CN106957844A - 一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列 - Google Patents

一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列 Download PDF

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CN106957844A CN201710260974.7A CN201710260974A CN106957844A CN 106957844 A CN106957844 A CN 106957844A CN 201710260974 A CN201710260974 A CN 201710260974A CN 106957844 A CN106957844 A CN 106957844A
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Abstract

本发明公开一种有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA靶向序列及其应用，包括第一RNA正向序列、第二RNA正向序列、第一RNA反向序列和第二RNA反向序列；第一RNA正向序列与第一RNA反向序列彼此互补，分别包括如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示的序列；第二RNA正向序列与第二RNA反向序列彼此互补，分别包括如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示的序列。本发明的gRNA序列能够有效敲除HTLV‑1的病毒基因组，且能有效抑制ATL细胞的增殖和肿瘤的发生。

Description

一种能有效敲除HTLV-1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA 序列
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能有效敲除HTLV-1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列。
背景技术
成人T细胞白血病(adultT-cell leukemia，ATL)是由人类T淋巴白血病I型病毒(Human T cell lymphotropic virus，HTLV-1)感染所致的恶性淋巴系统增殖性疾病，目前其治疗与预后均没有理想的方案，严重威胁着人类的健康，我国HTLV-1感染高发区集中在闽台沿海地区。HTLV-1是第一个被发现的与人类疾病相关的逆转录病毒，潜伏期长达40年，当它感染宿主细胞后能够将其基因组会随机整合到宿主细胞染色体上，现有的治疗手段很难清除宿主内潜伏的病毒。
全球约有两千万余人感染HTLV-1，该病毒携带者广泛分布于全球五大洲，主要我国HTLV-1感染人群广泛分布在北京、安徽、四川、广东、福建、香港等十余个省市，但是集中流行于本项目申报所在地福建东南沿海与台湾地区。目前，国际上主要是通过CHOP疗法、allo-SCT疗法、AZT/IFN疗法、Anti-CCR等多种方案进行治疗。然而，这一系列的治疗方案并不能有效地清除HTLV-1，故而前期治疗后常引起HTLV-1二次感染，最终在短期导致病人淋巴瘤的再次发生，而HTLV-1相关疾病患者的平均生存时间也未能超过18个月的极限。基因编辑技术可以从源头上清除ATL细胞中HTLV-1，从源头上解决这一问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种能有效敲除HTLV-1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列。
本发明的另一目的在于提供上述gRNA序列的应用。
本发明的技术方案如下：
一种能有效敲除HTLV-1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列，包括第一RNA正向序列、第二RNA正向序列、第一RNA反向序列和第二RNA反向序列；第一RNA正向序列与第一RNA反向序列彼此互补，分别包括如SEQ ID NO 01和SEQ D NO 02所示的序列；第二RNA正向序列与第二RNA反向序列彼此互补，分别包括如SEQ D NO 03和SEQ ID NO 04所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一RNA正向序列如SEQ ID NO 01所示，第二RNA正向序列如SEQ ID NO 03所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一RNA反向序列如SEQ ID NO 02所示，第二RNA反向序列如SEQ ID NO 03所示。
上述gRNA序列进行HTLV-1病毒基因组敲除的方法，包括如下步骤：
(1)以HTLV-1病毒基因组LTR区域为靶点设计依次对应第一RNA正向序列、第二RNA正向序列、第一RNA反向序列和第二RNA反向序列的第一DNA正向序列、第二DNA正向序列、第一DNA反向序列和第二DNA反向序列，进行退火粘连，分别得第一退火片段和第二退火片段；
(2)将上述第一退火片段和/或第二退火片段与lentiCRISPRv2质粒连接后构建重组质粒；
(3)将上述重组质粒进行病毒载体包装，并感染整合HTLV-1前病毒基因组的宿主细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一DNA正向序列包括如SEQ ID NO 05所示的序列，所述第一DNA反向序列包括如SEQ ID NO 06所示的序列，所述第二DNA正向序列包括如SEQ ID NO 07所示的序列，所述第二DNA反向序列包括如SEQ ID NO 08所示的序列。
进一步优选的，所述第一DNA正向序列如SEQ ID NO 05所示，所述第一DNA反向序列如SEQ ID NO 06所示，所述第二DNA正向序列如SEQ ID NO 07所示，所述第二DNA反向序列如SEQ ID NO 08所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述病毒载体为慢病毒载体。
本发明的有益效果：本发明的gRNA序列能够有效敲除HTLV-1的病毒基因组，且能有效抑制ATL细胞的增殖。
附图说明
图1为本发明实施例2中gRNA序列及其体外切割效率报告基因实验效果图。
图2为本发明实施例2中CRISPR/Cas9抑制病毒蛋白的表达Western blotting效果图。
图3为本发明实施例2中CRISPR/Cas9抑制病毒蛋白的表达ELISA实验效果图。
图4为本发明实施例2中CRISPR/Cas9靶向HTLV-1抑制ATL-T、ATL-ED细胞增殖MTT实验效果图。
图5为本发明实施例2中gRNA系列对ATL细胞DNA复制抑制效果EdU实验结果图。
图6为本发明实施例2中CRISPR/Cas9靶向HTLV-1切割后序列分析图
图7为本发明实施例3中gRNAs系列抑制ATL细胞成瘤能力动物实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：构建靶向序列的重组质粒引物设计与靶点选择
以HTLV-1的LTR区域作为靶点选择的区域，在此区域内，以引物设计的基本原则为依据，设计若干对不同靶点的上下游引物序列：
R1：
DNA正向序列：CACCGGACTCAACCGGCGTGGATGG(SEQ ID NO 05，即为本发明的第一DNA正向序列，对应第一RNA正向序列，如SEQ ID NO 01所示：
GACUCAACCGGCGUGGAUGG)
DNA反向序列：AAACCCATCCACGCCGGTTGAGTCC(SEQ ID NO 06，即为本发明的第一DNA反向序列，对应第一RNA反向序列，如SEQ ID NO 02所示：
CCAUCCACGCCGGUUGAGUC)
R2：
DNA正向序列：CACCGAGAACGCGACTCAACCGGCG(SEQ ID NO 07，即为本发明的第二DNA正向序列，对应第二RNA正向序列，如SEQ ID NO 03所示：
AGAACGCGACUCAACCGGCG)
DNA反向序列：AAACCGCCGGTTGAGTCGCGTTCTC(SEQ ID NO 08，即为本发明的第二DNA反向序列，对应第二RNA反向序列，如SEQ ID NO 04所示：
CGCCGGUUGAGUCGCGUUCU)
R3：
DNA正向序列：CACCGTCCAAGGGAGCGCCGGACAA(SEQ ID NO 9)
DNA反向序列：AAACTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAC(SEQ ID NO 10)
R4：
DNA正向序列：CACCGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGT(SEQ ID NO 11)
DNA反向序列：AAACACCTAGACTCAGCCGGCTCTC(SEQ ID NO 12)
U3-1
DNA正向序列：CACCGGAGACGTCAGAGCCTTAGTC(SEQ ID NO 13)
DNA反向序列：AAACGACTAAGGCTCTGACGTCTCC(SEQ ID NO 14)
U3-2
DNA正向序列：CACCGGGGGTTGTCGTCAACGCCTG(SEQ ID NO 15)
DNA反向序列：AAACCAGGCGTTGACGACAACCCCC(SEQ ID NO 16)
U5-1
DNA正向序列：CACCGCCAACGGAGTCGCCGGTACT(SEQ ID NO 17)
DNA反向序列：AAACAGTACCGGCGACTCCGTTGGC(SEQ ID NO 18)
U5-11
DNA正向序列：CACCGGTGGAACTTTCGATCTGTAA(SEQ ID NO 19)
DNA反向序列：AAACTTACAGATCGAAAGTTCCACC(SEQ ID NO 20)
(2)退火粘连反应体系如下所示
(3)载体的酶切与连接
双酶切：目的载体质粒LentiCRISPRv2采用Bsm BI内切酶37℃，酶切3h、酶切产物电泳，并采用promega胶回收试剂盒回收目的片段，目的载体LentiCRISPRv2的酶切体系如下所示：
连接：退火片段和目的载体采用Ligation highver.2DNA连接酶4℃连接过夜，连接体系如下所示：
(4)连接产物转化
(1)将所有连接产物含有目的基因片段的质粒加入至100μL Stabl3感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；
(2)42℃热激90s；
(3)冰浴10min；
(4)分别加入200μL SOC培养基，200rpm 37℃振荡培养1h，活化感受态细胞；
(5)将菌液涂布于含氨苄的LB平板表面，置于生化培养箱中37℃正置30min，至液体完全吸收；随后倒置37℃培养过夜。
(5)连接产物鉴定
(1)将stabl3细胞接种到12mL摇菌管中，5mL氨苄抗性的SOB培养液中180rpm 37℃培养8h；
(2)收集2mL菌液于EP管中，12000rpm离心2min，弃去上清；
(3)将菌体沉淀充分重悬到250μL缓冲溶液P1，使菌体处在缓冲环境中(采用TIANGEN质粒小提试剂盒)；
(4)加入250μL裂解溶液P2，轻轻翻转EP管，充分裂解菌体；
(5)加入350μL中和溶液P3，轻轻翻转EP管数次，充分中和P2buffer并室温放置2min，使蛋白质和核酸充分分离；
(6)置于离心机中12000rpm，4℃离心10min；
(7)取上清液700μL，加入到吸附柱上，室温放置2min；
(8)把DNA纯化柱置于离心机中，12000rpm，20℃离心1min；
(9)把步骤8中的离心柱取出，加入700μL wash buffer，12000rpm离心1min；
(10)在DNA纯化柱中加入600μL wash buffer，12000rpm离心1min；
(11)12000rpm空转离心2min；将DNA纯化柱置于一干净的1.5mLEP管上，加入50μLddH2O，室温静置3min，12000rpm离心1min，收集质粒DNA；
(12)质粒DNA抽提完后，将质粒样品送到上海生工生物工程有限公司测序进行鉴定。
(6)大量碱裂解法提取质粒
(1)取经鉴定确认正确的菌液100μL到100mL新鲜配制的氨苄抗性SOB培养液中，37℃，280rpm振荡培养过夜；
(2)室温下，3500rpm，离心30min收集菌体；
(3)弃上清，加入3mL Cell Resuspension Solution重悬菌体(promega质粒中提试剂盒)；
(4)加入3mL CellLysis Solution，轻轻的将离心管上下颠倒2-3次，室温静置3min充分裂解细胞；
(5)加入5mL Neutralization Solution于上述裂解液中，上下颠倒离心管数次，静置2-3min使沉淀充分中和终止反应；
(6)4℃ 9000rpm离心30分钟；
(7)将Clearing Column置于一新离心管内，取上述离心的上清液，置于Column内，室温中，3000rpm下离心3min，收集滤液；
(8)将滤液转移至Binding Column中，室温下，3000rpm旋转离心3min，去滤液；
(9)在柱子上加入5mL Endotoxin Removal Wash，3000rpm离心3min，去内毒素；
(10)加入20mL Column Wash到柱子上，室温3000rpm离心5min；
(11)弃去液体，室温3000rpm旋转离心5min，充分去除Wash Buffer；
(12)将柱子置于一新的离心管中，在柱子中加入600μL的RNase-free water，室温3000rpm离心5min；
(13)重复步骤14两次，将质粒充分洗脱下来。
实施例2：细胞内各种靶向指标检测
将实施例1中构建获得的质粒进行病毒包装并感染细胞，对细胞进行各种靶向指标的检测
1、慢病毒包装与稳定株筛选
A、慢病毒包装
(1)转染前一天收集293FT细胞，以每盘2×106个细胞(10mL细胞悬液)接种到10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养。(293FT培养基含：DMEM、10％FBS、P/S)；
(2)12小时后，在1.5mLEP管中加入1mL OPTI-MEM，加入75μL Lipofectamine3000，颠倒混匀；取另1.5mLE管管中加入1mL OPTI-MEM并按以下体系配制质粒：LentiCRISPRv2-gRNA(15μg)，pCMV-A8/9(15μg)，pcDNA-VSVG(7.5μg)
(3)颠倒混匀；
(4)将上述两种混合物混合在一起，室温静置5min，均匀滴加于10cm培养盘；
(5)转染48h后，收集上清，4℃保存备用；
(6)转染72h后，收集上清与48h混合，1500rpm离心5min 0.45μm滤器过滤；
(7)4℃，25000g离心2h；
(8)弃上清，500μLOPTI-MEM无血清培养基吹打重悬病毒颗粒，每管100μL分装，冻于-80℃保存。
B、稳定株构建
(1)感染前一天，将按1×106个/孔细胞ATL-T或ED细胞接种于24孔板，每孔体积为500μL。
(2)取3μL Polybrene(母液1mg/mL)加入到100μL病毒重悬液中混匀；
(3)将上述混合液滴加到12孔板中，37℃，5％CO2培养12h后，其培养基并加入新鲜培养基；
(4)感染48小时后，将正常培养基更换为加入嘌呤霉素抗性RPMI-1640培养基进行筛选；
(5)经筛选后细胞，挑取单个细胞并建立单克隆稳定细胞系；
2、报告基因实验
具体步骤如下：
(1)实验前一天，在12孔板中接种2×105个细胞接种于12孔板中，置于细胞培养箱37℃，5％CO2培养，备用；
(2)将采用脂质体转染发将及报告基因质粒SSA-Luc及内部对照质粒phe-TK共转染至细胞；
(3)转染48h后，1500rpm离心5min，收集细胞；
(4)每管分别用1mL PBS轻轻重悬细胞，1500rpm离心5min清洗细胞，弃上清；
(5)再次重复清洗细胞2次；
(6)将1×Passive Lysis Buffer工作液加入到细胞沉淀拍散，加入100μL 1×PLB工作液，室温静置20min充分裂解；
(7)13,500rpm离心1min；
(8)设置Luciferase Assay ReagenII(LARII)进样器进样量为100μL；将50×StopReagent稀释成1×Stop工作液，设置Stop工作液进样器进样量为100μL；
(9)取(7)中上清20μL加入到96孔荧光检测板，依次LARII进样器进样量，震荡2s，数据读取10s，stop工作液进样器进样，荡2s，数据读取10s；
(10)统计数据，萤火虫荧光与海肾荧光的比值作为目的基因相对转录活性值。
通过报告基因实验对gRNAs靶向切割效果进行验证，实验结果如图1所示，靶向gRNAs序列均有较高的切割效果，我们选择敲除效果较好的gRNAs序列进行以下实验。
3、蛋白质免疫印迹
对细胞内病毒蛋白的表达量进行检测，通过检测，了解病毒敲除的初步情况，具体操作过程如下：
试剂配制：
(1)RIPA细胞裂解液：0.3g Tris-HCl，0.43g NaCl，0.05g SDS，0.0186g EDTA·Na2·2H2O，0.25g脱氧胆酸钠，500μL Triton X-100，加超纯水定容至50mL，调整pH值至7.4；使用前按比例加入1/100PMSF、1/1000蛋白酶抑制剂和1/200磷酸酶抑制剂；
(2)5×上样缓冲液：在5mL双蒸水中，依次加入2.5mL 1mol/L Tris-HCl(pH6.8)，1g SDS，50mg溴酚蓝以及5mL甘油，定容至25mL，每管1mL分装，室温保存；使用前每管加入50μL β-巯基乙醇；
(3)5×蛋白质电泳缓冲液：在800mL双蒸水中，分别加入15g Tris-base，5g SDS以及4g Gly，充分搅拌至其溶解，用双蒸水定容至1L；
(4)转膜缓冲液：在800mL双蒸水中，依次加入3g Tris-base，0.5g SDS以及14.4g甘氨酸，充分搅拌至其溶解，用甲醇定容至1L，现配现用；
(5)30％聚丙烯酰胺：在70mL双蒸水中，分别加入1g甲叉双丙烯酰胺和29g丙烯酰胺，充分搅拌至其溶解，定容至100mL后过滤，置于棕色瓶中4℃保存。
(6)分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl(pH8.8)：称取363.4g Tris-base，加入体积约800mL的双蒸水，旋转搅拌至其溶解，用浓盐酸调pH至8.8，用双蒸水定容至1L；
(7)浓缩胶缓冲液：称取60.55g Tris-base，加入体积约800mL的双蒸水，旋转搅拌至其溶解，用浓盐酸调pH至6.8，用双蒸水定容至1L；
(8)10％过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵于1.5mL的EP管中，加入1mL去离子水，使其充分溶解，现配现用；
(9)10×PBS缓冲液：在800mL双蒸水中加入NaCl 100g、Na2HPO436.3g、KH2PO42.4g、KCl 2g，溶解后调节pH至7.4，室温保存；
(10)转移缓冲液：称取14.41g Gly，3.02g Tris-base，200mL CH3OH，定容至1L 4℃保存；
(11)PBST洗膜液：在900mL双蒸水中，依次取100mL 10×PBS，0.5mL Tween-20，充分混匀备用；
(12)封闭液：分别加入50mL PBST、2.5g脱脂奶粉，充分混匀。
蛋白提取
(1)采用胰酶消化ATL或ED细胞(正常培养基终止消化)，1500rpm离心5min收集细胞；
(2)弃上清，加入1mL预冷的1×PBS缓冲液，混合均匀，4℃ 1000rpm旋转离心5min，收集细胞；
(3)加入200μL细胞裂解液，重悬细胞，冰浴30min，使细胞充分裂解；
(4)4℃预冷的离心机中12,000rpm，离心20min，转移上清液到洁净的EP离心管中；
(5)另取少量蛋白溶液，根据BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度；
(6)加入蛋白上清液体积的1/4体积的5×SDS上样缓冲液，混合均匀，沸水浴10min使蛋白充分变性；
(7)冰浴5min，随后将蛋白样品保存于-20℃冰箱中备用。
蛋白质浓度测定
按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制与电泳
(1)15％SDS-聚丙烯酰胺分离胶配制：依次加入3.71mL双蒸水、5mL 30％A/B、1.3mL3M Tris-HCl(pH8.8)、100μL 10％SDS、120μL10％AP、12μL TEMED，立刻混匀，匀速灌胶至分界线，不要产生气泡，加入双蒸水封液面；
(2)65％蛋白电泳浓缩胶配制：依次加入3.4mL双蒸水、1mL 30％A/B、1.5mL0.5MTris-HCl(pH6.8)、60μL10％SDS、80μL10％AP、8μLTEMED，迅速混匀，倒满并且插上梳子；
(3)上样：每孔加入30μg蛋白样品，并且加入对照蛋白Marker；
(4)电泳：先80V恒压电泳至分离胶界面，然后电压调至120V，电泳至蛋白Marker充分分散开。
电转移
(1)将PVDF膜放入甲醇中浸泡大约1min彻底活化，然后浸泡于转移缓冲液中，同时将滤纸浸泡于转移缓冲液中；
(2)从转移电泳槽的阳极到阴极依次叠放海绵、3层滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶、3层滤纸和海绵，用玻璃棒轻轻赶尽各层间的气泡；
(3)90V恒压电转移90min；
免疫印迹分析
(1)PVDF膜封闭：转膜结束后，取出转印膜，去离子水漂洗1次，将PVDF膜浸泡于5％脱脂奶粉封闭液，室温封闭1h；
(2)一抗孵育：将转印膜取出，PBST缓冲液洗涤2次，每次5min；将PVDF膜浸没在相应的抗体溶液(稀释比例1∶1000)中，4℃孵育过夜，使抗体与目的蛋白充分结合；
(3)洗膜：孵育结束后在脱色摇床上用PBST缓冲液洗涤3次，每次10min；
(4)二抗孵育：将PVDF膜浸没在二抗稀释液中(1∶2000)，室温孵育2h；
(5)洗膜：如步骤3；
(6)曝光，保存曝光结果，并进行灰度分析。
实验结果如图2所示，与对照株细胞相比，稳定表达gRNAR1和R2的细胞株中，病毒蛋白HTLV-1gap-19、gap-24、gap-46表达水平均明显下降，说明gRNAR1和R2能够有效地靶向HTLV-1前病毒基因组并抑制相关病毒蛋白的表达。
4、酶联免疫反应检测胞外病毒滴度
(1)样品准备：
①取样，离心，3000rpm，5min.取200μL样品于干净的离心管中
②取22.2μL lysing buffer于离心管中，轻弹，混匀
(2)样板准备：
①洗板：300μL 1*wash buffer/孔，洗6次
②留下一个空白孔，不用wash buffer清洗
(3)检测步骤：
①向每孔中加入200μL样品，稀释剂稀释的样品或适当的稀释剂。用封口膜封盖，37℃，孵育2h。
②吸弃液体，按照步骤(2)洗板。
③除空白空外，每孔加入100μL HTLV Detector antibody，封口，37℃，1h。
④吸弃液体，按照步骤2洗板。
⑤除空白孔外，每孔加入100μL的Peroxidase working solution，封口，37℃，1h。
⑥重复第(2)步，洗板。
⑦直接向每孔加入100μL substrate solution，开口室温，30min，视野中出现蓝色。
⑧每孔中加入100μL stop solution终止反应，轻轻地敲击平板，充分混合溶液，溶液将由蓝色变为黄色。
⑨15min后，用酶标仪测定光密度值(OD值)，采用λ＝450nm光测定，λ＝630nm做参比。具体参照试剂盒说明书进行。
实验结果如图2所示，与对照株细胞相比，稳定表达gRNAR1和R2的细胞株中，病毒蛋白HTLV-1gap-19、gap-24、gap-46表达水平均明显下降，说明gRNAR1和R2能够有效地靶向HTLV-1前病毒基因组并抑制相关病毒蛋白的表达。
通过对稳定表达gRNAR1和R2的细胞培养基上清液中病毒蛋白量的检测，实验结果如图3所示，与对照相比，gRNAR1和R2胞外病毒蛋白HTLV-1gap-19表达水平均明显下降，结果再次证明gRNAR1和R2能够有效地靶向HTLV-1前病毒基因组并抑制相关病毒蛋白的表达。下面的试验中我们将采用gRNAR1和R2验证其抑制肿瘤生长和肿瘤形成的效果
5、细胞增殖及活力检测(MTT实验)
为了进一步的讨论该gRNA系列对HTLV-1相关性疾病的治疗作用，我们在分别采用MTT及EdU检测细胞的活力及病毒基因组复制能力。
MTT实验
试剂配制
(1)MTT：取250mgMTT加入到50mLPBS中，配制成终浓度为5mg/mL的MTT溶液。
(2)三联溶解液：SDS10g，异丁醇5mL，10M HC1 0.1mL用双蒸水溶解配成100m。
实验步骤
(1)在96孔板中接种细胞，每孔接种3000个细胞，培养3-5天
(2)每天统一的时间加MTT溶液(5mg/mL用PBS<ph＝7.4>配)20μL；
(3)继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解；
(4)选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
通过MTT实验对细胞生长速率进行检测，实验结果如图4所示，由图可以看出，在两种不同的细胞株中，对于不同靶向的gRNA序列，较对照细胞而言，生长速率均有下降，这说明gRNA靶向作用后的细胞，增殖速率在一定程度受到了抑制。
6、细胞活力检测(EdU实验)
试剂配制
PBS(pH7.2～7.4)
渗透剂(含0.5％TritonX-100的PBS)
细胞固定液(含3.7％多聚甲醛的PBS-福尔马林)
实验步骤
(1)收集细胞，计数，接种
以6孔板为例，用2毫升培养基收集，取50ul稀释至200ul
将洗净的玻片放入24孔板，用培养基浸润，洗涤，接种，过夜，使细胞在玻片上贴牢
(2)EdU标记
用细胞培养基(正常加血清)以2500∶1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量20uMEdU培养基
每空加入200ul的edu培养基孵育2h，弃掉培养基
预热的PBS清洗细胞1～2次(防止细胞萎缩)，每次5min
(3)细胞固定化
每孔加入500ul细胞固定液(即含3.7％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min或者4℃过夜，弃固定液
每孔加入500ul的2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min，
每孔加入500ul PBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS
每孔加入500ul渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min，PBS清洗1次，5min
(3)Apollo染色
每孔加入200ul的Apollo染色液，避光，室温，脱色摇床孵育20(10-30)min，弃染色液加入500ul渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)摇床脱色清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂
每孔加入500ul甲醇清洗1-2次，每次5min，PBS清洗1次，每次5min
(4)Hoechst染色：按100∶1的比例用去离子水稀释，避光保存
每孔加入50ul避光，室温，孵育5-10min，PBS洗3次，每次5min，去离子水洗1次(去盐)，5min
(5)荧光显微镜检测
(6)封片，-80℃保存
实验结果如图5所示，由图可以看出，对于不同靶向的gRNA R1和R2序列，与对照组相比gRNA-R-1及gRNA-R-2细胞的DNA复制能力明显下降。以上结果说明敲除HTLV-1病毒能够有效的抑制ATL细胞的增殖，暗示着CRISPR/Cas9gRNA系统极可能成为治疗HTLV-1相关性疾病的有效手段。
7、HTLV-1靶向敲除后序列分析
分别从实验组和对照组的细胞中提取基因组，通过PCR扩增靶向序列。R1和R2的上下游引物分别为：
R1：
F：GCCGTCCTCAGGCGTTGACGAC
R：AGGCCCGGTCTCGACCTGAGC
R2：
F：GCGTGGAGACAGTTCAGGAGGGG
R：GCCCGGTCTC GACCTGAGCTTTA
每个样品挑取12个单克隆菌落进行测序。
结果如图6所示，gRNA-R-1及gRNA-R-2均能有效地靶向目的序列，并对靶向序列进行敲除，这一结果表明CRISPR/Cas9 gRNA系统可能为病毒感染类疾病的治愈提供一种新的临床方案。
实施例3动物实验
将实施例2中获得的稳定株，通过注射导入小鼠体内，构建小鼠成瘤模型
(1)收集细胞，并进行细胞计数
(2)每只小鼠背部左右两侧分别注射对照组和实验组的细胞，数量均为7×105个/只
(3)4周后，解剖小鼠，取瘤，称重，检测肿瘤细胞的各项指标
结果如图7(A-C)所示，实验组无论是成瘤率还是瘤体积都明显低于对照组；此外，我们通过免疫组织化学实验技术检测了各组小鼠所成瘤体的，结果如图7(D)所示，实验组出现肿瘤而对照组细胞不仅所成瘤体积较大而且肿瘤细胞生长状态良好。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
<110> 华侨大学
<120> 一种有效敲除HTLV-1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA靶向序列
<160> 20
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacucaaccg gcguggaugg 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccauccacgc cgguugaguc 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
agaacgcgac ucaaccggcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgccgguuga gucgcguucu 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caccggactc aaccggcgtg gatgg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaacccatcc acgccggttg agtcc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caccgagaac gcgactcaac cggcg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaaccgccgg ttgagtcgcg ttctc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caccgtccaa gggagcgccg gacaa 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaacttgtcc ggcgctccct tggac 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caccgagagc cggctgagtc taggt 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaacacctag actcagccgg ctctc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caccggagac gtcagagcct tagtc 25
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaacgactaa ggctctgacg tctcc 25
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caccgggggt tgtcgtcaac gcctg 25
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaccaggcg ttgacgacaa ccccc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caccgccaac ggagtcgccg gtact 25
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaacagtacc ggcgactccg ttggc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
caccggtgga actttcgatc tgtaa 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aaacttacag atcgaaagtt ccacc 25

Claims (7)

1.一种能有效敲除HTLV-1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列，其特征在于：包括第一RNA正向序列、第二RNA正向序列、第一RNA反向序列和第二RNA反向序列；第一RNA正向序列与第一RNA反向序列彼此互补，分别包括如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示的序列；第二RNA正向序列与第二RNA反向序列彼此互补，分别包括如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示的序列。
2.如权利要求1所述的gRNA序列，其特征在于：所述第一RNA正向序列如SEQ ID NO 01所示，第二RNA正向序列如SEQ ID NO 03所示。
3.如权利要求1所述的gRNA序列，其特征在于：所述第一RNA反向序列如SEQ ID NO 02所示，第二RNA反向序列如SEQ ID NO 03所示。
4.权利要求1至3中任一权利要求所述的gRNA序列进行HTLV-1病毒基因组敲除的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)以HTLV-1病毒基因组LTR区域为靶点设计依次对应第一RNA正向序列、第二RNA正向序列、第一RNA反向序列和第二RNA反向序列的第一DNA正向序列、第二DNA正向序列、第一DNA反向序列和第二DNA反向序列，进行退火粘连，分别得第一退火片段和第二退火片段；
(2)将上述第一退火片段和/或第二退火片段与lentiCRISPRv2质粒连接后构建重组质粒；
(3)将上述重组质粒进行病毒载体包装，并感染整合HTLV-1前病毒基因组的宿主细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一DNA正向序列包括如SEQ ID NO 05所示的序列，所述第一DNA反向序列包括如SEQ ID NO 06所示的序列，所述第二DNA正向序列包括如SEQ ID NO 07所示的序列，所述第二DNA反向序列包括如SEQ ID NO 08所示的序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述第一DNA正向序列如SEQ ID NO 05所示，所述第一DNA反向序列如SEQ ID NO 06所示，所述第二DNA正向序列如SEQ ID NO 07所示，所述第二DNA反向序列如SEQ ID NO 08所示。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述病毒载体为慢病毒载体。
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Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
CN110066803A (zh) * 2019-05-16 2019-07-30 珠海乐维再生医学科技有限公司 一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN111909961A (zh) * 2020-08-21 2020-11-10 华侨大学 一种CRISPR/Cas介导的ATL细胞基因编辑载体及其应用
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0952898A (ja) * 1995-08-09 1997-02-25 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk 抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0952898A (ja) * 1995-08-09 1997-02-25 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk 抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチド

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A TANAKA等: "《A novel therapeutic molecule against HTLV‐1 infection targeting provirus》", 《LEUKEMIA》 *
HO YIK-KHUAN等: "《Htlv-1 tax stimulates ubiquitin e3 ligase, ring finger protein 8, to assemble lysine 63-linked polyubiquitin chains for tak1 and ikk activation》", 《PLOS PATHOGENS》 *
SATOU YORIFUMI等: "《The retrovirus htlv-1 inserts an ectopic ctcf-binding site into the human genome》", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA》 *

Cited By (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
CN110066803B (zh) * 2019-05-16 2021-04-13 珠海乐维再生医学科技有限公司 一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法
CN110066803A (zh) * 2019-05-16 2019-07-30 珠海乐维再生医学科技有限公司 一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN111909961A (zh) * 2020-08-21 2020-11-10 华侨大学 一种CRISPR/Cas介导的ATL细胞基因编辑载体及其应用

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