CN106434782B - 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 - Google Patents

一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产顺式‑4‑羟脯氨酸的方法，该方法通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR‑Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α‑酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后，全细胞转化生产顺式‑4‑羟脯氨酸。本方法培养方式简单，并且菌株活力较高，产物转化率较高。

Description

一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法。
背景技术
羟脯氨酸（hydroxyproline），亚氨基酸之一，通常在第四位上带有羟基，但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体。在动物胶和骨胶原中含有L-羟脯氨酸。自然界中不存在D-羟脯酸。是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，可以通过脯氨酸羟化酶生成。在食品、医学和工业上具有广泛的应用。在食品上, 羟脯氨酸可作为婴儿的营养物质来源来补充甘氨酸丙氨酸和葡萄糖，羟脯氨酸还有独特的甜味能改善饮料的风味，常作为饮料的添加剂；医学上，在食品和饮料中添加可防止过敏性炎症，衍生物 N-乙酰羟脯氨酸可用于治疗结蹄组织疾病和风湿性关节炎；顺式-4-羟脯氨酸作为抗癌药物治疗各种癌症，包括肝，膀胱，前列腺，肾盂等。防止骨胶原折叠成一个稳定的三螺旋构象,从而减少瘤细胞生长和纤维化过程中胶原过度沉积；抗肝纤维化、抗高血压。
随着经济快速发展，大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。国内多采用生物提取法由明胶、骨胶、干酪素、大豆表皮等蛋白质，用盐酸水解，用亚硝化法提取亚氨酸后经树脂层析后精制、结晶而成，并且顺式-4-羟脯氨酸的生产还需要通过手性异构合成，生物法合成顺式-4-羟脯氨酸具有经济学和生态学双重意义，生物法合成顺式-4-羟脯氨酸的基因工程菌主要有大肠杆菌和酵母。目前生物法合成顺式-4-羟脯氨酸主要有两种方式：发酵法和生物转化法。发酵法原料来源广泛且可再生，成本低，产量较高，污染也较小，但其调控过程比较复杂；生物转化法产量高，成本低，过程简单，有利于下游提取操作。大肠杆菌生长速率快，生产周期短，而大肠杆菌中存在底物降解途径与羟脯氨酸产生存在竞争，而羟脯氨酸的产生需要α-酮戊二酸参加反应，而α-酮戊二酸也存在其他途径的竞争，然而敲除过多基因会抑制菌体的生长，本文通过CASI抑制putA脯氨酸脱氢酶基因，以及琥珀酸脱氢酶sucA，sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA,异柠檬酸激酶aceK的表达提高反应中α-酮戊二酸和脯氨酸浓度利于顺式-4-羟脯氨酸的产生。
发明内容
为解决现有技术问题，本发明的目的是提供一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，该方法简单易行，提高了原料利用率，节约了生产成本，该方法能利用脯氨酸产生顺式-4-羟脯氨酸即解决了生产过程中的环境污染问题，又解决了敲除多个基因会影响菌体的快速生长，又能提高底物与辅酶浓度提高产物的产生。
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后获取全细胞，最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸。
作为上述方法优选的是，所述脯氨酸羟化酶基因putA，GenBank: AY143338.1 ；琥珀酸脱氢酶sucA和sucB,Gene ID: 7329904；异柠檬酸裂解酶基因aceA,Gene ID: 946829；异柠檬酸激酶aceK,Gene ID:946036。
作为上述方法优选的是，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21、大肠杆菌TransB、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌Origami中的一种。
上述方法包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液，并与培养皿、锥形瓶、离心管灭菌后备用；
步骤2，构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h得菌种；
步骤3，向离心管中依次接入种子培养基和菌种后，摇床上培养9-10h得发酵菌种；
步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD至少为0.6，再加入至终浓度为0.8-1.2mmol的IPTG，诱导培养后离心8-10min，倒掉上清，收集菌体，用菌体洗液洗涤2-4遍后得备用菌体；
步骤5，向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体，加入缓冲溶液，并用KOH调节pH至中性，进行全细胞催化反应，反应中并用磷酸调节pH至中兴，其中，备用菌体的干重为0.41g/L；
步骤6，每隔5-8h取样一次，并通过液相检测产物，待全细胞催化55-65h时结束得产物顺式-4-羟脯氨酸。
作为方法优选的是，步骤1中反应液由脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亚铁和维生素C组成，其中，脯氨酸密度为9-11g/L， α-酮戊二酸密度为10-12g/L，硫酸亚铁和维生素C的摩尔浓度比为3：4mmol/L。
作为方法优选的是，步骤3中摇床培养温度为37℃，转速为250rpm。
作为上述方法优选的是，步骤4中发酵培养基与摇瓶体积比为1：5，发酵菌种的量为发酵培养基的1-2%倍，摇床转速为200rpm，诱导培养的温度为20℃，转速为200rpm，离心用的离心力为4000g/min，离心10min。
作为上述方法优选的是，步骤5中pH调节至6-8。
作为pH优选的是，步骤5中pH通过磷酸调节至6.5。
作为上述方法优选的是，步骤6中全细胞催化时间为60h。
有益效果
本发明方法提供了一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，有效降低了胞内脯氨酸在其他路径上的消耗，首次实现了用CASI系统减少了脯氨酸用于其他路径的消耗，并且抑制了降解α-酮戊二酸的竞争途径抑制了多个基因，但不影响菌体的生长，使得一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法变得更加简单，不仅有效的减少了底物脯氨酸和α-酮戊二酸的消耗，而且大幅度提高了转化效率。这从很大程度上节约了生产成本，并对于环境的保护起到了一定的作用。
（1）有效降低了胞内脯氨酸在其他路径上的消耗的培养策略，增加了CASI
抑制比不增加CASI抑制产量提高了1.5倍，效果明显。
（2）抑制了降解α-酮戊二酸的竞争，降低了反应成本，并且不影响菌体的
生长，有利于工业化生产。
附图说明
图1为标准品顺式-4-羟脯氨酸的出峰时间4.1分钟；
图2为标准品底物L-脯氨酸的出峰时间8.1分钟；
图3为实施例2中顺式-4-羟脯氨酸的出峰时间及底物L-脯氨酸的出峰时间；
图4 为重组质粒pET-28a-CP4H；
图5 为重组质粒pACYC-Cas9；
图6 为重组质粒pCDF-303-putA-aceA-aceK-sucA-sucB。
具体实施方式
实施例1 构建重组质粒
1.通过金唯质基因合成公司合成优化后脯氨酸羟化酶基因构建于在体pET-28a载体上酶切位点为NdeI/XhoI. 构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H
2.pACYC-CAS9蛋白为实验室提供
3.pCDF-303-CriRNA-putA-sucA-sucB-aceA-aceK
抑制代谢途径脯氨酸降解基因putA,琥珀酸脱氢酶基因sucA和sucB,异柠檬酸裂解酶基因aceA,异柠檬酸激酶aceK，转化pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及质粒pCDF-putA-sucA-sucB-aceA-aceK。
实施例2
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液，并与培养基、锥形瓶、离心管一起灭菌备用，其中：
发酵培养基LB：蛋白胨10g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，氨苄青霉素0.02%，氯霉素0.01%，链霉素0.01% pH7.0。
反应液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/L磷酸二氢钾, 0.2mol/L磷酸氢二钾,0.8mmol/L维生素C, 0.4 mmol/L 硫酸亚铁，其中硫酸亚铁用纯水配置。
菌体洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH2PO4 ,2.96g/LNa2HPO4。
soc培养基:蛋白胨4g/L，酵母粉1g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO4 10mm/L，MgCl2 20mm/L，葡萄糖20 g/L。
种子培养基的配方同发酵培养基。
步骤2，将实施例1中构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，转入大肠杆菌TransB后在37℃的培养箱中培养12-14h得菌种；
步骤3，向50ml离心管依次接入10ml的种子培养基、0.2um的抗生素和菌种后，摇床37℃转速为200rpm下培养得发酵菌种；
步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD长至0.6时，加入至终浓度为1mmol的IPTG，20℃，200rpm诱导12h后，离心10 分钟倒掉上清，收集菌体后用菌体洗液2遍后得备用菌体，其中离心时离心力4000g/min；
步骤5，向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体，控制反应溶液中菌体的干重为0.41g/L，加入缓冲溶液，并用KOH调节pH至7.2后进行全细胞催化反应，反应过程中用磷酸调节pH在7.2。
步骤6，每隔6h取一次样检测，并通过液相检测产物，等到55h-65h停止催化反应，取最终产物。
顺式-4-羟脯氨酸含量，HPLC-ELSD分析。
HPLC-ELSD分析使用蒸发光检测器，色谱柱为Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6mm × 5 μm)。HPLC条件为：流动相A：1升纯水中含有7毫升三氟乙酸0.653毫升七氟丁酸，流动相B：100% 乙腈，条件如下：100% A；流速：1.0 ml/min；柱温：28.5±1 °C；进样量：10 μl。ELSD检测条件：雾化温度为115°C，气流速为3.2L/min。
转化产物经HPLC-ELSD分析（如图3所示），出峰时间为4.1分钟与标品出峰时间一致。
实施例3
一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc培养基、菌体洗液，并与培养皿、离心管灭菌备用，其中：
soc培养基:蛋白胨4g/L，酵母粉1 g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO4 10mm/L，MgCl2 20mm/L，葡萄糖20 g/L。
发酵培养基M9：葡萄糖10g/L，NH4Cl 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 1mol/L,CaCl21mol/L,FeSO4•7H2O 0.005mol/L；
反应液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/LKH2PO4, 0.2mol/LK2HPO4,0.8mmol /L维生素C, 0.4 mmol /L FeSO4，其中硫酸亚铁用纯水配置；
菌体洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH2PO4 ,2.96g/LNa2HPO4。
步骤2至步骤3同实施例。
步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD为0.6时，加入至终浓度为1mmol的IPTG，20℃，200rpm诱导14h后，离心10 分钟，倒掉上清，收集菌体，用菌体洗液清洗2遍后得备用菌体，其中离心时离心力4000g/min。
步骤5，向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体，控制反应溶液中菌体的干重为0.41g/L，加入缓冲溶液，并用KOH调节pH至6.5后进行全细胞催化反应，反应过程中用磷酸调节pH在6.5。
步骤6，每隔6h取一次样检测，并通过液相检测产物，等到55h-65h取产物顺式-4-羟脯氨酸。
对比例
以上述产脯氨酸羟化酶菌株进行全细胞催化，其他反应条件同实施例2，全细胞催化结束后转化液中顺式-4-羟脯氨酸产量达到2.50g/L。
本发明方法中不同实施例产顺式-4-羟脯氨酸的量记录于下表中，从中可以看出由于pH的改变导致产量发生明显的变化，及由于M9培养基比较简单，所以菌体生长慢一些，但成本比较低。
Figure 53548DEST_PATH_IMAGE001
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本领域的技术人员，应该理解，上述实施例和说明书中描述的只是说明发明的原理，在不脱离本发明技术精神和范围的前提下，本发明还会有些许更动、修饰与演变的等同变化，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所做的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9 技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸脱氢酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后获取全细胞，最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸；具体的方法包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc 培养基、菌体洗液，并与培养皿、锥形瓶、离心管一起灭菌后备用；步骤2，构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9 及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并
转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h 得菌种；步骤3，向离心管中依次接入种子培养基、抗生素和菌种后，摇床上培养9-10h 得发酵菌种；步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD 至少为0.6，再加入至终浓度为0.8-1.2mmol 的IPTG，诱导培养后离心8-10min，倒掉上清，收集菌体，用菌体洗液洗涤2-4 遍后得备用菌体；步骤5，向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体，加入缓冲溶液，并用KOH 调节pH 至中性，进行全细胞催化反应，反应中并用磷酸调节pH 至中性，其中，备用菌体的干重为0.41g/L；步骤6，每隔5-8h 取样一次，并通过液相检测产物，待全细胞催化55-65h 时结束得产物顺式-4-羟脯氨酸。
2.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，所述脯氨酸脱氢酶基因putA，GenBank: FU758039.1 ；琥珀酸脱氢酶sucAB,Gene ID: 7329904；异柠檬酸裂解酶基因aceA,Gene ID: 946829；异柠檬酸激酶aceK,Gene ID:946036。
3.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21、大肠杆菌TransB、大肠杆菌Rosetta 或大肠杆菌Origami 中的一种。
4.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤1 中反应液由L-脯氨酸、α-酮戊二酸、硫酸亚铁和维生素C 组成，其中，脯氨酸密度为9-11g/L， α-酮戊二酸密度为10-12g/L，硫酸亚铁和维生素C 的摩尔浓度比为3：4mmol/L。
5.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤3 中摇床培养温度为37℃，转速为250rpm。
6.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤4 中发酵培养基与摇瓶体积比为1：5，发酵菌种的量为发酵培养基的1-2%倍，摇床转速为200rpm，诱导培养的温度为20℃，转速为200rpm，离心用的离心力为4000g/min，离心10min。
7.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤5 中pH调节至6-8。
8.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤5 中pH调节至6.5。
9.根据权利要求1 所述的一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤6 中全细胞催化时间为60h。
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