CN101864419B - 小鼠Miwi启动子,其载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的小鼠Miwi启动子，含有小鼠Miwi启动子的载体，宿主细胞以及小鼠Miwi启动子的用途。小鼠Miwi启动子可用于指导外源基因在雄性生殖细胞中特异表达，为研究生殖相关的基因功能提供方便，并为建立基因治疗技术以治疗男性不育等疾病提供了手段。

Description

小鼠Miwi启动子,其载体及应用

技术领域

本发明涉及基因表达调控领域，更具体地说，本发明涉及一种在小鼠雄性生殖细胞中特异表达的小鼠基因启动子。 

背景技术

Argonaute蛋白质家族的成员包含PAZ(Piwi Argonaut and Zwille)和PIWI两个结构域。Argonaute蛋白通过其PAZ结构域与小RNA的3’端发生作用，通过PIWI结构域与小RNA的5’端相互作用(Song JJ，et al.The crystalstructure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif inRNAi effector complexes.Nat Struct Biol，2003，10：1026-1032；Yan KS，et al.Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain.Nature，2003，426：468-474；Song JJ，et al.Crystal structure of Argonaute andits implications for RISC slicer activity.Science，2004，305：1434-1437；Takada S，Rivas FV，et al.Purified Argonaute2 and an siRNA formrecombinant human RISC.Nat Struct Mol Biol，2005，12：340-349)。并在小RNA的指导下寻找目标位点，从而引起基因沉默。根据Argonaute蛋白家族氨基酸序列相似性，Ago/Piwi家族可分为三个亚家族。第一，Argonautes(Ago)亚家族；第二，Piwi蛋白亚家族；第三个亚家族包括线虫中的Sago-1和Sago-2。 

小鼠Piwi亚家族的成员包括MIWI，MI LI/PIWIL2和MIWI2/PIWIL4，小鼠Miwi、Mili和Miwi2都是雄性生殖细胞发育过程中特异表达的基因，但其表达时间有所不同。Miwi从减数分裂时期的粗线期精母细胞开始表达持续到圆形精子细胞时期；Mili从原始生殖细胞迁入生殖嵴后不久即胚胎期12.5天左右开始表达，一直持续到圆形精子细胞时期；相对于Miwi和Mili来说，Miwi2的表达时期很短，只在胚胎期15.5天到出生后3天的精原细胞中表达。Piwi亚家族都能与一类小RNA结合，称为piRNA，在粗线期与Miwi和Mili相互作用的piRNA称为粗线期piRNA，在粗线期之前与Mili相互作用的piRNA称为前粗线期piRNA。 

Satomi Kuramochi-Miyagawa等人在2001年最早克隆到小鼠Miwi基因，并对其表达谱进行了研究，发现Miwi只在小鼠睾丸组织中有表达，原位杂交显示其表达位于减数分裂的粗线期(Kuramochi-Miyagawa S，et al.Two mousepiwi-related genes：miwi and mili.Mech Dev，2001，108：121-133)。2002年，Wei Deng，Haifan Lin等人也对小鼠Miwi基因进行了克隆和表达分析，他们克隆到4.06kb的小鼠Miwi基因cDNA，包括191bp的5’UTR区，2.59kb的开放读码框，和1.17kb的3’UTR区，并通过原位杂交和Miwi-GFP Knockin小鼠发现：MiwiRNA最早出现于出生后12天(12dpp)，即偶线期精母细胞开始出现的时候，并在出生后14天(14dpp)开始大量出现。其表达一直持续到圆形精子细胞时期(Deng W，et al.miwi，a murine homolog of piwi，encodes acytoplasmic protein essential for spermatogenesis.Dev Cell，2002，2：819-830)。在Miwi基因Knockout的小鼠中，其精子发生被阻滞在圆形精子细胞期，同时不能生成长型精子细胞。 

然而尚没有关于Miwi基因组织特异性表达转录调控机制的研究。 

始于20世纪80年代初的转基因动物技术，是指通过重组DNA技术，将外源基因导入动物体内，外源基因稳定整合在染色体基因组上并传给下一代。用这种方法可建立转基因动物模型以研究外源基因在整体动物中的表达调控规律；可改变动物基因型使其表现型更符合人类需要，也可用转基因动物生产人类所需的生物活性物质。 

转基因动物自80年代初转基因小鼠的问世开始，转基因技术体系成为遗传学研究中继本世纪初的基因连锁分析、60年代的体细胞遗传和70年代的基因克隆之后第四代技术，推动了生命科学的发展。现在，转基因动物不单单是分子生物学中研究基因基本调控信息的重要工具，在器官移植、生物反应器和育种学上也起到越来越重要的作用。1985年Harmmer和Berm首次用显微注射技术获得1头转基因猪，其与同窝非转基因猪比较，生长速度显著提高，饲料利用率提高17％，胴体脂肪明显减少。2004年，日美联手利用基因工程手段培育出对疯牛病(牛海绵状脑病，BSE)具有免疫力的牛，这种转基因牛不携带普里昂蛋白或其他传染性蛋白。越来越多的转基因经济动物表明转基因将成为人类培育新型高效生产力经济动物的重要手段。 

随着转基因技术在科研、医疗、畜牧业、农业等领域中越来越广泛的应用，对指导外源基因在体内表达的启动子元件的要求也越来越高，迫切需要开发各类组织特异性表达的启动子，而不是在体内广谱表达的启动子。 

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠Miwi启动子，该启动子能够驱动目的基因在雄性生殖细胞中特异表达；本发明提供的小鼠Miwi启动子为研究生殖相关的基因功能提供方便，并为建立基因治疗技术以治疗男性不育等疾病提供了手段。 

本发明的另一个目的是提供含有小鼠Miwi启动子的载体和宿主细胞。 

本发明的再一个目的是提供小鼠Miwi启动子的用途。 

在本发明的第一方面，本发明人鉴定出小鼠Miwi基因的转录起始位点。在图1.A中详细列出了小鼠Miwi基因全基因序列和功能位点，方框表示的A即为转录起始位点，该位置记为+1，本发明中所有相关序列的位置都是相对该转录起始位点的相对位置，按照以下方法确定其相对位置，本发明确定的转录起始位点为+1，其5’上游的核苷酸依次为-1，-2，-3，……，3’端下游核苷酸依次为+2，+3，+4，……。 

在本发明中，发明人提供了一种分离的小鼠Miwi启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

较佳的，该启动子核酸序列在 

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中-97～-93区域为五个核苷酸CCAAT组成的序列，且在 

(2)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中-82～-77区域为六个核苷酸CACGTG组成的序列。 

在-97～-93区域的CCAAT五个核苷酸是转录因子NFY结合的CCAAT box，在-82～-77区域的CACGTG六个核苷酸是转录因子USF结合的E box。 

在本发明的第二方面，提供一种载体，该载体含有小鼠Miwi启动子，其启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

在另一优选例中，提供的载体还含有由Miwi启动子驱动的目的基因，更佳的，目的基因是荧光素酶基因或荧光蛋白基因。 

在本发明的第三方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有所述的载体。 

在本发明的第四方面，提供小鼠Miwi启动子的用途，所述的启动子可驱动目的基因在细胞中表达的应用。较佳的，目的基因是荧光素酶基因或荧光蛋白基因。 

在另一优选例中，所述的启动子驱动目的基因在雄性生殖细胞中从粗线期精母细胞到圆形精子细胞时期特异表达中的应用。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

本发明的优点在于： 

提供了一种新的，驱动目的基因在细胞中特异表达启动子。本发明的启动子可以指导外源基因在小鼠精子发生过程中从粗线期精母细胞时期到圆形精子细胞时期特异表达。为利用转基因技术研究雄性生殖提供了手段，同时该技术也能够应用于条件性基因敲除中，指导cre重组酶在粗线期精母细胞到圆形精子细胞特异表达，从而特异的敲除这类细胞中的基因。为进一步研究人类男性生殖，治疗男性不育等疾病奠定了基础。 

附图说明

图1.确定Miwi基因启动子转录起始位点的序列及电泳图 

(A)方框所示A为本实验确定的转录起始位点，标记为+1TSS，MIWIGSP1和MIWIGSP2分别为5RACE引物。 

(B)第1道为DNA marker，第2道为第一轮RACE产物的PCR电泳图，第3道为RACE巢式PCR电泳图。 

图2.Miwi基因启动子驱动荧光素酶基因表达载体的构建示意图 

图3.不同长度Miwi启动子驱动荧光素酶基因表达载体转染宿主细胞的荧光素酶活性柱状图 

黑色柱状为转染COS 7细胞，灰色柱状为转染GC-1细胞， 

横坐标为相对荧光素酶活性。 

图4.Miwi启动子突变载体的荧光素酶活性柱状图 

左侧方框和圆圈分别代表ccaat box和E box，空心为野生型，实心为突变型；黑色柱状为转染COS 7细胞的结果，灰色柱状为转染GC-1细胞的结果，pGL3-Basic为阴性对照，横坐标为相对荧光素酶活性。 

图5.构建Miwi基因启动子驱动EGFP表达的转基因载体示意图 

图6.Miwi基因启动子驱动EGFP表达载体转染细胞荧光图 

A为COS 7经蓝光激发的绿色荧光照片，B为COS 7细胞的明场照片。 

图7.Miwi-EGFP转基因小鼠F1代小鼠睾丸切片的荧光图 

A为4#转基因小鼠F1代雄性小鼠睾丸切片荧光照，B为9#转基因小鼠F1代雄性小鼠睾丸切片荧光照。 

图8.Miwi-EGFP转基因小鼠多种组织切片的荧光图，及各组织中检测EGFP蛋白存在的western blot图。 

(A)a，c，e，g，i，k分别为蓝光激发转基因小鼠睾丸、心、肝、脾、肺、肾组织切片的荧光照片；b，d，f，h，j，1分别为a，c，e，g，i，k对应的明场照片； 

(B)western blot检测小鼠睾丸、心、肝、脾、肺、肾组织中EGFP蛋白的存在；1，2，3，4，5，6，分别表示小鼠睾丸、心、肝、脾、肺、肾的蛋白样品，beta-actin为对照。 

图9.Miwi-EGFP转基因小鼠睾丸切片免疫组化图 

A，B，E分别为用anti-Miwi抗体检测内源性Miwi的表达，用anti-EGFP抗体检测转基因小鼠中EGFP的表达，用anti-EGFP抗体检测正常小鼠中EGFP的表达；C，D，F分别为A，B，E的放大，相对于A，B，E中小方框的部分；SG代表精原细胞，SE代表支持细胞，PSC代表粗线期精母细胞，RS代表圆形精子细胞，ES代表长形精子细胞。 

具体实施方式

本发明人经过深入客观的研究，首次从小鼠基因组中分离到一种核酸，该核酸位于小鼠Miwi基因的上游，将其作为启动子元件，可以指导目的基因的表达。所述的核酸包含了指导Miwi基因在小鼠雄性生殖细胞中从粗线期精母细胞到圆形精子细胞特异表达所需的调控元件，从而可用于研究小鼠精子发生过程中特定基因的表达调控机制及其功能。在此基础上完成了本发明。 

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子元件”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够指导核酸序列转录为mRNA。一般的启动子或启动子元件提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它转录 因子识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子元件包括启动子的变体，通过定点突变等来获得。 

启动子及其指导的基因表达 

本发明人在研究过程中，首次从小鼠Miwi基因的上游克隆到一段可良好地指导外源基因表达的启动子核酸序列，利用该启动子来指导报告基因的表达，可良好地模拟小鼠Miwi基因的内源表达情况。在本发明的实施例中，本发明人证明了利用所述的启动子指导EGFP的表达能够完全模拟内源Miwi的表达，说明该段核酸序列包含了指导Miwi在小鼠精子发生过程中从粗线期精母细胞到圆形精子细胞时期特异表达所需的所有调控元件，从而改变了目前现有技术中具体体内对Miwi基因有调控作用的核酸序列未知的现状。 

因此本发明提供一种分离的启动子核酸序列，所述的核酸具有SEQ ID NO：1所示的序列，所述的核酸可作为指导目的基因表达的启动子元件。 

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源的。所述的目的基因通常可以是一种结构性核酸序列；所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要性或功能的蛋白；或者所述目的基因是在转录或表达后可以发挥指示作用的基因，如报告基因。 

例如所述的目的基因包括但不限于：荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因。 

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来表达白喉毒素，人工构建的锌指核酸酶，cre重组酶等。 

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列为该基因的siRNA。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。 

本发明的启动子和目的基因序列可被构建到新的重组载体中。 

所述的重组载体一般包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因，如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其他非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增 强子或操纵子。 

用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。属于“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞、病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定存在，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是真核表达载体。 

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外DNA重组技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，所述的标记基因如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、新霉素抗性等。 

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其他启动子。所述的其他启动子例如是：组织特异性的、组成性的或诱导型的。 

作为本发明的实例，所述的载体是pGL3-Basic，其本身含有编码荧光素酶基因的序列。通过改造，即利用pGL3-Basic上的多克隆位点，可将本发明的启动子区域构建到荧光素酶编码基因的5’端，转化宿主细胞，启动子将激活荧光素酶基因的表达，所述启动受到启动子各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。 

作为本发明的实例，所述的载体是pEGFP-1，其本身含有编码绿色荧光蛋白基因的序列。通过改造，即利用pEGFP-1上的多克隆位点，可将本发明的启动子区域构到绿色荧光蛋白编码基因的5’端，转化宿主细胞，启动子将激活绿色荧光蛋白基因的表达，所述启动受到启动子各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。 

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，或转化入受精卵或胚胎内，以使其能够表达蛋白。 

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，动物细胞等。受精卵可以是两栖类动物的受精卵或胚胎，如非洲爪蟾的受精卵或胚胎。 

作为本发明的实例，所述的宿主细胞为GC-1或COS 7细胞。GC-1为小鼠精 原细胞系，COS 7是来源于非洲绿猴肾成纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞系。 

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核生物如大肠杆菌时，使用CaCl₂制备感受态细胞，所用的步骤在本领域众所周知。当宿主细胞为真核细胞时，可使用脂质体转染法等。 

制备转基因小鼠的原核注射、胚胎移植等方法也是本领域已知的。 

在本发明的实例中，在所述的启动子指导下，可以使荧光素酶(Luciferase)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因良好的表达。因此可见，本发明的启动子在基因转录调控的研究中具有重要的应用价值。 

在本发明的实例中，利用所述的启动子指导绿色荧光蛋白表达的载体制备转基因小鼠，结果表明，所述的启动子可以指导的EGFP的表达模式与内源的Miwi基因的表达模式非常相似，这说明本发明人得到的Miwi基因启动子中包含了指导Miwi基因在小鼠雄性生殖细胞中从粗线期精母细胞到圆形精子细胞时期特异表达所需的所有重要顺式作用元件。 

本发明的优点在于： 

提供了一种新的，驱动目的基因在细胞中特异表达启动子。本发明的启动子可以指导外源基因在小鼠精子发生过程中从粗线期精母细胞时期到圆形精子细胞时期特异表达。为利用转基因技术研究雄性生殖提供了手段，同时该技术也能够应用于条件性基因敲除中，指导cre重组酶在粗线期精母细胞到圆形精子细胞特异表达，从而特异的敲除这类细胞中的基因。为进一步研究人类男性生殖，治疗男性不育等疾病奠定了基础。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 

实施例1.5’RACE确定小鼠Miwi基因启动子转录起始位点 

首先制备小鼠睾丸SMART cDNA，其步骤包括： 

(1)cDNA第一链的合成： 

A、向0.5ml的EP管中加入：3μl RNA样品，1μl SMARTⅣ引物，1μlCDSⅢ引物，补水至总体系5μl； 

B、混匀，72℃，孵育2分钟，冰上冷却2分钟，离心将液体离至管底； 

C、加入以下试剂： 

2.0μl 5×第一链缓冲液 

1.0μl DTT(20mM) 

1.0μl dNTP混合物(各10mM) 

1.0μl PowerScriptTMRT逆转录酶 

D、轻轻混匀，离心，42℃水浴中孵育2小时； 

E、加1μlNaOH使反应终止，产物保存于-20℃； 

(2)SMART cDNA的引物延伸合成： 

A、在0.5ml的EP管中加入以下成份： 

11μl    第一链cDNA 

71μl    水 

10μl   10×Advantage 2PCR Buffer 

2μl    50×dNTP Mix 

2μl    10mM 5’PCR Primer/SMARTⅣ 

2μl    10mM CDSⅢ/3’PCR Primer 

2μl    50×Advantage 2 Polymerase Mix 

B、按以下程序进行引物延伸 

72℃，10分钟→95℃1分钟→按以下条件进行3-10个循环：95℃15秒，68℃8分钟； 

C、反应结束后，取5μl产物，电泳检测；产物保存于-20℃； 

(3)5’-RACE： 

5’-RACE所用引物如下： 

MIWIGSP1(SEQ ID NO：2)5′CTGATCGTCGTGGTCCAGCA3′ 

MIWIGSP2(SEQ ID NO：3)5′CCAGTCAGCTCAGGTGTTCA3′ 

SMARTⅣ引物(SEQ ID NO：4) 

5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′ 

5’-RACE反应体系如下： 

10×PCR buffer                2.5μl 

25mM MgCl2                    1.5-2.0μl 

SMARTⅣ引物(10μM)                1μl 

MIWIGSP2(5μM)                    1μl 

dNTP(各2mM)                       2μl 

SMART cDNA                        1μl 

Taq酶(2U/μl)                     0.5μl 

去离子水                          15.0-15.5μl 

扩增条件：94℃，5分钟，然后开始循环(94℃，30秒→65℃，40秒→72℃，120秒)共34个循环，72℃延伸5分钟，PCR结束后，取5μl的PCR产物电泳检测； 

(4)Nest-5’-RACE： 

Nest-5’-RACE反应体系如下： 

10×PCR buffer                    2.5μl 

25mM MgCl2                        1.5-2.0μl 

SMARTⅣ引物(10μM)                1μl 

MIWIGSP1(5μM)                    1μl 

dNTP(各2mM)                       2μl 

稀释10倍的5’RACE产物             1μl 

Taq酶(2U/μl)                     0.5μl 

去离子水                          15.0-15.5μl 

扩增条件：94℃，5分钟，然后开始循环(94℃，30秒→65℃，40秒→72℃，9秒)共34个循环，72℃延伸5分钟，PCR结束后，取5μl的PCR产物电泳检测。 

通过5’RACE实验确定小鼠Miwi基因启动子转录起始位点在基因组上位于Miwi基因编码区起始密码子上游2871bp的腺嘌呤A上。如图1，+1TSS为本发明确认的转录起始位点。在图1.A中列出了小鼠Miwi基因转录起始位点附近的基因组序列及5’RACE所用引物在基因组上的相对位置，方框表示的A即为转录起始位点，该位置记为+1，本发明中所有相关序列的位置都是相对该转录起始位点的相对位置，按照以下方法确定其相对位置，本发明确定的转录起始位点为+1，其5’上游的核苷酸依次为-1，-2，-3，……，3’端下游核苷酸依次为+2，+3， +4，……。在图1.A中MIWIGSP1，和MIWIGSP2分别为5RACE引物，Intron1表示第一个内含子，其长度为1094bp；Intron2表示第二个内含子，其长度为1517bp；方框所示ATG为Miwi基因编码区的起始密码子。在图1.B中，为5RACE PCR产物的电泳图，第1道为DNA marker，第2道为第一轮RACE产物的PCR电泳图，其大小为300bp左右，第3道为RACE巢式PCR产物电泳图，其大小为200bp左右。本发明将第3道RACE巢式PCR产物克隆到T-easy载体中，并进行测序，证明Miwi基因转录起始位点在基因组上位于Miwi基因编码区起始密码子上游2871bp的腺嘌呤A上，即图1.A中方框A所示。 

实施例2.Miwi基因启动子驱动荧光素酶基因表达载体的构建 

使用带有MluI酶切位点的5′端引物5M1(SEQ ID NO：5)(5’-CCGACGCGTTCATCTGCAGTGGGTTTTGGCAC-3’)，5M2(SEQ ID NO：6)(5’-CCGACGCGTGCCACCATTGAGTGAGGAGGATT-3’)，5M3(SEQ ID NO：7)(5’-CCGACGCGTCCAAGAAGAATGGGGCTTGG-3’)，5M4(SEQ ID NO：8)(5’-CCGACGCGTCACAAA ACCGCCACCCACGTG-3’)，5M5(SEQ ID NO：9)(5’-CCGACGCGTACGTGGCAGCCAATCAGGGC-3’)，5M6(SEQ ID NO：10)(5’-CCGACGCGTCAGGGCCCAGCACGTGTCCA-3’)，5M7(SEQ ID NO：11)(5’-CCGACGCGTTCCACCTCGCCGTTAACCCA-3’)，5M8(SEQ ID NO：12)(5’-CCGACGCGTAGGGATCTGGCAGTTGGGGCTGT-3’)分别与带有HindIII位点的3′端引物3H(SEQ ID NO：13)(5’-CCCAAGCTTCCTGATCGTCGTGGTCCAGC-3’)搭配，以KM小鼠鼠尾基因组DNA为模板，分别扩增出-469～+179；-208～+179；-168～+179；-124～+179；-108～+179；-94～+179；-78～+179；-13～+179的Miwi基因5′端侧翼区；PCR体系如下： 

PCR程序：94℃5min，94℃ 30s→66℃ 30s→72℃1min共进行35个循环，最后72℃5min，4℃保存。 

将上述PCR片段使用MluI/HindIII双酶切，酶切产物经过U-gene胶回收试剂盒回收，再将8个5M片段定向克隆到pGL3-basic vector(Promega)中，分别命名为pGL3-5M1；pGL3-5M2；pGL3-5M3；pGL3-5M4；pGL3-5M5；pGL3-5M6；pGL3-5M7；pGL3-5M8。所有重组质粒均经限制性内切酶酶切鉴定和测序确认，如图2所示，5M1(-467～+181)，5M2(-206～+181)，5M3(-166～+181)，5M4(-122～+181)，5M5(-106～+181)，5M6(-92～+181)，5M7(-76～+181)，5M8(-11～+181)分别为不同长度的Miwi启动子片段，其5’带有MluI酶切位点，3’带有HindIII酶切位点，通过MluI与HindIII双酶切再与MluI与HindIII双酶切的pGL3-basic载体连接，构建出Miwi基因启动子驱动荧光素酶基因表达的载体。 

实施例3.不同长度Miwi启动子驱动荧光素酶基因表达载体转染细胞 

分别将质粒pGL3-5M1；pGL3-5M2；pGL3-5M3；pGL3-5M4；pGL3-5M5；pGL3-5M6；pGL3-5M7；pGL3-5M8与内参pRT-TK共转染COS 7和GC-1细胞，并测定荧光素酶活性，结果如图3所示。5M1(-467～+181)，5M2(-206～+181)，5M3(-166～+181)，5M4(-122～+181)，5M5(-106～+181)，5M6(-92～+181)，5M7(-76～+181)，5M8(-11～+181)分别表示不同长度的Miwi基因启动子片段连接荧光素酶报告基因的载体，数字表示该片段相对与本发明确定的转录起始位点的位置，转录起始位点为+1。pGL3-Basic为阴性对照。棕色柱状图为转染COS 7细胞的结果，蓝色柱状图为转染GC-1细胞的结果。结果显示：在GC-1细胞系和COS 7细胞系中，5M1～5M5都能驱动荧光素酶基因的表达，而5M6～5M8几乎不能驱动荧光素酶基因的表达，说明在引物5M5与5M6之间，即-106～-92之间存在对Miwi启动子转录活性不可缺少的转录因子结合位点。5M5片段即-106～+181为Miwi基因的 核心启动子。 

实施例4.在核心启动子区域进行点突变确定对转录活性具有重要影响的转录因子结合位点的确定 

为了对核心启动子区域重要转录因子结合位点进行验证，我们以pGL3-5M4构建了CCAAT box、第一个E box(以下简称E1 box)、第二个E box(以下简称E2 box)的突变载体以及E1 box和E2 box双突变的载体，分别命名为pGL3-5M4-Cmut、pGL3-5M4-E1mut、pGL3-5M4-E2mut、pGL3-5M4-E1/E2mut。构建突变的引物序列如下表： 

突变载体名称            构建该突变载体所用的引物 

pGL3-5M4-Cmut     (SEQ ID NO：14) 

5’-CCACCCACGTGGCAGTTCCTCAGGGCCCAGCACG-3’ 

(SEQ ID NO：15) 

5’-CGTGCTGGGCCCTGAGGAACTGCCACGTGGGTGG-3’ 

pGL3-5M4-E1mut    (SEQ ID NO：16) 

5’-ACAAAACCGCCACCTCTAGTGCAGCCAATCAGGG-3’ 

(SEQ ID NO：17) 

5’-CCCTGATTGGCTGCACTAGAGGTGGCGGTTTTGT-3’ 

pGL3-5M4-E2mut    (SEQ ID NO：18) 

5’-CAATCAGGGCCCAGTCTAGTTCCACCTCGCCGTT-3’ 

(SEQ ID NO：19) 

5’-AACGGCGAGGTGGAACTAGACTGGGCCCTGATTG-3’ 

pGL3-5M4-E1/E2mut    构建pGL3-5M4-E1/E2mut突变载体时以pGL3-5M4-E1mut为模板，利用pGL3-5M4-E2mut的突变引物进行二次突变。 

构建突变载体的PCR反应体系： 

构建突变载体的PCR反应条件：94℃，5分钟，然后进行(94℃，40秒→60℃，1min→68℃，5min)共18个循环，最后72℃延伸10分钟。 

PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃水浴孵育1小时。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，挑克隆鉴定突变重组子。 

将构建好的突变质粒分别转染GC-1和COS 7细胞，同时转入pRT-TK质粒作为内参，24个小时之后测定荧光素酶的活性，通过计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值，分析突变后启动子的活性。见图4，5M4(-122～+181)为野生型Miwi启动子连荧光素酶报告基因的载体，CCAAT mut为5M4上ccaat(-97～-93)突变为ttcca的突变载体，E1mut为5M4上cacgtg(-107～-102)突变为tctagt的突变载体，E2mut为5M4上cacgtg(-82～-77)突变为tctagt的突变载体，E1/E2mut为5M4上cacgtg(-107～-102)突变为tctagt，同时cacgtg(-82～-77)突变为tctagt的突变载体。数字表示该片段相对与本发明确定的转录起始位点的位置。pGL3-Basic为阴性对照。左侧方框和圆圈分别代表ccaatbox和E box，空心为野生型，实心为突变型。黑色柱状为转染COS 7细胞的结果，灰色柱状为转染GC-1细胞的结果。横坐标为相对荧光素酶活性。 

结果表明：CCAAT box突变之后，与pGL3-5M4相比，其启动子活性降低了60％左右；E1box突变之后，对其启动子活性没有任何影响；而E2box突变之后，pGL3-5M4的启动子活性几乎完全丧失。 

实施例5构建Miwi基因核心启动子驱动EGFP表达的转基因载体 

使用5’端引物pmiwi5E(SEQ  ID  NO：20)(5’-CCGGAATTCCACAAAACCGCCACCCACGTG-3’)，和3’端引物p miwi3B(SEQ ID NO：21)(5’-GTTGGATCCCCTGATCGTCGTGGTCCAGC-3’)，以KM小鼠鼠尾基因组DNA为模板，扩增出Miwi基因启动子-122～+181区域。 

PCR体系如下： 

PCR程序：94℃5min，94℃30s→66℃30s→72℃1min共进行35个循环，最后72℃5min，4℃保存。 

将上述PCR片段使用EcoRI/BamHI双酶切，胶回收，T4连接酶连入经EcoRI/BamHI双酶切的pEGFP-1载体中，命名为pMiwi-EGFP，如图5，将-122～+181(相对与本发明确定的Miwi基因转录起始位点)区域共303bp的Miwi基因启动子区域克隆到pEGFP-1载体的EcoRI与BamHI酶切位点之间，该303bp的Miwi启动子序列包括位于-97～-93区域(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第26到第30个碱基)的CCAAT box，和位于-82～-77区域(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第41到第46个碱基)的E2 box。+1显示本研究中所确定的转录起始位点。 

使用HindIII线性化pMiwi-EGFP，纯化回收，用作制备转基因小鼠的载体。 

实施例6.Miwi基因启动子驱动EGFP表达载体转染细胞 

将所构建的Miwi启动子(-122～+181)驱动EGFP表达的转基因表达载体转染COS 7细胞进行验证。如图6，A为COS 7经蓝光激发的绿色荧光照片，B为COS 7细胞的明场照片。结果表明在COS 7细胞中，Miwi启动子(-122～+181)可以驱动外源基因EGFP的表达。 

实施例7.制备转基因小鼠，并检测EGFP的表达 

以HindIII线性化的Miwi-EGFP，通过原核注射制备转基因小鼠。共得到两个阳性小鼠(4#和9#)。 

如图7，A为4#转基因小鼠F1代雄性小鼠睾丸切片荧光照，B为9#转基因小鼠F1代雄性小鼠睾丸切片荧光照。通过对4#和9#转基因小鼠F1代小鼠睾丸切片的荧光观察发现，4#和9#转基因小鼠F1代的睾丸中都有绿色荧光蛋白的存在，并且只存在与曲精小管中。 

进一步的荧光观察和western blot实验证明，在4#和9#小鼠的其它组织中没有EGFP蛋白的存在，如图8.A，a，c，e，g，i，k分别为蓝光激发转基因小鼠睾丸、心、肝、脾、肺、肾组织切片的荧光照片；b，d，f，h，j，1分别为a，c，e，g，i，k对应的明场照片。其中只有睾丸组织中观察到绿色荧光。如图8.B，western blot检测小鼠睾丸、心、肝、脾、肺、肾组织中EGFP蛋白的存在。1，2，3，4，5，6，分别表示小鼠睾丸、心、肝、脾、肺、肾的蛋白样品，beta-actin为对照。结果显示只有睾丸中检测到EGFP的存在。 

由于转基因小鼠冰冻切片直接观察荧光很难区分EGFP表达的细胞类型，因此我们使用EGFP的抗体进行了转基因小鼠睾丸切片的免疫组化实验，如图9，A，B，E分别为用anti-MIWI抗体检测内源性Miwi的表达，用anti-EGFP抗体检测转基因小鼠中EGFP的表达，用anti-EGFP抗体检测正常小鼠中EGFP的表达；C，D，F分别为A，B，E的放大，相对于A，B，E中小方框的部分。SG代表精原细胞；SE代表支持细胞；PSC代表粗线期精母细胞；RS代表圆形精子细胞；ES代表长形精子细胞。内源性的Miwi蛋白从粗线期开始表达持续到圆形精子细胞时期(如图9A，C)，我们同样观察到MIWI启动子驱动的EGFP在粗线期到圆形精子细胞时期表达(如图9B，D)。 

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>小鼠Miwi启动子，其载体及应用

<130>小鼠Miwi启动子，其载体及应用

<160>21

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>303

<212>DNA

<213>mouse

<400>1

cacaaaaccg ccacccacgt ggcagccaat cagggcccag cacgtgtcca cctcgccgtt    60

aacccagagg tctgtggagg tagctcggcc gaggcctggg cggtggggcg gagggatctg    120

gcagttgggg ctgttagcag gtgccgcagc aggtgcagca gcagtgcgag gtggtggcag    180

cccctgcgcc cgcgagaagc ctgctgcagg gggtggcgtg aggagcctca gggactgcgg    240

acctaagcgt gctaagcacg gggccaggat aggactggac gctgctggac cacgacgatc    300

agg                                                                  303

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ctgatcgtcg tggtccagca                        20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ccagtcagct caggtgttca                        20

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggg   39

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

ccgacgcgtt catctgcagt gggttttggc ac          32

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

ccgacgcgtg ccaccattga gtgaggagga tt          32

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ccgacgcgtc caagaagaat ggggcttgg              29

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

ccgacgcgtc acaaaaccgc cacccacgtg    30

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

ccgacgcgta cgtggcagcc aatcagggc     29

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

ccgacgcgtc agggcccagc acgtgtcca     29

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

ccgacgcgtt ccacctcgcc gttaaccca     29

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>mouse

<400>12

ccgacgcgta gggatctggc agttggggct gt 32

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>mouse

<400>13

cccaagcttc ctgatcgtcg tggtccagc             29

<210>14

<400>14

000

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

cgtgctgggc cctgaggaac tgccacgtgg gtgg       34

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

acaaaaccgc cacctctagt gcagccaatc aggg       34

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

ccctgattgg ctgcactaga ggtggcggtt ttgt       34

<210>18

<400>18

000

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

aacggcgagg tggaactaga ctgggccctg attg    34

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

ccggaattcc acaaaaccgc cacccacgtg         30

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

gttggatccc ctgatcgtcg tggtccagc          29

Claims (5)

1.一种小鼠Miwi启动子，其特征在于，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含有权利要求1所述启动子的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，该载体还含有由所述启动子驱动的目的基因。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述目的基因为荧光蛋白基因或荧光素酶基因。

5.一种用权利要求2、3或4所述的任何一种载体转化的宿主细胞。

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