CN104109707A - 一种人生理特征基因芯片 - Google Patents

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张新
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Abstract

本发明公开了一种人生理特征基因芯片，包括步骤：1）提取受检者样本DNA；2）对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记；3）荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因多态性位点；4）根据步骤3）得到的基因分型结果，评估受检者的生物学性状。通过相关基因分型，可以对受检者进行性格、情感、智商、阅读、数学、饮酒、成瘾性、运动和体质等生理特征预估，从而制订最科学的个体化培养计划，提高教育培养成功率。

Description

一种人生理特征基因芯片
技术领域
本发明涉及体外诊断技术和检测领域，更具体地，涉及一种基因芯片，以及包括该芯片的检测人生理特征相关基因各基因型的寡核苷酸芯片套组和方法。 
背景 
通过比较同卵双生和异卵双生孪生子的群体遗传学研究表明，人体的生长发育以及大脑各部分功能的发展与完善受到遗传因素和环境因素的影响和制约，其中大约40-50%受遗传因素的影响。由于遗传因素目前人们无法掌控，而环境因素却是人们可以创造和调节，因此可根据儿童本身的遗传因素，为其创设量身定做的外部环境（包括自然和社会环境），强化优势天赋，消除潜在的不良人格，因材施教，进行个性化教育培养。 
三维人格问卷将人格分为三个相互独立的维度，即猎奇性（Novelty-Seeking，NS）、躲避伤害性（Harm-Avoidance，HA）和奖赏依赖性（Reward-Dependence，RD），分别与多巴胺（DA）神经递质、5-羟色胺（5-HT）神经递质和去甲肾上腺素（NA）神经递质有关。多巴胺主要与大脑的情欲和感觉有关，传递兴奋及快乐的信息，也与上瘾有关。脑部多巴胺含量多，人会变得极富好奇心，爱冒险，积极进取。爱情其实就是脑里产生大量多巴胺作用的结果。所以，吸烟和吸毒都可以增加多巴胺的分泌，使上瘾者感到开心及兴奋。若多巴胺较少时，便会导致优柔寡断而冷漠的个性，缺乏启动力和积极性。5-羟色胺可以直接影响人的心理功能和生理功能，比如人的喜怒哀乐、睡眠、食欲等。血液中5-羟色胺水平低，儿茶酚胺浓度较高的人脾气容易急躁，性格比常人刚强、倔犟，遇事好冲动。反之，血液中5-羟色胺浓度较高，儿茶酚胺浓度偏低的人性情比常人温和，遇事较冷静，不易产生急躁情绪。与这些神经递质相关基因的遗传变异在不同程度上影响了个体的人格。大脑是一切心理活动的物质基础，大脑结构发育差异不仅影响个体的智商，同时也影响个体的人格。如BDNF基因参与与大脑海马发育，低BDNF活性的个体比正常人的大脑海马的体积要小11%，从而影响部分记忆功能，并与焦虑、抑郁等相关。不良性格的人在人际交往、社会支持度和事业等方面，相对不易获得成功，严重者甚至存在严重的心理障碍、自杀等精神疾病，关系到社会的稳定。另一方面，个体运动能力等也受到遗传因素影响。 
在儿童教育培养上，年纪越小可塑性越强，良好的人格越容易培养。利用人类行为遗 传学的研究进展，通过检测生物学性状相关基因，即可判断儿童最初的潜能，以正确的抚养方式对孩子的先天弱点进行“基因治疗”，对孩子的先天优点进行强化。 
发明内容
1.发明目的： 
本发明要解决的技术问题是提供一种人生物学性状基因检测芯片，能有效地检测生物学性状相关基因的多态性，从而使家长、教师及心理医生能及时了解孩子性格、情感、智商、音乐、运动和体质等相关遗传信息，预测儿童最初的性格和潜能，并根据儿童所具有的遗传特性，创造合适的生活环境，制定针对性的教育计划，制定合理的个性化培养方案，充分发挥儿童的优势天赋，取长补短，因材施教，培养儿童健康成长。为此，本发明还要提供应用该芯片检测人生物学性状相关基因多态性的方法。 
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: 
在本发明的一个方面，提供了一种人生物学性状遗传学检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测的人生物学性状遗传学相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。 
本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。 
所述待测人生物学性状遗传学相关多态性包括rs2770296、rs2350780、rs2061174、rs4680、rs1042713、rs2242446、rs1799971、rs6265、rs13212041、rs429358、MAOA G941T、rs1800955、rs1815739、rs671、rs1695、rs7412、rs2143340、rs363449和MSTN C66493737T。 
所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA 或其衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成与目的核苷酸序列特异性结合。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。 
本发明检测芯片的探针为DNA，包括：(1) 与待测rs2770296杂交的(a)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示序列，(b) SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(2) 与待测rs2350780杂交的(a)SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示序列，(b)SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示的序列 中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(3) 与待测rs2061174杂交的(a)SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示序列，(b) SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(4) 与待测rs4680杂交的(a)SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8所示序列，(b)SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(5) 与待测rs1042713杂交的(a)SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示序列，(b)SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(6) 与待测rs2242446杂交的(a)SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示序列，(b)SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(7) 与待测rs1799971杂交的(a)SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示序列，(b)SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(8) 与待测rs6265杂交的(a)SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示序列，(b)SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(9) 与待测rs13212041杂交的(a)SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18所示序列，(b)SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(10) 与待测rs429358杂交的(a)SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示序列，(b)SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列； 
(11) 与待测MAOA G941T杂交的(a)SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:22所示序列，(b)SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:22所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:22所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(12) 与待测rs1800955杂交的(a)SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:24所示序列，(b)SEQ ID  NO:23～SEQ ID NO:24所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:24所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(13) 与待测rs1815739杂交的(a)SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:26所示序列，(b)SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:26所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:26所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(14) 与待测rs671杂交的(a)SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示序列，(b)SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(15) 与待测rs1695杂交的(a)SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30所示序列，(b)SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(16) 与待测rs7412杂交的(a)SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:32所示序列，(b)SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:32所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:32所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(17) 与待测rs2143340杂交的(a)SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示序列，(b)SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(18) 与待测rs363449杂交的(a)SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36所示序列，(b)SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
(19) 与待测MSTN C66493737T杂交的(a)SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:38所示序列，(b)SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:38所示序列中每条序列的互补链，(c) 与SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:38所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。 
优选的，本发明检测芯片的探针选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:38所示序列。 
所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。 
本发明检测芯片还包括至少一种对照探针,所述对照探针选自: 阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。 
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个 自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V, HanemannV, Wolfl S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res. 2000, 28: e66; USA Patent No. 5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T（A、C或G）、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T（A、C或G）的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。 
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键（玻璃或二氧化硅作支持物时使用）。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2 一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。 
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T（A、C 或G）修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2 修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T （A、C 或G）修饰和3’-生物素修饰等。 
所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。 
在本发明的另一方面，提供了一种应用上述芯片对人生物学性状进行遗传学检测的方法，包括如下步骤： 
(1)在固相载体表面点载与待测人生物学性状相关基因多态性的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针； 
(2)抽提待测样品的核酸； 
(3)制备待测人生物学性状相关基因的目的核苷酸序列； 
(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列； 
(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间； 
(6)检测杂交反应的结果。 
(7)将步骤 (6)中的基因分型结果导入人生物学性状分析软件进行受检者生物学性状分析。 
在本发明的另一方面，还提供了一种应用上述芯片对人生物学性状进行基因多态性检测 的方法，包括如下步骤： 
(1)标记与待测生物学性状相关基因多态性的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针； 
(2)抽提待测样品的核酸； 
(3)制备待测生物学性状相关基因多态性的目的核苷酸序列； 
(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列； 
(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间； 
(6)检测杂交反应的结果。 
(7)将步骤 (6)中的基因分型结果导入人生物学性状分析软件进行受检者生物学性状分析。 
所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，用分离的靶样本中含核酸的细胞直接扩增，也可用抽提的靶核酸直接扩增。如用磁珠从全血中分离白细胞，直接用分离的白细胞或用全血抽提的核酸作模板，扩增目的核酸序列。扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也于本发明所述芯片杂交。 
目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），多重PCR，连接酶链反应（ligase chain reaction， LCR），滚环扩增（rolling cycle amplification，RCA），基于核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA），链置换扩增（strand displacement amplification，SDA）和转录介导的扩增（transcription medicated amplification，TMA）等。 
在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用PCR扩增方法，该方法所用引物含有SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:78所示序列的核苷酸链或其互补链。 
所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。 
合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。 
本发明方法的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为2分 钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。 
本发明生物学性状基因芯片及其检测套组和方法，使家长、教师及心理医生及时掌握儿童大量遗传信息，从而可以结合儿童实际情况，制定个体化的教育培养方案，充分发挥儿童的优势天赋，取长补短，因材施教，培养儿童健康成长。同时对于心理疾病患者，也可为临床心理医生提供用药参考。 
附图说明
图1是本发明的实施例1中多重PCR扩增后的电泳检测结果图； 
图2是本发明的实施例1中PCR产物片段化后的电泳检测结果图； 
图3是本发明实施例1的人生物学性状遗传学检测芯片的杂交结果图； 
图4是本发明实施例1的电泳检测基因缺失结果图。 
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 
实施例1  反向杂交 
1.基因芯片的制备 
(1)探针溶解 
将SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:38所示序列探针的每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10 mM。将浓度为10 mM的探针与浓度为200 mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。 
(2)点样 
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65－75％（以FullMoon片基为准），温度为25℃的条件下点样，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。 
2.待测样品的处理和标记 
(1) 人基因组DNA抽提及目的基因的扩增 
采用FlexiGene DNA Kit（250）（QIAGEN，Cat. No. 51206）试剂盒抽提人外周血中基因组DNA。取1ul进行电泳（1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小时电泳），在FR-200 紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker（Lambda DNA/EcoRI+HindIII）进行定量。 
用rs2770296的引物（SEQ ID NO:39、40）、rs2350780的引物（SEQ ID NO:41、42）、rs2061174的引物（SEQ ID NO:43、44）、rs4680的引物（SEQ ID NO:45、46）、rs1042713 的引物（SEQ ID NO:47～48）、rs2242446的引物（SEQ ID NO:49、50）、rs1799971的引物（SEQ ID NO:51、52）、rs6265的引物（SEQ ID NO:53、54）、rs13212041的引物（SEQ ID NO:55、56）、rs429358的引物（SEQ ID NO:57、58）、MAOA G941T的引物（SEQ ID NO:59、60）、rs1800955的引物（SEQ ID NO:61、62）、rs1815739的引物（SEQ ID NO:63、64）、rs671的引物（SEQ ID NO:65、66）、rs1695的引物（SEQ ID NO:67、68）、rs7412的引物（SEQ ID NO:69、70）、rs2143340的引物（SEQ ID NO:71、72）、rs363449的引物（SEQ ID NO:73、74）和MSTN C66493737T的引物（SEQ ID NO:75～76）进行目的核苷酸序列的扩增。PCR扩增用30 μl反应体系进行，反应体系是0.3 mM dNTP、10 mM Tris-HCl、50 mM KCl、2 mM MgCl2、20% Q solution（Qiagen）、上游和下游引物的浓度0.16 μM、基因组DNA 10ng，Taq酶0.6 U（Takara）。应用Touch-down PCR反应程序[Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991, 19: 4008]：94℃变性5 min；94℃变性40 s，64℃退火1 min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50 s，共10个循环；然后94℃变性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸50 s，共30个循环；最后72℃ 延伸5 min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果。 
当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:78所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50μl。多重PCR的反应体系为：每种dNTP 0.3 μmol/L，Tricine-KOH（PH8.7）40 mmol/L，KCl 16 mmol/L, MgCl23.5 mmol/L, BSA 3.75 μg/ml，每条引物2μmol/L，DNA 80ng 和2.2× Titanium Taq DNA聚合酶（Clontech，USA）。多重PCR反应条件：95℃ 变性3 min；95℃变性30s，66℃退火2 min，68℃延伸4 min，共40个循环；最后68℃延长10 min。PCR 扩增后，取3 μl PCR 反应产物做琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。这些PCR 产物经处理后可用于下面的杂交步骤。 
(2) PCR产物纯化和片段化 
每个样品的所有PCR产物混合，用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，Cat. No. 28106）纯化。纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNaseⅠ进行片段化。片段化的反应体系包括：30 μl纯化PCR产物(10 μg), 4 μl的10× DNaseⅠ缓冲液,0.12 μl的DNaseⅠ，5.88 μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴5 min，然后95℃ 15 min。片段化后的产物跑4％琼脂糖凝胶，保证绝大多数的片段处于30-200个碱基对，电泳检测结果如图2所示。 
(3) 荧光素标记 
利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的40 μl反应体系包括：25 μl 片段化PCR产物，8 μl的5×脱氧核苷酸转移酶缓冲液，1 μl的CY3-N6-ddCTP（1 mM），3 μl的脱氧核苷酸转移酶（20 U/μl），3 μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴120min，然后95℃加热15min。 
3.杂交、洗涤和结果检测 
荧光标记的PCR产物95℃变性10 min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应20 μl体系包括：荧光素标记的PCR产物15 μl，20× SSPE 1.2 μl，1% Triton 0.2 μl， 10× Denhandts 0.9 μl，甲酰胺0.5 μl，ddH2O 2.2 μl。反应条件为48℃温浴120 min，然后相继用1×洗涤缓冲液Ⅰ（5× SSC，0.1% SDS）、1×洗涤缓冲液Ⅱ（2× SSC，0.1% SDS）和1×洗涤缓冲液Ⅲ（1× SSC）在42℃各洗涤10 min，最后用ddH2O洗涤0.5 min。 
洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B 共聚焦激光扫描仪进行扫描（也可以用其他的激光扫描仪）。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图3所示，再用GenePix Pro 处理图像得到数据文件，然后对数据文件利用人生物学性状评估软件（上海芯超生物科技有限公司）进行处理就可以得到受检者生物学性状的结果，从而指导家长、教育学家或心理医生为制定个性化的教育方案或心理治疗方案。 
实施例2  正向杂交 
1. 人生物学性状相关基因多态性的扩增和芯片制备 
用rs2770296的引物（SEQ ID NO:39、40）、rs2350780的引物（SEQ ID NO:41、42）、rs2061174的引物（SEQ ID NO:43、44）、rs4680的引物（SEQ ID NO:45、46）、rs1042713的引物（SEQ ID NO:47～48）、rs2242446的引物（SEQ ID NO:49、50）、rs1799971的引物（SEQ ID NO:51、52）、rs6265的引物（SEQ ID NO:53、54）、rs13212041的引物（SEQ ID NO:55、56）、rs429358的引物（SEQ ID NO:57、58）、MAOA G941T的引物（SEQ ID NO:59、60）、rs1800955的引物（SEQ ID NO:61、62）、rs1815739的引物（SEQ ID NO:63、64）、rs671的引物（SEQ ID NO:65、66）、rs1695的引物（SEQ ID NO:67、68）、rs7412的引物（SEQ ID NO:69、70）、rs2143340的引物（SEQ ID NO:71、72）、rs363449的引物（SEQ ID NO:73、74）和MSTN C66493737T的引物（SEQ ID NO:75～76）扩增基因。PCR扩增用100 μl反应体系进行，反应体系是0.3 mM dNTP，10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，2 mM MgCl2，20% Q solution（Qiagen），0.01 μM SHV-F，0.2 μM SHV-R，100 ng基因组DNA，3 U Ex Taq酶（Takara）。循环参数：94℃变性5 min；94℃变性40 s，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40个循环；最后72℃ 延伸5 min。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，Cat. No. 28106）纯化。将纯化的 PCR产物浓度调整至400 ng/μl。 
将浓度为400 ng/μl的PCR产物与100% 的DMSO于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心。将200 ng/μl的PCR产物通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65－75％（以FullMoon片基为准），温度为25℃的条件下点样，点样完毕放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600 mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。 
2.芯片杂交 
杂交反应体系包括：2 nM荧光标记的寡核苷酸探针（SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:54），1.2 μl 20× SSPE，0.2 μl 1% Triton，0.9 μl 10× Denhandts，0.5 μl甲酰胺，2.2 μl ddH 2O。反应条件为50℃温浴2小时，然后相继用1×洗涤缓冲液Ⅰ（5× SSC，0.1% SDS）、1×洗涤缓冲液Ⅱ（2× SSC，0.1% SDS）和1×洗涤缓冲液Ⅲ（1× SSC）在42℃各洗涤10 min，最后用ddH2O洗涤10秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B 共聚焦激光扫描仪进行扫描（也可以用其他的激光扫描仪）。 
实施例3：受检者生物学性状评估     
样本：受检者（女，4岁） 
按照实施例1的检测操作流程进行检测，其中，该受检者目的基因多重PCR扩增后的电泳检测结果见图1，PCR产物片段化后的电泳检测结果见图2，检测芯片杂交结果见图3，电泳检测基因缺失结果见图4。将所得检测结果导入人生物学性状评估软件，得到本实施例中的受检者的性格为A、情感为D、智商为B、阅读为A、数学为C、饮酒为A、成瘾性为B、运动为C、体质为B。 
序列表 
<110> 泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司 
<120>一种人生理特征基因芯片 
160> 76 
<213> 物种：人 
<400> 序列： 
aactcaggcc tcaggggaga gag                                           26 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：1 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
caactcaggc cttaggggag agag                                           26 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：2 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tctatcttgt acartccagca gaac                                                24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：3 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tctatcttgt acgtccagca gaac                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：4 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gacctgatgc acgagaatag gc                                             26 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：5 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gacctgatgc atgagaatag gc                                              26 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：26 
      序列编号：6 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
atttcgctgg catgaaggac aaggt                                              25 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：7 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
atttcgctgg cgtgaaggac aaggt                                              25 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：8 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccgccagcga aagccccgag ccgc                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：9 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccgccagcga aggccccgag ccgc                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：10 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cggacgcgcg cccttttctg ggaa                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：11 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cggacgcgcg ctcttttctg ggaa                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：12 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cttagatggc aracctgtccg a                                                     19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：13 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cttagatggc gracctgtccg a                                                    19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：14 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
actttcgaac acatgataga agagct                                             26 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：26 
      序列编号：15 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
actttcgaac acgtgataga agagct                                             26 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：26 
      序列编号：16 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tctgcagact tcggcactag cacac                                              25 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：17 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tctgcagact ttggcactag cacac                                              25 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：18 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tggaggacgt gcgcggccgc ctg                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：19 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tggaggacgt gtgcggccgc ctg                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：20 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ttaattcagc ggcttccaat gggag                                              25 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：21 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ttaattcagc gtcttccaat gggag                                              25 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：22 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gcgtggaggg cgcgcacgag gtc                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：23 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gcgtggaggg tgcgcacgag gtc                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：24 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccgaggctga ccgagagcga gg                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：25 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccgaggctga ctgagagcga gg                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：26 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
aggcatacac taaagtgaaa actg                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：27 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
aggcatacac tgaagtgaaa actg                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：28 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tgagggagac gtatttgcag c                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：29 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tgagggagat gtatttgcag c                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：30 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cctgcagaag cgcctggcag                                                      20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：31 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cctgcagaag cgtcctggcag t                                                      20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：32 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cagtgtcact tctagggctc tttt                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：33 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cagtgtcact tctagggctc tttt                                               24 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：24 
      序列编号：34 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gggttccatt tacaaagaca aagag                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：25 
      序列编号：35 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gggttccatt tagaaagaca aagag                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：36 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tgcaaaaatc aaatatctta at                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：37 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tgcaaaaatt aaatatctta atg                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：38 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ggagcaatgc atctgtgcta                                                      18 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：39 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gcaagtctgg gactcaaagc                                                     21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：40 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
caatttattg atgggaagtg gaa                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：41 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gacgtaaaac tgttctgctg ga                                                 21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：42 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cacctgcaga cctttcctgt                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：43 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gggcacagcc taggttctta                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：44 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
catcgagatc aaccccgact gt                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：45 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gtgatagtgg gttttcagtg a                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：46 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gagcccggta acctgtcgt                                                     19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：19 
      序列编号：47 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
acagcacgtc cactgaggtc                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：48 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ctcagcctcg gtgagttcaa t                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：49 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ggcacgccga ggctctgctt                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：50 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tgccttggcg tactcaagtt                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：51 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cacgcacacg atggagtaga                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：52 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccaggtgaga agagtgatga                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：53 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cccactcact aatactgtca                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：54 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cggttttacc aattgcatta g                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：55 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
agatgaggag tgttaaactg a                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：56 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
caaatcggaa ctggaggaa                                                     19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：19 
      序列编号：57 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gagcatggcc tgcacctc                                                      18 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：18 
      序列编号：58 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gccaagattc acttcagac                                                     19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：19 
      序列编号：59 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
acatgaataa tagcagccta                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：60 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gcgggatgag ctaggcgtc                                                     19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：19 
      序列编号：61 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gaaagacctg agctcaggct ct                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：62 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ggacaccagc tgacacttcc tg                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：63 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tctggcagat cttctggatc                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：64 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccctttggtg gctacaagat gt                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：65 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
agccaccagc agaccctcaa g                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：66 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tgcccaaccc tggtgcagat g                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：67 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
cagccctggt ggacatggtg a                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：21 
      序列编号：68 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gcctacaaat cggaactgga                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：69 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
acctgctcct tcacctcgt                                                    20 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：70 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
tctgtctaga acctggcatg ca                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：71 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ggtcaacact ggcaagatca gaa                                                23 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：23 
      序列编号：72 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ggatctgctg ggttccattt                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：73 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
ccttgcaaag aggactgcac                                                  21 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：20 
      序列编号：74 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
gagagctatt acactgaag                                                     19 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：19 
      序列编号：75 
<213> 物种：人  
<400> 序列： 
acaaggagga ctttgtgagc ca                                                 22 
<212> 类型：DNA 
<211> 长度：22 
      序列编号：76 

Claims (6)

1.一种人生理特征基因芯片，包括步骤：
1）提取受检者样本DNA；
2）对样本DNA进行目的基因SNP的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记，所述目的基因SNP包括rs2770296、rs2350780、rs2061174、rs4680、rs1042713、rs2242446、rs1799971、rs6265、rs13212041、rs429358、MAOA G941T、rs1800955、rs1815739、rs671、rs1695、rs7412、rs2143340、rs363449和MSTN C66493737T；
3）荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点；
4）根据步骤3）得到的基因分型结果，评估受检者的生物学性状。
2.如权利要求1所述的人生物学性状基因芯片及其检测套组和方法，其特征在于：所述步骤2）中的rs2770296的引物是SEQ ID NO:39~40所示序列的引物，rs2350780的引物是SEQ ID NO:41~42所示序列的引物，rs2061174的引物是SEQ ID NO:43~44所示序列的引物，rs4680的引物是SEQ ID NO:45~46所示序列的引物，rs1042713的引物是SEQID NO:47～48所示序列的引物，rs2242446的引物是SEQ ID NO:49~50所示序列的引物，rs1799971的引物是SEQ ID NO:51~52所示序列的引物，rs6265的引物是SEQ ID NO:53~54所示序列的引物，rs13212041的引物是SEQ ID NO:55~56所示序列的引物，rs429358的引物是SEQ ID NO:57~58所示序列的引物，MAOA G941T的引物是SEQ ID NO:59~60所示序列的引物，rs1800955的引物是SEQ ID NO:61~62所示序列的引物，rs1815739的引物是SEQ ID NO:63~64所示序列的引物，rs671的引物是SEQ ID NO:65~66所示序列的引物，rs1695的引物是SEQ ID NO:67~68所示序列的引物，rs7412的引物是SEQ IDNO:69~70所示序列的引物，rs2143340的引物是SEQ ID NO:71~72所示序列的引物，rs363449的引物是SEQ ID NO:73~74）和MSTN C66493737T的引物是SEQ ID NO:75～76所示序列的引物。
3.如权利要求1所述的人生物学性状基因芯片及其检测套组和方法，其特征在于：所述步骤2）中的片段化是将纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I进行片段化；
所述荧光素标记是将片段化PCR产物利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记。
4.如权利要求1所述的人生物学性状基因芯片及其检测套组和方法，其特征在于：所述步骤3）基因芯片的制备是将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片或硅片材质的固相载体片基上，其中，探针是SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:38所示序列的DNA探针。
5.如权利要求1所述的人生物学性状基因芯片及其检测套组和方法，其特征在于：所述步骤4）中的基因分型结果导入人生物学性状评估软件进行受检者生物学性状评估。
6.如权利要求1所述的人生物学性状包括：性格、情感、智商、阅读、数学、饮酒、成瘾性、运动和体质。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110268269A (zh) * 2016-12-18 2019-09-20 赛隆特拉有限公司 使用apoe4基序介导的基因以用于诊断和治疗阿尔茨海默氏病

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