CN110029194A - 基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置 - Google Patents
基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110029194A CN110029194A CN201910331800.4A CN201910331800A CN110029194A CN 110029194 A CN110029194 A CN 110029194A CN 201910331800 A CN201910331800 A CN 201910331800A CN 110029194 A CN110029194 A CN 110029194A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- fluorescence
- crispr
- gene editing
- cas
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 65
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 7
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims description 7
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- -1 Cas12 Proteins 0.000 claims description 4
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 claims description 4
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 claims description 4
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000007639 printing Methods 0.000 claims description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012549 training Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 1
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108020005093 RNA Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000004900 laundering Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005297 material degradation process Methods 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置，其通过从待测样品中提取待测核酸；将所述待测核酸与荧光报告因子相结合；Cas蛋白在向导核糖核酸的引导下，特异性的结合所述待测核酸，并转录出目标核酸片段；在Cas蛋白的作用下，截断所述目标核酸片段，并同时截断所述目标核酸片段中结合的荧光报告因子，使得被截断的荧光报告因子处于游离状态；对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别，得到荧光监测结果；本发明采用CRISPR‑Cas基因编辑系统与荧光监测相结合，检测结果更直观，无需PCR实验室，操作人员无需专业培训，使用更方便，适用范围更广，并且检测精度高，便于临床监测使用。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，特别是一种基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及其应用该方法的装置。
背景技术
快速且准确的诊断感染性疾病是提升临床诊疗水平，以及指导感染性疾病防控的重要公共卫生工作，这一点在大型医疗中心或者偏僻乡镇医院都是非常重要的，最佳的诊断方式应该是价格低廉，准确性高，并且是快速的，操作简便的，对大范围传播的致病性病毒，有了这种理想的检测技术，能够帮助医务人员在早期进行疾病控制，并给患者更多的治疗机会。
分子诊断是指应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术。分子诊断是预测诊断的主要方法，既可以进行个体遗传病的诊断，也可以进行产前诊断。分子诊断主要是指编码与疾病相关的各种结构蛋白、酶、抗原抗体、免疫活性分子基因的检测。
分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，其核心技术是基因诊断，常规技术包括:聚合酶链式反应(PCR)，DNA测序(DNA sequencing)，荧光原位杂交技术(FISH)，DNA印迹技术(DNA blotting)，单核苷酸多态性(SNP)，连接酶链反应(LCR)，基因芯片技术(gene chip)。
其中，PCR检测技术占据目前分子诊断的主要市场，其通过聚合酶链式反应扩增特定的DNA片段，将扩增后的产物进行电泳，通过分子量的区别进行DNA的判别区分与检测，有着优越的灵敏度和特异性。但是，PCR检测技术对环境要求高，单次过程智能处理15个样品，反正全程超过10个小时，实验过程中不可以进行监控，只能对PCR产物的终端检测，直到实验结束才能判断扩增过程是否成功。并且，需要专业的技术人员进行操作，反应需要大量的外置配套设备，反应条件控制要求较为严格，中间制剂需要冷藏保存，无法进行单人份检测，检测判读仪器体积较大笨重，使用不便，操作繁琐，在边远地区存在着相当的使用局限性。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置，采用CRISPR-Cas基因编辑系统与荧光监测相结合，检测结果更直观，使用更方便，适用范围更广。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其包括以下步骤：
a).从待测样品中提取待测核酸；
b).将所述待测核酸与荧光报告因子相结合；
c).Cas蛋白在向导核糖核酸(Guide RNA)的引导下，特异性的结合所述待测核酸，并转录出目标核酸片段；
d).在Cas蛋白的作用下，截断所述目标核酸片段，并同时截断所述目标核酸片段中结合的荧光报告因子，使得被截断的荧光报告因子处于游离状态；
e).对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别，得到荧光监测结果。
优选的，所述的步骤a)中，是通过对所述待测样品进行解链反应得到所述待测核酸；所述解链反应进一步包括以下步骤：
a1).在容器A中预先放置冻干处理后的解链酶；
a2).将待测样品加入容器A中进行解链反应，或者，将待测样品加入容器A之前，先在容器A中加入反应复溶液进行复溶。
进一步的，所述的步骤a2)中，所述反应复溶液的溶剂采用TX-100，溶质采用BSA和PEG-6000的组合，其中，所述BSA的质量分数为4～6mg/ul，所述PEG-6000的质量分数为8～12mg/ul。
优选的，所述的步骤a)中，还进一步包括步骤a3)，对所述待测核酸依次经等温预扩增法和重组多聚酶扩增法进行扩增，得到扩增后的核酸。
优选的，所述的步骤b)中，将所述待测核酸与荧光报告因子相结合，进一步包括以下步骤：
b1).在容器B中预先放置冻干处理后的Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子；
b2).将提取的所述待测核酸加入容器B中，使得所述待测核酸与所述荧光报告因子相结合。
优选的，所述的步骤a1)或所述的步骤b1)中，采用冻干保护剂对所述解链酶、Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子进行冻干处理；其中，所述冻干保护剂的溶剂采用Tris-HCL，溶质采用海藻糖、甘露醇、蔗糖的组合，其中，所述海藻糖的质量分数为0.08～0.13g/ml，所述甘露醇的质量分数为0.016～0.025g/ml，所述蔗糖的质量分数为0.016～0.025g/ml。
优选的，所述的步骤c)中，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、TnpB-like、Cas13中的一种以上；所述向导核糖核酸采用CRISPR RNA，且所述向导核糖核酸与所述目标核酸片段的靶序列相互补。
优选的，所述目标核酸片段包括塞卡病毒核酸片段、登革热病毒核酸片段、人乳头瘤病毒核酸片段、埃博拉病毒核酸片段、中东呼吸综合征病毒核酸片段中的一种以上。
优选的，所述的步骤e)中，对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别之前，还进一步包括：在所述容器B中加入对所述荧光信号有放大作用的化学酶。
对应的，本发明还提供了一种采用上述任一项所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法的装置，其包括：
容器A，用于放置待测样品和冻干处理后的解链酶；
容器B，用于放置冻干处理后的Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子；
检测仪器，用于进行荧光监测和监控容器A和容器B的反应时间；
输出机构，用于输出荧光监测结果；其中，所述输出机构采用设置于所述检测仪器上的显示屏，和/或，所述输出机构采用与所述检测仪器通信连接的智能终端或者打印终端。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的一种基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其包括以下步骤：
a).从待测样品中提取待测核酸(DNA或RNA)；
b).将所述待测核酸与荧光报告因子相结合；
c).Cas蛋白在向导核糖核酸(Guide RNA)的引导下，特异性的结合所述待测核酸，并转录出目标核酸片段；
d).在Cas蛋白的作用下，截断所述目标核酸片段，并同时截断所述目标核酸片段中结合的荧光报告因子，使得被截断的荧光报告因子处于游离状态；
e).对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别，得到荧光监测结果。
其中，CRISPR/Cas系统，全名为：常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)，为目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的质体或者噬菌体。CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫:这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。
本系统建立在CRISPR-Cas基因编辑技术的基础上，其原理阐述如下：
原核生物在它们基因组的CRISPR位点里储存了大量的感染性病原体遗传信息，这些信息就是原核生物自身的“抗体”。Cas蛋白通过适应(adaptation)、转录出crRNA和干扰(interference)等步骤，完成原核生物的适应性免疫反应。在适应阶段，外源性遗传物质被原核生物加工处理及挑选，最后整合进CRISPR位点，打下深刻的免疫记忆烙印，为今后再次遭遇该感染源做好准备；最后通过crRNA指引Cas蛋白剪切外源遗传物质的互补链，最终使外源遗传物质降解，消灭外来感染源。
当CRISPR-Cas蛋白以序列特异性方式切割dsDNA时，还会诱导出很强的非特异性ssDNA反式切割效应(trans-cleavage)；反式切割效应(trans-cleavage)是指，Cas蛋白在crRNA的引导下，以特异性方式切割crRNA选取的dsDNA片段后，引导出的非特异性切割ssDNA的行为。
本发明中，所述待测核酸包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、TnpB-like、Cas13中的一种以上，该Cas蛋白具有促进RNA切割的功能，但是需要对应的引导，同时具有移去无用蛋白的功能；所述Cas蛋白可以通过适应(adaptation)、转录出crRNA和干扰(interference)等步骤，完成原核生物的适应性免疫反应。
所述向导核糖核酸(Guide RNA)采用CRISPR RNA(crRNA)，是一种用于引导Cas蛋白特异性切割RNA片段的RNA。crRNA是一种长链RNA前体分子，它成熟成为crRNA之后，可以指引Cas蛋白剪切外源遗传物质的互补链，这就是干扰步骤(interference)，即，所述向导核糖核酸与所述目标核酸片段的靶序列相互补；最终使外源遗传物质降解，消灭外来感染源。
本实施例中，所述的步骤a)中，是通过对所述待测样品进行解链反应得到所述待测核酸；所述解链反应进一步包括以下步骤：
a1).在容器A中预先放置冻干处理后的解链酶；
a2).将待测样品加入容器A中进行解链反应，或者，将待测样品加入容器A之前，先在容器A中加入反应复溶液进行复溶；优选的，所述反应复溶液的溶剂采用TX-100，溶质采用BSA和PEG-6000的组合，其中，所述BSA的质量分数为4～6mg/ul，所述PEG-6000的质量分数为8～12mg/ul；例如，100ml复溶液包括:BSA 0.5g,PEG-6000 1g,TX-100 100ul。
a3).对所述待测核酸依次经等温预扩增法和重组多聚酶扩增法进行扩增，得到扩增后的核酸；采用该扩增技术可实现快速扩增，并且不需要专门仪器。
所述的步骤b)中，将所述待测核酸与荧光报告因子相结合，进一步包括以下步骤：
b1).在容器B中预先放置冻干处理后的Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子；
b2).将提取的所述待测核酸加入容器B中，使得所述待测核酸与所述荧光报告因子相结合。
其中，所述的步骤a1)或所述的步骤b1)中，采用冻干保护剂对所述解链酶、Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子进行冻干处理；其中，所述冻干保护剂的溶剂采用Tris-HCL，溶质采用海藻糖、甘露醇、蔗糖的组合，其中，所述海藻糖的质量分数为0.08～0.13g/ml，所述甘露醇的质量分数为0.016～0.025g/ml，所述蔗糖的质量分数为0.016～0.025g/ml。优选的，本发明的冻干保护剂配方：100ml Tris-HCL(PH8.5)中加入10g海藻糖、2g甘露醇，2g蔗糖。
所述的步骤e)中，对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别之前，还进一步包括：在所述容器B中加入对所述荧光信号有放大作用的化学酶。
其中，可以用于标记荧光报告因子的荧光标记信号物包括但不仅包括：FITC荧光素、荧光微球、荧光颗粒、生物荧光素、其他可发出荧光的物质。并且，6)标记信号物包括荧光信号，激发光信号，可见光信号，化学反应变色信号等。
本实施例中，检测对象可为各类致命性感染性病毒，即，所述待测样品中提取和转录的所述目标核酸片段包括塞卡病毒(Zika virus,ZIKV)核酸片段、登革热病毒(Denguevirus,DENV)核酸片段、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)核酸片段、埃博拉病毒(Ebola virus)核酸片段、中东呼吸综合征病毒(Midle East respiratory syndromecoronavirus)核酸片段中的一种以上。
以快速鉴定HPV16、18型致癌病毒为例，通过肛门拭子(anal swabs)标本提取出HPV病毒的dsDNA，经过等温预扩增(isothermal preamplification)，然后利用重组多聚酶扩增法(recombinase polymerase amplification,RPA)进行扩增。接着，通过Cas12a-crRNA复合体与扩增的HPV dsDNA结合，将其降解，同时诱发dsDNA反式降解反应，以激活结合在dsDNA分子上的荧光报告因子(fluorescent reporter)，结合了荧光报告因子的dsDNA被切割之后会释放出荧光信号；进一步的，为了提高检测灵敏度，本实施例中还对荧光信号再经酶的放大处理，从而完成整个检测。
另外，本发明还提供了一种采用上述任一项所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法的装置，其包括：
容器A，用于放置待测样品和冻干处理后的解链酶；
容器B，用于放置冻干处理后的Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子；
检测仪器，用于进行荧光监测和监控容器A和容器B的反应时间；
输出机构，用于输出荧光监测结果；其中，所述输出机构采用设置于所述检测仪器上的显示屏，和/或，所述输出机构采用与所述检测仪器通信连接的智能终端或者打印终端。
其中，所述容器A和容器B不仅包括试管、EP管等管状容器，还包括但层析法试条与渗滤法试条等固相载体。
本发明的检测装置的具体操作流程如下：
1.解链反应
将待测样本加入A管(容器A)，将A管放入反应区编号为1,2的竖列，根据荧幕提示，等待15分钟后完成解链，获得中间反应物B。A管中预先放置有冻干处理后的解链酶，当待测样本为唾液等带有粘稠性的体液样本时，待测样本加入A管前应先在A管加入200ul的反应复溶液进行复溶，解链反应时间由检测仪器进行自动控制，无需人工操作。
2.脱靶反应
将中间反应物B，用移液器取100ul，加入B管(容器B)，将B管放置在反应区编号为3,4的竖列，根据荧幕提示，等待15分钟后完成脱靶反应。B管中预先放置后冻干处理后的Cas13(Cas蛋白中的一种),向导核糖核酸(Guide RNA)，荧光报告因子(Reporter)；
Cas13在Guide RNA的引导下，会特异性的结合中间反应物B中的目标RNA，实现适应步骤，并转录出目标RNA片段，结合长度为30bp；之后在Cas13作用下，实现干扰步骤，截断特定的目标RNA片段；目标RNA片段被截断后，消耗了Guide RNA，并减少了反应中的无功能蛋白；失去Guide RNA引导的Cas13体现出非特异性无差别截断RNA的特性，针对标记了荧光信号的Reporter-信号亦同样出现了截断效应，荧光信号被截断，游离到B管的缓冲体系中。
本实施例中，脱靶反应中的适应步骤对应全片段核酸，对应单位包括但不包括30bp，反应时间为1-1.5小时。
3.荧光识别
往B管中加入对荧光信号有放大作用的化学酶，将反应区推入检测仪器内部，然后，在检测仪器荧幕的提示下进行操作，10分钟后输出荧光信号读值。当样本中后GuideRNA可以特异性识别适应的RNA片段时，则出现荧光信号读值，反之，则没有。
4.数据输出
本实施例中，数据以打印模式通过打印区的打印机打印输出。
本发明的检测装置，可以同时引多种ssRNA靶标和dsDNA靶标，即在B管中加入多种类型的Guide RNA，实现一次反应多种检测，检测条件的控制全程在仪器的监视下进行，随时对反应有效性进行及时的跟进，保证检测真实有效。
本发明是一种建立在基因编辑技术CRISPR-Cas系统基础上的免疫检测系统。本发明的检测装置的主要检测对象为各类致命性感染性病毒，在核酸分子水平上建立一种灵敏度和特异性并存，半自动模式的分子诊断检测系统，同时适用于大型医疗中心和边远地区，价格低廉，准确性高，快速并且操作简便。
本发明针对的待测样品可以是多种体液，包括尿液，血液，唾液，血清和血浆等，在1到2个小时内给出检测结果。样品的制备过程也非常简单，同时不需要复杂的设备，在边远地区可以方便时候，及时对疑似感染者进行检测鉴定，及时进行疾病防控。荧光信号亦可以通过层析试条模式建立报告模型系统，适合检测现场使用。
需要说明的是，本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。对于装置类实施例而言，由于其与方法实施例基本相似，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。并且，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
综上，本发明具有以下有益效果：
1)储运过程无需冷藏；
2)无需PCR实验室，操作人员无需专业培训；
3)操作简便：
3-1)反应过程中涉及的中间制剂均为冻干品，仅需配制工作液，无稀释等复杂操作；
3-2)所有中间制剂均为室温保存，无需低温设备，不需要平衡室温；
3-3)可实现单人份检测，单人份包装，无需担心开瓶稳定性浪费问题；
3-4)仪器内置cutoff值与标准曲线，自动判读并打印结果；
3-5)检测时间大幅缩短，可实现床旁诊断；
3-6)搭配自动化分析仪可以实现批量自动化检测；
3-7)试剂卡含有可靠的质控方式，防止试剂失效导致结果误判；
4)反应时间为1到1.5小时，本发明脱靶反应中的适应步骤采用30bp单链核酸进行杂交，比起一般PCR更为快速简便；
5)本发明的检测中间制剂采用冻干处理，适于室温保存；
6)仪器提示操作，便于指导，操作简便，无需专业人员，特殊培训；
7)检测精度高，便于临床监测使用；
8)灵敏度高，特异性好：
现有技术的每微升血样可检出一个分子，而本发明的方法灵敏度是现有技术的100倍，可从肺癌患者血样中检出含量很低、来自肿瘤细胞的游离DNA；
9)本发明结合冻干技术，可一次检测多个标靶，节约了样品用量；
10)本发明不仅可以用来研究致病病原体的耐药问题，指导临床用药；还可以分析致病病原体的活力(viability)，以指导感染疾病的防控工作；还可以扩展检测范围，让粪便、呼吸道分泌物、脑脊液等标本都成为检测样品，以用于明确肠炎(enteritis)、肺炎(pneumonia)和脑膜炎(meningitis)等疾病的病因。随着技术的发展，根据准确性、可靠性、简便性、检测速度、灵活性、费用等方面的考虑，还可以将这些检测技术应用于传染性疾病和非传染性疾病的检测，也可以应用于临床、实验室，以及野外等多种场合。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a).从待测样品中提取待测核酸；
b).将所述待测核酸与荧光报告因子相结合；
c).Cas蛋白在向导核糖核酸(Guide RNA)的引导下，特异性的结合所述待测核酸，并转录出目标核酸片段；
d).在Cas蛋白的作用下，截断所述目标核酸片段，并同时截断所述目标核酸片段中结合的荧光报告因子，使得被截断的荧光报告因子处于游离状态；
e).对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别，得到荧光监测结果。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤a)中，是通过对所述待测样品进行解链反应得到所述待测核酸；所述解链反应进一步包括以下步骤：
a1).在容器A中预先放置冻干处理后的解链酶；
a2).将待测样品加入容器A中进行解链反应，或者，将待测样品加入容器A之前，先在容器A中加入反应复溶液进行复溶。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤a2)中，所述反应复溶液的溶剂采用TX-100，溶质采用BSA和PEG-6000的组合，其中，所述BSA的质量分数为4～6mg/ul，所述PEG-6000的质量分数为8～12mg/ul。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤a)中，还进一步包括步骤a3)，对所述待测核酸依次经等温预扩增法和重组多聚酶扩增法进行扩增，得到扩增后的核酸。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤b)中，将所述待测核酸与荧光报告因子相结合，进一步包括以下步骤：
b1).在容器B中预先放置冻干处理后的Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子；
b2).将提取的所述待测核酸加入容器B中，使得所述待测核酸与所述荧光报告因子相结合。
6.根据权利要求2或5所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤a1)或所述的步骤b1)中，采用冻干保护剂对所述解链酶、Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子进行冻干处理；其中，所述冻干保护剂的溶剂采用Tris-HCL，溶质采用海藻糖、甘露醇、蔗糖的组合，其中，所述海藻糖的质量分数为0.08～0.13g/ml，所述甘露醇的质量分数为0.016～0.025g/ml，所述蔗糖的质量分数为0.016～0.025g/ml。
7.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤c)中，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、TnpB-like、Cas13中的一种以上；所述向导核糖核酸采用CRISPR RNA，且所述向导核糖核酸与所述目标核酸片段的靶序列相互补。
8.根据权利要求1或7所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述目标核酸片段包括塞卡病毒核酸片段、登革热病毒核酸片段、人乳头瘤病毒核酸片段、埃博拉病毒核酸片段、中东呼吸综合征病毒核酸片段中的一种以上。
9.根据权利要求5所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法，其特征在于：所述的步骤e)中，对游离状态的荧光报告因子进行荧光识别之前，还进一步包括：在所述容器B中加入对所述荧光信号有放大作用的化学酶。
10.一种采用权利要求1至9任一项所述的基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法的装置，其特征在于，包括：
容器A，用于放置待测样品和冻干处理后的解链酶；
容器B，用于放置冻干处理后的Cas蛋白、向导核糖核酸、荧光报告因子；
检测仪器，用于进行荧光监测和监控容器A和容器B的反应时间；
输出机构，用于输出荧光监测结果；其中，所述输出机构采用设置于所述检测仪器上的显示屏，和/或，所述输出机构采用与所述检测仪器通信连接的智能终端或者打印终端。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910331800.4A CN110029194A (zh) | 2019-04-24 | 2019-04-24 | 基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910331800.4A CN110029194A (zh) | 2019-04-24 | 2019-04-24 | 基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110029194A true CN110029194A (zh) | 2019-07-19 |
Family
ID=67239972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910331800.4A Pending CN110029194A (zh) | 2019-04-24 | 2019-04-24 | 基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110029194A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110628955A (zh) * | 2019-11-04 | 2019-12-31 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统 |
| CN111690773A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-22 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 利用新型Cas酶进行目标核酸检测的方法和系统 |
| WO2021143714A1 (en) * | 2020-01-14 | 2021-07-22 | Mgi Tech Co., Ltd. | Rapid multiplexing crispr-based diagnostics using microfluidic compartmentalization |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107488710A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-12-19 | 上海吐露港生物科技有限公司 | 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒 |
| CN108546718A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-09-18 | 康春生 | crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用 |
| CN108823291A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-11-16 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 基于crispr技术的特异性核酸片段定量检测方法 |
| WO2018226575A1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-12-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ribonucleoprotein-based imaging and detection |
| CN109666662A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-23 | 广州普世利华科技有限公司 | 新型ScCas12a在核酸检测方面的应用 |
-
2019
- 2019-04-24 CN CN201910331800.4A patent/CN110029194A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018226575A1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-12-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ribonucleoprotein-based imaging and detection |
| CN107488710A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-12-19 | 上海吐露港生物科技有限公司 | 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒 |
| CN108546718A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-09-18 | 康春生 | crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用 |
| CN108823291A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-11-16 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 基于crispr技术的特异性核酸片段定量检测方法 |
| CN109666662A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-23 | 广州普世利华科技有限公司 | 新型ScCas12a在核酸检测方面的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 单琳琳等: "成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)介导的基因组编辑技术研究进展", 《细胞与分子免疫学杂志》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110628955A (zh) * | 2019-11-04 | 2019-12-31 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统 |
| CN110628955B (zh) * | 2019-11-04 | 2023-04-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统 |
| WO2021143714A1 (en) * | 2020-01-14 | 2021-07-22 | Mgi Tech Co., Ltd. | Rapid multiplexing crispr-based diagnostics using microfluidic compartmentalization |
| CN111690773A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-22 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 利用新型Cas酶进行目标核酸检测的方法和系统 |
| CN111690773B (zh) * | 2020-06-17 | 2021-08-20 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 利用新型Cas酶进行目标核酸检测的方法和系统 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110029194A (zh) | 基于CRISPR-Cas基因编辑技术的连续荧光监测检测方法及装置 | |
| US11214841B2 (en) | Rapid low-cost detection of valley fever using isothermal amplification and sensing methods | |
| Alhamid et al. | SARS-CoV-2 detection methods: A comprehensive review | |
| CN109652516A (zh) | 一种双链寡核苷酸核酸探针的结构和用途 | |
| US20090286232A1 (en) | Method and apparatus for enhanced sensitivity in bacteriophage-based diagnostic assays | |
| CN102337351B (zh) | 一种流感病毒分型检测试剂盒 | |
| US20050250096A1 (en) | Microorganism detection using bacteriophage amplification | |
| CN103255216B (zh) | 院内感染多病原体并行检测基因芯片及其制作方法和应用 | |
| Sethi et al. | Direct detection of conserved viral sequences and other nucleic acid motifs with solid-state nanopores | |
| CN107312873B (zh) | 一种快速区分5种小鼠呼吸道病原的多重液相基因芯片检测引物、试剂盒及方法 | |
| Lindsay et al. | Rapid antigen-capture assay to detect West Nile virus in dead corvids | |
| Schulte et al. | Hybridization Chain Reaction Lateral Flow Assays for Amplified Instrument-Free At-Home SARS-CoV-2 Testing | |
| CN107267668A (zh) | 环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒 | |
| CN101676405A (zh) | 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN109486973A (zh) | 一种利用重组酶聚合酶等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的可视化方法 | |
| WO2006083292A2 (en) | Microorganism detection using bacteriophage amplification | |
| CN108315481A (zh) | 一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒 | |
| CN102337352B (zh) | 一种pcr微阵列检测多种流感病毒的试剂盒 | |
| Tran et al. | Evaluation of an automated insulated isothermal polymerase chain reaction system for rapid and reliable, on-site detection of African swine fever virus | |
| CN202297608U (zh) | 一种细菌耐药基因的检测试剂盒 | |
| EA010153B1 (ru) | Хранение и обнаружение нуклеиновой кислоты, нанесенной на твердый носитель | |
| Malamud et al. | Oral-based techniques for the diagnosis of infectious diseases | |
| CN106222299A (zh) | 一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr试剂盒及其用途 | |
| CN111334617A (zh) | 用于检测犬四种病毒的多重pcr检测引物、检测方法及应用 | |
| CN108977512A (zh) | 基于数字pcr技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针及其试剂盒与方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190719 |