成功率が高かったようであり、それゆえに優先的に使用した。
解離後、細胞を計数し、20%KOSR、3%USDA認定hESC品質FBS(Biological Industries)、1%GlutaMAX、1%NEAA、100μMの2-メルカプトエタノール(Sigma;M3148)、4ng/mlのbFGF、及び10μMのRockiを補充したDMEM/F12からなるhESC培地中に懸濁した。胚様体(EB)形成のために、9,000個の細胞を超低接着V底96ウェルプレート(S-Bio Prime;MS-9096VZ)の各ウェルに播種した。EBには、さらに5日間隔日で栄養供給し、最初の交換では新鮮なbFGFとROCKiを添加した。6日目に、培地を、DMEM/F12,1%N2サプリメント(Gibco;17502048)、1%GlutaMAX、1%MEM-NEAA、及び1μg/mlヘパリン溶液(Sigma;H3149)からなるNeural Induction(NI)培地(Bagley et al,2017)に交換した。神経上皮が確立されるまで(通常は11~12日目)、NI培地を1日おきに交換し、その場合、示されるように品質管理を実施し(Lancaster & Knoblich,2014;Bagley et al,2017)、十分に発達したEBをMatrigel液滴に包埋した(Lancaster & Knoblich,2014;Bagley et al,2017)。液滴を、DMEM/F12とNeuro-basal Medium(Gibco;21103049またはBiological Industries;06-1055110-1A)の1:1の混合物、0.5%N2サプリメント、ビタミンAを含まない1%B27サプリメント(Gibco;12587010)、1%GlutaMAX、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5%NEAA、50μMの2-メルカプトエタノール、2.5μg/mlのヒト組換えインスリン(Biological Industries;41-975-100)、及び3μMのCHIR-99021(Axon Medchem;1386)からなるCerebral Differentiation Medium(CDM)を含む90 mmの滅菌未処理の培養皿(Miniplast;825-090-15-017)に移した。培地は一日おきに交換した。16日目以降、オルガノイドをオービタルシェーカー上で、CDMと同様に構成され、B27サプリメントからビタミンA(Gibco;17504044)を含有するB27サプリメントに変更し、CHIR-99021は含まず、400μMのビタミンC(Sigma;A4403)及び12.5mMのHEPES緩衝液(Biological Industries;03-025-1B)を含有するCerebral Maturation Medium(CMM)(Lancaster et al,2018)中で、37℃及び5%CO2にて培養した。培地は2~4日ごとに交換した。6週目から、培地に1%Matrigelを添加した。汚染の可能性を減らすために、30日ごとにオルガノイドを新鮮な滅菌プレートに移した。記載されているすべての培地は、0.22μmフィルターで濾過し、使用するまで4℃で保存した。特に明記しない限り、すべての分析で同じバッチのオルガノイドを使用した。
WWOXのレンチウイルス形質導入は、以前に公開されたとおりに実施した(Deverman et al,2016;Khawaled et al,2019)。簡潔に述べると、WWOXを保有するウイルスを、pDEST12.2TMデスティネーションベクター(Gateway Cloning Technology)から生成した。超遠心分離後、293T細胞を感染させることによって力価を経験的に決定した。培養35日目に、個々のCOを、CMMならびに1:100のウイルス含有培地及び5μg/mlのポリブレン(Merck;TR-1003-6)を含有するエッペンドルフチューブに移し、一晩インキュベートした。翌日、オルガノイドを新鮮な培地で振盪培養に戻した。
体細胞の再プログラミング
WOREE及びSCAR12症候群に罹患した家族由来の血液試料は、Kaplan Medical Center Helsinki Committeeの承認の下、すべてのヒト対象からインフォームド コンセントを得て研究目的のみに提供され、すべての実験はWMA Declaration of Helsinki and the Department of Health and Human Services Belmont Reportに定められた原則に準拠した。
WOREE及びSCAR12症候群に罹患した家族由来の血液試料は、Kaplan Medical Center Helsinki Committeeの承認の下、すべてのヒト対象からインフォームド コンセントを得て研究目的のみに提供され、すべての実験はWMA Declaration of Helsinki and the Department of Health and Human Services Belmont Reportに定められた原則に準拠した。
製造業者の指示に従って、Yamanaka因子及びセンダイウイルスCytoTune-iPS 2.0 Kitを感染させることにより、PBMCから直接iPSCを誘導した。簡潔に述べると、PBMC由来の血液試料をFicoll勾配によって単離し、StemPro-34 Nutrient Supplement(Gibco;10639-011)、100ng/mlヒトSCF(PeproTech;300-07)、100ng/mlのヒトFLT-3リガンド(R&D Systems;308-FKE)、20ng/mlのヒトIL-3(PeproTech;200-03)、及び10ng/mlのヒトIL-6(PeproTech;200-06)を補充したStemPro-34(商標)培地(Gibco;10639-011)で培養した。24時間後、培地の半量を交換した。さらに24時間後、プロトコルの0日目に、細胞を6ウェルプレートに移し、再プログラミングウイルス混合物を加え、プレートを室温で1,000×gで30分間遠心分離した。細胞を再懸濁し、インキュベーター内に一晩戻した。翌日、残りのウイルスを取り除くために、細胞を遠心分離して洗浄し、完全に補充されたStemPro-34培地に再懸濁し、2日目に追加の培地を添加した。3日目に、細胞を10cmのMEFコーティングプレートに移し、培地の半量を、サイトカインを含まない完全StemPro-34に交換し、培地の半量を1日おきに交換した。7日目までに、再プログラミングの様々な段階にある細胞が認められ、再プログラミング関連のアポトーシスを防ぐために、培地を10μMのROCKiを補充したmTeSRに徐々に変更した。16日目に、正常な形態と成長率を有するコロニーを採取し、増殖させ、多能性マーカーの発現を検証し、WWOX変異について配列決定した。
前脳オルガノイドの生成及び培養
前脳オルガノイドを、以下に記載する変更点を加えた上で、以前に記載されたようにiPSCから生成した(Qian et al,2016,2018):
iPSC細胞は、有糸分裂不活性化MEF上で維持した。プロトコル開始の4~7日前に、細胞をMEFコーティング60mmプレート上で継代し、最大70~80%の集密度まで培養した。0日目に、iPSCコロニーをCOと同様に、剥離させ、解離させ、計数し、DMEM/F12、20%KOSR、1%GlutaMax、1%MEM-NEAA、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、及び100μMの2-メルカプトエタノールを含有するhPSC培地に再懸濁した。ウェルあたり9,000個の細胞をV底96ウェルプレートに播種した。1日目に、培地を、2μMのA83(Axon Medchem;1421)と100nMのLDN-193189(Axon Medchem;1527)を新たに補充したhPSC培地であるNeuroectoderm Medium(NEM)に変更し、これを1日おきに交換した。5日目と6日目に、培地の半量を吸引し、DMEM/F12、1%N2サプリメント、1%GlutaMax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%NEAA、10μg/mlのヘパリン、1μMのCHIR-99021(Axon Medchem;1386)、及び1μMのSB-431542(Sigma;S4317)からなるNeural Induction Medium(NIM)に置き換えた。7日目に、示されたように品質管理及びMatrigel包埋を実施し(Qian et al,2018)、1日おきに培地を交換しながらEBをNIM中で培養し続けた。14日目に、Matrigel除去を実施し(Qian et al,2018)、培地を、DMEM/F12、1%N2サプリメント、ビタミンAを含む1%B27、1%NEAA、1%GlutaMax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノール、及び2.5μg/mlのインスリンからなるForebrain Differentiation Medium(FDM)に変更し、37℃及び5%CO2のオービタルシェーカーに移した。培地は2~3日ごとに交換した。71日目に、培地を、Neurobasal培地、ビタミンAを含む1%B27サプリメント、1%GlutaMax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノール、200μMのビタミンC、20ng/mlのヒト組換えBDNF(Pepro-Tech;450-02)、20ng/mlのヒト組換えGDNF(PeproTech;450-10)、1μMのジブチリル-cAMP(Sigma;D0627)、及び1ng/mLのTGF-β1(PeproTech;100-21C)を含有するForebrain Maturation Medium(FMM)に変更した。培地は2~3日ごとに交換した。
前脳オルガノイドを、以下に記載する変更点を加えた上で、以前に記載されたようにiPSCから生成した(Qian et al,2016,2018):
iPSC細胞は、有糸分裂不活性化MEF上で維持した。プロトコル開始の4~7日前に、細胞をMEFコーティング60mmプレート上で継代し、最大70~80%の集密度まで培養した。0日目に、iPSCコロニーをCOと同様に、剥離させ、解離させ、計数し、DMEM/F12、20%KOSR、1%GlutaMax、1%MEM-NEAA、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、及び100μMの2-メルカプトエタノールを含有するhPSC培地に再懸濁した。ウェルあたり9,000個の細胞をV底96ウェルプレートに播種した。1日目に、培地を、2μMのA83(Axon Medchem;1421)と100nMのLDN-193189(Axon Medchem;1527)を新たに補充したhPSC培地であるNeuroectoderm Medium(NEM)に変更し、これを1日おきに交換した。5日目と6日目に、培地の半量を吸引し、DMEM/F12、1%N2サプリメント、1%GlutaMax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%NEAA、10μg/mlのヘパリン、1μMのCHIR-99021(Axon Medchem;1386)、及び1μMのSB-431542(Sigma;S4317)からなるNeural Induction Medium(NIM)に置き換えた。7日目に、示されたように品質管理及びMatrigel包埋を実施し(Qian et al,2018)、1日おきに培地を交換しながらEBをNIM中で培養し続けた。14日目に、Matrigel除去を実施し(Qian et al,2018)、培地を、DMEM/F12、1%N2サプリメント、ビタミンAを含む1%B27、1%NEAA、1%GlutaMax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノール、及び2.5μg/mlのインスリンからなるForebrain Differentiation Medium(FDM)に変更し、37℃及び5%CO2のオービタルシェーカーに移した。培地は2~3日ごとに交換した。71日目に、培地を、Neurobasal培地、ビタミンAを含む1%B27サプリメント、1%GlutaMax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノール、200μMのビタミンC、20ng/mlのヒト組換えBDNF(Pepro-Tech;450-02)、20ng/mlのヒト組換えGDNF(PeproTech;450-10)、1μMのジブチリル-cAMP(Sigma;D0627)、及び1ng/mLのTGF-β1(PeproTech;100-21C)を含有するForebrain Maturation Medium(FMM)に変更した。培地は2~3日ごとに交換した。
免疫蛍光
オルガノイドの固定と免疫染色は、以前に記載されたとおりに実施した(Mansour et al,2018)。簡潔に述べると、オルガノイドをPBSで3回洗浄し、次いで固定のために4%氷冷パラホルムアルデヒド中に45分間移し、冷PBSで3回洗浄し、30%スクロース溶液中で一晩平衡化して凍結保護した。翌日、オルガノイドをOCTに包埋し、ドライアイスでスナップ凍結し、Leica CM1950クライオスタットで10μmに切片化した。
オルガノイドの固定と免疫染色は、以前に記載されたとおりに実施した(Mansour et al,2018)。簡潔に述べると、オルガノイドをPBSで3回洗浄し、次いで固定のために4%氷冷パラホルムアルデヒド中に45分間移し、冷PBSで3回洗浄し、30%スクロース溶液中で一晩平衡化して凍結保護した。翌日、オルガノイドをOCTに包埋し、ドライアイスでスナップ凍結し、Leica CM1950クライオスタットで10μmに切片化した。
免疫蛍光染色のために、切片を室温に温め、再水和のためにPBSで洗浄し、PBS中の0.1%TritonX-100(PBT)で透過処理し、次いで、PBT中の5%正常ヤギ血清(NGS)及び0.5%BSAを含有するブロッキング緩衝液中で1時間ブロッキングした。次いで、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に切片を4℃で一晩インキュベートした。翌日、続いて切片を0.05%Tween-20を含有するPBS(PBST)中で振盪しながら3回洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体及びHoechst33258溶液と共に室温で1.5時間インキュベートした。スライドを振盪しながらPBSTで4回洗浄し、Immunofluorescence Mounting Medium(Dako;s3023)を使用してカバースリップを封入した。切片を、Olympus FLUOVIEW FV1000共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化し、付属のOlympus FLUOVIEWソフトウェアを使用して処理した。γH2AX陽性の核を、NIH ImageJを使用して手動で計数し、後述のように統計的に解析した。
電気生理学的記録
オルガノイドを3%低温ゲル化アガロースに包埋し(約36℃で)、氷上で5分間インキュベートした後、Leica 1200S Vibratomeを使用して、スクロース溶液(mMで:87NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、25グルコース、0.5CaCl2、7MgCl2、1.25NaHPO4、及び75スクロース)中で4℃にて400μmに切片化した。切片を、人工脳脊髄液(ACSF、mMで:125NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、10グルコース、2.5CaCl2、1.5MgCl2、pH7.38、及び300mOsm)中で37℃にて30分間、続いて室温で1時間インキュベートした。記録中、切片は、ベースライン条件で、灌流カーボゲン(95%O2、5%CO2)と共に、37℃にてACSF中でインキュベートした。局所集合電位(LFP)及び全細胞パッチクランプ記録は、ホウケイ酸キャピラリーガラスから引き出し、各切片の外縁から深さ150μmに配置した電極を使用して実施した。LFP電極をACSFで満たし、一方、パッチ電極を内部溶液で満たした。25,000HzのサンプリングレートでMultiClampソフトウェアを使用してデータを記録した。MATLABソフトウェアを使用してデータを分析した。(i)60ノッチフィルター(5倍音)を使用してノイズを除去し、(ii)0.1HzハイパスIIRフィルターを使用して記録セットアップからの変動を除去し、トレースをフィルター処理した。次いで、トレンド除去機能(ハミングウインドウを使用)を使用して信号の大きな変動を除去し、高速フーリエ変換を使用して正規化されたスペクトルパワーを計算した。パワースペクトル密度プロットの曲線下面積を、特定の周波数範囲でビン化された周波数の合計を取得することによって計算した。
オルガノイドを3%低温ゲル化アガロースに包埋し(約36℃で)、氷上で5分間インキュベートした後、Leica 1200S Vibratomeを使用して、スクロース溶液(mMで:87NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、25グルコース、0.5CaCl2、7MgCl2、1.25NaHPO4、及び75スクロース)中で4℃にて400μmに切片化した。切片を、人工脳脊髄液(ACSF、mMで:125NaCl、25NaHCO3、2.5KCl、10グルコース、2.5CaCl2、1.5MgCl2、pH7.38、及び300mOsm)中で37℃にて30分間、続いて室温で1時間インキュベートした。記録中、切片は、ベースライン条件で、灌流カーボゲン(95%O2、5%CO2)と共に、37℃にてACSF中でインキュベートした。局所集合電位(LFP)及び全細胞パッチクランプ記録は、ホウケイ酸キャピラリーガラスから引き出し、各切片の外縁から深さ150μmに配置した電極を使用して実施した。LFP電極をACSFで満たし、一方、パッチ電極を内部溶液で満たした。25,000HzのサンプリングレートでMultiClampソフトウェアを使用してデータを記録した。MATLABソフトウェアを使用してデータを分析した。(i)60ノッチフィルター(5倍音)を使用してノイズを除去し、(ii)0.1HzハイパスIIRフィルターを使用して記録セットアップからの変動を除去し、トレースをフィルター処理した。次いで、トレンド除去機能(ハミングウインドウを使用)を使用して信号の大きな変動を除去し、高速フーリエ変換を使用して正規化されたスペクトルパワーを計算した。パワースペクトル密度プロットの曲線下面積を、特定の周波数範囲でビン化された周波数の合計を取得することによって計算した。
細胞接着記録
細胞接着記録を、ブラインドパッチクランプ記録法で取得した。オルガノイドのニューロン集団由来の自発的なニューロン活動を記録した。電極(約7MOhm)を、垂直2段プラー(PC-12、Narishige)で、フィラメント状の薄壁のホウケイ酸ガラス(外径1.5mm、内径0.86mm、Hilgenberg GmbH)から引き出した。電極を、以下のもの(mMで):140K-グルコン酸塩、10KCl、10HEPES、10Na2-ホスホクレアチン、及び0.5EGTAを含有する内部溶液で満たし、KOHでpH7.25に調整した。
細胞接着記録を、ブラインドパッチクランプ記録法で取得した。オルガノイドのニューロン集団由来の自発的なニューロン活動を記録した。電極(約7MOhm)を、垂直2段プラー(PC-12、Narishige)で、フィラメント状の薄壁のホウケイ酸ガラス(外径1.5mm、内径0.86mm、Hilgenberg GmbH)から引き出した。電極を、以下のもの(mMで):140K-グルコン酸塩、10KCl、10HEPES、10Na2-ホスホクレアチン、及び0.5EGTAを含有する内部溶液で満たし、KOHでpH7.25に調整した。
オルガノイドの表面に対して45°で電極を挿入した。記録中、オルガノイドを、35℃でMatrigelを含まないCMM中に保持した。ピペットの抵抗が10~200MOhmに増加すると、ほとんどの場合、スパイクが発生した。単一のスパイクの検出は、記録を開始する基準であった。すべての記録は、電流クランプモードの細胞内アンプ(MultiClamp 700B、Molecular Devices)で取得し、10kHzのサンプリングレートで取得し(CED Micro1401-3、Cambridge Electronic Design Limited)、ハイパスフィルターでフィルター処理して、集合電位を排除し、ニューロンのスパイクを保持した。
細胞接着記録のデータ分析は、MATLAB(The MathWorks)でカスタム作成されたコードを使用して実行した。細胞接着モードで記録されたスパイクは、閾値を適用することによって生の電圧トレースから抽出した(スパイクの閾値は、バックグラウンドノイズレベルのピークよりもかなり上に配置した)。平均発火率の計算では、記録した細胞ごとに4分間の記録時間にわたる発火率を計算した。
イムノブロット分析と細胞内分画
全タンパク質について、50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、10%グリセロール、ならびにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を補充した0.5%Nonidet P-40(NP-40)を含有する溶解緩衝液でオルガノイドを均一化した。細胞質画分を分離するために、1mmol/l DTTならびにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を補充した低張溶解緩衝液[10mmol/l HEPES(pH7.9)、10mmol/l KCl、0.1mmol/l EDTA]でオルガノイドを粉砕した。細胞を氷上で15分間膨潤させた後、0.5%NP-40を添加し、ボルテックスによって細胞を溶解した。遠心分離後、細胞質画分を回収した。その後、残余のペレットを、1mmol/l DTTを補充した高張核抽出緩衝液[20mmol/l HEPES(pH7.9)、0.42mol/l KCl、1mmol/l EDTA]で、振盪しながら4℃にて15分間インキュベートすることにより、核画分を得た。試料を遠心分離し、液相を回収した。
全タンパク質について、50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、10%グリセロール、ならびにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を補充した0.5%Nonidet P-40(NP-40)を含有する溶解緩衝液でオルガノイドを均一化した。細胞質画分を分離するために、1mmol/l DTTならびにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を補充した低張溶解緩衝液[10mmol/l HEPES(pH7.9)、10mmol/l KCl、0.1mmol/l EDTA]でオルガノイドを粉砕した。細胞を氷上で15分間膨潤させた後、0.5%NP-40を添加し、ボルテックスによって細胞を溶解した。遠心分離後、細胞質画分を回収した。その後、残余のペレットを、1mmol/l DTTを補充した高張核抽出緩衝液[20mmol/l HEPES(pH7.9)、0.42mol/l KCl、1mmol/l EDTA]で、振盪しながら4℃にて15分間インキュベートすることにより、核画分を得た。試料を遠心分離し、液相を回収した。
各試料に40~50μgのタンパク質を使用して、標準条件下でウエスタンブロッティングを実施した。実験ごとに2~3回、ブロットを繰り返し、Bio-RadのImage Labソフトウェアで定量化した。
RNA抽出、逆転写PCR、及びqPCR
フェノール/クロロホルムベースの方法について製造業者によって説明されているように、Bio-Tri試薬(Biolab;9010233100)を使用して全RNAを単離した。0.5~1μgのRNAを使用して、qScript cDNA Synthesis Kit(QuantaBio;95047)を使用してcDNAを合成した。Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems;AB4367659)を使用してqRT-PCRを実施した。すべての測定を3回実施し、HPRTまたはUBCのいずれかのレベルに標準化した。
フェノール/クロロホルムベースの方法について製造業者によって説明されているように、Bio-Tri試薬(Biolab;9010233100)を使用して全RNAを単離した。0.5~1μgのRNAを使用して、qScript cDNA Synthesis Kit(QuantaBio;95047)を使用してcDNAを合成した。Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems;AB4367659)を使用してqRT-PCRを実施した。すべての測定を3回実施し、HPRTまたはUBCのいずれかのレベルに標準化した。
ライブラリの調製及びRNA配列決定
ライブラリの調製及びRNA配列決定は、標準的な手順に従って、ヘブライ大学Core Research FacilityのGenomic Applications Laboratoryによって実行した。簡潔に述べると、RNA ScreenTape Kit(Agilent Technologies;5067-5576)、D1000 ScreenTape Kit(Agilent Technologies;5067-5582)、Qubit(登録商標)RNA HS Assay Kit(Invitrogen;Q32852)、及び Qubit(登録商標)DNA HS Assay Kit(Invitrogen;32854)を使用して、RNAの品質を評価した。
ライブラリの調製及びRNA配列決定は、標準的な手順に従って、ヘブライ大学Core Research FacilityのGenomic Applications Laboratoryによって実行した。簡潔に述べると、RNA ScreenTape Kit(Agilent Technologies;5067-5576)、D1000 ScreenTape Kit(Agilent Technologies;5067-5582)、Qubit(登録商標)RNA HS Assay Kit(Invitrogen;Q32852)、及び Qubit(登録商標)DNA HS Assay Kit(Invitrogen;32854)を使用して、RNAの品質を評価した。
mRNAライブラリの調製では、試料あたり1μgのRNAをKAPA Stranded mRNA-Seq Kit with mRNA Capture Beads(Kapa Biosystems;KK8421)を使用して処理した。ライブラリを20μlの溶出緩衝液で溶出し、10mMに調整した後、各試料から10μl(50%)を回収し、1つのチューブにプールした。マルチプレックス試料プール(1.5pM,1.5%PhiXを含む)をNextSeq 500/550 High Output v2 Kit(75サイクル)カートリッジ(Illumina;FC-404-1005)にロードし、75サイクル及びシングルリード配列決定条件でNextSeq 500 System Machine(Illumina)にロードした。
ライブラリの品質管理のために、Fastqファイルを、FastQC(ver.0.11.8)で試験し、残りのアダプター、低品質の塩基(Q=20)、及び読み取り長(20塩基)についてトリミングした。トリミングは、trim galore(ver.0.6.1)で実施した。読み取りカウントはサンプルあたり約30~50Mと高く、フィルタリング後はほとんど減少しなかった。Salmon(ver.1.2.1)を使用して、検証マッピングモードとgcバイアス補正の両方をオンにして、マッピングベースモードでトランスクリプトームマッピングを実施した。アラインメントの前に、25のkmerサイズを使用して、HS GRCh38 CDNA release 99(2019年11月)に基づいてSalmonインデックスを作成した。Salmonマッピングでは、生の転写産物のカウント数とTPMのカウント数の両方が報告される。得られるマッピング率は、80%~90%と高い。合計8つのCOサンプル(4つのWT COと4つのKO CO)を配列決定した。1つのWTサンプルは、予備的な品質管理に合格しなかった(低い読み取り数と低いトランスクリプトームマッピング率)。他のサンプルのいずれともクラスター化されなかった別のWTサンプル(WWOX-KOでもWTでもない)は、PCAとデンドログラム分析の両方で明らかであった。これらの2つのサンプルを、さらなる分析から抽出し、合計6つのサンプルをさらなる分析に使用した。示差的に発現する遺伝子の決定(KO対WT)では、未加工の転写カウント数を6つのサンプルすべてで最小の全体カウント10でフィルター処理し、Rパッケージtximport(ver.1.16.1)でインポートしてDEeq2(ver.1.28.1)で分析した。カウント数をDESeq2によって正規化し、示差的に発現する遺伝子をフィルター処理し、αを0.01に設定した。apeglm(ver.1.10.0)に基づいて、平均ベースの倍率変化、及び収縮ベースの倍率変化を計算した。
図16A及びCに示すヒートマップを作成するために、示差的に発現する遺伝子のリストを、上方制御された(WWOX-KO発現がWT発現より高かった)サブリスト及び下方制御されたサブリストに分けた。各サブリストを倍率変化値でソートし、各サブリストから上位100個の遺伝子を選択した。選択した各遺伝子について、log2正規化カウントをスケーリングし、Rパッケージgplots(ver.3.0.3)のheatmap.2を使用してヒートマップに示した。
図14Fに認められるヒートマップでは、6つの皮質層遺伝子マーカーのそれぞれのlog2正規化カウントをスケーリングし、Rパッケージgplotsのheatmap.2を使用してヒートマップ形式で示した。遺伝子セットの濃縮分析は、Broad Institute GSEAソフトウェア(ver.4.0.3)を使用して実施した。入力には、倍率変化のlog2でランク付けした15,348の遺伝子が含まれていた。GOセットは Broad Instituteセットc5.all.v7.0である。許容されるセットは、遺伝子が15個以上500個以下のセットである。遺伝子セットは、GO生物学的プロセスである。この分析で許容されるセットは、遺伝子が10個以上500個以下のセットである。最初の2つの成分のPCAプロットを計算し、ベースR関数でプロットした。計算は、疑似カウント1を追加した、log2変換及びlog2正規化したカウントに基づいている。
統計
実験結果を、平均±SEMとして、または第1及び第3の四分位数、最小値と最大値、ならびに中央値を示す箱ひげ図で表現した。最初に、Wilk-Shapiro検定を使用して正規性を決定し、正規分布したサンプルの場合、ウェルチの補正を使用した両側独立スチューデントt検定を使用して、試験サンプルと対照サンプルの値を比較した。非正規分布のサンプルについては、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用した。2つ以上のサンプル間の比較には、一元配置分散分析を使用し、Tukeyの多重比較検定を使用して多重比較を修正した。正規分布していないサンプルについては、Kruskal-Wallis検定をDunnの多重比較検定と共に使用した。速度論的実験では、SDが等しいと仮定せずに、Holm-Sidak法を使用して多重t検定に対して分析を修正した。統計的に有意な結果のP値カットオフは以下のとおりである:n.s(有意でない)、*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001、及び****P≦0.0001。GraphPad Prism8を使用して、統計解析と視覚的なデータ表示を行った。この研究では、無作為化や盲検化は適用しなかった。実験は、いくつかの生物学的複製で実施し、各遺伝子型について少なくとも2つのhPSC系統を使用した(WiBR3 WT系統を除く)。特に明記しない限り、実験はオルガノイドの複数のバッチで実行した。
実験結果を、平均±SEMとして、または第1及び第3の四分位数、最小値と最大値、ならびに中央値を示す箱ひげ図で表現した。最初に、Wilk-Shapiro検定を使用して正規性を決定し、正規分布したサンプルの場合、ウェルチの補正を使用した両側独立スチューデントt検定を使用して、試験サンプルと対照サンプルの値を比較した。非正規分布のサンプルについては、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用した。2つ以上のサンプル間の比較には、一元配置分散分析を使用し、Tukeyの多重比較検定を使用して多重比較を修正した。正規分布していないサンプルについては、Kruskal-Wallis検定をDunnの多重比較検定と共に使用した。速度論的実験では、SDが等しいと仮定せずに、Holm-Sidak法を使用して多重t検定に対して分析を修正した。統計的に有意な結果のP値カットオフは以下のとおりである:n.s(有意でない)、*P≦0.05、**P≦0.01、***P≦0.001、及び****P≦0.0001。GraphPad Prism8を使用して、統計解析と視覚的なデータ表示を行った。この研究では、無作為化や盲検化は適用しなかった。実験は、いくつかの生物学的複製で実施し、各遺伝子型について少なくとも2つのhPSC系統を使用した(WiBR3 WT系統を除く)。特に明記しない限り、実験はオルガノイドの複数のバッチで実行した。
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配列
配列番号1:ヒトWWOX cDNA(コーディング)配列(NCBI参照配列NM_016373.4)
atggc agcgctgcgc tacgcggggc tggacgacac ggacagtgag gacgagctgc ctccgggctg ggaggagaga accaccaagg acggctgggt ttactacgcc aatcacaccg
aggagaagac tcagtgggaa catccaaaaa ctggaaaaag aaaacgagtg gcaggagatt
tgccatacgg atgggaacaa gaaactgatg agaacggaca agtgtttttt gttgaccata
taaataaaag aaccacctac ttggacccaa gactggcgtt tactgtggat gataatccga
ccaagccaac cacccggcaa agatacgacg gcagcaccac tgccatggaa attctccagg gccgggattt cactggcaaa gtggttgtgg tcactggagc taattcagga atagggttcg aaaccgccaa gtcttttgcc ctccatggtg cacatgtgat cttggcctgc aggaacatgg
caagggcgag tgaagcagtg tcacgcattt tagaagaatg gcataaagcc aaggtagaag caatgaccct ggacctcgct ctgctccgta gcgtgcagca ttttgctgaa gcattcaagg
ccaagaatgt gcctcttcat gtgcttgtgt gcaacgcagc aacttttgct ctaccctgga gtctcaccaa agatggcctg gagaccacct ttcaagtgaa tcatctgggg cacttctacc ttgtccagct cctccaggat gttttgtgcc gctcagctcc tgcccgtgtc attgtggtct cctcagagtc ccatcgattt acagatatta acgactcctt gggaaaactg gacttcagtc gcctctctcc aacaaaaaac gactattggg cgatgctggc ttataacagg tccaagctct
gcaacatcct cttctccaac gagctgcacc gtcgcctctc cccacgcggg gtcacgtcga
acgcagtgca tcctggaaat atgatgtact ccaacattca tcgcagctgg tgggtgtaca cactgctgtt taccttggcg aggcctttca ccaagtccat gcaacaggga gctgccacca
ccgtgtactg tgctgctgtc ccagaactgg agggtctggg agggatgtac ttcaacaact
gctgccgctg catgccctca ccagaagctc agagcgaaga gacggcccgg accctgtggg
cgctcagcga gaggctgatc caagaacggc ttggcagcca gtccggctaa
配列番号2:ヒトWWOXアミノ酸配列
MAALRYAGLDDTDSEDELPPGWEERTTKDGWVYYANHTEEKTQWEHPKTGKRKRVAGDLPYGWEQETDENGQVFFVDHINKRTTYLDPRLAFTVDDNPTKPTTRQRYDGSTTAMEILQGRDFTGKVVVVTGANSGIGFETAKSFALHGAHVILACRNMARASEAVSRILEEWHKAKVEAMTLDLALLRSVQHFAEAFKAKNVPLHVLVCNAATFALPWSLTKDGLETTFQVNHLGHFYLVQLLQDVLCRSAPARVIVVSSESHRFTDINDSLGKLDFSRLSPTKNDYWAMLAYNRSKLCNILFSNELHRRLSPRGVTSNAVHPGNMMYSNIHRSWWVYTLLFTLARPFTKSMQQGAATTVYCAAVPELEGLGGMYFNNCCRCMPSPEAQSEETARTLWALSERLIQERLGSQSG
配列番号3:ヒトWWOX cDNA(全体)
GCAGTGCGCAGGCGTGAGCGGTCGGGCCCCGACGCGCGCGGGTCTCGTTTGGAGCGGGAGTGAGTTCCTGAGCGAGTGGACCCGGCAGCGGGCGATAGGGGGGCCAGGTGCCTCCACAGTCAGCCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGACGACACGGACAGTGAGGACGAGCTGCCTCCGGGCTGGGAGGAGAGAACCACCAAGGACGGCTGGGTTTACTACGCCAATCACACCGAGGAGAAGACTCAGTGGGAACATCCAAAAACTGGAAAAAGAAAACGAGTGGCAGGAGATTTGCCATACGGATGGGAACAAGAAACTGATGAGAACGGACAAGTGTTTTTTGTTGACCATATAAATAAAAGAACCACCTACTTGGACCCAAGACTGGCGTTTACTGTGGATGATAATCCGACCAAGCCAACCACCCGGCAAAGATACGACGGCAGCACCACTGCCATGGAAATTCTCCAGGGCCGGGATTTCACTGGCAAAGTGGTTGTGGTCACTGGAGCTAATTCAGGAATAGGGTTCGAAACCGCCAAGTCTTTTGCCCTCCATGGTGCACATGTGATCTTGGCCTGCAGGAACATGGCAAGGGCGAGTGAAGCAGTGTCACGCATTTTAGAAGAATGGCATAAAGCCAAGGTAGAAGCAATGACCCTGGACCTCGCTCTGCTCCGTAGCGTGCAGCATTTTGCTGAAGCATTCAAGGCCAAGAATGTGCCTCTTCATGTGCTTGTGTGCAACGCAGCAACTTTTGCTCTACCCTGGAGTCTCACCAAAGATGGCCTGGAGACCACCTTTCAAGTGAATCATCTGGGGCACTTCTACCTTGTCCAGCTCCTCCAGGATGTTTTGTGCCGCTCAGCTCCTGCCCGTGTCATTGTGGTCTCCTCAGAGTCCCATCGATTTACAGATATTAACGACTCCTTGGGAAAACTGGACTTCAGTCGCCTCTCTCCAACAAAAAACGACTATTGGGCGATGCTGGCTTATAACAGGTCCAAGCTCTGCAACATCCTCTTCTCCAACGAGCTGCACCGTCGCCTCTCCCCACGCGGGGTCACGTCGAACGCAGTGCATCCTGGAAATATGATGTACTCCAACATTCATCGCAGCTGGTGGGTGTACACACTGCTGTTTACCTTGGCGAGGCCTTTCACCAAGTCCATGCAACAGGGAGCTGCCACCACCGTGTACTGTGCTGCTGTCCCAGAACTGGAGGGTCTGGGAGGGATGTACTTCAACAACTGCTGCCGCTGCATGCCCTCACCAGAAGCTCAGAGCGAAGAGACGGCCCGGACCCTGTGGGCGCTCAGCGAGAGGCTGATCCAAGAACGGCTTGGCAGCCAGTCCGGCTAAGTGGAGCTCAGAGCGGATGGGCACACACACCCGCCCTGTGTGTGTCCCCTCACGCAAGTGCCAGGGCTGGGCCCCTTCCAAATGTCCCTCCAACACAGATCCGCAAGAGTAAAGGAAATAAGAGCAGTCACAACAGAGTGAAAAATCTTAAGTACCAATGGGAAGCAGGGAATTCCTGGGGTAAAGTATCACTTTTCTGGGGCTGGGCTAGGCATAGGTCTCTTTGCTTTCTGGTGGTGGCCTGTTTGAAAGTAAAAACCTGCTTGGTGTGTAGGTTCCGTATCTCCCTGGAGAAGCACCAGCAATTCTCTTTCTTTTACTGTTATAGAATAGCCTGAGGTCCCCTCGTCCCATCCAGCTACCACCACGGCCACCACTGCAGCCGGGGGCTGGCCTTCTCCTACTTAGGGAAGAAAAAGCAAGTGTTCACTGCTCCTTGCTGCATTGATCCAGGAGATAATTGTTTCATTCATCCTGACCAAGACTGAGCCAGCTTAGCAACTGCTGGGGAGACAAATCTCAGAACCTTGTCCCAGCCAGTGAGGATGACAGTGACACCCAGAGGGAGTAGAATACGCAGAACTACCAGGTGGCAAAGTACTTGTCATAGACTCCTTTGCTAATGCTATGCAAAAAATTCTTTAGAGATTATAACAAATTTTTCAAATCATTCCTTAGATACCTTGAAAGGCAGGAAGGGAAGCGTATATACTTAAGAATACACAGGATATTTTGGGGGGCAGAGAATAAAACGTTAGTTAATCCCTTTGTCTGTCAATCACAGTCTCAGTTCTCTTGCTTTCACATTGTACTTAAACCTCCTGCTGTGCCTCGCATCCTATGCTTAATAAAAGAACATGCTTGAATATCA
配列番号4:ヒトシナプシンIプロモーターの配列
ac tacaaaccga gtatctgcag agggccctgc gtatgagtgc aagtgggttt taggaccagg atgaggcggg gtgggggtgc ctacctgacg accgaccccg acccactgga caagcaccca acccccattc cccaaattgc gcatccccta tcagagaggg ggaggggaaa caggatgcgg cgaggcgcgt gcgcactgcc agcttcagca ccgcggacag tgccttcgcc cccgcctggc ggcgcgcgcc accgccgcct cagcactgaa ggcgcgctga cgtcactcgc cggtcccccg caaactcccc ttcccggcca ccttggtcgc gtccgcgccg ccgccggccc agccggaccg caccacgcga ggcgcgagat aggggggcac gggcgcgacc atctgcgctg cggcgccggc gactcagcgc tgcctcagtc tgcggtgggc agcggaggag tcgtgtcgtg cctgagagcg cagctgtgct cctgggcacc gcgcagtccg cccccgcggc tcctggccag accaccccta ggaccccctg ccccaagtcg cagccttcga
配列番号5:シナプシン1/WWOX cDNA構築物(太字フォント-最小SynIプロモーター、下線-ヒトWWOX cDNA、通常フォント-AAV9ベクター)
配列番号1:ヒトWWOX cDNA(コーディング)配列(NCBI参照配列NM_016373.4)
atggc agcgctgcgc tacgcggggc tggacgacac ggacagtgag gacgagctgc ctccgggctg ggaggagaga accaccaagg acggctgggt ttactacgcc aatcacaccg
aggagaagac tcagtgggaa catccaaaaa ctggaaaaag aaaacgagtg gcaggagatt
tgccatacgg atgggaacaa gaaactgatg agaacggaca agtgtttttt gttgaccata
taaataaaag aaccacctac ttggacccaa gactggcgtt tactgtggat gataatccga
ccaagccaac cacccggcaa agatacgacg gcagcaccac tgccatggaa attctccagg gccgggattt cactggcaaa gtggttgtgg tcactggagc taattcagga atagggttcg aaaccgccaa gtcttttgcc ctccatggtg cacatgtgat cttggcctgc aggaacatgg
caagggcgag tgaagcagtg tcacgcattt tagaagaatg gcataaagcc aaggtagaag caatgaccct ggacctcgct ctgctccgta gcgtgcagca ttttgctgaa gcattcaagg
ccaagaatgt gcctcttcat gtgcttgtgt gcaacgcagc aacttttgct ctaccctgga gtctcaccaa agatggcctg gagaccacct ttcaagtgaa tcatctgggg cacttctacc ttgtccagct cctccaggat gttttgtgcc gctcagctcc tgcccgtgtc attgtggtct cctcagagtc ccatcgattt acagatatta acgactcctt gggaaaactg gacttcagtc gcctctctcc aacaaaaaac gactattggg cgatgctggc ttataacagg tccaagctct
gcaacatcct cttctccaac gagctgcacc gtcgcctctc cccacgcggg gtcacgtcga
acgcagtgca tcctggaaat atgatgtact ccaacattca tcgcagctgg tgggtgtaca cactgctgtt taccttggcg aggcctttca ccaagtccat gcaacaggga gctgccacca
ccgtgtactg tgctgctgtc ccagaactgg agggtctggg agggatgtac ttcaacaact
gctgccgctg catgccctca ccagaagctc agagcgaaga gacggcccgg accctgtggg
cgctcagcga gaggctgatc caagaacggc ttggcagcca gtccggctaa
配列番号2:ヒトWWOXアミノ酸配列
MAALRYAGLDDTDSEDELPPGWEERTTKDGWVYYANHTEEKTQWEHPKTGKRKRVAGDLPYGWEQETDENGQVFFVDHINKRTTYLDPRLAFTVDDNPTKPTTRQRYDGSTTAMEILQGRDFTGKVVVVTGANSGIGFETAKSFALHGAHVILACRNMARASEAVSRILEEWHKAKVEAMTLDLALLRSVQHFAEAFKAKNVPLHVLVCNAATFALPWSLTKDGLETTFQVNHLGHFYLVQLLQDVLCRSAPARVIVVSSESHRFTDINDSLGKLDFSRLSPTKNDYWAMLAYNRSKLCNILFSNELHRRLSPRGVTSNAVHPGNMMYSNIHRSWWVYTLLFTLARPFTKSMQQGAATTVYCAAVPELEGLGGMYFNNCCRCMPSPEAQSEETARTLWALSERLIQERLGSQSG
配列番号3:ヒトWWOX cDNA(全体)
GCAGTGCGCAGGCGTGAGCGGTCGGGCCCCGACGCGCGCGGGTCTCGTTTGGAGCGGGAGTGAGTTCCTGAGCGAGTGGACCCGGCAGCGGGCGATAGGGGGGCCAGGTGCCTCCACAGTCAGCCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGACGACACGGACAGTGAGGACGAGCTGCCTCCGGGCTGGGAGGAGAGAACCACCAAGGACGGCTGGGTTTACTACGCCAATCACACCGAGGAGAAGACTCAGTGGGAACATCCAAAAACTGGAAAAAGAAAACGAGTGGCAGGAGATTTGCCATACGGATGGGAACAAGAAACTGATGAGAACGGACAAGTGTTTTTTGTTGACCATATAAATAAAAGAACCACCTACTTGGACCCAAGACTGGCGTTTACTGTGGATGATAATCCGACCAAGCCAACCACCCGGCAAAGATACGACGGCAGCACCACTGCCATGGAAATTCTCCAGGGCCGGGATTTCACTGGCAAAGTGGTTGTGGTCACTGGAGCTAATTCAGGAATAGGGTTCGAAACCGCCAAGTCTTTTGCCCTCCATGGTGCACATGTGATCTTGGCCTGCAGGAACATGGCAAGGGCGAGTGAAGCAGTGTCACGCATTTTAGAAGAATGGCATAAAGCCAAGGTAGAAGCAATGACCCTGGACCTCGCTCTGCTCCGTAGCGTGCAGCATTTTGCTGAAGCATTCAAGGCCAAGAATGTGCCTCTTCATGTGCTTGTGTGCAACGCAGCAACTTTTGCTCTACCCTGGAGTCTCACCAAAGATGGCCTGGAGACCACCTTTCAAGTGAATCATCTGGGGCACTTCTACCTTGTCCAGCTCCTCCAGGATGTTTTGTGCCGCTCAGCTCCTGCCCGTGTCATTGTGGTCTCCTCAGAGTCCCATCGATTTACAGATATTAACGACTCCTTGGGAAAACTGGACTTCAGTCGCCTCTCTCCAACAAAAAACGACTATTGGGCGATGCTGGCTTATAACAGGTCCAAGCTCTGCAACATCCTCTTCTCCAACGAGCTGCACCGTCGCCTCTCCCCACGCGGGGTCACGTCGAACGCAGTGCATCCTGGAAATATGATGTACTCCAACATTCATCGCAGCTGGTGGGTGTACACACTGCTGTTTACCTTGGCGAGGCCTTTCACCAAGTCCATGCAACAGGGAGCTGCCACCACCGTGTACTGTGCTGCTGTCCCAGAACTGGAGGGTCTGGGAGGGATGTACTTCAACAACTGCTGCCGCTGCATGCCCTCACCAGAAGCTCAGAGCGAAGAGACGGCCCGGACCCTGTGGGCGCTCAGCGAGAGGCTGATCCAAGAACGGCTTGGCAGCCAGTCCGGCTAAGTGGAGCTCAGAGCGGATGGGCACACACACCCGCCCTGTGTGTGTCCCCTCACGCAAGTGCCAGGGCTGGGCCCCTTCCAAATGTCCCTCCAACACAGATCCGCAAGAGTAAAGGAAATAAGAGCAGTCACAACAGAGTGAAAAATCTTAAGTACCAATGGGAAGCAGGGAATTCCTGGGGTAAAGTATCACTTTTCTGGGGCTGGGCTAGGCATAGGTCTCTTTGCTTTCTGGTGGTGGCCTGTTTGAAAGTAAAAACCTGCTTGGTGTGTAGGTTCCGTATCTCCCTGGAGAAGCACCAGCAATTCTCTTTCTTTTACTGTTATAGAATAGCCTGAGGTCCCCTCGTCCCATCCAGCTACCACCACGGCCACCACTGCAGCCGGGGGCTGGCCTTCTCCTACTTAGGGAAGAAAAAGCAAGTGTTCACTGCTCCTTGCTGCATTGATCCAGGAGATAATTGTTTCATTCATCCTGACCAAGACTGAGCCAGCTTAGCAACTGCTGGGGAGACAAATCTCAGAACCTTGTCCCAGCCAGTGAGGATGACAGTGACACCCAGAGGGAGTAGAATACGCAGAACTACCAGGTGGCAAAGTACTTGTCATAGACTCCTTTGCTAATGCTATGCAAAAAATTCTTTAGAGATTATAACAAATTTTTCAAATCATTCCTTAGATACCTTGAAAGGCAGGAAGGGAAGCGTATATACTTAAGAATACACAGGATATTTTGGGGGGCAGAGAATAAAACGTTAGTTAATCCCTTTGTCTGTCAATCACAGTCTCAGTTCTCTTGCTTTCACATTGTACTTAAACCTCCTGCTGTGCCTCGCATCCTATGCTTAATAAAAGAACATGCTTGAATATCA
配列番号4:ヒトシナプシンIプロモーターの配列
ac tacaaaccga gtatctgcag agggccctgc gtatgagtgc aagtgggttt taggaccagg atgaggcggg gtgggggtgc ctacctgacg accgaccccg acccactgga caagcaccca acccccattc cccaaattgc gcatccccta tcagagaggg ggaggggaaa caggatgcgg cgaggcgcgt gcgcactgcc agcttcagca ccgcggacag tgccttcgcc cccgcctggc ggcgcgcgcc accgccgcct cagcactgaa ggcgcgctga cgtcactcgc cggtcccccg caaactcccc ttcccggcca ccttggtcgc gtccgcgccg ccgccggccc agccggaccg caccacgcga ggcgcgagat aggggggcac gggcgcgacc atctgcgctg cggcgccggc gactcagcgc tgcctcagtc tgcggtgggc agcggaggag tcgtgtcgtg cctgagagcg cagctgtgct cctgggcacc gcgcagtccg cccccgcggc tcctggccag accaccccta ggaccccctg ccccaagtcg cagccttcga
配列番号5:シナプシン1/WWOX cDNA構築物(太字フォント-最小SynIプロモーター、下線-ヒトWWOX cDNA、通常フォント-AAV9ベクター)
Claims (48)
- WWドメイン含有オキシドリダクターゼ(WWOX)関連CNS疾患の治療方法であって、前記方法が、そのような治療を必要とする患者の脳に、前記脳内でWWOXを発現させる調節エレメントの制御下のWWOX野生型遺伝子、またはその機能的誘導体を投与することを含む、前記治療方法。
- 前記WWOX関連CNS疾患が、WWOX関連てんかん性脳症(WOREE)症候群、脊髄小脳失調症、常染色体劣性12(SCAR12)、アルツハイマー病、ウエスト症候群、自閉症、多発性硬化症及び性分化疾患(DSD)から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記WWOX関連CNS疾患が、WOREE症候群またはSCAR12である、請求項2に記載の方法。
- 前記患者が、WWOXの複合ヘテロ接合変異を有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、ニューロンにおいて前記WWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターがユニバーサルプロモーターである、請求項5に記載の方法。
- 前記プロモーターが、CMVプロモーター、E2F1プロモーター、及びU1snRNAプロモーター、またはそれらの誘導体である、請求項6に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、ニューロンで特異的に発現するプロモーターである、請求項5に記載の方法。
- 前記プロモーターが、シナプシンIプロモーター、CamKIIプロモーター、MeCP2プロモーター、NSEプロモーター、及びHb9プロモーター、またはそれらの誘導体から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記プロモーターが、グリア細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する、請求項8または9に記載の方法。
- 前記プロモーターが、オリゴデンドロサイト及び/または星状細胞において発現しないか、またはより低いレベルで発現する、請求項10に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、シナプシンIプロモーターまたはその誘導体である、請求項8~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、オリゴデンドロサイトにおいて前記WWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、MBPプロモーター、PLP1プロモーター、及びCNPプロモーター、またはそれらの誘導体から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、星状細胞において前記WWOX遺伝子の発現を指示するプロモーターである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、GFAPプロモーターもしくはS100bプロモーター、またはそれらの誘導体である、請求項15に記載の方法。
- 前記プロモーターが、1つ以上のエンハンサー配列をさらに含む、請求項5~16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記WWOX遺伝子が、mRNAの安定性を高める非翻訳配列を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子を、1つ以上の検出可能な標識と共に送達する、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、コード化された蛍光タンパク質である、請求項19に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、リポナノ粒子、またはエキソソームを使用して送達する、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、Cas酵素またはCas酵素をコードするポリヌクレオチド、及びgRNAまたは前記gRNAをコードするポリヌクレオチドと共に送達して、前記WWOX野生型遺伝子またはその部分の挿入を指示する、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体を、ウイルスベクターによって送達する、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)送達系である、請求項23に記載の方法。
- 前記AAV送達系がAAV9である、請求項24に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子が、配列番号2のアミノ酸配列をコードする、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子が、1つ以上のイントロンを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記WWOX野生型遺伝子がcDNAである、請求項26に記載の方法。
- 調節エレメントの制御下にある前記WWOX野生型遺伝子またはその機能的誘導体が、配列番号1または3に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記投与が、実質への直接注射、脳室内を介した脳脊髄液への注射、及び髄腔内(大槽または腰部)経路から選択される経路による、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。
- 個体が、小児患者または新生児患者である、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個体が成人患者である、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記患者が、成長障害、てんかん発作、認知機能障害、社会的機能障害、生殖障害、運動失調、網膜症、精神遅滞、及び小頭症から選択される1つ以上の症状を示す、請求項31または32に記載の方法。
- 投与エピソードが3回以下である、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。
- 投与エピソードが2回以下である、請求項34に記載の方法。
- 投与エピソードが1回である、請求項34に記載の方法。
- WOREE症候群またはSCAR12の治療方法であって、前記方法が、そのような治療を必要とする患者の脳に、シナプシン-1プロモーターの制御下にあるWWOX野生型遺伝子を含むAAV9遺伝子送達系を投与することを含む、前記治療方法。
- 前記AAV9送達系が、配列番号1または配列番号3に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項37に記載の方法。
- ニューロン特異的プロモーターの発現制御下にあるWWOX野生型遺伝子、またはその機能的誘導体を含む、発現構築物。
- 前記プロモーターが、シナプシン1プロモーター、CamKIIプロモーター、MeCP2プロモーター、NSEプロモーター、及びHb9プロモーター、またはそれらの誘導体から選択される、請求項39に記載の発現構築物。
- 前記プロモーターが、シナプシン1またはその誘導体である、請求項40に記載の発現構築物。
- 配列番号1、3、4、または5に実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項41に記載の発現構築物。
- 前記発現構築物がウイルスベクターである、請求項39~42のいずれか1項に記載の発現構築物。
- 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項43に記載の発現構築物。
- 前記AAVがAAV9である、請求項44に記載の発現構築物。
- 請求項39~45のいずれか1項に記載の発現構築物、及び脳への直接注射に適した薬学的に許容される担体を含む、前記脳への直接投与のための医薬組成物。
- 請求項46に記載の医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含む、WOREE症候群またはSCAR12の治療方法。
- 前記WOREEまたは前記SCAR12の治療における、請求項46に記載の医薬組成物の使用。
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