CN105063079A - 一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及其制备方法，该基因转移体包括MARs牛核基质结合区、以牛肌肉抑素第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、MRF4、MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因和终止信号区SV40？polyA，所述独立基因转移体无原核主干载体序列。本发明首次把RNA干扰技术与肌肉特异过表达FAD3、DsRed结合，实现了敲减与反向过表达相关基因同时进行，为安全高效地改善多基因控制的性状如肌肉、疾病相关性状等提供新的思路和途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，涉及一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法
背景技术
在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。更需要多基因，组织特异性共表达的载体。
MSTN，又称肌肉生长抑制素，属于转化生长因子β超家族成员，1997年McPherron、Lawler首次制备了MSTN基因敲除小鼠[1]，证实它最重要的功能即对骨骼肌的生长与发育负调控骨骼肌生长。MSTN作为一种分泌型蛋白主要由骨骼肌产生，在不同物种中MSTN基因都由3个外显子(exon1/2/3)和2个内含子(intron1/2)组成，在哺乳动物中MSTN的成熟肽序列同源性很高，例如人和牛的相似度为98.2％。自然突变或者通过基因操作手段制备的MSTN功能缺失型的动物(如小鼠、牛、羊等)表现出骨骼肌肥大的双肌效应，是一种常染色体隐性遗传的性状[2-3]，因此在家畜育种中如何有效阻断或抑制MSTN的表达，如何使MSTN失活成为家畜育种的研究热点。在医学方面抑制MSTN能够增强横纹肌生长，治疗肌肉萎缩，减少肥胖，改善心脏收缩性，因此，更多抑制MSTN表达的基因操作方法在不断的发现和研究中。
核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。
MARs的长度一般为300一1000bp，也有的长达几个kb，维持其活性的最小长度约是300bp，MARs是非编码序列，AT含量高达70％，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的结构基元，如烟草中发现TM2序列具备一般MARs序列的基本特征：其序列全长1001bp，AT含量为62.8％，序列上含有一个典型的T-box，两个潜在的DNA解旋序列(AATATT)和一个潜在的拓扑异构酶II结合位点(CTTTATATTGTTGAC)。
研究表明，MARs序列的功能包括边界因子(boundaryelement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARS对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。
MRF4，肌肉特异启动子，真核生物启动子位于基因5’端上游转录起始位点附近，是包含核心启动子以及上游转录调控元件的一段DNA序列，这些转录调控元件控制着基因表达的强度和特异性。肌肉特异性启动子的上游调控元件种类、数量和排列顺序决定着基因在肌肉中的特异性表达。目前，人们分离了许多肌肉特异性启动子，如骨骼肌α-actin、心肌α-actin、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链(MyHC)、结蛋白(desmin)和生肌调控因子家族(MyoD、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子，并对这些启动子的转录活性和其对肌肉细胞的增殖、分化作用进行深入研究]。本MRF4是根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”最终优化的MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
FAD3是在植物中发现的一种脂肪酸去饱和酶基因，催化细胞中亚油酸到亚麻酸的反应，研究表明在非光合作用的组织中，FAD3蛋白主要为ω-3去饱和酶的功能，催化组织中约80％三烯脂肪酸的合成。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3polyunsaturatedfattyacids，PUFA)是组成人体必需的物质，对健康非常重要，ω-6与ω-3PUFA比值过高可导致心血管疾病、癌症、炎症以及自身免疫反应等疑难病。但由于哺乳动物体内缺乏ω-3脂肪酸去饱和酶，自身不能催化合成ω-3PUFA，只能通过饮食获得。
RNAi技术，用基因打靶技术敲除MSTN基因，已在多种模式动物中成功运用，但该技术需要消耗大量的时间和资源而且往往效率很低。由于RNAi转基因小鼠的出现，使在哺乳动物个体水平上研究靶基因的敲减成为了可能。RNAi技术的优越性：①RNAi效应可以遗传。②dsRNA的表达受到特异性启动子的调控，因而可以有目的地在特定时相内启动RNAi。避免基因突变或敲减进行可遗传的修饰时，会过早的沉默基因，从而产生致死表型，使得无法进一步研究，从这点来看RNAi比基因敲除具有优越性。另外，利用RNAi可以很快得到许多有关基因的功能信息，而且可以达到研究信号通路中多个基因的目的。有研究证明，大于50bp的外源双链RNA转染细胞后，会引起干扰素途径，但转染19-23bp的shRNA却可以避免干扰素途径，从而特异性降解靶基因，而且这种shRNA具有高效、稳定的特点。
IRES序列，内部核糖体进入位点序列，真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子结构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5′端非翻译区(untranslatedregion，UTR)，即内部核糖体进入位点(IRES)，该位点是一段高度保守序列，可使其前后基因在同一启动子下转录一个双顺反子mRNA，而转译时使两基因分别翻译成两个独立的产物。因此，在真核生物转基因表达载体构建中，常用于构建在一个启动子下IRES连接两个基因编码序列，实现双顺反子共表达。
DsRed2基因，红色荧光蛋白基因，常用于转基因的标志性基因。
目前，构建真核表达载体多为非组织特异、单顺反子或双顺反子表达载体。而生物改造，尤其经济形状、数量性状的改造往往涉及多个基因，因此，多基因共表达的真核载体的构建，至关重要。多基因单向共表达，往往产生相互影响。而非组织特异性启动子在所有组织中均表达，并非需要，有时是有害的。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法，能使三种目的基因双向高效组织特异共表达，无质粒载体主干序列、无抗性选择基因，洁净且安全的三顺反子共表达基因转移体。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，基因转移体包括MARs牛核基质结合区、以牛肌肉抑素(MSTN)第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、MRF4、以MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、以FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因和终止信号区SV40polyA，所述独立基因转移体无原核主干载体序列。
其中，所述的基因转移体的全序列为SEQNO.：17。
其中，置换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQIDNO：9；根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”优化MRF4序列，在两端添加KpnI和SmaI酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
其中，置换U6的MRF4的序列为SEQIDNO：9；通过如下引物进行PCR获得：
MRF4-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：1；
MRF4-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：2。
其中，FAD3的序列为SEQIDNO：10；通过如下引物进行PCR获得：
FAD3-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：3；
FAD3-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：4。
其中，IRES的序列为SEQIDNO：11；通过如下引物进行PCR获得：
IRES-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：5；
IRES-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：6。
其中，DsRed基因为SEQIDNO：12；通过如下引物进行PCR获得：
DsRed-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：7；
DsRed-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：8。
还提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，包括如下步骤：
S1、，人工合成MRF4，并用MRF4置换初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN中的CMV，得pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN；
S2、用克隆的MRF4置换pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN中的U6，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN；
S3、用克隆的FAD3置换pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN中的FSTN，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3；
S4、进行IRES序列的克隆，并连入FAD3下游，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES；
S5、克隆DsRed，连入IRES下游，构建质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed；
S6、用XhoII、AfIII对步骤S5所得的质粒载体双酶切，电泳分离，获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA。
其中，所述步骤S1具体包括如下步骤：
S11、根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”优化MRF4序列，在两端添加KpnI和SmaI酶切位点及保护碱基，并将序列送至takara公司，进行人工合成；
S12、将步骤S11合成的MRF4肌肉特异启动子序列连接到PMD19T-simple载体中，挑取穿刺菌加入到LB液体培养基中37℃摇菌14-16h，通过茵液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性菌液送去测序；
S13、选择测序结果正确的菌液提取质粒，通过KpnI和SmaI双酶切回MRF4片段；
S14、通过KpnI和SmaI双酶切置换CMV。
步骤S2具体包括如下步骤：
S21、根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物，并在MRF4序列两端添加EcoRI和BamHI酶切位点及保护碱基；
S22、通过PCR.扩增得到MRF4片断，
S23、将所得的MRF4片断进行测序，得片断大小为1027bp；
S24、通过EcoRI和BamHI酶切所得的MRF4片断，置换U6；
所述步骤S3具体包括如下步骤：
S31、根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物，并在FAD3人源化片段两端添加SmaI和NotI酶切位点及保护碱；
S32、通过PCR技术从构建的重组载体上获得FAD3片断；
S33、将所得FAD3片断进行测序，得片断大小1342bp；
S34、将所得的FAD3片断经SmaI和NotI酶切，置换FSTN；
所述步骤S4具体包括如下步骤：
S41、设计IRES的特异性引物(Anti-senseNotI、MIuI两个酶切位点，以便下游连接)；
S42、通过PCR技术从构建的重组载体上获得IRES片断；
S43、将得到IRES片断进行测序，得IRES片断的大小为608bp；
S44、将IRES片断与FAD3的下游无缝连接；
所述步骤S5具体包括如下步骤：
S51、根据DsRed序列设计引物，并在DsRed两端添加NotI和MIuI酶切位点及保护碱基；
S52、通过PCR技术从重组载体上获得DsRed片断；
S53、将所得的DsRed片断进行测序，得片断大小为691bp；
S54、将所得的DsRed片断经NotI和MIuI酶切，连入IRES的下游，得质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed。
所述步骤S6具体包括如下步骤：
S61、对鉴定正确的pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒；
S62、通过XhoI和AfIII对质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA。
本发明具有以下有益效果：
首次把RNA干扰技术与肌肉特异过表达FAD3、DsRed结合，实现了敲减与反向过表达相关基因同时进行，为安全高效地改善多基因控制的性状如肌肉、疾病相关性状等提供新的思路和途径。
附图说明
图1为本发明实施例一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA的结构示意图。
图2是本实验室构建的初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN结构示意图。
图3是载体pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN结构示意图。
图4是载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN质粒结构示意图。
图5是载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-结构示意图。
图6是载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES结构示意图。
图7是载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed结构示意图。
图8是MRF4置换CMV后对pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN载体的酶切鉴定。
图9是MRF4置换U6后对pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN载体的酶切鉴定。
图10是FAD3置换FSTN后对pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3载体的酶切鉴定。
图11是IRES连入FAD3后对pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES载体的菌落PCR鉴定。
图12是IRES连入FAD3后对pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES载体的测序鉴定。
图13是DsRed连入IRES之后对pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed载体的酶切鉴定。
图14是pMAR-MRF4-shRNA-MRF4-FAD3-IRES-DsRed质粒用XhoI、AfIII进行双酶切回收即获得三顺反子表达盒三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体酶切电泳图。
图15是Real-timePCR检测实验组与对照组中MSTN表达情况，结果显示MSTN基因在肌肉卫星细胞中表达量下调，下调率为61％。
图16是FAD3基因在牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中的表达具有显著性差异，在肌肉卫星细胞中的表达量是在成纤维细胞中的4.9倍。
图17是肌卫星细胞DsRed表达图片。
图18是成纤维细胞DsRed表达图片。
图19是DsRed基因在1：肌肉卫星细胞；2：成纤维细胞；3：水对照中RT-PCR电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的基因序列为：SEQIDNO：13，如图1所示，所述基因转移体从5′端起到3′端止包括MARs牛核基质结合区、以牛肌肉抑素(MSTN)第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、MRF4、MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因、SV40polyA为终止信号区。该独立基因转移体无原核主干载体序列。
所述置换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQIDNO：9；根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”最终优化的MRF4序列，在两端添加KpnI和SmaI酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
所述置换U6的MRF4的序列为SEQIDNO：9；通过如下引物进行PCR获得：
MRF4-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：1；
MRF4-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：2。
所述FAD3的序列为SEQIDNO：10；通过如下引物进行PCR获得：
FAD3-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：3；
FAD3-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：4。
所述IRES的序列为SEQIDNO：11；通过如下引物进行PCR获得：
IRES-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：5；
IRES-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：6。
所述DsRed基因为SEQIDNO：12；通过如下引物进行PCR获得：
DsRed-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：7；
DsRed-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：8。
本发明实施例还提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，包括如下步骤：
S1、人工合成MRF4置换初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN中的CMV，获得pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN，具体的：
S11、根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”最终优化的MRF4序列，在两端添加KpnI和SmaI酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
S12、质粒提取具体步骤如下：
a、收集菌液于1.5mlEP管中，12000rpm离心1min，弃上清，进行多次，直至收集完毕。
b、加入250μl重悬液，吹吸，将沉淀混匀。
c、加入250μl裂解液，轻轻颠倒4-6次。
d、加入350μl中和液，反复颠倒4-6次；14000rpm离心5min。
e、将上清移至吸附柱中，静置1min，使其充分吸附，14000rpm离心1min。f、弃废液，加入500μl洗涤液，14000rpm离心30-60s。
g、重复步骤f。
h、弃废液，空转1min。
i、将柱子转移到新的EP管中，加入30-5-ul无菌水，静置2min，离心2min。
j、测OD值。
S13、MRF4片段通过KpnI和SmaI双酶切回收，酶切体系如下：
胶回收步骤如下：
a、将目的条带切下来放入1.5mL离心管中，加入350μL的膜结合液，65℃融化胶10-20min。
b、室温冷却将液体转移到柱子上，静置2min。14000rpm离心2min。
c、弃废液，加入700μL膜洗脱液，14000rpm离心1min。
d、弃废液，加入500μL膜洗脱液，14000rpm离心5min。
e、弃废液，空转1min。
f、将柱子转入心离心管，加30-50μL无酶水，静置2min，离心1min。
g、测OD值。
S14、pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN载体的构建，通过KpnI和SmaI双酶切置换CMV。
将本实验室已构建的鉴定正确的双顺反子pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN载体(作为初始载体，如图2所示)的菌液在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养，并提取质粒。将含人工合成MRF4的19T-MRF4茵液在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，并提取质粒。初始载体和19T-MRF4两种质粒分别用KpnI、SmaI进行双酶切、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒、酶切验证(如图8所示)正确，获得pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN载体。如图3所示。
S2、用克隆的MRF4置换pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN中的U6，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN，具体包括如下步骤：
S21、引物的设计
根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物，两端添加EcoRI和BamHI酶切位点及保护碱基，通过如下引物进行PCR获得：
MRF4-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：1；
MRF4-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：2。
PCR反应体系
S22、PCR反应条件
通过这个反应可得到MRF4片断，
S23、测序
胶回收该片段，连接到PMD19T-vector上(SolutionI5μl+目的片段4μl+PMD19T-vector1μl16℃过夜连接)，转化E.coliDH5α感受态细胞，涂平板过夜，挑菌并摇菌，菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性茵液一部分送测序，一部分保菌待用。经测序片断大小1027bp。
S24、选择测序结果正确的菌液进行提质粒。对所提质粒进行两种质粒pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN和19T-MRF4分别用EcoRI、BamHI进行双酶切、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒、并进行酶切鉴定，以确保外源基因正确置入，鉴定结果如图9所示，并获得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN载体，如图4所示。
S3、pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3载体的构建，具体步骤如下：
FAD3基因的克隆与测序，通过PCR技术从本实验室构建的重组载体上获得。
(1)引物的设计
根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物，两端添加SmaI和NotI酶切位点及保护碱基，通过如下引物进行PCR获得：
FAD3-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：3；
FAD3-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：4。
(2)PCR反应体系
(3)PCR反应条件
通过这个反应可得到FAD3片断。
(4)测序
胶回收该片段，连接到PMD19T-vector上(SolutionI5μl+目的片段4μl+PMD19T-vector1μl16℃过夜连接)，转化E.coliDH5α感受态细胞，涂平板过夜，挑菌并摇菌，菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性菌液一部分送测序，一部分保菌待用。经测序片断大小为1342bp。
(5)选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提两种质粒pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN和19T-MRF4分别用SmaI、NotI进行双酶切、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒，酶切验证，结果正确，如图10所示。并获得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3载体，如图4所示。
S4、IRES的克隆与pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES载体构建。具体步骤是：IRES序列的克隆和测序，通过PCR技术从本实验室构建的重组载体上获得。
(1)引物设计
根据TAKARA无缝拼接试剂盒(HDCloningKit)引物设计原则：克隆引物包括目的片段特异性引物序列和重叠序列，设计引物。
IRES-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：5；
IRES-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：6。
(2)PCR反应体系
(3)PCR的反应条件
通过这个反应可得到IRES片断。
(4)PCR克隆并胶回收的IRES质粒利用TAKARA无缝拼接试剂盒(HDCloningKit)通过同源重组的方式进行连接、转化、挑取单克隆菌落、摇菌、送测序，测序结果片断大小608bp。测序正确即获得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES载体。如图6所示。PCR鉴定如图11所示。测序鉴定如图12所示.
S5、DsRed基因的克隆和测序与pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed的构建，具体步骤是：
通过PCR技术从本实验室构建的重组载体上获得。
(1)引物的设计
根据DsRed序列设计引物，两端添加NotI和MIuI酶切位点及保护碱基，
IRES-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：7；
IRES-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：8。
(2)PCR反应体系
(3)PCR反应条件
通过这个反应可得到DsRed片断；测序片断大小为691bp。
(4)将PCR克隆并测序正确的19T-DsRed菌液在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，并提取质粒。将两种质粒pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES和19T-DsRed分别用NotI、MIuI进行双酶切、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌、提质粒，酶切验证正确，如图13所示。并获得三顺反子pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed。如图7所示。
S6、如图7所示的质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed构建完毕后，用XhoII、AfIII双酶切，通过双酶切的方法获得如图1所示的MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA三顺反子共表达基因转移体。具体步骤是：
(1)对鉴定正确的如图7所示的pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒；
(2)用XhoI和AfIII对质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收获得如图1所示的MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA三顺反子共表达基因转移体，全序列见SEQIDNO：13.
本发明MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其在细胞水平表达功能鉴定过程如下：
牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞的冻存复苏与培养
从液氮中取出冻存管，迅速在37℃水浴中将其融化，用移液器将细胞悬液移入到15mL离心管中(提前加入5ml的新鲜培养液)，室温下1500rpm/min离心5min，弃上清。加入新鲜的培养液(牛胎儿成纤维细胞培养液为DMEM+10％FBS、肌肉卫星细胞培养液为DMEM+10％FBS+10％HS)，将细胞吹打均匀，接种到合适的培养皿或细胞培养板中，于培养箱(37℃，5％CO2及饱和湿度)中培养。
待牛胎儿成纤维细胞传代长满后，培养液去掉，用PBS洗两遍，加入适量的0.05％的胰蛋白酶，放入细胞培养箱中消化处理2-3min，于显微镜下观察细胞已经变圆后立即加入两倍体积的细胞培养液终止消化。使细胞悬浮均匀后转移到离心管中，1500rpm/min的条件下离心4min，此时细胞集中于离心管底部，小心将液体去除，加入适量冻存液(DMEM∶FBS∶DMSO为7∶2∶1)，吹匀后移入冻存管。冻存管放入细胞程序冷冻盒，-80℃过夜后转移到液氮罐中保存。三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体转染牛胎儿成纤维细胞、肌肉卫星细胞
通过电穿孔转染法将双酶切分离获得的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体转染牛胎儿成纤维细胞、肌肉卫星细胞，并分别设置阴性对照。
Real-timePCR检测各顺反子表达情况，根据RealTimePCR引物设计原则，设计MSTN、FAD3、GAPDH的引物序列。
表1RealTimeRT-PCR检测中的MSTN、FAD3和GAPDH引物序列
RealTimeRT-PCR
a、样品的收集
分别收集转染组和对照组的牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞。提取各组细胞的总RNA，反转录为cDNA。并进行RealTimePCR反应。
b、反转录cDNA反应体系如下：
(1)
(2)
b、RealTimeRT-PCR反应体系
c、RealTimePCR反应条件：95℃30sec，95℃5sec→60℃34sec(40cycles)。
本实验重复三次，并通过SPASS进行差异显著性分析。Real-timePCR检测实验组与对照组中MSTN、FAD3表达情况，结果显示MSTN基因在肌肉卫星细胞中表达量下调，下调率为61％，如图15所示，并显示shRNA对MSTN有较强的抑制作用；FAD3基因在牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中具有显著性差异，在肌肉卫星细胞中的表达量是在成纤维细胞中的4.9倍，如图16所示，显示MRF4有较强的肌肉组织表达特异性。
DsRed表达情况，肌卫星细胞DsRed表达高于成纤维细胞DsRed的表达量。肌卫星细胞DsRed表达如图17所示。成纤维细胞DsRed表达如图18所示。图19是DsRed基因在1：肌肉卫星细胞；2：成纤维细胞；3：水对照中RT-PCR电泳图，显示DsRed基因在RNA水平，在肌卫星细胞表达量远高于成纤维细胞，而在水中无表达，上述均显示MRF4有较强的肌肉组织表达特异性。
上述实验结果表明，本发明所构建的MAR-MRF4-shRNA-MRF4-FAD3-IRES-DsRed三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，可以有效的在细胞水平表达，并且在肌卫星细胞可以显著的上调外源过表达基因的表达，下调内源干扰基因的表达，起到了过表达与干扰载体共同发挥的作用，而且表明具多基因肌肉特异性表达特征。无任何质粒载体主干序列和任何抗性基因，是安全有效的新型多基因转移体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，基因转移体包括MARs牛核基质结合区、以牛肌肉抑素第三号外显子为靶点的小发夹RNA、MRF4、MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因和终止信号区SV40polyA，所述独立基因转移体无原核主干载体序列。
2.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，所述的基因转移体的全序列为SEQNO.：17。
3.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，置换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQIDNO：9；根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”优化MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
4.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，置换U6的MRF4的序列为SEQIDNO：9；通过如下引物进行PCR获得：
MRF4-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：1；
MRF4-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：2。
5.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，FAD3的序列为SEQIDNO：10；通过如下引物进行PCR获得：
FAD3-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：3；
FAD3-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：4。
6.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，IRES的序列为SEQIDNO：11；通过如下引物进行PCR获得：
IRES-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：5；
IRES-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：6。
7.根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，DsRed基因为SEQIDNO：12；通过如下引物进行PCR获得：
DsRed-F正义链，5′到3′：SEQIDNO：7；
DsRed-R反义链，5′到3′：SEQIDNO：8。
8.一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、，人工合成MRF4，并用MRF4置换初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN中的CMV，得pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN；
S2、用克隆的MRF4置换pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN中的U6，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN；
S3、用克隆的FAD3置换pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN中的FSTN，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3；
S4、进行IRES序列的克隆，并连入FAD3下游，得pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES；
S5、克隆DsRed，连入IRES下游，构建质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed；
S6、用XholI、AflII对步骤S5所得的质粒载体双酶切，电泳分离，获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed。
9.根据权利要求8所述的一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括如下步骤：
S11、根据“肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线”优化MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，并将序列送至takara公司，进行人工合成；
S12、将步骤S11合成的MRF4肌肉特异启动子序列连接到PMD19T-simple载体中，挑取穿刺菌加入到LB液体培养基中37℃摇菌14-16h，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，将阳性菌液送去测序；
S13、选择测序结果正确的菌液提取质粒，通过Kpnl和Smal双酶切回MRF4片段；
S14、通过Kpnl和Smal双酶切置换CMV。
步骤S2具体包括如下步骤：
S21、根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物，并在MRF4序列两端添加EcoRl和BamHl酶切位点及保护碱基；
S22、通过PCR.扩增得到MRF4片断，
S23、将所得的MRF4片断进行测序，得片断大小为1027bp；
S24、通过EcoRl和BamHl酶切所得的MRF4片断，置换U6；
所述步骤S3具体包括如下步骤：
S31、根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物，并在FAD3人源化片段两端添加Smal和Notl酶切位点及保护碱；
S32、通过PCR技术从构建的重组载体上获得FAD3片断；
S33、将所得FAD3片断进行测序，得片断大小1342bp；
S34、将所得的FAD3片断经Smal和Notl酶切，置换FSTN；
所述步骤S4具体包括如下步骤：
S41、设计IRES的特异性引物；
S42、通过PCR技术从构建的重组载体上获得IRES片断；
S43、将得到IRES片断进行测序，得IRES片断的大小为608bp；
S44、将IRES片断与FAD3的下游无缝连接；
所述步骤S5具体包括如下步骤：
S51、根据DsRed序列设计引物，并在DsRed两端添加Notl和Mlul酶切位点及保护碱基；
S52、通过PCR技术从重组载体上获得DsRed片断；
S53、将所得的DsRed片断进行测序，得片断大小为691bp；
S54、将所得的DsRed片断经Notl和Mlul酶切，连入IRES的下游，得质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed；
所述步骤S6具体包括如下步骤：
S61、对鉴定正确的pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed载体在含有卡那霉素的液体LB培养基中培养并提质粒；
S62、通过XhoI和AflII对质粒载体pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40polyA。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102994536A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-03-27 | 内蒙古大学 | 双顺反子共表达基因转移体及制备方法 |
| CN104195153A (zh) * | 2014-05-16 | 2014-12-10 | 内蒙古大学 | 一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102994536A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-03-27 | 内蒙古大学 | 双顺反子共表达基因转移体及制备方法 |
| CN104195153A (zh) * | 2014-05-16 | 2014-12-10 | 内蒙古大学 | 一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吴丹 等: "MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖及分化的影响", 《沈阳农业大学学报》 * |
| 胡兰 等: "MSTN RNAi双元表达载体构建及效果试验", 《中国兽医杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110257373A (zh) * | 2018-01-12 | 2019-09-20 | 内蒙古大学 | 一种组织特异性基因转录调控元件的构建方法 |
| CN114231532A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-03-25 | 广州派真生物技术有限公司 | 在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用 |
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