CN105602987A - 一种高效的dc细胞xbp1基因敲除方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效率的DC细胞XBP1基因敲除方法。本发明DC细胞XBP1基因敲除方法包括基因敲除靶点和寡核苷酸设计、寡核苷酸退火反应处理、酶切线性化载体、线性化载体与双链寡核苷酸连接反应和转化感受态细胞以及DC细胞XBP1基因敲除等步骤。本发明DC细胞XBP1基因敲除方法采用改良的CRISPR/pCas9基因敲除系统，以XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计并制备出pCas9/gRNA1-XBP1质粒，进一步在L189药物的处理作用下使其对DC细胞进行转染，从而能高效的敲除DC细胞内的XBP1基因，有效保证了DC细胞的免疫刺激作用，有效发挥了DC细胞抗肿瘤免疫作用。

Description

一种高效的DC细胞XBP1基因敲除方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种高效的DC细胞XBP1基因敲除方法。

背景技术

树突状细胞(DendriticCell，DC)对于激发和维持T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应至关重要。然而，肿瘤可通过削弱DC细胞功能从而逃避免疫系统的杀伤作用。有研究表明DC细胞内的内质网压力感受因子XBP1的激活导致DC细胞抗肿瘤免疫活性降低，最终导致肿瘤的进展。XBP1可调控DC细胞内的脂质代谢，脂质过氧化反应的副产品可以激发DC细胞内三酰甘油的生物合成反应，导致异常的脂质堆积，最终抑制DC的功能，不能有效激发出抗肿瘤活性的T细胞。因此，若能有效抑制DC细胞内XBP1基因的表达，将为肿瘤的靶向治疗提供有效的途径。

目前抑制DC细胞内XBP1基因的表达是采用传统siRNA法对XBP1基因进行抑制，但是只能抑制大约50％的XBP1基因表达，抑制效率较低。因此，如果能找到一种新的抑制DC细胞内XBP1基因表达方法将有重要的生物学和医学意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种DC细胞中XBP1基因的敲除方法，旨在解决DC细胞中由于XBP1基因的存在并被激活而导致DC细胞抗肿瘤免疫活性降低的不利现象。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种DC细胞XBP1基因敲除方法。本发明实施例DC细胞XBP1基因敲除方法包括如下步骤：

以内质网压力感受因子XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计，并根据所述CRISPR靶向序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应处理形成双链寡核苷酸；

酶切pCas9/gRNA1载体获得线性化载体；

将所述双链寡核苷酸与所述线性化载体在连接反应体系中进行连接反应处理，获得连接产物；

将所述连接产物转化感受态细胞，并将被转化后的细胞进行扩大培养后进行质粒提取处理，获得pCas9/gRNA1-XBP1质粒；

与现有技术相比，本发明DC细胞XBP1基因敲除方法采用CRISPR/pCas9基因敲除系统，以XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计并制备出pCas9/gRNA1-XBP1质粒，使其对DC细胞进行转染，从而能高效的敲除DC细胞内的XBP1基因，从而有效保证了DC细胞的免疫刺激作用，有效发挥了DC细胞抗肿瘤免疫作用。

进一步地，通过向转染培养体系中还加入L189试剂，该L189试剂能够与CRISPR/pCas9基因敲除系统发挥增效作用，显著提高了有效提高了CRISPR/pCas9基因敲除系统敲除XBP1基因的效率。

附图说明

图1为改进CRISPR/Cas9系统作用原理示意图；

图2为pCAS9/gRNA1质粒载体图谱；

图3为实施例2、3中NC-DC、XBP1-DC和XBP1/L189-DC三组DC细胞中XBP1基因的表达水平柱状图；

图4为NC-DC-T、XBP1-DC-T和XBP1/L189-DC-T三种DC-T细胞对RB视网膜母细胞瘤细胞的杀伤效率图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种高效的DC细胞XBP1基因敲除方法。在一实施例中，该本发明实施例DC细胞XBP1基因敲除方法包括如下步骤：

步骤S01.基因敲除靶点和寡核苷酸设计：以内质网压力感受因子XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计，并根据所述CRISPR靶向序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

步骤S02.寡核苷酸退火反应处理：将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应处理形成双链寡核苷酸；

步骤S03.酶切线性化载体：酶切pCas9/gRNA1载体获得线性化载体；

步骤S04.线性化载体与双链寡核苷酸连接反应：将步骤S02中获得的双链寡核苷酸与步骤S03中获得的所述线性化载体在连接反应体系中进行连接反应处理，获得连接产物；

步骤S05.转化感受态细胞：将步骤S04中获得的所述连接产物转化感受态细胞，并将被转化后的细胞进行扩大培养后进行质粒提取处理，获得pCas9/gRNA1-XBP1质粒；

步骤S06.DC细胞XBP1基因敲除：将所述pCas9/gRNA1-XBP1质粒对DC细胞进行转染培养处理。

具体地，上述步骤S01中的CRISPR靶向序列设计是以基于CRISPR/pCas9基因敲除系统。

其中，该CRISPR/pCas9基因敲除系统中的CRISPR指的是规律成簇的间隔短回文重复(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)。CRISPR/Cas是在大多数细菌和古细菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统首先产生与靶标序列对应的RNA序列，与病毒或质粒的DNA进行互补作用，然后引导Cas内切酶对互补的序列进行双链切割。其中Cas基因家族中的Cas9广泛地应用于该系统中，它是一种天然存在的内切酶，具有两个酶切活性结构域：HNH核酸酶结构域和Ruv-Clike结构域，分别切割互补链和非互补链。切割过程需要另外两个RNA的帮助，分别为CRISPRRNA(crRNA)和反式CRISPRRNA(trans-actingCRISPRRNA，tracrRNA)，人们已经将这两种RNA改造融合成一个向导RNA(single-guideRNA，sgRNA)，单个sgRNA足以帮助Cas9实现定点切割的效果。

经过人工改造的CRISPR/Cas系统一般分为两种，一种主要由Cas9、tracrRNA和crRNA三部分构成；另一种主要由Cas9和sgRNA两部分构成。载体的构建过程简便快捷，仅需人工合成一段和靶标序列相同的序列，连接至载体特定位点即可，具有高通量高效率的特点。

CRISPR/Cas9系统作用原理如图1所示，其平台是从化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的II型CRISPR系统优化而来，由SpCas9核酸酶和gRNA构成。其中SpCas9核酸酶识别基因组中的PAM(Protospaceradjacentmotif,PAM)序列，gRNA中的长约20bp的引导序列决定靶向特异性。当基因组上位于PAM5'端的前体间隔序列(Protospacer)与gRNA中的引导序列互补时，Cas9核酸酶启动对DNA双链进行切割，形成DNA双链断裂缺口(Double-strandbreaks,DSBs)。

DSBs能激活细胞内非同源末端连接(Non-homologousendjoining,NHEJ)和同源重组(Homologydirectedrepair,HDR)两种DNA修复机制。NHEJ修复过程可以引入碱基的随机插入或者缺失(Insertionordeletion)；而在外源模板存在的情况下，细胞也可以通过HDR的方式对基因组进行精确修复。细胞内发生HDR的频率比NHEJ低，只发生于细胞分裂的S期和G2期，而NHEJ发生于整个细胞周期。HDR与NHEJ在细胞内同时存在，但在NHEJ存在缺陷的细胞内HDR发生频率更高，因此抑制NHEJ可提高HDR的发生频率。

NHEJ包含两种类型的途径：(1)DNA连接酶IV依赖性NHEJ(经典NHEJ，C-NHEJ)途径，主要用于末端连接；(2)选择性NHEJ(alt-NHEJ/A-NHEJ/A-EJ)途径，需要DNA连接酶I/III，C-NHEJ途径缺失时可诱发。

因此，CRISPR/Cas9基因敲除系统的靶点由19个碱基构成。靶点前面为转录起始信号G，靶点后面为PAM序列NGG。这样可作为靶点的序列为GN20GG。基于此，上述步骤S01中是以内质网压力感受因子XBP1为靶基因，通过在线软件(http://crispr.mit.edu)针对XBP1基因进行CRISPR靶向序列设计和脱靶位点预测。那么根据所述CRISPR靶向序列设计寡核苷酸序列。

在一实施例中，该过综合分析最终选择的CRISPR靶向序列如下述SEQIDNO：1中下划线所示：

“...CGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGC...”(SEQIDNO：1)

在进一步实施例中，根据所述CRISPR靶向序列设计的寡核苷酸序列包括正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，在一具体实施例中，所述正向寡核苷酸序列如下述SEQIDNO：2所示：

5’GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’(SEQIDNO：2)

反向寡核苷酸序列如下述SEQIDNO：3所示：

5’AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGTGTTTC3’(SEQIDNO：3)

上述步骤S02中的退火反应处理是在退火反应体系中进行的，在此过程中，步骤S01中设计的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列在该退火反应体系中形成双链寡核苷酸。

在一实施例中，该退火反应体系除了包括上文所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列之外，还包括NaCl和Tris-Cl试剂，在具体实施例中，该退火反应体系如下文实施例1中表1中所示的试剂。在进一步实施例中，该退火反应的程序为：90℃4min，70℃10min，55℃10min，40℃10min，25℃10min。通过对退火反应体系和条件的控制，能有效提高退火反应效率。

在一实施例中，上述步骤S03中酶切pCas9/gRNA1载体的酶选EcoRV。其中，pCas9/gRNA1载体的图谱如图2所示，该EcoRV在图2所示的酶切位点进行酶切，酶切后用琼脂糖凝胶回收线性化载体。

在一实施例中，上述步骤S04中的连接反应体系除了包括上文所述的双链寡核苷酸和线性化载体之外，还包括T4DNA连接酶、EcoRV、连接酶Buffer、PEG4000试剂，在具体实施例中，该连接反应体系如下文实施例1中表2中所示的试剂。在进一步实施例中，该连接反应的条件为：22℃30min，37℃15min。通过对连接反应体系和条件的控制，能有效提高连接反应效率。

上述步骤S05中感受态细胞可以是本领域常用的感受态细胞，在一具体实施例中，该感受态细胞可以是大肠杆菌DH5α感受态细胞。将被转化后的大肠杆菌DH5α感受态细胞在氨苄抗性的琼脂平板上37℃培养转化后，大约14-16小时后平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行PCR鉴定，筛选阳性细胞进行扩大培养，然后获取质粒，此时，该质粒为pCas9/gRNA1-XBP1质粒。

上述步骤S06的转染培养处理的步骤中，被转染后的DC细胞在pCas9/gRNA1-XBP1质粒的作用下，DC细胞中的XBP1基因被敲除。

为了提高转染率，在一实施例中，在转染过程中，向转染体系中还加入L189试剂。在进一步实施例中，加入的L189试剂在所述转染培养体系中的浓度为0.1μM-10μM。向转染培养体系中加入L189试剂后，该L189可靶向作用于DNA连接酶I、III和IV的DNA结合域，降低这三种DNA连接酶与DSBs的亲和力，从而抑制它的功能。因此，将L189与CRISPR/Cas9系统共同转进细胞可通过阻碍NHEJ而增强HDR的发生频率，大大提高基因编辑的精准性，从而提高DC细胞中的XBP1基因被敲除率。通过进一步控制L189在转染体系中的浓度，以实现进一步提高DC细胞中的XBP1基因被敲除率。

上述L189试剂(别名：6-Amino-2,3-dihydro-5-[(phenylmethylene)amino]-2-4(1H)-pyrimidineone)分子结构式为如下结构式A。

在上述DC细胞XBP1基因敲除方法的各实施例中，在一实施例中，控制转染体系中pCas9/gRNA1-XBP1质粒加入DC细胞的浓度为10-20μg/ml。通过优化pCas9/gRNA1-XBP1质粒的浓度，以实现提高对DC细胞的转染率。

在另一实施例中，上述各实施例中的转染体系包括Polyfect-V转染试剂4.8ul，Alys505培养基。

因此，上述本发明实施例DC细胞XBP1基因敲除方法采用CRISPR/pCas9基因敲除系统，利用本发明pCas9/gRNA1-XBP1质粒对DC细胞进行转染，从而能高效的敲除DC细胞内的XBP1基因，从而有效保证了DC细胞的免疫刺激作用，有效发挥了DC细胞抗肿瘤免疫作用。优选的向通过向转染培养体系中还加入L189试剂，该L189试剂能够与CRISPR/pCas9基因敲除系统发挥增效作用，显著提高了有效提高了CRISPR/pCas9基因敲除系统敲除XBP1基因的效率。

现以具体的pCas9/gRNA1-XBP1质粒及其制备方法和DC细胞XBP1基因敲除方法为例，对本发明做进一步详细说明。

实施例1

本发明实施例1提供一种DC细胞XBP1基因敲除方法，包括如下步骤：

S11.基因敲除靶点和寡核苷酸设计

以内质网压力感受因子XBP1为靶基因，通过在线软件(http://crispr.mit.edu)针对XBP1基因进行CRISPR靶向序列设计和脱靶位点预测。经过综合分析最终选择的靶向序列如下划线所示。

“...CGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAAAGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAGCCCAGAGAGGGGC...”(SEQIDNO：1)

设计的插入寡核苷酸序列如下：

正向寡核苷酸序列为：

5’GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’

反向寡核苷酸序列为：

5’AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGTGTTTC3’

S12.pCas9/gRNA1基因敲除载体连接和鉴定

S121寡核苷酸退火

用水将步骤S11设计的寡核苷酸稀释为100μM。按以下表1所示的体系配制退火反应体系：

表1

正义寡核苷酸(100μM)	5μl
		反义寡核苷酸(100μM)	5μl
NaCl	100mM
		Tris-Cl pH7.4	50mM5 -->
加水补足	50μl

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放至PCR仪上，运行以下程序：90℃4min，70℃10min，55℃10min，40℃10min，25℃10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20℃长期保存。

S122酶切线性化载体

用EcoRV酶切2μgpCas9/gRNA1载体(具体图谱见附图1)。酶切后用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量至浓度为500ng/μl。

S123连接

用水将步骤S121退火后双链寡核苷酸(10μM)稀释100倍备用。按照以下表2所示的体系配制连接反应体系：

表2

T4 DNA连接酶	5U
		EcoRV	5U
线性化载体	2μl
		稀释100倍后双链寡核苷酸	1μl
10×连接酶Buffer	1μl
		50％PEG4000	1μl
加水补足	10μl

反应条件：22℃30min，37℃15min。

S124转化感受态细胞及PCR鉴定阳性克隆

用步骤S123连接后产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。在氨苄抗性的琼脂平板上37℃培养转化后细菌，大约14-16小时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行PCR鉴定。

鉴定引物：

gRNA-FGACTATCATATGCTTACCGTAACT

gRNA-RCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA

阳性克隆鉴定产物大小为190bp，阴性克隆无条带。

将鉴定正确的阳性克隆扩大培养后提取pCas9/gRNA1-XBP1质粒，用于后续细胞转染。

S13.DC细胞培养

S131抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自体血浆4℃保存备用；

S132取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到2个装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心(800g，15min)；

S133吸取白膜层细胞，加入到装有5mlRPMI1640的50ml离心管中；

S134加入RPMI1640至总体积为50ml，离心(600g，10min)，弃上清液；

S135加入50mlRPMI1640，离心(600g，10min)，弃上清液；

S136用含10％自体血浆的Alys-505培养液重悬细胞，分装入六孔板中，5×10⁶/ml，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中培养2h；

S137洗涤并收集未贴壁的细胞进行T细胞培养。保留贴壁细胞于六孔板中，加入含100ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4、及10％自体血浆的Alys-505培养液，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中继续培养；

S138Day3：半量换液并补充新鲜的细胞因子，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中继续培养；

S139Day5：收集DC细胞，计数，PBS离心洗涤细胞(1500rpm×10min)，以含100ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4及10％自体血浆的Alys-505培养液重悬细胞，分别接种于6孔板中，1×10⁶个细胞/孔，2ml/孔；共设三组。

S14.DC细胞XBP1基因敲除

S141DC的分组情况如下：

(1)阴性对照组；(NC-DC)

(2)pCas9/gRNA1-XBP1组；(XBP1-DC)

(3)pCas9/gRNA1-XBP1+L189组。(XBP1/L189-DC)

S142XBP1基因敲除

(1)DC培养第六天，按照下述表3中的体系制备质粒稀释液。其中，表3中的组2所示的pCas9/gRNA1-XBP1为上述实施例1制备的pCas9/gRNA1-XBP1质粒。

表3

(2)准备转染试剂稀释液：Polyfect-V转染试剂4.8ul，Alys505培养基145.2ul。

(3)分别将质粒稀释液50ul和转染试剂稀释液50ul充分混匀，室温孵育15min。

(4)72小时后检测二组DC细胞中XBP1基因的表达。

实施例2

本发明实施例2提供了一种DC细胞XBP1基因敲除方法。该方法包括如下步骤：

S21.基因敲除靶点和寡核苷酸设计

直接按照实施例1中S11进行处理。

S22.pCas9/gRNA1基因敲除载体连接和鉴定

直接按照实施例1中步骤S12进行处理。

S23.DC细胞培养

直接按照实施例1中步骤S13进行处理。

S24.DC细胞XBP1基因敲除

S241DC的分组情况如下：

(1)阴性对照组；(NC-DC)

(3)pCas9/gRNA1-XBP1+L189组。(XBP1/L189-DC)

S242XBP1基因敲除

(1)DC培养第六天，按照下述表4中的体系制备质粒稀释液。其中，表4中的组3所示的pCas9/gRNA1-XBP1为本实施例2步骤S22制备的pCas9/gRNA1-XBP1质粒。

表4

(2)准备转染试剂稀释液：Polyfect-V转染试剂4.8ul，Alys505培养基145.2ul。

(3)分别将质粒稀释液50ul和转染试剂稀释液50ul充分混匀，室温孵育15min。

(4)将转染液加入培养至第六天的DC细胞中，XBP1/L189-DC组中另外加入1uML189。

(5)72小时后检测二组DC细胞中XBP1基因的表达。

DC细胞内XBP1基因表达水平的检测

将上述实施例1、2中组1、组2和组3中的转染后的DC分别进行XBP1基因表达水平的检测，具体方法如下：

(1)RNA提取

分别收集1×10⁶个质粒转染后的三组DC细胞，利用RNA提取试剂盒(AurumTotalRNAMiniKit，BioRad，Cat.No.732-6820)提取出细胞内的总RNA。

(2)qRT-PCR检测XBP1-mRNA水平

利用一步法qRT-PCR试剂盒(iScript^TMOne-StepRT-PCRKitWithGreen，Bio-Rad，Cat.No.170-8892)对提取出的总RNA进行XBP1基因表达水平检测。

反应体系如下表5所示：

表5

反应条件如下表6所示：

表6

(3)XBP1基因敲除结果

三组DC细胞中XBP1基因的表达水平如图3所示，以NC-DC中XBP1表达量作为100％，pCas9/gRNA1-XBP1质粒转染组XBP1-DC的相对表达量为18.59％，pCas9/gRNA1-XBP1质粒转染+L189药物处理组XBP1/L189-DC的相对表达量为0.89％。单纯pCas9/gRNA1-XBP1质粒转染大概能敲除DC细胞内超过80％的XBP1基因。而加入L189处理后，pCas9/gRNA1-XBP1质粒敲除XBP1基因的效率大概是不加L189的XBP1-DC组的20.9倍。因此，L189可大大提高CRISPR/Cas9系统敲除XBP1基因的效率。

实施例3

DC激发的T细胞抗肿瘤实验

S31DC-T细胞培养

(1)将实施例1中步骤S13中培养DC细胞前的未贴壁细胞用含0.5％自体血浆的Alys-505培养液调整细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，同时每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中培养。

(2)24h后，每孔分别加入50ng/mlCD3单抗，1000U/mlIL-2，1000U/mlIL-1α，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中继续培养。

(3)每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/mlIL-2和0.5％自体血浆的Alys-505培养液。

(4)第9天将三种DC细胞(NC-DC、XBP1-DC(实施例2中转染DC)、XBP1/L189-DC(实施例3中转染DC))分别与T细胞以1:10的比例混合，用含0.5％自体血浆、1000U/mlIL-2、100ng/mlGM-CSF的Alys-505培养液继续培养至第14天，获得三种成熟的DC-T细胞。

S32DC-T细胞抗肿瘤实验

(1)以三种DC-T细胞(NC-DC-T、XBP1-DC-T、XBP1/L189-DC-T)作为效应细胞，CFSE标记的视网膜母细胞瘤RB作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀。

(2)5％CO₂，37℃培养箱孵育24h，反应结束后，加入1μg/mlPI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检测CFSE+PI+细胞(死亡的RB细胞)的百分率。实验结果(图4)表明，与对照组相比，DC细胞内XBP1基因的敲除效率越高，其诱导的DC-T细胞对RB肿瘤细胞的杀伤效率越高，激发出更强的抗肿瘤免疫效应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高效的DC细胞XBP1基因敲除方法，包括如下步骤:

以内质网压力感受因子XBP1为靶基因进行CRISPR靶向序列设计，并根据所述CRISPR靶向序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应处理形成双链寡核苷酸；

酶切pCas9/gRNA1载体获得线性化载体；

将所述双链寡核苷酸与所述线性化载体在连接反应体系中进行连接反应处理，获得连接产物；

将所述连接产物转化感受态细胞，并将被转化后的细胞进行扩大培养后进行质粒提取处理，获得pCas9/gRNA1-XBP1质粒；

将所述pCas9/gRNA1-XBP1质粒对DC细胞进行转染培养处理。

2.根据权利要求1所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述转染培养处理的转染培养体系中还加入L189。

3.根据权利要求2所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述L189在所述转染培养体系中的浓度为0.1μM-10μM。

4.根据权利要求2或3所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述pCas9/gRNA1-XBP1质粒的浓度为10-20μg/ml；所述DC细胞的浓度为2×10⁵个/ml-2×10⁶个/ml。

5.根据权利要求1-3任一所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述CRISPR靶向序列为CCGCGCCGAACCCGGCCGA。

6.根据权利要求5所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述正向寡核苷酸序列为：

5’-GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT-3’；

所述反向寡核苷酸序列为：

5’-AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGTGTTTC-3’。

7.根据权利要求1-3、6任一所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述退火反应处理中的退火反应体系包括所述正向寡核苷酸序列、所述反向寡核苷酸序列、NaCl和Tris-Cl试剂，且所述退火反应的程序为：90℃4min，70℃10min，55℃10min，40℃10min，25℃10min。

8.根据权利要求1-3、6任一所述的DC细胞XBP1基因敲除方法，其特征在于：所述连接反应体系包括所述双链寡核苷酸、所述线性化载体、T4DNA连接酶、EcoRV、连接酶Buffer、PEG4000试剂，且所述反应条件为：22℃30min，37℃15min。