CN113999847A - 一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用 - Google Patents

一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用。本发明针对LRRK2基因设计了3个不同的sgRNA寡核苷酸序列，构建了针对LRRK2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒表达载体，成功转染PC12细胞，获得能稳定传代的LRRK2基因缺陷的PC12细胞，为从分子水平和细胞水平探讨LRRK2基因在帕金森病中的调控作用提供了体外细胞模型，为进一步研究帕金森病发病机制、进展及治疗奠定了基础。

Description

一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病，临床主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势反射障碍四主征。随着社会人口的老龄化，PD患者正逐年增多，晚期患者多因严重运动障碍而导致生活自理能力丧失，给家庭和社会带来沉重的负担。
PD是遗传易患因素与环境因素共同作用的结果，而富含亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)与遗传及散发性帕金森病均有关，作为联系这两大因素的核心和共同通路，通过氧化应激、加速α-突触核蛋白(α-synuclein)的聚集、线粒体功能紊乱等多种途径介导DA(多巴胺)能神经元变性，均提示LRRK2在PD的发病机制中发挥重要的作用。多项临床研究表明，LRRK2基因突变与帕金森病发病密切相关。在动物实验中应用原位杂交技术也发现患帕金森病的成年鼠基底节区LRRK2表达水平较高。由此抑制LRRK2生成可作为PD神经保护治疗的一种可行性措施。
近年来，利用成簇规律间隔的短回文重复序列(The clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)技术在体外和体内编辑多种细胞类型和生物体中的单个或多个基因，已然成为当今生物医学领域的热门技术。CRISPR/Cas是细菌为抵御外来DNA入侵所进化出的一种适应性免疫防御机制，通过RNA介导的Cas核酸酶能够特异性的识别和切割入侵的外来核酸。
近年来，基因编辑技术包括锌指核糖核酸酶(ZEN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等。然而，第1代锌指核糖核酸酶和第2代转录激活样效应因子核酸酶过程相对繁琐，敲除往往不完整且持续时间有限。作为第3代基因组编辑工具，CRISPR/Cas9系统由sgRNA识别靶位点，具有成本低、过程简便、高效等优势，由此越来越多的应用于细胞的基因组编辑。
迄今为止，PD尚缺乏长期有效的治疗手段，现行的各种治疗方法均不能有效阻止PD病理过程中LRRK2突变对DA神经细胞的毒性作用，从而陷入困境，而CRISPR/Cas9基因编辑技术能够在基因组水平上特异性敲除目的基因，是研究基因功能的强而有力手段。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术中的缺点和不足，提供一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用。所述的sgRNA可通过CRISPR/Cas9基因编辑技术造成LRRK2基因的DNA缺失，从而高效实现对LRRK2基因的特异性敲除，并且得到稳定敲除LRRK2基因的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株，从根本上解决LRRK2突变对DA神经细胞的毒性作用，从而保护多巴胺能神经元，促进多巴胺能神经元的再生和修复，从而为PD的治疗提供新的策略。
本发明的第一个目的是提供一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA核苷酸序列。所述的sgRNA核苷酸选自下列中的至少一种：
(1)、Lrrk2-sgRNA-1：5’-GCACACTGGCGACTCTCATGT-3’，如SEQ ID NO：1所示；
(2)、Lrrk2-sgRNA-2：5’-GCGCCTGTCAGGGCTGCGACG-3’，如SEQ ID NO：2所示；
(3)、Lrrk2-sgRNA-3：5’-GAAGCTTCTGGACTTCCTCGT-3’，如SEQ ID NO：3所示。
本发明的第二个目的是提供一种载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体。
所述的慢病毒转染载体优选为CRISPR/Cas9系统质粒载体。
所述的CRISPR/Cas9系统质粒载体，优选为Lenti CRISPR/Cas9 v2质粒。
Lenti CRISPR/Cas9 v2质粒已经携带了脓毒症链球菌CRISPR/Cas9系统的Cas9内切酶基因。因此，为了构建同时表达Cas9和本发明的三个sgRNA序列的重组慢病毒质粒，本发明将三对sgRNA寡核苷酸链退火形成的DNA双链插入质粒框架中替换相应的DNA片段，从而获得了三个慢病毒质粒，分别命名为：LVPCA01851-1、LVPCA01852-1、LVPCA01853-1。
本发明的第三个目的是提供一种被载有特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体转染的细胞株。
所述的细胞株优选为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株。
本发明的第四个目的是提供一种利用载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体敲除LRRK2基因的方法，包括以下步骤：
(1)、在上述sgRNA核苷酸序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸；同时根据sgRNA核苷酸序列获得其对应的DNA互补链，并且在互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成DNA双链，如表1所示：
表1：特异靶向LRRK2的sgRNA寡核苷酸链合成序列
Figure BDA0003297803010000041
(2)、将步骤(1)获得的双链DNA与CRISPR/Cas9载体连接，得到特异靶向LRRK2基因的sgRNA慢病毒转染载体；
(3)、将步骤(2)制得的慢病毒转染载体转染细胞，对LRRK2基因进行敲除。
本发明的第五个目的是提供上述特异靶向LRRK2基因的sgRNA序列及其慢病毒转染载体、被转染的细胞株在制备帕金森病的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本研究中成功构建了3个慢病毒载体，经测序验证，结果显示3重序列均成功插入目的载体，且序列完全正确，证实重组表达载体构建成功，慢病毒载体介导的基因治疗被用于选择性切除细胞中的LRRK2基因，该基因从根本上解决了导致神经细胞细胞毒性的突变。
本研究成功构建了敲除LRRK2基因的细胞株，为从分子水平和细胞水平探讨LRRK2基因在帕金森病中的调控作用提供了体外细胞模型，为进一步研究帕金森病发病机制、进展及治疗奠定了基础。
附图说明
图1：本发明的三个慢病毒转染载体LVPCA0185-1、LVPCA0185-2和LVPCA0185-3构建测序结果，其中，A为LVPCA0185-1，B为LVPCA0185-2，C为LVPCA0185-3；
图2：阴性对照组和实验组处理24小时后的PC12细胞形态学，其中A为：阴性对照组，B为：实验组；
图3：阴性对照组和实验组的细胞内LRRK2基因表达水平；
图4：阴性对照组和实验组的细胞内LRRK2蛋白表达水平；
图5：特异靶向LRRK2基因的sgRNA慢病毒转染载体构建的质粒图谱
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、细胞培养
本发明采用的细胞株为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株，为发明人课题组实验室所有，也可在市场上购买获得。细胞培养条件为在37℃，5％CO2，培养基为DMEM高糖培养基(品牌Gibco)，加入10％灭活小牛血清及5％灭活马血清。当细胞密度达到70％-80％时进行传代培养。
2、sgRNA的设计和寡核苷酸链合成
针对LRRK2基因设计了3个不同的sgRNA寡核苷酸序列：
(1)、Lrrk2-sgRNA-1：5’-GCACACTGGCGACTCTCATGT--3’，如SEQ ID NO：1所示；
(2)、Lrrk2-sgRNA-2：5’-GCGCCTGTCAGGGCTGCGACG-3’，如SEQ ID NO：2所示；
(3)、Lrrk2-sgRNA-3：5’-GAAGCTTCTGGACTTCCTCGT-3’，如SEQ ID NO：3所示。
sgRNA设计通过网站http：//crispr.mit.edu/完成，设计步骤：在载体两端BsmBI酶切位点序列如下，
\CACCGGAGACG CGTCTCT/GTTT
GTGG\CCTCTGC GCAGAGACAAA/
设计原理为在sgRNA两端加入BsmBI位点切割后产生的互补粘端。
在上述sgRNA核苷酸序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸；同时根据sgRNA核苷酸序列获得其对应的DNA互补链，并且在互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；将合成的引物干粉溶解于退火缓冲液中，95℃水浴15min，然后自然冷却至室温，得到退火后的DNA双链。如表1所示：
表1：特异靶向LRRK2的sgRNA寡核苷酸链合成序列
Figure BDA0003297803010000061
寡核苷酸链合成及测序由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。
3、特异靶向LRRK2基因的sgRNA慢病毒转染载体的构建
所使用的基础载体名称：GV392(质粒图谱如图5所示)
元件顺序：U6-sgRNA-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-puro
对照编号：CON250
对照插入序列：上述3种sgRNA
(1)慢病毒载体酶切
酶切反应体系：
Figure BDA0003297803010000071
37℃酶切3小时或过夜
(2)连接
连接反应体系：
Figure BDA0003297803010000072
16℃连接3小时或过夜。
(3)转化
1.取TOP10感叐态(100μl)置于冰上，待其融化完全后加入10μl连接液，轻弹管壁以混匀，在冰中静置30分钟；
2. 42℃水浴热激90秒；
3.快速将感受态转移到冰上，冰浴2-5分钟；
4.每管加入500μl LB培养基(可先用水浴将培养基加热至37℃)，然后将感受态转移到；
37℃摇床中，恒温培养1小时；
5. 5000rpm离心1分钟，去除500μl上清液后吹打混匀，均匀涂布在Amp抗性的LB同体培养基上；
6.倒置平皿，37℃恒温培养箱中培养过夜；
7.次日，菌落PCR鉴定。
(四)鉴定
PCR鉴定体系：
Figure BDA0003297803010000081
Figure BDA0003297803010000091
引物说明：菌落PCR引物一条采用质粒共有序列(CCATGATTCCTTCATATTTGC)，即Primer
(+)；一条采用sgRNA的oligo序列的反义链，即Primer(-)。
PCR仪进行反应，按以下循环条件：
Figure BDA0003297803010000092
菌落PCR模版：使用牙签或10μL枪头沾一下单菌落，在鉴定体系中搅一下；
空白对照：混好体系后，不加任何模板或菌落；
阴性对照：模板为空载，鉴定大小不阳性大小有区分，排除假阳性的可能(此种方案阴性对照PCR无条带)；
阳性对照：验证鉴定体系是否有问题。
PCR条带大小：连入sgRNA片段的阳性克隆可得到大小为343bp的条带。
选取阳性克隆测。
4、慢病毒转染载体感染PC12细胞及筛选
1.细胞感染：
i.准备目的细胞
1.1细胞复苏
1)从液氮罐中取出细胞冻存管；
2)迅速放入37℃水浴中，并摇动使其尽快解冻；
3)完全解冶后，1000rpm，离心2min；
4)70％酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台；
5)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO2培养箱培养；
6)次日更换一次培养液后再继续培养。
1.2细胞传代
1)将生长90％汇合的细胞进行传代；
2)弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液；
3)加入1ml胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来；
4)加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来；
5)混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4ml，继续培养。
ii.目的细胞慢病毒感染
1)处于对数生长期的PC12细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；
2)将细胞悬液(细胞数约为5×104)接种于6孔板中，37℃5％CO2培养箱培养待细胞融合度达到约60％-70％；
3)根据细胞MOI值，加入聚凝胺(polybrene)工作浓度为5μg/mL，同时加病毒浓缩液各25μL，标记孔1加入慢病毒转染载体LVPCA0185-1，标记孔2加入慢病毒转染载体LVPCA0185-2，标记孔3加入慢病毒转染载体LVPCA0185-3，标记孔4加入慢病毒阴性对照25μL，标记孔5加入PBS25μL；
4)10h后观察细胞状态更换培养基；
5)感染3天后，加入工作浓度为5μg/mL的嘌呤霉素筛选。待孔5内无活细胞时，将孔1-4细胞一部分转至25cm2培养瓶内培养并冻存保种，另一部分转移至6孔板中。
成功转染的稳定表达PC12细胞株与普通PC12细胞株的形态学对照如图2所示，通过荧光倒置光学显微镜拍照观察发现，两组细胞在形态学上没有明显变化，证实稳定转染的细胞株能够稳定转染且不改变原来的细胞形态。
5、鉴定LRRK2基因敲除效率
(1)qPCR检测RNA
待6孔板中细胞长至80％-90％时提取RNA并测量RNA浓度稀释至300μg/μL。提取细胞RNA并用RNA逆转录试剂盒(TaKaRa公司)逆转录为cDNA。LRRK2和GAPDH的引物序列如下：LRRK2正向引物5’-gacgaggaagaggaggaggag-3’，反向引物5’-caggactatcaacagaggca-3’；GAPDH正向引物5′-ggctctctgctcctcccc-3′，反向引物5′-CCGTTCACACCGACCTT-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司。qPCR按照
Figure BDA0003297803010000111
RT-PCR试剂盒(Takara，Japan)的检测方案进行，并由LightCycler仪器(Roche Diagnostics，USA)完成。循环程序设置为95℃初始变性30秒，然后进行40个循环扩增定量(95℃每循环5秒，60℃每循环30秒)。比较Ct法检测RNA的相对表达。
LVPCA0185-1(V1组)、LVPCA0185-2(V2组)和LVPCA0185-3(V3组)的qPCR结果显示LRRK2的表达水平较空白对照组低，如图3所示，相对于阴性对照组，LVPCA0185-1(V1组)的表达水平是18.6％，LVPCA0185-2(V2组)的表达水平是58.9％，LVPCA0185-3(V3组)的表达水平是50.3％，P＜0.05。
(2)蛋白质免疫印迹检测蛋白表达
待6孔板中被慢病毒转染载体转染的细胞长至80％-90％时加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂提取蛋白，提取蛋白加入SDS缓冲液沸水浴10分钟，进行SDS-PAGE电泳，结束后转移至PVDF膜，牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，分别将Anti-LRRK2抗体[MJFF2(c41-2)](1∶5000)、β-Actin(8H10D10)Mouse mAb(1∶1000)分别稀释于TBST溶液，并于4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，5分钟/次。Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(1∶1000)、Anti-mouseIgG，HRP-linkedAntibody(1∶2000)分别稀释于TBST溶液，室温孵育1小时，TBST洗膜3次，5分钟/次，ECL化学发光液进行显影、曝光。
Western blot检测发现在200kda和250kda之间有一条免疫反应带。与转染慢病毒阴性对照的细胞相比(PC12 NC组)，转染LVPCA0185-1(PC12 V1组)、LVPCA0185-2(PC12 V2组)及LVPCA0185-3(PC12 V3组)的细胞裂解液中LRRK2蛋白含量显著降低，如图4所示。这表明利用CRISPR/Cas9技术成功建立了敲除LRRK2的细胞模型。
6、统计学分析
在本研究中，采用GraphPad Prism 8.0软件使用单因素方差分析进行统计学检验与分析。当p值小于0.05时，结果被认为具有显著性。
本发明成功构建了3个慢病毒载体，经测序验证，结果显示3重序列均成功插入目的载体，且序列完全正确，证实重组表达载体构建成功。慢病毒载体介导的基因治疗被用于选择性切除PC12细胞中的LRRK2基因，该基因从根本上解决了导致神经细胞细胞毒性的突变。
本研究成功构建了敲除LRRK2基因的PC12细胞株，为从分子水平和细胞水平探讨LRRK2基因在帕金森病中的调控作用提供了体外细胞模型，为进一步研究帕金森病发病机制、进展及治疗奠定了基础。
Figure BDA0003297803010000141
Figure BDA0003297803010000151
序列表
<110> 中山大学附属第六医院
<120> 一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcacactggc gactctcatg t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcgcctgtca gggctgcgac g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gaagcttctg gacttcctcg t 21

Claims (10)

1.一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA核苷酸序列，其特征在于，所述的sgRNA核苷酸选自下列中的至少一种：
(1)、Lrrk2-sgRNA-1：5’-GCACACTGGCGACTCTCATGT-3’，如SEQ ID NO：1所示；
(2)、Lrrk2-sgRNA-2：5’-GCGCCTGTCAGGGCTGCGACG-3’，如SEQ ID NO：2所示；
(3)、Lrrk2-sgRNA-3：5’-GAAGCTTCTGGACTTCCTCGT-3’，如SEQ ID NO：3所示。
2.一种载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体，其特征在于，是通过以下步骤构建的：在权利要求1所述的三个sgRNA核苷酸序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸，同时根据sgRNA核苷酸序列获得其对应的DNA互补链，并且在互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成DNA双链；再将该DNA双链插入质粒框架中替换相应的DNA片段，从而获得了三个慢病毒转染载体，分别命名为：LVPCA01851-1、LVPCA01852-1、LVPCA01853-1。
3.根据权利要求2所述的载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体，其特征在于，所述的质粒框架优选为CRISPR/Cas9系统质粒载体。
4.根据权利要求3所述的载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9系统质粒载体优选为Lenti CRISPR/Cas9 v2质粒。
5.一种被载有特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体转染的细胞株，其特征在于，所述的细胞株含有权利要求2所述的慢病毒转染载体。
6.根据权利要求5所述的被载有特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体转染的细胞株，其特征在于，所述的细胞株优选为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株。
7.一种利用权利要求2所述的载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体敲除LRRK2基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、在权利要求1所述的sgRNA核苷酸序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸，同时根据sgRNA核苷酸序列获得其对应的DNA互补链，并且在互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成DNA双链；
(2)、将步骤(1)获得的双链DNA与CRISPR/Cas9载体连接，得到特异靶向LRRK2基因的sgRNA慢病毒转染载体；
(3)、将步骤(2)制得的慢病毒转染载体转染细胞，对LRRK2基因进行敲除。
8.权利要求1所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA序列在制备帕金森病的药物中的应用。
9.权利要求2所述的载有所述的特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体在制备帕金森病的药物中的应用。
10.权利要求5所述的被载有特异靶向LRRK2基因的sgRNA的慢病毒转染载体转染的细胞株在制备帕金森病的药物中的应用。
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