CN105177038B - 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有启动子pYAO的表达盒甲。所述表达盒甲中由所述启动子pYAO启动Cas9核酸酶的编码基因表达；所述启动子pYAO为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表序列1自5'末端第1‑1012位所示的DNA分子；(a2)与(a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，利用在植物配子体或/和胚胎发育早期高表达基因的YAO基因，驱动Cas9基因的表达，可以高效的编辑植物基因组。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统。
背景技术
实现对植物基因组进行高效、定点编辑对研究植物基因功能具有重要意义。目前，锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及CRISPR/Cas9等基因改造技术已广泛的应用于科研中，其中CRISPR/Cas9技术是近年来才发展起来的基因改造技术。CRISPR/Cas系统，为目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。利用CRISPR/Cas9系统编辑生物基因组，在靶标片段处造成不同形式的缺失或插入已成功应用于人类细胞系、斑马鱼、大鼠、小鼠、果蝇等生物中。在植物领域，该技术也已应用于拟南芥、水稻、玉米、烟草以及番茄等植物中，但是已有的CRISPR/Cas9系统编辑效率比较低。
目前用来驱动Cas9基因表达的启动子多为CMV 35S启动子和Ubiquitin启动子，但是已有的研究表明，二者驱动的Cas9对植物基因组的编辑效率都较低，可见，选择合适的启动子驱动Cas9基因的表达对于提高其编辑效率尤其重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效定点编辑植物基因组的方法。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种含有启动子pYAO的表达盒甲。所述表达盒甲中由所述启动子pYAO启动Cas9核酸酶的编码基因表达。
所述启动子pYAO可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表序列1自5'末端第1-1012位所示的DNA分子；
(a2)与(a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
所述Cas9核酸酶可为如下b1)或b2)：
b1)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质；
b2)将b1)所示的蛋白质经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Cas9核酸酶具有相同功能的蛋白质。
所述表达盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：所述启动子pYAO、所述Cas9核酸酶的编码基因和终止子。
所述Cas9核酸酶的编码基因可如序列表序列1自5'末端第1139-5239位所示。
所述终止子具体可为NOS终止子。所述NOS终止子的核苷酸序列可如序列表序列1自5'末端第5297-5580位所示。
所述表达盒甲中还可包括一个以上Flag标签和/或一个以上核定位信号。
所述表达盒甲中具体可包括1个Flag标签、核定位信号甲和核定位信号乙。所述表达盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：所述启动子pYAO、所述Flag标签、所述核定位信号甲、所述Cas9核酸酶的编码基因、所述核定位信号乙和终止子。
所述Flag标签的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第1019-1087位所示。所述核定位信号甲的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第1088-1138位所示。所述核定位信号乙的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第5240-5287位所示。
所述表达盒甲的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示。
所述启动Cas9核酸酶的编码基因表达具体可为启动Cas9核酸酶的编码基因在植物中的表达。
含有上述任一所述表达盒甲的重组质粒也属于本发明的保护范围。
所述重组质粒还可包括表达盒乙，所述表达盒乙中由AtU6-26启动子启动sgRNA转录。
所述表达盒乙自5’端至3’端依次可包括AtU6-26启动子和sgRNA区段(sgRNA区段即具有sgRNA的编码基因的DNA片段)。
所述sgRNA区段可包括crRNA区段(crRNA区段即具有crRNA的编码基因的片段)和tracrRNA区段(tracrRNA区段即具有tracrRNA的编码基因的片段)。
所述crRNA与靶标基因上的靶标片段特异结合，所述靶标片段可具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，X＝20。所述crRNA区段的核苷酸序列具体可如序列表序列9自5'末端第9390-9409位所示。
所述tracrRNA区段的核苷酸序列具体如序列表序列9自5'末端第9410-9485位所示。
所述表达盒乙中，在所述sgRNA区段的下游还可包括3’-UTR区段。所述3’-UTR区段的核苷酸序列具体可如序列表序列9自5'末端第9493-9575位所示。
所述表达盒乙的核苷酸序列具体可如序列表中序列9自5'末端第8941-9575位所示。
所述重组质粒还可包括功能片段乙，所述功能片段乙自5’端至3’端依次可包括AtU6-26启动子、供crRNA的编码基因插入的多克隆位点区段和tracrRNA区段。
所述crRNA与靶标基因上的靶标片段特异结合，所述靶标片段具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，X＝20。
所述多克隆位点区段可包括一个以上限制性内切酶BsaⅠ的酶切识别位点，具体可包括两个限制性内切酶BsaⅠ的酶切识别位点。两个限制性内切酶BsaⅠ的酶切识别位点的核苷酸序列可分别如序列表序列7自5'末端第451-456位和第465-470位所示。所述多克隆位点区段的核苷酸序列具体可如序列表序列7自5'末端第449-471位所示。
所述AtU6-26启动子的核苷酸序列具体可如序列表序列7自5'末端第1-448位所示。
所述tracrRNA区段的核苷酸序列具体可如序列表序列7自5'末端第472-547位所示。
所述功能片段乙中，在所述tracrRNA区段的下游还包括3’-UTR区段。所述3’-UTR区段的核苷酸序列具体可如序列表序列7自5'末端第555-637位所示。
所述功能区段乙的核苷酸序列具体可如序列表中序列7所示。
本发明还提供一种定向编辑植物基因组的方法。
本发明所提供的一种定向编辑植物基因组的方法为方法(c1)或方法(c2)：
方法(c1)可包括如下步骤：通过将含有上述任一所述表达盒乙的重组质粒导入出发植物，从而定向编辑所述出发植物的基因组中的所述sgRNA的靶基因；
方法(c2)包括如下步骤：(1)根据出发植物中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；(2)将所述crRNA的编码基因插入含有上述任一所述功能区段乙的重组质粒的多克隆位点区段中，得到重组质粒甲；(3)将所述重组质粒甲导入所述出发植物，从而定向编辑所述出发植物的基因组中的所述靶基因。
本发明还提供了一种定向编辑植物基因组的系统。
本发明所提供的定向编辑植物基因组的系统包括表达CRISPR/Cas9系统的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒中启动Cas9表达的启动子为上述任一所述启动子pYAO。
所述启动子pYAO也属于本发明的保护范围。
所述启动子pYAO在启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。
所述目的基因具体可为Cas9核酸酶的编码基因。所述Cas9核酸酶可为如下b1)或b2)：b1)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质；b2)将b1)所示的蛋白质经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Cas9核酸酶具有相同功能的蛋白质。所述Cas9核酸酶的编码基因可如序列表序列1自5'末端第1139-5239位所示。
所述启动子pYAO在启动目的基因表达具体可为启动目的基因在拟南芥中的表达。
上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
实验证明，利用在植物配子体或/和胚胎发育早期高表达基因的启动子，如YAO基因的启动子，启动Cas9核酸酶的编码基因的表达，可以高效的编辑植物基因组。
附图说明
图1为35S:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统和pYAO:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统引导的拟南芥内源基因BRI1突变的T1代表型。
其中Col-0为野生型拟南芥；35S-6-T1和35S-18-T1为初筛阳性T1代转35S:Cas9/AtU6-26-sgRNA的拟南芥植株；pYAO-3-T1和pYAO-4-T1为初筛阳性T1代转pYAO:Cas9/AtU6-26-sgRNA拟南芥植株。
图2为RFLP检测35S:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统和pYAO:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统对拟南芥内源基因BRI1的定点编辑效果。
其中M为DNA Marker；A图泳道1—23为导入35S:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统的T1代拟南芥的PCR产物经EcoR V酶切后的电泳结果，B图泳道1—21为导入pYAO:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统的T1代拟南芥的PCR产物经EcoR V酶切后的电泳结果；Col-0为野生型拟南芥的PCR产物经EcoR V酶切后的电泳结果。
图3为35S:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统和pYAO:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统对T1代拟南芥内源基因BRI1的定点编辑效果的测序分析。
其中A为35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA系统对35S-6-T1的PCR产物测序峰图；B为pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA系统对pYAO-16-T1的PCR产物测序峰图；C为35S-6-T1和pYAO-16-T1在BRI1基因靶定位点处编辑的形式；D为pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA系统对pYAO-3-T1的PCR产物测序峰图；E为pYAO-3-T1在BRI1基因靶定位点处编辑的形式；WT表示野生型拟南芥在靶定位点处的核苷酸序列，“D”表示发生删除突变(Deletion)的序列，“+”表示发生插入突变的序列，“D/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0生态型)(Kim H,Hyun Y,Park J,Park M,Kim M,Kim H,Lee M,Moon J,Lee I,Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验。拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0生态型)在下文中简称野生型拟南芥。
下述实施例中的载体35S-Cas9-SK记载在如下文献中：Feng et al.Efficientgenome editing in plants using a CRISPR/Cas system.Cell Res.2013.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验。
载体pCAMBIA1300和载体pBluescript-SK(+)均为Biovector公司产品，KOD-Plus-Neo为TOYOBO公司产品。下述实施例中bri1突变体记载在如下文献中：Noguchi,T.,Fujioka,S.,et al.Brassinosteroid-insensitive dwarf mutants of Arabidopsisaccumulate brassinosteroids.Plant Physiol.1999.121:743–752.bri1突变体的表型为植株矮小、叶片扭曲、营养生长周期延长和暗形态建成改变等。
实施例1、重组质粒的构建
1、重组质粒pYAO:Cas9的构建
1)以野生型拟南芥的基因组DNA为模板，以人工合成的pYAO-F：5'-AAGTCGACGATGGGAAATTCATTGAAAACCCT-3'(下划线为SalI酶切位点)和pYAO-R：5'-AAGTCGACTCCTTTCTTCTTCTCGTTGTTGT-3'(下划线为SalI酶切位点)为引物，用KOD-Plus-Neo进行PCR扩增，得到N端和C端均含有限制性内切酶SalI的双链DNA分子。
2)完成步骤1)后，用限制性内切酶SalI单酶切步骤1)扩增得到的双链DNA分子，回收约1024bp的片段1。
3)用限制性内切酶XhoI单酶切载体35S-Cas9-SK，回收约7493bp的载体骨架1。
4)将片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒pYAO-Cas9-SK。
5)用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切载体pCAMBIA1300，回收约8948bp的载体骨架2。
6)将人工合成的单链DNA分子MCS-F：
5'-ATCACTAGTATCCTAGGAAG-3'(下划线为限制性内切酶SpeI酶切识别位点，双下划线为限制性内切酶XbaI的粘性末端，波浪线为限制性内切酶KpnI的粘性末端)和单链DNA分子MCS-R：5'-CTTCCTAGGATACTAGTGAT-3'(下划线为限制性内切酶SpeI酶切识别位点)按摩尔比1:1混合，然后进行退火(退火程序为：95℃、5min，自然冷却至室温)，形成双链DNA分子，命名为片段2。
7)将载体骨架2和片段2连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-SpeI。
8)用限制性内切酶KpnI和EcoRI双酶切步骤7)得到的质粒pCAMBIA1300-SpeI，回收约8956bp的载体骨架3。
9)用限制性内切酶KpnI和EcoRI双酶切步骤4)得到的重组质粒pYAO-Cas9-SK，回收约5584bp的片段3。
10)将载体骨架3与片段3连接，得到重组质粒pYAO:Cas9。
重组质粒pYAO:Cas9表达序列表中序列2所示的Cas9核酸酶。
重组质粒pYAO:Cas9经酶切鉴定和测序，重组质粒pYAO:Cas9具有一个表达盒甲，表达盒甲的核苷酸序列如序列表序列1所示的双链DNA分子，其中序列表序列1自5'末端第1-1012位为pYAO启动子，第1019-1087位为Flag标签，第1088-1138位为核定位信号，第1139-5239位为Cas9核酸酶的编码基因，第5240-5287位为核定位信号，第5297-5580位为NOS终止子。
2、重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK的构建
1)将载体pBluescript-SK(+)上Ampr编码区的Bsa I酶切位点进行点突变且不影响基因编码的氨基酸，将点突变后的载体命名为载体pBluescript-SK(+)-M。载体pBluescript-SK(+)-M的构建过程如下：
①以载体pBluescript-SK(+)为模板，以人工合成的AmprBsaI–mutant F：
5'-GGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGCGACCCACGCTCAC-3'(下划线为点突位点)和AmprBsaI–mutant R：5'-GTGAGCGTGGGTCGCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCC-3'(下划线处为点突位点)为引物，用KOD-Plus-Neo进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，68℃2min，20个循环：68℃10min。
②用Dpn I(NEB公司产品)酶切(37℃30min)步骤①获得的PCR扩增产物，得到酶切产物。此步骤的目的为消化PCR体系中加入的载体pBluescript-SK(+)，即去除Ampr编码区中Bsa I未发生突变的载体pBluescript-SK(+)。
③完成步骤②后，取1μL酶切产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取单克隆，提质粒进行测序，得到重组质粒pBluescript-SK(+)-M。
重组质粒pBluescript-SK(+)-M与质粒pBluescript-SK(+)的区别仅在于前者含有AmprBsaI–mutant F和AmprBsaI–mutant R序列中所示的突变位点。
2)向载体pBluescript-SK(+)-M中引入NheI的酶切位点，具体步骤如下：
①以步骤1)构建的载体pBluescript-SK(+)-M为模板，以人工合成的CS-F：5'-CACTATAGGGCGAATTGGGTGCTAGCCCCCCCGTCGAC-3'(下划线为限制性内切酶NheI酶切识别位点，双下划线为限制性内切酶XhoI的酶切识别位点)和CS-R：5'-GTCGACGGGGGGGCTAGCACCCAATTCGCCCTATAGTG-3'(下划线为限制性内切酶NheI酶切识别位点，双下划线为限制性内切酶XhoI的酶切识别位点)为引物，用KOD-Plus-Neo进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，68℃2min，20个循环：68℃10min。
②用Dpn I(NEB公司产品)酶切(37℃、30min)步骤①获得的PCR扩增产物，得到酶切产物。
③完成步骤②后，取1μL酶切产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取单克隆，提质粒进行测序，得到重组质粒pBluescript-SK(+)-NheI。
重组质粒pBluescript-SK(+)-NheI与重组质粒pBluescript-SK(+)-M的区别仅在于前者含有CS-F和CS-R序列中所示的NheI酶切识别位点。
3)以野生型拟南芥的基因组DNA为模板，以人工合成的AtU6-26-F：5'-AAGCTAGCAAGCTTCGTTGAACAACGGAAACTC-3'(下划线为NheI酶切识别位点)和AtU6-26-R：5'-AAGAATTCAGGTCTCACAATCACTACTTCGACTCTAGCTGT-3'(下划线为EcoRI酶切识别位点)为引物，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO公司产品)进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶NheI和C端含有限制性内切酶EcoRI的双链DNA分子。
4)完成步骤3)后，用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切步骤3)扩增得到的双链DNA分子，回收454bp的片段4。
5)将步骤2)得到的重组质粒pBluescript-SK(+)-NheI用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切，回收约2913bp的载体骨架4。
6)将载体骨架4和片段4连接，得到重组质粒pBluescript-SK(+)-AtU6-26。
7)用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切载体pBluescript-SK(+)-AtU6-26，回收约3406bp的载体骨架5。
8)将人工合成的单链DNA分子sgRNA-F和单链DNA分子sgRNA-R按摩尔比1:1混合，进行退火(退火程序为：95℃、5min，自然冷却至室温)，形成具有粘性末端的双链DNA分子，命名为片段5。sgRNA-F的核苷酸序列如序列表的序列3所示的单链DNA分子，sgRNA-R的核苷酸序列如序列表的序列4所示的单链DNA分子。
9)将人工合成的单链DNA分子3’-UTR-F和单链DNA分子3’-UTR-R，按摩尔比1:1混合，然后进行退火(退火程序为：95℃、5min，自然冷却至室温)，形成具有粘性末端的双链DNA分子，命名为片段6。3’-UTR-F的核苷酸序列如序列表的序列5所示的单链DNA分子，3’-UTR-R的核苷酸序列如序列表的序列6所示的单链DNA分子。
10)将载体骨架5、片段5和片段6混合(片段5与片段6的摩尔质量比为1:1)，进行连接，得到重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK。
重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK经酶切鉴定和测序，重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK具有一个功能区段乙，功能区段乙的核苷酸序列如序列表序列7所示的双链DNA分子，其中序列表序列7自5'末端第1-448位为AtU6-26启动子，第451-456位和第465-470位均为限制性内切酶BsaⅠ的酶切位点(供插入crRNA的编码序列用)，第472-547位为tracrRNA区段的核苷酸序列，第555-637位为3’-UTR区段的核苷酸序列。
实施例2、pYAO:Cas9/AtU6-26-sgRNA系统对拟南芥内源基因BRI1的定点编辑
一、靶标片段BRI1-T1的设计
设计靶标片段BRI1-T1，靶标片段BRI1-T1位于所述目的基因上，双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，X＝20。
靶标片段BRI1-T1的核苷酸序列为：5'-TTGGGTCATAACGATATCTC-3'(下划线处为EcoR V的酶切识别位点)。
二、重组质粒pYAO:hspCas9-BRI1-sgRNA的构建
(1)人工合成BRI1-T1F：5'-ATTGTTGGGTCATAACGATATCTC-3'(下划线部分为粘性末端)和BRI1-T1R：5'-AAACGAGATATCGTTATGACCCAA-3'(下划线部分为粘性末端)，BRI1-T1F和BRI1-T1R均为单链DNA分子。
(2)将BRI1-T1F和BRI1-T1R按摩尔比1:1混合，进行退火(退火程序为：95℃，5min，自然冷却至室温)，形成具有粘性末端的双链DNA分子。
(3)用Bsa I酶(NEB公司产品)酶切重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK，然后与步骤(2)合成的双链DNA连接，使步骤(2)合成的双链DNA插入到重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK的两个BsaI酶切位点之间，即得含有靶标片段BRI1-T1的重组质粒，命名为重组质粒AtU6-26-BRI1-T1-sgRNA。
(4)用限制性内切酶SpeI和NheI双酶切重组质粒AtU6-26-sgRNA-SK，回收约642bp的片段7。
(5)用限制性内切酶Spe I单酶切后实施例1构建的重组质粒pYAO:Cas9，回收约14557bp的载体骨架7。
(6)将载体骨架7和片段7连接，得到重组质粒pYAO:hspCas9-BRI1-sgRNA。
经测序重组质粒pYAO:hspCas9-BRI1-sgRNA的核苷酸序列如序列表中序列9所示。
重组质粒pYAO:hspCas9-BRI1-sgRNA具有一个表达盒乙，所述表达盒乙的核苷酸序列如序列表序列9自5'末端第8941-9575所示的双链DNA分子，其中序列表序列9自5'末端第8941-9388位为AtU6-26启动子，第9390-9409位为crRNA区段的核苷酸序列，第9410-9485位为tracrRNA区段的核苷酸序列，第9493-9575位为3’-UTR区段的核苷酸序列。
将重组质粒pYAO:hspCas9-BRI1-sgRNA中的pYAO启动子替换为CaMV 35S启动子，得到重组质粒35S:hspCas9-BRI1-sgRNA。CaMV 35S启动子的核苷酸序列如序列表中序列8所示。
三、拟南芥转化和初步筛选
将步骤二获得的重组质粒(重组质粒35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA或重组质粒pYAO:hspCas9-BRI1-sgRNA)通过电转化转至根癌农杆菌GV3101(高建强,梁华,赵军.植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展，中国农学通报，2010，2(16)：22-25)中，然后利用Floral dip的方法(参考文献：Zhang et al.Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nat.Protoc.2006.)将重组质粒转至野生型拟南芥中，获得T1代拟南芥种子。
将收到T1代拟南芥种子在MS培养基(含潮霉素20μg/L和羧卞青霉素150μg/L)上进行筛选，获得23株初筛阳性T1代转35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株和21株转pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株(非阳性转拟南芥出现萎蔫并停止生长，15天后基本死亡)。将获得的23株初筛阳性T1代转35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株依次命名为35S-1-T1、35S-2-T1、35S-3-T1、35S-4-T1、35S-5-T1、35S-6-T1、35S-7-T1、35S-8-T1、35S-9-T1、35S-10-T1、35S-11-T1、35S-12-T1、35S-13-T1、35S-14-T1、35S-15-T1、35S-16-T1、35S-17-T1、35S-18-T1、35S-19-T1、35S-20-T1、35S-21-T1、35S-22-T1和35S-23-T1，将获得的21株初筛阳性T1代转pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株依次命名为pYAO-1-T1、pYAO-2-T1、pYAO-3-T1、pYAO-4-T1、pYAO-5-T1、pYAO-6-T1、pYAO-7-T1、pYAO-8-T1、pYAO-9-T1、pYAO-10-T1、pYAO-11-T1、pYAO-12-T1、pYAO-13-T1、pYAO-14-T1、pYAO-15-T1、pYAO-16-T1、pYAO-17-T1、pYAO-18-T1、pYAO-19-T1、pYAO-20-T1和pYAO-21-T1。
将上述23株初筛阳性T1代转35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株和21株转pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株移至土中，观察表型。
结果表明(见图1)，23株转35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥中，其中35S-5-T1、35S-6-T1、35S-8-T1、35S-16-T1和35S-18-T1只出现植株矮小的表型，其余拟南芥植株与野生型拟南芥的表型无显著差异。而21株转pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株中，其中pYAO-5-T1、pYAO-7-T1、pYAO-11-T1和pYAO-16-T1只表现为植株矮小，pYAO-10-T1、pYAO-12-T1与野生型拟南芥的表型无显著差异，其余15株表现为与bri1突变体相似的表型，即植株矮小和叶片扭曲。
四、利用RFLP及PCR产物测序分析pYAO-Cas9/AtU6-26-sgRNA系统对拟南芥内源基因BRI1的编辑结果
1、RFLP分析拟南芥内源基因BRI1的编辑结果
由于靶标片段BRI1-T1的核苷酸序列中含有EcoR V的识别位点，可以利用限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)对编辑的结果进行鉴定。分别提取步骤三中的初筛阳性T1代转35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株叶片和转pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植株叶片的基因组DNA，以其为模板，以人工合成的BRI1-F：5’-GATGGGATGAAGAAAGAGTG-3’和BRI1-R：5’-CTCATCTCTCTACCAACAAG-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将回收的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRV进行酶切，然后进行电泳分析。以野生型拟南芥DNA为模板进行上述实验，作为对照。
实验结果见图2，结果表明，在23株T1代35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA转基因拟南芥中，只检测到表型为植株矮小的35S-6-T1在BRI1基因选定靶位点处发生了编辑。而21棵T1代pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA转基因植物中，除了pYAO-10-T1和pYAO-12-T1没有检测到编辑的结果，其余19株拟南芥植株在BRI1基因选定靶位点处均发生了编辑。
2、PCR产物测序分析拟南芥内源基因BRI1的编辑结果
对步骤1中的PCR产物进行测序分析。
结果表明(图3中A、图3中B和图3中C)，35S-6-T1、pYAO-5-T1、pYAO-7-T1、pYAO-11-T1和pYAO-16-T1在BRI1基因选定的靶位点处都只出现了两个峰图，都只发生了一种形式的碱基插入/删除(insertion/deletion，indel)编辑。
表型为植株矮小和叶片扭曲的15株转基因拟南芥在BRI1基因选定的靶位点处则均出现了多个峰图(图3中D)，导致无法读取该靶点处发生编辑的形式。将对应的PCR产物回收后与pEASY–Blunt simple CloningVector(北京全式金生物技术有限公司产品)连接，进行测序。测序结果表明，表型为植株矮小和叶片扭曲的15株转基因拟南芥在BRI1基因选定的靶位点处出现了多种编辑形式(图3中E)。
对35S-Cas9/AtU6-26-sgRNA系统和pYAO-Cas9/AtU6-26-sgRNA系统定点编辑拟南芥内源基因BRI1的效率进行统计，统计结果如表1所示，结果表明，T1代转35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植物被编辑的效率为4.3％，而T1代转pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA的拟南芥植物被编辑的效率为90.5％。结果表明，pYAO-Cas9/AtU6-26-sgRNA系统对植物基因组的编辑效率极显著的高于35S-Cas9/AtU6-26-sgRNA系统的编辑效率。
表1.不同种类启动子启动的定点编辑系统对拟南芥内源基因BRI1的编辑效率统计
| pYAO:hSpCas9-BRI1-sgRNA | 35S:hSpCas9-BRI1-sgRNA | |
| 筛选获得的T1代转基因阳性苗 | 21 | 23 |
| 表现为bri1突变体表型的T1代转基因植物 | 15 | 0 |
| BRI1位点发生编辑的T1代转基因植物 | 19/21(90.5％) | 1/23(4.3％) |
Claims (10)
1.含有启动子pYAO的表达盒甲；所述表达盒甲中由所述启动子pYAO启动Cas9核酸酶的编码基因表达；
所述启动子pYAO为序列表序列1自5'末端第1-1012位所示的DNA分子。
2.如权利要求1所述的表达盒甲，其特征在于：所述表达盒甲自5’端至3’端依次包括如下原件：所述启动子pYAO、所述Cas9核酸酶的编码基因和终止子；
所述Cas9核酸酶为序列表中序列2所示的蛋白质。
3.含有权利要求1或2所述表达盒甲的重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒还包括表达盒乙；所述表达盒乙中由AtU6-26启动子启动sgRNA转录；
所述AtU6-26启动子为序列表序列7自5'末端第1-448位所示的DNA分子。
5.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒还包括功能片段乙；所述功能片段乙自5’端至3’端依次包括AtU6-26启动子、供crRNA的编码基因插入的多克隆位点区段和tracrRNA区段。
6.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述表达盒乙如序列表中序列9自5'末端第8941-9575位所示。
7.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述功能区段乙如序列表中序列7所示。
8.一种定向编辑植物基因组的方法，为方法(c1)或方法(c2)：
方法(c1)包括如下步骤：通过将权利要求4或6所述重组质粒导入出发植物，从而定向编辑所述出发植物的基因组中的所述sgRNA的靶基因；
方法(c2)包括如下步骤：(1)根据出发植物中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；(2)将所述crRNA的编码基因插入权利要求5或7所述重组质粒的多克隆位点区段中，得到重组质粒甲；(3)将所述重组质粒甲导入所述出发植物，从而定向编辑所述出发植物的基因组中的所述靶基因。
9.一种定向编辑植物基因组的系统，包括表达CRISPR/Cas9系统的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒中启动Cas9表达的启动子为权利要求1中所述启动子pYAO。
10.权利要求1中所述启动子pYAO在启动目的基因表达中的应用。
Priority Applications (3)
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| CN201510631450.5A CN105177038B (zh) | 2015-09-29 | 2015-09-29 | 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统 |
| PCT/CN2016/100533 WO2017054721A1 (en) | 2015-09-29 | 2016-09-28 | A CRISPR/Cas9 System for high efficient site-directed altering of plant genomes |
| US15/764,217 US20180273961A1 (en) | 2015-09-29 | 2016-09-28 | A CRISPR/Cas9 SYSTEM FOR HIGH EFFICIENT SITE-DIRECTED ALTERING OF PLANT GENOMES |
Applications Claiming Priority (1)
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