CN110268269A - 使用apoe4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默氏病 - Google Patents

使用apoe4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默氏病 Download PDF

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Abstract

本发明提供使用APOE4基序介导的基因和其表达产物以用于诊断、治疗和预防阿尔茨海默氏病和轻度认知障碍的组合物和方法。本发明还涉及鉴别治疗剂以基于APOE4基序介导的基因治疗和诊断阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的方法。

Description

使用APOE4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默 氏病
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月18日提交的美国临时申请第62/435,815号的优先权权益，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及诊断、预防和治疗阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的方法。本发明的方法至少部分地基于测量或调节来自由本发明人鉴别为与阿尔茨海默氏病相关的一组基因(在本文中被称作“APOE4基序介导的基因”)的一或多种基因或其表达产物。本发明还涉及使用APOE4基序介导的基因表达的抑制来治疗且诊断阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的方法。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)影响全世界数以百万计的人且其发病率继续上升。然而，当前不存在用于诊断、治疗或预防AD的可靠和有效方法。相信AD由环境、生活方式、医学病况和基因因素的组合造成。AD通常在其治疗可能最有效的早期阶段中未被识别到。当前食品和药物管理局(FDA)审批通过的阿尔茨海默氏药物具有显著副作用且仅对改善患者的日常功能具有适度作用，但不会减缓疾病进程或治疗潜在的病理。
尚未完全了解AD的生物化学基础。大部分AD研究聚焦于淀粉样斑块的聚集，所述淀粉样斑块的主要组分为淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解裂解和过度磷酸化微管相关蛋白Tau(MAPT)的神经原纤维缠结衍生的39-到43-氨基酸_β-淀粉样肽。AD的其它标志包含细胞周期调节蛋白依赖激酶5(CDK5)i的失调，所述激酶参与Tau的异常过磷酸化和AD早期到晚期的神经发炎的存在。已在AD患者的大脑区域、周边组织和生物流体中发现DNA损伤的标记(确切地说氧化DNA损伤)。研究还表明，AD涉及神经元细胞周期折返ii的功能不全。已注意到在AD患者的神经元、淋巴细胞iii和体细胞iv中，染色体异常、微核、双核和非整倍体的发生率增加。还通常观测到自噬失调v、高尔基体碎裂和萎缩vi。即使在斑块形成vii之前，观测到细胞表面α-胺基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(AMPAR)的下调和GluR2/R3AMPAR亚基的选择性损失。另外，早期核内体在偶发性AD中明显扩增，这是一种在ADviii的最早阶段几年前出现的异常现象。
不利的是，尚不清楚所观测的生物化学事件是AD发展的原因还是结果。常规研究明显地与AD的实际致病机制无关，但实际上仅与造成AD的潜在机制的结果有关。如果可获得关于AD发展的潜在机制的详细知识，那么将有可能精确地诊断、治疗和/或预防AD的发展。
一条可能治疗AD的诱人线索来自基因研究，所述研究在20世纪90年代早期揭露携载载脂蛋白(APOE)基因的特定等位基因(亦即APOE4等位基因)的人患上AD的风险大大增加。阿朴脂蛋白在血液和肝中转运胆固醇和甘油三酯方面具有主要作用。基因发现引发了阿朴脂蛋白可在AD的发展中所起的作用的大量研究。迄今为止，对于主要存在于血液和肝中的APOE4活性与在血脑屏障之外的大脑中鉴别出的AD的所观测生物化学效果之间的相关性，不存在普遍接受的阐释。此处同样，这个研究区域令人沮丧且尚未产生针对AD的新治疗。
由于AD的当前治疗仅治疗AD的症状而不治疗其潜在病因，因此仍然存在对用于通过治疗AD的实际病因治疗AD的方法的需求。
发明内容
本发明的一些方面基于直接地引起AD的发展的一组基因的发现。本发明人的这个发现提供用于诊断、预防和/或治疗AD的多个新途径。
本发明的一个特定方面基于APOE4变体的基因结构的分析和APOE4变体为神经元特异性转录因子NRF1产生新生识别基序的出人意料的发现。本发明人的这种显著的发现首次揭示APOE4等位基因在脑细胞中引起转录效应，且出乎意料地调节(例如，活化或抑止)广泛范围基因(在本文中被称作APOE4基序介导的基因)的转录。这些基因不通过APOE的其它等位基因活化(或抑止)至相同程度，由此首次提供对APOE4与AD的相关性的阐释。如本文所论述，APOE4基序介导的基因表达可造成抑制或活化特定基因或基因表达产物的活性。因此，贯穿本公开，应理解，当术语“抑制”时参看APOE4基序介导的基因表达或其基因表达产物使用时，术语“抑制”可替代地经术语“增加”或“活化”取代。举例来说，如果特定基因表达(或其基因表达产物的活性)由于APOE4等位基因的存在而减少或抑止，那么本发明的方法针对增加基因表达(或其基因表达产物的活性)。类似地，如果特定基因表达(或其基因表达产物的活性)由于APOE4等位基因的存在而增加，那么本发明的方法将针对抑制基因表达(或其基因表达产物的活性)。
识别APOE4基序的转录因子为核呼吸因子1(“NRF1”)。核呼吸因子1(又称为Nrf1、Nrf-1、NRF1和NRF-1)与神经突生长的调节相关联。NRF1还经展示以编码同聚的蛋白质且充当活化一些关键代谢基因的表达的转录因子。对可通过NRF1活化的APOE4附近的靶基因的分析将FBXO46鉴别为造成AD的基因。FBXO46干扰生理淀粉样蛋白生成路径的功能，从而引起广泛的蛋白质分选功能不全、细胞周期重返和神经元死亡且由此被认为造成AD。在一些实施例中，本发明的方法提供对FBX046的异常活性的抑制和/或对由APOE4基序产生的这种NRF1识别位点的作用的抑制以稳定或改善具有AD的个体的认知能力。
本发明的一个特定方面提供一种调节APOE4基序介导(亦即，调节)的基因表达或其基因产物的活性的方法。在一些实施例中，对APOE4基序调节的基因表达的调节可通过使能够或表达由APOE4基序介导的基因的细胞与分子接触来实现。如本文中所使用，除非本文另有规定，否则术语“分子”和“化合物”在本文中可互换使用且是指所属领域的技术人员已知的任何分子，例如(但不限于)药物、寡核苷酸(包括短干扰RNA、适体等)、肽(包括适体、抗体和其片段)以及其衍生物或经修饰形式。在一些实施例中，细胞为神经元细胞、神经元母细胞或分化神经元。在其它实施例中，对APOE4基序介导的基因表达产物的活性的调节可通过使所述基因表达产物能够选择性地调节所述基因表达产物的分子接触来实现。
在又其它实施例中，通过APOE4基序表达的基因位于rs429358的约2Mb内的人类染色体19上。在其它实施例中，APOE4基序介导的基因选自由以下组成的组：PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCCI、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OPA3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP，和其组合。在仍其它实施例中，APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP、RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5、GPR4，或其组合。在另一实施例中，APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR、KLC3，或其组合。
在一个特定实施例中，使用调节APOE4基序介导的基因表达的分子或化合物来调节APOE4基序介导的表达。如本文所使用，术语“APOE4基序介导的基因”、“由APOE4基序介导的基因”和“APOE4基序”在本文中可互换使用且是指位于rs429358的约5Mb内，通常约4Mb内，通常约3Mb内且最通常约2Mb内的人类染色体19上的基因。在一个特定实施例中，APOE4基序介导的基因选自由以下组成的组：PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCC1、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OPA3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP，和其组合。在仍另一实施例中，APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP、RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5、GPR4，或其组合。在另一实施例中，APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR、KLC3，或其组合。当用于描述数值时，除非另外规定，否则术语“约”和“大约”在本文中可互换使用且并不意欲限制本发明的范围。术语“约”和“大约”指在如一般技术人员确定的特定值的可接受的偏差范围内，其将部分取决于如何测量或确定所述值，即测量系统的限度，即特定目的所需的精确度程度。举例来说，根据所属领域的实践，术语“约”和“大约”可意味着1内或大于1的准差。替代地，当提及数值时，术语“约”和“大约”可意味着±20％，通常±10％，通常±5％及更通常±1％的数值。然而，一般来说，当在申请和权利要求中描述特定值时，除非另行说明，否则术语“约”和“大约”意味着在特定值的可接受的偏差范围内。当参看APOE4基序介导的基因表达使用时，术语“调节”包含降低或增加基因该转录和/或转译。这可包含相较于对照(例如，在不存在分子的情况下)下调或完全抑止或上调基因表达。通常，本发明的方法展示APOE4基序介导的基因表达或其表达产物的活性的至少约25％，通常至少约50％且通常至少约75％调节。在一个特定实施例中，本发明的方法抑制APOE4基序介导的基因表达或其表达产物的活性。
用于抑制APOE4基序介导的基因表达的分子包含(但不限于)药物、寡核苷酸、肽或其衍生物，或其组合。在一些例子中，寡核苷酸长度为11至30个核苷酸，包括SEQ IDNO:1内的连续核苷酸序列。在一些情况下，寡核苷酸为单链寡核苷酸，而在其它例子中，寡核苷酸为双链寡核苷酸。寡核苷酸还可为硫代磷酸酯寡核苷酸、甲基膦酸酯寡核苷酸、亚磷酰胺寡核苷酸、肽核酸寡核苷酸、锁核酸修饰的寡核苷酸，或其组合。
在一些实施例中，分子进一步包括药学上可接受的载剂。
本发明的另一方面提供一种用于鉴别可抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子的方法。可尤其使用这种方法来鉴别用于药物研发的主要候选物以用于治疗AD。
本发明的另一方面提供一种用于抑制细胞中的APOE4基序介导的基因表达的方法。方法包括使表达由APOE4基序介导的基因的细胞与能够抑制所述所述基因的表达的分子接触。在又其它实施例中，分子包括药物、寡核苷酸、肽或其衍生物，或其组合。在一些例子中，寡核苷酸为小干扰RNA(siRNA)。在仍其它实施例中，APOE4基序介导的表达基因为MIR4531、MIR8085、MIR6088、MIR330、MIR642A、MIR642B、MIR769或MIR320E且用于抑制表达的分子为锁核酸修饰的寡核苷酸。如本文所使用，术语“锁核酸”是指其中核糖部分经连接2'-氧和4'-碳的额外桥修饰的核酸。
本发明的另一方面提供一种用于治疗患有阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的个体的方法。所述方法包含测定存在于个体中的APOE基因分型；及(a)如果所述个体携载APOE4等位基因，那么向所述个体投予能够抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子；或(b)如果所述个体不携载APOE4等位基因，那么向所述个体投予与(a)的所述分子不同的分子。在一些实施例中，所述方法可包含测定所述个体对于APOE4是纯合抑或杂合的步骤。如本文所使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”疾病包含：(1)预防疾病，即使得疾病的临床症状不出现在可易患所述疾病但尚未经历或显示所述疾病的症状的哺乳动物中；(2)抑制疾病，即遏制或减少疾病的出现或其临床症状；或(3)缓解疾病，即使得消退疾病或其临床症状。
本发明的优点包含AD治疗的转化型方法、延迟AD发病的解决APOE4基序介导的功能不全的靶向疗法、预防其进展或逆转其症状且提供疾病改善疗法，即治疗AD的实际病因而非仅治疗AD的症状。
附图说明
图1说明来自11种哺乳动物物种的APOE4区的蛋白质序列比对。
图2为小鼠APOE和人类APOE4关于ε等位基因残基的比较。
图3说明通过APOE4和触发子特异性转录因子活化造成AD的基因的机制。
图4说明SorLA在健康个体中的淀粉样蛋白生成路径中的生理作用。
图5分析APOEε等位基因附近的DNA序列。APOE4基序被定义为序列“TGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGG”。存在于rs429358中的核苷酸变化以粗体和加底线突出显示。
图6显示APOE4基序的基因组出现。
图7为展示通过APOE4产生新生NRF1结合位点的示意性图示。
图8a-c展示FBXO46作用机制和FBXO46错表达对淀粉样蛋白生成路径的影响。图8A，图例：滞蛋白亚基CUL1充当在氨基末端处与接合体亚基SKP1(S相激酶相关蛋白1)且在羧基末端处与RING(锌指蛋白RBX1和特定泛素共轭酶E2)互动的分子架构。F-盒蛋白FBXO46经由Skp1与F盒域与之间的相互作用连接至核复合物。泛素从E2转移到通过FBXO46募集的底物上。在聚泛素化之后，通过蛋白酶体或替代地溶酶体来识别和降解底物。FBXO46的特定目标底物为SorLA或影响SorLA基因转录和/或蛋白质稳定性的蛋白质。图8(c)，FBXO46表达对淀粉样蛋白生成路径的影响。突变效应：APOE4相关的FBXO46表达降低了SorLA水平；受影响步骤：APP-BACE1处理过早地出现；最终结果：Fe65保持结合于APP，无BACE1回收(核内体扩增)，无逆运复合体(retromer)结合。
图9为内质网蛋白-2错表达对淀粉样蛋白生成路径的影响的示意性图示。
具体实施方式
载脂蛋白E(“APOE”)为调节从一种组织或细胞类型转运到另一种的脂质的主要胆固醇载体。在大脑中，APOE主要由星形胶质细胞产生，且通过APOE受体将胆固醇转运到神经元。其为由单基因位点处的不同等位基因(标示为ε2、3及4)产生的多晶型蛋白质。“等位基因”为人类中存在的基因的变体或替代形式。个体通常在受孕时遗传针对每个基因的两个这类等位基因。(表1)展示一般人类中的APOEε变体频率。三个主要异构体APOE2、APOE3和APOE4因2个位置rs429358(位置19处的T/C多晶型：基因组参考协会人类构建38补丁版本2(Genome Reference Consortium Human Build 38patch release 2)/GRCh38.p2中的染色体19上的44908684)和rs7412(位置19处的C/T多晶型：GRCh38.p2中的染色体19上的44908822)处的半胱氨酸/精氨酸取代而不同于彼此，从而影响含有信号肽之合成蛋白质中的残基130和176和成熟蛋白质中的残基112和158。APOE等位基因ε4(APOE4变体，较短形式E4)具有位置19:44908684和位置19:44908822处的C。APOE等位基因ε2(APOE2变体，较短形式E2)具有两个位置处的T。APOE等位基因ε3(APOE3变体，较短形式E3)具有位置19:44908684处的T和位置19:44908822处的C(表2)。在以下段落中，“APOE2/E3/E4”将视上下文而定指代基因或蛋白质变体。“APOE2/E3/E4”具有APOE2或APOE3或APOE4存在的含义。APOE3为所有已知官能基的正常异构体。APOE2与基因病症III型高脂蛋白血症和动脉粥样硬化相关ix。
表1：一般人类中的APOEε变体频率
表2：APOE2、APOE3和APOE4
由本发明人进行之连接研究和基因组广泛相关性已揭露载脂蛋白E变体APOE4作为AD的最大已知基因风险因子。另外，基于临床和尸检的研究的荟萃分析(meta-analysis)表明罹患AD的风险在E4变体相比于E3/E3基因分型的每一个复本下增加：优势比(OR)在E4等位基因的一个复本下为2.6(E2/E4)和3.2(E3/E4)，OR在等位基因的两个复本(E4/E4)下增加到14.9。在另一方面，APOE的E2等位基因针对AD具有防护性，其中针对E2/E2个体OR＝0.6。APOE4与早期发病年龄相关，其中针对APOE4纯合体，年龄68为平均临床发病年龄，而针对未携带APOE4等位基因的个体，84岁为平均临床发病年龄x。临床和流行病资料指示：根据人类和研究而定，40％到80％之间的AD患者为APOE4携带者xi，其中APOE4的外显率估计为60％到80％xi。这些资料展示APOE对AD的作用的量值更类似于在孟德尔疾病中针对主要基因(例如乳癌中的BRCAI)所观测到的量值，而不是由复杂疾病中最新的GWAS所识别的低风险常见等位基因xii。
最常接受的前驱症状的AD阶段为轻度认知障碍(MCI)，其特征在于在不存在显著干扰日常功能的情况下的临床上地相关认知功能障碍。对于具有一或多个APOE4等位基因的个体，从正常认知到轻度障碍的相关进展风险加倍xiii。另外，E4/E4纯合子状态实质上加速了MCI到痴呆症的进展，并且加速MCI患者痴呆症发生率大于3年xiv。
基因组广泛的相关研究展示APOE区域还与非病理学认知老龄化显著相关xv。
变体ε2、ε3和ε4嵌入与人类大脑中高度甲基化的APOE基因的内含子3和外显子4的末端重叠的CpG岛状物(CGI)中。这种APOE CGI可在荧光素酶类报导子系统中根据细胞类型和启动子构建体用作转录强化子或沉默子xvixvii。
蛋白质中的氨基酸变化几乎始终使得功能降低，并且为疾病病因的主要嫌疑因子。由于直接的致病作用可不归因于AD中的APOE4蛋白质功能，随后进行对数千AD患者DNA样本的完全外显子组定序分析。然而，这些研究未能识别与疾病相关的非同义突变(除APOE4以外)。在基因组广泛相关研究中将若干基因组区域识别为晚期发病疾病的风险因子(例如，CLU、PICALM、CRI、BINI、MS4A、CD2AP、CD33、EPHAI和ABCA7)xviii。然而，从所执行的超过400个基因相关性研究中未识别到单一功能性风险变体。在这些研究中，仅小部分患者具有给定的单核苷酸多形现象(SNP)。此外，所识别的绝大部分SNP位于内含子中。APOE4为始终与AD相关的单一突变。
大致一半的早发型阿尔茨海默氏病例(即，在65岁之前诊断)为家族性阿尔茨海默氏病(FAD)，并且以常染色体显性方式遗传。FAD由至少3个基因中的一者的突变造成：APP突变、PSENI突变和PSEN2突变。已在121个家族中识别出淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)突变。最常见的错义突变利用Ile(伦敦突变)、Phe或Gly残基替换Val717残基，利用Gln残基(荷兰突变)或Gly残基(北极突变)替换Glu693，或利用Asn和Leu残基替换Lys670和Met671(双重突变称为瑞典突变，在APP770异构体中编号)。已在480个家族中识别出219个早老素1(PSEN1)，其中γ分泌酶裂解减弱、一些突变的氧化应力增加且对DNA损伤诱发的死亡的神经元敏感性增加xix。已在34个家族中识别出13个早老素2(PSEN2)，其中γ分泌酶裂解减弱且一些突变的氧化应力增加xx。
当α分泌酶存在时，APP的非淀粉样蛋白生成加工主要发生在细胞表面。其为在生理条件下APP裂解的主要类型xxi。由α-分泌酶进行的蛋白水解裂解导致产生可溶性APP肽(SAPPα)，且保留相应的膜锚定的C端片段，C83。由早老素/呆蛋白(nicastrin)介导的γ分泌酶对C83的后续加工产生p3肽和C端胞内可溶性结构域AICD。在γ分泌酶加工之后，可溶性AICD在分解时释放于细胞质中，但其一部分在具有重要的信号传递功能时再分布到细胞核中xxii。淀粉样蛋白生成加工同样为正常APP加工的一部分，但在APP遇到β分泌酶(BACE1)时包括通过内吞细胞器的中转xxiii。由BACE1进行的APP蛋白水解裂解导致产生可溶性APP肽(SAPPβ)，且保留相应的膜锚定的C端片段，C99。利用γ分泌酶对C99的加工释放AICD和淀粉样蛋白-β片段(Aβ40-42)。Aβ40/Aβ42比率受到胞内产生位点的影响。依赖于从早期内体再循环到TGN的内吞APP池，Aβ40主要产生于反式高尔基体网状结构(TGN)中xxiv。APP在TGN与内体之间的双向运输的中断，具体地逆运复合体(retromer)介导的获取从早期内体到TGN的APP，使得内吞APP在减少APP加工下积聚于早期内体中。BACE1在内体、TGN或质膜之间经历再循环，自其中内吞。BACE1的胞溶质结构域含有结合高尔基体定位的含有γ-耳状物的ARF结合(GGA)蛋白质并且影响其亚细胞分布的酸性聚簇-双白氨酸基序(ACDL)。利用酪蛋白激酶1对Ser498的磷酸化促进了GGA1对BACE1的识别以获取到内体。BACE1C端Lys501的泛素化对GGA3进行信号传递以将BACE1输出溶酶体以用于分解。逆运复合体介导BACE1从内体到TGN的逆行转运。在碱性条件下，大部分含有树突状囊泡的APP和BACE1在通过分泌路径合成之后在很大程度上经分离。虽然将BACE1分选到酸性再循环内体中，但APP在高尔基体衍生的囊泡中运送。然而，在触发诱导淀粉样蛋白生成路径后，APP通过网格蛋白依赖性机制传送到BACE1阳性再循环内体中xxv。替代地，BACE1可聚簇于质膜处的脂筏中并且与APP一起经历内吞作用。
APP的细胞质域含有高度保守性Y682ENPTY687基序(神经元APP剪接形式APP695的残基编号)，其中若干接附蛋白通过其磷酸酪氨酸结合(PTB)域结合，最值得注意地是Fe65(淀粉样蛋白βA4前体蛋白质结合家族B成员1，APBB1)xxvi。Fe65为在哺乳动物神经系统的若干区域中的神经元中表达的90-kDa接附蛋白xxvii。Fe65具有三个假定的蛋白质-蛋白质相互作用结构域：一个WW(富含色氨酸，脯氨酸-脯氨酸-白氨酸-脯氨酸-序列结合)结构域和两个PTB结构域。PTB1结构域结合其中的组蛋白乙酰基转移酶Tip60(KAT5)xxviii和转录因子LSF/CP2/LBP1(TFCP2)，其为AD风险的基因决定因子xxix。TFCP2驱动DNA复制和细胞存活所必需的胸苷酸合成酶的表达。此外，Fe65还通过其WW结构域与肌动蛋白细胞骨架重塑所涉及的蛋白质，尤其血管舒张剂刺激的磷蛋白VASP相互作用。VASP已展示调节脊椎和突触形成、成熟，以及脊椎头部增大xxx。
低密度脂蛋白相关的蛋白质-1(LRP1)为主要定位于肝细胞、成纤维细胞和神经元中的受体。其由连接到较短跨膜子单元(85kDaβ链)的胞外配体结合子单元(515kDaα链)组成。其作为内吞受体和作为信号传递分子两者涉及多种生物过程。此外，LRP1表达对于初级神经元在应力条件下的存活是极其重要的xxxi。在生理条件下，LRP1经历由金属蛋白酶介导的胞外域脱落以释放可结合于配体的可溶形式的LRP1(sLRP1)xxxii。LRP1和其配体(尤其APOE)与AD在基因上相关并且在AD患者的老年斑中发现xxxiii。连同LRP1一起，APP从早期分泌性隔室转运到细胞表面并且随后内化到内体隔室中。已经证明LRP1调节APP加工和运输中的多个步骤，包含APP的全长和C端片段两者的翻转、APP的分泌、细胞表面APP的内化，以及Aβ肽的产生和释放xxxiv。已知APP不是直接地而是通过与Fe65的PTB1结构域间接相互作用来结合于LRP1xxxv。
可在常规条件下在神经元中观测到由针对脯氨酸的蛋白激酶(例如CDK5、GSK-3β、CDK1)和c-Jun N端蛋白激酶(JNK)xxxvi对Thr668处的APP的磷酸化。需要利用JNK的苏氨酸668磷酸化以用于由β分泌酶产生的APP的C端片段的γ介导的裂解xxxvii。Thr668位于基序667VTPEER672内，其形成I型β转角和使其羧基端螺旋结构稳定的氨基端螺旋封端盒结构。Thr668的磷酸化诱导APP细胞质区域的构形变化，从而影响其与Fe65的相互作用xxxviii。当Thr668的磷酸化通过突变消除或通过Thr668激酶抑制剂抑制时，Aβ的产生显著减少。Thr668磷酸化还可以促使APP的BACE1裂解xxxix。
涉及内体隔室与TGN之间的运输的蛋白质，即逆运复合体复合物(Vps35、Vps26)和其假定的受体(SorL1/Sortilin相关受体，SorLA)已涉及AD的分子病变xl、xli。尚未发现APP与逆运复合体复合物之间的直接结合，从而证明将APP桥接到逆运复合体的分选受体的存在。为调节APP到TGN的运输，逆运复合体结合于神经元分选受体SorLA的分选基序，该神经元分选受体本身结合到APP的细胞质域xlii。降低的逆运复合体活性可以模拟家族性AD早老素突变对APP加工的作用xliii。
若干研究已展示SorLA相对于AD具有防护性。已在AD患者的尸检材料中注意到SorLA在皮层和海马区中的含量减少。在另一方面，SorLA的表达在小脑(不受AD病变影响的组织)中是正常的。蛋白质印迹和免疫组织化学分析证实AD前额皮层中的SorLA蛋白质减少25％xxliv。在AD患者的脑脊髓液中观测到脱落的SorLA胞外域水平降低xlv。然而，SorLA的表达在患有FAD的个体中和在PS1/APP转殖基因小鼠中是正常的xlvi。神经元SorLA表达在显示轻度认知障碍的个体中减少xlvii。据报导若干与AD相关的SorLA变体使得SorLA蛋白质水平降低xlviii。
APP通过其碳水化合物连接的细胞外域和其细胞质尾部两者与SorLA相互作用xlix。研究展示分泌酶为需要通过APP低聚合的协同作用进行高效加工的变构酶并且SorLA防止APP低聚合，致使分泌酶切换到低效的非变构作用模式l。SorLA还与BACE相互作用，并且可因此直接影响BACE-APP复合物形成li。Ser2206处的SorLA(接近细胞质域中的GGA结合位点的残基)的ROCK2激酶磷酸化促进通过金属蛋白酶的SorLA胞外域脱落和GGA结合。这种磷酸化事件是恰当的APP淀粉样蛋白生成加工所必需的lii。经过加工的SorLA C尾端仍能够独立于GYENPTY基序结合C99(β裂解的，C端APP片段)102。
核呼吸因子1(NRF1)蛋白质序列以寄存编号Q16656-1作为“NRF1＿HUMAN”寄存于UniProtKB中。NRF1为介导关键代谢基因和线粒体生物合成所必需的一系列核基因的表达的均二聚转录因子，包含呼吸链复合体的子单元，和mtDNA转录和复制机构的组分liii。NRF1调节谷氨酸能受体子单元基因(例如，NMDA受体子单元1和2B以及AMPA受体子单元2)的表达和离子泵Na+/K+-ATP酶的子单元的表达，由此在能量消耗、能量产生和神经元活性之间的偶合中起重要作用。NRF1还与神经突生长的调节相关lv。此外，一组神经退化病症相关的基因，例如PARK2、PINK1、PARK7和GPR37、PSENEN和MAPT已识别为NRF1靶标lvi。对来自死后大脑的微阵列数据使用网络拓扑分析，还发现NRF1为AD的潜在重要因子lvii。
F盒蛋白质家族的成员，例如FBXO46为SCF复合物(或含有SKP1-滞蛋白-F盒的复合物)的组分，催化指定用于蛋白酶体分解的蛋白质的泛素化的多蛋白质E3泛素连接酶。滞蛋白子单元CUL1充当在氨基末端处与接合体子单元SKP1(S相激酶相关蛋白1)且在羧基末端处与RING指蛋白RBX1和特定泛素共轭酶(E2)相互作用的分子架构。F盒蛋白质充当通过F盒结构域结合SKP1并且通过F盒基序的其它基序定位的C端结合带泛素化的基质的可变组分。每一F盒蛋白质具有靶标特异性并且识别较小亚组的基质，由此促进SCF的特异性。
一些F盒蛋白质还具有其自身的功能。作为一实例，FBXP38为Krueppel类因子KLF7的转录共活化剂。
内质网蛋白形成在细胞中具有多个功能的较大且不同的膜相关蛋白质家族。内质网蛋白主要定位到内质网，并且有证据表明其涉及成型内质网(ER)膜、ER-高尔基体运输、膜形态发生、囊泡形成和融合以及内吞循环lviii。哺乳动物内质网蛋白质家族由四种成员(RTN1-RTN4)组成。尽管内质网蛋白基因在许多组织中表达，但RTN4(Nogo)和RTN2优选地在神经组织中表达。已广泛证明RTN4为轴突延伸和神经突生长的抑制剂。RTN2突变引起轴突退化性病症遗传性痉挛截瘫12型lix。
He等人lx展示BACE1与RTN1、RTN2、RTN3和RTN4共免疫沉淀。内质网蛋白结合于BACE1跨膜/C端结构域并且抑制其活性。单RTN的过度表达降低由表达促进β分泌酶的APP变体(瑞典突变)的HEK-293细胞产生的Aβ的水平lxi。已在表达APP瑞典和伦敦突变的转基因小鼠中观测到RTN3对β淀粉样蛋白积聚的降低lxii。在另一方面，已知内质网蛋白积聚在阿尔茨海默氏病神经元的营养不良性神经突中。过表达RTN3的转基因小鼠发展成在形态上类似于在AD大脑中观测到的彼等并且与易感性大脑区域中形成RTN3聚集物相关的营养不良性神经炎lxiii。
神经元中的轴突微管组织化以使得正端从细胞体向外取向，而树突展现含有负端和正端微管两者的混合微管极性。囊泡和细胞器沿微管的胞内转运通过驱动蛋白(顺行)和细胞质动力蛋白(逆行)分子运动来提供动力。动力蛋白为具有六个子单元的较大蛋白质复合物：较大动力蛋白重链、中间体链和较轻的中间体链，以及三个动力蛋白轻链。驱动蛋白-1由使用ATP水解以提供动力在微管上移动的一对重链(KHC)和调节KHC活性并且介导货物附接的一对轻链(KLC)组成。APP能够通过其C端余KLC的结合将驱动蛋白-1募集到囊泡lxiv，但一些迹象表明APP与驱动蛋白-1的附接可不是直接的，反而需要c-Jun N端激酶(JNK)的蛋白质-交互蛋白质(JIP1-1/JIP-2)。数据进一步表明APP还能够募集动力蛋白-1作为逆行APP囊泡运动子单元lxv。此外，驱动蛋白-1需要动力蛋白在APP囊泡上的正确缔合。货物上驱动蛋白-1的损失导致囊泡上动力蛋白减少。由于顺行和逆行运动两者可同时附接到同一货物，所以精密的协作对于胞内材料的恰当分布是极其重要的。在动物模型中的研究表明由驱动蛋白-1功能障碍造成的轴突转运改变干扰了神经组织中Aβ和磷酸化Tau两者的水平。小鼠转录组学已识别KLC1作为Aβ积聚的调节剂。使用神经母细胞瘤细胞的功能分析展示KLC1剪接变体的过度表达增加了Aβ40和Aβ42两者的产生lxvi。
载脂蛋白E(APOE)为脂蛋白的关键成分并且对于保持胆固醇和三酸甘油酯体内平衡是至关重要的。其在正常(健康)条件下由约75％的星形胶质细胞群表达，其中在嗅球中表达水平最高。除了响应于应力(例如，兴奋毒性损伤)，其不由神经元表达。已提出一系列假设来阐释APOE4等位基因与AD的缔结lxvii:抗氧化防御系统的缺陷、神经元信号传递路径的调节异常、细胞骨架结构和功能的破坏、改变的Tau磷酸化和神经元纤维缠结的形成、大脑中胞溶质雄激素受体水平的减少、Aβ诱发溶酶体泄漏和神经元细胞凋亡的增强，或促进与Aβ过度产生相关的内体异常，或经表达APOE蛋白质的直接转录作用lxviii。本领域技术人员已推断这些APOE4作用是由APOE蛋白质中的氨基酸变化Cys130/Arg介导的。
分析APOE的变体并且出人意料地发现APOE变体蛋白质结构与AD之间不存在相关性：与AD风险增加相关的APOE4变体(Cys130/Arg)如通过预测蛋白质变体(例如，Sift、PolyPhen-2)的有害影响的工具评定为良性的。预测其紧邻的Arg132/Ser将更损坏但其与AD风险增加不相关。此外，惊人的是大多数哺乳动物在位置130(Arg)处携带有E4异构体。来自猿和若干其它哺乳动物的APOE4区域的多个蛋白质序列比对提供于图1中。
已建立许多APOE小鼠模型以研究APOE4致病性作用的根本机制。这些模型包含在神经元或星形胶质细胞中表达不同的APOE异构体的转基因小鼠、在神经元中表达神经毒性APOE4片段的小鼠和人类APOE异构体敲入小鼠。然而，由于小鼠APOE针对ε等位基因残基相当于人类APOE4(图2)，所以利用转基因小鼠获得的结果不能表示人类APOE4变体的真实作用，这是因为其通过在结构上相同的异构体替换了WT小鼠APOE。此外，在APOE异构体之间观测到的差异展示人类APOE4蛋白质仅在转殖基因神经元中人工地过度表达时才为有害的。在另一方面，APOE2/3/4敲入到Apoe+/-小鼠显示与人体内相同的与LDLR的亲和力等级次序(APOE4>APOE3>>APOE2)。此外，在表达相应APOE基因分型的小鼠中反映了人体内APOE变体的脂蛋白特征曲线。在相应的APOE2/3/4敲入小鼠中反映了携带不同APOE异构体的人体内胆固醇水平的差异。以相同的方式，Apoe-/-小鼠中的星形胶质细胞(在例如胶质细胞原纤维酸性蛋白/GFAP)中的APOE的转殖基因过度表达不会引起老年斑积聚、神经退化，抑或任何其它AD标志。本发明人意识到即使对胆固醇和脂肪代谢起作用的APOE等位基因精确地呈现在动物模型中，但这些模型并不显示AD标志。本发明人发现，与本领域技术人员相反，APOE4对AD的作用并不与蛋白质层级下的Cys至Arg突变相关。
许多基因在多于一个子集的细胞或组织中表达。转录因子的活性允许对这些基因的时间和空间调节。转录因子结合于调节元件，例如强化子，从而使得刺激或增强，或者抑制基因转录。强化子含有在其相应启动子中发现的相同的调节元件。其通常表示较短序列基序的模块化布置，所述基序各自与特异性细胞转录因子相互作用lxix，所述特异性细胞转录因子将负责开启或关闭不同集合细胞集中的转录，或在发展的不同时间处开启或关闭转录。
本发明人发现基因层级下的APOE4变体含有较短序列基序“APOE4基序”(图5e)并且形成AD神经元中转录因子NRF1的新生识别序列。APOE4转录增强子元件可延伸超出中心APOE4基序，从而涵盖APOE4外显子4上的邻近序列。
强化子通过细胞型特异性转录因子的结合发挥其调节功能。因此，使用来自真核生物的实验定义的转录因子结合位点的JASPAR CORE数据库的结合概况检索用于假定转录因子结合位点的APOE4基序的DNA序列(jaspar.genereg.net)。计算所探测序列的得分，其提供与转录因子共有序列类似的量测值。APOE4基序的这种分析得到核呼吸因子1(NRF1)共有结合基序的统计学上显著的命中值(图7a)。表4展示相较于针对相同位置的APOE3所获得的得分和相对得分，针对APOE4rs429358/C变体所获得的最高值。由APOE4变体产生的新颖NRF1结合位点位于反向链上(图7b)，其中得分为11.859，而APOE3产生3.879的得分。作为比较，预期NRF1共有序列在JASPAR中的最高得分为18.058。如果序列对于功能性或随机位点具有相等的概率，那么得分为0。此外，APOE4变体NRF1共有序列的核苷酸频率矩阵中出现0次非共有T核苷酸(A在反向链上)变为频率矩阵中出现4275次的高度保守、共有匹配的C核苷酸(G在反向链上)(图7c)。出人意料地发现，T核苷酸(APOE3)改变成C核苷酸(APOE4)产生了新生NRF1结合位点。APOE4基序还产生转录因子HIF1A::ARNT的统计上显著的命中值。用于这个转录因子的结合基序可发现于同样具有类似得分的APOE3序列中(表4)。HIF1A::ARNT为缺氧诱导因子1(HIF-1)、由α子单元HIF1A(缺氧诱导因子1，α)和β子单元ARNT(芳基烃类受体核转运蛋白)组成的异二聚体转录因子。HIF-1为由于许多基因的活化而对于低氧的细胞反应的首要调节因子。由APOE4产生的新生NRF1结合基序覆盖已经存在的HTFA::ARNT结合基序。因此，在APOE4中，AD患者对于低氧的反应可归因于NRF1和HIF-1与相同DNA区域的竞争性结合而受到阻碍。
表4：与rs429358重叠的区域的JASPAR分析
模型ID 模型名称 序列名称 得分 链 预测位点
MA0506.1 NRF1 共有序列 18.058 正向 GCGCCTGCGCA
MA0506.1 NRF1 APOE3,Rs429358/T 3.879 反向 GCGGCCGCaCA
MA0506.1 NRF1 APOE4,Rs429358/C 11.859 反向 GCGGCCGCgCA
MA0259.1 HIF1A::ARNT 共有序列 11.2 正向 GGACGTGC
MA0259.1 HIF1A::ARNT APOE3,Rs429358/T 11.2 正向 GGACGTGt
MA0259.1 HIF1A::ARNT APOE4,Rs429358/C 9.6 正向 GGACGTGc
APOE变体rs429358以小型大写字母表示。
APOE4基序的NRF1结合位点为合法增强子，因为这些序列可以正向或反向定向定位于所调节基因的内部、下游或上游中，且大部分转录因子结合位点可在两个定向中出现于启动子或增强子中。
年龄、头部外伤、不充分地受控多尿症以及共同病毒感染为影响AD发病、进展和结果的已知风险因素。这些触发所有刺激NRF1活性lxx、lxxi、lxxii、lxxiii。本发明人发现APOE4变体产生NRF1的新生结合位点，其为调节造成AD的基因的表达的APOE4基序的部分。
在一些情况下，增强子长距离调节DNA转录。举例来说，音猬因子(SonicHedgehog)增强子ZRS定位于其调节的基因上游的1Mb。增强子与启动子相互作用的能力不限于位于其染色体上顺式基因。发现基因调节元件参加与其它染色体上的靶基因的直接实体相互作用lxxiv。增强子的又一重要属性其读数是特定于上下文的lxxv，因此太大为其内的突变效应，其可更改一个组织而非另一组织中的基因的表达。已知远端作用的增强子中的变体有助于疾病(例如，β-地中海贫血、赫希施普龙氏病(Hirschsprung's disease)、足前多趾症)。发现更改淋巴增强子-结合因子1(LEF1)转录因子的结合位点的共用单核苷酸多态性(SNP)(其减少所培养人类角化细胞中的LEF1反应性和增强子活性)有助于北欧人中发现的典型金发表型lxxvi。
本发明人发现，APOE4基序充当造成AD易受损神经元中远处基因的不当转录的增强子，定义为造成AD的基因。
增强子会影响位于相同染色体上相距2Mb的顺式基因的转录，但其也可影响位于通过蛋白质-蛋白质DNA-DNA或蛋白质-DNA交互作用引入空间接近增强子的不同染色体上的基因的转录。定位APOE4基序上游和下游的若干基因会影响涉及AD的途径。
在一些实施例中，“APOE4基序介导的基因”意味着位于定中心于染色体19的rs429358的APOE4基序上游或下游的2Mb(2兆碱基＝2百万碱基)内的任何基因。在仍其它实施例中，术语“APOE4基序介导的基因”或“表达产物”分别是指相较于其它APOE等位基因通过APOE4等位基因的存在调节(例如，增加或减少)的基因或表达产物。在一些情况下，APOE4基序介导的基因或其表达产物的活性与其它APOE等位基因相比较增加。在其它情况下，基因或其表达产物的活性与其它APOE等位基因相比较减少。这个基因的转录产物包含基于这类基因的任何RNA转录物，包括任何微RNA或mRNA(无论mRNA转录物是否为原生、剪接、编辑、修饰或成熟的)。如本文中所使用，“APOE4基序介导的基因表达产物”意味着从APOE4基序介导的基因的mRNA转录物转译的多肽，尽管其有时通俗地用以指基因的RNA转录产物。这类多肽可为初生的或处理为蛋白质的成熟或修饰形式。
从EnsEmbl的GRCh38.p5智人基因组组装lxxvii汇编APOE4基序介导的基因的代表性列表(包括位于APOE基序周围2Mb窗中的染色体19上的基因)且提供于表3中。这些基因包含PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCC1、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OP A3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4和FKRP。在仍其它实施例中，通过APOE4基序表达的基因包括：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP、RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4。在另一实施例中，通过APOE4基序表达的基因包括：FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR和KLC3。
表3：位于APOE4基序上游和下游约2Mb内的基因的代表性列表(基因组组装GRCh38.p5)
真核生物中的细胞周期的进展通过高度受控制磷酸化和细胞周期调节蛋白质的降解来实现。SCF通过细胞周期调节蛋白的特异性结合和泛素化来控制G1/S和G2/M相转变(例如，FBXW7直接地结合于细胞周期调节蛋白E且FBXO31介导细胞周期调节蛋白D1降解)。F盒蛋白本质上本身不稳定且通过泛素相关路径降解，大概通过在组装SCF复合物内自身泛素化，由此使得细胞能够快速适应改变环境条件和通过细胞周期进展lxxviii。在AD神经元中观测到细胞周期重返且因此暗示F-盒蛋白功能。FBXO46干扰正常淀粉样蛋白生成路径。
研究表明，对内质网蛋白的更改，例如增加的聚合，削弱了BACE1结合，从而增加淀粉样-β产生且促进内质网蛋白在营养不良神经突中的沉积。RTN2的不当表达干扰AD神经元中的正常淀粉样蛋白生成路径。
具有减少KLC1功能的APP转基因小鼠展现早期和加重的大脑淀粉样斑块，认为这由异常APP转运和/或裂解造成。运动蛋白亚单位KLC3在AD神经元中的不适当表达干扰正常淀粉样蛋白生成路径。
位于来自EnsEmbl的GRCh38.p2智人基因组组装的APOE基序周围的2Mb窗中的染色体19上的基因的列表提供于表3中。这个列表随后与NRF1靶基因的列表进行比较，所述NRF1靶基因的列表如从在ENCODE项目的SK-N-SH人类神经母细胞瘤细胞中执行的ChIP-Seq实验中撷取的公开的ChIP-Seq-Based数据来确定(encodeproject.org，DDBJ序列读数档案，寄存编号SRP007993)lvi。通过这种分析，在受NRF1控制且位于APOE4基序附近中的基因当中鉴别出F-盒蛋白FBXO46。FBXO46定位于19q13.32上，距APOE下游0.8Mb。位于APOE4基序附近且受NRF1控制的其它基因包括：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4和FKRP。APOE4变体产生用于NRF1的新生结合位点，且在已知转录增强子活性可及的APOE4基序的基因组距离内，将FBXO46确定为靶基因。不受任何理论限制，，相信APOE4基序通过AD神经元中的NRF1介导转录。APOE4基序介导的基因表达是指刺激或替代地抑制基因表达。
在RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4的5'DNA区域中也检测到NRF1结合位点。相对于转录开始位点涵盖1000bp+400bp的基因RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4的5'DNA区域经受NRF1结合基序的JASPAR 2016数据库(http://jaspar2016.genereg.net/)检索。在RTN2的5'区域中鉴别出得分为11.490的一个NRF1结合位点，在IRGQ的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于14.489到18.058的五个NRF1结合位点，在SRRM5的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于14.489到18.058的五个NRF1结合位点，在FOXA3的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于10.857到17.077的三个NRF1结合位点，在FOSB/ΔFOSB的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于10.228到18.058的八个NRF1结合位点，在SIX5的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于14.200到18.058的三个NRF1结合位点，且在GPR4的5'区域中鉴别出得分为9.693的一个NRF1结合位点(表5)。我们推断，基因RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4受转录因子NRF1控制。
在启动子和增强子处结合的细胞周期或组织特异性DNA结合转录因子募集建立远侧增强子与启动子之间的接触的“环”因子。这类因子似乎在由通用因子(如CCCTC结合因子(CTCF))介导的更多“结构”环内形成环。CTCF和粘附蛋白涉及哺乳动物基因组中自我缔合、长程染色质拓扑域的形成。CTCF在不同细胞类型中的差异募集通过帮助确立控制增强子活性的细胞型特异性染色质域来控制差异基因表达模式。结合于其结合位点的两个CTCF分子之间的相互作用正面地影响所有基因在所产生环内的表达。众多CTCF结合位点存在于APOE基因组区域(APOE的上游以及下游)中。
已充分地记载环境、生活方式和医学病况对AD发病的影响。取决于研究，同卵双胞胎的AD的符合率在59％与80％之间变化。此外，在均受AD影响的同卵双胞胎当中，发病年龄的差异范围介于0到15岁。在APOE4的情况下，外显率为约67％。因此，AD基因的表达取决于将通过诱导AD神经元特异性CTCF环内部的次级染色质环影响疾病结果的触发子。APOE4基序在所需因素存在于AD易受损神经元中时变为活化的，因此解释外部触发子如何影响疾病的表达。重叠APOE的DNA环由2个CTCF分子之间的神经元特异性相互作用产生。在携载APOE4变体的个体中，触发子特异性转录因子NRF1诱导次级染色质环的形成且随后介导造成AD的基因的表达。APOE3不产生NRF1结合位点且因此不为这个转录因子的神经元特异性增强子且通常不允许转录调节。保护性APOE2可结合这个基因的转录抑制物(图3)。
不受任何理论限制，相信响应于环境和生理应激，NRF1在AD神经元中活化，所述环境和生理应激包含(但不限于)感染、脑缺氧、低血糖或高胰岛素血症。在一个非限制性实例中，通过结合于APOE4基序和FBXO46基因的近侧启动子区，相信NRF1开启造成AD的基因FBXO46的不适当表达。
淀粉样蛋白生成路径中的关键步骤中的一个涉及LRP1、Fe65和APP在三元复合物中的内吞作用，随后通过BACE1和γ-分泌酶处理，在Thr668处进行APP磷酸化，且最后将c99-APP逆运复合体介导的逆行运输到TGN中。所有这些步骤必须以精确顺序进行。这些步骤中的任一个的延迟或故障引起细胞周期重返、CDK5过度活化、Tau/MAPT过磷酸化和缠结形成以及最终的细胞死亡。
图4说明SorLA在生理淀粉样蛋白生成路径中的作用。SorLA与淀粉样蛋白生成运输核内体内部的APP的相互作用通过BACE1抑制过早APP处理。将SorLA磷酸化且在APP同样磷酸化后之后脱落其胞外域，这引起构形变化和释放Fe65。BACE1增加对APP的获取且接着在APP处理之后回收。逆运复合体随后能够结合于仍连接至C99的SorLA的C-尾部，且将APP撷取到TGN。
SorLA在AD神经元中的过表达减少了淀粉样蛋白生成处理和老年斑块形成，而基因表达(如在基因剔除小鼠模型中)的失活促进淀粉样蛋白生成处理和老年斑块形成。
AD患者中淀粉样蛋白生成路径的功能不全与神经元中的低SorLA浓度有关。我们发现，携载APOE4变体的AD患者的神经元中的这种低浓度为APOE4基序的转录增强子活性的直接结果。在AD患者中，APOE4基序介导的造成AD的基因FBXO46的表达降低了SorLA蛋白质的水平。
本发明基于用于发展如上文所论述的阿茲海默氏病的潜在基因机制的详细知识的发现。特定来说，本发明人的这个发现提供用于更精确诊断和/或治疗阿茲海默氏病的方法。这种发现还提供用于预防个体(尤其遗传上易患AD的那些个体)的阿茲海默氏病(AD)的发展的方法。
基于基因结构的分析，本发明人发现，APOE4变体产生用于神经元特异性转录因子NRF1的新生识别基序。APOE4变体附近的NRF1靶基因的分析将FBXO46鉴别为造成AD的基因。至少部分地基于这个发现，本发明的一个方面提供一种抑制由APOE4基序产生的这种NRF1识别位点的功能以尤其稳定或改善患有AD的个体的认知能力的方法。
在一些实施例中，APOE4基序调节的基因表达的抑制可通过使表达由APOE4基序介导的基因的细胞与能够抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子(有时称为“诱饵”)接触来实现。在一些实施例中，细胞为神经元细胞、神经元母细胞或分化神经元。
在本发明的又另一实施例中，基因表达由APOE4基序介导的基因位于rs429358的2Mb内的人类染色体19上。通过APOE4基序表达的示例性基因包含(但不限于)：PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCC1、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OPA3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4和FKRP，和其组合。在仍其它实施例中，基因表达由APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP、RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5、GPR4。在另一实施例中，基因表达由APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR、KLC3。
本发明的一个特定实施例提供一种用于抑制转录因子与APOE4基序的结合方法。在另一实施例中，本发明提供一种用于抑制由转录因子与APOE4基序的结合介导的基因表达的方法。应了解，当提及基因表达时，术语“抑制”意味着与不存在分子的相同细胞株相比较，在本发明的分子存在下转录和/或转译的基因的量减少至少约10％，通常至少约20％或基本上完全停滞(亦即，>90％减少)。所属领域的技术人员可容易地测量使用已知的方法中的任一种所抑制的量。
本发明的一个特定实施例提供一种能够通过抑制转录因子NRF1抑制APOE4基序介导的基因表达的分子。如本文中所使用，术语“抑制转录因子NRF1”包含抑制NRF1与APOE4基序的结合，抑制NRF1的产生，例如通过抑制NRF1基因的转录和/或通过抑制编码NRF1的mRNA的转译等。
用于通过抑制转录因子NRF1抑制APOE4基序介导的基因表达的分子包含(但不限于)药物、寡核苷酸、肽或其衍生物，或其组合。在一些实施例中，有时称为“诱饵寡核苷酸”，寡核苷酸为SEQ ID NO:1的子序列或区段。特定来说，寡核苷酸长度为11到30核苷酸，包括SEQ ID NO:1内的连续核苷酸子序列。在一个例子中，诱饵寡核苷酸单链寡核苷酸。在又另一个例子中，诱饵寡核苷酸为双链寡核苷酸。
术语“寡核苷酸”是指成单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另外限制，否则涵盖以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。此类类似物的实例包含(但不限于)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。“子序列”或“区段”是指包含核苷酸的长序列的一部分的一连串核苷酸。
在本发明的另一实施例中，分子为可结合于结合于NRF1的APOE4基序的寡核苷酸。在一些例子中，寡核苷酸基本上与结合于NRF1的APOE4基序互补。术语“基本上与……互补”或“基本上序列”是指与在严格条件下提供的序列杂交的序列和/或与结合于NRF1的APOE4基序具有充足同源性以使得本发明的寡核苷酸与APOE4基序序列杂交的序列。与其所指的寡核苷酸序列“基本上”相同还指以区别突变的存在或不存在的充足特异性进行杂交或退火的功能能力。这可通过充分不同的熔化温度来测量，以准许简易的鉴别寡核苷酸是否结合于结合于NRF1的APOE4基序序列。除非本文另有规定，否则术语“APOE4基序”是指结合于NRF1的APOE基因的E4变体的一部分。
在又一些实施例中，寡核苷酸为硫代磷酸酯寡核苷酸、甲基膦酸酯寡核苷酸、亚磷酰胺寡核苷酸、肽核酸寡核苷酸、锁核酸修饰的寡核苷酸，和其组合。
在另一实施例中，寡核苷酸与细胞穿透肽融合。
在一些实施例中，分子为作为可结合于APOE4基序的NRF1蛋白质的片段的肽。在一优选实施例中，所述肽不具有NRF1的反式活化域且涵盖氨基酸残基78到304。在另一优选实施例中，所述肽包括NRF1序列或其片段的氨基酸残基110到304。
在另一实施例中，NRF1肽和其片段与细胞穿透肽融合以促进NRFT肽和其片段的胞内递送。在另一实施例中，细胞穿透肽具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPQ。在另一实施例中，NRF1肽或其片段由表达载体编码。
分子还可包含药学上可接受的载剂。术语“药学上可接受的载剂”和“药学上可接受的赋形剂”在本文中可互换使用且指适用于制备药物组合物的赋形剂，所述药物组合物通常为安全、无毒和皆不生物学上也不以其它方式非所要且包含对于人类药物用途是可接受的。
在仍其它实施例中，细胞包括神经元细胞。神经元细胞可为神经元祖细胞以及分化神经元。本发明的方法适用于神经元母细胞、分化神经元或其组合。
本发明的方法包含可通过结合于APOE4基序、转录因子或两者抑制APOE4介导的基因表达的分子。
本发明的另一方面提供一种用于鉴别可抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子的方法。这种方法可用于鉴别用于治疗AD的药物研发的主要候选物。所述方法通常涉及不含全细胞的活体外或生物化学分析。分析可含有细胞提取物或其它细胞组分。阅读本公开的所属领域的技术人员可容易地认识到，合适活体外分析条件是鉴别可抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子所必需的。通常，其将为测量NRF1与固定APOE4基序寡核苷酸的直接结合的活体外结合分析。示例性合适活体外分析包含(但不限于)表面等离子共振和电泳迁移率位移分析(EMSA)。简单点说，在EMSA中，放射性标记的APOE4基序寡核苷酸与重组NRF1和待作为可能的主要药物候选物测试的分子一起培育。随后通过凝胶电泳分析分子抑制重组NRF1与标记的APOE4基序的结合的能力。如果NRF1结合于标记的APOE4基序(即并不明显抑制结合的分子)，那么标记的APOE4基序的所观测迁移率朝向较高分子量转移。
高通量筛选分析：本发明的筛选分析被设计成鉴别APOE4基序介导的基因或基因表达产物(例如由基因序列产生的mRNA或蛋白质)的功能、活性或量的调节。如本文中所使用，术语“调节”意味着转录基因、mRNA或蛋白质(共同地其有时称为“标靶”)的功能或量的活性的任何变化，包含转录速率或表达水平的任何变化，且包含抑制或活化和对标靶的生物化学或生物活性的拮抗和促效作用。贯穿本公开，当提及任何生物活性，例如APOE4基序介导的基因表达或APOE4基序介导的基因表达产物的活性时，术语“变化”意味着统计学上与对照不同的值(即，p<0.25，通常p<0.1，且及更通常p<0.05)。术语基因表达或基因表达产物的活性的“对照”是指患者样品中分别基因表达或基因表达产物的活性或可与其进行比较的标准水平。在一些实施例中，对照可与不具有APOE4等位基因的细胞相关，意味着与非APOE4基序介导的基因表达或其表达产物相比较的水平。这允许基于表达或生物活性针对不具有APOE4等位基因的细胞或个体进行的测定。术语“对照”还可参照在来自个体或被认为携载APOE4等位基因的个体群体的样品中所确定的水平使用。在一些情况下，术语“阴性对照”(即针对不具有APOE4等位基因的个体或细胞)或“阳性对照”(即针对具有APOE4等位基因的个体或细胞)用于进一步区别“对照”的含义。以这种方式，可针对“阴性对照”或“阳性对照”比较APOE4基序修饰的基因表达的水平或APOE4基序修饰的基因表达产物的活性的水平。
本说明书公开从所属领域已知或相同类别蛋白质隐含的APOE4基序介导的基因的不同功能，其可用于评定调节。一些功能可被直接地评定，例如特定反应的催化，或不直接评定，例如通过测量下游产物的聚集。许多分析设计可供所属领域的技术人员使用。优选的分析针对速度、效率、信号检测和低反应剂消耗优化。(张(Zhang)等人(1999)《生物分子筛选杂志(J.Biomolec.Screen.)4(2):67》。分析可为测量基因转录、基因转译或基因表达产物的生物活性的报导子分析。分析可在神经细胞或来源于哺乳动物神经细胞或哺乳动物多能干细胞的细胞中进行。以下实例包含用于SorLa蛋白质的聚集的分析描述，其为可在神经细胞中测量以鉴别抑制APOE基序介导的基因产物中的一或多种的活性的化合物的一种这类下游产物的实例。基于本文中的发明，所属领域的技术人员现在可基于被设计成测量化合物是否调节本文公开的蛋白质功能和已知的或在现在理解其意义所发现的其它功能的分析可预测地进行用于潜在的AD治疗剂的筛选分析。
在一些实施例中，设计本发明的筛选分析(无论细胞、细胞提取物或基于生物化学)以用于通过化学库的高通量筛选测试多种化合物(例如，数百万)。
可筛检以鉴别调节剂的测试化合物的化学库可从众多可用资源或使用所属领域中已知的库合成方法中的众多方法中的任一种来获得，包括：生物库；空间上可寻址的平行固相或溶液相库；需要去卷积的合成库方法；“一个珠粒一种化合物”库方法；及使用亲和色谱法选择的合成库方法。生物库方法限于肽库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子库(兰姆(Lam)(1997)《抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)》12:145)。还参见多勒(Dolle)等人(2010)用于药物发现和化学生物学的化学库的综合调查(Comprehensive Survey of Chemical Libraries for Drug Discovery and ChemicalBiology):2009，《组合化学杂志(J.Comb.Chem.)》2010,12(6),第765-806页。
用于合成分子库的方法的实例可在例如以下的领域中发现：德威特(DeWitt)等人(1993)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》90:6909；尔博(Erb)等人(1994)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》91:11422；祖凯曼(Zuckermann)等人(1994).《药物化学杂志(J.Med.Chem.37:2678)》；曹(Cho)等人(1993)《科学(Science)》261:1303；卡雷尔(Carrell)等人(1994)《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》33:2059；卡雷尔(Carrell)等人(1994)《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》33:2061；及盖洛普(Gallop)等人(1994)《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》37:1233。
成功地调节(尤其抑制)APOE4基序介导的基因或表达产物的活性的测试化合物为针对在治疗AD或轻度认知病症中的潜在用途在替代分析中用于进一步研究和二次筛选的引人注目的候选物。当首先在筛选分析中鉴别时，将化合物视为“潜在地适用于治疗”，因为众所周知，初始成功的命中者含有成功药物的所有所需特征。然而，其极适用于允许研究人员鉴别在有效地调节或抑制标靶活性的化合物当中共享的化学核心结构。通常，当鉴别出核心结构时，进一步研发可能数千相关化合物的大量库，其目的在于鉴别符合成功药物候选物的所有标准的主要化合物。通过许多轮至多数百万化合物的筛选重复地使用分析以最终鉴别小群体的主要化合物，其中的一种可最终变为审批通过的治疗剂。
在本发明的一些实施例中，用于治疗通过本发明的方法鉴别出的AD的可能的主要分子具有约500μM或更少，通常约100μM或更少，通常约50μM或更少，更多通常约10μM或更少，且最通常约500nM或更少的50％抑制浓度(IC50)。
本发明的又一方面提供一种用于抑制细胞中的APOE4基序介导的基因表达的方法。贯穿本公开，应了解，术语“APOE4基序介导的基因表达”是指基因的表达由APOE4基序与转录因子的结合造成、归因于APOE4基序与转录因子的结合或由APOE4基序与转录因子的结合介导。基因的表达是指所述基因的诱导或抑止。这种方法包含使表达或能够表达由APOE4基序介导的基因的细胞与能够抑制所述基因的表达的分子接触。在一个实施例中，通过APOE4基序表达的基因位于rs429358的2Mb内的人类染色体19上。通过APOE4基序表达的示例性基因包含(但不限于)：PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCC1、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OPA3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4和FKRP。特定来说，本发明的方法包含抑制通过转录因子与APOE4基序的结合表达的以下基因的表达：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP、RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4，或其组合。在另一实施例中，APOE4基序介导的基因包括：FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR、KLC3，或其组合。在一个具体实施例中，基因表达通过本发明的方法抑制的基因为MIR4531、MIR8085、MIR6088、MIR330、MIR642A、MIR642B、MIR769、MIR320E，其中用于抑制的分子为锁核酸修饰的寡核苷酸。
本发明的临床用途包含一种用于治疗患有AD或轻度认知障碍的个体的方法。本发明的方法包含测定存在于所述个体中的APOE基因分型；及(a)如果所述个体携载APOE4等位基因，那么向个体投予能够抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子；或(b)如果个体不携载APOE4等位基因，那么向个体投予与抑制转录因子与APOE4基序的结合的分子不同的分子。在一些实施例中，确定个体中APOE基因分型的步骤包括测定个体对于APOE4是纯合抑或杂合的步骤。
本发明的分子可例如与惰性稀释剂或可吸收食用载剂一起口服投予，或其可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或其可压缩为片剂，或其可直接地并有饮食食物。对于经口治疗性投药，可将本发明的分子与赋形剂合并且以可吞食片剂、口含片剂、糖衣片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、粉片等形式使用。这类组合物和制剂可含有至少0.1％的本发明分子。当然，组合物和制剂的百分比可不同且可适宜地介于单元重量的约1与约10％之间。在这类治疗上有用的组合物中本发明分子的量是使得可以获得合适的剂量的量。制备根据本发明的优选的组合物或制剂以使得口服单位剂型含有约1到约1000mg的本发明分子。
片剂、糖衣片、丸剂、胶囊等还可含有以下：结合剂，例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或可添加的糖精；或调味剂，例如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除上述类型材料以外，其可含有液体载剂。各种其它材料可以涂层形式存在或以其它方式调节剂量单元的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的分子，蔗糖作为甜味剂，甲基和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂例如樱桃或橙子调味剂。理所当然地是，制备任何单位剂型中所使用的任何材料应为药学上纯的且在所用量方面大体上无毒。另外，本发明的分子可并入到持续释放制剂和调配物中。
还可不经肠投予本发明的分子。作为游离碱或者药学上可接受的盐的本发明分子的溶液可在合适地与例如羟丙基纤维素的表面活性剂混合的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在一般的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适用于可注射用途的医药形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，以便存在易于注射的程度。其必须在制造和存储的条件下稳定且必须被保存以免微生物(例如细菌和真菌)的污染活动。所述载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物)、其合适混合物和植物油的分散介质的溶剂。可以例如通过使用涂层(如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。延迟吸收的可注射试剂组合物的长期吸收，例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌可注射溶液是按如下方式制备：将所需量的本发明的分子视需要与上文列举的多种其它成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分。
医生将测定将最适用于防治或治疗的本发明的分子的剂量且其将随投药形式和所选特定分子变化，且也将随处于治疗下的特定患者变化。医生将通常希望开始通过小增量用小剂量进行治疗，直到在所述情形下达到最佳效果。治疗性剂量可通常介于约0.1到约1000mg/天，且优选地介于约10到约100mg/天，或介于约0.1到约50mg/Kg体重/每天并且优选地介于约0.1到约20mg/Kg体重/天可以若干不同剂量单位投予。对于经口投药，可能需要数量级为约2×到约4×的较高剂量。
本发明的目标、优点和新颖特征将在检查其以下实例时对所属领域的技术人员变得显而易见，其并不意欲为限制性的。在实例中，建设性地简化为实践的程序以现在时态描述，且已在实验室中实行的程序以过去时态阐述。
实例
分析重叠APOE等位基因的DNA序列：测定APOE等位基因的两个SNP(rs429358和rs7412)在外显子4上相隔138bp定位(图5a)。我们对齐重叠这些SNP的DNA序列且观测到其为极相似的(图5b)。
此外，发现位于APOE外显子4上的稀少APOE变体Val236Glu(rs199768005，Val254Glu在全长序列中，图5c)明显与AD风险的显著减少相关联(p＝7.5×10-5；OR＝0.10[0.03至0.45])lxxix。分析重叠这种多态性的序列且发现其与具有APOE4rs429358SNP的DNA序列极相似(图5d)。
由于rs429358为测定APOEε4等位基因的基因变体，将位于rs429358周围的序列“TGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGG”(SEQ ID NO:1)定义为“APOE4基序”(图5e)。
APOE4基序在人类基因组中的出现：进行基本局部比对检索工具(Basic LocalAlignment Search Tool，BLAST)分析以寻找类似于APOE4基序的基因组区域且发现这种基序出现在其它基因组位置中，例如出现在IRF5基因中(图6a)。
美籍西班牙人群展示高风险的AD和2型糖尿病。32bp插入(rs3842570)钙蛋白酶10(CAPN10)基因的内含子6内的已与墨西哥-美国群体的高风险2型糖尿病有关。两个等位基因与这种多态性CSNP-19相关联：等位基因1具有2个重复，且等位基因3具有3个重复的32-bp序列。发现这种插入(CAPNIOIns)的反向互补序列与APOE4基序极相似(图6a)。
APOE外显子4DNA序列的分析：Rs429358和rs7412均定位于APOE基因的外显子4内部且为从内含子3的末端延伸并覆盖外显子4的总体的880bp CpG岛(CGI)的部分。这种APOECGI通常在大脑中携载高水平的甲基化。随着重叠这些SNP的DNA区域展示高水平的一致性，检查外显子4DNA序列以寻找其它结构要素且发现穿插在整个外显子中的众多重复，其中一些与APOE4基序极相似(图6b)。增强子序列含有充当转录因子和其它调节蛋白的结合位点的短DNA序列基序。APOE的外显子4出人意料地具有典型的句意转录增强子元件的模块化短序列基序的布置。APOE4转录增强子元件可因此延伸超出中心APOE4基序，从而涵盖APOE4外显子4上的相邻序列。
鉴别别APOE4基序中的NRF1转录因子结合位点：强化子通过细胞型特异性转录因子的结合发挥其调节功能。因此，使用来自真核生物的实验定义的转录因子结合位点的JASPAR CORE数据库的结合概况针对假定转录因子结合位点检索APOE4基序周围的DNA序列(jaspar.genereg.net)。计算所探测序列的得分，其提供与转录因子共有序列类似的测量值。APOE4基序的这种分析得到核呼吸因子1(NRF1)共有结合基序的统计学上显著的命中值(图7a)。表4展示相较于针对相同位置的APOE3所获得的得分和相对得分，针对APOE4rs429358/C变体所获得的最高值。由APOE4变体产生的新颖NRF1结合位点位于反向链上(图7b)，其中得分为11.859，而APOE3产生3.879的得分。作为比较，预期NRF1共有序列在JASPAR中的最高得分为18.058。如果序列对于功能性或随机位点具有相等的概率，那么得分为0。此外，APOE4变体NRF1共有序列的核苷酸频率矩阵中出现0次非共有T核苷酸(A在反向链上)变为频率矩阵中出现4275次的高度保守、共有匹配的C核苷酸(G在反向链上)(图7c)。出人意料地和出乎意料地，发现T核苷酸(APOE3)变为C核苷酸(APOE4)产生新生NRF1结合位点。
这种结合位点为合法增强子，因为这些序列可以正向或反向定向定位于调节的基因的内部、下游或上游，且大部分转录因子结合位点可出现在启动子或增强子的两个定向上。
将NRF1标靶与APOE4基序附近的基因匹配：NRF1转录因子响应于细胞损伤/创伤性脑损伤、代谢和异生物质应激表达。认识到，这些为与增加的AD风险相关联的所有因素。根据EnsEmbl的GRCh38.p5智人基因组组装建立位于rs429358周围的2Mb窗中的染色体19上的所有基因的列表(表3)。随后将这个列表与NRF1靶基因的列表相比较，所述NRF1靶基因的列表如从在ENCODE项目的SK-N-SH人类神经母细胞瘤细胞中执行的ChIP-Seq实验中撷取的公开的ChIP-Seq-Based数据来确定(encodeproject.org，DDBJ序列读数档案，寄存编号SRP007993)，且涉及用单克隆抗NRF1抗体进行染色质免疫沉淀，随后在基因组分析上以36bp读取长度进行深度测序lvi。通过这种分析，在受NRF1控制且位于APOE附近中的基因当中鉴别出F-盒蛋白FBXO46。FBXO46定位于19q13.32上，距APOE下游0.8Mb。位于APOE4基序附近且受NRF1控制的其它基因包括：SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4和FKRP。
在RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4的5'DNA区域中也检测到 NRF1结合位点：有可能在距转录开始位点下游的100bp与约200bp上游之间的观测到功能性转录因子结合位点，但有时可能在更远处发现。我们使基因RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB(ΔFOSB，FOSB的剪接变体)、涵盖-1000bp+400bp的SIX5和GPR4相对于转录开始位点经受NRF1结合基序的JASPAR 2016数据库(http://jaspar2016.genereg.net/)检索。使用90％的严格的相对概况得分阈值(所有座标来自基因组组装GRCh38.p10)分别地扫描基因组区域chrl9:45496661-45498061(RTN2)、chrl9:43595735-43597135(IRGQ)和chr 19:43596017-43597017(SRRM5)、chrl9:45862989:45874397(FOXA3)、chrl9:45466995-45468395(FOSB/ΔFOSB)、chrl9:45768826-45770226(SIX5)和chrl9:45589164:45601808(GPR4)。在RTN2的5'区域中鉴别出得分为11.490的一个NRF1结合位点，在IRGQ的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于14.489到18.058的五个NRF1结合位点，在SRRM5的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于14.489到18.058的五个NRF1结合位点，在FOXA3的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于10.857到17.077的三个NRF1结合位点，在FOSB/ΔFOSB的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于10.228到18.058的八个NRF1结合位点，在SIX5的5'DNA区域中鉴别出得分范围介于14.200到18.058的三个NRF1结合位点，且在GPR4的5'区域中鉴别出得分为9.693的一个NRF1结合位点(表5)。预期NRF1共有序列在JASPAR中的最高得分为18.058。我们推断，基因RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4受转录因子NRF1控制。
表5：RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5和GPR4的5'DNA区的JASPAR分析。
如可清楚地看见，APOE4变体产生NRF1的新生结合位点。响应于包括(但不限于)疱疹再活化、头损伤或代谢应激的环境信号，相信NRF1在AD神经元中活化。通过结合于APOE4和具有NRF1结合位点的基因中的一个的近侧启动子区，这种转录因子引起造成AD的基因的不适当(增加或减少)表达。因此，本发明的一些方面提供一种通过抑制造成AD的基因的表达来治疗AD的方法。
干扰淀粉样蛋白生成路径的FBXO46：SorLA水平在AD患者和患有轻度认知障碍的人体中降低。展示FBXO46与泛素化/类泛素化修饰途径的关键成员(SKP1、NEDD8和COPS5)相互作用lxxx、lxxxi，从而指示其在蛋白质泛素化和蛋白酶体降解中的作用(图8a)。APOE4基序介导的FBXO46表达降低了SorLA水平。此外，APOE4基序介导的FBXO46表达引起降解和随后发生的低SorLA表达(图8b)。此外，FBXO46直接地结合且泛素化SorLA造成其从薄膜提取且由蛋白酶体或溶酶体过早降解。另外，FBXO46降解或结合SorLA的转录因子且产生减少的SorLA转录。相信FBXO46通过结合于SorLA结合蛋白造成SorLA的过早降解。
在AD患者中，APOE4基序介导的FBXO46表达由此降低SorLA蛋白质的水平(图8c)。不受任何理论限制，相信APP-BACE1处理过早地发生，不利于LRP1处理，γ-分泌酶不能够处理未裂解LRP1。LRP1细胞质域保持与Fe65/APP复合物相关联，且不可在APP磷酸化之后释放Fe65。逆运复合体和GGA蛋白质由于位阻不可结合。因此，pAPP不输送到TGN。细胞内吞囊泡导引到早期/晚期核内体，且与其它细胞组分互混。不可溶的Aβ42产生且囊泡的内容物作为斑块排出。
干扰淀粉样蛋白生成路径的RTN2：RTN2的细胞发生位置处于19q13.32，在来自APOE的反向链上为约0.58Mb qter，且因此在APOE4基序范围内。APOE4基序增强RTN2的表达(图9)。RTN2结合于在内质网隔室中保留更多BACE1且防止其积聚在质膜处的脂质筏中的BACE1。当内吞APP复合物随后与BACE-1-阳性再循环核内体合并时，APP-BACE1处理过早地发生。γ-分泌酶不能够处理未裂解LRP1且LRP1细胞质域保持与Fe65/APP复合物相关联，且不可在APP磷酸化之后释放Fe65。逆运复合体和GGA蛋白质由于位阻不可结合。因此，磷酸化APP不输送到TGN。将细胞内吞囊泡导引到早期/晚期核内体，且与其它细胞组分互混。不可溶的Aβ42产生且囊泡的内含物作为斑块排出。
干扰淀粉样蛋白生成路径的KLC3：KLC3(驱动蛋白轻链3)基因位于染色体19q13.32(APOE的下游)上。KLC3通常在包括睾丸和大脑的若干组织中表达。在特定环境或细胞触发下，KLC3经由APOE4基序的转录增强子活性在AD神经元中表达。APP-Fe65-LRP1囊泡的转运取决于马达蛋白动力蛋白，APP到TGN的逆运复合体转运也是如此。驱动蛋白-1还需要在APP囊泡上正确缔合动力蛋白。KLC3在AD神经元中的不当表达通过向顺行转运转移其余部分干扰APP囊泡的顺行转运与逆行转运之间的恰当配合。在AD患者中，APOE基序介导的所表达KLC3结合于驱动蛋白-1的重链，和/或结合于防止内吞复合物恰当地转移到质膜和其它细胞隔室且从质膜和其它细胞隔室转移出的APP。未以及方式募集时涉及淀粉样蛋白生成路径的关键角色。过早地发生APP-BACE1处理。此外，不发生到核周空间的转运和App运输回TGN的转运。细胞内吞囊泡保留在树突内部且成熟为晚期核内体。不可溶的Aβ42产生且囊泡的内容物作为斑块排出。
测定由造成AD的基因编码的蛋白质细胞的表达水平：人类诱导的多能干细胞(iPSC)来源于患有AD的个体，且培育rs429358位点处的已知基因分型并分化到神经元中。存在可供所属领域的技术人员使用以执行iPSC的培育且实现分化到神经元(例如，皮层神经元)中的众多方案。细胞通常接收在冷冻管中，细胞随后解冻且以大约50,000个细胞/cm2的密度接种在合适培养容器中。细胞随后在神经元分化介质的存在下生长三天且在神经元维持介质的存在下培育另外若干周。在分化之后针对神经元和突触标记物表达将细胞通常评定35天。神经元标记物通常为Tuj1和MAP2，而突触标记物为PSD-95(突触后终端)和突触素(突触前终端)。可因此分析含有一个、若干个或所有这些神经元和突触标记物的细胞培养物且使其进一步经受应激。尽管存在可供所属领域的技术人员使用的诱导细胞应激的许多程序，通过用浓度为例如0.1到2.0M的含有山梨糖醇的介质替换分化神经元的培养基持续15到180分钟来诱导渗透应激。NRF1表达和与APOE4基序的结合还可通过使神经元细胞培养物感染单纯疱疹病毒来实现。对分化神经元加压的另一程序是用缺乏葡萄糖的介质替换分化神经元的培养基持续15到180分钟。在这些描述的应激条件下培育分化神经元之后，去除介质。将培养物中的一些保存在原始培养基(阴性对照)中且不暴露于应激条件。所有神经元培养物随后用合适缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)冲洗且裂解。随后针对由造成AD的基因编码的表达蛋白质的存在使用可供所属领域的技术人员使用的众多方法中的一个来分析裂解物。制备细胞溶解物且将其与合适装载缓冲液混合。通过分解物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与特定检测方法(蛋白质印迹)的组合使用针对待分析的蛋白质的抗体来测定特定蛋白质在裂解物中的水平。将E4基因分型为rs429358的神经元中的FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAEIR、KLC3或表3中列出的基因中的任一种的水平与E3基因分型为rs429358的神经元中的水平(阴性对照)进行比较。此外，可将暴露于应激的神经元中的FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR、KLC3或表3中列出的基因中的任一种的水平与不暴露于应激的神经元中的水平(阴性对照)进行比较。造成AD的基因的表达水平还通过定量信使RNA(mRNA)水平来确定且在携载E4基因分型相较于E3基因分型的细胞中进行比较。此外，可通过与不暴露于应激的神经元中的mRNA水平相比较来测量应激条件的效果。
为评定化合物对抑制分化神经元的应激诱导的表达的活性，采用相同细胞培养物和应激条件。然而，在此情况下，在应激诱导之前将细胞培养物与药物组合物一起培育1到48小时。药物组合物可含有化合物、寡核苷酸或其衍生物、siRNA或其衍生物、蛋白质或肽。
所属领域的技术人员容易显而易见，这种所描述方法不限于神经元培养物，但可应用于神经元细胞线路、神经元祖细胞、从具有AD的患者收集的细胞或来源于从人类个体收集的细胞的细胞。容易地显而易见，这种分析可使用从人类个体收集的血液、血浆、血清或分离的血细胞执行且可用于诊断AD。
测定造成AD的基因在细胞分析中的活性：
将来源于人类iPSC的分化神经元、神经元祖细胞、神经元细胞线路的细胞(例如PC12或SH-SY5Y)维持于培养物中。利用病毒递送系统，使用腺相关或塞姆利基森林类病毒(semliki-forest like virus)、pBROAD、慢病毒、HSV载体或携载编码FBXO46、RTN2、KLC3或表3基因中列出的基因中的任一种的DNA序列的其它转染媒剂来转染细胞。
在瞬时表达造成AD的基因或建立造成AD的基因的稳定表达之后，通过分解物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与特定检测方法的组合使用针对SorLA的抗体使用蛋白质印迹在培养细胞的裂解物中确定SorLA的水平。
通过表达造成AD的基因的培养细胞中的SorLA水平来测量医药组合物对抑制造成AD的基因活性的活性。将细胞培养物与药物组合物一起培育1到48小时。医药组合物可含有化合物、寡核苷酸或其衍生物、蛋白质或肽。比较存在或不存在医药组合物时SorLA的水平。
所属领域的技术人员容易显而易见，这种所描述方法不限于神经元培养物，但可应用于神经元细胞线路、神经元祖细胞、从具有AD的患者收集的细胞或来源于从人类个体收集的细胞的细胞。容易地显而易见，这种分析可使用从人类个体收集的血液、血浆、血清或分离的血细胞执行且可用于诊断AD。
用于测量在测试分子存在下转录因子与APOE4基序的结合的抑制的方法可包括生物化学分析。生物化学分析基本上不含全细胞但可含有细胞提取物或其它细胞组分，包括重组或化学上合成的转录因子、重组或化学上合成的寡核苷酸，和测量转录因子与寡核苷酸的结合的检测方法。存在可供所属领域的技术人员使用以测量转录因子与寡核苷酸的结合的众多方法。
转录因子可固定于固体载体上且使寡核苷酸与反应腔室中的转录因子接触。使用所属领域的技术人员已知的技术在合适仪器中定量寡核苷酸的结合。在一优选实施例中，通过表面等离子共振技术定量结合。替代地，将寡核苷酸固定到固体载体且使转录因子在合适反应腔室中接近。转录因子可为以重组方式表达的NRF1或其片段。寡核苷酸包括APOE4基序。在一个实施例中，寡核苷酸为APOE基因或其片段的外显子4。在一优选实施例中，寡核苷酸长度为11到30个核苷酸，包括SEQ ID NO:1内的11到30个连续核苷酸。
生物化学分析包括电泳迁移率位移分析(EMSA)。含有寡核苷酸的APOE4基序(标记有放射性标记、荧光标记或生物素标记)与转录因子一起培育以允许复合物形成。在一个实施例中，转录因子为以重组方式表达的NRF1或其片段。在另一实施例中，转录因子为化学上合成的NRF1或其片段。在另一实施例中，NRF1含于细胞的核提取物中。在一个实施例中，寡核苷酸长度为11到30个核苷酸，包括SEQ ID NO:1内的11到24个连续核苷酸。随后通过凝胶电泳分析反应混合物。如果NRF1或其片段结合于APOE4基序寡核苷酸，那么其将观测到标记寡核苷酸的迁移率向显而易见更高分子量转移。
在抑制NRF1转录因子的活性的诱饵寡核苷酸的替代例中，本发明还包含靶向APOE4基序介导的基因的任何转录物的寡核苷酸。这类寡核苷酸可包括结合于APOE4基序介导的基因的转录产物的长度为11到30核苷酸的寡核苷酸。其可为单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。对于用作治疗剂，这类寡核苷酸可进一步包括药学上可接受的载剂。任选地，其可经化学修饰或调配以使得能够穿过血脑屏障转运到大脑中。优选的修饰包含硫代磷酸酯寡核苷酸、甲基膦酸酯寡核苷酸、亚磷酰胺寡核苷酸、肽核酸寡核苷酸、锁核酸修饰的寡核苷酸，和其组合。本发明包含用于抑制APOE4基序介导的基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括使细胞与本文公开的寡核苷酸接触。
在另一实施例中，寡核苷酸为短干扰RNA(siRNA)。存在用于制备siRNA的若干方法，例如化学合成、活体外转录、siRNA表达载体和PCR表达盒。无关于所使用的方法，设计siRNA的第一步骤需要选择siRNA标靶位点。用于选择siRNA标靶位点的标准指南可在当前文献中获得。使用标准指南，大约所有siRNA的一半产生标靶mRNA水平的>50％减少，因此提供潜在地适用于治疗AD的化合物，且对进一步研究和二次筛选具有较大兴趣。
抗体和其抗原结合片段：如本文中所使用，术语“抗体”可包含全抗体且在一个实施例中指包括通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个域(CH1、CH2和CH3)构成。在某些天然存在的抗体中，每个轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域CL构成。VH区和VL区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)，穿插有称为构架区(framework regions，FR)的更保守区。每个VH和VL由自氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR及四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)。
抗体通常以高亲和力特异性地结合于其同源抗原，通过10-7到10-11M或更少的解离常数(KD)反映。通常将大于约10-6M的任何KD视为指示非特异性结合。如本文中所使用，“特异性结合”于抗原的抗体是指以高亲和力结合于抗原和基本上相同抗原(其意味着具有10- 7M或更少，优选地10-8M或更少，甚至更优选地5×10-9M或更少，并且最优选地在10-8M与10- 10M之间或更少的KD)，但不以高亲和力结合于不相关抗原的抗体。
借助于实例，抗体还可包含天然存在和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人类化抗体；全人类抗体和所属领域中已知的许多变体。
短语“选择性结合于”是指抗体、抗原结合片段或结合搭配物(抗原结合肽)优选地结合于APOE4基序介导的基因表达产物的能力。通常，短语“选择性结合”是指抗体、其片段或结合搭配物特异性结合于抗原。如通过任何标准分析(例如，免疫分析)所测量，结合水平统计学上明显高于分析的背景对照。举例来说，当执行免疫分析时，对照通常包含仅含有抗体或抗原结合片段(亦即，不存在抗原)的反应孔/套管，其中将在不存在抗原的情况下通过抗体或其抗原结合片段进行反应(例如，非特异性结合于孔)的量视为背景。可使用在所属领域中标准的各种方法来测量结合，所述方法包含酶免疫分析(例如，ELISA)、免疫印迹分析等。
本发明的分离的抗体可包含含有这类抗体或已纯化到变化程度的抗体的血清。本发明的全抗体可为多克隆或单克隆的。替代地，还可在本发明中采用全抗体的功能等效物，例如其中一或多个抗体域被截短或不存在的抗原结合片段(例如，Fv、Fab、Fab'或F(ab)2片段)，以及遗传工程改造的抗体或其抗原结合片段，包括单链抗体或可结合于多于一个表位的抗体(例如，双特异性抗体)或可结合于一或多个不同抗原的抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)。
一般来说，在产生抗体时，将合适实验动物(例如(但不限于)兔、绵羊、仓鼠、天竺鼠、小鼠、大鼠或鸡)暴露于针对所需要的抗体的抗原。通常，用有效量的注入动物的抗原使动物免疫。有效量的抗原是指通过动物诱导抗体产生所需的量。随后使动物的免疫系统在预定时间段内作出反应。可重复免疫过程直到发现免疫系统针对抗原产生抗体。为获得对抗原具有特异性的多克隆抗体，从含有所需抗体的动物中收集血清(或在鸡的情况下，可从蛋卵中收集抗体)。这类血清适用作反应剂。多克隆抗体可通过例如用硫酸铵处理血清而进一步从血清(或蛋卵)纯化。
单克隆抗体可根据科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)的方法(《自然(Nature)》，1975，256，495-497)产生。举例来说，B淋巴细胞从免疫动物的脾(或任何合适组织)中回收且随后与骨髓瘤细胞融合以获得能够在适合培养基中不断生长的杂交瘤细胞群。通过测试通过杂交瘤产生的抗体结合于所需抗原的能力来选择产生所需抗体的杂交瘤。
如本文中所使用，术语抗体的“抗原结合片段”是指保留选择性地结合于抗原(例如，APOE4基序介导的基因的表达产物)的能力的抗体的一或多个片段。已展示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来进行。术语抗体(例如针对APOE4基序介导的基因的表达产物的抗体)的“抗原结合片段”内所涵盖的结合片段的实例包含(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包括在铰链区处通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，(1989)《自然》，341:544-546)，其由VH域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)；或(vii)可任选地通过合成连接子接合的两种或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个域(VL和VH)通过单独的基因编码，但这两个域可以使用重组方法通过合成连接子接合，所述连接子能够使其制造成VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链条(称为单链Fv(scFv)；参见例如伯德(Bird)等人(1988)，《科学(Science)》，242:423-426；和休斯顿(Huston)等人(1988)，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，85:5879-5883)。这类单链抗体也意欲涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些和其它潜在构建物描述在陈(Chan)和卡特(Carter)(2010)《自然综述免疫学(Nat.Rev.Immunol.)》10:301处。所属领域的技术人员还熟悉抗原结合片段，例如微型抗体、半胱氨酸-双功能抗体和纤维结合蛋白结合域，其也包含在在本文之发明中。这些抗原结合片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式针对效用对片段进行筛选。抗原结合片段可以通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两对不同重链/轻链和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过包括融合杂交瘤之各种方法或通过连接抗原结合片段来产生。参见例如宋斯维那(Songsivilai)和拉赫曼(Lachmann)，《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》，79:315-321(1990)；科斯特尔尼(Kostelny)等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》,148，1547-1553(1992)。当结合位点中的一个或两个对APOE4基序介导的基因的表达产物具有特异性时，本发明包含用于治疗AD的双特异性抗体。基于本文公开的发明，治疗抗体和其抗原结合片段的引人注目的方法包含修饰，以增强血液穿过血脑屏障(BBB)到大脑的转运。
抗体已证实其自身穿过血脑屏障(“BBB”)的能力，通常在BBB缺陷的情况下(普林斯(Prins)和斯凯尔特(Scheltens)(2013)《阿尔茨海默研究和治疗(Alzheimer'sResearch&Therapy)》5:56；杜迪(Doody)等人，《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》370:4。能够如此进行的抗体片段已通过表型平移未经治疗大羊驼单域抗体噬菌体展示库分离。单结构域抗体(也被称作纳米抗体)来源于骆驼科，其形成由不含轻链的重链同源二聚体组成的免疫球蛋白的独特子集。其可变区(VHH)为在抗体世界中天然发现的最小抗原结合单一多肽链。相较于对照VHH，所选择抗体FC5和FC44在大鼠活体外模型中明显地(p＜0.01)显示穿过BBB的增强的转运(50-100倍)。
增强BBB转运的替代例采用将抗体/片段从血液转运到大脑的连接子分子。举例来说，特定大脑递送可通过工程改造其中治疗性“臂”与BBB-胞转臂组合的双特异性抗体来实现。这类工作基于公认的BBB特定受体和转运体。循环中的许多内源性分子能够通过在脑内皮细胞的内腔侧上表达的特定受体和转运体穿过BBB，这一过程称为受体介导的胞转。展示针对这些受体产生的抗体活体内积聚在大脑中，所述受体例如转铁蛋白受体(TFRC)、胰岛素受体(INSR)、低密度脂蛋白受体相关蛋白质1(LRP1)、Basigin(Ok血型，BSG)、葡萄糖转运体1型(SLC2A1)和溶质载剂CD98hc(SLC3A2)。这些抗体可用作递送治疗抗体穿过BBB的平台(其中二分之一靶向转运系统且其它二分之一为治疗抗体的双特异性抗体)。展示针对转铁蛋白受体和BACE1的双特异性抗体横穿血脑屏障且有效地降低大脑淀粉样β水平。
展示单域抗体FC5通过结合假定的α(2,3)-唾液酸糖蛋白受体参与活性RMT过程。在双特异性抗体或抗体-药物共轭物中使用FC5作为BBB托架臂提供针对CNS病症研发药理学活性生物治疗药物的方法。
另一BBB转运部分为在鲨鱼中鉴别出的仅重链抗体。抗原结合由较小和高度稳定的域(称为VNAR)介导。抗原特异性VNAR分子已经由免疫针对众多不同标靶产生，例如靶向BBB传递蛋白受体的VNAR，如通过奥萨尼克斯公司(Ossianix Inc)(宾夕法尼亚州费城)所显示。这种VNAR可并入到双特异性抗体中，其中其它结合部分靶向APOE4基序介导的基因的表达产物。
使用APOE4基序介导的基因进行AD的诊断和预后：本发明的另一方面提供用于在生物样品(例如，血液、尿液、活检体、淋巴、唾液、大脑脊髓液)的情形下测量APOE4基序介导的基因或其蛋白质活性的水平以由此有助于诊断AD或轻度认知病症的的诊断分析。
针对造成AD的基因的表达水平或针对列于表3中的基因中的任一个的表达水平来收集和分析来自个体的组织、细胞或体液。存在所属领域的技术人员已知的众多方法来测量组织、细胞或体液中的蛋白质或mRNA表达水平。在一优选实施例中，用于表达分析的从个体收集的组织包含全血。在另一优选实施例中，用于表达分析的从个体收集的体液包含血浆、血清、痰液、唾液或脑脊髓液。在另一较优选施例中，从个体收集的细胞包含血细胞、颊内细胞或皮肤成纤维细胞。
用于检测APOE4基序介导的蛋白质或核酸在生物样品中的存在或缺失的示范性方法涉及从测试个体获得生物样品且使所述生物样品与能够检测蛋白质或核酸(例如，mRNA)的化合物或试剂接触，所述核酸编码蛋白质以使得在生物样品中检测蛋白质或核酸的存在。用于检测mRNA的优选试剂为能够与mRNA杂交的标记的核酸探针。举例来说，核酸探针可为核酸或用于APOE4基序介导的基因的对应核酸，例如能够在严格条件下专门与mRNA杂交的长度为至少15、30、50、100、250或500核苷酸的寡核苷酸。用于诊断本发明的分析的其它合适探针为所属领域的技术人员已知。
用于检测蛋白质表达的优选试剂为能够结合于从APOE4基序介导的基因表达的蛋白质的抗体，优选为具有可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的，或更优选地，单克隆的。可以使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab')2)。关于探针或抗体，术语“标记”意欲涵盖通过将可检测物质偶合(即，物理连接)到探针或抗体直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包含使用荧光标记的二级抗体检测初级抗体且用生物素末端标记DNA探针以使得其可用荧光标记的抗生蛋白链菌素来检测。
相对于基于抗体的检测技术，所属领域的技术人员可针对APOE4基序介导的基因蛋白质表达产物的合适免疫原使用仅常规实验产生抗体。用于在诊断分析中使用这类抗体的条件包含在视组织或细胞类型而变化的条件下将抗体与测试样品一起培育。培育条件可取决于分析中采用的型式、采用的检测方法和用于分析的抗体的类型和性质。所属领域的技术人员将认识到，通常可用的免疫分析型式(例如放射免疫分析、酶联免疫吸附分析、基于扩散的奥脱洛尼氏技术(Ouchterlony)或火箭免疫荧光分析)中的任一种可容易地适于采用本发明的抗体。这类分析的实例可在以下中发现：查德(Chard)，“放射免疫分析和相关技术的引入(An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques)”，荷兰阿姆斯特丹埃尔塞维尔科学出版商(Elsevier Science Publishers)(1986)；布洛克(Bullock)等人，“免疫细胞化学中的技术(Techniques in Immunocytochemistry)”，佛罗里达州奥兰多学术出版社(Academic Pres)，第1卷(1982)、第2卷(1983)、第3卷(1985)；蒂亚娜(Tijssen)，“酶免疫分析的实践和理论：生物化学和分子生物学中的实验室技术(Practice and Theory of enzyme Immunoassays:Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)”，荷兰阿姆斯特丹埃尔塞维尔科学出版商(1985)。
本发明的诊断方法可用于活体外以及活体内检测APOE4基序介导的基因在生物样品中的mRNA或蛋白质。举例来说，用于检测mRNA的活体外技术包含北方印迹(northernblot)交杂和原位杂交。用于检测蛋白质的活体外技术包含酶联免疫吸附分析(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀反应、免疫荧光法或定量测序反应。还可在被设计成评估一组靶基因的分析(例如，微阵列或多工测序反应)中测量蛋白质或mRNA水平。
本发明还提供用于检测APOE4基序介导的基因转录物或其蛋白质表达产物在生物样品中的存在的试剂盒。举例来说，试剂盒可包括能够检测生物样品中的这类蛋白质或mRNA的标记的化合物或试剂；用于测定这类蛋白质或mRNA在样品中的量的构件；和用于将样品中的量与已知标准进行比较的构件。化合物或试剂可封装于中合适容器中。试剂盒还可包括用于使用试剂盒的说明书。
所属领域的技术人员将能够执行用于本发明的方法的这些良好确立的方案。(参见例如奥苏贝尔(Ausubel)等人，“现代分子生物学实验技术(Current Protocols inMolecular Biology)，纽约州纽约市约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)”(1999))。
治疗剂的伴随诊断或选择：本发明的诊断方法在选择用于治疗或预防AD或轻度认知病症的合适治疗剂时提供优点。鉴于在治疗AD症状时采用的各种治疗剂及在将来几年预期的新治疗剂，现在有可能基于APOE4基序介导的基因的活性或表达将作为对这种治疗的反应者或无反应者的患者进行分层。所属领域的技术人员现在可执行使药物反应性与APOE4基序介导的基因和其蛋白质产物的一或多个诊断分析的结果相关的临床试验。
至少两个类别的这种测试紧接着显而易见。在一个中，用于选择向患有或处于患有阿茲海默氏病或轻度认知障碍的风险下的个体投予的治疗剂的方法包括测量APOE4基序介导的基因在来自个体的生物样品中的活性和基于个体是否显示所述基因在所述样品中的提升的活性来选择治疗剂。本实例有助于基于诊断产物选择用于患者的任何类型的治疗剂。
在另一方法中，可仅在个体显示这种基因表达产物在组织样品中的提升的水平时才推荐抑制APOE4基序介导的基因表达产物的活性的治疗剂。在这种情况下，用于APOE4基序介导的基因表达产物的诊断测试通常称为伴随诊断。在这类情况下，如果所述个体不显示基因或蛋白质活性的提升的水平，那么治疗不同于他/她进行的治疗。
作为人类神经细胞的诊断性和治疗性标靶的APOE4基序介导的基因的实验性验证
研究1：AD和对照神经组织中的FBXO46RNA表达水平：在本研究中，相较于非AD个体，在AD个体中鉴别出FBX046(APOE4基序介导的基因中的一个)的提升的RNA转录水平，由此验证FBX046作为用于诊断和治疗AD的标靶的潜能。
确定FBXO46在从有或无阿茲海默氏病的个体中分离的海马体组织中的相对RNA表达水平。使用GEO(高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus))的数据集浏览器(搜索阿茲海默氏病中的基因表达谱的公共功能性基因组学数据储存库)。GEO图谱资料库存储来源于通过研究团体提交的管理数据集的基因表达谱。本发明人鉴别出含有检索词(“阿茲海默”)的32个数据集记录，本发明人选择标题为：“死后阿尔茨海默氏病大脑：久山町研究(Postmortem Alzheimer's disease brains:Hisayama study)”lxxxii的研究作为最相关的研究，因为其为来自病理地诊断为患有阿尔茨海默氏病(AD)或AD样病症的男性和女性久山町居民的死后大脑组织(额皮质、颞叶皮层、海马体)的比较性微阵列分析(参考序列号GSE36980)。
分析来自7名阿茲海默氏病患者(4名女性和3名男性)和10名健康(非AD)个体(5名女性和5名男性)的解剖海马体的总RNA。将所有AD患者诊断为Braak期V-VI。使用Affymetrix基因芯片人类基因1.0ST阵列((GPL6244平台)，所有实验性步骤遵循制造商的指令且使用制造商的软件完成数据分析。所获得数据集(在GEO图谱中记录为GDS4758)基于33,297个转录物群的表达数据。使用浏览器DATA分析工具来分析这种数据集。在搜索窗中输入术语“FBXO46”且撷取表示FBXO46的对数2转化相对表达水平以17个组织样本中的每一个的数据。2的指数(亦即，2×)应用于这种数据以得到17个组织中的每一个的未转化表达水平信息(表6)。
使用双尾司徒登氏t测试分别地计算和比较来源于AD患者的7个组织和来自对照患者的10个组织的平均表达水平。FBXO46表达值对于AD患者为271.6±14.1(平均值±标准偏差)且对于对照个体为254.7±15.6(平均值±标准偏差)。这种差异在p值<0.05的情况下为统计学上显著的。这些结果指示FBXO46表达在阿茲海默氏病中增加。
表6：阿茲海默氏病和对照人类海马体组织中的FBXO46表达
*对照＝非-AD**标准偏差
研究2：AD和对照神经组织中的PPP5C RNA表达水平：在本研究中，相较于非AD个体，在AD个体中鉴别出PPP5C(APOE4基序介导的基因中的一个)的降低的RNA转录水平，由此验证PPP5C作为用于诊断和治疗AD的标靶的潜能。
在从有或无阿茲海默氏病的个体中分离的海马体组织中测定PPP5C(蛋白磷酸酶5催化亚基)的相对表达水平。选择来自GEO功能性基因组学数据储存库的标题为：“死后阿尔茨海默氏病大脑：久山町研究(Postmortem Alzheimer's disease brains:Hisayamastudy)”lxxxiii(参考序列号GSE36980)的研究作为最相关的研究，因为其为来自病理地诊断为患有阿尔茨海默氏病(AD)或AD样病症的男性和女性久山町居民的死后大脑组织(额皮质、颞叶皮层、海马体)的比较性微阵列分析。使用DATA分析工具浏览器检索“PPP5C”的附属数据集(GDS4758)且撷取表示PPP5C的对数2转化相对表达水平的17个组织样本中的每一个的数据。2的指数(亦即，2×)应用于这种数据以得到17个组织中的每一个的未转化表达水平信息(表7)。使用双尾司徒登氏t测试来分别地计算和比较来源于AD患者的7个组织和来自对照患者的10个组织的平均表达水平。PPP5C表达值对于AD患者为496.01±50.83(平均值±标准偏差)且对于对照个体为574.14±51.28(平均值±标准偏差)。这种差异在p值<0.05时为统计学上显著的。结果展示PPP5C表达在阿尔茨海默氏病中降低。
表7：阿茲海默氏病和对照人类海马体组织中的PPP5C表达
*标准偏差**非-AD
研究3：AD和对照组织中的福库汀(Fukutin)相关蛋白和丝普克林(Symplekin)表 达水平：在本研究中，相较于非AD个体，在初期AD个体中鉴别出作为APOE4基序介导的基因的福库汀相关蛋白(FKRP)和丝普克林(SYMPK)的增加的RNA转录水平，由此验证FKRP和SYMPK作为用于诊断和治疗AD的标靶的潜能。
在来自处于阿茲海默氏病的变化阶段的个体的海马体组织中确定FKRP和SYMPK的相对表达水平。GEO功能性储存库的数据集浏览器用于搜索基因表达谱且选择标题为：“阿尔茨海默氏病的各个阶段：激光捕获的海马体CA1灰质(various stages of Alzheimer'sdisease:laser-captured hippocampal CA1gray matter)”lxxxiv的研究作为最相关的研究。本研究为通过从处于阿茲海默氏病的变化阶段的个体的福马林固定的石蜡嵌入式海马体切片进行激光捕获而显微解剖的海马体CA1灰质的比较性微阵列分析(参考序列号GSE28146)。分析来自总共30名个体的大脑切片。基于微型精神状态测验(MiniMentalStatus Exam，MMSE)结果、神经纤维缠结(NFT)计数和Braak分期将个体分成四个类别的变化AD严重程度。因此，8名个体归类为对照(MMSE：27.6±0.6；NFT：3.0±1.1；Braak：2.3±0.40)、7名个体归类为初期AD(MMSE：24.3±1.1；NFT：17.5±8.2；Braak：5.0±0.5)、8名个体归类为中度AD(MMSE：16.5±0.6；NFT：8/25.6±3.5；Braak：5.5±0.2)，以及7个体归类为重度AD(MMSE：6.0±1.4；NFT：32.7±3.2；Braak：5.8±0.2)。具有RoboMover帽系统的ZeissAxioObserver PALM微光束用于使每个样本的CA1灰质区域成像、切割所述CA1灰质区域且捕获所述CA1灰质区域。随后制备来自解剖区域的总RNA以用于标记和微阵列杂交(Affymetrix人类基因组U133加2.0阵列，GPL570平台)。所有实验性步骤遵循制造商的指令的且使用制造商的软件完成数据分析。所获得数据集(在GEO图谱中记录为GDS4136)基于12,665个基因的表达数据。
使用浏览器DATA分析工具来分析这种数据集。在搜索窗中输入术语“FKRP”且撷取表示福库汀相关蛋白的未转化表达水平的四个组织样品类别中的每一个的数据(表8)。在去除所有组中的低于平均值的1/3或高于平均值3倍的值之后分别地计算来源于对照患者的8个组织和来自初期AD患者的7个组织的平均表达水平。使用双尾司徒登氏t测试比较剩余的7个对照值和5个初期AD值。FKRP表达值对于AD患者为455.32±88.39(平均值±标准偏差)且对于对照个体为262.97±72.09(平均值±标准偏差)。这种差异在p值<0.05时为统计学上显著的。结果展示FKPD表达在阿尔茨海默氏病中增加。
表8：初期阿尔茨海默氏病和对照人类CA1灰质中的FKRP表达
在浏览器DATA分析工具的搜索窗中输入术语“SYMPK”且四个组织样品类别中的每一个的所撷取数据表示丝普克林的未转化表达水平。(表9)。分别计算来源于对照患者的8个组织和来自初期AD患者的7个组织的的平均表达水平且去除所有组中的低于平均值的1/3或高于平均值3倍的值。使用双尾司徒登氏t测试比较剩余的7个对照值和6个初期AD值。SYMPK表达值对于AD患者为504.73±198.01(平均值±标准偏差)且对于对照个体为253±127.81(平均值±标准偏差)。这种差异在p值<0.05时为统计学上显著的。这些结果展示SYMPK表达在阿尔茨海默氏病中增加。
表9：初期阿尔茨海默氏病和对照人类CA1灰质中的SYMPK表达
研究4：使用qPCR对具有APOE4/E4、APOE3/E3和APOE2/E2基因型的同基因人类神经 元的差异基因表达
方法：执行定量实时逆转录聚合酶链反应(qPCR)分析以评估位于染色体19上的rs429358(APOE4)的2Mb内的基因的表达图谱。
PCR(聚合酶链反应)是所属领域的技术人员已知的常用实验室方法，其中模板DNA的特定部分在重复加热和冷却的周期中复写，因此允许靶序列的指数扩增。PCR依赖于耐热DNA聚合酶且需要引物，即通过互补碱基配对结合于模板的单链DNA的短片段。设计引物，因此其侧接待扩增的DNA区域。当在标准PCR中在端点分析中检测到扩增DNA产物时，在qPCR(定量PCR或实时PCR)中，在每个周期之后将扩增产物的聚集测量为反应进展。通过在反应中使用荧光报告分子来实现PCR产物的检测，所述分子随着产物DNA的量的增加而产生增加的荧光。我们采用涉及双链DNA插入分子SYBR以确定位于染色体19上的rs429358(APOE4)的2Mb内的蛋白质编码基因的基因表达水平的检测方法。我们采用使用双重标记探针(又称为探针)以测量位于染色体19上的rs429358(APOE4)的2Mb内的miRNA的表达水平的方法。双重标记探针由用5'端处的报导子染料和3'端处的抑止剂部分标记的18-22bp单链寡核苷酸组成。这种类型的荧光探针被设计成专门退火到正向引物与反向引物之间的靶序列的内部区域。靶基因的扩增造成探针通过TaqDNA聚合酶的5'核酸酶活性位移和裂解，从而随PCR引物的延伸产生报导子荧光的增加。这些方法均通常用于定量基因表达水平且为所属领域的技术人员已知。
执行定量PCR(qPCR)以确定APOE4基序介导的基因的子集在从诱导多能干细胞(IPSC)分化的市售人类神经元(美国威斯康星州细胞动态公司(Cellular DynamicsInc.))中的转录水平。人类IPCS来源于通过应用一组转录因子已再程序化为多能性的体细胞lxxxv。通过CRISPR修饰一个原始神经元线路以分别携载APOE4/E4、APOE3/E3或APOE2/E2基因分型，由此最小化细胞株之间的任何其它基因变异。因此，这些神经元中的每一个分别针对E4、E3或E2等位基因纯合。所分析的神经元因此分别称为纯合基因型E3/E3、E4/E4和E2/E2的E3E3、E4E4和E2E2。这些神经元为有丝分裂后神经亚型的混合物，但主要地包括GABA能、抑制性神经元，具有典型的生理特征和反应。
总RNA通过所属领域的技术人员已知的方法从4.0×106E3E3神经元、4.9×106E4E4神经元和4.4×106E2E2神经元中提取。通过NanoDrop分光光度计分析执行RNA纯度和浓度的初步评定且通过使用安捷伦(Agilent)2100生物分析仪确定RNA完整性。分别对于E3E3、E4E4和E2E2神经元，总RNA的产量为9.6微克、5.8微克和8.4微克。使用来自所属领域的技术人员已知的确定制造商的经论证、一致和可靠反应剂合成互补DNA。qPCR实验在来自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)的7900HT快速实时PCR系统中使用用于检测信使RNA的基于SYBR Green分析和用于检测微RNA的塔克曼(TaqMan)探针来运行。每个实验涵盖从每个单独丸粒分离的基因材料的三次独立扩增分析。
结果：使用相对定量分析(双△Ct数据分析)实现核酸的定量。相对定量允许确定靶基因在疾病细胞株相对于对照细胞株中的表达的倍数差异。首先，基于原始荧光值从原始数据中减去基线。接着，针对每种样品确定阈值周期(Ct)值，其表示达到特定定量阈值荧光信号水平所需的周期数。针对评估的基因且针对标准化目的的参考基因来确定Ct值。四个基因(甘油醛-3-磷酸酯去氢酶(GAPDH)、泛素共轭酶E2D2(UBE2D2)、细胞色素c1(CYC1)和核糖体蛋白质L13(RPL13))用作基于Green分析中的参考基因，且MIR103、MIR106b、MIR26b和MIR191用作微RNA表达分析中的参考物。针对E4E4IPSC衍生的神经元和对照细胞株中的每一个(分别为E3E3和E2E2IPSC衍生的神经元)中的所关注基因和参考基因(称为“Ref'”)来确定平均Ct值。对于另外的数据分析，将E4E4样品与E3E3或E2E2样品进行比较。对于每个配对的比较，产生以下四个值：E4E4中平均Ct参考值、E3E3(或E2E2)平均Ct参考值、E4E4中所关注基因的平均Ct和E3E3(或E2E2)中所关注基因的平均Ct。针对E4E4和对照来计算所关注基因和参考基因的Ct值(△Ct值，短dCt)之间的差异。接着，将E4E4和对照之间的差异计算为达到双△Ct值(ddCt E4E4-E3E3或ddCt E4E4-E2E2)。由于扩增产物的数量在每个周期中加倍，E4E4与对照之间的表达倍数变化(相对量或RQ(E4E4/E3E3或E4E4/E2E2))用下式2/\-ddCt计算。通过双尾t测试使用每个样品集的dCt值作为数据来计算评定所观测差异的统计显著性的P值。在IPSC-衍生的神经元中相较于E3E3或E2E2神经元与纯合E4E4基因分型明显不同的蛋白质编码基因列于表10中。倍数变化列的负值指示基因在E4E4神经元中下调，而正值指示基因上调。MIR320E相对于E3E3神经元在E4E4神经元中提升(1.37倍)。MIR320E相对于E2E2神经元在E4E4神经元中提升(1.54倍)。
表10：分别与E3E3和E2E2神经元相比较，在具有纯合E4E4基因分型的IPSC衍生的神经元中展现显著差异表达的基因。
此等结果引人注目地展示，分别与针对E3纯合或针对E2基因分型纯合的同基因的神经元相比较，APOE4基序在E4E4神经元中的存在介导染色体19上的rs429358(APOE4)附近的基因表达水平的显著变化。此外，APOE4基序的存在可降低靶基因的表达水平(FOSB剪接变体ΔFOSB、FOXA、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、ZNF285、SIX5、PLAUR、VASP、EML2、OPA3、BCAM、QPCTL)或增加靶基因的表达水平(KLC3、SYMPK、STRN4)。
总之，本文中的实例提供APOE4基序介导的基因和其表达产物作为用于诊断、预防和治疗阿尔茨海默氏病和轻度认知障碍的靶标的实验性验证。
出于说明和描述的目的，已经呈现本发明的前述论述。前述不意图将本发明限制于本文公开的一或多种形式。尽管本发明的描述包含一或多个实施例的描述和某些变化和修改，但在理解本公开之后，其它变化和修改在本发明的范围内，例如，可在所属领域的技术人员的技能和知识内。期望获得在准许的范围内包含替代实施例的权利，包含所要求的替代的、可更换的和/或等效的结构、功能、范围或步骤，而无论这些替代的、可更换的和/或等效的结构、功能、范围或步骤是否在本文中公开，且不期望公开用于任何可获专利的主题。本文中引用的所有参考文献全文以引用的方式并入本文中。
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<210> 25
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SIX5正向01
<400> 25
gcgcctgcgc a 11
<210> 26
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SIX5反向02
<400> 26
gcggatgcgc g 11
<210> 27
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPR4反向01
<400> 27
gcggatgccc c 11

Claims (37)

1.一种用于测量载脂蛋白E 4“APOE4”基序介导的基因或其表达产物的活性的分析，所述分析包括：
能够产生由APOE4基序介导的基因的表达产物的细胞；
APOE4基序介导的基因的表达产物；或
其组合。
2.根据权利要求1所述的分析，其中所述细胞包括哺乳动物神经细胞、哺乳动物多能干细胞或由其衍生的细胞，或其组合。
3.根据权利要求1所述的分析，其中所述分析用于测量基因转录、基因转译的活性或所述基因表达产物的生物活性。
4.一种用于鉴别潜在地适用于治疗阿尔茨海默氏病AD的化合物的方法，所述方法包括：
使测试化合物与根据权利要求1所述的分析接触；
在所述分析中测定载脂蛋白E 4“APOE4”基序介导的基因表达的调节水平或APOE4基序介导的基因表达产物的活性的调节水平，或其组合；
其中当与不存在所述测试化合物的情况下的APOE4基序介导的基因表达的活性相比较，APOE4基序介导的基因表达的活性或APOE4基序介导的基因表达产物的活性水平在存在所述测试化合物的情况下调节时，那么其为所述测试化合物潜在地适用于治疗阿尔茨海默氏病的指示。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法包括测定APOE4基序介导的基因转录、APOE4基序介导的基因转译、APOE4基序介导的基因表达产物的生物功能或其组合的水平。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述调节为抑制。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因位于rs429358的约2Mb内的人类染色体19上。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因选自由以下组成的组：PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCC1、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OPA3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP，和其组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因选自由以下组成的组：FBXO46、SNRPD2、ZNF285、ZNF180、PVR、ERCC2、QPCTL、SYMPK、MYPOP、CCDC61、XRCC1、ZNF576、ZNF428、SMG9、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP、RTN2、IRGQ、SRRM5、FOXA3、FOSB/ΔFOSB、SIX5、GPR4，和其组合。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因选自由以下组成的组：FBXO46、PPP5C、FKRP、SYMPK、FOSB/ΔFOSB、FOXA3、GPR4、PSG1、PPP1R13L、EXOC3L2、SIX5、PLAUR、KLC3，和其组合。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述分析为小分子库的高通量筛选分析。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括鉴别在所述分析中具有抑制性活性的抑制剂且使所述抑制剂经历第二次分析的步骤。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述测试化合物选自由以下组成的组：小分子、寡核苷酸或其衍生物，或肽或其衍生物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述寡核苷酸为小干扰RNA。
15.根据权利要求4所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因为MIR4531、MIR8085、MIR6088、MIR330、MIR642A、MIR642B、MIR769、MIR320E和其组合，且所述测试化合物为锁核酸修饰的寡核苷酸。
16.一种用于抑制APOE4基序介导的基因或APOE4基序介导的基因表达产物在细胞中的活性的方法，所述方法包括使表达所述APOE4基序介导的基因的细胞与能够抑制所述APOE4基序介导的基因或APOE4基序介导的基因表达产物的活性的化合物接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述化合物为寡核苷酸或其衍生物、肽或其衍生物，或抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选择性结合于APOE4基序介导的基因表达产物。
18.一种用于治疗或预防阿尔茨海默氏病的治疗剂，其包括已鉴别为降低APOE4基序介导的基因表达的水平或APOE4基序介导的基因表达产物的活性水平的根据权利要求4所述的测试化合物。
19.一种用于治疗AD的治疗剂，其包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选择性结合于APOE4基序介导的基因的表达产物。
20.根据权利要求19所述的治疗剂，其中所述抗体或所述其抗原结合片段结合于APOE4基序介导的基因表达产物的胞外域。
21.根据权利要求19所述的治疗剂，其中所述抗体或所述其抗原结合片段经修饰以增加血液穿过血脑屏障进入大脑的转运。
22.根据权利要求19所述的治疗剂，其进一步包括药学上可接受的载剂。
23.一种组合物，其包括含有SEQ ID NO:1内的11到24个连续核苷酸的长度为11到30个核苷酸的寡核苷酸和药学上可接受的载剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述寡核苷酸为双链寡核苷酸。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述寡核苷酸为单链寡核苷酸。
26.根据权利要求23所述的组合物，其中所述寡核苷酸经化学修饰或调配以使得能够穿过血脑屏障转运到大脑中。
27.根据权利要求23所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为硫代磷酸酯寡核苷酸、甲基膦酸酯寡核苷酸、亚磷酰胺寡核苷酸、肽核酸寡核苷酸、锁核酸修饰的寡核苷酸，或其组合。
28.一种用于抑制APOE4基序介导的基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求23所述的组合物接触。
29.一种诊断个体患阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的风险的方法，所述方法包括测定获自所述个体的样品中的APOE4基序介导的基因的水平或APOE4基序介导的基因表达产物的水平，其中与对照相比较，APOE4基序介导的基因的水平的差异或APOE4基序介导的基因表达产物的水平的差异为所述个体患阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的风险升高的指示。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述样品包括组织、细胞或体液。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因包括位于人类染色体19上的rs429358的约2Mb内的基因。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述APOE4基序介导的基因选自由以下组成的组：PSG1、XRCC1、PINLYP、IRGQ、ZNF576、SRRM5、ZNF428、PLAUR、SMG9、ZNF224、ZNF285、ZNF180、PVR、BCL3、CBLC、BCAM、PVRL2/NECTIN2、CLPTM1、RELB、CLASRP、GEMIN7、MARK4、PPP1R37、NKPD1、TRAPPC6A、BLOC1S3、EXOC3L2、CKM、KLC3、ERCC2、PPP1R13L、ERCC1、FOSB/ΔFOSB、RTN2、VASP、OPA3、GPR4、EML2、GIPR、SNRPD2、QPCTL、FBXO46、SIX5、SYMPK、FOXA3、MYPOP、NOVA2、CCDC61、HIF3A、PPP5C、PNMA8A/PNMAL1、PNMA8B/PNMAL2、DACT3、STRN4、FKRP，和其组合。
33.一种用于确定患有或处于患有阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的风险下的个体的治疗方案的方法，所述方法包括：
测量APOE4基序介导的基因或APOE4基序介导的基因表达产物在来自所述个体的生物样品中的水平；
将APOE4基序介导的基因或APOE4基序介导的基因表达产物在所述生物样品中的水平与对照水平进行比较；和
基于所述比较选择治疗剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述对照为APOE4基序介导的基因或APOE4基序介导的基因表达产物在不具有APOE4等位基因的个体中的标准水平。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述对照为APOE4基序介导的基因或APOE4基序介导的基因表达产物在具有APOE4等位基因的个体中的标准水平。
36.一种用于治疗患有或处于患有阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍的风险下的个体的方法，所述方法包括测定所述个体中的APOE基因分型且如果所述个体携载APOE4等位基因，那么向所述个体投予治疗有效量的调节APOE4基序介导的基因的活性的分子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中测定所述个体中的所述APOE基因分型的所述步骤包括测定所述个体对于APOE4是纯合抑或杂合的步骤。
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