CN103421786A - 鼠肌肉分化时期特异性表达基因启动子的克隆与应用 - Google Patents

Abstract

鼠肌肉分化时期特异性表达基因启动子的克隆与应用。本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种鼠肌肉分化时期特异性表达基因的启动子的克隆与应用。所述的启动子由Mylpf基因克隆得到，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。在该序列的第410位、430位、454位、499位和1135位含有MyoD的结合位点，使该基因在肌肉分化时期表达量较高。本发明公开了获得上述启动子序列的制备和启动效率的检测方法，为调控基因在鼠肌肉中表达提供了一个新的诱导型启动子。

Description

鼠肌肉分化时期特异性表达基因启动子的克隆与应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种鼠肌肉分化时期特异性表达基因的启动子序列的克隆与应用。

背景技术

我国是世界上最大的生猪养殖和猪肉消费国，在国内的肉类食品消费结构中，猪肉的消费量位居第一。近年来，现代育种技术在改良猪肉生产方面做出了很大贡献，但是猪肉的产量仍然不能满足国民需求。由于猪肉的遗传改良需要清晰的遗传背景，需要对猪的骨骼肌发育机理有明确的认识，因此，研究猪骨骼肌生长发育机制，已经成为一个重要的研究领域。

肌肉的发育可分为四个阶段：第一阶段是中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cells)分化形成单核的成肌细胞(myoblast)；第二阶段是成肌细胞相互融合形成多核的肌管(myotube)；第三阶段是肌管分化形成肌纤维(myofiber)；第四阶段是肌纤维的生长发育成熟。胚胎期时，基本完成肌肉发育的前三个阶段，出生之后，肌纤维的数目基本不变，肌肉的生长主要依赖于肌细胞的肥大(赵晓等，猪骨骼肌生长发育研究进展，生命科学，2011，23：37-44)。研究猪骨骼肌发育机制时，由于缺乏猪肌肉相关的商品化细胞系，所以多采用小鼠肌细胞系C2C12细胞，本发明也使用该细胞系进行研究。C2C12细胞是小鼠成肌细胞，用于研究myoblast发育至myotube过程的成肌细胞的分子机制。在骨骼肌发育的过程中，研究最多的是生肌调节因子家族(myogenic regulatory factors，MRFs)和肌细胞增强因子家族(MEF2)在肌肉发育过程中的作用。生肌调节因子家族是含有螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)结构的转录因子(Bryson Richardson RJ et al.The genetics of vertebrate myogenesis.Nat Rev Genet，2008，9(8)：632-46)，主要由四个成员组成，包括：myogenic differentiationl(MyoD)、myogenic factor5(Myf5)、myogenin(MyoG)和MRF4(Myf6)。这四个转录因子中，Myf5和MyoD最先表达，决定成肌(Rudnicki MA，et al.MyoD or Myf-5 is required for the formation of skeletal muscle.Cell，1993，75(7)：1351-1359)，MyoG和Myf6在Myf5和MyoD的下游表达，影响肌肉分化(HastyP，et al.Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogeningene.Nature，1993，364(6437)：501-506)。MEF2基因家族与MRFs基因家族之间存在相互作用，一般是通过协同作用调控肌肉发育相关基因的激活(Naya FJ，et al.MEF2：a transcriptionaltarget for signaling pathways controlling skeletal muscle growth and differentiation.Curr Opin CellBiol，1999，11(6)：683-688)。

本发明前期，收集分化天数为0d、1d、2d和4d的C2C12细胞，送至公司测序后分析差异表达基因，结果显示Mylpf基因在增殖时期低表达，分化时期高表达，且差异显著。Mylpf基因是肌球蛋白轻链，简清等研究者克隆了斑马鱼肌球蛋白轻链启动子，获得了肌肉特异性表达绿色荧光蛋白的斑马鱼(简清等，斑马鱼Mylz2启动子的克隆与转绿色荧光蛋白基因鱼的构建，中国水产科学，2004，11：391-395)；Michael J McGrew等研究者也发现Mylpf基因在肌肉组织特异表达(Michael J McGrew，et al.Functional conservation between rodents and chicken ofregulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens，BMCDevelopmental Biology，2010，10)，研究结果显示，Mylpf是肌肉组织特异表达基因。基于前人的研究与实验芯片数据结果，本发明从NCBI中下载其序列，生物信息学分析5′-UTR，预测出5个MyoD(成肌分化抗原)的结合位点，推测Mylpf基因不仅是肌肉特异表达，而且是肌肉分化时期表达的基因。因此，本发明克隆Mylpf基因的部分5′-UTR区，构建肌肉分化诱导型启动子，为调控基因在鼠肌肉中表达提供了材料。

发明内容

本发明的目的在于寻找鼠肌肉分化时期表达的Mylpf基因的启动子，克隆肌肉分化诱导表达的启动子，利用该启动子调节基因在鼠肌肉中的表达。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人根据技术流程克隆得到鼠基因Mylpf的启动子，片段长度为1498bp。通过PCR方法扩增Mylpf基因启动子序列的引物的DNA序列如下所示：

正向引物：5′-CattaatGACTAAAGGCCACCGCTGAACC-3′，

反向引物：5′-TAaccggtGGGATGCAAGTCTCGTTAGGAC-3′。

本发明所述的启动子的制备方法是：

生物信息学预测Mylpf基因的启动子区域，并进行注释；提取鼠C2C12细胞的DNA，扩增Mylpf基因的启动子，PCR产物纯化后克隆于pEGFP-C1(见图2)载体上，测序后获得pEGFP-C1-Mylpf的重组载体；转染重组载体于C2C12细胞，分化后用荧光显微镜检测启动效率。即在pEGFP-C1载体基础上，通过改造形成pEGFP-C1-Mylpf载体。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的鼠肌肉分化时期特异性表达基因启动子序列(序列表中第1至1564位所示的序列)。

图1发明内容技术流程示意图。根据启动子质粒载体构建方法标准，采用分子克隆与细胞生物学检测相结合的方式，通过荧光蛋白GFP肌细胞分化特异性表达最终确证本发明内容构建的启动子具有肌肉分化特异性表达特征。

图2启动子载体模式图。在pEGFP-C1质粒载体基础上(见图2A)，通过双酶切方式将本发明启动子序列克隆至载体替换原有CMV启动子序列，形成本发明的启动子质粒载体

pEGFP-C1-Mylpf(见图2B)，通过肌细胞分化特异性启动绿色荧光蛋白GFP的条件性表达。整个质粒载体5.6kb，具有卡那霉素筛选标记。

图3启动子PCR产物电泳图。经过分子克隆，采用上游引物带Ase I酶切位点和下游引物带Age I酶切位点的常规PCR扩增，扩增产物大小1498bp，经琼脂糖电泳检测表明，PCR产物大小符合预期。第一泳道为DNA marker DL2000，第二泳道为PCR产物。

图4启动子核苷酸序列分析图谱。整个启动子序列长度约1.5kb，具有5个肌细胞分化特异性转录因子MyoD(成肌分化抗原)的结合位点(粗体且下划线标记)，第一外显子位于整个序列的末端(斜体，粗体ATG为翻译起点)，本发明启动子序列位于第一外显子上游1.5kb处。

图5启动子载体细胞学效应鉴定。通过脂质体Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)转染本发明的启动子质粒载体pEGFP-C1-Mylpf到小鼠肌细胞系C2C12中，采用条件培养基(DMEM+2％HS)使细胞分化4天后，形成明显肌管(见图5A)，通过荧光检测，肌管高表达绿色荧光蛋白(见图5B)，启动子正常发挥功能。

具体实施方式

实施实例1

(一)MyIpf基因启动子序列的克隆

(1)引物设计

从NCBI上下载鼠Mylpf基因(GenBank收录号：NC_000073.6)的序列，分析5′-UTR区域，并用MyoD的motif预测转录因子结合位点，分析可能的启动子区域。

克隆Mylpf基因启动子引物的DNA序列如下所示：

正向引物：5′-CattaatGACTAAAGGCCACCGCTGAACC-3′，

反向引物：5′-TAaccggtGGGATGCAAGTCTCGTTAGGAC-3′。

(2)PCR产物的纯化、克隆

PCR扩增条件：10μL的反应体系中加入DNA模板0.3μL，10mM引物前后各0.3μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa)0.2μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer 2μL，dNTP Mixture 0.8μL，双蒸水6.1μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min30s，35个循环，68℃终止延伸5min，15℃冷却2min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(见图3)。

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，用凝胶回收试剂盒(购自北京天根公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在胶块中加入等倍体积溶液PC(凝胶为0.1g，其体积视为100μL)，于65℃温育至凝胶完全融化，然后将溶液转移至吸附柱的离心管中，12,000rpm离心1min，除去离心管内溶液，再向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心1min，除去废液，重复此操作一次，之后12,000rpm空离心2min，将吸附柱置于室温至乙醇挥发完全后，加入30μL洗脱缓冲液，静置2min，12,000rpm离心2min，以洗脱DNA于Ependorff管中。

酶切回收：取5μL回收后产物，加入0.7μL限制性内切酶Ase I、0.7μLAge I和相应的10×Buffer O缓冲液(购自Fermentas公司)，并用H₂O补至20μL，另取0.8μLpEGFP-C1载体，加入0.7μL限制性内切酶Ase I、0.7μLAge I和相应的10×Buffer O缓冲液，并用H₂O补至20μL，于37℃酶切6h。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用凝胶回收试剂盒回收。

连接反应：取回收的酶切产物6μL与pEGFP-C1 2μL混合，并加入10×LONG LigationBuffer(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa)5μL，补水至49μL，65℃保温3min，冰上急冷，再加入DNA Ligase＜LONG＞1μL，置16℃水浴过夜。

转化：无菌状态下取30μL感受态细胞(购自全式金公司)于1.5mL Ependorff管中，将3μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入370μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。低速离心后去除370μL的溶液，然后悬浮沉淀并将其涂布于含有Kan+抗生素的LB固体培养基上，37℃平放1h后倒置培养。

单菌落检测与测序：挑取平板上的单菌落，接种于1mL LB液体培养基中，37℃ 300r/min培养6-8h。以菌液为模板，按照上述PCR扩增体系扩增启动子序列，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性菌液送至Invitrogen公司测序。序列特征分析结果如图4所示。

质粒抽提：将测序结果与目的序列比对正确的相应菌液扩大培养，并用无内毒素质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)抽提质粒，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：将菌液转移到合适的离心管中，室温下5000rmp离心10min，去除上清后加入500μL Solution I(含RNase I)，然后将溶液分两份，分别转移至1.5mL Ependorff管中。每管加入250μL SolutionII，温和翻转后静置2-3min，再向其中加入250μL中和缓冲液，翻转后13,000rpm离心10min，转移上清至新的离心管中，分别加入70μL ETR，翻转后冰上孵育10min，然后再转移至42℃孵育5min后，13,000rpm离心3min，转移上清至新的离心管中，分别加入350μL无水乙醇，翻转后静置1-2min，然后将上述溶液转移到装配有mini columnII的收集管中，10,000rpm离心1min，重复操作至溶液转移完全。然后加入500μL Buffer HB溶液洗柱，10,000rpm离心1min，去除废液后加入700μL DNA Washing Buffer，10,000rpm离心1min洗柱，重复操作一次，13,000rpm空离心3min，将吸附柱置于室温至乙醇挥发完全后，加入60μL洗脱缓冲液，静置2min，13,000rpm离心1min，以洗脱DNA于Ependorff管中。

(二)MyIpf基因启动子启动效果的检测

(1)细胞复苏与培养

从液氮罐中取出含有C2C12细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)的培养瓶，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，不断摇动至解冻。用70％酒精擦拭消毒培养瓶后，在超净台上打开，将细胞悬液转移至离心管，补加10ml含10％胎牛血清(购自美国GIBCO公司)的DMEM高糖培养基(购自美国GIBCO公司)，吹打使细胞悬浮后低速离心5min去除上清，再加入培养基悬浮细胞，转移至培养皿中，放置37℃恒温培养箱中培养。每天更换培养基，并及时传代，待细胞状态良好时，转染构建的Mylpf基因(GenBank收录号：NC_000073.6)启动子的载体(pEGFP-C1-Mylpf)。

(2)转染启动子载体

6.3μL启动子载体、1.2μL pEGFP-C1分别与100μL OPTI-MEMI低血清培养基(购自Invitrogen公司)混合，并有100μL OPTI作为对照，12μL Lipofectamine 2000与300μL OPTI混合，放置5min，再向启动子载体(pEGFP-C1-Mylpf)、pEGFP-C1和对照中分别加入104μLLipofectamine 2000和300μL OPTI的混合溶液，混匀后放置20min。将培养皿中的培养基替换为OPTI，分别将相应孔中加入混合后的质粒。37℃恒温培养箱中培养5h后，重新更换培养基。

转染结束更换培养后，使用荧光显微镜采集图片，之后每天更换含2％马血清(购自美国GIBCO公司)的DMEM高糖培养基，并用荧光显微镜采集图片。在细胞分化至第四天，采集图片时，观察到转染启动子载体的细胞发出荧光，即启动子在鼠肌肉分化时期特异调控GFP基因的表达(见图5)。

Claims (3)

1.一种鼠肌肉分化时期基因Mylpf的特异性表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

2.克隆权利要求2所述启动子引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：CattaatGACTAAAGGCCACCGCTGAACC，

方向引物：TAaccggtGGGATGCAAGTCTCGTTAGGAC。

3.权利要求1所述的启动子在调控基因在鼠肌肉中表达的应用。

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