CN118318040A - 通过使神经胶质祖细胞恢复活力来治疗髓磷脂缺乏的组合物和方法 - Google Patents

通过使神经胶质祖细胞恢复活力来治疗髓磷脂缺乏的组合物和方法 Download PDF

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CN118318040A CN202280069706.6A CN202280069706A CN118318040A CN 118318040 A CN118318040 A CN 118318040A CN 202280069706 A CN202280069706 A CN 202280069706A CN 118318040 A CN118318040 A CN 118318040A
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史蒂文·A·戈尔德曼
约翰·N·玛利亚尼
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University of Rochester
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Abstract

本公开涉及诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力的方法，以及治疗患有髓磷脂缺乏的受试者的方法。

Description

通过使神经胶质祖细胞恢复活力来治疗髓磷脂缺乏的组合物 和方法
本申请要求2021年10月20日提交的美国临时申请第63/257,827号和2022年6月8日提交的美国临时申请第63/350,039、63/350,041、63/350,042号的优先权，这些临时申请通过引用并入本文。
本发明是在美国国立卫生研究院授予的NS110776和AG072298下的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本申请涉及用抑制转录因子的试剂使CNS神经胶质细胞群恢复活力的方法和组合物。
背景技术
神经胶质祖细胞(GPC，也称为少突胶质细胞祖细胞和NG2细胞)在发育期间定植于人脑中，并且在整个成年期持续大量存在。在发育过程中，人类GPC(hGPC)是高度增殖的双能细胞(bipotential cells)，产生新的少突胶质细胞和星形胶质细胞(French-Constantand Raff,“Proliferating Bipotential Glial Progenitor Cells in Adult Rat OpticNerve,”Nature319:499-502(1986)以及Raff et al.,“A Glial Progenitor Cell thatDevelops in Vitro into an Astrocyte or an Oligodendrocyte Depending onCulture Medium,”Nature 303:390-396(1983))。在啮齿类动物中，这种能力在正常衰老过程中减弱，同时在老化的GPC中，增殖、迁移和分化的能力都会减弱(Chari et al.,“Decline in Rate of Colonization of Oligodendrocyte Progenitor Cell(OPC)-depleted Tissue by Adult OPCs With Age,”J.Neuropathol.Exp.Neurol.62:908-916(2003)；Gao and Raff,“Cell Size Control and a Cell-intrinsic MaturationProgramin Proliferating Oligodendrocyte Precursor Cells,”J.Cell Biol.138:1367-1377(1997)；Moyon et al.,“TET1-mediated DNA Hydroxymethylation RegulatesAdult Remyelination in Mice,”Nature Communications 12:3359-3359(2021)；Segelet al.,“Niche Stiffness Underlies the Ageing of Central Nervous SystemProgenitor Cells,”Nature 573:130-134(2019)；Tang et al.,“Long-Term Culture ofPurified Postnatal Oligodendrocyte Precursor Cells.Evidence for an IntrinsicMaturation Program that Plays Out Over Months,”J.Cell Biol.148:971-984(2000)；Temple&Raff,“Clonal Analysis of Oligodendrocyte Development in Culture:Evidence for aDevelopmental Clock that Counts Cell Divisions,”Cell 44:773-779(1986)；Wolswijk&Noble,“Identification of an Adult-Specific Glial ProgenitorCell,”Development 105:387-400(1989)；以及Wren et al.,“In Vitro Analysis of theOrigin and Maintenance of O-2Aadult Progenitor Cells,”J.Cell Biol.116,:167-176(1992))。类似地，之前发现，当移植到先天性髓鞘发育不良的小鼠宿主中时，成体GPC与其胎儿GPC相比，增殖能力较低、迁移能力较差且更容易分化(Windrem et al.,“Fetal andAdult Human Oligodendrocyte Progenitor Cell Isolates Myelinate theCongenitally Dysmyelinated Brain,”Nat.Med.10:93-97(2004))。然而，尽管胎儿和成体hGPC的能力明显不同，并且在啮齿动物衰老模型中GPC转录的数据丰富(Bouhrara et al.,“Evidence of Demyelination in Mild Cognitive Impairment and Dementia Using aDirect and Specific Magnetic Resonance Imaging Measure of Myelin Content,”Alzheimers Dement.14:998-1004(2018)；de la Fuente et al.,“Changes in theOligodendrocyte Progenitor Cell Proteome with Ageing,”Mol.Cell Proteomics 19:1281-1302(2020)；Neumann et al.,“Metformin Restores CNS Remyelination Capacityby Rejuvenating Aged Stem Cells,”Cell Stem Cell 25:473-485e478(2019)；以及Spitzer et al.,“Oligodendrocyte Progenitor Cells Become Regionally Diverseand Heterogeneous with Age,”Neuron 101:459-471e455(2019))，但是很少有数据可以解决人衰老过程中GPC基因表达的变化(Perlman et al.,“Developmental Trajectory ofOligodendrocyte Progenitor Cells in the Human Brain Revealed by Single CellRNA Sequencing,”Glia 68:1291-1303(2020)以及Sim et al.,“Complementary Patternsof Gene Expression by Human Oligodendrocyte Progenitors and their EnvironmentPredict Determinants of Progenitor Maintenance and Differentiation,”Ann.Neurol.59:763-779(2006))，或者提供胎儿和成体GPC转录的清晰的头对头比较。
本公开旨在克服本领域的缺陷。
发明内容
本申请的一个方面涉及一种治疗患有髓磷脂缺乏的受试者的方法。该方法包括如下步骤：在受试者的神经胶质祖细胞中表达一种或多种转录因子，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高迁移率族蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB)和转录增强子TEF-4 10(TEAD2)，其中所述表达在受试者中有效诱导髓鞘形成，从而治疗髓磷脂缺乏。
本申请的另一方面涉及在成体神经胶质祖细胞中诱导恢复活力的方法。该方法包括如下步骤：在成体神经胶质祖细胞中表达一种或多种转录因子，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2，其中所述表达在成体神经胶质祖细胞中有效诱导恢复活力。
附图说明
图1显示人胎儿GPC的批量RNA序列表征。A图：CD140a+、CD140a-和A2B5+/PSA-NCAM-选择的妊娠第二期(2nd trimester)人胎儿脑分离物的批量和scRNA测序工作流程。B图：两批次所有样品的主成分分析。C图：CD140a+相对于CD140a-以及CD140+相对于A2B5+/PSA-NCAM-的差异表达基因组的维恩图(p<0.01且绝对log2倍数变化>1)。D图：两个基因集的显著独创性通路分析(Ingenuity Pathway Analysis)项。大小代表-log10 p值，颜色代表激活Z评分(蓝色，CD140a+；红色，A2B5+或CD140a-)。E图：两个基因集的显著基因(significant genes)的Log2倍数变化。缺失条形为不显著。F图：E图，19中选定基因的转化的每百万转录本(TPM)的热图。
图2显示CD140a和A2B5选择的人胎儿GPC的单细胞RNA测序。A图：在源自20周胎龄人胎儿VZ/SVZ的FACS分离hGPC的scRNA-Seq分析期间鉴定的原代细胞类型的UMAP图。B图-C图：仅PSA-NCAM-/A2B5+(B)或CD140a+(C)人胎儿细胞的UMAP。D图：细胞类型选择性标记基因的小提琴图。E图：GPC相对于pre-GPC群的火山图。F图：GPC和pre-GPC之间选定的差异表达基因的特征图。G图：选择显著富集的GPC和pre-GPC IPA项，指示它们的-log10 p值和激活Z评分。H图：预期在胎儿hGPC中显著激活的转录因子的选择特征图。相对转录因子调节子激活显示为使用SCENIC软件包计算得出。
图3显示成体GPC在转录和功能上与胎儿GPC不同。A图：成体和胎儿GPC的批量RNA-Seq分析的工作流程。B图：三个批次的所有样品的主成分分析。C图：成体相对于胎儿的差异表达基因组的维恩图。D图：策划项和基因的IPA网络。节点大小与节点度成正比。标签颜色对应于成体(红色)或胎儿(蓝色)群的富集。E图：按模块划分的显著IPA项的条形图。Z评分表示胎儿(蓝色)或成体(红色)hGPC的预期激活。F图：log2倍数变化的条形图和网络基因TPM的热图。
图4显示转录因子活性的推断暗示了在成体hGPC特性的建立中的一组转录阻遏物。A图：预计在胎儿和成体GPC中活跃的显著富集的转录因子的标准化富集评分图。每个点是一个基序，其大小表示该基序预计有多少个基因处于活跃状态，颜色代表启动子周围的窗口，在该窗口中发现该基序富集。对于两种胎儿hGPC分离物，B图：富集TF TPM的热图，以及C图：相对于成体GPC的log倍数变化。D图-G图：策划基因的预测直接转录因子活性，分为D图：胎儿激活子；E图：胎儿阻遏物；F图：成体激活子；G图：成体阻遏物。颜色指示在成体(红色)或胎儿(蓝色)hGPC中的差异表达；形状指示节点类型(八边形：阻遏物；矩形：激活子；椭圆形：其他靶基因)。加框和圈出的基因表示功能相关的基因，这些基因有助于神经胶质祖细胞/少突胶质细胞特性、衰老/增殖目标，或也被视为激活的上游或下游TF。
图5显示通过成体hGPC富集阻遏物诱导老化的GPC转录组。A图：示意性概述了四种不同的多西环素(Dox)诱导型EGFP慢病毒表达载体的结构，每种载体编码一种转录阻遏物：E2F6、IKZF3、MAX或ZNF274。B图：诱导多能干细胞(iPSC)衍生的hGPC培养物(C27细胞株(Chambers et al.,Nature biotechnology,27,275-280,2009；Wang et al.,Cell StemCell12,252-264,2013))用单一慢病毒或载体转导一天，然后剩余的实验用Dox处理。在Dox诱导的转基因表达开始后3、7和10天，通过FACS分离hGPC进行qPCR。C图：Dox处理的细胞的qPCR显示每种转录因子的表达，与匹配的时间点对照相比。D图：选择衰老相关基因的qPCR倍数变化热图。在时间点内，通过细胞批次效应回归后的线性模型的事后分析最小二乘均值检验(post hoc least-squares means tests)来计算与对照的比较。FDR调整后p值：*<0.05，**<0.01，***<0.001。
图6显示miRNA驱动成体GPC转录差异和转录因子活性。A图：来自人A2B5+成体和CD140a+胎儿GPC的miRNA微阵列样品的主成分分析。B图：差异表达miRNA的Log2倍数变化条形图和热图。C图：miRNA相对于其预测基因靶标的平均log2倍数变化(FC)的特征富集气泡图。D图-E图：D图，胎儿(顶部)和E图，成体(底部)富集miRNA及其预测靶标的策划信号网络。
图7与图1相关，显示通过CD140a+或A2B5+/PSA-NCAM-选择富集人胎儿GPC：A图：CD140a+和A2B5+胎儿GPC的主成分分析。B图：火山图显示显著A2B5(绿色)和CD140a(蓝色)富集基因。C图：CD140a+和CD140a-胎儿细胞的主成分分析。D图：火山图显示显著CD140a-(洋红色)和CD140a(蓝色)富集基因。E图：两个基因集中显著上调和下调基因的Upset图。
图8与图2相关，显示单细胞RNA-Seq质量过滤：未过滤的A图A2B5+/PSA-NCAM-和B图CD140a scRNA-seq捕获的小提琴图。C图-D图：C图，A2B5+/PSA-NCAM-和D图，CD140a+捕获的质量过滤后的小提琴图(线粒体基因表达百分比<15％并且>500个独特基因)。
图9与图2相关，显示PSA-NCAM-/A2B5+相对于CD140a+胎儿hGPC的单细胞RNA测序：A图：A2B5+和CD140a+胎儿hGPC的UMAP图。B图：在每种分选范例分离物(sorting paradigmisolate)中的细胞类型的频率。C图：在CD140a+和A2B5+胎儿hGPC分离物之间差异表达的大量RNA-Seq log2倍数变化相对于假延髓病log2倍数变化的散点图。
图10与图4相关，显示了在胎儿或成体hGPC中活性转录因子的共享基序：在胎儿和成体GPC中所有预测的活性转录因子的矩阵。大小和颜色表示转录因子之间共享的基序程度。
图11与图5相关，显示成体阻遏物亚型表达。在每个GPC组中所有编码成体阻遏物亚型的蛋白的每百万转录本(TPM)的条形图。
图12与图5相关，显示iPSC衍生的hGPC的批量RNA-Seq揭示了年龄相关基因的丰度一致。通过CD140a+FACS分离iPSC衍生的hGPC(C27)，并通过批量RNA测序进行测定。相关胶质细胞年龄相关基因(包括在我们的活性转录因子队列中的基因)的丰度与胎儿和成体hGPC数据一起显示。
图13与图6相关，显示miRNA的转录因子调节提供神经胶质老化基因表达的转录后调节：(A)图：预测为差异表达成体相对于胎儿GPC miRNA的上游的显著成体相对于胎儿GPC转录因子的Log2倍数变化的小提琴图。(B)图：图2中确定的转录因子网络及其对差异表达成体相对于胎儿hGPC miRNA的预测调节。
图14展示：A图：CBh-BCL11A-GFP和对照CBh-GFP慢病毒的设计。B图：从AAVS1基因座生成表达tRFP-mScarlet的CRISPR-Cas9修饰的C27 iPSC细胞株。C图：示意性描绘了在Ragl小鼠中长期嵌合和BCL 11A过表达的实验范例。D图：BCL11A通过CBh-BCL11A-GFP的过表达通过ddPCR在体外证实并且(E图)在体内通过免疫组织化学证实。
图15展示：A图：注射CBh-BCL11A-GFP(L)或CBH-GFP(R)三周后Ragl-C271 RFP小鼠胼胝体(CC)的冠状面。B图：CC的放大冠状面，显示BCL11A-GFP和仅GFP半球之间RFP标记的人类细胞和OLIG2的差异，在C图中进行量化。D图：CC的放大冠状面，显示BCL11 A-GFP和仅GFP半球之间RFP标记的人类细胞和小鼠NG2的差异，在E图中进行量化。
图16展示：A图：注射CBh-BCL11A-GFP(L)或CBh-GFP(R)三周后嵌合小鼠胼胝体(CC)的冠状图像。人类细胞用tRFP/mScarlet和人类核抗原(hNA)标记为红色，OLIG2染色为绿色。B图：注射六周后嵌合小鼠CC的冠状图像，人类细胞用tRFP/mScarlet和hNA标记为红色，OLIG2标记为绿色。C图：注射三周后嵌合小鼠CC的冠状图像，人类细胞用tRFP/mScarlet和hNA标记为红色，PDGFRa标记为绿色。D图：注射三周后嵌合小鼠CC的冠状图像，人类细胞用tRFP/mScarlet和hNA标记为红色，小鼠NG2标记为绿色。
图17显示BCL11A表达载体的示例性设计。
具体实施方式
将详细参考本申请的某些方面和示例性实施方式，在所附结构和附图中示出示例。将结合示例性实施方式来描述本申请的各方面，包括方法、材料和示例，这样的描述是非限制性的，并且本申请的范围旨在涵盖所有公知的或者并入本文的等同物、替代物和修改。所描述的本发明的各方面、特征、优点和特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个另外的实施方式中。相关领域的技术人员将认识到，本发明可以在没有特定实施方式的一个或多个具体方面或优点的情况下实践。在其他情况下，可以在某些实施方式中认识并要求保护可能不存在于本发明的所有实施方式中的附加方面、特征和优点。此外，本领域技术人员将认识到与本文所描述的技术和材料类似或等同的许多技术和材料，其可以在本申请的各方面和实施方式的实践中使用。本申请的所描述的方面和实施方式不限于所描述的方法和材料。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非该内容明确指出不是这样。因此，例如，提及“肽”包括“一个或多个”肽或“多个”这样的肽。
I.定义
本文所用的以下术语或短语(在括号中)应具有以下含义：
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非该内容明确指出不是这样。因此，例如，提及“肽”包括“一个或多个”肽或“多个”这样的肽。
术语“约”或“大约”包括一个值的统计意义上的范围。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，还更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许变化取决于所研究的特定系统，并且可以被本领域普通技术人员容易地理解。
本文使用的术语“和/或”是指所列出的项目单独或组合地存在或使用。实际上，该术语是指使用或存在列出的项目中的“至少一个”或“一个或多个”。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围及子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被认为充分描述并允许将同一范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还应当理解，诸如“最多”、“至少”等的所有语言都包括所列举的数字并且指的是随后可以分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。
在理解本申请的范围时，本文使用的术语“包含”及其派生词旨在是开放式术语，其指定存在所述特征、元件、组分、基团、整数和/或步骤，但不排除存在其他未陈述的特征、元件、组分、基团、整数和/或步骤。上述内容也适用于具有类似含义的词语，例如术语“包括”、“涉及”、“具有”及其派生词。本文使用的术语“由…组成”及其派生词旨在是封闭式术语，其指定存在所述特征、元件、组分、基团、整数和/或步骤，但排除存在其他未陈述的特征，元件、组分、基团、整数和/或步骤。本文所用的术语“基本上由......组成”旨在指定存在所述特征、元件、组分、基团、整数和/或步骤以及不实质上影响基本和新颖特点的那些特征、元件、组分、基团、整数和/或步骤。在术语“包含”(或类似术语)用作过渡短语的实施方式或权利要求中，这样的实施方式还可以被设想成将术语“包含”替换为术语“由......组成”或“基本上由......组成”。本公开的方法、试剂盒、系统和/或组合物可包含所公开的组分，基本上由所公开的组分组成，或由所公开的组分组成。
在包括“附加的”或“第二”组分的实施方式中，本文所用的第二组分不同于其他组分或第一组分。“第三”组分不同于其他组分、第一组分和第二组分，并且进一步列举的组分或“附加的”组分也类似地不同。
术语“互补”当与核酸结合使用时，是指碱基A与T或U以及G与C的配对。术语“互补”是指完全互补(即在整个参考序列中形成A至T或U碱基对和G至C碱基对)的核酸分子，以及部分(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)互补的核酸分子。
除非另有说明，术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”涵盖DNA和RNA两者。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可互换使用并且指氨基酸残基的聚合物。该术语涵盖所有种类的天然存在的和合成的蛋白，包括所有长度的蛋白片段、融合蛋白和修饰蛋白，包括但不限于，糖蛋白，以及所有其他类型的修饰蛋白(例如，由磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、多谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等所得的蛋白)。
术语“废除”或“消除”基因或基因产物(例如RNA或蛋白质)的表达是指基因的转录和/或翻译的完全丧失或基因产物(例如RNA或蛋白质)的完全丧失。与对照(例如未修饰的细胞)相比，基因或基因产物(例如RNA或蛋白质)的表达可以通过标准的本领域已知的方法(例如本文描述的那些方法)来检测。
术语“表达”是指允许或引起基因或DNA序列中的信息产生，例如通过激活涉及相应基因或DNA序列的转录和/或翻译的细胞功能来产生RNA或蛋白。DNA序列在细胞中或由细胞表达以形成“表达产物”，例如RNA或蛋白。表达产物本身(例如所得蛋白)，也可以说是由该细胞“表达”。表达产物可以表征为细胞内、细胞外或跨膜。
本文所用的术语“神经胶质细胞”是指提供支持和营养、维持体内平衡、形成髓磷脂或促进髓鞘形成、并参与神经系统中的信号传递的非神经元细胞群。本文所用的“神经胶质细胞”涵盖神经胶质谱系的完全分化细胞，例如少突胶质细胞或星形胶质细胞，以及神经胶质祖细胞，它们中的每一种都可以被称为大神经胶质细胞。
本文所用的术语“成体神经胶质祖细胞”是指存在于出生后任何发育阶段的哺乳动物中的神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，术语“成体神经胶质祖细胞”是指存在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18岁以上人类受试者中的神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，术语“成体神经胶质祖细胞”是指存在于20岁以上、25岁以上、30岁以上、35岁以上、40岁以上、45岁以上或50岁以上人类受试者中的神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，术语“成体神经胶质祖细胞”是指存在于高龄人类受试者(例如55岁以上、60岁以上、65岁以上、70岁以上、75岁以上或80岁以上的成人)中的神经胶质祖细胞。
术语基因产物(例如，转录因子)的“功能变体”是指在竞争测定中保留了未修饰(野生型)转录因子的至少50％生物活性的修饰转录因子(例如，通过缺失、取代、插入、糖基化等)。
术语“有效量”是指研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻求的在组织、系统、动物、个体或人中引起生物或医学反应的活性化合物或试剂的量。
术语“调节序列”或“调节元件”是指这样的核酸序列或元件，其控制、调节、引起或允许被该调节序列或元件调节的基因的表达。调节元件/序列可以在待调节基因的编码区的5'或3'侧，或在该编码区内，或在内含子内发现。调节序列/元件的实例包括，但不限于，启动子、增强子、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点和促进所编码的多肽在给定表达系统中表达的其他序列。
本文所用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。一般而言，感兴趣的多核苷酸位于启动子序列的3'。在一些实施方式中，启动子完全源自天然基因。在一些实施方式中，启动子由衍生自不同天然存在的启动子的不同元件组成。在一些实施方式中，启动子包含合成核苷酸序列。本领域技术人员应当理解，不同的启动子将指导基因在不同的组织或细胞类型中表达，或在不同的发育阶段表达，或响应于不同的环境条件或存在或不存在药物或转录辅因子而表达。普遍存在的、细胞类型特异性的、组织特异性的、发育阶段特异性的、以及条件启动子(例如药物响应启动子(例如四环素响应启动子))是本领域技术人员公知的。启动子的实例包括，但不限于，磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子，CAG、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、突触蛋白或NeuN启动子，SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子(例如CMV立即早期启动子区(CMVIE))，SFFV启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，合成启动子，杂合启动子等。启动子可以是人类来源的或其他物种来源的，包括小鼠来源的。此外，衍生自非病毒基因的序列，例如小鼠金属硫蛋白基因启动子，也可用于本文。在一些实施方式中，启动子是异源启动子。在一些实施方式中，启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，并且可以包含增强子元件。
本文所用的术语“异源启动子”是指在自然界中未发现可操作地连接至给定编码序列的启动子。
术语“增强子”指这样的核苷酸序列，其可以刺激启动子活性，并且可以是所述启动子的固有元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。
术语“可操作地连接”是指将两个以上核酸片段结合在单个核酸片段上，使得一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(例如，编码序列处于启动子的转录控制之下)时，则启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。
术语“转录因子”是指调节特定基因表达的DNA结合蛋白。
转录因子可以对基因转录具有积极作用，因此可以被称为“转录激活子”、“激活子”或“转录激活因子”。示例性激活子(或转录激活因子)是信号转导和转录激活子3(STAT3)。如本公开图4的F所示，在成体神经胶质祖细胞的背景下，STAT3预计会激活一组衰老相关基因(例如，BIN1、DMTF1、CD47、CTNNA1、RUNX2、RUNX1、MAP3K7和OGT))、神经胶质细胞相关基因(例如，PLP1、CNP、PMP22、SEMA4D、CLDN11、GPR37、MYRF、MAG、BCAS1、ST18、ERBB4、CERS2、LPAR1和GJB1)和下游转录因子(例如，MAX、E2F6和IKZF3)。
转录因子还可以负面影响基因表达，因此可以被称为“转录阻遏物”、“阻遏物”或“转录抑制因子”。参与神经胶质祖细胞衰老的示例性阻遏物(或转录抑制因子)包括，但不限于，ZNF274、MAX、E2F6和IKZF3。如本公开图4的G所示，在成体神经胶质祖细胞的背景下，ZNF274、MAX、E2F6和IKZF3预计会抑制多组增殖相关基因靶标(例如，YAP1、LMNB1、PATZ1、TEAD1、FN1、TP53、CDK1、CCND2、CDKN2D、CENPH、MKI67、CDK4、CENPF、CDK5、CDKN3和CHEK1)、神经胶质细胞相关基因(例如CHRDL1、ST8SIA1、PTPRZ1、CA10、PDGFRA、BCAN、NXPH1、CSPG4和PCDH15)和下游转录因子(例如BLC11A、EZH2、HDAC2、NF1B、MYC、HMGA2和TEAD)。
术语“转录因子的抑制剂”或“转录因子阻遏物”是指抑制转录因子的活性或表达的试剂。“转录因子的抑制剂”或“转录因子阻遏物”可以是小分子、多肽、多核苷酸(例如反义寡核苷酸(ASO))、shRNA或miRNA。
这里收集了说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语。除非另有定义，本公开中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非上下文另有指示，否则本公开的给定方面、特征、实施方式或参数的偏好和选项应当被视为已经与本公开的所有其他方面、特征、实施方式或参数的任何和所有偏好和选项组合地公开。
II.涉及转录因子激活的方法
本申请的一个方面涉及通过激活某些转录因子来诱导成体神经胶质祖细胞恢复活力的方法。在一些实施方式中，该方法涉及在成体神经胶质祖细胞中表达有效量的一种或多种转录因子，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)、组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高15迁移率族蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB)和转录增强子TEF-4(TEAD2)。
如本文所述的术语“恢复活力”是指逆转细胞的衰老过程并返回到年轻的细胞状态，特别是关于增殖和/或分化能力，而不丧失细胞特性。
适合用于本文公开方法的成体神经胶质祖细胞包括哺乳动物神经胶质祖细胞，例如人神经胶质祖细胞、啮齿动物神经胶质祖细胞、非人灵长类神经胶质祖细胞、羊神经胶质祖细胞、牛神经胶质细胞祖细胞、猪神经胶质祖细胞、犬神经胶质祖细胞和猫神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，成体神经胶质祖细胞是成体人神经胶质祖细胞。
在一些实施方式中，神经胶质祖细胞是成体人神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，表达步骤是离体进行的。在一些实施方式中，表达步骤是在体内进行的。
本申请的另一个方面涉及通过激活受试者的神经胶质祖细胞中的某些转录因子来治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法。在一些实施方式中，该方法涉及在受试者的神经胶质祖细胞中表达有效量的一种或多种转录因子，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2。
在一些实施方式中，表达步骤是离体进行的。在一些实施方式中，表达步骤是在体内进行的。
根据本申请的这个方面，髓磷脂缺乏可以与病症相关，所述病症选自多发性硬化(multiple sclerosis)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、横贯性脊髓炎(transverse myelitis)、视神经炎(optic neuritis)、皮质下卒中(subcorticalstroke)、糖尿病性白质脑病(diabetic leukoencephalopathy)、高血压性白质脑病(hypertensive leukoencephalopathy)、年龄相关性白质病变(age-related whitematter disease)、脊髓损伤(spinal cord injury)、放疗或化疗引起的脱髓鞘、感染后和疫苗接种后白质脑炎、脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia)、小儿脑白质营养不良(pediatric leukodystrophiey)(例如佩利扎-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、泰-萨克斯病(Tay-Sach Disease)、桑德霍夫神经节苷脂沉积症(Sandhoff’s gangliosidoses)、克拉伯病(Krabbe’s disease)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidoses)、A型尼曼-匹克病(Niemann-Pick A disease)、肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)、卡纳万病(Canavan’s disease)、白质消失病(Vanishing White Matter Disease)和亚历山大病(Alexander Disease))、溶酶体贮积病(lysosomal storage diseases)、先天性髓鞘形成障碍(congenital dysmyelination)、炎性脱髓鞘(inflammatory demyelination)、血管性脱髓鞘(vascular demyelination)和脑瘫(cerebral palsy)。
在一些实施方式中，髓磷脂缺乏与神经退行性疾病(例如亨廷顿病(Huntington’sdisease))相关。本文所用的“亨廷顿病”是指通常在成年期显现出来的常染色体显性遗传性脑部疾病。亨廷顿病的病理学特征是髓鞘形成不足以及神经元和白质损失(参见，例如，Osipovitch et al.,“Human ESC-Derived Chimeric Mouse Models of Huntington’sDisease Reveal Cell-Intrinsic Defects in Glial Progenitor CellDifferentiation,”Cell Stem Cell
24(1):107-122(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。
在其他实施方式中，髓磷脂缺乏与神经精神疾病(例如精神分裂症)相关。本文所用的“精神分裂症”是指通常以白质相对缺乏和通常明显的髓鞘形成不足为特征的病症(参见，例如，Windrem et al.,“Human iPSC Glial Mouse Chimeras Reveal GlialContributions to Schizophrenia,”Cell Stem Cell 21(2):195-208(2017)，其全部内容通过引用并入本文)。
如下文所用的术语“治疗”患有髓磷脂缺乏的受试者涵盖：(1)在可能患有或易患髓磷脂缺乏但尚未经历或表现出髓磷脂缺乏的临床或亚临床症状的受试者中预防、延迟或减少髓磷脂缺乏发展的至少一种临床或亚临床症状的发生率和/或出现可能性；或者(2)抑制髓磷脂缺乏，即阻止、减少或延迟髓磷脂缺乏的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状；或者(3)缓解髓磷脂缺乏，即引起髓磷脂缺乏的消退或其至少一种临床或亚临床症状的消退。对于待治疗的受试者的益处是统计学上显著的或者至少是患者或医生可察觉的。
如下文所用的术语“受试者”是指个体生物体，例如个体哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是非人类哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是非人类灵长类动物。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物。在一些实施方式中，受试者是绵羊、山羊、猫或狗。在一些实施方式中，受试者是研究动物。在一些实施方式中，受试者是基因工程改造的，例如，基因工程改造的非人类受试者。受试者可以是成人受试者。在一些实施方式中，受试者年龄是至少1岁、至少2岁、至少4岁、至少6岁、至少8岁、至少10岁、至少12岁、至少15岁、至少18岁，至少20岁，至少25岁，至少30岁，至少35岁，至少40岁，至少45岁，至少50岁，至少55岁，至少60岁，至少65岁，至少70岁，至少75岁，至少80岁，至少85岁，至少90岁，至少95岁，至少100岁，或更老。在一些实施方式中，受试者是年龄18至100岁、20至100岁、30至100岁、40至100岁、50至100岁、50至100岁、60至100岁、70至100岁、80至100岁、或90至100岁之间的成年受试者。
在一些实施方式中，在成体GPC中诱导恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中的表达步骤包括向成体GPC或受试者中的GPC分别施用编码一种或多种转录因子的一种或多种核酸分子，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2。
在一些实施方式中，在成体GPC中诱导恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中的表达步骤包括向成体GPC或受试者中的GPC分别施用一种或多种表达载体，所述表达载体表达一种或多种转录因子，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2，其中每种表达载体包含(1)编码一种或多种转录因子的核苷酸序列，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2，和(2)与所述核苷酸序列可操作地连接的调节序列。
如本文所用，本申请中提及的转录因子，例如BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2，包括其所有转录变体及功能变体。编码本文列出的一种或多种转录因子的核苷酸序列是本领域公知的且可获取的。下面的表1通过基因名称、基因ID号和NCBI参考转录登录号列出了转录因子及其转录变体。
表1.示例性的人类基因和转录变体
*它们中每一个都通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码BCL11A、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码SEQ ID NO：21的BCL11A变体的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码HDAC2、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码EZH2、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码MYC、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码HMGA2、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包括的表达载体包含编码HFIB、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包含的表达载体包含编码TEAD2、其转录变体或功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，在成体GPC中诱导恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中的表达步骤包括向成体GPC或受试者中的GPC分别施用有效量的转录因子阻遏物的抑制剂。
本文所用的术语“转录因子阻遏物”是指抑制转录因子的活性或表达的试剂。“转录因子阻遏物”可以是多肽或多核苷酸。
在一些实施方式中，转录因子阻遏物的抑制剂是小分子。
在一些实施方式中，转录因子阻遏物的抑制剂是多肽或多核苷酸。在一些实施方式中，在成体GPC中诱导恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中的表达步骤包括向成体GPC或受试者中的GPC分别施用有效量的表达载体，所述表达载体包含(1)编码转录因子阻遏物的抑制剂的核苷酸序列，和(2)可操作地连接至该核苷酸序列的调节序列。
在一些实施方式中，所述转录因子阻遏物是芳香20烃受体(AHR)。根据这样的实施方式，所述转录因子阻遏物的抑制剂是AHR抑制剂。在一些实施方式中，AHR抑制剂是小分子抑制剂。
合适的AHR抑制剂是本领域已知的并且包括，但不限于，小分子，例如BAY-218(参见，例如，Abstract 1288:Blocking Tumor Associated Immune Suppression with BAY-218,aNovel,Selective Aryl Hydrocarbon Receptor(AhR)Inhibitor,”Proceedings ofthe American Association for Cancer 25Research Annual Meeting 2019；2019Mar29-Apr 3；Atlanta,GA.Philadelphia(PA):AACR；Cancer Res.79(13Suppl):Abstract nr1288(2019)，它们的全部内容通过引用并入本文)；紫苏醛(参见，例如，Fuyuno et al.,“Perillaldehyde Inhibits AHR Signaling and Activates NRF2 Antioxidant Pathwayin Human Keratinocytes,”Oxid.Med.Cell Longev.2018:9524657(2018)，其全部内容通过引用并入本文)；StemRegenin 1(SR1)(参见，例如，Boitano et al.,“Aryl HydrocarbonReceptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic StemCells,”Science 329(5997):1345-1348(2010)，其全部内容通过引用并入本文)；KYN-101(参见，例如，Campesato et al.,“Blockade of the AHR Restricts aTreg-MacrophageSuppressive Axis Induced by L-5Kynurenine,”Nature Comm.11:4011(2020)，其全部内容通过引用并入本文)；CH-223191(参见，例如，Kim et al.,“Novel Compound 2-Methyl-2H-Pyrazole-3-Carboxylic acid(2-Methyl-4-o-Tolylazo-Phenyl)-Amide(CH-223191)Prevents 2,3,7,8-TCDD-Induced Toxicity by Antagonizing the Aryl HydrocarbonReceptor,”，其全部内容通过10引用并入本文)；BAY2416964(参见，例如，BayerAktiengesellschaft等人的国际专利公开号WO/2018/146010，其全部内容通过引用并入本文)；PDM2(参见，例如，de Medina et al.,“Synthesis and Biological Properties ofNew Stilbene Derivatives of Resveratrol as New Selective Aryl HydrocarbonModulators,”J.Med.Chem.48:287-291(2005)，其全部内容通过引用并入15本文)，和GNF351(参见，例如，Smith etal.,“Identification of a High-Affinity Ligand thatExhibits Complete Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonism,”J.Pharmacol.Exp.Ther.338(1):318-327(2011)，其全部内容通过引用并入本文)。示例性AHR小分子抑制剂如下表2所示。
表2.示例性AHR小分子抑制剂
在一些实施方式中，所述转录因子阻遏物是Myc框依赖性互作蛋白(BINI)。根据这样的实施方式，所述转录因子阻遏物的抑制剂是BINI抑制剂。
在一些实施方式中，所述转录因子阻遏物是miRNA分子。根据这样的实施方式，所述转录因子阻遏物的抑制剂是miRNA的抑制剂。如本文所述，充当转录因子阻遏物的miRNA包括，但不限于，下表3中列出的那些。
表3.示例性人miRNA转录因子阻遏物
miRNA 序列 SEQ ID NO：
miR-193a-5p UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA 1
miR-23b-3p AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC 2
miR-4687-3p UGGCUGUUGGAGGGGGCAGGC 3
miR-4651 CGGGGUGGGUGAGGUCGGGC 4
miR-4270 UCAGGGAGUCAGGGGAGGGC 5
miR-24-3p UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 6
在一些实施方式中，所述转录因子阻遏物的抑制剂是任何一种或多种上述列出的miRNA(靶miRNA)的抑制剂。miRNA的抑制剂在本领域中被称为“antagomirs”。antagomir是与特定miRNA具有互补性的RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸模拟物，并且其抑制该miRNA的活性。
在一些实施方式中，所述转录因子阻遏物的抑制剂是靶向表3中列出的一种或多种miRNA的antagomir。所述antagomir与其抑制的miRNA的互补序列可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸差异。此外，所述antagomirs与它们抑制的miRNA相比可以具有相同的长度、更长的长度或更短的长度。在某些实施方式中，所述antagomir与其抑制的miRNA的5'端的6-8个核苷酸杂交。在其他实施方式中，所述antagomir与长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的miRNA互补。在其他实施方式中，所述antagomir的长度是5-10、6-8、10-20、10-15或5-500个核苷酸。
在一些实施方式中，所述antagomir是靶RNA的合成反向互补物，其紧密结合靶miRNA并使靶miRNA失活。因此，在一些实施方式中，所述antagomir特异性抑制或阻断靶miRNA的表达或活性。
在一些实施方式中，所述antagomir与上表3中提供的miRNA中的任一序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在一些实施方式中，所述antagomir能够抑制表3中公开的一种或多种miRNA的表达。
特别地，本申请的antagomir可以与选自miR-193a-5p、miR-23b-3p、miR-4687-3p、miR-4651、miR-4270或miR-24-3p的miRNA特异性的核酸序列或其一部分基本上互补。因此，表现出基本相同或改变的活性的核酸或其类似物也被涵盖。
在一些实施方式中，所述antagomir包含改善核酸酶抗性和结合亲和力的化学修饰。合适的修饰包括，但不限于，2'糖修饰，例如2'-O-Me、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)或2'-氟(2'-F)。
在一些实施方式中，在诱导成体GPC恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中的表达步骤包括向成体GPC或受试者中的GPC分别施用有效量的(1)转录因子阻遏物的抑制剂，和/或(2)有效量的一种或多种转录因子，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2))、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高15迁移率组蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB)和转录增强子TEF-4(TEAD2)。
在一些实施方式中，在诱导成体GPC恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中的表达步骤包括向成体GPC或受试者中的GPC分别施用有效量的(1)编码转录因子阻遏物的抑制剂的表达载体，和/或(2)有效量的表达载体，所述表达载体编码一种或多种转录因子，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高15迁移率组蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB))和转录增强子TEF-4(TEAD2)。
在一些实施方式中，在诱导成体GPC恢复活力的方法中或在治疗受试者中髓磷脂缺乏的方法中，上文描述的表达载体的调节序列包含由神经胶质祖细胞选择性或特异性表达的基因的启动子和/或增强子。
由神经胶质祖细胞选择性表达的基因包括血小板25衍生生长因子α(PDGFRA)、锌指蛋白488(ZNF488)、G蛋白偶联受体(GPR17)、少突胶质细胞转录因子2(OLIG2)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)和SRY-box转录因子10(SOX10)。
根据这样的实施方式，适合于控制本文公开的核酸抑制剂的表达的启动子序列包括，但不限于，血小板衍生生长因子α(PDGFRA)启动子、锌指蛋白488(ZNF488)启动子、G蛋白偶联受体(GPR17)启动子、少突胶质细胞转录因子2(OLIG2)启动子、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)启动子和SRY-box转录因子10(SOX10)启动子，其列出在下表4中。
表4.由神经胶质祖细胞选择性或特异性表达的示例性基因
*它们中每一个都通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中，在诱导成体GPC恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中，上文描述的表达载体的调节序列包含诱导型启动子或启动子系统，例如四环素控制的诱导系统、4-异丙基苯甲酸(cumate)控制的诱导系统和雷帕霉素控制的诱导系统，它们在下文中更详细地描述。
在一些实施方式中，在诱导成体GPC恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中，上文描述的表达载体是质粒载体、病毒载体或细菌载体。
在一些实施方式中，在诱导成体GPC恢复活力的方法中或在治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法中，上文描述的表达载体是病毒载体，所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒和疱疹病毒。在一些实施方式中，所述表达载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，所述表达载体是逆转录病毒载体。在其他实施方式中，所述表达载体是AAV载体。下文更详细地描述了产生和分离适合用作表达载体的病毒载体的方法。
III.涉及转录因子抑制的方法
本申请另一方面涉及通过抑制某些转录因子来诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力的方法。该方法包括向成体神经胶质祖细胞群施用有效量的抑制一种或多种转录因子的试剂，所述转录因子选自由锌指蛋白274(ZNF274)、Myc相关因子X(MAX)、E2F转录因子6(E2F6)、锌指蛋白Aiolos(IKZF3)以及信号转导和转录激活子3(STAT3)。
本申请另一方面涉及通过抑制某些衰老基因来诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力的方法。该方法包括向成体神经胶质祖细胞群施用有效量的抑制一种或多种衰老基因表达的试剂，所述衰老基因选自：RUNX1、BIN1、VAMP3、DMTF1、CTNNA1、SERPINE1、CDK19、CDKN1C、RUNX2、EFEMP1、MAP3K7、AHR、OGT、PAK1、CBX7和CYLD。
本申请另一方面涉及通过抑制某些衰老基因来诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力的方法。该方法包括向成体神经胶质祖细胞群施用有效量的抑制一种或多种神经胶质靶基因的表达试剂，所述神经胶质靶基因选自MBP、CD9、ENPP2、PLP1、ERBIN、ZNF365、UGT8、GDNF、DUSP10、PMP22、ERBB4和MYRF。
适用于本文公开的方法的成体神经胶质祖细胞包括哺乳动物神经胶质祖细胞，例如人神经胶质祖细胞、啮齿动物神经胶质祖细胞、非人灵长类神经胶质祖细胞、羊神经胶质祖细胞、牛神经胶质祖细胞、猪神经胶质祖细胞、犬神经胶质祖细胞和猫神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，所述成体神经胶质祖细胞是成体人神经胶质祖细胞。
在一些实施方式中，所述施用是离体进行的。在根据本公开的方法的其他实施方式中，所述施用在体内进行。
本申请的另一方面涉及通过抑制某些转录因子来治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法。该方法包括向患有髓磷脂缺乏的受试者施用抑制一种或多种转录因子的试剂，所述转录因子选自由ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和STAT3，其中所述试剂以有效量施用以抑制受试者的成体神经胶质祖细胞中的一种或多种转录因子。
本申请的另一方面涉及通过抑制某些衰老基因来治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法。该方法包括向受试者施用抑制一种或多种衰老基因表达的试剂，所述衰老基因选自RUNX1、BIN1、VAMP3、DMTF1、CTNNA1、SERPINE1、CDK19、CDKN1C、RUNX2、EFEMP1、MAP3K7、AHR、OGT、PAK1、CBX7和CYLD，其中所述试剂以有效量施用以抑制受试者的成体神经胶质祖细胞中的一种或多种衰老基因。
本申请的另一方面涉及通过抑制某些神经胶质靶基因来治疗受试者的髓磷脂缺乏的方法。该方法包括向受试者施用抑制一种或多种衰老基因表达的试剂，所述衰老基因选自由MBP、CD9、ENPP2、PLP1、ERBIN、ZNF365、UGT8、GDNF、DUSP10、PMP22、ERBB4和MYRF，其中所述试剂以有效量施用以抑制受试者的成体神经胶质祖细胞中的一种或多种神经胶质靶基因。
根据本申请的这个方面，髓磷脂缺乏可以与病症相关，所述病症选自多发性硬化、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎、视神经炎、皮质下卒中、糖尿病性白质脑病、高血压性白质脑病、年龄相关性白质病变、脊髓损伤、放疗或化疗引起的脱髓鞘、感染后和疫苗接种后白质脑炎、脑室周围白质软化、小儿脑白质营养不良(例如佩利扎-梅茨巴赫病、泰-萨克斯病、桑德霍夫神经节苷脂沉积症、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、粘多糖贮积症、尼曼-匹克A病、肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病、白质消失病和亚历山大病)、溶酶体贮积病、先天性髓鞘形成障碍、炎性脱髓鞘、血管性脱髓鞘和脑瘫。
在一些实施方式中，髓磷脂缺乏与神经退行性疾病(例如亨廷顿病)相关。本文所用的“亨廷顿病”是指通常在成年期显现出来的常染色体显性遗传性脑部疾病。亨廷顿病的病理学特征是髓鞘形成不足以及神经元和白质损失。
在其他实施方式中，髓磷脂缺乏与神经精神疾病(例如精神分裂症)相关。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法或治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂是抑制STAT3的试剂。如本公开图4的F所示，在成体神经胶质祖细胞的背景下，STAT3预计会激活一组衰老相关基因(例如，BIN1、DMTF1、CD47、CTNNA1、RUNX2、RUNX1、MAP3K7和OGT)、神经胶质细胞相关基因(例如，PLP1、CNP、PMP22、SEMA4D、CLDN11、GPR37、MYRF、MAG、BCAS1、ST18、ERBB4、CERS2、LPAR1和GJB1)以及下游转录因子(例如，MAX、E2F6和IKZF3)。在一些实施方式中，所述试剂是抑制或沉默STAT3和/或任何上述由STAT3激活的衰老相关基因的活性的试剂。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法和治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂是抑制ZNF274、MAX、E2F6和IKZF3中的一种或多种的试剂。如本申请的图4的G所示，在成体神经胶质祖细胞的背景下，ZNF274、MAX、E2F6和IKZF3预计会抑制多组增殖相关基因靶标(例如，YAP1、LMNB1、PATZ1、TEAD1、FN1、TP53、CDK1、CCND2、CDKN2D、CENPH、MKI67、CDK4、CENPF、CDK5、CDKN3和CHEK1)、神经胶质细胞相关基因(例如CHRDL1、ST8SIA1、PTPRZ1、CA10、PDGFRA、BCAN、NXPH1、CSPG4和PCDH15)以及下游转录因子(例如BLC11A、EZH2、HDAC2、NF1B、MYC、HMGA2和TEAD)。
在一些实施方式中，所述试剂是抑制或沉默ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3或其任何组合的活性以允许下游增殖相关基因靶标表达的试剂。
在一些实施方式中，所述试剂是抑制ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的试剂。适用于本文所述方法的试剂包括，但不限于，ZNF274抑制剂、MAX抑制剂、E2F6抑制剂、IKZF3抑制剂和STAT3抑制剂。
ZNF274抑制剂、MAX抑制剂、E2F6抑制剂、IKZF3抑制剂和/或STAT3抑制剂可以是(1)小分子抑制剂，(2)核酸分子抑制剂(例如，miRNA、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸)，(3)基于核酸酶的基因编辑系统(例如，靶向沉默ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT表达的CRISPR/Cas系统)，或(4)编码(2)或(3)的核酸分子。
小分子抑制剂
在一些实施方式中，ZNF274抑制剂、MAX抑制剂、E2F6抑制剂、IKZF3抑制剂和/或STAT3抑制剂是小分子抑制剂。下表5中提供了本领域已知的并且适合根据本文所述方法使用的这些转录因子的示例性小分子抑制剂。表5的小分子抑制剂的类似物和衍生物也预期用于本文所述的方法中。
表5.示例性小分子抑制剂
在一些实施方式中，所述小分子抑制剂是Myc相关因子X(MAX)的小分子抑制剂，选自10058-F4(也称为“10058-F4(1RH)”)(参见，例如，Huang et al.,“A Small-Molecule c-Myc Inhibitor,10058-F4,Induces Cell-Cycle Arrest,Apoptosis,and MyeloidDifferentiation of Human Acute Myeloid Leukemia,”Exp.Hematol.34(11):1480–1489(2006)，其全部内容通过引用并入本文)；MYCMI-6,MYCMI-11和MYCMI-14(参见，例如，Castell et al.,“A Selective High Affinity MYC-Binding Compound Inhibits MYC:MAX Interaction and MYC-Dependent Tumor Cell Proliferation,”Sci.Rep.8:10064(2018)，其全部内容通过引用并入本文)；12RH、22RH、27RH、28RH、1RH-S-Me、1RH-NCN-1、#015、#474、#764、12RH-NCN-1和28RH-NCN-1(参见，例如，Wang et al.,“Improved LowMolecular Weight Myc-Max inhibitors,”Mol.Cancer Ther.6(9):2399-2408(2007)，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，所述小分子抑制剂是信号转导和转录激活子3(STAT3)的小分子抑制剂，选自隐丹参酮(参见，例如，Shin et al.,“Cryptotanshinone InhibitsConstitutive Signal Transducer and Activator of Transcription 3Functionthrough Blocking the Dimerization in DU145 Prostate Cancer Cells,”CancerRes.69(1):193-202(2009)，其全部内容通过引用并入本文)；STA-21(参见，例如，Song etal.,“A Low-Molecular-Weight Compound Discovered through Virtual DatabaseScreening Inhibits Stat3 Function in Breast Cancer Cells,”PNAS
102(13):4700-4705(2005)，其全部内容通过引用并入本文)；NSC7459(S3I-201)(参见，例如，Siddiquee et al.,“Selective Chemical Probe Inhibitor of Stat3,Identified through Structure-Based Virtual Screening,Induces AntitumorActivity,”PNAS104(18):7391-7396(2007)，其全部内容通过引用并入本文)；那布卡辛(BBI608)(参见，例如，Li et al.,“Suppression of Cancer Relapse and Metastasis byInhibiting Cancer Stemness,”PNAS
112(6):1839-1844(2015)和Hubbard et al.,“Napabucasin:An Update on theFirst-in-Class Cancer Stemness Inhibitor,”Drugs 77(10):1091-1103(2017)，其全部内容通过引用并入本文)；Stattic、葫芦素I、葫芦素Q、Phpr-pTyr-Leu-cis-3,4-methanoPro-Gln-NHBn(参见，例如，McMurray,J.,“A New Small-Molecule Stat3Inhibitor,”Chem.Biol.13(11):1123-1124(2006)，其全部内容通过引用并入本文)；LLL-3(参见，例如，Fuh et al.,“LLL-3Inhibits STAT3Activity,Suppresses GlioblastomaCell Growth and Prolongs Survival in a Mouse Glioblastoma Model,”Br.J.Cancer100(1):106-112(2009)，其全部内容通过引用并入本文)；LLL-12,S31-201、SF-1-066、S31-1757、STX-0119、Cpd30-12、LY5、Cpd9、和Cpd1(参见，例如，Orlova et al.,“DirectTargeting Options for STAT3 and STAT5 in Cancer,”Cancers 11(12):1930(2019)，其全部内容通过引用并入本文)；SF-1–087、SF-1–121、S3I-M2001、S3I-201.1066和BP-1–102(参见，例如，Wu et al.,“Negative Regulators of STAT Signaling Pathway inCancers,”Cancer Manag.Res.11:4957-4969(2019)，其全部内容通过引用并入本文)；
HO-3867(参见，例如，Tierney et al.,“HO-3867,a STAT3 Inhibitor InducesApoptosis by Inactivation of STAT3 Activity in BRCA1-Mutated Ovarian CancerCells,”Cancer Biol.Ther.13(9):766-775(2012)；corylifol A(参见，例如，Lee et al.,“Phenolic Compounds Isolated from Psoralea corylifolia Inhibit IL-6-InducedSTAT3 Activation,”Planta.Med.78(9):903-906(2012)，其全部内容通过引用并入本文)；以及SD 1008(参见，例如，Liu et al.,“SOCS3Promotes Inflammation and Apoptosisvia Inhibiting JAK2/STAT3 Signaling Pathway in 3T3-L1Adipocyte,”Immunobiology220(8):947-953(2015)，其全部内容通过引用并入本文)。
核酸抑制剂
在一些实施方式中，ZNF274抑制剂、MAX抑制剂、E2F6抑制剂、IKZF3抑制剂和/或STAT3抑制剂是核酸分子抑制剂。
本文所用的术语“核酸分子抑制剂”是指减少或消除靶基因的表达的核酸分子。核酸分子抑制剂通常含有特异性靶向靶基因或靶基因mRNA中的序列的区域，以实现靶向特异性抑制。通常，核酸抑制剂分子的靶向区域包含与靶基因或靶基因mRNA上的序列充分互补的序列，以将核酸抑制剂分子的作用引导至特定的靶基因或靶基因mRNA。例如，“ZNF274的核酸分子抑制剂”减少或消除ZNF274基因的表达。核酸抑制剂分子可包括天然核糖核苷酸、天然脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸包括修饰，例如糖环上的位置上的取代，核苷酸之间的磷酸酯键的修饰，非天然碱基，和非天然替代碳结构，例如锁定核酸(“LNA”)和解锁核酸(“LNA”)。
本文所用的术语“减少”或“降低”是指其在本领域中普遍接受的含义。关于示例性核酸抑制剂分子(例如，选自miRNA、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸的ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的核酸分子抑制剂)，“减少”或“降低”一般是指，相对于在不存在核酸抑制剂分子的情况下观察到的基因转录和/或翻译而言，抑制了基因转录和/或翻译或基因产物水平。在一些实施方式中，相对于不存在根据本公开的核酸抑制剂分子时观察到的结果，基因转录和/或翻译或基因产物水平的减少是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、高达100％(即，没有可检测到的转录和/或翻译)或减少至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或更多。
合适的核酸抑制剂分子包括，但不限于，(i)ZNF274的核酸分子抑制剂，其选自miRNA、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸(ASO)；(ii)MAX的核酸分子抑制剂，其选自miRNA、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸；(iii)E2F6的核酸分子抑制剂，其选自miRNA、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸；(iv)IKZF3的核酸分子抑制剂，其选自miRNA、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸；以及(v)STAT3的核酸分子抑制剂，其选自miRNA、miRNA抑制剂、shRNAi、siRNA和反义寡核苷酸。
本文所用的术语“微小RNA”或“miRNA”是指可以负向调节基因表达的一类小RNA分子(参见，例如，Lam et al.,“siRNA Versus miRNA as Therapeutics for GeneSilencing,”Mol.Ther.Nucleic Acids 4(9):e252(2015)，其全部内容通过引用并入本文)。miRNA基因转录由细胞核中的RNA聚合酶II进行，产生初级miRNA(pri-miRNA)，其是具有双链茎环结构的5'加帽、3'多腺苷酸化的RNA。然后该pri-miRNA被微处理器复合物(microprocessor complex)(包含Drosha和微处理器复合物亚单位DCGR8)切割，形成前体miRNA(pre-miRNA)，它是包含散布错配的70-100个核苷酸且采用环结构的双链体。随后，Pre-miRNA通过输出蛋白(Exportin)5从细胞核转运至细胞质，并在细胞质中被Dicer酶进一步加工成18-25个核苷酸的miRNA双链体。然后所述miRNA双链体与RISC结合，形成称为miRISC的复合物。所述miRNA双链体解开，释放并丢弃乘客链(有义链)。成熟的单链miRNA引导所述miRISC到达靶mRNA。成熟的miRNA可以通过部分互补碱基配对与靶mRNA结合，结果是通过翻译抑制、降解和/或切割发生靶基因沉默。在一些实施方式中，所述核酸抑制剂分子是miRNA分子。用于本公开方法中的合适的miRNA抑制剂分子包括，但不限于，下表6中列出的那些。
表6.示例性miRNA序列
转录因子 miRNA 序列 SEQ ID NO：
MAX miR-485-5p AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC 7
E2F6 miR-379-5p UGGUAGACUAUGGAACGUAGG 8
STAT3 miR-125b-5p UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 9
STAT3 miR-106a-5p AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 10
STAT3 miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 11
STAT3 miR-130a-3p CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU 12
STAT3 miR-130b-3p CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU 13
在一些实施方式中，所述MAX抑制剂是MAX的核酸分子抑制剂，并且合适的MAX核酸分子抑制剂是miRNA。根据这样的实施方式，示例性MAX抑制剂miRNA具有对应于miR-485-5p、pre-miR-485-5p或成熟miR-485-5p的核苷酸序列。例如，所述miRNA可以具有SEQ IDNO：7的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述E2F6抑制剂是E2F6的核酸分子抑制剂，并且合适的E2F6核酸分子抑制剂是miRNA。根据这样的实施方式，示例性E2F6抑制剂miRNA具有对应于miR-379-5p、pre-miR-379-5p或成熟miR-379-5p的核苷酸序列。例如，所述miRNA可以具有SEQID NO：8的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述STAT3抑制剂是STAT3的核酸分子抑制剂，并且合适的STAT3抑制剂是miRNA。根据这样的实施方式，示例性STAT3抑制性miRNA具有对应于miR-125b-5p、pre-miR-125b-5p、成熟miR-125b-5p、miR-106a-5p、pre-miR-106a-5p、成熟miR-106a-5p、miR-17-5p、pre-miR-17-5p、成熟miR-17-5p、miR-130a-3p、pre-miR-130a-3p、成熟miR-130a-3p、miR-130b-3p、pre-miR-130b-3p或成熟miR-130b-3p的核苷酸序列。例如，所述miRNA可具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的核苷酸序列。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法和治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂包含一种或多种表达载体，其编码(i)选自miR-125b-5p、miR-106a-5p、miR-17-5p、miR-130a-3p和miR-130b-3p的一种或多种微小RNA，其中所述施用抑制信号转导和转录激活子3(STAT3)信号传导通路；(ii)miR-379-5p，其中所述施用抑制E2F转录因子6(E2F6)信号传导通路；和/或(iii)miR-485-5p，其中所述施用抑制Myc相关因子X(MAX)信号传导通路。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法和治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂包含编码MAX抑制剂的表达载体。在一些实施方式中，所述MAX抑制剂是核酸分子抑制剂。在一些实施方式中，所述MAX核酸分子抑制剂是miRNA。根据这样的实施方式，示例性MAX抑制剂miRNA具有对应于miR-485-5p、pre-miR-485-5p或成熟miR-485-5p的核苷酸序列。例如，所述miRNA可以具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法和治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂包含编码E2F6抑制剂的表达载体。在一些实施方式中，所述E2F6抑制剂是核酸分子抑制剂。在一些实施方式中，所述E2F6核酸分子抑制剂是miRNA。根据这样的实施方式，示例性E2F6抑制剂miRNA具有对应于miR-379-5p、pre-miR-379-5p或成熟miR-379-5p的核苷酸序列。例如，所述miRNA可以具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法和治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂包含编码STAT3抑制剂的表达载体。在一些实施方式中，所述STAT3抑制剂是核酸分子抑制剂。在一些实施方式中，所述STAT3核酸分子抑制剂是miRNA。根据这样的实施方式，示例性STAT3抑制性miRNA具有对应于miR-125b-5p、pre-miR-125b-5p、成熟miR-125b-5p、miR-106a-5p、pre-miR-106a-5p、成熟miR-106a-5p、miR-17-5p、pre-miR-17-5p、成熟miR-17-5p、miR-130a-3p、pre-miR-130a-3p、成熟miR-130a-3p、miR-130b-3p、pre-miR-130b-3p或成熟miR-130b-3p的核苷酸序列。例如，所述miRNA可具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的核苷酸序列。
在一些实施方式中，在诱导恢复活力的方法和治疗髓磷脂缺乏的方法中使用的试剂包含表达载体，所述表达载体编码(1)选自miR-485-5p、miR-379-5p、miR-125b-5p、miR-106a-5p、miR-17-5p、miR-130a-3p和miR-130b-3p的一种或多种微小RNA，和(2)选自如下表7所示的miR-93-3p、miR-1260b、miR-767-5p、miR-30b-5p、miR-9-3p和miR-9-5p的一种或多种微小RNA。
表7.miRNA序列
miRNA 序列 SEQ ID NO：
miR-93-3p ACUGCUGAGCUAGCACUUCCCG 8
miR-1260b AUCCCACCACUGCCACCAU 9
miR-767-5p UGCACCAUGGUUGUCUGAGCAUG 10
miR-30b-5p UGUAAACAUCCUACACUCAGCU 11
miR-9-3p AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 12
miR-9-5p UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 13
在一些实施方式中，ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的核酸抑制剂分子是shRNA分子。短发夹RNA(shRNA)分子包含由环连接的来自靶基因的有义序列和反义序列。转录后，shRNA分子从细胞核转运到细胞质，在细胞质中Dicer酶在短发夹RNA干扰过程中将它们加工成小/短干扰RNA(siRNA)。本文所用的术语“短发夹RNA干扰”或“shRNAi”是由一类负向调节基因表达的小RNA分子介导的过程。
在一些实施方式中，所述ZNF274抑制剂是ZNF274的核酸分子抑制剂，并且合适的ZNF274抑制剂是ZNF274 shRNA。在一些实施方式中，所述MAX抑制剂是MAX的核酸分子抑制剂，并且合适的MAX抑制剂是MAX shRNA。在一些实施方式中，所述E2F6抑制剂是E2F6的核酸分子抑制剂，并且合适的E2F6抑制剂是E2F6 shRNA。在一些实施方式中，所述IKZF3抑制剂是IKZF3的核酸分子抑制剂，并且合适的IKZF3抑制剂是IKZF3shRNA。在一些实施方式中，所述STAT3抑制剂是STAT3的核酸分子抑制剂，并且合适的STAT3抑制剂是STAT3 shRNA。
在一些实施方式中，ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的核酸抑制剂分子是siRNA。本文所用的术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指长度通常为21-23个核苷酸且具有3'-两个核苷酸突出端的短核酸分子(参见，例如，McManus&Sharp,“Gene Silencing inMammals by Small Interfering RNAs,”Nat.Rev.Genet.3(10):737–747(2002)，其全部内容通过引用并入本文)。siRNA与RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)相互作用并激活该复合物。RISC的核酸内切酶argonaute 2(AGO2)组分裂解siRNA的过客链(有义链)，而引导链(反义链)仍与该RISC结合。
随后，所述引导链将活性RISC引导至其靶mRNA以供AGO2切割。由于引导链仅结合至与其完全互补的mRNA，因此siRNA导致特异性基因沉默(参见，例如，Lam et al.,“siRNAVersus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing,”Mol.Ther.Nucleic Acids4(9):e252(2015)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，所述ZNF274抑制剂是ZNF274 siRNA。在一些实施方式中，所述MAX抑制剂是MAX siRNA。在一些实施方式中，所述E2F6抑制剂是E2F6 siRNA。在一些实施方式中，所述IKZF3抑制剂是IKZF3 siRNA。在一些实施方式中，所述STAT3抑制剂是STAT3siRNA。
在一些实施方式中，ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的核酸抑制剂分子是反义寡核苷酸。本文所用的术语“反义寡核苷酸”或“ASO”是指不同化学成分(diversechemistries)的小的(～18-30个核苷酸)、合成的单链核酸聚合物，其可用于通过各种机制调节基因表达(参见，例如，Roberts et al.,“Advances in Oligonucleotide DrugDelivery,”Nature Reviews Drug Discovery 19:673-694(2020)，其全部内容通过引用并入本文)。ASO可分为两大类：RNase H能力型(RNase H competent)和空间位阻型(stericblock)。内源性RNase H酶RNASEH1识别RNA-DNA异源双链体底物并催化RNA降解，所述RNA-DNA异源双链体底物是当基于DNA的寡核苷酸与其同源mRNA转录本结合时形成的。ASO结合位点的切割导致靶RNA的破坏，从而沉默靶基因的表达。空间位阻寡核苷酸是这样的ASO，其设计以高亲和力与感兴趣的转录本结合，但因为它们缺乏RNase H能力，所以不会诱导感兴趣的转录本降解。因此，这样的寡核苷酸包含当与RNA配对时不形成RNase H底物的核苷酸或核苷酸化学成分的混合物(即“混合体”)，从而避免连续DNA样碱基的运行。
在一些实施方式中，所述ZNF274抑制剂是ZNF274 ASO。在一些实施方式中，所述MAX抑制剂是MAX ASO。在一些实施方式中，所述E2F6抑制剂是E2F6 ASO。在一些实施方式中，所述IKZF3抑制剂是IKZF3 ASO。在一些实施方式中，所述STAT3抑制剂是STAT3 ASO，例如danvatirsen(参见，例如，Xu et al.,“Population Pharmacokinetic Analysis ofDanvatirsen Supporting Flat Dosing Switch,”J.Pharmacokinet.Pharmacodyn.46(1):65-74(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。
设计核酸抑制剂的方法是本领域公知的并且适合于设计用于本文描述的方法中的核酸抑制剂(参见，例如，Lam et al.,“siRNA Versus miRNA as Therapeutics forGene Silencing,”Mol.Ther.Nucleic Acids 4(9):e252(2015)和Kulkarni et al.,“TheCurrent Landscape of Nucleic Acid Therapeutics,”Nature Nanotechnology 16:630-643(2021)，其全部内容通过引用并入本文)。
核酸抑制剂分子被设计为以序列特异性方式靶向ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3及其转录变体。ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3及其转录变体的序列是本领域公知的并且可通过各种精选数据库(例如NCBI核苷酸或基因数据库)获得。在一些实施方式中，核酸抑制剂分子被设计为靶向使用通过所提供的NCBI登录号可获得的序列在下表8中列出的一种或多种转录因子。
表8.示例性人转录因子基因和转录变体
*它们中每一个都通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中，ZNF274抑制剂、MAX抑制剂、E2F6抑制剂、IKZF3抑制剂和/或STAT3抑制剂是能够沉默ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的表达的基于核酸酶的基因编辑系统。本文所用的术语“基于核酸酶的基因编辑系统”是指包含可以被招募至基因组中的靶序列的核酸酶或其衍生物的系统。该系统可包含成簇规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)相关(“Cas”)蛋白(例如Cas9、Cas12a和Cas12b)、锌指核酸酶(“ZFN”)或转录激活子样效应子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases)(“TALEN”)。
在一些实施方式中，所述基于核酸酶的基因编辑系统是一种CRISPR/Cas系统，其靶向沉默ZNF274表达、MAX表达、E2F6表达、IKZF3表达和/或STAT3表达。所述CRISPR/Cas系统可包含Cas蛋白或编码该Cas蛋白的核酸分子，以及向导RNA，所述向导RNA包含与靶DNA序列的一部分互补的核苷酸序列。
如本文所述，Cas蛋白与引导该Cas蛋白至靶DNA序列的向导RNA形成核糖核蛋白复合物。合适的Cas蛋白包括Cas核酸酶(即，能够在靶核酸序列处引入双链断裂的Cas蛋白)、Cas切口酶(即，能够在靶核酸序列处引入单链断裂的Cas蛋白衍生物)，和核酸酶死亡Cas(dCas)蛋白(即，不具有任何核酸酶活性的Cas蛋白衍生物)。
在一些实施方式中，所述Cas蛋白是Cas9蛋白。本文所用的术语“Cas9蛋白”或“Cas9”包括任何重组或天然存在形式的CRISPR相关蛋白9(Cas9)或其变体或同源物。在一些实施方式中，所述变体或同源物与天然存在的Cas9蛋白相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，所述Cas9蛋白与由UniProt参考号Q99ZW2、G3ECR1、J7RUA5、A0Q5Y3或J3F2B0(其全部内容通过引用并入本文)确认的蛋白或与其具有基本同一性的变体或同源物基本上相同。在一些实施方式中，所述Cas9蛋白选自Cas9核酸酶、Cas9切口酶和核酸酶死亡Cas9(“dCas9”)。
在一些实施方式中，所述Cas蛋白是Cas12a蛋白。本文所用的术语“Cas12a蛋白”或“Cas12a”包括任何重组或天然存在形式的CRISPR相关蛋白12(Cas12a)或其变体或同源物。在一些实施方式中，所述变体或同源物与天然存在的Cas12a蛋白相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，所述Cas12a蛋白与由UniProt参考号A0Q7Q2、U2UMQ6、A0A7C6JPC1、A0A7C9H0Z9或A0A7J0AY55(其全部内容通过引用并入本文)确认的蛋白或与其具有基本同一性的变体或同源物基本上相同。在一些实施方式中，所述Cas12a蛋白选自Cas12a核酸酶、Cas12a切口酶和核酸酶死亡Cas12a(“dCas12a”)。
在一些实施方式中，所述Cas蛋白是Cas12b蛋白。本文所用的术语“Cas12b蛋白”或“Cas12b”包括任何重组或天然存在形式的CRISPR相关蛋白12(Cas12b)或其变体或同源物。在一些实施方式中，所述变体或同源物与天然存在的Cas12b蛋白相比在整个序列或该序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，所述Cas12b蛋白与由UniProt参考号T0D7A2、A0A6I3SPI6、A0A6I7FUC4、A0A6N9TP17、A0A6M1UF64、A0A7Y8V748、A0A7X7KIS4、A0A7X8X2U5或A0A7X8UMW7(其全部内容通过引用并入本文)确认的蛋白或与其具有基本同一性的变体或同源物基本上相同。在一些实施方式中，所述Cas12b蛋白选自Cas12b核酸酶、Cas12b切口酶和核酸酶死亡Cas12b(“dCas12b”)。
本文所用的术语“向导RNA”或“gRNA”是指能够结合核蛋白从而形成核糖核蛋白复合物的核糖核苷酸序列。根据本公开的方法和系统，所述向导RNA包含(i)DNA靶向序列，其与ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3或STAT3序列的靶核酸序列互补，和(ii)用于Cas蛋白(例如，Cas9核酸酶、Cas9切口酶、dCas9、Cas12a核酸酶、Cas12a切口酶或dCas12a)的结合序列。
在一些实施方式中，所述向导RNA是单向导RNA分子(单个RNA核酸)，其可以包括“单向导RNA”或“sgRNA”。在其他实施方式中，本公开的核酸包括两个RNA分子(例如，通过在结合序列处杂交而连接在一起)。因此，术语向导RNA是包容性的，既指双分子核酸也指单分子核酸(例如，sgRNA)。
在一些实施方式中，gRNA的长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核酸残基。在一些实施方式中，gRNA的长度为10至30个核酸残基。在一些实施方式中，gRNA的长度是20个核酸残基。在一些实施方式中，gRNA的长度是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核酸残基或糖残基。在一些实施方式中，gRNA的长度为5至50、10至50、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、5至75、10至75、15至75、20至75、25至75、30至75、35至75、40至75、45至75、50至75、55至75、60至75、65至75、70至75、5至100、10至100、15至100、20至100、25至100、30至100、35至100、40至100、45至100、50至100、55至100、60至100、65至100、70至100、75至100、80至100、85至100、90至100、95至100或更多残基。在一些实施方式中，gRNA的长度为10至15、10至20、10至30、10至40或10至50个残基。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统被靶向沉默ZNF274基因表达，并且向导RNA包含与ZNF274基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统被靶向沉默MAX基因表达，并且向导RNA包含与MAX基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统被靶向沉默E2F6基因表达，并且向导RNA包含与E2F6基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统被靶向沉默IKZF3基因表达，并且向导RNA包含与IKZF3基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统被靶向沉默STAT3 DNA表达，并且向导RNA包含与STAT3基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，靶向沉默ZNF274表达、MAX表达、E2F6表达、IKZF3表达和/或STAT3表达的CRISPR/Cas系统是CRISPRi系统。本文所用的术语“CRISPR干扰”或“CRISPRi”是指允许基因表达的序列特异性抑制的系统。CRISPRi系统包含核酸酶死亡Cas(“dCas”)蛋白(即核酸酶失活Cas蛋白)以阻断靶基因的转录，而不切割靶DNA序列。核酸酶失活Cas蛋白和产生核酸酶失活Cas蛋白的方法是本领域公知的(参见，例如，Qi etal.,“RepurposingCRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of GeneExpression,”Cell 152(5):1173-1183(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。
适合如本文所述使用的CRISPRi系统可以包含(i)核酸酶死亡Cas(dCas)蛋白(即，核酸酶失活Cas蛋白)或编码该dCas蛋白的核酸分子，和(ii)向导RNA，其包含与ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和STAT3的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述核酸酶死亡Cas(dCas)蛋白选自dCas9、dCas12a和dCas12b。
在一些实施方式中，所述核酸酶死亡Cas(dCas)蛋白是融合蛋白，其包含Cas蛋白和一种或多种抑制或沉默靶基因(即，ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和STAT3)表达的表观遗传调节剂。
合适的表观遗传调节剂包括，但不限于，DNA甲基转移酶(例如，DNA甲基转移酶3α(“DNMT3A”)和DNA甲基转移酶3样(“DNMT3L”))、组蛋白去甲基化酶(例如，赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(“LSD1”))、组蛋白甲基转移酶(例如，G9A和SuV39h1)、转录因子招募结构域(例如，Krüppel相关盒结构域(“KRAB”)、KRAB-甲基-CpG结合蛋白2结构域(“KRAB-MeCP2”)、Zeste 2增强子(“EZH2”))、锌指转录阻遏物结构域(例如，spalt样转录因子1(“SALL1”)，和缺陷沉默蛋白抑制子3(“SDS3”))(参见，例如，Brezgin et al.,“Dead CasSystems:Types,Principles,and Applications,”Int.J.Mol.Sci.20:6041(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，所述表观遗传调节剂选自DNMT3A、DNMT2L、LSD1、KRAB、KRAB-MeCP2、EZH2、SALL1、SDS3、G9A和Suv39hl(参见，例如，Yeo et al.,“An Enhanced CRISPRRepressor for Targeted Mammalian Gene Regulation,”15(8):611-616(2018)；Alerasool et al.,“An Efficient KRAB Domain for CRISPRi Applications in HumanCells,”Nature Methods17:1093-1096(2020)；和Duke et al.,“An Improved CRISPR/dCas9 Interference Tool for Neuronal Gene Suppression,”Frontiers in GenomeEditing 2:9(2020)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，所述ZNF274抑制剂是靶向沉默ZNF274 DNA表达的CRISPRi系统，并且所述向导RNA包含与ZNF274基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述MAX抑制剂是靶向沉默MAX DNA表达的CRISPRi系统，并且所述向导RNA包含与MAX基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述E2F6抑制剂是靶向沉默E2F6 DNA表达的CRISPRi系统，并且所述向导RNA包含与E2F6基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述IKZF3抑制剂是靶向沉默IKZF3 DNA表达的CRISPRi系统，并且所述向导RNA包含与IKZF3基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述STAT3抑制剂是靶向沉默STAT3 DNA表达的CRISPRi系统，并且所述向导RNA包含与STAT3基因序列的一部分互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，抑制ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的试剂包含一种或多种表达载体，所述表达载体表达一种或多种转录因子抑制剂，所述转录因子抑制剂选自ZNF274抑制剂、MAX抑制剂、E2F6抑制剂、IKZF3抑制剂和IKZF3抑制剂。每个表达载体包含(1)核苷酸序列，其编码用于ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或IKZF3的一种或多种核酸抑制剂，和(2)可操作地连接至所述核苷酸序列的调节序列。在一些实施方式中，所述调节序列包含神经胶质细胞特异性启动子，所述神经胶质细胞特异性启动子选自PDGFRA启动子、ZNF488启动子、GPR17启动子、OLIG2启动子、CSPG4启动子和SOX10启动子。在一些实施方式中，所述调节序列包含诱导型启动子或启动子系统，例如四环素控制的诱导型系统、4-异丙基苯甲酸控制的诱导型系统和雷帕霉素控制的诱导型系统，其在下文中更详细地描述。
在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包括质粒载体、病毒载体或细菌载体。在一些实施方式中，一种或多种表达载体包含选自腺病毒、AAV、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒和疱疹病毒的病毒载体。在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包括慢病毒载体。在一些实施方式中，所述一种或多种表达载体包括逆转录病毒载体。在其他实施方式中，所述一种或多种表达载体包括AAV载体。下文更详细地描述了产生和分离适合用作表达载体的病毒载体的方法。
IV.表达载体
本公开的另一方面涉及本申请中描述的表达载体。在一些实施方式中，所述表达载体表达一种或多种转录因子，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2，其中所述表达载体包含(1)核苷酸序列，其编码一种或多种转录因子，所述转录因子选自BCL11A、HDAC2、EZH2、MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2，和(2)与所述核苷酸序列可操作地连接的调节序列。
在一些实施方式中，所述表达载体包含(1)核苷酸序列，其编码ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或IKZF3的一种或多种核酸抑制剂，和(2)与所述核苷酸序列可操作地连接的调节序列。
在一些实施方式中，所述调节序列包含神经胶质细胞特异性启动子，所述神经胶质细胞特异性启动子选自PDGFRA启动子、ZNF488启动子、GPR17启动子、OLIG2启动子、CSPG4启动子和SOX10启动子。
在一些实施方式中，所述调节序列包含诱导型启动子和/或操纵子系统序列。可用于实施本公开的方法或包括在本公开的系统中的诱导型启动子和/或操纵子系统包括受激素和激素类似物(例如黄体酮、蜕皮激素和糖皮质激素)调节的启动子和/或操纵子系统，以及受四环素、热休克、重金属离子、干扰素和乳糖操纵子激活化合物调节的启动子。诱导型启动子和/操纵子系统能够直接或间接激活其可操作地偶联的核酸分子的转录，以响应“调节剂”(例如，化学剂或生物分子，例如代谢物、小分子)或刺激物。在不存在“调节剂”或刺激物的情况下，可操作地连接至诱导型启动子和/或操纵子系统的核苷酸序列将不被转录或基本上不被表达。
术语“不被转录”或“基本上不表达”是指，转录水平与在适当的刺激物或调节剂存在下观察到的转录水平相比低至少50倍；优选地，与在适当的刺激物或调节剂存在下观察到的转录水平相比低至少100倍、250倍、或500倍或更低。有关这些系统的综述，请参阅Gingrich&Roder,“Inducible Gene Expression in the Nervous System of TransgenicMice,”Annu.Rev.Neurosci.21:377-405(1998)，其全部内容通过引用并入本文。
用于包含在本公开内容的表达载体中的合适的诱导型启动子和/或操纵子系统是本领域公知的，并且包括，但不限于，四环素控制的操纵子系统、4-异丙基苯甲酸控制的操纵子系统、雷帕霉素诱导系统、FKCsA诱导系统和ABA诱导系统(参见，例如，Kallunkietal.,“How to Choose the Right Inducible Gene Expression System for MammalianStudies？”
Cells 8(8):796(2019)；美国专利号8728759；和美国专利号7745592，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，所述四环素控制的操纵子系统包含基于抑制的配置，其中在组成型启动子和感兴趣的基因之间插入Tet操纵子(“TetO”)，并且其中Tet阻遏物(“TetR”)与操作子的结合抑制感兴趣的核酸序列的下游转录(参见，例如，Kallunki et al.,“Howto Choose the Right Inducible Gene Expression System for Mammalian Studies？”Cells 8(8):796(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。根据这样的实施方式，四环素(或合成的四环素衍生物多西环素)的添加导致TetR和TetO之间的结合的破坏，从而触发感兴趣的核酸序列的TetO依赖性转录。
在一些实施方式中，所述四环素控制的操纵子系统包含Tet-off配置，其中将串联TetO序列设置在最小启动子的上游，随后是感兴趣的核酸序列(参见，例如，Kallunki etal.,“How to Choose the Right Inducible Gene Expression System for MammalianStudies？”Cells 8(8):796(2019)，其全部内容通过引用并入本文。根据这样的实施方式，将由TetR和VP16(“tTA”)(源自1型单纯疱疹病毒的真核反式激活子)组成的嵌合蛋白转化为转录激活子，并且将表达质粒与操纵子质粒一起转染。因此，四环素(或合成的四环素衍生物多西环素)的存在会关闭系统或其组分的表达，而去除四环素则将其打开。
在一些实施方式中，所述四环素控制的操纵子系统包含Tet-on配置，其中当四环素存在时系统或其组分被转录(参见，例如，Kallunki et al.,“How to Choose the RightInducible Gene Expression System for Mammalian Studies？”Cells 8(8):796(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。根据这样的实施方式，将串联TetO序列设置在最小启动子的上游，随后是目的核酸序列。在四环素(或5合成四环素衍生物多西环素)存在的情况下，突变体rTa(“rtTa”)与TetO序列结合，从而激活最小启动子。
在一些实施方式中，所述诱导型启动子和/或操纵子系统是4-异丙基苯甲酸控制的操纵子系统。类似于四环素控制的操纵子系统，所述4-异丙基苯甲酸控制的操纵子系统，4-异丙基苯甲酸操纵子(“CuO”)及其阻遏物(“CymR”)可以被设计成阻遏物构型、激活子构型和反向激活子构型(参见，例如，Kallunki et al.,“How to Choose the RightInducible Gene Expression System for Mammalian Studies？”Cells 8(8):796(2019)，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，所述4-异丙基苯甲酸控制操纵子系统包含基于抑制的配置，其中在组成型启动子和感兴趣的基因之间插入4-异丙基苯甲酸操纵子(“CuO”)，并且其中4-异丙基苯甲酸阻遏物(“CymR”)与操纵子的结合抑制本文所述的系统(或系统组分)的下游转录。根据这样的实施方式，添加4-异丙基苯甲酸释放CymR，从而触发系统或系统组分的CuO依赖性表达。
在一些实施方式中，所述4-异丙基苯甲酸控制的操纵子系统包含激活子构型，其中通过CymR和VP16的融合而形成嵌合分子(“cTA”)。在该构型中，最小启动子置于多聚化操作子结合位点(例如，6xCuO)的下游。感兴趣的核酸序列的转录由最小启动子控制，该启动子在没有4-异丙基苯甲酸的情况下被激活。
在一些实施方式中，所述4-异丙基苯甲酸控制的操纵子系统包括反向激活子配置，其中当4-异丙基苯甲酸存在时核酸序列被转录。根据这样的实施方式，将串联CuO序列设置最小启动子的上游，随后是感兴趣的核酸序列。在4-异丙基苯甲酸存在的情况下，cTA突变体(“rcTA”)与CuO序列结合，从而激活最小启动子。
在一些实施方式中，所述诱导型启动子和/或操纵子系统是雷帕霉素诱导型系统。根据这样的实施方式，启动子是雷帕霉素诱导型启动子(例如，最小IL-2启动子)。在该系统中，DNA 25结合结构域(ZFHD1)和转录因子激活结构域(NF-KBp65)分别表达为分别与FKBP12和FRAP的雷帕霉素结合结构域(mTOR)融合的融合蛋白(参见，例如，Koh et al.,“Use of a Stringent Dimerizer-Regulated Gene Expression System for ControlledBMP2Delivery,”Mol.Ther.14(5):P684-691(2006)，其全部内容通过引用并入本文)。添加雷帕霉素(或雷帕霉素类似物FK506)后，融合蛋白可逆地交联以驱动感兴趣的核酸序列的转录。mTOR激活结构域融合蛋白的雷帕霉素结合区的突变导致系统对雷帕霉素样化合物(rapalogs)有反应，所述雷帕霉素样化合物与雷帕霉素不同，不与内源性mTOR蛋白结合，因此几乎没有免疫抑制或抗增殖活性。
在一些实施方式中，所述调节序列包含人延伸因子lα启动子(“EFlA”)、5巨细胞病毒(“CMV”)启动子、人泛素C启动子(“UBC”)、鸡β-肌动蛋白启动子、杂合鸡β-肌动蛋白启动子(CBh)和磷酸甘油激酶(“PGK”)启动子。根据这样的实施方式，启动子可被修饰以包含一、二、三或更多个Tet操纵子(TetO)位点或一、二、三、四、五、六或更多个CuO位点。
用于包含在本申请的表达载体中的另外的合适启动子包括，但不限于，H1启动子和U6启动子。在一些实施方式中，当诱导型启动子和/或操纵子系统可操作地连接至编码Cas系统中的一种或多种向导RNA的核苷酸序列时，启动子是H1启动子或U6启动子。H1启动子可以是修饰的H1启动子，包含一、二、三或更多个Tet操纵子(TetO)位点。U6启动子可以是修饰的U6启动子，包含一、二或三个Tet操纵子(TetO)位点或一、二、三、四、五、六或更多个CuO位点(参见，例如，Sun et al.,“Development of Drug-20 Inducible CRISPR-Cas9Systems for Large-Scale Functional Screening,”BMC Genomics 20:225(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，所述调节序列还可以包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点和/或在表达载体中促进与调节序列可操作地连接的核苷酸序列的表达的其他位点。
在一些实施方式中，所述表达载体编码的系统用于诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏。
在一些实施方式中，用于诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏的系统是核酸酶死亡Cas(dCas)系统。该系统包含：第一核酸分子，其编码融合蛋白，该融合蛋白包含与表观遗传调节剂融合的核酸酶死亡Cas(dCas)蛋白；第二核酸分子，其编码一种或多种向导RNA，其中所述一种或多种向导RNA各自包含与ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的DNA序列的一部分杂交的RNA序列；以及诱导型启动子和/或操纵子系统，其可操作地连接至第一核酸分子、第二核酸分子或两者。在一些实施方式中，所述失活的Cas蛋白(dCas)选自dCas9、dCas12a和dCas12b(参见，例如，Brezgin et al.,“Dead CasSystems:Types,Principles,and Applications,”Int.J.Mol.Sci.20:6041(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。
合适的表观遗传调节剂在上文详细描述。在一些实施方式中，所述表观遗传调节剂选自DNMT3A、DNMT2L、LSD1、KRAB、KRAB-MeCP2、EZH2、SALL1、SDS3、G9A、Suv39hl、Cs和WRPW(参见，例如，Yeo et al.,“An Enhanced CRISPR Repressor for Targeted MammalianGene Regulation,”15(8):611-616(2018)；Alerasool et al.,“An Efficient KRABDomain for CRISPRi Applications in Human Cells,”Nature Methods 17:1093-1096(2020)；和Duke et al.,“An Improved CRISPR/dCas9 Interference Tool for NeuronalGene Suppression,”
Frontiers in Genome Editing 2:9(2020)，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方式中，当基因或基因启动子的甲基化有效抑制其转录时，表观遗传调节剂是甲基转移酶。
在一些实施方式中，所述表观遗传调节剂选自Tet甲基胞嘧啶双加氧酶1(“TET1”)、SunTag-TET1、MS2/MCP-TET1、p300Core、单纯疱疹病毒蛋白16的四个串联拷贝(“VP64”)、VP160、NF-KB p65激活结构域(“p65”)、Epstein-Barr病毒衍生的R反式激活子(“Rta”)、SunTag-VP64、VP64-p65-Rta(“VPR”)、SunTag-p65-HSF1、TV、协同激活介质(“SAM”)、用于增强表达的三组分再利用技术(“TREE”)、Casilio、Scaffold和CMV(参见，例如，Brezgin et al.,“Dead Cas Systems:Types,Principles,and Applications,”Int.J.Mol.Sci.
20(23):6041(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方式中，当基因或基因蛋白的去甲基化有效抑制其转录时，所述表观遗传调节剂是去甲基酶(例如，TET1)。
在一些实施方式中，用于诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏的系统包含dCas融合蛋白，其中dCas与甲基转移酶融合。在任何实施方式中，用于诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏的系统包含dCas融合蛋白，其中dCas与去甲基酶融合。
用于根据本公开方法使用的示例性dCas融合蛋白和dCas融合蛋白系统列在下表9中。
表9.示例性Cas融合蛋白
*它们中每一个都通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中，所述dCas蛋白是dCas9或dCas12蛋白。
在一些实施方式中，所述dCas系统的第一和第二核酸分子包含在单个表达载体中。在一些实施方式中，所述系统的第一和第二核酸分子包含在不同的表达载体中。
在一些实施方式中，用于诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏的系统是Cas系统。所述系统包含：编码Cas蛋白的第一核酸分子；编码一种或多种向导RNA的第二核酸分子，其中所述一种或多种向导RNA各自包含与ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的DNA序列的一部分杂交的RNA序列；和可操作地连接至第一核酸分子、第二核酸分子或两者的诱导型启动子和/或操纵基因系统。
在一些实施方式中，所述Cas核酸酶系统包含Cas9蛋白或Cas12蛋白(例如，Cas12a或Cas12b)。包含在根据本公开的系统中的合适的Cas蛋白及其衍生物是本领域公知的并且在上文进行了更详细的描述。
在一些实施方式中，所述Cas核酸酶系统的第一和第二核酸分子包含在单个表达载体中。在一些实施方式中，所述第一和第二核酸分子包含在不同的表达载体中。
在一些实施方式中，用于诱导成体神经胶质祖细胞群恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏的系统是基因编辑核酸酶系统。所述系统包含：第一核酸分子，其编码包含第一DNA结合基序的第一序列特异性基因编辑核酸酶，其中第一DNA结合基序分别结合ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的第一DNA序列；第二核酸分子，其编码包含第二DNA结合基序的第二序列特异性基因编辑核酸酶，其中所述第二DNA结合基序分别结合ZNF274、MAX、E2F6、IKZF3和/或STAT3的第二DNA序列；以及可操作地偶联至所述第一核酸分子、所述第二核酸分子或所述第一和第二核酸分子两者的诱导型启动子和/或操纵子系统序列。
包含在根据本公开的系统中的合适的序列特异性基因编辑核酸酶是本领域公知的，并且包括，但不限于，锌指核酸酶(“ZFN”)和转录激活子样效应核酸酶(“TALEN”)。
在一个实施方式中，本文所述系统的序列特异性基因编辑核酸酶是ZFN。ZFN是包含与核酸酶结构域(例如，FokI限制酶的切割结构域)融合的至少1个锌指基序(例如，至少2、3、4或5个锌指基序)的人工核酸内切酶。两个单独ZFN在靶核酸序列上的异二聚化可导致靶序列的裂解。例如，两个单独ZFN可以结合靶DNA序列的相反链以诱导靶核酸序列中的双链断裂。设计包含在本公开内容的系统中的合适ZFN的方法是本领域公知的(参见，例如，Urnov et al.,“Genome Editing with Engineered Zinc Finger Nucleases,”Nat.Rev.Genet.11(9):636-646(2010)；Gaj et al.,“Targeted Gene Knockout byDirect Delivery of Zinc-Finger Nuclease Proteins,”Nat.Methods 9(8):805-807(2012)；美国专利号6,534,261；美国专利号6,607,882；美国专利号6,746,838；美国专利号6,794,136；美国专利号6,824,978；美国专利号6,866,997；美国专利号6,933,113；美国专利号6,979,539；美国专利号7,013,219；美国专利号7,030,215；美国专利号7,220,719；美国专利号7,241,573；美国专利号7,241,574；美国专利号7,585,849；美国专利号7,595,376；美国专利号6,903,185和美国专利号6,479,626，它们的全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方式中，第一和第二基因编辑核酸酶是FokI核酸酶。根据这样的实施方式，第一和第二DNA结合基序是锌指基序。
在一些实施方式中，本文所述系统的序列特异性基因编辑核酸酶是TALEN。TALEN是工程化的转录激活子样效应核酸酶，其包含DNA结合结构域和核酸酶结构域(例如，FokI限制酶的切割结构域)。所述DNA结合结构域包含一系列33-35个氨基酸重复结构域，每个重复结构域识别单个碱基对。两个单独TALEN在靶核酸序列上的异二聚化可导致靶序列的裂解。例如，两个单独TALEN可以结合靶DNA序列的相反链以诱导靶核酸序列中的双链断裂。设计包含在本公开内容的系统中的合适ZFN的方法是本领域公知的(参见，例如，Scharenberget al.,“Genome Engineering with TAL-Effector Nucleases and AlternativeModular Nuclease Technologies,”Curr.Gene Ther.13(4):291-303(2013)；Gaj et al.,“Targeted Gene Knockout by Direct Delivery of Zinc-Finger Nuclease Proteins,”Nat.Methods
9(8):805-807(2012)；Beurdeley et al.,“Compact Designer TALENs forEfficient Genome Engineering,”Nat.Commun.4:1762(2013)；美国专利号8,440,431；美国专利号8,440,432；美国专利号8,450,471；美国专利号8,586,363；以及美国专利号8,697,853，它们的全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方式中，第一和第二基因编辑核酸酶是FokI核酸酶。根据这样的实施方式，第一和第二DNA结合基序是TALE基序。
在一些实施方式中，本文所述的序列特异性基因编辑核酸酶系统的第一和第二核酸分子包含在单个表达载体中。在一些实施方式中，所述第一和第二核酸分子包含在不同的表达载体中。
在本文所述的用于使神经胶质祖细胞恢复活力或治疗受试者的髓磷脂缺乏的所有系统中，所述系统的第一和/或第二核酸分子可操作地偶联至诱导型启动子和/或操纵子系统，如上述更详细地描述的。
在一些实施方式中，本申请的表达载体是质粒载体、病毒载体或细菌载体。
在一些实施方式中，本申请的表达载体是慢病毒载体(参见，例如，Fang等人的美国专利号748,529；Ura et al.,“Developments in Viral Vector-Based Vaccines,”Vaccines 2:624-641(2014)；和Hu et al.,“Immunization Delivered by LentiviralVectors for Cancer and Infection Diseases,”Immunol.Rev.239:45-61(2011)，15它们的全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，本申请的表达载体是逆转录病毒载体(参见，例如，Fang等人的美国专利号748,529和Ura et al.,“Developments in Viral Vector-BasedVaccines,”Vaccines 2:624-641(2014)，它们的全部内容通过引用并入本文)、痘苗病毒、复制缺陷型腺病毒载体和无肠腺病毒载体(参见，例如，美国专利号5,872,005，其全部内容通过引用并入本文)。
在其他实施方式中，本申请的表达载体是腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如，Krause et al.,“Delivery of Antigens by Viral Vectors for Vaccination,”Ther.Deliv.2(1):51-70(2011)；Ura et al.,“Developments in Viral Vector-BasedVaccines,”Vaccines 2:624-641(2014)；Buning et al,"Recent Developments inAdeno-associated Virus Vector Technology,"J.Gene Med.
10:717-733(2008)，它们每一篇的全部内容均通过引用并入本文)。
用于产生和分离适合用作载体的病毒表达载体的方法是本领域已知的(参见，例如，Bulcha et al.,“Viral Vector Platforms within the Gene Therapy Landscape,”Nature 6:53(2021)；Bouard et al.,“Viral Vectors:From Virology to TransgeneExpression,”Br.J.Pharmacol.
157(2):153-165(2009)；Grieger&Samulski,"Adeno-associated Virus as aGene Therapy Vector:Vector Development,Production and Clinical Applications,"Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145(2005)；Buning et al,"RecentDevelopments in Adeno-associated Virus Vector Technology,"J.Gene Med.10:717-733(2008)，它们每一篇的全部内容都通过引用并入本文)。
V.基因修饰的神经胶质祖细胞
本公开的方面还涉及用本申请的表达载体或核酸分子进行基因修饰的神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，所述表达载体或核酸分子整合至基因修饰的神经胶质祖细胞的基因组中。在一些实施方式中，所述表达载体或核酸分子以表观染色体形式存在于基因修饰的神经胶质祖细胞中。
在一些实施方式中，所述神经胶质祖细胞用根据本申请的核酸酶死亡Cas(dCas)系统、Cas核酸酶系统或基因编辑核酸酶系统进行基因修饰。
在一些实施方式中，所述基因修饰的神经胶质祖细胞是哺乳动物神经胶质祖细胞。在任何实施方式中，所述基因修饰的神经胶质祖细胞是人神经胶质祖细胞。
适用于这里所述的基因修饰的神经胶质祖细胞可以使用本领域已知的或本文所述的方法衍生自多潜能(multipotent)细胞(例如，神经干细胞)或多能(pluripotent)细胞(例如，胚胎干细胞和诱导多能干细胞)。在另一实施方式中，可以通过使用如美国专利申请公开号20040029269和20030223972(它们的全部内容通过引用并入本文)中所述的启动子特异性分离技术直接从含有混合细胞群的胚胎组织、胎儿组织或成人脑组织中提取神经胶质祖细胞。根据该实施方式，从脑室区或亚脑室区或从皮层下白质分离神经胶质祖细胞。
在一些实施方式中，所述基因修饰的神经胶质祖细胞是基因修饰的双能神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，所述基因修饰的神经胶质祖细胞是基因修饰的偏向少突胶质细胞的神经胶质祖细胞。在一些实施方式中，所述基因修饰的神经胶质祖细胞是基因修饰的偏向星形胶质细胞的神经胶质祖细胞。
在一些实施方式中，优选在基因修饰之前或之后富集包含神经胶质祖细胞的细胞制剂，以增加经修饰以含有本文描述的表达载体或系统的神经胶质祖细胞的浓度和/或纯度。因此，在一个实施方式中，利用在发育或分化过程早期识别并结合存在于神经胶质祖细胞上的神经节苷脂的A2B5单克隆抗体(mAb)来从混合细胞群中分离神经胶质祖细胞(Nuneset al.,“Identification and Isolation of Multipotential Neural ProgenitorCells From the Subcortical White Matter of the Adult Human Brain.,”Nat Med.9(4):439-47(2003)，其全部内容通过引用并入本文)。使用A2B5 mAb，可以从混合细胞类型群中分离、富集或纯化神经胶质祖细胞。在另一实施方式中，采用CD140a/PDGFRa阳性细胞的选择来产生双潜能神经胶质祖细胞的纯化或富集制剂。在另一实施方式中，采用CD9阳性细胞的选择来产生偏向少突胶质细胞的神经胶质祖细胞的纯化或富集制剂。在又一实施方式中，同时采用CD140a/PDGFRa和CD9阳性细胞选择两者来产生偏向少突胶质细胞的神经胶质祖细胞的纯化或富集制剂。在另一实施方式中，采用CD44阳性细胞的选择来产生偏向星形胶质细胞的神经胶质祖细胞的纯化或富集制剂(Liu et al.,“CD44 ExpressionIdentifies Astrocyte-Restricted Precursor Cells,”Dev.Biol.276(1):31-46(2004)，其全部内容通过引用并入本文。)在另一实施方式中，同时采用CD140a/PDGFRa和CD44阳性细胞选择两者来产生偏向少突胶质细胞的神经胶质祖细胞的纯化或富集制剂。在另一实施方式中，采用CD140a/PDGFRa、CD9和CD44阳性细胞选择来产生偏向少突胶质细胞的神经胶质祖细胞的纯化或富集制剂。
本公开的另一方面涉及表达根据本公开的基因构建体的神经胶质祖细胞的制剂。
下面的实施例旨在举例说明本公开实施方式的实践，但决不旨在限制其范围。
实施例
材料和方法
细胞株
人iPSC细胞株C27用于产生hGPC，其中验证了预测的感兴趣的转录本。C27细胞株是雄性。细胞分化为GPC，如人iPSC衍生的GPC生产中所详述(Chambers et al.,“HighlyEfficient Neural Conversion of Human ES and iPS Cells by Dual InhibitionofSMAD Signaling,”Nat Biotechnol 27:275-280(2009)，其全部内容通过引用并入本文)。
用于细胞分离的成人和胎儿大脑处理
人脑样品是根据批准的机构审查委员会方案从罗彻斯特大学斯特朗纪念医院(Strong Memorial Hospital)的同意患者获得的。脑组织取自正常GW18-24皮质和/或VZ/SVZ解剖或成人白质/皮质癫痫切除(mRNA为18F、19M和27F岁，miRNA为8M、20F、43M和54F岁)。A2B5+/PSA-NCAM-细胞的胎儿GPC采集、解离和免疫磁性分选如所述进行(Windrem etal.,“Fetal and Adult Human Oligodendrocyte Progenitor Cell Isolates Myelinatethe Congenitally Dysmyelinated Brain,”Nat.Med.10:93-97(2004)，其全部内容通过引用并入本文)。使用双重免疫磁性分选策略从解离组织中分离GPC：使用微珠标记的大鼠抗小鼠IgM(Miltenyi Biotech)耗尽小鼠抗PSA-NCAM+(Millipore，DSHB)细胞，然后如文献(Windrem et al.,“Fetal and Adult Human Oligodendrocyte Progenitor CellIsolates Myelinate the Congenitally Dysmyelinated Brain,”Nat.Med.10:93-97(2004)和Windrem et al.,“Neonatal Chimerization with Human Glial ProgenitorCells can both Remyelinate and Rescue the Otherwise Lethally HypomyelinatedShiverer Mouse,”Cell Stem Cell 2:553-565(2008)，其全部内容通过引用并入本文)所述从PSA-NCAM-池选择A2B5+(克隆105；ATCC，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(VA))来自的细胞。分选后，将细胞在含有10ng/ml bFGF和20ng/ml PDGF-AA的DMEM-F12/N1中维持1-14天。或者，如前所述(Sim et al.,“CD140aIdentifies a Population of HighlyMyelinogenic,Migration-Competent and Efficiently Engrafting HumanOligodendrocyte Progenitor Cells,”Nat.Biotechnol.29:934-941(2011b)，其全部内容通过引用并入本文)，使用MACS分离和分选CD140a/PDGFaR定义的GPC，产生富集的CD140+神经胶质祖细胞群。
批量RNA测序
通过Qiagen RNeasy试剂盒从分离物中纯化RNA，并构建批量RNA测序文库。样品在罗彻斯特大学基因组研究中心的Illumina HiSeq 2500上进行深度测序。使用fastp修剪原始FASTQ文件并删除接头(Chen et al.,“fastp:An Ultra-fast All-in-one FASTQPreprocessor,”Bioinformatics 34:i884-i890(2018)，其全部内容通过引用并入本文)，并在所有样品上以2遍模式(2-pass mode)通过STAR使用Ensembl 95基因注释与GRCh38对齐(Dobin et al.,“STAR:Ultrafast Universal RNA-seq Aligner,”Bioinformatics 29:15-21(2013)，其全部内容通过引用并入本文)并用RSEM版本进行定量(Li and Dewey,“RSEM:Accurate Transcript Quantification From RNA-Seq Data With or Without aReference Genome,”BMC Bioinformatics 12:323(2011)，其全部内容通过引用并入本文)。随后的分析在R中进行(RCore Team R:A Language and Environment forStatistical Computing.(Vienna,Austria:RFoundation for Statistical Computing)(2017)，其全部内容通过引用并入本文)，其中RSEM基因水平结果通过tximport导入(Soneson et al.,“Differential Analyses for RNA-seq:Transcript-Level EstimatesImprove Gene-Level Inferences,”F1000Research 4:1521(2015)，其全部内容通过引用并入本文)。DE分析在DESeq2中进行(Love et al.,“Moderated Estimation of FoldChange and Dispersion for RNA-seq Data With DESeq2,”Genome Biology 15:550(2014)，其全部内容通过引用并入本文)，其中配对分析(胎儿A2B5+vs CD140a+、胎儿CD140a+vs CD140a-)将配对信息添加到它们的模型中。对于成体vs胎儿DE分析，将年龄与分类标记(不包括CD140a-样品)连接起来以定义组变量，其中还将测序批次添加到模型中以考虑技术变异性。调整后p值<0.01且绝对log2倍数变化>1的基因被认为是显著的。然后通过有意义的丰度进一步过滤这些数据，定义为至少1组中的中位数TPM(通过RSEM计算)为1(在DE之前有20,663个基因满足此标准)。
scRNA测序分析
如上所述处理过的胎儿脑样品用于批量RNA-seq，直至单细胞通过FACS进行分选用于CD140a+或PSA-NCAM-/A2B5+表面表达。然后利用V2化学在10X基因组学铬控制器上捕获单细胞，并根据制造商的说明生成文库。
在Illumina HISeq 2500系统上对样品进行测序。然后使用Cell Ranger将多路分离的样品与仅使用蛋白编码、IncRNA或miRNA生物型从GRCh38和Ensembl 95基因注释生成的索引进行比对和定量。scRNA-Seq样品的分析在R内通过Seurat进行(Butler et al.,“Integrating Single-cell Transcriptomic Data Across Different Conditions,Technologies,and Species,”Nat Biotechnol 36:411-420(2018)，其全部内容通过引用并入本文)。将两个样品合并，并滤除低质量细胞(定义为线粒体基因表达大于15％或独特基因少于500个)。然后利用SCTransform对样品进行归一化，注意回归掉(regress out)由于UMI总数、线粒体基因含量百分比或每个细胞的S期和G2M期评分差异造成的贡献。然后计算PCA，使用前30个维度以n.neighbors＝60和repulsion.strength＝0.8运行UMAP。然后运行FindNeighbors，然后运行FindClusters，分辨率设置为0.35。根据每个簇的表达谱，一些相似的簇被合并成更宽的细胞类型簇。使用MAST测试计算簇的静态差异表达(Finak etal.,“MAST:A Flexible Statistical Framework for Assessing TranscriptionalChanges and Characterizing Heterogeneity in Single-cell RNA Sequencing Data,”Genome Biology 16:278(2015)，其全部内容通过引用并入本文)，其中调整后p值<0.01和绝对log2倍数变化>0.5被认为是显著的。使用位于https://resources.aertslab.org/cistarget/的hg38数据库在R中使用SCENIC包进行活性转录因子调节子的预测(Aibar etal.,“SCENIC:Single-cell Regulatory Network Inference and Clustering,”Nat.Methods 14:1083-1086(2017)，其全部内容通过引用并入本文)。如果基因在至少1％的细胞中表达，则该基因包含在共表达分析中。
Ingenuity Pathway Analysis与网络构建
将差异表达的基因送入Ingenuity Pathway Analysis(Qiagen)以确定重要的规范、功能和上游信号传导项。为了构建IPA网络，过滤调整后p值低于0.001的术语。删除了不相关的IPA项以及使用iGraph软件包通过jaccard相似性指数评估的高度冗余的功能项(Csardi,G.N.,Tamas“The Igraph Software Package for Complex Network Research,”InterJournal Complex Systems 1695(2006)，其全部内容通过引用并入本文)。在Gephi中建立了模块化(Bastian et al.,“Gephi:An Open Source Software for Exploring andManipulating Networks,”(2009)，其全部内容通过引用并入本文)，并且使用Cytoscape对最终网络进行可视化(Shannon P.,“Cytoscape:A Software Environment forIntegrated Models of Biomolecular Interaction Networks,”Genome Res 13:2498-2504(2003)，其全部内容通过引用并入本文)。保留感兴趣的基因和项用于可视化目的。模块相互分离并使用yFiles有机布局进行组织。
转录因子活性的推断
将成体和胎儿富集基因列表分别输入RcisTarget(Aibar et al.,“SCENIC:Single-cell Regulatory Network Inference and Clustering,”Nat.Methods 14:1083-1086(2017)，其全部内容通过引用并入本文)来识别基因启动子周围窗口(向上500bp/向下100bp以及向上10kb和向下10kb)中基序的过表达。然后根据输入基因列表中显著差异表达来过滤与显著富集基序(NES>3)相关的转录因子。在每个窗口和基因列表中，仅保留适当的TF-基因相互作用(下调基因的阻遏物(Repressors downregulating genes)和上调基因的激活子(activators upregulating genes))。然后合并扫描窗口以产生预测的胎儿/成体阻遏物/激活子的TF-基因边缘列表。感兴趣的TF被缩小到那些在文献中主要被报道为单独的激活子或阻遏物的转录因子。
miRNA微阵列分析
如上所述经由MACS分离A2B5+成体(n＝3)和CD140a+胎儿(n＝4)细胞悬浮液，并根据制造商说明(QIAGEN)使用miRNeasy试剂盒分离它们的miRNA。然后按照标准方案的指示，制备纯化的miRNA，并在Affymetrix GeneChip miRNA 3.0阵列上进行分析。然后通过oligo(Carvalho and Irizarry,“A Framework for Oligonucleotide MicroarrayPreprocessing,”Bioinformatics 26:2363-2367(2010)，其全部内容通过引用并入本文)包将原始CEL文件读入R，并通过稳健多阵列平均(robust multi-array averaging，RMA)对样品进行归一化。然后根据Affymetrix注释仅过滤人miRNA的探针，并在limma(Ritchieetal.,“Limma Powers Differential Expression Analyses for RNA-Sequencing andMicroarray Studies,”Nucleic Acids Res 43:e47(2015)，其全部内容通过引用并入本文)中进行差异表达，其中在调整后p值<0.01时确立显著性。最后，使用miRNAtap(PajakM.,“miRNAtap:miRNAtap:microRNA Targets-Aggregated Predictions,”R PackageVersion 1.22.0(2020)，其全部内容通过引用并入本文)在五个独立的miRNA预测数据库中调查差异表达的miRNA，min_src设置为2，方法设置为“geom”。通过查询TrasmiR V2.0数据库进行miRNA的转录因子调控(Tong et al.,“TransmiR v2.0:An Updated TranscriptionFactor-microRNA Regulation Database,”Nucleic Acids Res 47:D253-D258(2019)，其全部内容通过引用并入本文)。
探索性分析和可视化
以DESeq2对象的方差稳定值的默认设置，通过prcomp计算批量RNA-Seq或微阵列样品的PCA。通过ggfortify包中的autoplot绘制PCA。使用EnhancedVolcano生成火山图。使用ggplot2进一步编辑或重新生成图表，并使用patchwork对齐。
人iPSC衍生的GPC生产
人诱导多能干细胞(C27(Chambers et al.,“Highly Efficient NeuralConversion of Human ES and iPS Cells by Dual Inhibition of SMAD Signaling,”Nat Biotechnol 27:275-280(2009)，，其全部内容通过引用并入本文)使用我们之前描述的方案(Osipovitch et al.,“Human ESC-Derived Chimeric Mouse Models ofHuntington's Disease Reveal Cell-Intrinsic Defects in Glial Progenitor CellDifferentiation,”Cell Stem Cell 24:107-122e107(2019)；Wang et al.,“Human iPSC-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cells Can Myelinate and Rescue a MouseModel of Congenital Hypomyelination,”Cell Stem Cell 12:252-264(2013)；和Windrem et al.,“Human iPSC Glial Mouse Chimeras Reveal Glial Contributions toSchizophrenia,”Cell Stem Cell 21:195-208.e196(2017)，其全部内容通过引用并入本文)分化为GPC。简而言之，细胞首先分化为神经上皮细胞，然后分化为pre-GPC，最后分化为GPC。GPC维持在补充有T3、NT3、IGF1和PDGF-AA的神经胶质培养基中。
慢病毒过表达
对于E2F6、ZNF274、IKZF3或MAX的过表达，我们首先从成体hGPC数据集中确定了这些基因中的每一个的最丰富的蛋白编码转录本。将每个转录本的cDNA克隆到pTANK-TRE-EGFP-CAG-rtTA3G-WPRE载体中四环素响应元件启动子的下游。通过瞬时转染HEK293FT细胞产生用水泡性口炎病毒G糖蛋白假型化的病毒颗粒，并通过超速离心浓缩，并通过QPCR(qPCR慢病毒滴度试剂盒，ABM-Applied Biological Materials Inc)滴定。iPSC(C27)衍生的GPC培养物(体外160-180天)在神经胶质培养基中以1.0MOI感染24小时。细胞用HBSS洗涤并维持在补充有1pg/ml多西环素(Millipore-Sigma St.Louis,MO)的神经胶质培养基中，以进行剩余的实验。在最初添加多西环素后3、7和10天，通过FACS在DAPI-/EGFP+表达上分离转导的hGPC。多西环素对照细胞仅在DAPI-上进行分选。
定量PCR
使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，德国)提取来自过表达实验的RNA。使用TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems，美国)合成第一链cDNA。qPCR反应一式三份，每次反应加载混有FastStart Universal SybrGreen Mastermix(Roche Diagnostics，德国)的1ng RNA，并在实时PCR仪器(CFX Connect实时系统热循环仪；Bio-Rad)上进行分析。结果根据每个样品的18S表达进行标准化。
量化和统计分析
对于qPCR实验，在通过过表达条件和时间点与添加细胞批次协变量的相互作用构建的线性模型中分析每个基因的ΔCT的显著差异。使用Ismeans包，通过最小二乘法检验(least-squares means tests)对时间点内的Dox对照进行事后配对比较(Post hocpairwise comparisons)(Lenth,R.V.,“Least-Squares Means:The R Package lsmeans,”Journal of Statistical Software,Foundation for Open Access Statistics 69(i01)(2016)，其全部内容通过引用并入本文)。使用错误发现率法(false discovery ratemethod)对P值进行多重比较调整，其中p值<0.05被认为是显著的。
实施例1：CD140a选择富集人胎儿神经胶质祖细胞比A2B5更有效
为了识别GPC老化的转录伴随物，首先使用批量和单细胞RNA-Seq来表征源自妊娠第二期胎儿人组织的hGPC，无论是通过靶向PDGFRa的CD140a表位(Sim et al.,“CD140aIdentifies a Population of Highly Myelinogenic,Migration-Competent andEfficiently Engrafting Human Oligodendrocyte Progenitor Cells,”NatureBiotechnology 29:934-941(2011a)，其全部内容通过引用并入本文)，或由单克隆抗体A2B5识别的神经胶质神经节苷脂(Dietrich et al.,“Characterization of A2B5+GlialPrecursor Cells From Cryopreserved Human Fetal Brain Progenitor Cells,”Glia40:65-77(2002)；Sim et al.,“CD140a Identifies a Population of HighlyMyelinogenic,Migration-Competent and Efficiently Engrafting HumanOligodendrocyte Progenitor Cells,”Nature Biotechnology 29:934-941(2011a)；和Windrem et al.,“Fetal and Adult Human Oligodendrocyte Progenitor CellIsolates Myelinate the Congenitally Dysmyelinated Brain,”Nat.Med.10:93-97(2004)，其全部内容通过引用并入本文)来分离。为此，进行了两个样品匹配实验，其中18-22周胎龄(g.a.)胎儿大脑的脑室/脑室下区(VZ/SVZ)被分离并通过荧光激活细胞分选术(FACS)分选，用于从同一胎儿大脑中分离的CD140a+和A2B5+/PSA-NCAM-(A2B5+)GPC(n＝3)，或用于CD140a+GPC以及CD140a耗尽的剩余部分(n＝5；图1，A图)。然后生成批量RNA-Seq文库，并对两个实验进行深度测序。主成分分析(PCA)显示CD140a+和A2B5+细胞的分离，以及两者与CD140a耗尽的样品的进一步分离(图1，B图)。两个配对组(paired cohorts)中的差异表达(p<0.01，绝对log2倍数变化>1)鉴定出723个基因在CD140a+和A2B5+GPC之间差异表达(CD140a中435个，A2B5中288个，表S1)。相比之下，有2,629个基因将CD140a+GPC与CD140a-细胞区分开(图1，C图)。当比较CD140+与A2B5+或CD140-细胞时，差异基因表达方向性高度一致，除了4个基因外，所有基因都是一致的。
使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)对这两个基因集进行的通路富集分析鉴定出在CD140+GPC中相对活跃的类似通路；这些通路包括细胞运动、少突胶质细胞分化、脂质合成以及下游PDGF、SOX10和TCF7L2信号传导(图1，D图)。正如预期的那样，当将CD140a+GPC与CD140a-细胞而不是与A2B5+GPC进行比较时，通常会观察到更强的激活Z评分。有趣的是，CD140a+细胞还差异表达了许多与免疫系统相关的通路，这可能是由于小胶质细胞表面上PDGFaR表位的重新表达导致的少量小胶质细胞污染。A2B5+样品另外表现出上调的ST8SIA1，该酶负责A2B5合成(Sim et al.,“Fate Determination of Adult Human GlialProgenitor Cells,”Neuron Glia Biol 5:45-55(2009)，其全部内容通过引用并入本文)，以及促神经通路。
CD140a+分离物中差异上调的基因包括PDGFRA本身，以及许多早期少突胶质细胞基因，包括OLIG1、OLIG2、NKX2-2、SOX10和GPR17(图1，E-1图，F图)。此外，CD140a+部分还表现出后期髓鞘形成相关基因(包括MBP、GAL3ST1和UGT8)的表达增加。除了少突胶质细胞谱系的富集之外，许多通常与小胶质细胞相关的基因也在CD140a分离物中富集，包括CD68、C2、C3、C4和TREM2。相比之下，A2B5+分离物表现出星形胶质细胞(AQ4、CLU)和早期神经元(NEUROD1、NEUROD2、GABRG1、GABRA4、EOMES、HTR2A)基因的富集，表明未成熟星形胶质细胞和神经元以及GPC和少突胶质细胞谱系表达A2B5细胞。总体而言，当各自与耗尽部分进行比较时，CD140a+GPC中的少突胶质细胞富集显著高于A2B5定义的GPC，这表明CD140a分离物在hGPC中更富集，因此CD140a作为更合适的表型用于与成体hGPC进行头对头比较。
实施例2：单细胞RNA测序揭示人胎儿GPC分离物内的细胞异质性
为了进一步以单细胞分辨率描绘胎儿hGPC分离物的组成，通过FACS从20周g.a.的胎儿VZ/SVZ分离CD140a+和A2B5+hGPC两者，然后通过单细胞RNA-Seq测定各自的转录组(图1，A图，10X Genomics V2)。目标是每个捕获>1,000个细胞；过滤低质量细胞(独特基因<500，线粒体基因百分比>15％)后，留下1,053个PSA-NCAM-/A2B5+和957个CD140a+高质量细胞(每个细胞中位数为6,845个独特分子标识符和2,336个独特基因)。通过统一流形逼近和投影(uniform manifold approximation and projection，UMAP)进行的降维，然后使用Seurat进行的所有细胞的基于共享最近邻模块化聚类分析(shared nearest neighbormodularity-based clustering)(Butler et al.,“Integrating Single-cellTranscriptomic Data Across Different Conditions,Technologies,and Species,”NatBiotechnol 36:411-420(2018)，其全部内容通过引用并入本文)揭示了具有8种主要细胞类型的11个细胞簇，如通过标记基因的差异富集所定义的。这些主要细胞类型包括：GPC、pre-GPC、神经祖细胞(NPC)、未成熟神经元、神经元、小胶质细胞以及由内皮细胞和周细胞组成的细胞簇。我们发现CD140a+FACS分离物比胎儿A2B5+/PSA-NCAM-细胞更富集GPC和pre-GPC群(图2，A-2图，D图)。此外，虽然CD140a分选的细胞主要限于GPC和pre-GPC，仅具有分散的小胶质细胞污染，但A2B5+/PSA-NCAM-分离物还包括星形胶质细胞和神经元谱系细胞，尽管后者先期耗尽了神经元PSA-NCAM。这些数据支持CD140a的选择性和表型限制性比基于A2B5的GPC分离更强。
在此基础上，接下来探索CD140a+胎儿分离物中主要细胞群，GPC和pre-GPC的基因表达谱。这两个池库之间的差异表达产生了269个(143个上调，126个下调；p<0.01，log2倍数变化>0.5；图2，E图)。在pre-GPC到GPC的转变过程中，早期少突胶质细胞谱系基因迅速上调(OLIG2、SOX10、NKX2-2、PLLP、APOD)，而在pre-GPC中表达的基因有效地消失了(VIM、HOPX、TAGLN2、TNC)。有趣的是，随着细胞过渡到GPC阶段，参与人白细胞抗原系统的基因(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M)均被下调(图2，F图)。IPA分析表明，对于与迁移、增殖相关的项和预示星形胶质细胞特性的那些项(BMP4、AGT和VEGF信号传导)pre-GPC相对富集，而GPC除了激活MYC和MYCN通路以外，还对于与获得少突胶质细胞特性相关的项(PDGF-AA、FGFR2、CCND1)显示出富集(图2，G图)。接下来使用单细胞共表达数据和使用SCENIC包(Aibar etal.,“SCENIC:Single-cell Regulatory Network Inference and Clustering,”NatMethods 14:1083-1086(2017)，其全部内容通过引用并入本文)的启动子基序富集鉴定了262个预计在GPC中相对于pre-GPC相对激活的转录因子(Wilcoxon秩和检验，p<0.01)。这些包括SATB1，以及早期GPC规格因子(specification factor)OLIG2、SOX10和NKX2-2(图2，H图)。
实施例3：人成体和胎儿GPC在转录上是不同的
本研究接下来询问成体hGPC在其转录方面与胎儿hGPC有何不同。为此，从手术切除的成人颞叶新皮质(19-21岁，n＝3)中分离出A2B5+hGPC，并评估它们的批量RNA表达，并与另外四个胎儿CD140a+样品配对。先前已经指出，考虑到成体hGPC中与成熟相关的PDGFRA表达下调，A2B5选择足以从成人大脑中分离GPC，并且在这方面比CD140a更敏感(Sim etal.,“Complementary Patterns of Gene Expression by Human OligodendrocyteProgenitors and their Environment Predict Determinants of ProgenitorMaintenance and Differentiation,”Ann Neurol 59:763-779(2006)和Windrem et al.,“Fetal and Adult Human Oligodendrocyte Progenitor Cell Isolates Myelinate theCongenitally Dysmyelinated Brain,”Nat.Med.10:93-97(2004),，其全部内容通过引用并入本文)。
证实之前的观察，发现A2B5+成体GPC中PDGFRA的中位数TPM表达为0.55，相比之下胎儿A2B5+细胞的中位数TPM为47.56。通过将测序和分析与胎儿CD140a选择的细胞配对，可以实现测序批次效应的回归，同时提高功效(图3，A图)。对于成体hGPC样品来说，不需要耗尽PSA-NCAM+细胞，因为PSA-NCAM在成人皮质和白质中停止表达(Seki et al.,“Distribution and Possible Roles of the Highly Polysialylated Neural CellAdhesion Molecule(NCAM-H)in the Developing and Adult Central Nervous System,”Neurosci.Res.1:265-290(1993)，其全部内容通过引用并入本文)。结果，人成体和胎儿GPC的PCA表明成体GPC紧密聚集，与两个分选的胎儿hGPC池明显分离(图3，B图)。与A2B5+或CD140a+胎儿GPC群体相比，成体GPC的差异表达分别产生3,142和5,282个显著基因(p<0.01；绝对log2倍数变化>1)(图3，C图)。为了提高定义差异表达的准确性，对交叉的2,720个基因进行了下游分析(图3，D图，与胎儿hGPC相比，成体GPC中有1,060个上调和1,660个下调)。值得注意的是，在这两个差异表达的基因集中，100％的基因在方向上是一致的。
为了更好地理解成体GPC和胎儿GPC之间的差异，构建了非冗余显著IPA项及其贡献差异表达基因的基因本体网络(图3，D-3图，E图)。该网络的自旋玻璃社区检测(Reichardt et al.,“Statistical Mechanics of Community Detection,”Phys.Rev.EStat.Nonlin.Soft Matter Phys.74:016110(2006)，其全部内容通过引用并入本文)发现了高度连接的功能项(图3的E)和基因(图3的F，表S3)的三个模块(模块M1-M3)。M1包括与神经胶质细胞发育、增殖和运动相关的项和基因。值得注意的是，许多与GPC个体发育相关的基因在成体GPC中下调；这些基因包括CSPG4/NG2、PCDH15、CHRDL1、LMNB1、PTPRZ1和ST8SIA1(Huang et al.,“Origins and Proliferative States of Human OligodendrocytePrecursor Cells,”Cell 182:594-608e511(2020)；McClain et al.,“PleiotrophinSuppression of Receptor Protein Tyrosine Phosphatase-β/ζMaintains the Self-renewal Competence of Fetal Human Oligodendrocyte Progenitor Cells,”JNeurosci 32:15066-15075(2012)；Nishiyama et al.,“Co-Localization of NG2Proteoglycan and PDGFα-Receptor on O2A Progenitor Cells in the Developing RatBrain,”Journal of Neuroscience Research 43:299-314(1996)；Sim et al.,“FateDetermination of Adult Human Glial Progenitor Cells,”Neuron Glia Biol 5:45-55(2009)；和Yattah et al.,“Dynamic Lamin B1-Gene Association DuringOligodendrocyte Progenitor Differentiation,”Neurochem Res 45:606-619(2020)，其全部内容通过引用并入本文)。相比之下，许多在少突胶质细胞分化和髓鞘形成之前出现并持续出现的基因在成体GPC中上调，包括MAG、MOG、MYRF、PLP1、CD9、CLDN11、CNP、ERBB4、GJB1、PMP22和SEMA4D。
模块2包含许多与细胞老化以及增殖和衰老的调节相关的项。由于增殖因子(包括MKI67、TOP2A、CENPF、CENPH、CHEK1、EZH2)和多种细胞周期蛋白(包括CDK1和CDK4)的强烈富集，预计在胎儿GPC中会激活细胞周期进程和有丝分裂。此外，还推断增殖诱导通路被激活；这些增殖诱导通路包括MYC、CCND1和YAP1信号传导，其中YAP1和MYC转录本均类似上调(Bretones et al.,“Myc and Cell Cycle Control,”Biochim.Biophys Acta 1849:506-516(2015)；Bunt et al.,“Regulation of Cell Cycle Genes and InductionofSenescence by Overexpression of OTX2 in Medulloblastoma Cell Lines,”Mol.Cancer Res.8:1344-1357(2010)；和Xie et al.,“YAP/TEAD-MediatedTranscription Controls Cellular Senescence,”Cancer Res 73:3615-3624(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。在这方面，最近已显示MYC在衰老啮齿动物GPC中的瞬时过表达可恢复其增殖和分化的能力(Neumann et al.,“Myc Determines the Functional AgeState of Oligodendrocyte Progenitor Cells,”Nature Aging 1:826-837(2021)，其全部内容通过引用并入本文)。相反，成体GPC表现出衰老相关转录本(包括E2F6、MAP3K7、DMTF1/DMP1、OGT、AHR、RUNX1和RUNX2)的上调(Ferrand et al.,“Screening of a KinaseLibrary Reveals Novel Pro-senescence Kinases and Their Common NF-κB-dependentTranscriptional Program,”Aging(Albany NY)
7:986-1003(2015)；Inoue et al.,“Disruption of the ARF TranscriptionalActivator DMP1Facilitates Cell Immortalization,Ras Transformation,andTumorigenesis,”Genes Dev
14:1797-1809(2000)；Lee and Zhang,“O-Linked N-AcetylglucosamineTransferase(OGT)Interacts With the Histone Chaperone HIRA Complex andRegulates Nucleosome Assembly and Cellular Senescence,”Proceedings of theNational Academy of Sciences 113:E3213-E3220(2016)；Wotton et al.,“RUNX1Transformation of Primary Embryonic Fibroblasts is Revealed in the Absence ofp53,”Oncogene 23:5476-5486(2004)；和Kilbey et al.,“Runx2 Disruption PromotesImmortalization and Confers Resistance to Oncogene-induced Senescence inPrimary Murine Fibroblasts,”Cancer Res 67:11263-11271(2007)，其全部内容通过引用并入本文)。同时，成人hGPC表现出胎儿转录本(包括LMNB1、PATZ1、BCL11A、HDAC2、FN1、EZH2和YAP1及其辅因子TEAD1)的下调(Cho et al.,“POZ/BTB and AT-hook-containingZinc Finger Protein 1(PATZ1)Inhibits Endothelial Cell Senescence Through ap53 Dependent Pathway,”Cell Death Differ 19:703-712(2012)；Fan et al.,“EZH2-dependent Suppression of aCellular Senescence Phenotype in Melanoma Cells byInhibition of p21/CDKN1A Expression,”Mol.Cancer Res.9:418-429(2011)；Freund etal.,“Lamin B1 Loss is a Senescence-associated Biomarker,”Mol.Biol.Cell 23:2066-2075(2012)；Luc et al.,“Bcl11a Deficiency Leads to Hematopoietic StemCell Defects with an Aging-like Phenotype,”Cell Rep.16:3181-3194(2016)；Lukjanenko et al.,“Loss of Fibronectin From the Aged Stem Cell Niche Affectsthe Regenerative Capacity of Skeletal Muscle in Mice,”Nat Med 22:897-905(2016)；Sundar et al.,“Genetic Ablation of Histone Deacetylase 2Leads to LungCellular Senescence and Lymphoid Follicle Formation in COPD/Emphysema,”FASEBJournal:Official Publication of the Federation of American Societies forExperimental Biology 32:4955-4971(2018)；和Xie et al.,“YAP/TEAD-MediatedTranscription Controls Cellular Senescence,”Cancer Res 73:3615-3624(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。结果，预测在成体hGPC中激活的功能项包括衰老、在Hutchinson-Gilford早衰症中观察到的衰老的快速开始、以及CDKN1A/p21和CDKN2A/p16下游的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制通路。此外，AHR及其信号通路涉及通过抑制MYC驱动衰老(Yang et al.,“The Aryl Hydrocarbon Receptor Constitutively Represses C-MycTranscription in Human Mammary Tumor Cells,”Oncogene 24:7869-7881(2005)，其全部内容通过引用并入本文)，在成体GPC中类似地被上调。
模块3主要由也与衰老相关的发育和疾病相关信号传导通路组成。这包括在胎儿hGPC中的ASCL1和BDNF信号传导的预测激活以及在成体GPC中的MAPT/Tau、APP和REST信号传导的预测激活(Ahlin et al.,“High Expression of Cyclin D1 is Associated toHigh Proliferation Rate and Increased Risk of Mortality in Women With ER-positive But Not in ER-negative Breast Cancers,”Breast Cancer Res.Treat 164:667-678(2017)；Erickson et al.,“Brain-derived Neurotrophic Factor isAssociated With Age-related Decline in Hippocampal Volume,”J.Neurosci.30:5368-5375(2010)；和Harris et al.,“Coordinated Changes in Cellular BehaviorEnsure the Lifelong Maintenance of the Hippocampal Stem Cell Population,”CellStem Cell(2021)，其全部内容通过引用并入本文)。总体而言，成体GPC的转录和功能分析揭示了与增殖能力相关的转录本的减少，以及向衰老和更成熟表型的转变。
实施例4：转录因子活性的推断暗示了成体GPC转录阻遏物
鉴于成体和胎儿GPC之间的显著转录差异，本研究接下来询问是否可以推断哪些转录因子指导它们的特性。为了实现这一点，首先扫描成体或胎儿富集的GPC基因集的两个启动子窗口(500bp向上/100bp向下、10kb向上/10kb向下)以推断显著富集的TF基序(Aibaret al.,“SCENIC:Single-cell Regulatory Network Inference and Clustering,”Nat.Methods14:1083-1086(2017)，其全部内容通过引用并入本文)。这确定了48个TF，它们在扫描的相交数据集中也有差异表达。其中，首先研究了DNA相互作用的主要方式完全是抑制性或刺激性的TF，同时还考虑了它们的已知辅助因子的富集。该分析产生了12个潜在的上游调节子可供探索(图4，A-4图，C图)：4个成人阻遏物，E2F6、ZNF274、MAX和IKZF3；1个成体激活子，STAT3；3个胎儿阻遏物：BCL11A、HDAC2和EZH2；和4个胎儿激活子：MYC、HMGA2、NFIB和TEAD2。有趣的是，在这些预测的TF中，3个组在其目标启动子内具有高度一致性的基序相似性：1)E2F6、ZNF274、MAX和MYC；2)STAT3和BCL11A；3)EZH2和HDAC2，表明它们可能在共享位点合作或竞争DNA结合(图4，A图)。
接下来，基于策划的转录相互作用构建四种潜在的信号传导通路，以预测被已识别的TF集靶向的那些基因(图4，D-4图，G图)。在胎儿GPC中富集的激活子中(图4，D图)，MYC(一种增殖因子)(Dang,C.V.,“c-Myc Target Genes Involved in Cell Growth,Apoptosis,and Metabolism,”Molecular and Cellular Biology 19:1(1999)，其全部内容通过引用并入本文)，NFIB(一种胶质细胞生成的关键决定子)(Deneen et al.,“TheTranscription Factor NFIA Controls the Onset of Gliogenesis in the DevelopingSpinal Cord,”Neuron 52:953-968(2006)，其全部内容通过引用并入本文)，TEAD2(一种YAP/TAZ效应子)和HMGA2(另一种增殖因子)均被预测会激活祖细胞阶段基因群，包括有丝分裂相关转录本和被证明可抑制衰老开始的转录本(Dang,C.V.,“c-Myc Target GenesInvolved in Cell Growth,Apoptosis,and Metabolism,”Molecular and CellularBiology 19:1(1999)；Deneen et al.,“The Transcription Factor NFIA Controls theOnset of Gliogenesis in the Developing Spinal Cord,”Neuron52:953-968(2006)；Diepenbruck et al.,“Tead2 Expression Levels Control the SubcellularDistribution of Yap and Taz,Zyxin Expression and Epithelial-mesenchymalTransition,”Journal of Cell Science 127:1523-1536(2014)；和Yu et al.,“HMGA2Regulates the in Vitro Aging and Proliferation of Human Umbilical Cord Blood-Derived Stromal Cells Through the mTOR/p70S6K Signaling Pathway,”Stem CellRes 10:156-165(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。还预测这四种胎儿激活子之间存在直接正向调节，其中NFIB由HMGA2和TEAD2驱动，MYC由TEAD2和NFIB驱动，HMGA2由MYC和TEAD2驱动，TEAD2由MYC相互驱动(图4，D图))。与这些胎儿激活子相反，胎儿阶段阻遏物，包括C2H2型锌指BCL11A、多梳抑制复合物亚单位EZH2和组蛋白脱乙酰酶HDAC2，均预计在该阶段会抑制更成熟的少突胶质细胞基因表达(图4，E图)(Laherty et al.,“HistoneDeacetylases Associated With the mSin3 Corepressor Mediate MadTranscriptional Repression,”Cell89:349-356(1997)；Laible et al.,“MammalianHomologues of the Polycomb-group Gene Enhancer of Zeste Mediate GeneSilencing in Drosophila Heterochromatin and at S.cerevisiae Telomeres,”EMBO J16:3219-3232(1997)；和Nakamura et al.,“Evi9 Encodes a Novel Zinc FingerProtein that Physically Interacts with BCL6,a known Human B-Cell Proto-Oncogene Product,”Mol Cell Biol 20:3178-3186(2000)，其全部内容通过引用并入本文)。此外，所有这三种TF都被预测会抑制与衰老有关的靶标。因此，这些因子似乎直接协调下游转录事件，从而维持循环祖细胞状态。
接下来，对这些预测的成体GPC信号传导网络进行评估，以确定其与年龄相关的基因表达变化的潜在机制。预计STAT3通过上调一大群早期分化和髓鞘形成相关少突胶质细胞基因，将GPC特性转向神经胶质细胞成熟(图4，F图)。此外，STAT3还被推断激活一组衰老相关基因，包括BIN1、RUNX1、RUNX2、DMTF1、CD47、MAP3K7、CTNNA1和OGT。同时，预计在成体GPC中的抑制是通过Ikaros家族锌指IKZF3/Aiolos、KRAB(kruppel相关盒)锌指ZNF274、MYC相关因子MAX和细胞周期调节子E2F6来实现的(图4，G图)(Blackwood and Eisenman,“Max:A Helix-loop-helix Zipper Protein That Forms a Sequence-specific DNA-bindingComplex With Myc,”Science 251:1211-1217(1991)；Frietze et al.,“ZNF274 Recruitsthe Histone Methyltransferase SETDB1 to the 3'Ends of ZNF Genes,”PLoS One 5:e15082(2010)；Ma et al.,“Ikaros and Aiolos Inhibit Pre-B-cell Proliferation byDirectly Suppressing c-Myc Expression,”Mol Cell Biol 30:4149-4158(2010b)；和Ogawa et al.,“A Complex with Chromatin Modifiers that Occupies E2F-and Myc-Responsive Genes in G0Cells,”Science 296:1132-1136(2002)，其全部内容通过引用并入本文)。这转录因子集的靶向预测了那些有助于胎儿GPC特征的基因集的抑制，这确实在早期祖基因PDGFRA和CSPG4以及细胞周期性基因CDK1、CDK4的下调中观察到。和MKI67。还预测了YAP1、LMNB1和TEAD1(它们的表达减缓或阻止衰老发生)的抑制。有趣的是，除了胎儿富集的阻遏物BCL11A、EZH2和HDAC2之外，这组四种成体阻遏物还预测了胎儿富集的激活子NFIB、MYC、TEAD2和HMGA2中的每一种的表达下调。
实施例5：成体富集阻遏物的表达在GPC中诱导年龄相关性转录变化
接下来询问在图4的G图中鉴定的四种成体富集的转录阻遏物(E2F6，IKZF3，MAX和ZNF274)是否足以通过其他年轻GPC单独诱导基因表达中年龄相关性变化的方面。为了实现这一目标，为每个转录因子设计了多西环素(Dox)诱导型过表达慢病毒(图5，A图)。简而言之，首先确定了每种阻遏物在成体GPC中最丰富的蛋白编码亚型，以便最好地模拟内源性年龄相关上调；这些候选者是E2F6-202、IKZF3-217、MAX-201和ZNF274-201。这些cDNA被克隆到四环素响应元件启动子的下游和T2A自切割EGFP报告子的上游(图5，A图)。人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的hGPC培养物，按照先前所述从C27细胞株制备(Wang et al.,“HumaniPSC-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cells Can Myelinate and Rescue aMouse Model of Congenital Hypomyelination,”Cell Stem Cell12:252-264(2013)，其全部内容通过引用并入本文)，然后感染24小时，然后用Dox处理以诱导转基因过表达。选择C27 iPSC衍生的GPC是因为它们的转录组与胎儿的转录组相似，并且它们在移植后同样能够植入髓鞘发育不良小鼠并形成髓鞘(Wang et al.,“Human iPSC-DerivedOligodendrocyte Progenitor Cells Can Myelinate and Rescue a Mouse Model ofCongenital Hypomyelination,”Cell Stem Cell 12:252-264(2013)和Windrem et al.,“Human iPSC Glial Mouse Chimeras Reveal Glial Contributions toSchizophrenia,”Cell Stem Cell21:195-208.e196(2017)，其全部内容通过引用并入本文)。添加Dox后第3、7和10天，通过FACS选择过表达细胞进行EGFP表达(图5，B图，n＝3-5)。给予Dox的未感染培养物用作对照。
提取RNA并通过qPCR分析感兴趣的衰老相关基因。在补充Dox后的每个时间点都观察到每种成体富集阻遏物的显著诱导(图5，C图)。MKI67和CDK1(其上调与活跃的细胞分裂相关的基因)在每个过表达范例中均在两个或更多个时间点受到显著抑制(图5，D图)。这与它们在成体GPC中的表达减少一致(图3，F图)，并表明它们受到E2F6、MAX和ZNF274(MKI67)或全部四种(CDK1)的直接抑制。GPC阶段标记物PDGFRA(PDGF-AA的同源受体)在IKZF3转导的GPC中在两个时间点以及在第3天在E2F6转导的GPC中也受到显著抑制，这与其在正常成体GPC中的抑制一致。有趣的是，衰老相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1A/p21在所有时间点响应于每个测试的阻遏物都上调，而CDKN2A/p16在ZNF274转导的hGPC中在所有时间点以及在第7天在E2F6过表达GPC中都上调(图5，D图)。此外，MBP和ILIA在成人hGPC中相对于胎儿hGPC均显著上调，尽管时间点相关变异性阻止它们的增量达到统计学显著性，但它们都表现出响应阻遏物转导而表达上调的急剧趋势。总之，这些数据支持了我们的预测，即成人富集的GPC阻遏物E2F6、IKZF3、MAX和ZNF274的强制过早表达足以在年轻的iPSC衍生的GPC中诱导衰老GPC转录组的多种特征。
实施例6：胎儿hGPC的miRNA表达模式预测其对衰老的抑制
为了鉴定基因表达的潜在转录后调节子，我们利用Affymetrix GeneChip miRNA3.0阵列评估了成体和胎儿GPC(n＝4)之间miRNA表达的差异。PCA显示了由miRNA表达谱定义的两个GPC群的分离(图6，A图)。两个年龄之间的差异表达(调整后p值<0.01)产生了56个基因(23个在成体GPC中富集，33个在胎儿GPC中富集，图6，B-C图)。这些差异表达的miRNA中，除了胎儿祖细胞阶段miRNA miR-9-3p、miR-9-5p(Lau,P.,Verrier,J.D.,Nielsen,J.A.,Johnson,K.R.,Notterpek,L.,and Hudson,L.D.(2008).Identification ofdynamically regulated microRNA and mRNA networks in developingoligodendrocytes.JNeurosci 28,11720-11730)和miR-17-5p(Budde,H.,Schmitt,S.,Fitzner,D.,Opitz,L.,Salinas-Riester,G.,and Simons,M.(2010).Control ofoligodendroglial cell number by the miR-17-92cluster.Development 137,2127)以外，值得注意的是成体少突胶质细胞调节子miR-219a-3p和miR-338-5p(Dugas,J.C.,Cuellar,T.L.,Scholze,A.,Ason,B.,Ibrahim,A.,Emery,B.,Zamanian,J.L.,Foo,L.C.,McManus,M.T.,and Barres,B.A.(2010).Dicer1 and miR-219Are required for normaloligodendrocyte differentiation and myelination.Neuron 65,597-611)。
本研究接下来利用这组miRNA来预测其表达可能通过miRNA上调而被抑制的基因，分别分析成体和胎儿GPC池库。为了实现这一目标，使用miRNAtap查询五个miRNA基因靶标数据库：DIANA(Maragkakis,M.,Vergoulis,T.,Alexiou,P.,Reczko,M.,Plomaritou,K.,Gousis,M.,Kourtis,K.,Koziris,N.,Dalamagas,T.,and Hatzigeorgiou,A.G.(2011).
DIANA-microT Web server upgrade supports Fly and Worm miRNA targetprediction and bibliographic miRNA to disease association.Nucleic Acids Res39,W145-148)、Miranda(Enright,A.J.,John,B.,Gaul,U.,Tuschl,T.,Sander,C.,andMarks,D.S.(2003).MicroRNA targets in Drosophila.Genome biology 5,R1)、PicTar(Lall,S.,Grun,D.,Krek,A.,Chen,K.,Wang,Y.L.,Dewey,C.N.,Sood,P.,Colombo,T.,Bray,N.,Macmenamin,P.,et al.(2006).Agenome-wide map of conserved microRNAtargets in C.elegans.Current biology:CB 16,460-471)、TargetScan(Friedman,R.C.,Farh,K.K.,Burge,C.B.,and Bartel,D.P.(2009).Most mammalian mRNAs are conservedtargets of microRNAs.Genome Res 19,92-105)和miRDB(Wong,N.,and Wang,X.(2015).miRDB:an online resource for microRNA target prediction and functionalannotations.Nucleic Acids Res 43,D146-152)。
为了最大化精确度，只有当基因出现在至少两个数据库中时才将其视为靶标。在胎儿富集miRNA中，该方法预测每个miRNA平均36.3(SD＝24.5)个被抑制基因。相比之下，在成体hGPC富集miRNA中，每个miRNA平均46.4个(SD＝37.8)个基因被预测为靶标(图6，C图)。总而言之，这确定了通过胎儿miRNA可能抑制48.8％的成体GPC富集基因，以及通过成体miRNA抑制39.9％的胎儿GPC富集基因。
为了评估这些miRNA依赖性转录后调节机制的功能重要性，本研究根据功能相关的差异表达基因的miRNA靶向来策划胎儿和成人网络(图6，D-E图)。预计所提出的上游成体转录调节子STAT3、E2F6和MAX会通过胎儿GPC中的7个miRNA受到抑制(图24，D图)；其中包括已经验证的通过miR-126b-5p、miR-106a-5p、miR-17-5p、miR-130a-3p和miR-130b-3p在其他细胞类型中对STAT3的抑制(Du,W.,Pan,Z.,Chen,X.,Wang,L.,Zhang,Y.,Li,S.,Liang,H.,Xu,C.,Zhang,Y.,Wu,Y.,et al.(2014a).By Targeting Stat3microRNA-17-5pPromotes Cardiomyocyte Apoptosis in Response to Ischemia Followed byReperfusion.Cellular Physiology and Biochemistry 34,955-965)。与此同时，许多早期和成熟的少突胶质细胞基因同时被靶向抑制，所有这些都与祖细胞状态的维持一致；这些基因包括MBP、UGT8、CD9、PLP1、MYRF和PMP22(Goldman,S.A.,and Kuypers,N.J.(2015).How to make an oligodendrocyte.Development 142,3983-3995)。重要的是，一组与诱导衰老或抑制增殖或两者都相关的基因也被预测在胎儿GPC中受到积极抑制。这些基因包括RUNX1、RUNX2、BIN1、DMTF1/DMP1、CTNNA1、SERPINE1、CDKN1C、PAK1、IFI16、EFEMP1、MAP3K7、AHR、OGT、CBX7和CYLD(Eckers,A.,Jakob,S.,Heiss,C.,Haarmann-Stemmann,T.,Goy,C.,Brinkmann,V.,Cortese-Krott,M.M.,Sansone,R.,Esser,C.,Ale-Agha,N.,et al.(2016).The aryl hydrocarbon receptor promotes aging phenotypes acrossspecies.Sci Rep 6,19618)。通过这里鉴定的几种miRNA(包括miR-17-5p、miR-93-3p、miR-1260b、miR-106a-5p、miR-767-5p、miR-130a-3p、miR-9-3p、miR-9-5p和miR-130b-3p)也注意到了衰老抑制或增殖激活(Borgdorff,V.,Lleonart,M.E.,Bishop,C.L.,Fessart,D.,Bergin,A.H.,Overhoff,M.G.,and Beach,D.H.(2010).Multiple microRNAs rescue fromRas-induced senescence by inhibiting p21(Waf1/Cip1).Oncogene 29,2262-2271)。总之，这些数据提供了一种补充机制，胎儿hGPC可以通过该机制维持其特征性祖细胞转录状态和特征。
实施例7：成体miRNA信号传导可能抑制增殖祖细胞状态并预示衰老
本研究接下来检查了成体hGPC内潜在的miRNA调控网络(图6，E图)。这涉及5个miRNA，控制着5个已识别的活性胎儿转录调节子，包括HDAC2、NFIB、BCLL1A、TEAD2和HMGA2，这些调节子通过miR-4651的沉默已在先前被证明可以抑制增殖(Han,X.,Yang,R.,Yang,H.,Cao,Y.,Han,N.,Zhang,C.,Shi,R.,Zhang,Z,Fan,Z.(2020).miR-4651inhibitsproliferation of gingival mesenchymal stem cells by inhibiting HMGA2 undernifedipine treatment.Int J Oral Sci 12,10)。预计这组miRNA会与成体转录阻遏物同时发挥作用，抑制参与维持GPC祖细胞状态的基因的表达，包括PDGFRA、PTPRZ1、ZBTB18、SOX6、EGFR和NRXN1。此外，预计成体miRNA环境会抑制许多已知可诱导增殖状态或延迟衰老的基因，包括LMNB1(Freund,A.,Laberge,R.M.,Demaria,M.,and Campisi,J.(2012).LaminB1 loss is a senescence-associated biomarker.Mol Biol Cell 23,2066-2075)、PATZ1(Cho,J.H.,Kim,M.J.,Kim,K.J.,and Kim,J.R.(2012).POZ/BTB and AT-hook-containing zinc finger protein 1(PATZ1)inhibits endothelial cell senescencethrough a p53 dependent pathway.Cell Death Differ 19,703-712)、GADD45A(Hollander,M.C.,Sheikh,M.S.,Bulavin,D.V.,Lundgren,K.,Augeri-Henmueller,L.,Shehee,R.,Molinaro,T.A.,Kim,K.E.,Tolosa,E.,Ashwell,J.D.,et al.(1999).Genomicinstability in Gadd45a-deficient mice.Nat Genet 23,176-184)、YAP1和TEAD1(Xie,Q.,Chen,J.,Feng,H.,Peng,S.,Adams,U.,Bai,Y.,Huang,L.,Li,J.,Huang,J.,Meng,S.,etal.(2013).YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence.CancerRes 73,3615-3624.)、CDK1(Diril,M.K.,Ratnacaram,C.K.,Padmakumar,V.C.,Du,T.,Wasser,M.,Coppola,V.,Tessarollo,L.,and Kaldis,P.(2012).Cyclin-dependentkinase 1(Cdk1)is essential for cell division and suppression of DNA re-replication but not for liver regeneration.Proc Natl Acad Sci U S A 109,3826-3831)、TPX2(Rohrberg,J.,Van de Mark,D.,Amouzgar,M.,Lee,J.V.,Taileb,M.,Corella,A.,Kilinc,S.,Williams,J.,Jokisch,M.L.,Camarda,R.,et al.(2020).MYCDysregulates Mitosis,Revealing Cancer Vulnerabilities.Cell Rep 30,3368-3382)、S1PR1(Liu,Y.,Zhi,Y.,Song,H.,Zong,M.,Yi,J.,Mao,G.,Chen,L.,and Huang,G.(2019).S1PR1 promotes proliferation and inhibits apoptosis of esophageal squamouscell carcinoma through activating STAT3 pathway.Journal of Experimental&Clinical Cancer Research 38,369)、RRM2(Aird,K.M.,Zhang,G.,Li,H.,Tu,Z.,Bitler,B.G.,Garipov,A.,Wu,H.,Wei,Z.,Wagner,S.N.,Herlyn,M.,et al.(2013).Suppressionof nucleotide metabolism underlies the establishment and maintenance ofoncogene-induced senescence.Cell Rep 3,1252-1265)、CCND2(Bunt,J.,de Haas,T.G.,Hasselt,N.E.,Zwijnenburg,D.A.,Koster,J.,Versteeg,R.,and Kool,M.(2010).Regulation of cell cycle genes and induction of senescence by overexpressionof OTX2 in medulloblastoma cell lines.Mol Cancer Res 8,1344-1357)、SGO1(Murakami-Tonami,Y.,Ikeda,H.,Yamagishi,R.,Inayoshi,M.,Inagaki,S.,Kishida,S.,Komata,Y.,Jan,K.,Takeuchi,I.,Kondo,Y.,et al.(2016).SGO1 is involved in theDNA damage response in MYCN-amplified neuroblastoma cells.Scientific Reports6,31615)、MCM4和MCM6(Mason,D.X.,Jackson,T.J.,and Lin,A.W.(2004).Molecularsignature of oncogenic ras-induced senescence.Oncogene 23,9238-9246.)、ZNF423(Hernandez-Segura,A.,de Jong,T.V.,Melov,S.,Guryev,V.,Campisi,J.,and Demaria,M.(2017).Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.Currentbiology:CB 27,2652-2660)、PHB(Piper,P.W.,Jones,G.W.,Bringloe,D.,Harris,N.,MacLean,M.,and Mollapour,M.(2002).The shortened replicative life span ofprohibitin mutants of yeast appears to be due to defective mitochondrialsegregation in old mother cells.Aging cell 1,149-157)、WLS(Poudel,S.B.,So,H.S.,Sim,H.J.,Cho,J.S.,Cho,E.S.,Jeon,Y.M.,Kook,S.H.,and Lee,J.C.(2020).Osteoblastic Wntless deletion differentially regulates the fate andfunctions of bone marrow-derived stem cells in relation to age.Stem Cells.)和ZMAT3(Kim,B.C.,Lee,H.C.,Lee,J.J.,Choi,C.M.,Kim,D.K.,Lee,J.C.,Ko,Y.G.,and Lee,J.S.(2012).Wig1 prevents cellular senescence by regulating p21 mRNA decaythrough control of RISC recruitment.EMBO J 31,4289-4303)。更直接地，诱导衰老或抑制增殖与miR-584-5p(Li,Q.,Li,Z.,Wei,S.,Wang,W.,Chen,Z.,Zhang,L.,Chen,L.,Li,B.,Sun,G.,Xu,J.,et al.(2017).Overexpression of miR-584-5p inhibitsproliferation and induces apoptosis by targeting WW domain-containing E3ubiquitin protein ligase 1in gastric cancer.JExp Clin Cancer Res 36,59)、miR-193a-5p(Chen,J.,Gao,S.,Wang,C.,Wang,Z.,Zhang,H.,Huang,K.,Zhou,B.,Li,H.,Yu,Z.,Wu,J.,et al.(2016).Pathologically decreased expression of miR-193acontributes to metastasis by targeting WT1-E-cadherin axis in non-small celllung cancers.J Exp Clin Cancer Res 35,173)、miR-548ac(Song,F.,Yang,Y.,and Liu,J.(2020).MicroRNA-548ac induces apoptosis in laryngeal squamous cellcarcinoma cells by targeting transmembrane protein 158.Oncol Lett 20,69)、miR-23b-3p(Campos-Viguri,G.E.,Peralta-Zaragoza,O.,Jimenez-Wences,H.,Longinos-Gonzalez,A.E.,Castanon-Sanchez,C.A.,Ramirez-Carrillo,M.,Camarillo,C.L.,Castaneda-Saucedo,E.,Jimenez-Lopez,M.A.,Martinez-Carrillo,D.N.,et al.(2020).MiR-23b-3p reduces the proliferation,migration and invasion of cervicalcancer cell lines via the reduction of c-Met expression.Sci Rep 10,3256)、miR-140-3p(Wang,M.,Wang,X.,and Liu,W.(2020a).MicroRNA-130a-3p promotes theproliferation and inhibits the apoptosis of cervical cancer cells vianegative regulation of RUNX3.Mol Med Rep 22,2990-3000)和miR-330-3p(Wang,Y.,Chen,J.,Wang,X.,and Wang,K.
(2020b).miR-140-3p inhibits bladder cancer cell proliferation andinvasion by targeting FOXQ1.Aging 12,20366-20379)的上调有关。总之，这些数据表明这些miR是在胎儿hGPC中维持祖细胞状态的积极参与者，并且它们的调节是成体hGPC呈现其特征基因表达谱的可能机制。
实施例8：miRNA的转录因子调节建立并巩固了GPC特性
本研究接下来试图通过查询TransmiR转录因子miRNA调控数据库(Tong,et al.(2019).TransmiR v2.0:an updated transcription factor-microRNA regulationdatabase.Nucleic Acids Res 47,D253-D258)来预测在胎儿和成体GPC中差异表达的miRNA的上游调控。这个方法预测通过66个类似的被确定为在胎儿和成体GPC之间显著差异表达的转录因子对56个年龄特异性GPC miRNA中的54个进行调节。有趣的是，前四个预测的miRNA调节TF都是MYC相关因子，包括MAX、MYC本身、E2F6和胎儿富集的MYC相关锌指蛋白MAZ，分别靶向36、33、30和28个独特的差异表达miRNA。
在12个TF候选物的背景下检查所提出的关系指示大量胎儿hGPC富集的miRNA，其被预测为胎儿激活子和成体阻遏物两者的靶标，而在成体GPC中富集的那些miRNA是被更独特地靶向的。MYC被预计会驱动许多miRNA在胎儿GPC中的表达，其中许多miRNA预计在成年期会通过E2F6、MAX或两者受到抑制。除了通过TEAD2激活外，miR-130a-3p特别被预计会成为MYC、MAX和E2F6的靶标。值得注意的是，在其他细胞类型中经过验证的TF-miRNA相互作用中，已经报道了通过MYC上调miR-17-5p恢复活力以及通过MAX对其的抑制(Du,et al.(2014b).miR-17extends mouse lifespan by inhibiting senescence signalingmediated by MKP7.Cell Death Dis 5,e1355)。类似地，已经报道了通过MYC或TEAD2和YAP1并行激活增殖性miR-130-3p(Shen,et al.(2015).A miR-130a-YAP positivefeedback loop promotes organ size and tumorigenesis.Cell Res 25,997-1012)，以及通过MYC激活miR-9的双臂(Ma,L.,et al.(2010a).miR-9,a MYC/MYCN-activatedmicroRNA,regulates E-cadherin and cancer metastasis.Nat Cell Biol 12,247-256)，miR-9随着少突胶质细胞的成熟而减少(Lau,P.,et al.(2008).Identification ofdynamically regulated microRNA and mRNA networks in developingoligodendrocytes.J Neurosci 28,11720-11730)。
在成体GPC中，预计由我们显著富集的TF组调节的富集miRNA更有可能仅被仅具有miR-151a-5p和miR-4687-3p的胎儿阻遏物(预测的HMGA2抑制剂，分别是STAT3相对于BCL11A和EZH2的相反靶向)的成人激活子靶向。除此之外，预计miR-1268b会同时受到EZH2和HDAC2的抑制。值得注意的是，关键的少突胶质细胞microRNA miR-219a-2-3p预计将通过EZH2在胎儿GPC中保持受到抑制，而STAT3可能独立驱动7个其他miR的表达。有趣的是，STAT3的活性增加与衰老有关(Kojima,et al.(2013).IL-6-STAT3 signaling andpremature senescence.JAKSTAT 2,e25763)，也被预测会驱动一组与衰老诱导独立相关的miRNA(包括miR-584-5p、miR-330-3p、miR-23b-3p和miR-140-3p)的表达。
通过转录和miRNA谱分析、通路富集分析和靶标预测的整合，我们提出了人GPC衰老的模型，其中胎儿hGPC维持祖基因表达、激活增殖程序并防止衰老，同时通过microRNA在转录和转录后抑制少突胶质细胞和衰老基因程序。随着成体的成熟、时间的推移以及群体倍增，hGPC开始上调这些胎儿祖细胞相关网络的阻遏物，同时还激活程序至进一步逐渐更加分化并最终衰老的表型。
实施例9：嵌合动物模型脑中BCL11A的表达导致宿主中表达BCL11A的GPC增殖
通过分析来自从新鲜组织样品分选的胎儿和成体神经胶质祖细胞(GPC)的RNA测序数据，本研究确认了几种转录因子作为基因调控网络中区分“年轻”与“年长”GPC的的核心。其中，转录阻遏物BCL11A(B细胞CLL/淋巴瘤11A)是最显著的差异表达基因之一，在胎儿hGPC中表达较高，而在成体细胞中表达较低，表明其在保留胎儿hGPC表型中的作用。此前从未知道BCL11A在中枢神经系统中或在神经胶质祖细胞扩张、命运或衰老的调节中发挥如此重要的作用。
然后为了研究BCL11A是否可以重新启动或者加速老化GPC的自我更新，本研究还产生了由CBh启动子驱动的表达BCL11A和GFP的慢病毒(在此称为CBh-BCLl1A)，以及仅绿色荧光蛋白(GFP)的对照病毒(CBh-GFP)(图14的a)。GPC由人C27 iPSC细胞株产生，标记有红色荧光表达转基因(RFP)图14的b)，然后在出生后第1天移植到Rag1免疫缺陷小鼠的胼胝体(CC)中，如前所述(P1，300k细胞/动物)(Windrem at al.J.Neurosci34,16153–16161(2014),Windrem et al.,Cell Stem Cell 21,195-208.e6(2017))。嵌合小鼠在植入后老化2年，此时它们在左半球接受立体定向注射CBh-BCL11A，并在右半球接受CBh-GFP对照病毒。病毒沉积在纹状体、胼胝体和皮质中。在注射后3或6周，将小鼠解剖进行单细胞分析，或用4％ PFA灌注用于切片和免疫组织化学(图14的c)。
本研究通过体外RNA表达(图14的d)和体内蛋白染色(图14的e)证实了BCL11A的过表达。感染后三周，本研究观察到，与大脑的对照侧相比，CBh-BCL11A处理的半球中的GPC群扩大(图15的a)。本研究发现，RFP标记的人类细胞和GPC谱系的OLIG2+细胞的存在大幅增加(图15的b，在图15的c中定量)，以及由小鼠NG2抗原识别的常驻小鼠GPC的增加(图15的d，在图15的e中量化)。这种效应在感染后6周时仍然存在(图16的a)，同时与CBh-GFP处理的对照相比，在CBh-BCL11A感染的半球上检测到更多的RFP+和OLIG2+细胞(图16的b)。在该第6周的时间点，供体细胞分散广泛且相对均匀；没有发现肿瘤或异位。这些观察结果表明，BCL11A转导激活了老年人类和小鼠GPC，从而重新启动宿主大脑的有丝分裂扩张和迁移定植。此外，BCL11A动员的人类供体细胞的(红色)膜标记允许白质中大部分细胞的形态被定义为髓鞘少突胶质细胞，表明在这些老年小鼠中至少部分逆转了典型的年龄相关性髓磷脂损失。
虽然上面已经描述了各种实施方式，但是应当理解的是，这样的公开仅是以示例的方式呈现并且不是限制性的。因此，主题组合物和方法的广度和范围不应受到任何上述示例性实施方式的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同物来定义。
上述描述的目的是教导本领域的普通技术人员如何实践本发明，并且并不旨在详细描述本领域技术人员在阅读说明书后将变得显而易见的所有那些明显修改和变化。然而，所有这些明显的修改和变化都旨在包括在由所附权利要求限定的本发明的范围内。权利要求旨在覆盖有效满足其预期目标的任何顺序的组分和步骤，除非上下文明确指出相反。

Claims (20)

1.一种治疗患有髓磷脂缺乏的受试者的方法，所述方法包括：在受试者的神经胶质祖细胞中表达一种或多种转录因子，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)、组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高迁移率族蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB)和转录增强子TEF-4 10(TEAD2)，其中所述表达在受试者中有效诱导髓鞘形成，从而治疗髓磷脂缺乏。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在所述受试者的神经胶质祖细胞中表达选自PDGFRA、ZNF488、GPR17、OLIG2、CSPG4和SOX10的一种或多种神经胶质细胞特异性基因。
3.一种诱导成体神经胶质祖细胞恢复活力的方法，所述方法包括：在成体神经胶质祖细胞中表达一种或多种转录因子，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)、组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高迁移率族蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB)和转录增强子因子TEF-4(TEAD2)，其中所述表达在成体神经胶质祖细胞中有效诱导恢复活力。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括：在成体神经胶质祖细胞中表达选自PDGFRA、ZNF488、GPR17、OLIG2、CSPG4和SOX10的一种或多种神经胶质细胞特异性基因。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达BCL11A。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达HDAC2。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达EZH2。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达MYC。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达HMGA2。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达NF1B。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤表达TEAD2。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述表达步骤通过施用一种或多种表达载体来进行，所述表达载体各自包含：编码至少所述一种或多种转录因子的核酸序列和/或编码至少所述一种或多种神经胶质细胞特异性基因的核酸序列；和可操作地连接至所述核酸序列的调节元件。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述调节元件包含神经胶质细胞特异性启动子。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述调节元件包含诱导型启动子。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种表达载体包括非病毒载体。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种表达载体包括病毒载体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒载体是AAV载体。
19.根据权利要求1、2和5-18中任一项所述的方法，其中，所述髓磷脂缺乏与病症相关，所述病症选自多发性硬化、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎、视神经炎、皮质下卒中、糖尿性白质脑病、高血压性白质脑病、年龄相关性白质病变、脊髓损伤、放疗或化疗引起的脱髓鞘、感染后和疫苗接种后白质脑炎、脑室周围白质软化、小儿脑白质营养不良、溶酶体贮积病、先天性髓鞘形成障碍、炎性脱髓鞘、血管性脱髓鞘和脑瘫。
20.一种表达载体，其包含：编码至少一种或多种转录因子的核酸序列，所述转录因子选自B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)、组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(EZH2)、myc原癌基因蛋白(MYC)、高迁移率族蛋白HMGI-C(HMGA2)、核因子1B型(NFIB)和转录增强子TEF-4 10(TEAD2)；和可操作地连接至所述核酸序列的调控元件，其中所述调控元件包含神经胶质祖细胞特异性启动子或诱导型启动子，并且其中所述表达载体是慢病毒载体或AAV载体。
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