CN108823291B - 基于crispr技术的特异性核酸片段定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，通过获处理过的目标核酸样本，添加所述目标核酸样本和水相溶液至液滴生成设备，生成反应液滴,其中所述反应液滴包括至少一待测核酸片段；使用重组酶聚合酶扩增技术扩增反应液滴中的待测核酸片段,利用基因编辑技术使得所述待测核酸片段中的目的基因信号获得级联放大效应；收集所述目的基因对应的阳性信号，将所述阳性信号转化为图像数据；利用泊松分布原理对所述图像数据中的荧光阈值进行处理，得到所述阳性信号对应的所述待测核酸片段中目的基因的数量，从而基于CRISPR技术快速高效地定量检测目的基因的浓度。

Description

基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，所述特异性核酸片段定量检测方法可被应用于快速高效地定量检测特定核酸片段。

背景技术

随着科技的发展以及医学水平的提高，人们对于多种疾病与基因的突变或多态性的相关性研究已取得实际性进展，进而也逐渐了解到基因的突变或多态性与单基因疾病、多因子疾病之间的关系。基于基因和疾病之间的关系，人们可通过检测靶基因或者含有该靶基因的区域内的基因突变来简便且准确地检测疾病，而基因的检测就是通过核酸检测技术来完成。

目前，医院和检测机构常用的核酸检测技术是基于PCR(聚合酶链式反应)技术发展而来的，聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它最大特点是能将微量的DNA大幅增加，从而便于DNA的后续检测，其原理是利用DNA在体外摄氏高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调整温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖的方向合成互补链原理完成DNA的扩增，但这就意味着PCR技术对温度控制要求高，也使得PCR技术的操作条件显得复杂，并且PCR技术只能用于DNA片段的检测，其检测灵敏度和特异性也仍需进一步提高，检测周期往往长达2小时。

针对PCR技术存在的问题，专利申请号为201710831152.X的现有专利公开了“一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法”，该专利文献公开了结合RPA(重组酶聚合酶扩增技术)扩增目标分子，然后通过Cas13a蛋白定性检测目标分子中特异性核酸序列的方法，这种方法对温度控制要求低，一般控制在37摄氏度作用即可，灵敏度和特异性高。虽然这种方法可以检测出阿摩尔级别的核酸，但是其存在一个极大的问题：该方法不能达到特异性核酸片段的精准定量，然而定量检测对于医疗来说又是极其重要的，很多疾病的诊断或者治疗需要获知的不仅仅是是否有特异性核酸片段，更需要获知特异性核酸片段的具体数量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，所述特异性核酸片段定量检测方法解决了核酸片段定量检测的问题，可快速高效地定量检测单分子特异性核酸片段。

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，所述特异性核酸片段定量检测方法结合液滴微流控技术、光学信号采集系统以及泊松分布原理实现对特异性核酸片段的定量检测。

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，所述特异性核酸片段定量检测方法采用CRISPR技术进行特异性核酸片段的剪切，可以简单、快速、灵敏地对目标DNA进行特异性检测和分型，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计的关键瓶颈问题，并且具有高度的特异性和灵敏度。

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR技术的单分子特异性核酸片段定量检测方法，所述特异性核酸片段定量检测方法检测速度快，检测效果好，在实现高灵敏度和高特异性前提下实现30分钟快速检测。

为了实现以上任一发明目的，本发明提供一种基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，包括步骤：

S1：获取处理过的目标核酸样本；

S2:添加所述目标核酸样本和水相溶液至液滴生成设备，生成反应液滴,其中所述反应液滴包括至少一待测核酸片段；

S3:使用重组酶聚合酶扩增技术扩增反应液滴中的待测核酸片段,利用基因编辑技术使得所述待测核酸片段中的目的基因获得级联放大效应，释放阳性信号；

S4：收集所述目的基因对应的荧光信号，将所述荧光信号转化为图像数据；以及

S5：利用泊松分布原理对所述图像数据中的荧光阈值进行处理，得到所述阳性信号对应的所述待测核酸片段中目的基因的数量。

在一些实施例中，所述步骤S4进一步包括以下步骤：

S41：朝向所述液滴生成设备发射光束，激发所述目的基因，产生荧光信号；以及

S42:光学镜头收集所述荧光信号，图像传感器转化所述荧光信号为所述图像数据，其中所述发射光束和所述图像传感器的光敏面均位于所述液滴生成设备的像方共轭位置。

在一些实施例中，所述步骤S4进一步包括以下步骤：

S411:朝向垂直于所述液滴生成设备的法线方向发射光束，所述发射光束经设置于所述液滴生成设备前端的分光二色镜反射至所述液滴生成设备；以及

S421：沿着所述液滴生成设备的法线方向收集光束，其中所述光束透过所述分光二色镜。

在一些实施例中，在所述步骤S411当中，发射光束被整形以及被激光过滤后被发射至所述液滴生成设备，在所述步骤S412当中，所述荧光信号被荧光过滤后被收集。

在一些实施例中，所述光学镜头为连续变倍镜头，根据所述液滴生成设备的尺寸调整所述光学镜头的像面大小，所述图像传感器的光敏面重合于所述光学镜头的光轴。

在一些实施例中，所述步骤S2当中所述水相溶液的体积量大于所述目标核酸样本的体积量，所述反应液滴包括单分子的待测核酸片段。

在一些实施例中，所述步骤S2采用乳浊液滴式的液滴生成设备。

在一些实施例中，所述待测核酸片段选自DNA或RNA的一种或其组合，当为RNA时，需要在扩增阶段进行逆转录，所述待测核酸片段为血浆中的游离核酸片段。

在一些实施例中，所述步骤S3中，添加RPA相关试剂和CRISPR相关试剂同时添加到液滴中，其中所述RPA相关试剂包括RNA重组酶、RNA引物、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，所述CRISPR相关试剂包括Cas13a蛋白，向导RNA，报告RNA分子和缓冲液。

在一些实施例中，所述步骤S5当中，选取两个荧光阈值R11,R12，R11＜R12，第Cn个周期的荧光强度值满足：

其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值,

荧光阈值R11与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期有交点，该交点对应相应的扩增周期值Cti，根据Cti进行聚类，获得K个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M1,M2,.....Mk；第J个聚类中包含的扩增周期值Cti的数量为SJ,

计算扩增效率平均值

ni为第I个反应单元的反应效率，n为反应单元个数，

RB为本底荧光值，Ci1,Ci2分别为荧光阈值R11,R12与第i个反应单元的扩增曲线的交点所对应的扩增周期，C2＞C1,

则反应物初始浓度

附图说明

图1是根据本发明的一实施例的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法的液滴生成步骤的步骤示意图。

图2是根据本发明的信号采集系统的结构示意图。

图3是根据本发明的所述信号采集系统采集到的信号图的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所述使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在介绍说明实施方式之前，介绍实施方式中涉及的专业名词：

RPA技术：Recombinase Polymerase Amplification，重组酶聚合酶扩增。需要用到能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，其原理是重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换，在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件，整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

CRISPR技术：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，基因编辑技术。一般而言，所述CRISPR技术由两部分组成，一部分是可以切割基因的Cas蛋白，另一部分是引导Cas蛋白在基因组中精确定位的向导RNA(核糖核酸)。CRISPR/Cas系统是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行特定DNA修饰的技术,此系统的工作原理是通过人工优化的具有引导作用的单链gRNA(Guide RNA)引导Cas蛋白在与gRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA双链断裂(DSB)，进而利用生物体内非同源末端修复机制(NHEJ)或同源重组机制(HR)修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。

液滴微流控技术:微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)，利用流动剪切力与表面张力之间的相互作用将连续流体分隔成离散的纳升级及以下体积的液滴的一种微纳技术。

EMCCD:Electronic Multiplying Charge Coupled Device,电子倍增电荷耦合器件，是一种全新的微弱光信号增强探测技术。

级联放大效应：从细胞表面受体接收外部信号到最后作出综合性应答是一个将信号逐步放大的过程，又称为信号的级联放大反应。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，为了便于说明，以下将以定量检测方法替代所述基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，两者在含义上并无差别，所述定量检测方法包括以下步骤：

S1：获取处理过的目标核酸样本；

S2:添加所述目标核酸样本和水相溶液至液滴生成设备，生成反应液滴,其中所述反应液滴包括至少一待测核酸片段；

S3:使用重组酶聚合酶扩增技术扩增反应液滴中的待测核酸片段,利用基因编辑技术使得所述待测核酸片段中的目的基因获得级联放大效应，释放阳性信号；

S4：收集所述目的基因对应的荧光信号，将所述荧光信号转化为图像数据；以及

S5：利用泊松分布原理对所述图像数据中的荧光阈值进行处理，得到所述阳性信号对应的所述待测核酸片段中目的基因的数量。

因此，可以看到本发明提供的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法在现有申请专利“一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法”的基础上，利用液滴微流控技术结合荧光共焦显微技术成像以及图像阈值二极化处理等技术实现特异性核酸片段的定量检测。

即，基于液滴微流控技术将反应体系稀释并分装进若干液滴或反应单元中，通过RPA技术结合CRISPR技术完成对目的基因的定性检测，再通过光学显微成像技术并结合泊松分布原理实现对目的基因的浓度计算，从而高度灵敏及特异性地完成对目标基因的定量检测。

具体而言，在所述步骤S1当中的目的核酸片段优先地选择血浆中的游离核酸片段，实验操作步骤优先选择以下实施例，但其实验步骤也不一定只能选择这种方式：

操作步骤如下：

1、裂解步骤：

取一个新的15/50ml离心管，加入规定体积的蛋白酶K，依次加入血浆、裂解液，涡旋振荡1min左右，55℃加热30min(每隔10min涡旋振荡30s)。其中所述血浆，所述蛋白酶K以及所述裂解液的体积比例如下表所示：

2、结合

向上述离心管中加入规定体积的结合液，充分涡旋振荡1min，再加入规定体积的磁珠，充分涡旋振荡1min，静置10min，然后将离心管置于磁力架上至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。其中所述血浆和磁珠的用量如下表所示：

血浆量(ml)	1	3	5
				磁珠用量(μl)	20	45	75

3、洗涤

(1)加入规定体积的漂洗液A，适当涡旋振荡1min，使磁珠充分混匀，将离心管置于磁力架上至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管，其中所述血浆和漂洗液A的用量如下表所示：

血浆量(ml)	1	3	5
				漂洗液A(ml)	3	9	15

(2)加入规定体积的漂洗液B，适当涡旋振荡1min，使磁珠充分混匀，将离心管置于磁力架上至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管，其中所述血浆和漂洗液B的用量如下表所示：

血浆量(ml)	1	3	5
				漂洗液B(ml)	3	9	15

4、干燥

保持离心管于磁性分离器上，室温静置10min左右，待磁珠充分干燥后取下离心管,值得注意的是，磁珠干燥后即可，不可过分干燥，否则会影响洗脱效率。

5、洗脱

加入50μl洗脱液，涡旋或用移液器缓慢吹打，使磁珠从管壁上脱离，重悬于液体中，静置1分钟左右，充分洗脱磁珠吸附的核酸，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5ml离心管中。如果需要，可将洗脱液提前放置在55℃水浴锅加热，同时为了提高洗脱效率，也可将洗脱体系放置在水浴锅中，洗脱5min，然后磁力架上吸取上清液。

6、游离DNA的储存

得到的游离DNA，立即检测或于-20℃保存。

值得注意的是，所述目标核酸片段可以是DNA也可以是RNA。

在所述步骤S2当中，所述液滴生成设备的种类和类型并无特殊要求，所述液滴生成设备可以采用T型通道法，流动聚焦法，共聚焦法，光控法等多种方法，本发明在这方面并无限制，在本发明的实施例中，优选采用微流控液滴芯片来完成反应液滴的生成以及反应。在本发明的实施例中，优选地，采用乳浊液滴式的方式生成反应液滴。

液滴生成的方法原理如图1所示，向所述液体生成设备中添加所述目标核酸样本和所述水相溶液，鉴于所述目标核酸样本和所述水相溶液不相容，其中所述水相溶液作为连续相，所述目标核酸样本作为分散相，所述水相溶液在所述目标核酸样本上施加的作用力大于其界面张力，因此，该处的目标核酸样本会突破其界面张力进入所述水相溶液,形成所述反应液滴。

在本发明的实施例中，所述水相溶液和所述目标核酸样本的添加顺序并无过多要求，两者可同时添加也可单独添加，为了保证每个反应液滴包括尽可能少的待测核酸片段，在所述步骤S2当中尽量添加足够多的所述水相溶液，以尽量有限稀释所述目标核酸样本，得到含有单分子的反应液滴。

值得一提的是，所述反应液滴中可能存在待测核酸片段，也可能不存在待测核酸片段，而本发明的定量检测方法重点针对内部含有待测核酸片段的反应液滴，故其说明仅以含有待测核酸片段的反应液滴作为样本。

在所述步骤S3当中，所述重组酶聚合酶扩增技术和所述基因编辑技术同步进行，从而快速完成对特定目的基因的检测，此时在所述步骤S3当中，同时添加RPA相关试剂和CRISPR相关试剂添加到液滴中，具体而言，所述RPA相关试剂包括RNA重组酶、RNA引物、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，所述CRISPR相关试剂包括Cas13a蛋白，向导RNA，报告RNA分子和缓冲液。虽然在本发明的实施例中所述重组酶聚合酶扩增技术和所述基因编辑技术同步进行，但是其定性的原理依旧不变，也就是说，

所述步骤S3进一步包括:

步骤S31:RPA技术对所述反应液滴中的待测核酸片段进行核酸扩增反应，得到扩增产物：

所述RPA重组酶和RPA引物结合形成蛋白-DNA复合物，所述蛋白-DNA复合物在所述待测核酸片段上寻找同源序列。一旦所述RPA引物定位了同源序列，就会在所述链置换DNA聚合酶的作用下发生链交换反应形成并启动DNA合成，对所述待测核酸片段上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链和单链DNA结合蛋白SSB结合，防止进一步被替换。

所述RPA引物的长度控制在20-50个核苷酸，优选为20-35个核苷酸。所述RPA引物的上游引物，需要在5’端加入启动子序列，以用于扩增产物后续进行体外转录，所述启动子序列可以选择T7,T3,SP6，优选为T7启动子。当所述待测核酸片段为DNA时，需要额外添加RPA酶预混液，以实现反转录功能。

步骤S32:对所述扩增产物进行体外转录，得到转录产物：

在NTP混合液，和基于启动子的RNA聚合酶预混液的作用下实现扩增产物的体外转录。

步骤S33:CRISPR技术检测所述转录产物中的特定目的基因：

在本发明的实施例中，所述Cas13a蛋白可以来自不同细菌，所述缓冲液的浓度根据不同Cas13a蛋白的来源进行调整，一般而言，包括用于LshCas13a的缓冲液A(50mM Tris-HCL,pH7.5，200mM NaCL，10mM MgCl2)和用于LbuCas13a的缓冲液A(20mM HEPES,pH7.0，0.5mM KCL，5mM MgCl2)。

所述向导RNA的结构为5’-锚定序列-向导序列-3’，所述向导RNA和所述转录产品的片段匹配，长度为21-28个核苷酸。

当Cas13a蛋白在CrRNA的帮助下，识别靶向序列的靶向RNA后，被激活的RNA酶活动可以降解该带有信号的RNA，从而释放阳性信号。

值得注意的是，关于步骤S3的基于CRISPR技术的定性检测目的基因的方法可参考现有专利201710831152.X“一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法”的揭露内容，本发明的创造之处在定性检测的基础上完成特异性核酸片段的定量检测。

其定性检测的基本原理是：针对目标核酸片段经过RPA技术(重组酶聚合酶扩增技术)，将目标分子指数放大(百亿级别放大)，RNA聚合酶可以催化单链或双链DNA启动子下游NTP的掺入，合成与启动子下游的模板DNA互补的RNA。在RPA反应体系中加入Cas13a蛋白和报告RNA分子(报告RNA分子两端连接有荧光报告基团与淬灭基团)，当反应体系中存在目标分子时，核酸片段的指数级扩增，目标分子可被Cas13a识别(即使是单分子级别的浓度)，一旦Cas13a被激活后，因Cas13a的自身特性(一旦激活，便可不受限制的对RNA分子进行“疯狂”剪切)，报告RNA分子会被剪切，然后释放出阳性信号。

在所述步骤S4当中，搭建荧光高速显微成像装置，以荧光共焦连续变倍显微技术成像为技术路线。

所述步骤S4进一步包括：

S41：朝向所述液滴生成设备发射光束，激发所述目的基因，产生荧光信号；以及

S42:光学镜头收集所述荧光信号，图像传感器转化所述荧光信号为所述图像数据，其中所述发射光束和所述图像传感器的光敏面均位于所述液滴生成设备的像方共轭位置。

另外，为了保证荧光效率，在本发明的一具体实施例中，所述发射光束的光束方向和被反射的阳性信号的光束方向垂直，以确保两种光束之间彼此不会互相影响，则此时：所述步骤S4进一步包括：

S411:朝向垂直于所述液滴生成设备的法线方向发射光束，所述发射光束经设置于所述液滴生成设备前端的分光二色镜反射至所述液滴生成设备；以及

S421：沿着所述液滴生成设备的法线方向收集光束，其中所述光束透过所述分光二色镜被收集。

在所述步骤S411当中，发射光束被整形以及被激光过滤后被发射至所述液滴生成设备，在所述步骤S412当中，所述阳性信号以荧光形式被收集，其中所述阳性信号被荧光过滤后被收集。

如图2所示，所述荧光高速显微成像装置的结构被展示。所述荧光高速显微成像装置包括激发光源，激发镜头，激发光滤光片，分光二色镜，荧光滤光片，接收镜头以及图像传感设备，其中所述激发光源，激发光滤光片以及激光镜头配合处理激光光束，所述激光光束照射以及处理步骤S3得到的反应液滴，其中所述荧光滤光片，镜头，图像传感设备用于收集所述反应液滴反馈的阳性信号，并转化得到数据信息。

在本发明的实施例中，所述激发光源，激光镜头以及激发光滤光片依次设置于第一轴线方向，从所述激发光源发出的光线经所述激光镜头的整形后成为准直平行光束，随后平行光束经过激发光滤光片滤除不需要的波段后，照射至所述分光二色镜上，再由所述分光二色镜反射至所述液滴生成设备上。

在本发明的一具体实施例中，所述激发光源选自高效LED激发光源。

所述图像传感设备中设置所述图像传感器，所述图像传感器，所述光学镜头以及所述荧光滤光片依次设置于第二轴线上，具体而言，所述图像传感器的光敏面的法线与光学镜头的光轴重合，并位于所述液滴生成设备的法线方向，其中所述液滴生成设备的法线方向重合于所述第二轴线。从所述液滴生成设备反射的阳性信号经过所述荧光滤光片的过滤后，被所述光学镜头收集，所述图像传感器将所述阳性信号转化为图像数据。

在本发明的一实施例中，所述光学镜头为连续变倍镜头，所述连续变倍镜头上的变倍调节轮可调节的像面大小，实现了液滴芯片上不同尺寸的荧光成像，又因为激发光和图像传感器的光敏面均位于生物芯片的像方共轭位置，此时生物芯片的激发区域均同步有效的成像于图像传感器的光敏面。

所述图像传感设备采用EMCCD相机，所述EMCCD相机具备有高灵敏度，暗电流小，高量子产率，高动态范围以及高帧速，成像靶面大的优点，可通过大靶面一次荧光信号成像，快速获得的荧光信号，荧光信号像素密度高，信噪比好，利于在PCR扩增循环中及时捕获微弱的荧光信号，且不同的扩增循环中荧光信号稳定，避免荧光扫描时差引起的荧光信号强度差异。

值得一提的是，在本发明的实施例中，所述第一轴线垂直于所述第二轴线，即所述光学镜头的光轴与所述激发镜头的光轴互相垂直。此时，所述分光二色镜倾斜于所述反应液滴所在平面设置，在本发明的实施例中，所述分光二色镜可倾斜于液体生成设备中的液滴芯片设置。在本发明的实施例中，所述分光二色镜以45°角倾斜设置于所述液滴芯片。值得注意的是，所述分光二色镜认为是具有两向色性的分光板，其根据波长来透过或反射光，部分光束被所述分光二色镜反射至所述反应液滴，另外部分光束透过所述分光二色镜，其反射光束以及透光性能依据所述分光二色镜的性能不同而不同，从所述分光二色镜反射的部分光束抵达所述液滴芯片，以激发目的基因的荧光标记物，所述阳性信号被所述光学镜头收集。

在本发明的实施例中，所述分光二色镜的作用是激发光通过二色镜反射到被检测样品上，被测检品被激发后荧光波长跃升通过二色镜进入镜头。由于二色镜的作用，只允许激发后的波长荧光信号通过二色镜进入镜头，激发前的波长荧光信号不能通过二色镜进入镜头。二色镜的另一个特点是可以把入射光源和被检测物品成垂直摆放，而不是同一直线摆放，带来结构及操作上的便利性。

另外，值得一提的是，所述荧光高速显微成像装置采用多通道荧光过滤独立通道组件，滤波带通效率高达>98％，截止深度不小于OD6，能有效通过和过滤不同波长的荧光信号，经过数学模型适配，最大限度挖掘荧光通道采集效率。一体化模组二向分色镜技术，有效避免二向分色镜因为安装及震动误差带来的折射角不确定的改变有利于长时间高精度荧光成像。此时，所述接收滤光片匹配不同的荧光信号。

所述步骤S5当中，利用泊松分布原理进行数字定量结果判读。经过光学系统识别技术，实验标本的信号图如图3中所示，我们利用泊松分布原理，将阳性信号结果进行样本原始浓度返算，最后实现单分子核酸检测，同时可计算样本中目的基因的原始浓度。

具体而言，所述目的基因的浓度计算方法可详见本发明人在2017年10月27日申请的申请号为201711022118.4的“一种数字PCR浓度计算方法”的专利文本，虽然之前公布的一种数字PCR浓度计算方法被应用于计算PCR浓度，但是其计算原理可同类应用于本发明。

具体而言，所述信号采集系统获取所述阳性信号后，选取两个阈值R11,R12，R11＜R12，第Cn个周期的荧光强度值满足：

其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值。

荧光阈值R11与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期有交点，该交点对应相应的扩增周期值Cti。根据Cti进行聚类，获得K个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M1,M2,.....Mk；第J个聚类中包含的扩增周期值Cti的数量为SJ。

计算扩增效率平均值

ni为第I个反应单元的反应效率，n为反应单元个数，

RB为本底荧光值，Ci1,Ci2分别为荧光阈值R11,R12与第i个反应单元的扩增曲线的交点所对应的扩增周期，C2＞C1.

则反应物初始浓度

关于其算法的详细内容在此不做过多的介绍，但熟悉本领域的技术人员应当知道通过该算法，利用泊松原理可得到目的基因的原始浓度。

综上所述，本发明提供一种基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，利用RPA相关试剂和CRISPR相关试剂整合到核酸样本制成的液滴中，当随着RPA反应的进行，样本浓度不断增加，当达到一定浓度后，CRISPR发挥功能，进行目的基因片段的剪切，从而释放信号，通过信号采集系统采集信号以及泊松原理分析信号，定量获得所述核酸样本中的目的基因的原始浓度。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，包括步骤：

S1：获取处理过的目标核酸样本；

S2:添加所述目标核酸样本和水相溶液至液滴生成设备，生成反应液滴,所述反应液滴包括单分子的待测核酸片段；

S3:使用重组酶聚合酶扩增技术扩增反应液滴中的待测核酸片段,利用基因编辑技术使得所述待测核酸片段中的目的基因获得级联放大效应,释放阳性信号；

S4：朝向所述液滴生成设备的法线方向发射光束，激发所述目的基因，产生荧光信号，其中激发光源，激光镜头以及激发光滤光片依次设置于第一轴线所在的方向，从所述激发光源发出的光线经所述激光镜头的整形后成为准直平行光束，随后所述准直平行光束经过所述激发光滤光片滤除不需要的波段后，照射至所述分光二色镜上，再由所述分光二色镜反射至所述液滴生成设备上；

从所述液滴生成设备反射的阳性信号经过荧光滤光片的过滤后被光学镜头收集，所述光学镜头收集所述荧光信号，图像传感器转化所述荧光信号为所述图像数据，其中所述发射光束和所述图像传感器的光敏面均位于所述液滴生成设备的像方共轭位置，其中所述图像传感器，所述光学镜头以及所述荧光滤光片依次设置于第二轴线上，所述图像传感器的光敏面的法线与所述光学镜头的光轴重合，并位于所述液滴生成设备的法线方向，其中所述液滴生成设备的所述法线方向重合于所述第二轴线，所述第一轴线垂直于所述第二轴线；以及

S5：利用泊松分布原理对所述图像数据中的荧光阈值进行处理，得到所述阳性信号对应的所述待测核酸片段中目的基因的数量。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述步骤S4进一步包括以下步骤：

S411:朝向垂直于所述液滴生成设备的法线方向发射光束，所述发射光束经设置于所述液滴生成设备前端的分光二色镜反射至所述液滴生成设备；以及

S421：沿着所述液滴生成设备的法线方向收集光束，其中所述光束透过所述分光二色镜。

3.根据权利要求2所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，在所述步骤S411当中，发射光束被整形以及被激光过滤后被发射至所述液滴生成设备，在所述步骤S412当中，所述荧光信号被荧光过滤后被收集。

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述光学镜头为连续变倍镜头，根据所述液滴生成设备的尺寸调整所述光学镜头的像面大小，所述图像传感器的光敏面重合于所述光学镜头的光轴。

5.根据权利要求1到4任一所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2当中所述水相溶液的体积量大于所述目标核酸样本的体积量。

6.根据权利要求5所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2采用乳浊液滴式的液滴生成设备。

7.根据权利要求5所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述待测核酸片段选自DNA或RNA的一种或其组合，当为RNA时，需要在扩增阶段进行逆转录，所述待测核酸片段为血浆中的游离核酸片段。

8.根据权利要求7所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，添加RPA相关试剂和CRISPR相关试剂同时添加到液滴中，其中所述RPA相关试剂包括RNA重组酶、RNA引物、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，所述CRISPR相关试剂包括Cas13a蛋白，向导RNA，报告RNA分子和缓冲液。

9.根据权利要求8所述的基于CRISPR技术的特异性核酸片段定量检测方法，其特征在于，所述步骤S5当中，选取两个荧光阈值R11,R12，R11＜R12，第Cn个周期的荧光强度值满足：

其中Cn代表扩增周期，R是对应扩增周期的荧光强度值,

荧光阈值R11与每个阳性反应单元扩增曲线在指数增长期有交点，该交点对应相应的扩增周期值Cti，根据Cti进行聚类，获得K个聚类，每个聚类对应的中心值从大到小依次为M1,M2,.....Mk；第J个聚类中包含的扩增周期值Cti的数量为SJ,

计算扩增效率平均值

ni为第I个反应单元的反应效率，n为反应单元个数，

RB为本底荧光值，Ci1,Ci2分别为荧光阈值R11,R12与第i个反应单元的扩增曲线的交点所对应的扩增周期，C2＞C1,

则反应物初始浓度

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