CN108251451A - HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HTT的CRISPR/Cas9‑gRNA打靶序列对、质粒及其应用，涉及生物技术领域。本发明的HTT的CRISPR/Cas9‑gRNA打靶序列对包括L序列和R序列，所述L序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述R序列的碱基序列如SEQ ID NO.2或3所示。本发明的HTT的CRISPR/Cas9‑gRNA打靶质粒包括载体质粒和上述打靶序列对，打靶序列对构建至载体质粒中。本发明还提供了上述打靶序列对在制作HTT基因突变模型中的应用。本发明为HD的细胞模型和转基因动物模型的建立提供了可靠的基础，促进了HD的模型建造及基因治疗的发展；为HD治疗药物、治疗方法的筛选奠定了实验基础。

Description

HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种C57BL/6J小鼠及由此来源的神经元肿瘤细胞系HTT基因的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用。

背景技术

亨廷顿病(Huntington’s Disease，HD)是一种罕见的家族性常染色体显性遗传病，具有神经退行性。典型临床表现为不自主舞蹈样动作，进行性认知功能障碍或导致痴呆及精神症状，神经影像学检测表现为尾状核和大脑皮质萎缩。HD的发病机制可分为两种：一种是根据已知的病理生理学变化提出的(HD致病基因未发现之前)，包括兴奋性毒素损伤(excitotoxin lesions)、能量代谢受损(impaired energy metabolism)和氧化应激(oxidative stress)等；另外一种是在发现了HD致病基因IT15后，依据对基因及其表达产物huntingtin(Htt)的研究提出的。HD的病因是由于亨廷顿基因HTT(Huntingtin)上的三核苷酸CAG重复序列异常扩增，导致编码的HTT构象变化而错误表达，产生神经毒性继而影响不同的分子通路，导致神经功能异常和退化。

目前，HD仍是一种无法治愈的神经系统变性疾病，临床上主要通过药物对症治疗以直接缓解患者病症，改善患者的生活质量，但是这些方法并不能延缓病程进展。基因治疗是对因治疗，直接在基因水平上消除病因，能有效延缓或治愈疾病。现有技术中，已经能通过基因检测确诊HD，但是其基因治疗尚处于临床前研究阶段，所以，进一步开发HD基因治疗的相关技术仍是一大热点与难点。

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，即CRISPR)最早被发现于细菌免疫系统。CRISPR包括两个部分：一个向导RNA(gRNA)和一个非特异性CRISPR结合核酸内切酶(CRISPR-associatedendonumclease即Cas9)。向导RNA是一个短的合成RNA，由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列(靶位点)组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。因此我们只需改变gRNA上的靶向序列即可改变Cas9的基因靶标。现有研究已经证明CRISPR/Cas9可以高效进行细胞、动物、植物、酵母的靶向基因敲除和定点编辑。但是其在HTT中的应用较为少见。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，该序列对在体外以及细胞内对HTT具有剪切活性，为HTT的编辑以及HD的基因治疗的研究提供进一步地依据。

本发明的第二目的在于，提供一种含有上述打靶序列对的打靶质粒，该打靶质粒将上述打靶序列对转染进细胞发挥基因编辑活性。

本发明的第三目的在提供上述打靶序列对以及打靶质粒在制作HTT基因突变模型中的应用。

本发明采用的技术方案如下：

一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，其包括L序列和R序列，所述L序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述R序列的碱基序列对如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明的一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其包括载体质粒和上述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，所述HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对构建至所述载体质粒中。

本发明的一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，所述载体质粒为适用于哺乳动物和/或哺乳动物细胞的载体质粒。

本发明的一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，所述载体质粒具有荧光标记和抗性筛选标记。

本发明的一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，所述载体质粒为VK001-06。

需要说明的是，本发明中使用的VK001-06和VK001-07质粒是已经商业化的哺乳动物/细胞-Cas9(D10A)/gRNA表达载体，购自于北京唯尚立德生物科技有限公司，其中，VK001-06带有绿色荧光和抗性筛选标记，VK001-07带有红色荧光和抗性筛选标记。

上述HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对在制作HTT基因突变模型中的应用。

上述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒在制作HTT基因突变模型中的应用。

本发明的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒在制作HTT基因突变模型中的应用，所述HTT基因突变模型为细胞模型。

本发明的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒在制作HTT基因突变模型中的应用，其包括如下步骤：

步骤一：HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒与脑靶向肽RDP共孵育得到靶向质粒；

步骤二：靶向质粒进行第一次细胞转染；

步骤三：第一次细胞转染后24h后，用靶向质粒补转染，补转染48h后终止转染。

本发明的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒在制作HTT基因突变模型中的应用，步骤一中，HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒与脑靶向肽RDP的质量比为1:6，室温共孵育15min。

其中，脑靶向肽RDP由授权公告号为CN 102174110B的中国专利公开，其氨基酸序列为：MGKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGGRRRRRRRRR，其由狂犬病毒糖蛋白第330-357位肽段(序列的下划线部分)的羧基端通过连接肽与九聚精氨酸连接而得，可以快速、特异地携带生物活性大分子穿越血脑屏障，实现脑靶向给药。本发明中借用其脑靶向作用提高打靶质粒对神经细胞的转染率。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明根据HTT基因设计出一系列CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列，经过体外活性检测后，筛选出体外酶切活性合格的4条L序列(Htt-L1、Htt-L2、Htt-L4、Htt-L6)和2条R序列(Htt-R2、Htt-R6)，并用4条L序列和2条R序列两两组成L-R序列对，并将其构建到合适的载体构成打靶质粒，最终成功构建分别以VK001-06和VK001-07为载体质粒的六种打靶质粒，该六种打靶质粒在脑靶向肽RDP的辅助下转染细胞，进行细胞内活性检测，成功筛选出两种打靶质粒(Htt2号：Htt-L2@Htt-R2；Htt3号：Htt-L2@Htt-R6)，该两种打靶质粒对CATH-α细胞的HTT基因具有切割(编辑)活性，其中Htt2号质粒转染细胞后其靶点DNA长度比正常细胞(Normal)减少约80bp，Htt3号质粒转染细胞后其靶点DNA长度比正常细胞(Normal)减少约120bp。测序结果进一步证明此两种质粒对CATH-α细胞的HTT基因良好的切割活性，并且测定出Htt2号的活性位点在172-258bp处，Htt3号质粒的活性位点在172-282bp处。本发明的打靶序列和打靶质粒为制备HTT基因突变模型、HD细胞模型、HD转基因动物(尤其是C57BL/6J)模型以及HD的基因治疗提供了可靠的基础，促进了HD的模型建造及基因治疗的发展；为HD治疗药物，治疗方法的筛选奠定了实验基础。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1是本发明实施例1中搭桥PCR的过程示意图；

图2是本发明实施例1中第一次体外酶切效率的凝胶电泳分析图，其中，A为L1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，B为R1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图；

图3是本发明实施例1中第二次体外酶切效率的凝胶电泳分析图，其中，A为L1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，B为R1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图；

图4是本发明实施例2中构建的打靶质粒的线性图谱，其中，A为以VK001-06为载体构建的打靶质粒的线性图谱，B为以VK001-07为载体构建的打靶质粒的线性图谱；

图5是本发明实施例3中打靶质粒的细胞内酶切活性的凝胶电泳分析图，其中，A为Htt2号打靶质粒的结果图，B为Htt3号打靶质粒的结果图；

图6是本发明实施例3中Htt2号打靶质粒的细胞内酶切活性的DNA测序图；

图7是本发明实施例3中Htt3号打靶质粒的细胞内酶切活性的DNA测序图.

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1

本实施例提供HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列(以下简称gRNA)的体外活性测定。其中，发明人设计了如下多个打靶序列：

Htt-L1：ccctggaaaagctgatgaagg

Htt-L2：aagccgtcatggcaaccctgg

Htt-L3：tcgggcaggaagccgtcatgg

Htt-L4：gggtctgtcccatcgggcagg

Htt-L5：ttcagggtctgtcccatcggg

Htt-L6：gtaggctccaagtcttcaggg

Htt-R1：gggttgaggcggaggcggcgg

Htt-R2：agggggttgaggcggaggcgg

Htt-R3：ctgagggggttgaggcggagg

Htt-R4：cggctgagggggttgaggcgg

Htt-R5：cggcggctgagggggttgagg

Htt-R6：ccctgaggcggcggctgaggg

上述序列中，每个序列的最后三位“ngg(n为a/t/c/g中的任意碱基)”为PAM序列。

1.gRNA的体外转录

使用T7-gRNA-FPg和gRNA-RP引物对(引物对序列如表1所示)，以标准gRNA片段为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR反应体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。反应完成后，采用1.3％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果，然后采用EP101-01纯化柱(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)，根据其说明书提供的方法纯化PCR产物，然后测定浓度后保存备用。

同时，准备标准品的PCR产物。标准品为VK007-10-VK007-22试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司)中的gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)，其中，gRNA1(g1)引物对分别为试剂盒中提供的g1-FP和本发明提供的gRNA-RP，标准gRNA2(g2)引物对分别为试剂盒提供的g2-FP和本发明提供的gRNA-RP，以标准gRNA片段为模板做PCR，PCR反应体系参考表2所示的PCR反应体系。反应完成后，采用EP101-01纯化柱(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)，根据其说明书提供的方法纯化PCR产物(注意使用DEPC H₂O洗脱DNA)，然后测定浓度后保存备用。

表1 引物对序列

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

2.CRISPR/Cas9-gRNA体外酶切反应

首先，将gRNA打靶序列(包括PAM序列)通过搭桥PCR的方式构建到PCR产物中。如图1所示。图1中，F1和R4为引物对，g分别为配对的gRNA打靶序列及其反义链。搭桥PCR产物的序列为：nnnnnnnnn(270bp)mmmmmmmmmmm(gRNA靶位点位置，含有PAM序列)nnnnnnnnnnn(450bp)。酶切之前搭桥PCR产物片段大小为740bp，酶切之后目的条带大小应分别为280bp+460bp左右。

然后，按照表4所示的体系顺次加样，根据VK007-10-VK007-22试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司)说明书提供的方法进行酶切反应，标准gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)为阳性对照，其中gRNA1不含有PAM序列，具有不完全的Cas9蛋白酶活性，gRNA2具有PAM序列，具有完全的Cas9蛋白酶活性。

表4 体外酶切反应体系

反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。实验重复两次，两次实验结果分别如图2和图3所示，图2为第一次实验结果图，图3为第二次实验结果图。图2和图3中，A为L1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，B为R1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，NC-1和NC-2为阴性对照，标准1和标准2分别为标准gRNA1(g1)和标准gRNA2，L1-6和R1-6为相应的gRNA经搭桥PCR后的产物。

标准gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)经由SSA luciferase进行活性检测，二者的SSA活性分别为：

标准gRNA1(g1)＝3，标准gRNA2(g2)＝10。

据此，本发明对样品gRNA的酶切活性采用如下标准：

若样品gRNA的酶切效率<标准gRNA1(g1)，表明样品gRNA靶点活性比较差，标记为活性不合格；

若标准gRNA1(g1)≤样品gRNA的酶切效率≤40％-50％，标记为活性合格；

若标准40％-50％≤样品gRNA的酶切效率≤gRNA2(g2)，标记为活性良好；

若样品gRNA的酶切效率≥标准gRNA2(g2)，标记为活性高。

样品gRNA的酶切效率由酶切条带的灰度换算而来。具体地，若NC-1和NC-2均只在750kb左右出现条带，则表明实验可信，然后以其为阴性对照，即酶切效率为零，以标准gRNA1在750kb条带的灰度值所代表的酶切效率为30％，gRNA2在750kb条带的灰度值所代表的酶切效率为100％，换算L1-6和R1-6的酶切效率。两次实验结果经换算，得到的gRNA的体外酶切效率分别如表5和表6所示。

表5 第一次实验测得的gRNA体外酶切效率

表6 第一次实验测得的gRNA体外酶切效率

由表5以及表6可知，两次实验结果基本一致，其实验数据可信度高。其中，Htt-L1、Htt-L2、Htt-L4、Htt-L6、Htt-R2、Htt-R6等六个序列经两次实验测定的活性差异小，并且与标准品对照，其体外酶切活性合格。

实施例2

本实施例提供HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒及其构建方法，该打靶质粒由一对打靶序列对构建到载体质粒而得到。该打靶序列对由L序列和R序列构成，其中，L序列选自实施例1中的Htt-L1、Htt-L2、Htt-L4、Htt-L6中的任一序列；R序列为实施例1中的Htt-R2或Htt-R6。载体质粒为适用于哺乳动物和/或哺乳动物细胞的载体质粒，优选地，载体质粒还具有荧光标记和抗性基因。

本实施例中采用VK001-06和VK001-07质粒，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，并采用该公司相应的CRISPR/Cas9快速构建试剂盒Cat VK001-06/07构建打靶质粒。以VK001-06和VK001-07为载体构建的打靶质粒的线性图谱分别如图4所示，图4中，A为以VK001-06为载体构建的打靶质粒的线性图谱，B为以VK001-07为载体构建的打靶质粒的线性图谱。本实施例中最终构建成功6个打靶质粒，分别标记为Htt1-6号。

其中，Htt1-3号以VK001-06为载体质粒，根据CRISPR/Cas9快速构建试剂盒CatVK001-06说明书提供的方法构建而成：

Htt1号：Htt-L1@Htt-R6

Htt2号：Htt-L2@Htt-R2

Htt3号：Htt-L2@Htt-R6。

Htt4-6号以VK001-07为载体质粒，根据CRISPR/Cas9快速构建试剂盒Cat VK001-07说明书提供的方法构建而成：

Htt4号Htt-L4@Htt-R2

Htt5号Htt-L6@Htt-R2

Htt6号Htt-L6@Htt-R6。

实施例3

本实施例提供实施例2中构建的打靶质粒的活性检测，为本发明的打靶序列对以及打靶质粒的应用提供实验依据。

1.打靶质粒的提取

取Htt1号，Htt2号，Htt3号，Htt4号，Htt5号，Htt6号菌种，分别在含有Amp+(80μg/mL)的LB筛选平板培养基上，37℃下划线培养24h。分别挑出单菌落，接种于含有Amp+(80μg/mL)的LB液体培养基3ml，恒温空气摇床37℃，培养16h后，按照SanPrep无内毒素质粒DNA小量提取试剂盒(Sangon Biotech B518161)说明书提取Htt1号，Htt2号，Htt3号，Htt4号，Htt5号，Htt6号的无内毒素质粒。微量核酸定量仪测定质粒的浓度，保存于-20℃。

2.细胞的复苏、接种和质粒转染及DNA提取

从液氮罐取出冻存的CATH-α细胞，快速37℃水浴溶解，1000g、离心5min，去除冻存培养基、取1mL DMEM完全培养基将细胞轻轻吹打混匀、接种于25cm²培养瓶中、37℃5％CO₂培养箱培养，待细胞满度>90％、1mL Trypsin-EDTA Solution孵育30sec、加入5mL DMEM完全培养基、轻轻吹打细胞使其分离，分别取2.5*10⁴个细胞接种到7个90cm²平皿，37℃5％CO₂培养箱培养12h后，取3ug Htt1-Htt6质粒分别按照RDP(μg):质粒(μg)＝6:1的比例复合得到靶向质粒然后转染细胞。靶向质粒在需室下温孵育10-15min。并在转染24h后进行补转染一次，补转染48h后终止转染，更换新鲜培养基继续培养12h后，按照细胞基因组提取试剂盒(DP304，天根生化科技有限公司)分别提取其DNA备用。

3.基因组测序鉴定

将提取得到的DNA进行PCR反应，其中，扩增长度为379bp，引物对序列和PCR程序分别如表7和表8所示。

表7 引物对序列

表8 PCR反应程序

PCR反应结束后，将PCR产物进行凝胶回收并进行T载体克隆，然后进行单菌落PCR并进行结果测序。

凝胶电泳结果如图5所示，其中A为Htt2号的结果图，B为Htt3号的结果图。由A可知，Htt2号质粒转染细胞后其靶点DNA长度比正常细胞(Normal)减少约80bp。由B可知，Htt3号质粒转染细胞后其靶点DNA长度比正常细胞(Normal)减少约120bp。

DNA测序结果如图6和图7所示，其中图6为Htt2号的结果图，图7为Htt3号的结果图。由图6可知，Htt2号质粒的切割位点分别为：Htt-L2在82-102bp处；Htt-R2在195-215bp处。从图6中可以看出，与正常细胞(Normal)DNA测序结果对比，所有的单克隆测序结果显示在172-258bp处出现碱基丢失，而此区间正是Htt2号质粒上游靶点(Htt-L2)和下游靶点(Htt-R2)区域，且在171bp之前和282bp之后的所有碱基均与Normal相同。说明Htt2号质粒在CATH-α细胞中的正确靶点敲除了大约87bp。说明Htt2号质粒对CATH-α细胞有有效的胞内DNA编辑活性。由图7可知，Htt3号质粒的切割位点分别为：Htt-L2在82-102bp处；Htt-R6在212-232bp处。从图7中可以看出，与正常细胞(Normal)DNA测序结果对比，所有的单克隆测序结果显示在172-282bp处出现碱基丢失，而此区间正是Htt3号质粒上游靶点(Htt-L2)和下游靶点(Htt-R6)区域，且在171bp之前和282bp之后的所有碱基均与Normal相同。说明Htt2号质粒在CATH-α细胞中的正确靶点敲除了大约111bp。说明Htt3号质粒对CATH-α细胞有有效的胞内DNA编辑活性。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagccgtcat ggcaaccctg g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggggttga ggcggaggcg g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccctgaggcg gcggctgagg g 21

Claims (10)

1.一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，其特征在于，其包括L序列和R序列，所述L序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述R序列的碱基序列对如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示。

2.一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，其包括载体质粒和权利要求1所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，所述HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对构建至所述载体质粒中。

3.根据权利要求2所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，所述载体质粒为适用于哺乳动物和/或哺乳动物细胞的载体质粒。

4.根据权利要求3所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，所述载体质粒具有荧光标记和抗性筛选标记。

5.根据权利要求4所述的HTT的CRISPR/CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，所述载体质粒为VK001-06。

6.权利要求1所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对在制作HTT基因突变模型中的应用。

7.权利要求2-5中任一项所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒在制作HTT基因突变模型中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述HTT基因突变模型为细胞模型。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其包括如下步骤：

步骤一：HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒与脑靶向肽RDP共孵育得到靶向质粒；

步骤二：靶向质粒进行第一次细胞转染；

步骤三：第一次细胞转染后24h后，用靶向质粒补转染，补转染48h后终止转染。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤一中，HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒与脑靶向肽RDP的质量比为1:6，室温共孵育10-15min。