CN105779449B - 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用 - Google Patents
一种棉花启动子GbU6-5PS及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105779449B CN105779449B CN201510885425.XA CN201510885425A CN105779449B CN 105779449 B CN105779449 B CN 105779449B CN 201510885425 A CN201510885425 A CN 201510885425A CN 105779449 B CN105779449 B CN 105779449B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gbu6
- cotton
- promoter
- promoters
- gus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种棉花启动子GbU6‑5PS及应用,该棉花启动子GbU6‑5PS的正反链如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示,该启动子通过第一轮PCR扩增获得覆盖全长GbU6‑5启动子序列的片段,然后通过第二步进行第二轮PCR扩增,以GbU6‑5P为供体质粒模板,以AtU6‑26SK为受体质粒模板,采用Transfer PCR方法对GbU6‑5P启动子进行截短克隆得到。本发明的棉花启动子GbU6‑5PS不仅适合用于棉花,而且片段很短,长度只有105bp,符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,能显著提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种棉花启动子GbU6-5PS及应用。
背景技术
基因组编辑技术是一种研究基因功能的重要工具,它能精确修饰受体细胞染色体特定位点的基因,可以高效产生特定基因的功能失活突变体,能为生物功能基因组研究提供优质的遗传材料。所以该技术自诞生以来,就受到广大生物学家的青睐。II型CRISPR/Cas9基因组编辑系统是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)之后,另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术。sgRNA和Cas9是该技术系统的两个必要元件,其中sgRNA在CRISPR/Cas9基因组编辑过程中起到靶向结合目的基因位点的功能。在CRISPR/Cas9技术系统中,sgRNA的转录通常由U6启动子驱动完成,因为其转录活性相对较高,而且都有着明确的转录起始位点,精确起始转录具有靶向功能的sgRNA能消除无关DNA序列的转录,从而大大减少脱靶效应的产生。
U6启动子虽然具有高效转录的特点,但是它在同源关系较远的不同物种之间不一定适用,而且同一物种基因组中存在多个U6启动子,这些启动子的转录效率也不相同。另外由于Cas9基因巨大(大于4000bp),而且驱动Cas9基因表达的35S启动子长度也在1000bp左右,这两个片段上分布着绝大多数常用的限制性内切酶位点。因此在构建sgRNA和Cas9共表达载体时,可用于sgRNA重组片段连接的酶切位点非常少。所以这就要求U6启动子上不能再出现这些酶切位点,而只有更短的片段才有可能满足这个要求。因此克隆的U6启动子片段越短越便于CRISPR/Cas9载体的构建。
棉花是我国重要的经济作物和纺织工业原料。其基因组中至少有10种U6启动子。克隆适用于棉花CRISPR/Cas9基因组编辑技术系统的、高转录效率的、短片段的U6启动子,对于利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行棉花分子育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棉花启动子GbU6-5PS及其制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述棉花启动子GbU6-5PS的应用。
本发明的再一目的在于提供包含上述棉花启动子GbU6-5PS的表达载体及应用。
本发明是这样实现的,一种棉花启动子GbU6-5PS,该启动子核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示,该启动子互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的棉花启动子GbU6-5PS由105个核苷酸组成,含有USE和TATA作用元件。
或者在严格条件下与上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子;
或者与上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有90%以上同源性,且具有启动子功能的DNA分子。
优选的,所述严格条件为:在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。
本发明进一步提供了上述棉花启动子GbU6-5PS的制备方法,该方法包括以下步骤:
第一步进行第一轮PCR扩增获得覆盖全长GbU6-5启动子序列的片段,第一轮PCR的程序为:94℃3min;98℃30s,60℃30s,72℃90s,35个循环,然后72℃10min;最后克隆测序验证,正确的克隆质粒被命名为GbU6-5P。
所用引物为:GbU6-5PF:CCGAAGCCAAAGCTCACAAT;
GbU6-5PR:ACAGACCGAACCCAGTAAAC;
第二步进行第二轮PCR扩增,以GbU6-5P为供体质粒模板,以AtU6-26SK为受体质粒模板,采用Transfer PCR方法对GbU6-5P启动子进行截短克隆,获得的截短启动子被命名为GbU6-5PS,其中,Transfer PCR的程序为:95℃1min;95℃30s,60℃1min,72℃40s,13个循环;95℃30s,67℃1min,72℃4min,20个循环;72℃8min;所用引物:
T-GbU6-5PS F:CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAAGGACGTGGTAGCATACTTC;
T-GbU6-5PS R:CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC。
本发明进一步提供了上述棉花启动子GbU6-5PS在驱动GUS基因转录方面的应用。
优选的,所述棉花启动子GbU6-5PS的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在驱动GUS基因转录方面的应用。
优选的,所述棉花启动子GbU6-5PS驱动GUS基因在棉花花粉中的高效转录。
本发明进一步提供了一种GUS融合表达载体,该表达载体是通过将所述棉花启动子GbU6-5PS与GUS基因连接后,克隆至植物表达载体制备得到。
优选的,所述植物表达载体为pCAMBIA 1300。
本发明进一步提供了上述GUS融合表达载体在驱动GUS基因转录方面的应用。
U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件。本发明提供了一种棉花启动子GbU6-5PS及应用。在本发明中,将已经克隆获得的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1787bp)(参考文献:雷建峰,伍娟,陈晓俊,於添平,倪志勇,李月,张巨松,刘晓东.棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析.中国农业科学,2015,48(19):3794-3802.),采用Transfer PCR方法成功地截短出105bp长的棉花启动子GbU6-5PS,并构建启动子驱动的GUS融合表达载体GbU6-5PS::GUS-P1300。将构建好的GbU6-5PS::GUS-P1300与阳性对照CaMV35S::GUS-P1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转化棉花花粉。经GUS组织化学染色显示:克隆得到的105bp的棉花启动子GbU6-5PS能驱动GUS基因在棉花花粉中转录,棉花花粉被染成显著深蓝色。
相比于现有技术的缺点和不足,本发明具有以下有益效果:本发明的棉花启动子GbU6-5PS不仅适合用于棉花,而且片段很短,长度只有105bp,符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,能显著提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。
附图说明
图1是本发明实施例中GbU6-5P启动子的第一轮PCR扩增结果图;
图2是本发明实施例中棉花启动子GbU6-5PS的Transfer PCR扩增结果图;
图3是本发明实施例中棉花启动子GbU6-5PS驱动GUS在棉花花粉中的瞬时表达结果图,参见附图3A所示,图B、C分别是阳性对照CaMV35S强启动子驱动GUS基因表达和阴性对照pCAMBIA 1300转化花粉染色的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
1、试验材料
试验所用AtU6-26SK(参考文献:Feng Z Y,Zhang B,DingW,LiuX D,Yang D L,WeiP,Cao F,Zhu S,Zhang F,Mao Y,Zhu J K.Efficient genome editing in plants usinga CRISPR/Cas system.Cell Research,2013,23(10):1229-1232.)、pBI101载体、农杆菌GV3101、棉花品种新海16均为新疆农业大学农业生物技术重点实验室保存。
各种限制性内切酶购于Fermentas公司;T4DNA连接酶、Blunt Zero平端载体、Trans1-T1感受态细胞、胶回收试剂盒、Taq DNA Polymerase、RNase A、KD Plus DNAPolymerase、1Kb Plus DNA Ladder均购自于北京全式金生物技术有限公司;Phusion超保真DNA聚合酶购自于纽英伦生物技术(北京)有限公司;其它常规试剂均为国产分析纯;引物合成及测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。
2、GbU6-5PS启动子的克隆
(1)第一轮PCR
通过PCR扩增(参考文献:雷建峰,伍娟,陈晓俊,於添平,倪志勇,李月,张巨松,刘晓东.棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析.中国农业科学,2015,48(19):3794-3802.)。获得棉花品种新海16覆盖全长GbU6-5启动子序列的片段,PCR的程序为:94℃3min;98℃30s,60℃30s,72℃90s,35个循环,然后72℃10min;最后克隆测序验证,正确的克隆质粒被命名为GbU6-5P;所用引物为GbU6-5P F:CCGAAGCCAAAGCTCACAAT;GbU6-5P R:ACAGACCGAACCCAGTAAAC。克隆结果如图1所示。
(2)第二轮PCR
本发明第二轮PCR是精确克隆截短的棉花启动子GbU6-5PS,以第一轮PCR克隆的GbU6-5P启动子质粒为供体质粒模板,以拟南芥AtU6-26SK的质粒为受体质粒模板进行由两轮PCR组成的Transfer PCR(参考文献:Erijman A,Shifman J M,Peleg Y.A single-tubeassembly of DNA using the transfer-PCR(TPCR)platform.Methods in MolecularBiology,2014,1116:89-101.),对GbU6-5P启动子进行截短。
根据已克隆的GbU6-5P启动子序列和AtU6-26SK载体序列设计棉花启动子GbU6-5PS的Transfer PCR引物:
T-GbU6-5PS F:CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAAGGACGTGGTAGCATACTTC;
T-GbU6-5PS R:CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC。
以GbU6-5P为供体质粒模板,以AtU6-26SK为受体质粒模板,采用Transfer PCR方法对GbU6-5P启动子进行截短克隆,获得的截短启动子被命名为GbU6-5PS,其中,TransferPCR的程序为:95℃1min;95℃30s,60℃1min,72℃40s,13个循环;95℃30s,67℃1min,72℃4min,20个循环;72℃8min;PCR产物电泳结果如图2所示。
取酶切产物10μL转化Trans1-T1感受态细胞。对初步获得的截短的质粒采用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定。以上截短的启动子质粒经BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定与预期目标片段大小相符(图略)。
酶切正确的质粒进行测序验证,经测序比对为预期的截短GbU6-5PS启动子,GbU6-5PS启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,该启动子互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示测定序列。。
3、GUS融合表达载体GbU6-5PS::GUS-P1300的构建
将已克隆的GUS基因经BbsⅠ酶切,并与同样酶切后的GbU6-5PS质粒连接、转化,挑单克隆进行菌落PCR初步鉴定和酶切鉴定。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pCAMBIA1300和构建好的GbU6-5PS::GUS的融合表达载体,分别回收目标片段,T4DNA连接酶4℃连接过夜。转化,提质粒。
再用HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆,将酶切鉴定正确的质粒命名为:GbU6-5PS::GUS-P1300质粒。
经酶切鉴定正确后,转入农杆菌感受态GV3101,28℃倒置培养两天,挑取阳性克隆于LB培养基(含50μg·mL-1kan和25μg·mL-1Rif)培养至对数生长期,用于下一步侵染。
4、农杆菌真空渗透转化棉花花粉
将构建好的GbU6-5PS::GUS-P1300以及阳性对照CaMV35S::GUS和阴性对照pCAMBIA1300空载体的农杆菌按1:100比例接种于LB培养基(含50g·mL-1kan和25g·mL- 1Rif)中活化。28℃,180rpm摇菌,摇至菌液的OD600=0.6-1.2时,分别吸取不同体积的活化菌液接种到6mL LB培养基(含50μg·mL-1kan和25μg·mL-1Rif)中,使得每个处理起始OD值相同,再次28℃,180rpm摇菌,统一摇至菌液的OD600=1.6时,12000rpm离心5min收集菌体,弃上清液,重悬于花粉萌发培养基(参考文献:张燕红,黄乐平,周小云,王冬梅.农杆菌真空渗透法转化棉花花粉的初步研究.棉花学报,2008,05:354-358.)中(0.1%H3BO3、0.3%Ca(NO3)2、0.2%MgSO4·7H2O、0.1%KNO3、45%蔗糖),收集新鲜棉花花粉,等量分成多份。每份各加入上述不同的农杆菌重悬液,并在-0.05MPa压力下抽真空30min。每种农杆菌转化进行技术重复三次,生物学重复两次。
5、GbU6-5PS::GUS在棉花花粉中的瞬时表达分析
将抽完真空后的棉花花粉悬浮液100rpm离心1min,弃上清液,收集转化后的花粉,并用蒸馏水漂洗4-5次,除去农杆菌。加入适量的GUS染液(0.5mol·L-1磷酸缓冲液,pH 7.0;0.5mol·L-1EDTA,pH 8.0;10%Triton X-100;20mmol·L-1X-Gluc),37℃,180rpm震荡染色3~4h,100rpm离心5min,吸取上清GUS染液保留备用。用蒸馏水漂洗转化后的花粉4~5次,100rpm离心5min确保去除残留的GUS染液。收集的花粉在体式显微镜下观察拍照。同时取处理转化后GUS染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值。
通过GUS组织化学染色发现:截短的棉花启动子GbU6-5PS能驱动GUS基因的表达,棉花花粉被染成蓝色且染色相对较深,接近于阳性对照,而阴性对照pCAMBIA1300转化的花粉未被染蓝色(如图3所示)。
6、结论
本发明的棉花启动子GbU6-5PS不仅适合用于棉花,而且片段很短,长度只有105bp,符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,能显著提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种棉花启动子GbU6-5PS,其特征在于,该启动子的序列如SEQ ID NO.1所示,该启动子互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的棉花启动子GbU6-5PS在驱动GUS基因在棉花花粉中的转录方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述棉花启动子GbU6-5PS的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在驱动GUS基因在棉花花粉中的转录方面的应用。
4.一种GUS融合表达载体,其特征在于,该表达载体是通过将所述棉花启动子GbU6-5PS与GUS基因连接后,克隆至植物表达载体制备得到。
5.如权利要求4所述的GUS融合表达载体,其特征在于,所述植物表达载体为pCAMBIA1300。
6.权利要求4或5所述的GUS融合表达载体在驱动GUS基因在棉花花粉中的转录方面的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510885425.XA CN105779449B (zh) | 2015-12-04 | 2015-12-04 | 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510885425.XA CN105779449B (zh) | 2015-12-04 | 2015-12-04 | 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105779449A CN105779449A (zh) | 2016-07-20 |
CN105779449B true CN105779449B (zh) | 2018-11-27 |
Family
ID=56389943
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510885425.XA Expired - Fee Related CN105779449B (zh) | 2015-12-04 | 2015-12-04 | 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105779449B (zh) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
IL294014B1 (en) | 2015-10-23 | 2024-03-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
CN110214180A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
KR20190130613A (ko) | 2017-03-23 | 2019-11-22 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
EP3942040A1 (en) | 2019-03-19 | 2022-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
-
2015
- 2015-12-04 CN CN201510885425.XA patent/CN105779449B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105779449A (zh) | 2016-07-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105779449B (zh) | 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用 | |
CN105779448B (zh) | 一种棉花启动子GbU6-7PS及应用 | |
CN103993018B (zh) | 控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因及其应用 | |
CN110747187B (zh) | 识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法 | |
CN104946648B (zh) | 一种植物花粉特异性启动子pchf32 及其应用 | |
CA3228222A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
CN102628057B (zh) | 一种无背景定向克隆pcr产物的载体及制备方法和应用 | |
CN101880665B (zh) | 一种水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子及其应用 | |
CN109762815A (zh) | 一种在水稻花药与花粉中特异表达的启动子pchf17及其应用 | |
CN109750037A (zh) | 一种在水稻花粉中特异表达的启动子pchf40及其应用 | |
EP4392561A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
CN106146638B (zh) | 一种控制水稻叶片衰老的基因及其编码的蛋白质 | |
CN105823888B (zh) | 一种利用甘蔗条纹花叶病毒p3n-pipo构建的亚细胞定位试剂盒 | |
WO2011102301A1 (ja) | 藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター | |
CN103320441B (zh) | 一种植物启动子及其应用 | |
CN107058324A (zh) | 水稻根特异表达启动子POsRO4及相应水稻培育方法 | |
CN109306352B (zh) | 番木瓜u6启动子基因及应用 | |
CN104152454B (zh) | 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 | |
NI et al. | Isolation and expression analysis of two genes encoding cinnamate 4-hydroxylase from cotton (Gossypium hirsutum) | |
CN111172308A (zh) | 一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法 | |
CN110055252A (zh) | 一种在水稻花粉中特异表达的启动子pchf45及其应用 | |
CN101831431B (zh) | 启动子afb4及其应用 | |
CN109486818B (zh) | 狗尾草u6启动子基因及应用 | |
CN108251505A (zh) | 一种用于泡吻棘虫头线粒体基因组中三个基因片段核苷酸的扩增测序方法 | |
CN117737065A (zh) | 一种水曲柳强启动子及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20181127 Termination date: 20191204 |