CN106434782B - 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 - Google Patents
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106434782B CN106434782B CN201610895160.6A CN201610895160A CN106434782B CN 106434782 B CN106434782 B CN 106434782B CN 201610895160 A CN201610895160 A CN 201610895160A CN 106434782 B CN106434782 B CN 106434782B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydroxyproline
- gene
- culture medium
- proline
- cis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/05—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with a quinone or related compound as acceptor (1.3.5)
- C12Y103/05001—Succinate dehydrogenase (ubiquinone) (1.3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
- C12Y114/11002—Procollagen-proline dioxygenase (1.14.11.2), i.e. proline-hydroxylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
- C12Y401/03001—Isocitrate lyase (4.1.3.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种产顺式‑4‑羟脯氨酸的方法,该方法通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H,利用CRISPR‑Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α‑酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株,并将重组菌株发酵培养后,全细胞转化生产顺式‑4‑羟脯氨酸。本方法培养方式简单,并且菌株活力较高,产物转化率较高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法。
背景技术
羟脯氨酸(hydroxyproline),亚氨基酸之一,通常在第四位上带有羟基,但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子,所以有4种立体异构体。在动物胶和骨胶原中含有L-羟脯氨酸。自然界中不存在D-羟脯酸。是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,可以通过脯氨酸羟化酶生成。在食品、医学和工业上具有广泛的应用。在食品上, 羟脯氨酸可作为婴儿的营养物质来源来补充甘氨酸丙氨酸和葡萄糖,羟脯氨酸还有独特的甜味能改善饮料的风味,常作为饮料的添加剂;医学上,在食品和饮料中添加可防止过敏性炎症,衍生物 N-乙酰羟脯氨酸可用于治疗结蹄组织疾病和风湿性关节炎;顺式-4-羟脯氨酸作为抗癌药物治疗各种癌症,包括肝,膀胱,前列腺,肾盂等。防止骨胶原折叠成一个稳定的三螺旋构象,从而减少瘤细胞生长和纤维化过程中胶原过度沉积;抗肝纤维化、抗高血压。
随着经济快速发展,大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。国内多采用生物提取法由明胶、骨胶、干酪素、大豆表皮等蛋白质,用盐酸水解,用亚硝化法提取亚氨酸后经树脂层析后精制、结晶而成,并且顺式-4-羟脯氨酸的生产还需要通过手性异构合成,生物法合成顺式-4-羟脯氨酸具有经济学和生态学双重意义,生物法合成顺式-4-羟脯氨酸的基因工程菌主要有大肠杆菌和酵母。目前生物法合成顺式-4-羟脯氨酸主要有两种方式:发酵法和生物转化法。发酵法原料来源广泛且可再生,成本低,产量较高,污染也较小,但其调控过程比较复杂;生物转化法产量高,成本低,过程简单,有利于下游提取操作。大肠杆菌生长速率快,生产周期短,而大肠杆菌中存在底物降解途径与羟脯氨酸产生存在竞争,而羟脯氨酸的产生需要α-酮戊二酸参加反应,而α-酮戊二酸也存在其他途径的竞争,然而敲除过多基因会抑制菌体的生长,本文通过CASI抑制putA脯氨酸脱氢酶基因,以及琥珀酸脱氢酶sucA,sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA,异柠檬酸激酶aceK的表达提高反应中α-酮戊二酸和脯氨酸浓度利于顺式-4-羟脯氨酸的产生。
发明内容
为解决现有技术问题,本发明的目的是提供一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,该方法简单易行,提高了原料利用率,节约了生产成本,该方法能利用脯氨酸产生顺式-4-羟脯氨酸即解决了生产过程中的环境污染问题,又解决了敲除多个基因会影响菌体的快速生长,又能提高底物与辅酶浓度提高产物的产生。
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H,利用CRISPR-Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株,并将重组菌株发酵培养后获取全细胞,最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸。
作为上述方法优选的是,所述脯氨酸羟化酶基因putA,GenBank: AY143338.1 ;琥珀酸脱氢酶sucA和sucB,Gene ID: 7329904;异柠檬酸裂解酶基因aceA,Gene ID: 946829;异柠檬酸激酶aceK,Gene ID:946036。
作为上述方法优选的是,所述的宿主菌为大肠杆菌BL21、大肠杆菌TransB、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌Origami中的一种。
上述方法包括以下步骤:
步骤1,配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液,并与培养皿、锥形瓶、离心管灭菌后备用;
步骤2,构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H,pACYC-CAS9及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK,并转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h得菌种;
步骤3,向离心管中依次接入种子培养基和菌种后,摇床上培养9-10h得发酵菌种;
步骤4,向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种,摇床培养至OD至少为0.6,再加入至终浓度为0.8-1.2mmol的IPTG,诱导培养后离心8-10min,倒掉上清,收集菌体,用菌体洗液洗涤2-4遍后得备用菌体;
步骤5,向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体,加入缓冲溶液,并用KOH调节pH至中性,进行全细胞催化反应,反应中并用磷酸调节pH至中兴,其中,备用菌体的干重为0.41g/L;
步骤6,每隔5-8h取样一次,并通过液相检测产物,待全细胞催化55-65h时结束得产物顺式-4-羟脯氨酸。
作为方法优选的是,步骤1中反应液由脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亚铁和维生素C组成,其中,脯氨酸密度为9-11g/L, α-酮戊二酸密度为10-12g/L,硫酸亚铁和维生素C的摩尔浓度比为3:4mmol/L。
作为方法优选的是,步骤3中摇床培养温度为37℃,转速为250rpm。
作为上述方法优选的是,步骤4中发酵培养基与摇瓶体积比为1:5,发酵菌种的量为发酵培养基的1-2%倍,摇床转速为200rpm,诱导培养的温度为20℃,转速为200rpm,离心用的离心力为4000g/min,离心10min。
作为上述方法优选的是,步骤5中pH调节至6-8。
作为pH优选的是,步骤5中pH通过磷酸调节至6.5。
作为上述方法优选的是,步骤6中全细胞催化时间为60h。
有益效果
本发明方法提供了一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,有效降低了胞内脯氨酸在其他路径上的消耗,首次实现了用CASI系统减少了脯氨酸用于其他路径的消耗,并且抑制了降解α-酮戊二酸的竞争途径抑制了多个基因,但不影响菌体的生长,使得一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法变得更加简单,不仅有效的减少了底物脯氨酸和α-酮戊二酸的消耗,而且大幅度提高了转化效率。这从很大程度上节约了生产成本,并对于环境的保护起到了一定的作用。
(1)有效降低了胞内脯氨酸在其他路径上的消耗的培养策略,增加了CASI
抑制比不增加CASI抑制产量提高了1.5倍,效果明显。
(2)抑制了降解α-酮戊二酸的竞争,降低了反应成本,并且不影响菌体的
生长,有利于工业化生产。
附图说明
图1为标准品顺式-4-羟脯氨酸的出峰时间4.1分钟;
图2为标准品底物L-脯氨酸的出峰时间8.1分钟;
图3为实施例2中顺式-4-羟脯氨酸的出峰时间及底物L-脯氨酸的出峰时间;
图4 为重组质粒pET-28a-CP4H;
图5 为重组质粒pACYC-Cas9;
图6 为重组质粒pCDF-303-putA-aceA-aceK-sucA-sucB。
具体实施方式
实施例1 构建重组质粒
1.通过金唯质基因合成公司合成优化后脯氨酸羟化酶基因构建于在体pET-28a载体上酶切位点为NdeI/XhoI. 构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H
2.pACYC-CAS9蛋白为实验室提供
3.pCDF-303-CriRNA-putA-sucA-sucB-aceA-aceK
抑制代谢途径脯氨酸降解基因putA,琥珀酸脱氢酶基因sucA和sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA,异柠檬酸激酶aceK,转化pET-28a-Ecp4H,pACYC-CAS9及质粒pCDF-putA-sucA-sucB-aceA-aceK。
实施例2
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,包括以下步骤:
步骤1,配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液,并与培养基、锥形瓶、离心管一起灭菌备用,其中:
发酵培养基LB:蛋白胨10g/L,酵母粉0.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,氨苄青霉素0.02%,氯霉素0.01%,链霉素0.01% pH7.0。
反应液:10 g /L 脯氨酸, 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/L磷酸二氢钾, 0.2mol/L磷酸氢二钾,0.8mmol/L维生素C, 0.4 mmol/L 硫酸亚铁,其中硫酸亚铁用纯水配置。
菌体洗液:PBS 7.0溶液,11.09g/LNaH2PO4 ,2.96g/LNa2HPO4。
soc培养基:蛋白胨4g/L,酵母粉1g/L,NaCl 10mm/L,KCl 2.5mm/L,MgSO4 10mm/L,MgCl2 20mm/L,葡萄糖20 g/L。
种子培养基的配方同发酵培养基。
步骤2,将实施例1中构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H,pACYC-CAS9及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK,转入大肠杆菌TransB后在37℃的培养箱中培养12-14h得菌种;
步骤3,向50ml离心管依次接入10ml的种子培养基、0.2um的抗生素和菌种后,摇床37℃转速为200rpm下培养得发酵菌种;
步骤4,向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种,摇床培养至OD长至0.6时,加入至终浓度为1mmol的IPTG,20℃,200rpm诱导12h后,离心10 分钟倒掉上清,收集菌体后用菌体洗液2遍后得备用菌体,其中离心时离心力4000g/min;
步骤5,向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体,控制反应溶液中菌体的干重为0.41g/L,加入缓冲溶液,并用KOH调节pH至7.2后进行全细胞催化反应,反应过程中用磷酸调节pH在7.2。
步骤6,每隔6h取一次样检测,并通过液相检测产物,等到55h-65h停止催化反应,取最终产物。
顺式-4-羟脯氨酸含量,HPLC-ELSD分析。
HPLC-ELSD分析使用蒸发光检测器,色谱柱为Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6mm × 5 μm)。HPLC条件为:流动相A:1升纯水中含有7毫升三氟乙酸0.653毫升七氟丁酸,流动相B:100% 乙腈,条件如下:100% A;流速:1.0 ml/min;柱温:28.5±1 °C;进样量:10 μl。ELSD检测条件:雾化温度为115°C,气流速为3.2L/min。
转化产物经HPLC-ELSD分析(如图3所示),出峰时间为4.1分钟与标品出峰时间一致。
实施例3
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,包括以下步骤:
步骤1,配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液,并与培养皿、离心管灭菌备用,其中:
soc培养基:蛋白胨4g/L,酵母粉1 g/L,NaCl 10mm/L,KCl 2.5mm/L,MgSO4 10mm/L,MgCl2 20mm/L,葡萄糖20 g/L。
发酵培养基M9:葡萄糖10g/L,NH4Cl 5g/L,NaCl 5g/L,MgSO4 1mol/L,CaCl21mol/L,FeSO4•7H2O 0.005mol/L;
反应液:10 g /L 脯氨酸, 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/LKH2PO4, 0.2mol/LK2HPO4,0.8mmol /L维生素C, 0.4 mmol /L FeSO4,其中硫酸亚铁用纯水配置;
菌体洗液:PBS 7.0溶液,11.09g/LNaH2PO4 ,2.96g/LNa2HPO4。
步骤2至步骤3同实施例。
步骤4,向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种,摇床培养至OD为0.6时,加入至终浓度为1mmol的IPTG,20℃,200rpm诱导14h后,离心10 分钟,倒掉上清,收集菌体,用菌体洗液清洗2遍后得备用菌体,其中离心时离心力4000g/min。
步骤5,向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体,控制反应溶液中菌体的干重为0.41g/L,加入缓冲溶液,并用KOH调节pH至6.5后进行全细胞催化反应,反应过程中用磷酸调节pH在6.5。
步骤6,每隔6h取一次样检测,并通过液相检测产物,等到55h-65h取产物顺式-4-羟脯氨酸。
对比例
以上述产脯氨酸羟化酶菌株进行全细胞催化,其他反应条件同实施例2,全细胞催化结束后转化液中顺式-4-羟脯氨酸产量达到2.50g/L。
本发明方法中不同实施例产顺式-4-羟脯氨酸的量记录于下表中,从中可以看出由于pH的改变导致产量发生明显的变化,及由于M9培养基比较简单,所以菌体生长慢一些,但成本比较低。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制;凡本领域的技术人员,应该理解,上述实施例和说明书中描述的只是说明发明的原理,在不脱离本发明技术精神和范围的前提下,本发明还会有些许更动、修饰与演变的等同变化,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所做的任何等同变化的更动、修饰与演变等,均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H,利用CRISPR-Cas9 技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸脱氢酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株,并将重组菌株发酵培养后获取全细胞,最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸;具体的方法包括以下步骤:步骤1,配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc 培养基、菌体洗液,并与培养皿、锥形瓶、离心管一起灭菌后备用;步骤2,构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H,pACYC-CAS9 及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK,并
转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h 得菌种;步骤3,向离心管中依次接入种子培养基、抗生素和菌种后,摇床上培养9-10h 得发酵菌种;步骤4,向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种,摇床培养至OD 至少为0.6,再加入至终浓度为0.8-1.2mmol 的IPTG,诱导培养后离心8-10min,倒掉上清,收集菌体,用菌体洗液洗涤2-4 遍后得备用菌体;步骤5,向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体,加入缓冲溶液,并用KOH 调节pH 至中性,进行全细胞催化反应,反应中并用磷酸调节pH 至中性,其中,备用菌体的干重为0.41g/L;步骤6,每隔5-8h 取样一次,并通过液相检测产物,待全细胞催化55-65h 时结束得产物顺式-4-羟脯氨酸。
2.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,所述脯氨酸脱氢酶基因putA,GenBank: FU758039.1 ;琥珀酸脱氢酶sucAB,Gene ID: 7329904;异柠檬酸裂解酶基因aceA,Gene ID: 946829;异柠檬酸激酶aceK,Gene ID:946036。
3.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,所述宿主菌为大肠杆菌BL21、大肠杆菌TransB、大肠杆菌Rosetta 或大肠杆菌Origami 中的一种。
4.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,步骤1 中反应液由L-脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亚铁和维生素C 组成,其中,脯氨酸密度为9-11g/L, α-酮戊二酸密度为10-12g/L,硫酸亚铁和维生素C 的摩尔浓度比为3:4mmol/L。
5.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,步骤3 中摇床培养温度为37℃,转速为250rpm。
6.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,步骤4 中发酵培养基与摇瓶体积比为1:5,发酵菌种的量为发酵培养基的1-2%倍,摇床转速为200rpm,诱导培养的温度为20℃,转速为200rpm,离心用的离心力为4000g/min,离心10min。
7.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,步骤5 中pH调节至6-8。
8.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,步骤5 中pH调节至6.5。
9.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法,其特征在于,步骤6 中全细胞催化时间为60h。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610895160.6A CN106434782B (zh) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610895160.6A CN106434782B (zh) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106434782A CN106434782A (zh) | 2017-02-22 |
CN106434782B true CN106434782B (zh) | 2020-01-10 |
Family
ID=58175157
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610895160.6A Active CN106434782B (zh) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106434782B (zh) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
IL294014B1 (en) | 2015-10-23 | 2024-03-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
CN110214180A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
KR20190130613A (ko) | 2017-03-23 | 2019-11-22 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
CN108949706B (zh) * | 2018-06-29 | 2021-08-06 | 天津科技大学 | 一种l-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用 |
EP3942040A1 (en) | 2019-03-19 | 2022-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104894152A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-09-09 | 江南大学 | 利用重组大肠杆菌生产顺式-4-羟基-l-脯氨酸的方法 |
-
2016
- 2016-10-14 CN CN201610895160.6A patent/CN106434782B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104894152A (zh) * | 2015-05-26 | 2015-09-09 | 江南大学 | 利用重组大肠杆菌生产顺式-4-羟基-l-脯氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Microbial production of N-acetyl cis-4-hydroxy-l-proline by coexpression of the Rhizobium l-proline cis-4-hydroxylase and the yeast N-acetyltransferase Mpr1;Thi,MHB等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20130131;第97卷(第1期);247-257 * |
Proline Availability Regulates Proline-4-Hydroxylase Synthesis and Substrate Uptake in Proline-Hydroxylating Recombinant Escherichia coli;Falcioni,F等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20130531;第79卷(第9期);3091-3100 * |
产顺式-4-L-羟脯氨酸工程菌的构建及转化条件的优化;赵利维等;《微生物学通报》;20160309;第43卷(第9期);1 * |
生物制备手性羟脯氨酸;赵同心等;《2015年中国化工学会年会》;20151017;1887-1894 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106434782A (zh) | 2017-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106434782B (zh) | 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 | |
Meng et al. | Efficient production of L-lactic acid with high optical purity by alkaliphilic Bacillus sp. WL-S20 | |
Khan et al. | Calcium malate overproduction by Penicillium viticola 152 using the medium containing corn steep liquor | |
Li et al. | Utilization of white rice bran for production of L-lactic acid | |
CN109321590B (zh) | 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
CN103602623A (zh) | 高产l-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产l-丙氨酸的方法 | |
CN103966274A (zh) | 一种以水产品及其加工下脚料为原料生物转化生产γ-氨基丁酸的方法 | |
CN101535467A (zh) | 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法 | |
Jiang et al. | Succinic acid production by Actinobacillus succinogenes using spent brewer's yeast hydrolysate as a nitrogen source | |
JP5883780B2 (ja) | 酵母の培養方法 | |
CN109929870A (zh) | 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用 | |
Bai et al. | Ammonium lactate production by Lactobacillus lactis BME5-18M in pH-controlled fed-batch fermentations | |
Zeng et al. | Analysis of the L-malate biosynthesis pathway involved in poly (β-L-malic acid) production in Aureobasidium melanogenum GXZ-6 by addition of metabolic intermediates and inhibitors | |
CN103276019A (zh) | 一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法 | |
CN108410918B (zh) | 一种色氨酸发酵培养基及色氨酸发酵方法 | |
WO2011156945A1 (zh) | 采用花生粕同步酶解发酵生产高浓度d-乳酸的方法及其专用培养基 | |
DK180437B1 (en) | Method for Fermentative Production of Oxidized Coenzyme Q10 and High-content Oxidized Coenzyme Q10 Prepared therefrom | |
CN105925519A (zh) | 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用 | |
CN102352382A (zh) | 一种两阶段发酵生产苹果酸的方法 | |
CN102816812A (zh) | 低分子量右旋糖酐的一步法发酵生产工艺 | |
CN104593306B (zh) | 一种大肠埃希氏菌株hy‑05c高密度培养方法 | |
CN103667107B (zh) | 一种产l-乳酸的屎肠球菌菌株 | |
CN107326052B (zh) | 一种以d101大孔吸附树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法 | |
CN105861339B (zh) | 一株过表达gtp 环式水解酶基因的重组高山被孢霉、其构建方法及应用 | |
Sun et al. | Diammonium phosphate stimulates transcription of L-lactate dehydrogenase leading to increased L-lactate production in the thermotolerant Bacillus coagulans strain |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |