CN114938633A - 阿尔茨海默病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用某些GPR4调节基因及其表达产物(即YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL、ITGB3)诊断、治疗和预防阿尔茨海默病和轻度认知损害的组合物和方法。本发明还涉及一种基于GPR4调节基因的差异表达鉴定治疗剂以治疗和诊断阿尔茨海默病或轻度认知损害的方法。

Description

阿尔茨海默病的治疗
交叉引用
本申请要求2020年1月7日提交的美国临时申请62/957999的优先权。
技术领域
本发明涉及一种基于调节GPR4和/或一个或多个GPR4调节基因或其表达产物来预防和治疗阿尔茨海默病和/或神经系统病症(例如但不限于轻度认知损害)的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)影响着全球数千万人，其患病率仍在上升。遗憾的是，目前还没有可靠有效的方法来诊断、治疗或预防AD。人们认为AD是由环境、生活方式、医疗条件和遗传因素共同引起的。AD在早期阶段往往不能被识别，而此时一些治疗方法可能是最有效的。目前FDA批准的阿尔茨海默病药物有明显的副作用，不但对改善患者的日常功能作用不大，且不能减缓疾病进程或治疗潜在的病理。
阿尔茨海默病的分子根源：大多数AD研究集中于淀粉样斑块的积聚和超磷酸化微管相关蛋白Tau(MAPT)的神经纤维缠结。还观察到突触功能障碍、突触可塑性受损和树突丢失i。甚至在斑块形成之前，GLUR2，即AMPAR(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体)亚单位的选择性丢失就发生了ii。研究还表明，AD涉及神经细胞周期调节和细胞周期重入的功能障碍iii。此外，与对照组相比，AD患者的神经原纤维素(neurofilament light)表达明显减少iv。在AD患者的尸检材料和脑脊液中，也发现皮质和海马中的SorLA(SorL 1/Sortilin相关受体)减少了25％v。
APOE4-AD的主要遗传因素。对于AD可能的治疗的一条诱人线索来自于20世纪90年代早期的遗传学研究，该研究表明，携带载脂蛋白E(APOE)基因特定等位基因(即APOE4等位基因)的人，患AD的风险显著增加。APOE3是APOE所有已知功能的正常等位基因。在参考基因组联盟人类38(Genome Reference Consortium Human Build 38)补丁版2/GRCh38.p2(单核苷酸多态性rs429358)中，APOE4变体在19号染色体的19:44908684处含有一个G。临床和流行病学数据表明，超过60％的AD患者是APOE4携带者vi，根据人群和研究，APOE4的外显率估计为60-70％。APOE4与早期发病年龄相关，APOE4纯合子的临床发病平均年龄为68岁，而未携带APOE4等位基因的受试者的临床发病平均年龄为84岁vii。在两条19号染色体上携带APOE4基因型的纯合子神经元在此被指定为E4E4神经元。在两条19号染色体上携带APOE3基因型的纯合神经元在此被指定为E3E3神经元。
受试者因其遗传背景易患AD或轻度认知损害。携带APOE4等位基因的受试者患AD或轻度认知损害的风险显著增加。易感受试者可能是APOE4等位基因的纯合子或杂合子。此外，携带AD家族变异体(包括淀粉样前体蛋白(APP)、早老素-1(PSEN1)或早老素-2(PSEN2)变异体)的受试者患AD或轻度认知损害的风险显著增加。
增强子通过结合细胞类型特异性转录因子发挥其调节功能。令人惊讶和意外的是，利用JASPAR CORE数据库中实验定义的真核生物转录因子结合位，APOE4变体创建了一个转录因子NRF1(核呼吸因子1)的结合基序viii。APOE4变体将NRF1共有序列核苷酸频率矩阵中出现0次的非共有A核苷酸改变为高度保守的共有匹配G核苷酸。NRF1蛋白序列以“人类NRF1”的身份保存在UniProtKB中，登录号为QI6656-1。NRF1是一种同源二聚体转录因子，介导关键代谢和线粒体基因的表达，在能量消耗、能量生成和神经元活动之间的耦合中发挥重要作用。
与增强子结合的转录因子会刺激或抑制基因转录。增强子可以影响位于同一染色体上距离2Mb的顺式基因的转录。增强子包含与它们调控的基因启动子相同的调控元件。远端增强子和启动子之间的联系是通过特定招募“环”因子建立的。在携带APOE4变体的神经元中，触发特异性转录因子NRF1诱导次级染色质环的形成，影响其附近几个基因的转录。该发现表明，APOE4等位基因在脑细胞中引起转录效应，改变一系列基因的转录，包括GPR4(G蛋白偶联受体4；UniProtKB为“人类GPR4”，登录号为P46093)的表达x，APOE3不会产生高评分的NRF1结合位点，因此通常不会影响附近基因的转录调节。PCT专利申请WO2018/112446中列出了将APOE4基因座与APOE4附近基因的NRF1活性联系起来的发现的更多细节。
发明内容
本发明提供了通过调节GPR4的活性来治疗阿尔茨海默病或轻度认知损害的方法。GPR4活性的调节提供了调节受GPR4调节或影响的基因的优势。还提供筛选治疗性化合物的方法和诊断疾病或疾病易感性的方法。
在一个方面，本发明提供GPR4的调节作为治疗阿尔茨海默病的方法。与携带E3基因型的纯合子神经元(E3E3神经元)相比，调节性GPR4调节携带E4基因型的神经元中差异调节基因的表达，包括YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3。图1中公开了这种差异表达。
在该方面的某些实施方案中，受试者为APOE4纯合的(E4E4神经元)。在其他实施方案中，受试者是APOE4等位基因杂合的。
本发明的一个方面提供了一种治疗被诊断患有或易感阿尔茨海默病或轻度认知损害的受试者的方法，所述治疗包括施用有效治疗量的增加GPR4活性的分子。
在该方面的优选实施方案中，有效治疗量增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一种基因的表达，或减少神经细胞中ITGB3的表达。
在该方面的优选实施方案中，所述治疗包括使用GPR4激动剂治疗受试者。
在该方面的优选实施方案中，所述治疗包括使用GPR4的正变构调节剂治疗受试者。
在该方面的优选实施方案中，所述受试者是人类。
在该方面的优选实施方案中，与APOE3等位基因纯合的受试者相比，受试者表现出选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达减少或ITGB3的表达增加。
在该方面的优选实施方案中，有效治疗量增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达，或降低ITGB3的表达，达到与APOE3等位基因纯合的人相当的水平。
本发明的一个方面提供了一种测定可用于治疗受试者阿尔茨海默病或轻度认知损害的调节剂治疗效果的方法。在优选实施方案中，对携带APOE4变体的神经细胞以及携带APOE3变体的神经细胞中差异表达的基因的调节进行评估，所述基因选自选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3和VCL。如果调节剂增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的基因的表达或降低ITGB3的表达，则调节剂具有治疗效果。
在该方面的优选实施方案中，所述调节剂是小分子。
在该方面的优选实施方案中，所述调节剂是GPR4的激动剂。
在该方面的优选实施方案中，所述调节剂是GPR4的正变构调节剂。
在该方面的优选实施方案中，所述神经元细胞是人类神经细胞。
在该方面的优选实施方案中，所述神经元细胞维持在细胞培养物中。
在该方面的优选实施方案中，所述神经元细胞位于类器官中。
在该方面的优选实施方案中，所述神经元细胞位于人脑中。
在这方面的优选实施方案中，所述神经元细胞位于阿尔茨海默病或轻度认知损害患者的大脑中。
在该方面的优选实施方案中，所述神经元细胞是APOE4等位基因纯合的。
在该方面的优选实施方案中，与APOE3等位基因纯合的受试者相比，受试者表现出选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达减少或ITGB3的表达增加。
在该方面的优选实施方案中，有效治疗量增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达，或降低ITGB3的表达，达到与APOE3等位基因纯合的人相当的水平。
本发明的一个方面提供了一种诊断具有阿尔茨海默病或轻度认知损害风险的APOE4等位基因杂合或纯合受试者的方法，包括确定GPR4表达产物的表达或活性水平，以及确定所述受试者的组织、细胞或体液中选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3的至少一个基因以及VCL的表达产物水平。当就表达产物水平而言，可以看到GPR4的基因表达或活性降低，并且YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL中的至少一种降低或ITGB3增加，表明阿尔茨海默病或轻度认知损害的风险升高。
在该方面的优选实施方案中，所述受试者是人类。
在该方面的优选实施方案中，所述受试者是APOE4基因型纯合的。
本发明的一个方面提供了选择GPR4治疗调节剂的方法，所述调节剂施用给患有或有可能患有阿尔茨海默病或轻度认知损害的受试者，所述方法包括测定受试者生物样本中选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3和VCL的基因的表达水平，以及基于受试者在所述样本中是否表现出YAP1、CTGF、CCND3、BDNF或VCL表达产物的减少或ITGB3表达产物的增加而对所述治疗调节剂进行选择。
本发明的一个方面提供了一种鉴定调节剂的筛选分析方法，所述调节剂调节选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3的基因或蛋白质的表达，包括：提供具有APOE4等位基因的细胞，并测定选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3的至少一个基因或蛋白质的表达。将细胞暴露于作为GPR4活性调节剂的调节剂中，并且在暴露后测定选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3的至少一个基因或蛋白质在细胞中的表达。鉴定改变了YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3中至少一种的基因或蛋白质表达的调节剂。
在该方面的优选实施方案中，所述调节剂是小分子。
在该方面的优选实施方案中，所述细胞是神经元细胞。
在该方面的优选实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。
在该方面的优选实施方案中，所述细胞维持在细胞培养物中。
在该方面的优选实施方案中，所述细胞是APOE4等位基因纯合的。
在该方面的优选实施方案中，所述神经元细胞位于类器官中。
在该方面的优选实施方案中，所述细胞是人类细胞。
在该方面的优选实施方案中，所述细胞是小鼠细胞。
在该方面的优选实施方案中，所述调节剂增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达。
在该方面的优选实施方案中，所述调节剂降低ITGB3的表达。
在这方面的优选实施方案中，所述人类神经元细胞位于患有阿尔茨海默病或轻度认知损害的个体的大脑中
在该方面的优选实施方案中，所述筛选是高通量筛选。
附图说明
图1示出了与纯合E3E3神经元相比，纯合E4E4神经元中YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3基因的相对表达水平。相对表达水平表示为平均值±平均值的标准误差。
图2示出了溶剂处理的纯合E4E4神经元相比于SLC2004处理的纯合E4E4神经元和溶剂处理的纯合E3E3神经元的YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3基因的相对表达水平。相对表达水平表示为平均值±平均值的标准误差。
图3示出了溶剂处理的纯合E3E3神经元相比于SLC2002处理的纯合E3E3神经元和溶剂处理的纯合E4E4神经元的YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3基因的相对表达水平。相对表达水平表示为平均值的平均值±标准误差。
具体实施方式
GPR4本身是WO2018/112446中列出的一个APOE4基序介导基因，与纯合APOE3基因型(E3E3神经元)的人类神经元相比，该基因在纯合APOE4基因型(E4E4神经元)的人类神经元中的表达显著降低。本发明认识到GPR4的调节剂(例如，增加GPR4表达水平或活性的分子)可用于恢复与正常E3E3神经元中观察到的表型相对应的适当GPR4活性。
GPR4(G蛋白偶联受体4；UniProtKB为“人类GPR4”，登录号为P46093)。GPR4是一种G蛋白偶联受体，通过组氨酸残基的质子化被细胞外酸性pH激活xi。GPR4信号通过Gαs(Gs)进行xii，允许激活cAMP/EPAC/Rap 1途径和Gα12/13(G12/13)刺激小GTP酶RhoA/ROCKxiii。低pH刺激GPR4在肌动蛋白应力纤维xiv、细胞粘附xv和黏着斑动态xvi的形成中发挥作用。突触活动与海马脑片(hippocampal slice)细胞外pH值的短暂降低有关xvii。刺激Gs和G12/13通路可激活整联蛋白，并使Yes相关蛋白1(YAP1)控制黏着斑的组装和成熟xviii，从而导致细胞骨架重排、树突棘扩张和突触可塑性。
GPR4影响YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3等基因的表达，从而调节基因表达产物。基因表达产物包括该基因的转录产物，该转录产物包括基于该基因的任何RNA转录物，包括任何microRNA或mRNA(无论mRNA转录物是初级的、拼接的、编辑的、修饰的或成熟的)或从mRNA转录物翻译的多肽。这种多肽可以是新生的或加工成成熟的或修饰的蛋白质。表达产物的量可以定性或定量地测定和描述为产物的表达水平。
YAP1(Yes相关蛋白1；UniProtKB作为转录辅激活子YAP1，“人YAP1”，登录号P46937)是Hippo信号通路的下游效应物。YAP1与来自TEA结构域家族的转录因子复合物调节多种细胞过程，包括细胞扩散、增殖和迁移、葡萄糖摄取和代谢。AD患者在Aβ沉积或tau缠结出现之前，YAP1表达很早就降低了xix。YAP1控制着黏着斑的组装和成熟，以及细胞骨架重排、树突棘扩张和突触可塑性所必需的通路的激活。
GPR4信号通路与YAP1功能和表达之间的联系在文献中尚不确定。在一种情况下，GPR4介导YAP1的抑制xx，在另一种情况下，GPR4信号促进YAP1控制的细胞增殖和存活xxi。本发明表明，基于调节性GPR4的治疗导致APOE4等位基因存在情况下YAP1表达的调节。
通过GPR4水平降低(如在携带APOE4等位基因的细胞中观察到的)，或通过连接GPR4与YAP1功能和表达信号通路的下调或抑制元件来下调GPR4信号通路。AD携带者家族变异体(包括淀粉样前体蛋白(APP)、早老素-1(PSEN1)或早老素-2(PSEN2)变异体)突变的基因，可位于连接GPR4与YAP1功能和表达的信号通路中。
携带APOE4等位基因的细胞中GRP4活性降低，并导致本文所述的其他基因表达降低。表达降低的级联导致阿尔茨海默病或轻度认知损害的易感或疾病状态。当存在其他降低GPR4表达的效应物时，GPR4也可能在非APOE4背景中降低。在这两种情况下，当GRP4活性降低时，基于增加GPR4活性的治疗对于预防、延迟、减少或逆转级联引起的疾病过程是有用的。
VCL(纽带蛋白(Vinculin)；UniProtKB为“人VINC”，登录号为P18206)是一种黏着斑蛋白，控制黏着斑形成和整联蛋白(integrin)动态。
CCND3(细胞周期蛋白D3；UniProtKB，作为G1/S特异性细胞周期蛋白D3，“人CCND3”，登录号P30281)是一种细胞周期蛋白，是CDK4和CDK6激酶的调节亚单位。CCND3在静止细胞中积累，并参与有丝分裂后阻滞xxii。
CTGF/CCN2(CCN2，细胞通讯网络因子2；UniProtKB，作为CCN家族成员2，“人CCN2”，登录号P29279)是一种分泌蛋白，可直接与整联蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合，从而激活多种细胞内信号通路xxiii。
BDNF(脑源性神经营养因子；UniProtKB，作为“人BDNF”，登录号为P23560)是一种促进神经元存活的神经生长因子。BDNF在成人突触可塑性中起着重要作用。BDNF的表达在AD中减少xxiv。
ITGB3(整联蛋白亚单位β3；UniProtKB，作为整联蛋白β3，“人ITGB3”，登录号为P05106)是稳态突触缩放所必需的。突触后神经元中β3整联蛋白的粘附和表面水平与突触强度以及AMPAR亚单位突触GLUR2(GRIA2，谷氨酸离子受体AMPA型亚单位2；UniProtKB，作为谷氨酸受体2，“人GRIA2”，登录号P42262)的丰度直接相关xxv。
GPR4的调节剂包括改变GPR4活性的分子。所述调节剂包括GPR4的激动剂或拮抗剂分子。GPR4激动剂增加GPR4的活性，GPR4拮抗剂降低GPR4的活性。所述分子包括小分子化合物和大分子生物化合物。所述生物化合物包括GPR4特异性RNA、DNA、抗体和含有互补决定区(CDR)的抗体的抗原结合片段、或与GPR4相互作用的蛋白质或辅因子。
小分子是分子量小于2000道尔顿、优选小于1500道尔顿、最优选小于900道尔顿的有机化合物。
GPR4激动剂增加GPR4的活性，从而影响选自YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3的至少一个基因的表达水平；对于YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF，GPR4激动剂的效应是表达水平的增加，而对于ITGB3，GPR4激动剂效应是表达水平的降低。
本领域技术人员已知GPR4的示例性拮抗剂。SLC2002是GPR4的示例性拮抗剂，在引用的参考文献中指的是化合物3bxxvi。SLC2002是一种高效、选择性的GPR4拮抗剂。
如本文所用，“GPR4激动剂”是一种与GPR4(或和直接与GPR4相互作用的蛋白质或辅因子)结合和/或导致GPR4细胞活性增加的化合物。GPR4激动剂的活性可包括Gs(cAMP)和/或G12/13信号通路的激活，诱导组氨酸残基质子化所需的GPR4受体pH激活曲线的改变、GPR4寡聚化或GPR4与相互作用伙伴(interactionpartner)结合的控制、或影响GPR4的内吞或钝化。这些GPR4激活机制用作示例，本领域技术人员已知与GPR4激活直接相关的其他事件。SLC2004(鞘氨醇磷酰胆碱)是GPR4的典型激动剂xxvii。另一种已知的GPR4激动剂是溶血磷脂酰胆碱xxviii。
GPR4的正变构调节剂是GPR4的激动剂，通过与GPR4上不同于GPR4配体结合位点的位点结合来增加GPR4的活性。
本发明包括诊断分析，用于确定受试者是否患有阿尔茨海默病或轻度认知损害，或是否有患阿尔茨海默病或轻度认知损害的风险。所述受试者为哺乳动物，最好为人类受试者。根据本发明，进行分析以确定受试者是否携带APOE4等位基因。如果是，则执行一个或多个分析以确定GPR4的表达水平或活性以及选自YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3的至少一个基因的表达。如果受试者的GPR4表达或活性降低，并且至少YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF中的一种降低，或ITGB3表达增加，则受试者患有阿尔茨海默病或轻度认知损害，或有患阿尔茨海默病或轻度认知损害的风险。在优选实施方案中，除了GPR4的测定之外，还测定YAP1的表达。
通过诊断分析收集受试者的组织、细胞或体液。测定组织、细胞或体液中的蛋白质或mRNA表达水平，并进行比较。在优选实施方案中，用于分析的从受试者收集的组织包括全血。在另一优选实施方案中，用于分析的从受试者收集的体液包括血浆、血清、痰、唾液、汗液、尿液、淋巴或脑脊液。在又一优选实施方案中，从受试者收集的细胞包括血细胞、颊细胞、皮肤成纤维细胞、神经细胞或淋巴细胞。在最优选的实施方案中，所述细胞是神经元细胞。
本发明包括用于鉴定用于治疗阿尔茨海默病和轻度认知损害的治疗剂的筛选分析。进行筛选分析，以测定分子对GPR4表达或活性的影响，以及选自YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3的至少一个基因的表达。所述筛选分析可以使用细胞，尤其是神经细胞，也可以是无细胞的。这些细胞可以从人类受试者或动物受试者身上获得。
本发明的筛选分析旨在确定分子对GPR4和至少一个选自YAPI、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3的基因的表达或活性水平的调节反应。如本文所用，术语“调节”是指转录基因、mRNA或蛋白质的功能或数量的任何活性变化，包括转录率或表达水平的任何变化。术语“变化”是指生物活性或表达水平的水平，是指数值在统计上不同于对照(即p<0.25，通常p<0.1，更常见的是p<0.05)。基因表达产物的基因表达或活性的术语“对照”是指细胞中的基因表达或基因表达产物的活性分别与之进行比较的标准水平。
优选的分析是优化速度、效率、信号检测和低试剂消耗。(Zhang等人，(1999)J.Biomolec.Screen.4(2):67)。可使用多种细胞或细胞提取物开发分析，优选但不限于神经细胞、神经祖细胞、分化神经元、少突胶质细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、人类胚胎肾细胞或其他细胞类型或其提取物。
在一些实施方案中，本发明的筛选分析，无论是细胞、细胞提取物还是基于基本纯化基因或基因表达产物的生物化学分析，都设计用于通过化学文库的高通量筛选来测试多种化合物(例如，数百万)。
可从众多可用资源或使用本领域已知的文库合成方法中的任何方法获得可筛选以鉴定调节剂的测试化合物的化学文库，包括：生物文库；空间寻址并行固相或溶液相库；需要反卷积的合成库方法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库方法；以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法仅限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽低聚物或化合物的小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。另见Dolleet al.(2010)Comprehensive Survey of Chemical Libraries for Drug Discovery andChemical Biology:2009.J.Comb.Chem.,2010,12(6),pp765–806。
分子文库合成方法的示例可在本领域中找到，例如：DeWitt等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermann等人.(1994).J.Med.Chem.37:2678；Cho等人.(1993)Science 261:1303；Carrell等人.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等人.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；and in Gallop等人.(1994)J.Med.Chem.37:1233。
对GPR4活性和/或表达水平以及选自YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3的至少一个基因表达水平进行成功调节的试验化合物是有吸引力的候选，可用于进一步研究和二次筛选替代分析治疗AD或轻度认知损害的潜在用途。当首次在筛选分析中被鉴定，化合物被考虑是“对治疗潜在有用”，因为众所周知，最初成功的苗头化合物(hit)很少包含成功药物所需的所有特征。然而，它们非常有用，可以让研究人员确定化合物之间共享的化学核心结构，从而有效调节目标活性。通常，当核心结构一旦确定，将进一步开发一个可能包含数千种相关化合物的广泛文库，目的是确定一种符合所有标准的先导化合物，即成功的候选药物。通过对多达数百万种化合物的多轮筛选，该分析被反复使用，以最终确定一小部分先导化合物，其中一种可能最终成为被认可的治疗剂。
在本发明的一些实施方案中，通过本发明方法鉴定的用于治疗AD或轻度认知损害的可能的先导分子呈现约50μM或更小、通常约100μM或更小、通常约50μM或更小、通常约10μM或更小、通常约为500nM或更小的50％活化浓度(EC50)。
本发明提供了治疗阿尔茨海默病或轻度认知损害患者的方法。本发明方法的临床应用包括治疗患有阿尔茨海默病或轻度认知损害的受试者的方法。
本发明的分子可经口施用，例如，使用惰性稀释剂或可同化的可食用载体，或可将其封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或将其压缩成片剂，或可直接与饮食中的食物结合。对于口服治疗给药，本发明分子可与赋形剂结合，并以可摄取片剂、口腔片剂、含片(troche)、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、圆药片等形式使用。此类组合物和制剂可含有至少0.1％的本发明分子。组合物和制剂的百分比可以改变，并且可以方便地在单位重量的约1％到约10％之间。本发明分子在此类有效治疗组合物中的量能获得合适的剂量。对根据本发明的优选组合物或制剂进行制备，使得口服剂量单位形式包含约1mg至约1000mg本发明分子。
片剂、含片、丸剂、胶囊等也可含有以下物质：粘合剂，如黄芩胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢钙；崩解剂，如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或添加调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式为胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以含有液体载体。各种其他材料可作为包衣存在，或以其他方式修改剂量单位的物理形式。例如，药片、药丸或胶囊可以用虫胶、糖或两者进行包裹。糖浆或酏剂可含有本发明的分子、蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯作为防腐剂、染料和如樱桃味或橙味的调味剂。当然，在制备任何剂量单位形式时使用的任何材料都应该是药物纯的，并且在使用量上基本无毒。此外，本发明的分子可包含在缓释制剂和制剂中。
本发明分子也可通过肠外给药。作为游离碱或药理学上可接受的盐的本发明分子溶液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。还可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物和油中制备分散液。在正常储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，可防止微生物生长。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是容易注射的流体。它在制造和储存条件下是稳定的，必须加以保护，以防细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当混合物和植物油的分散介质的溶剂。例如，可以通过使用如卵磷脂的包衣、在分散的情况下保持所需的粒径以及使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖或氯化钠，延迟可注射组合物吸收的吸延迟剂，例如单硬脂酸铝和明胶。
根据需要，将所需量的本发明分子与上述各种其他成分混合在适当的溶剂中，然后过滤灭菌，制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌活性成分加入含有基本分散介质和上述所列所需其他成分的无菌载体中制备分散体。对于无菌注射溶液无菌粉末的制备，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术可产生活性成分粉末以及先前无菌过滤溶液中的任何其他所需成分。
医生将确定最适合预防或治疗的本发明分子的剂量，该剂量将随施用形式和选择的特定分子而变化，也将随治疗中的特定受试者而变化。医生通常希望开始小剂量、小增量的治疗，直到达到这种情况下的最佳效果。治疗剂量通常可为约0.1至约1000mg/天，且优选约10至约100mg/天，或约0.1至约50mg/kg体重/天，且优选约0.1至约20mg/kg体重/天，并且可以几种不同的剂量单位施用。口服可能需要更高剂量，约为2倍至4倍。
本发明提供了对GPR4的治疗调节剂进行选择的方法，所述调节剂用于施用给患有或有可能患有阿尔茨海默病或轻度认知损害受试者。该方法包括测定受试者生物样品中基因的表达水平，所述基因选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3和VCL，并根据受试者是否显示出YAP1、CTGF、CCND3、BDNF或VCL的表达产物减少或所述样品中ITGB3表达产物增加来选择GPR4的所述治疗调节剂。所述生物样品包括来自所述受试者的组织、细胞或体液。在优选实施方案中，用于分析的从受试者收集的组织包括全血。在另一优选实施方案中，用于分析的从受试者收集的体液包括血浆、血清、痰、唾液、汗液、尿液、淋巴或脑脊液。在又一优选实施方案中，从受试者收集的细胞包括血细胞、颊细胞、皮肤成纤维细胞、神经细胞或淋巴细胞。
实施例
实施例1：携带纯合APOE4基因型(E4E4)或纯合APOE3基因型(E3E3)的人类等基因神经元的培养。商用人类等基因神经元取自Fujifilm Cellular Dynamics Inc。纯合APOE4基因型(E4E4)神经元被命名为DDP-NRC-1x 01434.779，在此称为E4E4神经元。纯合的APOE3基因型(E3E3)神经元被命名为R1013，在此称为E3E3神经元。神经元在96孔板中培养。在对神经元进行铺板之前，准备好制造商提供的完全培养基(complete maintenance medium)，并储存在4摄氏度下。首先在4摄氏度下将孔用聚-L-鸟氨酸包被过夜，用聚-L-鸟氨酸(PLO-Sigma；P4957)和层粘连蛋白(Sigma；L2020)对96孔板进行双重包被。用磷酸盐缓冲盐水冲洗微孔，然后加入浓度为10微克/毫升的磷酸盐缓冲盐水稀释的层粘连蛋白，持续3小时。将完全培养基平衡至室温。神经元在37摄氏度的水浴中解冻三分钟。通过添加1毫升室温平衡的完全培养基并使神经元悬浮，将小瓶的内容物转移到50ml锥形管中。将神经元悬液转移至50ml锥形管中。通过添加8毫升的完全培养基进一步稀释这种神经元悬浮液。进行活神经元计数，并将神经元以每平方厘米125000个神经元的神经元接种密度铺板于96孔板的各个孔中。将含有96孔板的E3E3和E4E4转移到细胞培养箱中，并在37摄氏度和5％CO2下培养。以这种方式铺板的E3E3和E4E4神经元被允许吸附到96孔板的孔上24小时，此时100％的培养基更换为新鲜的完全培养基。E3E3和E4E4神经元继续在37摄氏度和5％CO2下培养。在铺板后的第5天，通过去除50％的细胞上清液并添加相同体积的新鲜完全培养基来进行50％的培养基更换，然后在37摄氏度和5％CO2下继续培养96孔板。在铺板后第9天，通过去除50％的细胞上清液并添加相同体积的新鲜完全培养基，进行50％的培养基更换。在铺板后第9天，在用化合物处理神经元之前进行这种培养基更换。
实施例2：用示例性GPR4激动剂SLC2004和溶剂处理E4E4神经元，用溶剂处理E3E3神经元。如实施例1所述，在96孔板的单个孔中铺板和培养E4E4和E3E3神经元。化合物鞘氨醇磷酰胆碱(SLC2004)(Sigma；S4257)是一种冻干粉末，外观为白色至黄色，分子量为464.62道尔顿。以甲醇为溶剂，制备SLC2004储备浓度为300毫摩尔/升的新鲜储备溶液。将该储备溶液进一步稀释，以产生两种21倍于预期孔内浓度的浓缩溶液。对于其中一个21倍浓缩SLC2004溶液，向96孔板的每个孔中的200微升完全培养基中添加10微升21倍浓缩SLC2004溶液，可获得3微摩尔/升的最终SLC2004孔内浓度。对于第二个21倍浓缩SLC2004溶液，将10微升此21倍浓缩SLC2004溶液添加到96孔板每个孔中的200微升完全培养基中，可获得10微摩尔/升的最终SLC2004孔内浓度。所有包含经SLC2004处理的神经元的孔均在完全培养基中含有相同量的0.01％甲醇。同时，在无SLC2004的完全培养基中，在0.01％甲醇中培养E4E4神经元和E3E3神经元。这些样品用作溶剂对照。用SLC2004或溶剂(0.01％甲醇于完全培养基中)处理的E4E4神经元和用溶剂(0.01％甲醇于完全培养基中)处理的E3E3神经元在37℃和5％CO2条件下培养6小时。
实施例3：用示例性GPR4拮抗剂SLC2002和溶剂处理E3E3神经元，并用溶剂处理E4E4神经元。如实施例1所述，在96孔板的单个孔中铺板和培养E4E4和E3E3神经元。化合物SLC2002是一种冻干粉末，外观为白色至黄色，分子量为479.66道尔顿。在甲醇中制备SLC2002的储备浓度为100毫摩尔/升的新鲜储备溶液。进一步稀释该储备溶液，得到21倍浓缩溶液。通过在96孔板的每个孔中向200微升完全培养基中添加10微升21倍浓缩SLC2002溶液，最终得到最终浓度为1微摩尔/升的SLC2002。所有含有SLC2002处理神经元的孔都含有相同量的溶剂(0.01％甲醇于完全培养基中)。同时，在没有SLC2002的情况下，用溶剂(0.01％甲醇完全培养基)培养E4E4神经元和E3E3神经元。这些样品用作溶剂对照。用SLC2002或溶剂(0.01％甲醇在完全培养基中)处理的E3E3神经元和用溶剂(0.01％甲醇于完全培养基中)处理的E4E4神经元在37℃和5％CO2下培养12小时。
实施例4：收集经处理的E4E4和E3E3神经元，用于分析GPR4激动剂活性。后续分析SLC2004对E4E4神经元影响的神经元材料是通过将E4E4神经元与SLC2004或溶剂培养6小时和E3E3神经元与溶剂培养6小时生成的，如实施例2所述。在6小时培养期结束时，从96孔板的每个孔中去除完全培养基。这些神经元在100微升磷酸盐缓冲液中从每个孔中分离出来，转移到一个新鲜的试管中，在225g下离心三分钟。吸入约15微升磷酸盐缓冲液，将神经元颗粒快速冷冻在干冰上，并在-80摄氏度下储存，直至分析。
实施例5：收集经处理的E4E4和E3E3神经元用于分析GPR4拮抗剂活性。用于随后分析SLC2002对E3E3神经元影响的神经元材料是通过将E3E3神经元与SLC2002或溶剂培养12小时和将E4E4神经元与溶剂培养12小时生成的，如实施例3所述。在12小时培养期结束时，从96孔板的每个孔中去除完全培养基。在100微升磷酸盐缓冲盐水中从每个孔中分离神经元，转移到新鲜试管中，并在225g下离心三分钟。吸入约15微升磷酸盐缓冲盐水，将神经元颗粒快速冷冻在干冰上，并在-80摄氏度下储存，直至分析。
实施例6：定量聚合酶链反应分析，以确定对基于GPR4的处理有反应的基因的表达水平。使用Direct-zolTM RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research，尔湾，加利福尼亚州；目录号R2050)按照制造商的说明从实施例4和5中所述的每个快速冷冻神经元颗粒中提取总RNA，可选择柱上DNA酶处理。从经典型激动剂SLC2004或溶剂处理的E4E4神经元以及经溶剂处理的E3E3神经元中提取总RNA，培养6小时。还从用典型拮抗剂SLC2002或溶剂处理的E3E3神经元以及在培养12小时后用溶剂处理的E4E4神经元中提取总RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)测定RNA浓度和纯度。根据制造商的说明，使用Agilent 2100生物分析仪(AgilentTechnologies，加利福尼亚州帕洛阿尔托)和RNA 6000纳米芯片试剂盒测定RNA完整性。随后，使用3微克总RNA作为模板，使用高保真cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，福斯特市，加利福尼亚州，目录号4368814)合成cDNA。聚合酶链反应(PCR)产物的检测是通过在反应中使用荧光报告分子来实现的，该反应随着产物DNA数量的增加而产生更多的荧光。采用双链DNA插入分子SYBR
Figure BDA0003734383590000151
的检测方法来确定编码YAP1、BDNF、CTGF、CCND3、VCL和ITGB3基因的蛋白质的基因表达水平。实时PCR在BioRadCFX384实时系统(BioRad，加利福尼亚州海格立斯市)上进行，使用专门设计的正向和反向扩增引物检测每个目标基因YAPI、BDNF、CTGF、CCND3、VCL和ITGB3。每个反应孔包含5微升的PowerUpTM SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems；目录号A25742)，13ng总RNA当量的cDNA和250nM正向和反向扩增引物，最终反应体积为10微升。在本发明中，使用引物3xxix和QuantPrimexxx设计所有分析的引物。进行熔解曲线分析以确保所有引物对的单一产物扩增。循环条件如下：95℃1分钟聚合酶激活，然后是95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。以细胞色素cl(CYCl)和核糖体蛋白L13(RPL13)为参考基因。每个定量qPCR实验包括扩增和数据整理，均重复三次。使用BioRad 3.1版的CFX Manager软件进行数据分析。对照内源性对照品校准实验Cq(循环量化)。使用相对定量分析(双ΔCt数据分析，ΔΔCt方法)实现核酸定量。相对量化允许确定测试细胞系中目标基因表达相对于对照细胞系的倍数差异。首先，根据原始荧光值从原始数据中减去基线。接下来，确定每个样品的阈值周期(Ct)值，该值表示达到特定量化阈值荧光信号水平所需的循环数。Ct值是为了评估基因和参考基因出于归一化化目的而确定的。在所有神经元样本中，测定目标基因和参考基因(指定为“Ref”)的平均Ct值。
实施例7：确定示例性GPR4激动剂对E4E4神经元中表达基因的影响。为进行配对比较，以下四个值由SLC2004处理的E4E4样品和E4E4溶剂对照产生：SLC2004处理的E4E4中Ref的平均Ct、溶剂处理的E4E4中的Ref平均Ct、SLC2004处理的E4E4中目标基因的平均Ct和溶剂处理的E4E4中目标基因的平均Ct。对用SLC2004处理的E4E4和用溶剂处理的E4E4的目标基因和参考基因的Ct值之间的差异(ΔCt值，短dCt)进行计算。接下来，对用SLC2004处理的E4E4与用溶剂处理的E4E4之间的差值进行计算，以得出双ΔCt值(ddCt用SLC2004处理的E4E4–用溶剂处理的E4E4)。由于每个循环中扩增产物的数量加倍，用以下公式2-ddCt计算用SLC2004处理的E4E4和用溶剂处理的E4E4之间的表达倍数变化(相对定量或RQ(用SLC2004处理的E4E4/用溶剂处理的E4E4))。用溶剂处理的E3E3神经元与用SLC2004处理的E4E4神经元的处理方式相同，以产生与溶剂处理的E4E4神经元相比的相关基因表达水平。采用单因素方差分析和Dunnett事后检验进行统计分析，以进行多重比较。
实施例8：确定示例性GPR4拮抗剂对E3E3神经元中基因表达的影响。对于配对比较，以下四个值是由SLC2002处理过的E3E3样品和E3E3溶剂对照产生的：SLC2002处理过的E3E3中Ref的平均Ct、溶剂处理过的E3E3中Ref的平均Ct、SLC2002处理过的E3E3中目标基因的平均Ct和溶剂处理的E3E3中目标基因的平均Ct。计算用SLC2002处理的E3E3和用溶剂处理的E3E3的目标基因和参考基因的Ct值之间的差异(ΔCt值，短dCt)。接下来，计算用SLC2002处理的E3E3与用溶剂处理的E3E3之间的差异，以得出双ΔCt值(ddCt用SLC2002处理的E3E3-用溶剂处理的E3E3)。由于每个循环中扩增产物的数量翻了一番，使用以下公式2-ddCt计算用SLC2002处理的E3E3和用溶剂处理的E3E3之间的表达倍数变化(相对定量或RQ(用SLC2002处理的E3E3/用溶剂处理的E3E3))。用溶剂处理的E4E4神经元与用SLC2002处理的E3E3神经元的处理方式相同，以产生与溶剂处理的E3E3相比的相关基因表达水平。使用单因素方差分析进行统计分析，然后使用Dunnett的事后检验进行多重比较。
实施例9：携带E4E4和E3E3基因型的人类等基因神经元中的基因表达。对如先前实施例中所公开的所生成样品进行如实施例6、7和8中所公开基因的表达水平分析。这些基因包括YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3。与E3E3神经元相比，E4E4神经元中这些基因的差异表达如图1所示。相对表达水平表示为平均值±平均值的标准误差。通过非配对双尾t检验对E3E3神经元和E4E4神经元中这些基因的表达水平进行统计分析。P值显示为星号，具有以下含义：(*)P<0.05、(**)P<0.01、(***)P<0.001和(****)P<0.0001。对E4E4溶剂处理(E4E4 VC)和E3E3溶剂处理(E3E3 VC)神经元的比较表明，与E3E3溶剂处理(E3E3VC)神经元相比，E4E4溶剂处理(E4E4 VC)神经元中YAP1、VCL、CCND3、CTGF和BDNF的表达下调。与E3E3溶剂处理(E3E3 VC)神经元相比，E4E4溶剂处理(E4E4 VC)神经元的ITGB3表达上调。
实施例10：用示例性GPR4激动剂SLC2004处理E4E4神经元可调节基因的表达。对如先前实施例中所公开的所生成的样品进行如实施例7中所公开的基因的表达水平分析。这些基因包括YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3。与E4E4 SLC2004处理的神经元相比，E4E4溶剂处理的神经元中这些基因的差异表达如图2所示。相对表达水平表示为平均值±平均值的标准误差。E3E3溶剂处理的神经元被示出用于比较。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行Dunnett’s多重比较试验，比较E4E4溶剂处理神经元与E4E4 SLC2004处理神经元和E3E3溶剂处理神经元中这些基因的表达水平。P值显示为星号，具有以下含义：(*)P<0.05、(**)P<0.01、(***)P<0.001和(****)P<0.0001。对用SLC2004处理的E4E4神经元和用E4E4溶剂处理的神经元进行比较，结果表明，在10微摩尔/升的SLC2004处理后，YAP1、CTGF和BDNF的表达上调(图2)。对用SLC2004处理的E4E4神经元和用E4E4溶剂处理的神经元进行比较，结果表明，用3个微摩尔/升的SLC2004处理后，VCL和CCND3的表达上调(图2)。在3微摩尔/升SLC2004处理后，ITGB3下调(图2)。
实施例11：用示例性GPR4拮抗剂SLC2002处理E3E3E3神经元可调节基因的表达。对如先前实施例中所公开的所生成的样品进行如实施例8中所公开的基因表达水平分析。这些基因包括YAP1、VCL、CCND3、CTGF、BDNF和ITGB3。图3显示了E3E3溶剂处理神经元与E3E3SLC2002处理神经元中这些基因的差异表达。相对表达水平显示为平均值±平均值的标准误差。示出了E4E4溶剂处理的神经元用于比较。通过单因素方差分析和Dunnett’s多重比较试验进行统计分析，比较E3E3溶剂处理神经元与E3E3 SLC2002处理神经元中YAP1、VCL、CCND3、CTGF和BDNF基因的表达水平。采用单因素方差分析和Fisher最小显著性差异检验对E3E3溶剂处理神经元与E3E3 SLC2002处理神经元和E4E4溶剂处理神经元的ITGB3水平进行统计分析。P值显示为星号，具有以下含义：(*)P<0.05、(**)P<0.01、(***)P<0.001和(****)P<0.0001。对用SLC2002处理的E3E3神经元和E3E3溶剂处理的神经元进行比较，发现在1微摩尔/升SLC2002处理后，YAP1、VCL、CCND3、CTGF和BDNF的表达下调(图3)。1微摩尔/升SLC2002处理后ITGB3上调(图3)。
本发明的其他目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员来说，在检查其以下示例后将变得显而易见，这些示例并不旨在限制本发明。在这些例子中，建设性地简化为实践的程序用现在时态描述，在实验室中执行的程序用过去时态描述。
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Claims (34)

1.一种治疗被诊断患有或易感阿尔茨海默病或轻度认知损害的受试者的方法，所述方法包括：
施用有效治疗量的增加GPR4活性的分子。
根据权利要求1所述的方法，其中所述施用增加受试者中选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达，或减少ITGB3的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为GPR4的激动剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为GPR4的正变构调节剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人类。
5.根据权利要求1所述的方法，其中受试者携带APOE4等位基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其中与APOE3等位基因纯合的人相比，受试者表现出选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因表达减少或ITGB3的表达增加。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述有效治疗量增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达，或减少ITGB3的表达，使其达到与APOE3等位基因纯合的人相当的水平。
8.一种测定可用于治疗受试者阿尔茨海默病或轻度认知损害的GPR4调节剂的治疗效果的方法，所述方法是通过测定GPR4调节剂对选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3和VCL的基因在携带APOE4等位基因的神经元细胞和在与APOE3等位基因纯合的神经元细胞中的差异表达的影响来进行的，其中，如果调节剂增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的基因的表达或减少ITGB3的表达，则调节剂在治疗上有效。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述神经元细胞是APOE4等位基因纯合的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述调节剂为小分子。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述调节剂为GPR4的激动剂。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述调节剂为GPR4的正变构调节剂。
13.根据权利要求8所述的方法，其中该神经元细胞维持在细胞培养物中。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述神经元细胞位于类器官中。
15.根据权利要求8所述的方法，其中该神经元细胞为人类神经元细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述人类神经元细胞位于患有阿尔茨海默病或轻度认知损害的个体的大脑中。
17.一种诊断具有阿尔茨海默病或轻度认知损害风险的APOE4等位基因杂合或纯合受试者的方法，包括：
确定GPR4表达产物的表达水平或活性；
确定所述受试者的组织、细胞或体液中选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3和VCL的至少一个基因的表达产物的水平；
其中，对于GPR4，基因表达或活性降低，并且
对于YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL中的至少一种，基因的表达产物水平的降低或ITGB3的增加表明阿尔茨海默病或轻度认知损害的风险升高。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者为人类。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者是APOE4等位基因纯合的。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞为人类淋巴细胞。
21.一种对GPR4治疗调节剂进行选择以用于给患有或有可能患有阿尔茨海默病或轻度认知损害的受试者施用的方法，所述方法包括：
测定受试者生物样本中选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、ITGB3和VCL的基因的表达水平，以及
根据受试者在所述样本中是否显示YAP1、CTGF、CCND3、BDNF或VCL的表达产物减少或ITGB3的表达产物增加，对所述治疗调节剂进行选择。
22.一种筛选分析方法，用于鉴定选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3的基因或蛋白质的表达调节剂，包括：
提供具有APOE4等位基因的细胞，并测定选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3的至少一个基因或蛋白质的表达，将细胞暴露于GPR4活性调节剂中，
并测定暴露后细胞中选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3的至少一个基因或蛋白质的表达，以及
鉴定改变YAP1、CTGF、CCND3、BDNF、VCL和ITGB3中至少一种的基因或蛋白质表达的调节剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述调节剂为小分子。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞为神经元细胞。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞为淋巴细胞。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞维持于细胞培养物中。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是APOE4等位基因纯合的。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述神经元细胞位于类器官中。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞为人类细胞。
30.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞为小鼠细胞。
31.根据权利要求22所述的方法，其中所述调节剂增加选自YAP1、CTGF、CCND3、BDNF和VCL的至少一个基因的表达。
32.根据权利要求22所述的方法，其中所述调节剂降低ITGB3的表达。
33.根据权利要求22所述的方法，其中所述人类神经细胞位于患有阿尔茨海默病或轻度认知损害的个体的大脑中。
34.根据权利要求22所述的方法，其中所述筛选为高通量筛选。
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