CN104946648B - 一种植物花粉特异性启动子pchf32 及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物花粉特异性启动子PCHF32及其应用，属于基因工程技术领域。本发明还提供含有植物花粉特异性启动子PCHF32的表达载体、基因表达盒，及含有所述基因表达盒的载体。本发明还提供了扩增花粉特异性启动子PCHF32的引物对。本发明的花粉特异启动子PCHF32为水稻内源基因，对水稻基因工程十分有利驱动外源基因在花粉中特异性表达的表达水平精确，提供了一种驱动外源基因在花粉中特异性表达的新方法。

Description

一种植物花粉特异性启动子PCHF32及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种植物花粉特异性启动子PCHF32及其应用。

背景技术

在基因的结构与功能研究中，转录水平的调控是一个关键步骤，基因转录起始是一系列反式作用因子和转录位点共同作用的结果。编码蛋白质的基因包含启动子和编码区，启动子一般位于编码区上游，是反式作用因子的结合位点，有两个主要区域：核心启动子区域和转录调控区域。核心启动子是转录起始的最短启动子片段，一般为40nt，包含核心启动子元件，是一段被RNA聚合酶家族I、II和III识别和结合的DNA序列。转录调控区域位于核心启动子的上游(或下游)，可与特异的转录因子相结合从而对转录的时空、强弱起调控作用，如增强子和沉默子等。启动子具有如下特征：1)序列特异性。启动子含有保守的序列框，序列框中碱基的变化会影响转录水平。2)方向特异性。启动子是一种有方向性的顺式调控因子，分单向启动子和双向启动子两类。3)位置特异性。启动子一般位于基因编码区或功能区的上游。4)种属特异性。不同物种具有不同类型的启动子。5)功能特异性。不同组织和不同生化途径具有不同类型的启动子。核心启动子经典保守序列有以下四种：1)转录起始位点(initiator,Inr)。通常位于翻译起始密码子(AUG)上游-40到-70bp处。转录起始位点并无十分严格的同源顺序，常见的保守序列是处于+1的A和+3的T。TFIID和TFII-I等转录因子可识别转录起始位点并启动转录。2)TATAbox。是核心元件，是RNA聚合酶II的识别位点，也是与一些反式作用因子结合的位点之一。植物启动子的TATA box一般位于转录起始点上游32±7bp处，其保守序列为5’T₃₇C₄₂A₃₈C₄₇T₉₆A₉₇T₉₀A₉₄T₅₃A₉₅T₆₃A₇₁G₄₁3’。TATA box通过与转录因子TFIID的识别结合而决定RNA聚合酶起始转录的位点，形成前转录复合物并起动转录。TATA box还决定转录的方向以及介导上下游元件对转录的调控作用。3)CAAT box，是一种增强转录的元件。一般位于转录起始点的-75bp附近，其保守序列为GGC/TCAATCT。CAAT box与控制转录起始频率有关。4)GC box，通常位于转录起始点的-90bp附近，其保守序列为GGGCGG，可有多个拷贝，须与转录因子SP1互作才能促进基因转录。

启动子按其表达方式可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在生物体各个发育时期和所有的组织中都启动基因表达，具有时空持续性和表达量恒定性。大多数组成型启动子中存在六聚体TGACTG，位于转录起始位点上游100bp左右，并往往重复出现。诱导型启动子能在某些物理或化学信号的诱导下启动基因表达，或可以大幅度地提高基因的转录水平。它们具增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并有明显的专一性。一部分诱导型启动子同时具组织特异性，该类启动子常以诱导信号命名，如光诱导启动子、热诱导启动子、低温诱导启动子、干旱诱导启动子、创伤诱导启动子、激素诱导启动子等。组织特异性表达启动子只在某种细胞、组织或者器官中启动基因表达。其结构上通常存在组织特异性增强子和沉默子，因而调控基因在特定的组织或器官中的转录水平。这些启动子还往往表现出化学物理信号诱导性，还受到组织细胞生理状态以及发育阶段的影响。这种类型的启动子有根特异性启动子、维管束特异性启动子、茎杆和叶片特异性启动子、花特异性启动子、种子和果实特异性启动子等。

随着大量DNA序列的积累和各种基因数据库的建立，有关启动子的预测及鉴定和分析的计算机软件和网站也相继产生，如GENESCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)，GENEFINDER(http://rulai.cshl.edu/tools/genefinder/)，PROMOTER SCAN(ver 1.7http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)，TESS(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)，Match(http://www.generegulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/match.cgi)，AliBata 2.1(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)，ppdb(plant promoter database，http://www.ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp)以及PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)等。启动子克隆的方法也很多，其中PCR是很常用的手段，如环状PCR包括I-PCR(inverse PCR)、P-PCR(panhandle PCR)，TAIL-PCR和反向PCR等。目前，许多植物启动子已被克隆，并已申请了专利保护。但在水稻花粉特异启动子方面，所见报道不多。

水稻是我国的民族产业，研究水稻开花机理意义重大。水稻的花粉形成发生在雄蕊中的花药中，花药含有生殖细胞，这些生殖细胞形成绒毡层和花粉母细胞。绒毡层为雄配子体的发育提供营养，包括各种酶类和非酶类蛋白质，并参与花粉外壁的合成。花粉母细胞则进行减数分裂，产生四分体。四分体中的单细胞经绒毡层分泌胼胝酶的作用分离产生单倍体小孢子体。单倍体小孢子体进一步发育，到晚期时形成中央大液泡。中央大液泡将细胞核排挤到细胞边缘(称为单核靠边期)，形成细胞极性。这种细胞极性的促进小孢子体进行一次不等有丝分裂，产生一个大的营养核和一个小的生殖细胞。小的生殖细胞被完全包含在大的营养细胞内，形成细胞中细胞的特异现象。生殖细胞将进行第二次有丝分裂，产生两个精细胞，形成成熟的花粉粒。我们利用公共DND序列和基因表达数据，找到了水稻花器特异表达基因，并通过DNA序列分析，得到了启动子区域，其中一些基因经过RT-PCR和转基因验证后，确定为水稻花粉特异启动子。这些启动子为水稻的基因工程，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物花粉特异性启动子及其应用。

本发明提供的一种植物花粉特异性启动子PCHF32，其为具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，

或2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等花粉特异性启动功能的由1)衍生的核苷酸序列。

其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，与1)所述的核苷酸序列为与1)相比具有70％以上同源性，且具有同等花粉特异性启动子功能的核苷酸序列。2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，例如SEQID NO:1自第1500位至第2038位所示的核苷酸序列，已被验证具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同等的花粉特异性启动子功能。

本发明提供含有本发明所述植物花粉特异性启动子PCHF32的重组表达载体。本发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞。

本发明还提供与植物花粉特异性启动子PCHF32核苷酸序列互补的DNA分子。本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花粉特异性启动子PCHF32核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。

其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与PCHF32杂交。

严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术一用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

本发明提供含有本发明所述与植物花粉特异性启动子PCHF32核苷酸序列互补的DNA分子的重组表达载体。本发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞。

本发明进一步提供含有所述子花粉特异性启动子PCHF32的基因表达盒。

所述基因表达盒为在花粉特异性启动子PCHF32的下游连接有结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA的基因表达盒。

本发明提供了含有上述基因表达盒的表达盒重组表达载体。本发明提供了含有上述表达盒重组表达载体的宿主细胞。

本发明进一步提供含有上述花粉特异性启动子PCHF32的基因表达盒的植物花粉。

本发明还提供了扩增所述花粉特异性启动子PCHF32的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.5-6所示。

一种扩增花粉特异性启动子PCHF32的方法，其为通过SEQ IDNO.2-3引物对或SEQ ID NO.5-6引物对PCR扩增花粉特异性启动子PCHF32的核苷酸序列。

本发明还提供驱动外源基因在花粉中特异性表达的方法，包括如下步骤：

将花粉特异启动子PCHF32和目的外源基因导入到载体中得到含有花粉特异性启动子PCHF32和目的外源基因的表达盒重组表达载体，并将其引入植物基因组，得到外源基因在花粉中特异表达的转基因植物。

本发明提供了植物花粉特异性启动子PCHF32、启动子PCHF32的互补DNA分子、含有所述花粉特异性启动子PCHF32的基因表达盒在制备转基因植物中的应用。

所述转基因植物为外源基因在花粉中特异表达的转基因植物，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因植物。

所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

本发明提供的花粉特异启动子PCHF32优点如下：

1)花粉特异启动子PCHF32为水稻内源基因，对水稻基因工程十分有利。

2)花粉特异启动子PCHF32驱动GUS基因特异性表达实验表明，花粉特异启动子PCHF32驱动外源基因在花粉中特异性表达的表达水平精确。

3)本发明提供了一种驱动外源基因在花粉中特异性表达的新方法。

附图说明

图1是实施例2中花粉特异性启动子PCHF32的重组表达载体1300gus-PCHF32构建流程图。

图2是实施例3中花粉特异性启动子PCHF32的重组表达载体DX2181-PCHF32构建流程图。

图3是实施例5中1300gus-PCHF32转基因水稻花药GUS染色照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：水稻花粉特异性启动子PCHF32获取

1.水稻基因组DNA的提取

根据植物DNA分离试剂盒(成都福际生物技术有限公司)方法说明提取水稻基因组DNA。基因组来源于水稻日本晴品种新鲜叶子。提取的基因组DNA分装保存-20℃备用。

2.设计PCR PCHF32引物

引物设计使用Gibson Assembly方法，扩增产物插入到1300GUSplus载体NcoI和HindIII酶切位点。扩增PCHF32基因引物如序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便Gibson Assembly连接。

PCR反应体系(50μ1)：

DNA模板:1μ1(50ng)

KOD聚合酶(购自东洋纺公司):0.5μ1

10X buffer:5μl

正向引物:2.5μ1(10μM)

反向引物:2.5μl(10μM)

dNTP:2μl(10mM)

H₂O:36.5μl

PCR程序:预变性95℃4min，变性94℃30s，退火50℃40s，延伸72℃2min 30s，35个循环，延伸72℃10min。

实施例2：构建启动子PCHF32的重组表达载体1300gus-PCHF32

构建流程见图1，将实施例1扩增产物插入到1300GUSplus载体NcoI和HindIII酶切位点。

引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3扩增PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳回收2000bp左右产物。NcoI及HindIII酶切载体1300GUSplus，回收线性酶切载体。

2X连接试剂盒连接启动子PCHF32到1300GUSplus，10ul体系如下：

2.5μ1PCHF32PCR产物(50ng)

2.5μ1酶切载体(100ng)

5μ1Ligation Mix

连接程序：50℃60分钟。

转化：取上述连接产物5μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞。挑选阳性克隆测序。命名为1300gus-PCHF32。1300GUSplus载体含有GUS基因，其序列如SEQ ID NO:4所示，经染色其呈现蓝色，用于检测启动子的特异性表达。

实施例3：构建含PCHF32启动子序列重组表达载体DX2181-PCHF32

参照图2的构建流程，先构建含PCHF32启动子序列的重组克隆载体pGEM-PCHF32，再以之为基础构建含PCHF32启动子序列的重组表达载体DX2181-PCHF32。

1.构建含PCHF32启动子序列的重组克隆载体pGEM-PCHF32

参照实施例1的方法，以序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对替换实施例1中序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行扩增，得到的扩增产物与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体pGEM-PCHF32。转化大肠杆菌感受态细胞，进一步挑选阳性克隆，测序。将测序正确的克隆提取质粒。

2.构建含PCHF32启动子序列的重组表达载体DX2181-PCHF32

以限制性内切酶BamHI和NcoI分别酶切实施例3所得的重组克隆载体pGEM-PCHF32和表达载体DX2181，将切下的含PCHF32启动子的片段插入到DX2181载体的BamHI和NcoI酶切位点，构建重组载体DX2181-PCHF32。

4μ1PCHF32酶切片段(50ng)

4μ1酶切载体(100ng)

1μ1T4连接酶

1ul 10×Buffer

连接程序：22℃2小时。

电击转化感受态大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。DX2181-PCHF32在启动子下游包含绿色荧光蛋白基因GFP基因，其序列如SEQ IDNO:7所示，可以用来验证PCHF32启动子表达特异性和强度。

实施例4：转1300gus-PCHF32的水稻的获得

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml(含有抗生素)YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm 10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml 10％甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例1中得到的1300gus-PCHF32质粒，2.5KV电击转化。在含有卡那霉素和利福平的YEB培养板上28℃培养，挑选阳性克隆，用pCAMBIA1300NH-GUSplus载体特异性引物SEQ ID NO:8和SEQID NO:9PCR验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻中花11(Hiei Y Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证的转基因阳性植株，自交结实获得T1代。取T0或T1代植株进行后续分析。

实施实例5：转基因水稻GUS染色分析

配制GUS染色液X-Gluc反应液(50mM磷酸纳缓冲液，pH值7.0，0.5mM铁氰化钾，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mg/ml X-Gluc，体积百分含量20％甲醇，0.1％Triton X-100)，将采集的水稻各组织材料浸泡在X-Gluc反应液中37℃过夜，然后用体积百分含量70％乙醇脱去组织的叶绿体颜色后观察照相。结果如图3所示，仅在转基因水稻的花粉中显蓝色，小麦的其它花器官组织(雌蕊、子房、花药)和营养组织(根、叶)中未见蓝色，表明PCHF32启动子可驱动GUS基因在水稻花粉中特异性表达。

另外，SEQ ID NO:1自第1500位至第2038位所示的核苷酸序列，参照上述实施例的方法，已被验证具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同等的花粉特异性启动子功能。

Claims (13)

1.一种植物花粉特异性启动子PCHF32，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.与权利要求1所述植物花粉特异性启动子PCHF32核苷酸序列互补的DNA分子。

3.含有权利要求1所述植物花粉特异性启动子PCHF32的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞。

5.含有权利要求2所述与植物花粉特异性启动子PCHF32核苷酸序列互补的DNA分子的重组表达载体。

6.含有权利要求5所述重组表达载体的宿主细胞。

7.含有权利要求1所述花粉特异性启动子PCHF32的基因表达盒。

8.含有权利要求7所述基因表达盒的表达盒重组表达载体。

9.含有权利要求8所述表达盒重组表达载体的宿主细胞。

10.扩增权利要求1所述花粉特异性启动子PCHF32的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.5-6所示。

11.驱动外源基因在花粉中特异性表达的方法，包括如下步骤：

将权利要求1所述的花粉特异启动子PCHF32和目的外源基因导入到载体中得到含有花粉特异性启动子PCHF32和目的外源基因的表达盒重组表达载体，并将其引入植物基因组，得到外源基因在花粉中特异表达的转基因植物。

12.权利要求1所述植物花粉特异性启动子PCHF32在制备转基因植物中的应用。

13.权利要求7所述基因表达盒在制备转基因植物中的应用。