CN107630043A - 采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法 - Google Patents

Abstract

一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是利用Crispr/cas9技术敲除GADD45a基因，构建兔模型，探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。本发明的步骤是：构建sgRNA、合成双链DNA、p UC‑57载体线性化、连接p UC‑57载体和双链DNA、转化、单克隆的挑取及质粒DNA的提取、鉴定质粒测序、CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录。本发明经过相关检测，成功获得Gadd45a敲除兔模型，该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。

Description

采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

Gadd45家族是DNA损伤修复的重要相关基因，在细胞凋亡中发挥重要的作用。该家族由三个基因Gadd45a、Gadd45b和Gadd45g组成，调节各种细胞命运和功能，包括调控细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和表观遗传修饰等。Gadd45a作为该家族基因之一目前的研究还主要在细胞水平上，对于动物体的影响还不明确。有文献表明在肝硬化和肝细胞癌（HCC）组织中Gadd45a的表达量下调。因此，我们猜测Gadd45a对肝脏功能可能有一定的影响。故建立Gadd45a敲除兔模型，对其酒精灌胃处理，观察肝损伤程度。

人类肝病的病症模型肝病机理研究和新药研发的重要基础。因此建立敲除兔模型，刺激其产生相应的肝损伤，有效地模拟人类肝病的病理过程，能更有效地预测新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险。

发明内容

本发明的目的是利用Crispr/cas9技术敲除GADD45a基因，构建兔模型，探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。

本发明的步骤是：

①构建sgRNA：

在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链：

Sgrna1-F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACC

Sgrna1-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;

Sgrna2-F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGC

Sgrna2-R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；

②合成双链DNA：

两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA；反应条件：95℃ 5min后室温放置1h；双链DNA反应体系

；

③p UC-57载体线性化：

p UC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经Bbs I线性化，并回收纯化；

酶切反应体系表

；

④连接p UC-57载体和双链DNA：

按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，

连接反应体系表

；

⑤转化：

（1）从-80℃冰箱取50 μL感受态细菌，加入10 μL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；

（2）42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；

（3）加200μL LB液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250 rpm震荡培养30 min；

（4）吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；

⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：

从培养基中挑取单菌落，接种于6 mL液体LB培养基中，培养基中含6 μL氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12-14h；将细菌中的质粒提取出来；

⑦鉴定质粒测序

使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；

⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；

酶切体系

。

本发明模型建立过程：

（1）受精卵的获取和显微注射

注射卵泡刺激素（FSH），之后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)（购于宁波第二激素厂），获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中(CAS9mRNA 150ng/μl ； sgRNA 30ng/μl）。

（2）体外培养受精卵并进行发育

将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；

（3）胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定

显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5μL NP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为：56℃，1 h；95℃，10 min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；

设计PCR引物如下：

上游引物：GGGTTCGGATTGCCCAAA (Sense)

下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACT (AntiSense)

PCR反应体系

；

PCR反应条件：

95℃预变性5min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；35个循环；72 ℃延伸5min；

（4）注射后的受精卵移植及动物培育

显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。

本发明经过相关检测，成功获得Gadd45a敲除兔模型，该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。

附图说明

图1是本发明表达载体PUC57-sgRNA的结构示意图；

图2是本发明PCR产物鉴定胚胎Gadd45a基因敲除情况的电泳图；

图3是测序结果。

具体实施方式

本发明步骤是：p UC57-sgRNA载体构建

①构建sgRNA：

在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链：

Sgrna1-F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACC

Sgrna1-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;

Sgrna2-F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGC

Sgrna2-R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；

②合成双链DNA：

两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA；反应条件：95℃ 5min后室温放置1h；双链DNA反应体系

；

③p UC-57载体线性化：

p UC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经Bbs I线性化，并回收纯化；

酶切反应体系表

；

④连接p UC-57载体和双链DNA：

按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，

连接反应体系表

；

⑤转化：

（1）从-80℃冰箱取50 μL感受态细菌，加入10 μL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；

（2）42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；

（3）加200μL LB液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250 rpm震荡培养30 min；

（4）吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；

⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：

从培养基中挑取单菌落，接种于6 mL液体LB培养基中，培养基中含6 μL氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12-14h；将细菌中的质粒提取出来；

⑦鉴定质粒测序

使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；

⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；

酶切体系

。

本发明模型建立过程：

（1）受精卵的获取和显微注射

注射卵泡刺激素（FSH），之后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)（购于宁波第二激素厂），获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中(CAS9mRNA 150ng/μl； sgRNA 30ng/μl）。

（2）体外培养受精卵并进行发育

将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；

（3）胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定

显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5μL NP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为：56℃，1 h；95℃，10 min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；

设计PCR引物如下：

上游引物：GGGTTCGGATTGCCCAAA (Sense)

下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACT (AntiSense)

PCR反应体系

；

PCR反应条件：

95℃预变性5min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；35个循环；72 ℃延伸5min；

（4）注射后的受精卵移植及动物培育

显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> lepus

<400> 1

tgactttgga ggaattctcg gctggagagc agaagaccga aag 43

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> lepus

<400> 2

taggtcgcgg tcctcggcga aacc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> lepus

<400> 3

aaacggtttc gccgaggacc gcga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> lepus

<400> 4

taggactctc cgcaatccgg gtgc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> lepus

<400> 5

aaacgcaccc ggattgcgga gagt 24

<210> 6

<211> 1001

<212> DNA

<213> 标注为sgRNA1一条寡核苷酸链(lepus)

<400> 6

gccagctgta ttggagatcg gtacttcgcg aatgcgtcga gatattgggt ctttaaaagc 60

accgactcgg tgccactttt tcaagttgat aacggactag ccttatttta acttgctatt 120

tctagctcta aaacggtttc gccgaggacc gcgacctata gtgagtcgta ttaattgggt 180

atcggatgcc gggaccgacg agtgcagagg cgtgcaagcg agcttggcgt aatcatggtc 240

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 300

aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 360

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 420

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 480

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 540

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 600

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 660

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 720

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 780

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 840

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 900

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atcccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 960

cgggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg g 1001

<210> 7

<211> 1001

<212> DNA

<213> 标注为sgrna2一条寡核苷酸链(lepus)

<400> 7

attggggaga tcggtacttc gcgaatgcgt cgagatattg ggtctttaaa agcaccgact 60

cggtgccact ttttcaagtt gataacggac tagccttatt ttaacttgct atttctagct 120

ctaaaacgca cccggattgc ggagagtcct atagtgagtc gtattaattg ggtatcggat 180

gccgggaccg acgagtgcag aggcgtgcaa gcgagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 240

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 300

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 360

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 420

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 480

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 540

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 600

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 660

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 720

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 780

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 840

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 900

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 960

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga t 1001

Claims (2)

1.一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：

①构建sgRNA：

在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链：

Sgrna1-F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACC

Sgrna1-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;

Sgrna2-F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGC

Sgrna2-R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；

②合成双链DNA：

两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA；反应条件：95℃ 5min后室温放置1h；双链DNA反应体系

；

③p UC-57载体线性化：

p UC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经Bbs I线性化，并回收纯化；

酶切反应体系表

；

④连接p UC-57载体和双链DNA：

按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，

连接反应体系表

；

⑤转化：

（1）从-80℃冰箱取50 μL感受态细菌，加入10 μL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；

（2）42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；

（3）加200μL LB液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250 rpm震荡培养30 min；

（4）吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；

⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：

从培养基中挑取单菌落，接种于6 mL液体LB培养基中，培养基中含6 μL氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12-14h；将细菌中的质粒提取出来；

⑦鉴定质粒测序

使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；

⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；

酶切体系

。

2.权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：p UC57-sgRNA载体序列为SEQIDNo.1

权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：模型建立过程：

（1）受精卵的获取和显微注射

注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中CAS9mRNA 150ng/μl； sgRNA 30ng/μl；

（2）体外培养受精卵并进行发育

将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；

（3）胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定

显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5μL NP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为：56℃，1 h；95℃，10 min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；

设计PCR引物如下：

上游引物：GGGTTCGGATTGCCCAAA (Sense)

下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACT (AntiSense)

PCR反应体系

；

PCR反应条件：

95℃预变性5min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；35个循环；72 ℃延伸5min；

（4）注射后的受精卵移植及动物培育

显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。