JP2023510297A - アルツハイマー病の治療 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アルツハイマー病及び軽度認知障害の診断、治療及び予防のために、特定のＧＰＲ４調節遺伝子及びその発現産物（すなわち、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ、ＩＴＧＢ３）を使用する組成物及び方法を提供する。本発明はまた、ＧＰＲ４調節遺伝子の差次的発現に基づいてアルツハイマー病又は軽度認知障害を治療及び診断するための治療剤を同定する方法に関する。

Description

優先権の主張
本出願は、２０２０年１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／９５７，９９９号の優先権を主張する。
本発明は、ＧＰＲ４及び／又は１つもしくは複数のＧＰＲ４調節遺伝子、又はそれらの発現産物をモジュレーションすることに基づく、アルツハイマー病及び／又は神経障害、限定されないが、例えば軽度認知障害を予防及び治療する方法に関する。
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は、世界中の数千万の人々に影響を及ぼしており、その有病率は上昇し続けている。残念ながら、現在のところ、ＡＤの診断、治療又は予防のための信頼性が高く効果的な方法はない。ＡＤは、環境、生活様式、医学的状態及び遺伝的要因の組み合わせによって引き起こされると考えられている。ＡＤは、いくつかの処置が最も効果的であり得る初期段階では認識されないことが多い。現在ＦＤＡが承認しているアルツハイマー薬は、有意な副作用を有し、患者の日常機能の改善には中程度の効果しかないが、疾患の進行を遅らせることも、根底にある病態を治療することもない。
アルツハイマー病の分子的根本原因：ＡＤ研究の大部分は、過剰リン酸化微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）のアミロイド斑及び神経原線維変化の蓄積に焦点を当ててきた。シナプス機能不全、シナプス可塑性の障害及び樹状突起の喪失も観察されるｉ。ＡＭＰＡＲ（α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソキサゾールプロピオン酸受容体）サブユニットであるＧＬＵＲ２の選択的喪失は、斑形成の前でさえ起こるｉｉ。研究はまた、ＡＤが神経細胞周期調節及び細胞周期再突入における機能不全を伴うことを示唆しているｉｉｉ。さらに、ニューロフィラメント光の発現は、対照と比較してＡＤ患者において著しく減少するｉｖ。皮質及び海馬におけるＳｏｒＬＡ（ＳｏｒＬ１／Ｓｏｒｔｉｌｉｎ関連受容体）の２５％の減少もまた、ＡＤ患者の剖検材料及び脳脊髄液において認められているｖ。
ＡＰＯＥ４－ＡＤにおける優性遺伝因子。ＡＤの可能性のある治療への興味深い手がかりの１つは、１９９０年代初期に、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子の特定の対立遺伝子、すなわちＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有する人々がＡＤを発症するリスクが実質的に高いことを明らかにした遺伝子研究に由来する。ＡＰＯＥ３は、ＡＰＯＥのすべての公知の機能についての通常のアイソフォームである。ＡＰＯＥ４変異体は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８ ｐａｔｃｈ ｒｅｌｅａｓｅ ２／ＧＲＣｈ３８．ｐ２の１９番染色体上の１９：４４９０８６８４の位置にＧを有する（一塩基多型ｒｓ４２９３５８）。臨床的及び疫学的データは、ＡＤ患者の６０％超がＡＰＯＥ４保有者でありｖｉ、ＡＰＯＥ４の浸透率は集団及び研究に応じて６０～７０％であると推定されることを示している。ＡＰＯＥ４は、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有していない対象についての臨床的発症の平均年齢が８４歳に対して、ＡＰＯＥ４ホモ接合体についての臨床的発症の平均年齢が６８歳である、より早い発症年齢に関連するｖｉｉ。両方の１９番染色体にＡＰＯＥ４遺伝子型を保有するホモ接合ニューロンは、本明細書ではＥ４Ｅ４ニューロンと呼ばれる。両方の１９番染色体にＡＰＯＥ３遺伝子型を保有するホモ接合ニューロンは、本明細書ではＥ３Ｅ３ニューロンと呼ばれる。
対象は、遺伝的背景によってＡＤ又は軽度認知障害を発症する素因がある。ＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有する対象は、ＡＤ又は軽度認知障害を発症するリスクが実質的に高い。素因がある対象は、ＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合性又はヘテロ接合性であり得る。さらに、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）又はプレセニリン－２（ＰＳＥＮ２）の変異体を含むＡＤ家族性変異体を保有する対象は、ＡＤ又は軽度認知障害を発症するリスクが実質的に高い。
エンハンサーは、細胞型特異的転写因子の結合を通じてそれらの調節機能を発揮する。驚くべきことに、予想外にも、実験的に定義された真核生物の転写因子結合部位のＪＡＳＰＡＲ ＣＯＲＥデータベースを使用して、ＡＰＯＥ４変異体が転写因子ＮＲＦ１（核呼吸因子１）の結合モチーフを形成することが見出されたｖｉｉｉ。ＡＰＯＥ４変異体は、ＮＲＦ１コンセンサス配列のヌクレオチド頻度マトリックス中に出現しない非コンセンサスＡヌクレオチドを、高度に保存されたコンセンサス一致Ｇヌクレオチドに変化させる。ＮＲＦ１タンパク質配列は、受託番号Ｑ１６６５６－１で「ＮＲＦ１＿ＨＵＭＡＮ」としてＵｎｉＰｒｏｔＫＢに寄託されている。ＮＲＦ１は、エネルギー消費、エネルギー生成、及びニューロン活性の間のカップリングにおいて重要な役割を果たす重要な代謝及びミトコンドリア遺伝子の発現を媒介するホモ二量体転写因子であるｉｘ。
エンハンサーに結合する転写因子は、遺伝子転写の刺激又は代替的に抑制をもたらす。エンハンサーは、同じ染色体上の２Ｍｂ離れたシスに位置する遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子のプロモーターに見られるのと同じ調節エレメントを含有する。遠位エンハンサーとプロモーターとの間の接触は、「ループ形成」因子の特異的な動員によって設定される。ＡＰＯＥ４変異体を保有するニューロンにおいて、トリガー特異的転写因子ＮＲＦ１は、その近傍のいくつかの遺伝子の転写に影響を及ぼす二次クロマチンループの形成を誘導する。この発見により、ＡＰＯＥ４対立遺伝子が脳細胞において転写効果を引き起こし、ＧＰＲ４（Ｇタンパク質共役受容体４；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに「ＧＰＲ４＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ４６０９３）の発現を含む一連の遺伝子の転写を変化させていることが明らかになったｘ。対照的に、ＡＰＯＥ３は、高スコアＮＲＦ１結合部位をもたらさず、したがって、典型的には、近くの遺伝子の転写調節に影響を及ぼさない。ＡＰＯＥ４遺伝子座をＡＰＯＥ４の近傍の遺伝子に対するＮＲＦ１活性に結び付ける発見のさらなる詳細は、ＰＣＴ特許出願国際公開第２０１８／１１２４４６号パンフレットに記載されている。
本発明は、ＧＰＲ４の活性をモジュレーションすることによるアルツハイマー病又は軽度認知障害の治療方法を提供する。ＧＰＲ４活性のモジュレーションは、ＧＰＲ４によって調節又は影響を受ける遺伝子をモジュレーションするという利点を提供する。治療化合物をスクリーニングする方法及び疾患又は疾患の素因を診断する方法も提供される。
一態様では、本発明は、アルツハイマー病の治療法としてのＧＰＲ４のモジュレーションを提供する。ＧＰＲ４のモジュレーションは、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３を含むＥ３遺伝子型を保有するホモ接合ニューロン（Ｅ３Ｅ３ニューロン）と比較して、Ｅ４遺伝子型を保有するニューロンにおいて差次的に調節される遺伝子の発現をモジュレーションする。この差次的発現は、図１に開示されている。
この態様のある特定の実施形態において、対象は、ＡＰＯＥ４についてホモ接合性（Ｅ４Ｅ４ニューロン）である。他の実施形態において、対象は、ＡＰＯＥ４対立遺伝子についてヘテロ接合性である。
本発明の一態様は、アルツハイマー病又は軽度認知障害と診断された、又はその素因を有する対象の治療方法であって、ＧＰＲ４の活性を増加させる分子の治療有効量を投与することを含む、治療方法を提供する。
この態様の好ましい実施形態では、治療有効量は、神経細胞におけるＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる。
この態様の好ましい実施形態では、治療法は、ＧＰＲ４のアゴニストで対象を治療することを含む。
この態様の好ましい実施形態では、治療法は、ＧＰＲ４の正のアロステリックモジュレーターで対象を治療することを含む。
この態様の好ましい実施形態では、対象はヒトである。
この態様の好ましい実施形態では、対象は、ＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性である対象と比較して、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の減少又はＩＴＧＢ３の発現の増加を示す。
この態様の好ましい実施形態において、治療有効量は、ＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性であるヒトに匹敵するレベルまで、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる。
本発明の一態様は、アルツハイマー病又は軽度認知障害の対象の治療に潜在的に有用なモジュレーターの治療有効性を測定する方法を提供する。好ましい実施形態では、ＡＰＯＥ４変異体を保有する神経細胞対ＡＰＯＥ３変異体を保有する神経細胞におけるＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される遺伝子の差次的発現のモジュレーションを評価する。モジュレーターがＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる場合、モジュレーターは治療上有効である。
この態様の好ましい実施形態では、モジュレーターは小分子である。
この態様の好ましい実施形態では、モジュレーターはＧＰＲ４のアゴニストである。
この態様の好ましい実施形態では、モジュレーターはＧＰＲ４の正のアロステリックモジュレーターである。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞はヒト神経細胞である。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞は細胞培養物中で維持される。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞はオルガノイド内に位置する。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞はヒトの脳に位置する。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有する個体の脳に位置する。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞はＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合性である。
この態様の好ましい実施形態では、対象は、ＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性である対象と比較して、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の減少又はＩＴＧＢ３の発現の増加を示す。
この態様の好ましい実施形態において、治療有効量は、ＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性であるヒトに匹敵するレベルまで、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる。
本発明の一態様は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有するリスクがあるＡＰＯＥ４対立遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性の対象を診断する方法であって、ＧＰＲ４の発現産物の発現又は活性のレベルを決定することと、上記対象の組織、細胞又は体液中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現産物のレベルを決定することとを含む方法を提供する。ＧＰＲ４について、遺伝子発現又は活性が低下し、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬの少なくとも１つについて、遺伝子の発現産物のレベルの減少、又はＩＴＧＢ３について増加が見られる場合、これは、アルツハイマー病又は軽度認知障害のリスク上昇を示す。
この態様の好ましい実施形態では、対象はヒトである。
この態様の好ましい実施形態では、対象はＡＰＯＥ４遺伝子型についてホモ接合性である。
本発明の一態様は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有するか、又は有するリスクがある対象に投与するためのＧＰＲ４の治療モジュレーターを選択する方法であって、対象からの生物学的試料中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される遺伝子の発現レベルを測定することと、対象が上記試料中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦもしくはＶＣＬについてのその発現産物の減少又はＩＴＧＢ３についての発現産物の増加を示すか否かに基づいて、上記治療モジュレーターを選択することとを含む方法を提供する。
本発明の一態様は、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３の中から選択される遺伝子又はタンパク質の発現のモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイであって、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を有する細胞を提供することと、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現を測定することとを含むスクリーニングアッセイを提供する。細胞を、ＧＰＲ４活性のモジュレーターであるモジュレーターに曝露し、細胞におけるＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現を、曝露後に測定する。ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３の少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現を変化させるモジュレーターが同定される。
この態様の好ましい実施形態では、モジュレーターは小分子である。
この態様の好ましい実施形態では、細胞は神経細胞である。
この態様の好ましい実施形態では、細胞はリンパ球である。
この態様の好ましい実施形態では、細胞は細胞培養物中で維持される。
この態様の好ましい実施形態では、細胞はＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合性である。
この態様の好ましい実施形態では、神経細胞はオルガノイド内に位置する。
この態様の好ましい実施形態では、細胞はヒトである。
この態様の好ましい実施形態では、細胞はマウスである。
この態様の好ましい実施形態では、モジュレーターは、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させる。
この態様の好ましい実施形態では、モジュレーターは、ＩＴＧＢ３の発現を減少させる。
この態様の好ましい実施形態では、ヒト神経細胞は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有する個体の脳に位置する。
この態様の好ましい実施形態では、スクリーンはハイスループットスクリーンである。
ホモ接合Ｅ３Ｅ３ニューロンと比較した、ホモ接合Ｅ４Ｅ４ニューロンにおける遺伝子ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３の相対的発現レベルを示す。相対的発現レベルを、平均±平均の標準誤差として示す。
ＳＬＣ２００４処理ホモ接合Ｅ４Ｅ４ニューロン及びホモ接合ビヒクル処理Ｅ３Ｅ３ニューロンと比較した、ホモ接合ビヒクル処理Ｅ４Ｅ４ニューロンにおける遺伝子ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３の相対的発現レベルを示す。相対的発現レベルを、平均±平均の標準誤差として示す。
ＳＬＣ２００２処理ホモ接合Ｅ３Ｅ３ニューロン及びホモ接合ビヒクル処理Ｅ４Ｅ４ニューロンと比較した、ホモ接合ビヒクル処理Ｅ３Ｅ３ニューロンにおける遺伝子ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３の相対的発現レベルを示す。相対的発現レベルを、平均±平均の標準誤差として示す。
ＧＰＲ４自体は、ホモ接合ＡＰＯＥ３遺伝子型を有するヒトニューロン（Ｅ３Ｅ３ニューロン）と比較して、ホモ接合ＡＰＯＥ４遺伝子型を有するヒトニューロン（Ｅ４Ｅ４ニューロン）における発現が有意に低下している、国際公開第２０１８／１１２４４６号パンフレットに列挙されているＡＰＯＥ４モチーフ媒介遺伝子である。本発明は、ＧＰＲ４のモジュレーター（例えば、ＧＰＲ４発現レベル又は活性を増加させる分子）を使用して、正常なＥ３Ｅ３ニューロンで観察される表現型に対応する適切なＧＰＲ４活性を回復させることができることを認識する。
ＧＰＲ４（Ｇタンパク質共役受容体４；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに「ＧＰＲ４＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ４６０９３）。ＧＰＲ４は、ヒスチジン残基のプロトン化を介して細胞外酸性ｐＨによって活性化されるＧタンパク質共役受容体であるｘｉ。ＧＰＲ４シグナル伝達は、ｃＡＭＰ／ＥＰＡＣ／Ｒａｐ１経路の活性化を可能にするＧアルファｓ（Ｇｓ）ｘｉｉ及び小型ＧＴＰアーゼＲｈｏＡ／ＲＯＣＫを刺激するＧアルファ１２／１３（Ｇ１２／１３）ｘｉｉｉを介して進行する。ＧＰＲ４の低ｐＨ刺激は、アクチンストレスファイバーｘｉｖ、細胞接着ｘｖ及び焦点接着動態ｘｖｉの形成に役割を果たす。シナプス活性は、海馬薄片における細胞外ｐＨの一過性低下に関連するｘｖｉｉ。Ｇｓ及びＧ１２／１３経路の刺激は、インテグリン活性化ならびにＹｅｓ関連タンパク質１（Ｙｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １，ＹＡＰ１）によって制御された焦点接着の構築及び成熟を可能にし、細胞骨格再編成、樹状突起スパイン拡張及びシナプス可塑性をもたらすｘｖｉｉｉ。
ＧＰＲ４は、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３を含む遺伝子の発現に影響を及ぼし、遺伝子発現産物のモジュレーションをもたらす。遺伝子発現産物は、任意のマイクロＲＮＡもしくはｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ転写物が一次、スプライシング、編集、修飾又は成熟のいずれであろうと）又はｍＲＮＡ転写から翻訳されたポリペプチドなどの、そのような遺伝子に基づく任意のＲＮＡ転写物を含むそのような遺伝子の転写産物を含む。そのようなポリペプチドは、新生タンパク質であり得るか、又は成熟もしくは修飾タンパク質にプロセシングされ得る。発現産物の量は、産物の発現レベルとして定性的又は定量的に測定及び記載され得る。
ＹＡＰ１（Ｙｅｓ関連タンパク質１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに転写コアクチベーターＹＡＰ１「ＹＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ４６９３７）は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の下流エフェクターである。ＴＥＡドメインファミリーからの転写因子と複合体を形成するＹＡＰ１は、細胞拡散、増殖及び遊走、グルコース取り込み及び代謝を含む様々な細胞プロセスを調節する。ＹＡＰ１発現は、Ａβ沈着又はタウタングルの発症前のＡＤ患者において非常に早期に減少するｘｉｘ。ＹＡＰ１は、焦点接着の構築及び成熟ｘｘ、ならびに細胞骨格再編成、樹状突起スパイン拡張及びシナプス可塑性に必要な経路の活性化を制御する。
ＧＰＲ４シグナル伝達経路とＹＡＰ１の機能及び発現との関連は文献では不確実である。ある状況では、ＧＰＲ４はＹＡＰ１の抑制を媒介しｘｘｉ、別の状況では、ＧＰＲ４シグナル伝達はＹＡＰ１制御細胞増殖及び生存を促進するｘｘｉｉ。本発明は、ＧＰＲ４のモジュレーションに基づく治療法が、ＡＰＯＥ４対立遺伝子の存在下でのＹＡＰ１の発現のモジュレーションをもたらすことを示す。
ＧＰＲ４シグナル伝達経路は、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有する細胞で観察されるようなＧＰＲ４のレベルの低下によって、又はＧＰＲ４をＹＡＰ１の機能及び発現に結び付けるシグナル伝達経路の要素の下方制御又は阻害によって下方制御される。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）又はプレセニリン－２（ＰＳＥＮ２）の変異体を含むＡＤ家族性変異体の保有者において変異した遺伝子は、ＧＰＲ４をＹＡＰ１の機能及び発現に結び付けるシグナル伝達経路に配置され得る。
ＧＰＲ４活性は、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有する細胞において低下し、本明細書中に記載のように、他の遺伝子の発現低下をもたらす。発現低下のカスケードは、アルツハイマー病又は軽度認知障害の素因、すなわち疾患状態の一因となる。ＧＰＲ４発現を低下させる他のエフェクターが存在する場合、非ＡＰＯＥ４バックグラウンドにおいてもＧＰＲ４が減少する可能性がある。いずれの場合も、ＧＰＲ４活性が低下している場合、ＧＰＲ４の活性を増加させることに基づく治療法は、カスケードによって引き起こされる疾患の経過を予防、遅延、低減又は逆転させる治療法として有用である。
ＶＣＬ（ビンキュリン；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに「ＶＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ１８２０６）は、焦点接着形成及びインテグリン動態を制御する焦点接着タンパク質である。
ＣＣＮＤ３（サイクリンＤ３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにＧ１／Ｓ特異的サイクリン－Ｄ３「ＣＣＮＤ３＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ３０２８１）は、細胞周期タンパク質であり、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６キナーゼの調節サブユニットである。ＣＣＮＤ３は静止細胞に蓄積し、有糸分裂後の停止に関与するｘｘｉｉｉ。
ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２（ＣＣＮ２、細胞通信ネットワーク因子２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにＣＣＮファミリーメンバー２「ＣＣＮ２＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ２９２７９）は、インテグリン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンに直接結合し、したがって複数の細胞内シグナル伝達経路を活性化する分泌タンパク質であるｘｘｉｖ。
ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに「ＢＤＮＦ＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ２３５６０）は、ニューロンの生存を促進する神経成長因子である。ＢＤＮＦは、成体のシナプス可塑性において重要な機能を果たす。ＡＤではＢＤＮＦの発現が低下するｘｘｖ。
ＩＴＧＢ３（インテグリンサブユニットベータ３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにインテグリンベータ－３「ＩＴＢ３＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ０５１０６）は、恒常性シナプススケーリングに必要である。シナプス後ニューロンにおけるβ３インテグリンの接着及び表面レベルは、シナプス強度及びＡＭＰＡＲサブユニットであるシナプスＧＬＵＲ２（ＧＲＩＡ２、グルタミン酸イオノトロピック受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにグルタミン酸受容体２「ＧＲＩＡ２＿ＨＵＭＡＮ」として、受託番号Ｐ４２２６２）の存在量と直接相関するｘｘｖｉ。
ＧＰＲ４のモジュレーターには、ＧＰＲ４の活性を変化させる分子が含まれる。モジュレーターには、ＧＰＲ４のアゴニスト又はアンタゴニストである分子が含まれる。ＧＰＲ４アゴニストはＧＰＲ４の活性を増加させ、ＧＰＲ４アンタゴニストはＧＰＲ４の活性を減少させる。分子には、小分子化学化合物及び大分子生物学的化合物が含まれる。生物学的化合物には、ＧＰＲ４に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）又はＧＰＲ４と相互作用するタンパク質もしくは補因子を含有するＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体及び抗体の抗原結合断片が含まれる。
小分子は、２０００ダルトン未満、好ましくは１５００ダルトン未満、最も好ましくは９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物である。
ＧＰＲ４アゴニストは、ＧＰＲ４の活性を増加させ、それによってＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦの場合、ＧＰＲ４アゴニスト効果は発現レベルの増加であり、ＩＴＧＢ３の場合、ＧＰＲ４アゴニスト効果は発現レベルの減少である。
ＧＰＲ４の例示的なアンタゴニストは、当業者に公知である。ＳＬＣ２００２は、ＧＰＲ４の例示的なアンタゴニストであり、引用文献では化合物３ｂと呼ばれるｘｘｖｉｉ。ＳＬＣ２００２は、強力かつ選択的なＧＰＲ４アンタゴニストである。
本明細書で使用される場合、「ＧＰＲ４アゴニスト」とは、ＧＰＲ４（又はＧＰＲ４と直接相互作用するタンパク質もしくは補因子）に結合し、及び／又はＧＰＲ４細胞活性の増加を引き起こす化合物である。ＧＰＲ４アゴニストの活性は、Ｇｓ（ｃＡＭＰ）及び／又はＧ１２／１３シグナル伝達経路の活性化、ヒスチジン残基のプロトン化を誘導するのに必要なＧＰＲ４受容体のｐＨ活性化曲線のシフト、ＧＰＲ４のオリゴマー化もしくはＧＰＲ４と相互作用パートナーとの会合の制御、又はＧＰＲ４のエンドサイトーシスもしくは脱感作に影響を及ぼすことを含み得る。これらのＧＰＲ４活性化機構は例として与えられ、ＧＰＲ４活性化に直接関連する他の事象は当業者に公知である。ＳＬＣ２００４、スフィンゴシルホスホリルコリンは、ＧＰＲ４の例示的なアゴニストであるｘｘｖｉｉｉ。ＧＰＲ４の別の公知のアゴニストは、リソホスファチジルコリンであるｘｘｉｘ。
ＧＰＲ４の正のアロステリックモジュレーターは、ＧＰＲ４リガンド結合部位とは異なるＧＰＲ４上の部位への結合を通じてＧＰＲ４の活性を増加させるＧＰＲ４のアゴニストである。
本発明は、対象がアルツハイマー病又は軽度認知障害を有するか、又はそのリスクがあるか否かを判定する診断アッセイを含む。対象は哺乳動物であり、好ましくはヒト対象である。本発明によれば、アッセイを実施して、対象がＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有しているか否かを判定する。保有している場合、ＧＰＲ４の発現又は活性のレベルならびにＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を判定するために１つ又は複数のアッセイを実施する。対象が、ＧＰＲ４発現又は活性の減少、及びＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦの少なくとも１つの発現の減少、又はＩＴＧＢ３発現の増加を示す場合、対象は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有するか、又はそのリスクがある。好ましい実施形態では、ＹＡＰ１の発現は、ＧＰＲ４の測定に加えて測定される。
対象からの組織、細胞又は体液を診断アッセイのために収集する。組織、細胞又は体液中のタンパク質又はｍＲＮＡ発現レベルの測定値を取得し、比較する。好ましい実施形態では、分析のために対象から収集される組織は、全血を含む。別の好ましい実施形態では、分析のために対象から収集される流体は、血漿、血清、痰、唾液、汗、尿、リンパ液又は脳脊髄液を含む。さらに別の好ましい実施形態では、対象から収集される細胞は、血球、頬側細胞、皮膚線維芽細胞、神経細胞又はリンパ球を含む。最も好ましい実施形態では、細胞は神経細胞である。
本発明は、アルツハイマー病及び軽度認知障害の治療に有用な治療剤を同定するスクリーニングアッセイを含む。スクリーニングアッセイは、ＧＰＲ４の発現又は活性ならびにＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現に対する分子の効果を測定するために行われる。スクリーニングアッセイは、細胞、特に神経細胞を使用することができ、又は無細胞であってもよい。細胞は、ヒト対象又は動物対象に由来し得る。
本発明のスクリーニングアッセイは、ＧＰＲ４ならびにＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は活性レベルに対する分子のモジュレーション効果を同定するように設計される。本明細書で使用される場合、「モジュレーション」という用語は、転写速度又は発現レベルの任意の変化を含む、転写された遺伝子、ｍＲＮＡ又はタンパク質の機能又は量の活性の任意の変化を意味する。「変化」という用語は、生物学的活性のレベル又は発現レベルに言及する場合、その値が対照（すなわち、ｐ＜０．２５、多くの場合ｐ＜０．１、より多くの場合ｐ＜０．０５）と統計的に異なることを意味する。遺伝子発現又は遺伝子発現産物の活性の「対照」という用語は、細胞における遺伝子発現又は遺伝子発現産物の活性がそれぞれ比較される、又は比較され得る標準レベルを指す。
好ましいアッセイは、速度、効率、シグナル検出及び低試薬消費を求めて最適化される。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎ．４（２）：６７）。様々な細胞又は細胞抽出物、好ましくは、限定されないが、神経細胞、神経始原細胞、分化神経、乏突起膠細胞、線維芽細胞、リンパ球、ヒト胎児由来腎臓細胞もしくは別の細胞型又はそれらの抽出物を使用してアッセイを開発することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニングアッセイは、細胞、細胞抽出物、又は実質的に精製された遺伝子もしくは遺伝子発現産物を用いた生化学的ベースのいずれかであり、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングによって複数の化合物（例えば、数百万）を試験するために設計される。
モジュレーターを同定するためにスクリーニングされ得る試験化合物の化学ライブラリーは、多数の利用可能なリソースから、又は当該分野で公知のライブラリー合成方法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができ、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー、逆畳み込みを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：２００９．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１２（６），ｐｐ ７６５－８０６も参照されたい。
分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において、例えば、以下に見出すことができる：ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）。Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３．
ＧＰＲ４の活性及び／又は発現レベルならびにＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを首尾よくモジュレーションする試験化合物は、ＡＤ又は軽度認知障害の治療における潜在的な使用のための代替アッセイにおけるさらなる調査及び二次スクリーニングのための魅力的な候補である。化合物は、最初にヒットしたものが成功医薬品に必要なすべての特徴を含むことはほとんどないことは周知であるため、スクリーニングアッセイで最初に同定されたときに「治療に潜在的に有用」と見なされる。しかしながら、それらは、標的活性を効果的にモジュレーションする化合物間で共有される化学コア構造を研究者が同定することを可能にするために極めて有用である。典型的には、コア構造が同定されると、成功の医薬候補に向けてすべての基準を満たすリード化合物を同定する目的で、おそらく数千の関連化合物の広範なライブラリーがさらに開発される。このアッセイは、最終的にリード化合物の小さな群を同定するために最大数百万個の化合物の多数のスクリーニングを通して繰り返し使用され、そのうちの１つは最終的に承認された治療剤になり得る。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法によって同定されるＡＤ又は軽度認知障害の治療のための可能なリード分子は、約５００μＭ以下、典型的には約１００μＭ以下、多くの場合約５０μＭ以下、より多くの場合約１０μＭ以下、最も多くの場合約５００ｎＭ以下の５０％活性化濃度（ＥＣ５０）を示す。
本発明は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有する対象の治療方法を提供する。本発明の方法の臨床的使用には、アルツハイマー病又は軽度認知障害に罹患している対象を治療する方法が含まれる。
本発明の分子は、例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体と共に経口投与することができ、又はハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、又は錠剤に圧縮することができ、又は食事の食物に直接組み込むことができる。経口治療的投与のために、本発明の分子は、賦形剤と共に組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用されてもよい。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の本発明の分子を含有することができる。組成物及び調製物の割合は変えることができ、好都合には単位重量の約１～約１０％とすることができる。そのような治療的に有用な組成物中の本発明の分子の量は、適切な投与量が得られるような量である。本発明による好ましい組成物又は調製物は、経口単位剤形が約１～約１０００ｍｇの本発明の分子を含有するように調製される。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、結合剤、例えばトラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、バレイショデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含有することができ、甘味剤、例えばショ糖、乳糖、サッカリン、又は香料、例えばペパーミント、ウィンターグリーン（ｗｉｎｔｅｒｇｒｅｅｎ）油、サクランボ香料を添加することができる。単位剤形がカプセルである場合、カプセルは、上記の種類の材料に加えて、液体担体を含有することができる。様々な他の材料が、コーティングとして、又は投与単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤又はカプセルは、シェラック、糖又はその両方でコーティングすることができる。シロップ又はエリキシル剤は、本発明の分子、甘味剤としてショ糖、保存剤としてメチル及びプロピルパラベン、色素、ならびにサクランボ又はオレンジ風味などの香料を含有することができる。当然のことながら、任意の単位剤形を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、本発明の分子は、徐放性調製物及び製剤に組み込むことができる。
本発明の分子は、非経口投与することもできる。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての本発明の分子の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中で調製することもできる。通常の条件の保存及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。すべての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保存の条件下で安定であることができ、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する分散媒の溶媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの注射可能な組成物の持続的な吸収。
滅菌注射溶液は、必要量の本発明の分子を、必要に応じて上に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、塩基性分散媒及び上に列挙した成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
医師は、予防又は治療に最も適した本発明の分子の投与量を決定し、投与量は投与形態及び選択される特定の分子によって異なり、また、治療中の特定の対象によっても異なる。医師は、一般に、少量の投与量で治療を開始し、状況下での最適な効果に達するまで、少量ずつ増加させることを望む。治療投与量は、一般に、約０．１～約１０００ｍｇ／日、好ましくは約１０～約１００ｍｇ／日、又は約０．１～約５０ｍｇ／Ｋｇ体重／日、好ましくは約０．１～約２０ｍｇ／Ｋｇ体重／日であることができ、いくつかの異なる投与単位で投与することができる。経口投与には、約２倍～約４倍程度のより高い投与量が必要とされ得る。
本発明は、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有するか、又は有するリスクがある対象に投与するためのＧＰＲ４の治療モジュレーターを選択する方法を提供する。この方法は、対象からの生物学的試料中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される遺伝子の発現レベルを測定することと、対象が上記試料中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦもしくはＶＣＬについてのその発現産物の減少又はＩＴＧＢ３についての発現産物の増加を示すか否かに基づいて、ＧＰＲ４の上記治療モジュレーターを選択することとを含む。生物学的試料は、上記対象からの組織、細胞又は体液を含む。好ましい実施形態では、分析のために対象から収集される組織は、全血を含む。別の好ましい実施形態では、分析のために対象から収集される流体は、血漿、血清、痰、唾液、汗、尿、リンパ液又は脳脊髄液を含む。さらに別の好ましい実施形態では、対象から収集される細胞は、血球、頬側細胞、皮膚線維芽細胞、神経細胞又はリンパ球を含む。
例
例１：ホモ接合ＡＰＯＥ４遺伝子型（Ｅ４Ｅ４）又はホモ接合ＡＰＯＥ３遺伝子型（Ｅ３Ｅ３）のいずれかを保有するヒト同質遺伝子型ニューロンの培養。市販のヒト同質遺伝子型ニューロンは、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．から入手した。ホモ接合ＡＰＯＥ４遺伝子型（Ｅ４Ｅ４）ニューロンをＤＤＰ－ＮＲＣ－１ｘ ０１４３４．７７９と命名し、本明細書ではＥ４Ｅ４ニューロンと呼ぶ。ホモ接合ＡＰＯＥ３遺伝子型（Ｅ３Ｅ３）ニューロンをＲ１０１３と命名し、本明細書ではＥ３Ｅ３ニューロンと呼ぶ。ニューロンをプレーティングし、９６ウェルプレートで培養した。ニューロンをプレーティングする前に、製造業者が供給した完全維持培地を準備し、４℃で保存した。最初にウェルをポリ－Ｌ－オルニチンで４℃で一晩コーティングすることによって、９６ウェルプレートをポリ－Ｌ－オルニチン（ＰＬＯ Ｓｉｇｍａ、Ｐ４９５７）及びラミニン（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２０２０）で二重コーティングした。リン酸緩衝生理食塩水でウェルをすすぎ、次いで、１０マイクログラム／ミリリットルの濃度のリン酸緩衝生理食塩水で希釈したラミニンを３時間添加した。完全維持培地を室温に平衡化した。ニューロンを３７℃の水浴中で３分間解凍した。バイアルの内容物を、室温で平衡化された完全維持培地１ミリリットルを添加し、ニューロンを懸濁させることによって、５０ｍｌのコニカルチューブに移した。ニューロン懸濁液を５０ｍｌのコニカルチューブに移した。このニューロン懸濁液を、８ミリリットルの完全維持培地の添加によってさらに希釈した。生存ニューロンをカウントし、ニューロンを９６ウェルプレートの個々のウェルに、１２５，０００ニューロン／ｃｍ２のニューロンシード密度でプレーティングした。Ｅ３Ｅ３及びＥ４Ｅ４を含む９６ウェルプレートを細胞インキュベーターに移し、３７℃及び５％ ＣＯ２でインキュベートした。このようにしてプレーティングしたＥ３Ｅ３及びＥ４Ｅ４ニューロンを９６ウェルプレートのウェルに２４時間付着させ、その時点で、新鮮な完全維持培地への１００％培地交換を行った。次いで、Ｅ３Ｅ３及びＥ４Ｅ４ニューロンを３７℃及び５％ ＣＯ２で培養し続けた。プレーティング後５日目に、５０％の細胞上清を除去し、同量の新鮮な完全維持培地を添加することによって５０％培地交換を行い、次いで、９６ウェルプレートを３７℃及び５％ ＣＯ２で培養し続けた。プレーティング後９日目に、５０％の細胞上清を除去し、同量の新鮮な完全維持培地を添加することによって、５０％培地交換を行った。プレーティング後９日目にニューロンを化合物で処理する前に、この培地交換を行った。
例２：例示的ＧＰＲ４アゴニストＳＬＣ２００４及びビヒクルによるＥ４Ｅ４ニューロンの処理ならびにビヒクルによるＥ３Ｅ３ニューロンの処理。Ｅ４Ｅ４及びＥ３Ｅ３ニューロンを、例１に記載のように９６ウェルプレートの個々のウェルにプレーティングし、培養した。化合物スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＬＣ２００４）（Ｓｉｇｍａ、Ｓ４２５７）は、白色～黄色の外観及び４６４．６２ダルトンの分子量を有する凍結乾燥粉末である。ＳＬＣ２００４の新鮮なストック溶液を、３００ミリモルのストック濃度でビヒクルとしてのメタノール中で調製した。このストック溶液をさらに希釈して、意図したウェル内濃度の２１倍濃縮溶液を２つ得た。２１倍濃縮ＳＬＣ２００４溶液の１つについて、３マイクロモルの最終ＳＬＣ２００４ウェル中濃度は、この２１倍濃縮ＳＬＣ２００４溶液１０マイクロリットルを９６ウェルプレートの各ウェル中の完全維持培地２００マイクロリットルに添加することによって達成した。２つ目の２１倍濃縮ＳＬＣ２００４溶液について、１０マイクロモルの最終ＳＬＣ２００４ウェル中濃度は、この２１倍濃縮ＳＬＣ２００４溶液１０マイクロリットルを９６ウェルプレートの各ウェル中の完全維持培地２００マイクロリットルに添加することによって達成した。ＳＬＣ２００４処理ニューロンを有するすべてのウェルは、完全維持培地中に同量の０．０１％メタノールを含有していた。並行して、Ｅ４Ｅ４ニューロン及びＥ３Ｅ３ニューロンを、ＳＬＣ２００４の非存在下、完全維持培地中の０．０１％メタノール中で培養した。これらの試料をビヒクル対照とした。ＳＬＣ２００４又はビヒクル（完全維持培地中０．０１％メタノール）で処理したＥ４Ｅ４ニューロン及びビヒクル（完全維持培地中０．０１％メタノール）で処理したＥ３Ｅ３ニューロンを、３７℃、５％ ＣＯ２で６時間インキュベートした。
例３：例示的ＧＰＲ４アンタゴニストＳＬＣ２００２及びビヒクルによるＥ３Ｅ３ニューロンの処理ならびにビヒクルによるＥ４Ｅ４ニューロンの処理。Ｅ４Ｅ４及びＥ３Ｅ３ニューロンを、例１に記載のように９６ウェルプレートの個々のウェルにプレーティングし、培養した。化合物ＳＬＣ２００２は、白色～黄色の外観及び４７９．６６ダルトンの分子量を有する凍結乾燥粉末である。ＳＬＣ２００２の新鮮なストック溶液を、１００ミリモルのストック濃度でメタノール中で調製した。このストック溶液をさらに希釈して、２１倍濃縮溶液を得た。このＳＬＣ２００２溶液を使用して、この２１倍濃縮ＳＬＣ２００２溶液１０マイクロリットルを９６ウェルプレートの各ウェル中の完全維持培地２００マイクロリットルに添加することによって、最終的に１マイクロモルの最終ＳＬＣ２００２ウェル中濃度にした。ＳＬＣ２００２処理ニューロンを有するすべてのウェルは、同量のビヒクル（完全維持培地中０．０１％メタノール）を含有していた。並行して、Ｅ４Ｅ４ニューロン及びＥ３Ｅ３ニューロンを、ＳＬＣ２００２の非存在下、ビヒクル（完全維持培地中０．０１％メタノール）と共に培養した。これらの試料をビヒクル対照とした。ＳＬＣ２００２又はビヒクル（完全維持培地中０．０１％メタノール）で処理したＥ３Ｅ３ニューロン及びビヒクル（完全維持培地中０．０１％メタノール）で処理したＥ４Ｅ４ニューロンを、３７℃、５％ ＣＯ２で１２時間インキュベートした。
例４：ＧＰＲ４アゴニスト活性の分析のための処理されたＥ４Ｅ４及びＥ３Ｅ３ニューロンの収集。Ｅ４Ｅ４ニューロンに対するＳＬＣ２００４の効果を後に分析するためのニューロン材料は、例２に記載のように、Ｅ４Ｅ４ニューロンをＳＬＣ２００４又はビヒクルと共に６時間インキュベートし、Ｅ３Ｅ３ニューロンをビヒクルと共に６時間インキュベートすることによって生成した。６時間のインキュベーション期間の終了時に、完全維持培地を９６ウェルプレートの各ウェルから除去した。ニューロンを１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で各ウェルから分離し、新しいチューブに移し、２２５ｇで３分間遠心分離した。リン酸緩衝生理食塩水を約１５マイクロリットルまで吸引し、ニューロンのペレットをドライアイス上で急速凍結し、分析まで－８０℃で保存した。
例５：ＧＰＲ４アンタゴニスト活性の分析のための処理されたＥ４Ｅ４及びＥ３Ｅ３ニューロンの収集。Ｅ３Ｅ３ニューロンに対するＳＬＣ２００２の効果を後に分析するためのニューロン材料は、例３に記載のように、Ｅ３Ｅ３ニューロンをＳＬＣ２００２又はビヒクルと共に１２時間インキュベートし、Ｅ４Ｅ４ニューロンをビヒクルと共に１２時間インキュベートすることによって生成した。１２時間のインキュベーション期間の終了時に、完全維持培地を９６ウェルプレートの各ウェルから除去した。ニューロンを１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で各ウェルから分離し、新しいチューブに移し、２２５ｇで３分間遠心分離した。リン酸緩衝生理食塩水を約１５マイクロリットルまで吸引し、ニューロンのペレットをドライアイス上で急速凍結し、分析まで－８０℃で保存した。
例６：ＧＰＲ４に基づく治療に応答する遺伝子の発現レベルを決定するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州アーバイン、カタログ番号Ｒ２０５０）を製造者の説明書に従って使用し、任意選択のオンカラムＤＮａｓｅ処理により、例４及び５に記載の急速凍結ニューロンのペレットの各々から全ＲＮＡを抽出した。６時間のインキュベーション後に、例示的アゴニストＳＬＣ２００４又はビヒクルで処理したＥ４Ｅ４ニューロン、ならびにビヒクルで処理したＥ３Ｅ３ニューロンから全ＲＮＡを抽出した。１２時間のインキュベーション後に、例示的アンタゴニストＳＬＣ２００２又はビヒクルで処理したＥ３Ｅ３ニューロン、ならびにビヒクルで処理したＥ４Ｅ４ニューロンから全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度及び純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）及びＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して測定した。その後、３マイクログラムの全ＲＮＡを鋳型として使用して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ番号４３６８８１４）を用いてｃＤＮＡを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の検出は、産物ＤＮＡの量が増加するにつれて蛍光が増加する反応に蛍光レポーター分子を使用することによって可能になる。二本鎖ＤＮＡ挿入分子ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）を含む検出方法を使用して、遺伝子ＹＡＰ１、ＢＤＮＦ、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３をコードするタンパク質の遺伝子発現レベルを決定した。リアルタイムＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ３８４ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で、目的の遺伝子ＹＡＰ１、ＢＤＮＦ、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３のそれぞれを検出するように特別に設計された順方向及び逆方向増幅プライマーを使用して行った。各反応ウェルは、５マイクロリットルのＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ａ２５７４２）、１３ｎｇの全ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ、及びそれぞれ２５０ｎＭの順方向及び逆方向増幅プライマーを１０マイクロリットルの最終反応体積中に含有していた。本発明では、すべてのアッセイのプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ ３ｘｘｘ及びＱｕａｎｔＰｒｉｍｅｘｘｘｉを使用して設計した。融解曲線分析を実施して、すべてのプライマー対について単一産物増幅を確認した。サイクリング条件は以下の通りであった。ポリメラーゼ活性化のために９５℃で１０分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間。シトクロムｃ１（ＣＹＣ１）及びリボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）を参照遺伝子として使用した。増幅及びデータ減少を含む各定量的ｑＰＣＲ実験を３連で行った。ＢｉｏＲａｄ製のＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア、バージョン３．１を使用してデータ分析を行った。実験Ｃｑ（サイクル定量）を内因性対照産物に対して較正した。核酸の定量は、相対定量分析（ダブルデルタＣｔデータ分析、ΔΔＣｔ法）を用いて達成した。相対的定量化により、対照細胞株と比較した試験細胞株における標的遺伝子の発現の倍率差を決定することが可能になる。まず、生の蛍光値に基づいて、生データからベースラインを減算した。次に、特定の定量閾値蛍光シグナルレベルに達するのに必要なサイクル数を表す閾値サイクル（Ｃｔ）値を各試料について決定した。Ｃｔ値を、評価される遺伝子及び正規化目的のための参照遺伝子の両方について決定した。すべてのニューロン試料中の目的の遺伝子及び参照遺伝子（「Ｒｅｆ」と命名）について平均Ｃｔ値を決定した。
例７：Ｅ４Ｅ４ニューロンにおける発現遺伝子に対する例示的なＧＰＲ４アゴニスト効果の決定。対比較のために、以下の４つの値をＳＬＣ２００４処理Ｅ４Ｅ４試料及びＥ４Ｅ４ビヒクル対照について生成した。ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４におけるＲｅｆの平均Ｃｔ、ビヒクルで処理したＥ４Ｅ４におけるＲｅｆの平均Ｃｔ、ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４における目的の遺伝子の平均Ｃｔ、及びビヒクルで処理したＥ４Ｅ４における目的の遺伝子の平均Ｃｔ。ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４及びビヒクルで処理したＥ４Ｅ４について、目的の遺伝子のＣｔ値と参照遺伝子のＣｔ値との差（デルタＣｔ値、ショートｄＣｔ（ｓｈｏｒｔ ｄＣｔ））を計算した。次に、ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４とビヒクルで処理したＥ４Ｅ４との差を計算して、ダブルデルタＣｔ値（ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４－ビヒクルで処理したＥ４Ｅ４のｄｄＣｔ）に到達した。増幅産物の量は各サイクルで２倍になるので、ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４とビヒクルで処理したＥ４Ｅ４との間の発現倍数変化（相対定量又はＲＱ（ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４／ビヒクルで処理したＥ４Ｅ４））を以下の式２＾－ｄｄＣｔで計算した。ビヒクルで処理したＥ３Ｅ３ニューロンを、ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４と同じ方式で処理して、ビヒクルで処理したＥ４Ｅ４ニューロンと比較した目的の遺伝子の相対的発現レベルを得た。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較を説明するためのダネットの事後検定を使用することによって行った。
例８：Ｅ３Ｅ３ニューロンにおける遺伝子の発現に対する例示的なＧＰＲ４アンタゴニスト効果の決定。対比較のために、以下の４つの値をＳＬＣ２００２処理Ｅ３Ｅ３試料及びＥ３Ｅ３ビヒクル対照について生成した。ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３におけるＲｅｆの平均Ｃｔ、ビヒクルで処理したＥ３Ｅ３におけるＲｅｆの平均Ｃｔ、ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３における目的の遺伝子の平均Ｃｔ、及びビヒクルで処理したＥ３Ｅ３における目的の遺伝子の平均Ｃｔ。ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３及びビヒクルで処理したＥ３Ｅ３について、目的の遺伝子のＣｔ値と参照遺伝子のＣｔ値との差（デルタＣｔ値、ショートｄＣｔ（ｓｈｏｒｔ ｄＣｔ））を計算した。次に、ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３とビヒクルで処理したＥ３Ｅ３との差を計算して、ダブルデルタＣｔ値（ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３－ビヒクルで処理したＥ３Ｅ３のｄｄＣｔ）に到達した。増幅産物の量は各サイクルで２倍になるので、ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３とビヒクルで処理したＥ３Ｅ３との間の発現倍数変化（相対定量又はＲＱ（ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３／ビヒクルで処理したＥ３Ｅ３））を以下の式２＾－ｄｄＣｔで計算した。ビヒクルで処理したＥ４Ｅ４ニューロンを、ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３と同じ方式で処理して、ビヒクルで処理したＥ３Ｅ３ニューロンと比較した目的の遺伝子の相対的発現レベルを得た。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較を説明するためのダネットの事後検定を使用することによって行った。
例９：Ｅ４Ｅ４及びＥ３Ｅ３遺伝子型を保有するヒト同質遺伝子型ニューロンにおける遺伝子発現。前の例に開示されるように生成された試料を、例６、７及び８に開示されるように遺伝子の発現レベルについて分析した。これらの遺伝子には、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３が含まれた。Ｅ３Ｅ３ニューロンと比較したＥ４Ｅ４ニューロンにおけるこれらの遺伝子の差次的発現を図１に示す。相対的発現レベルを、平均±平均の標準誤差として示す。統計分析を、Ｅ３Ｅ３ニューロン及びＥ４Ｅ４ニューロンにおけるこれらの遺伝子の発現レベルを比較する対応のない両側ｔ検定によって行った。Ｐ値は、以下の意味を有するアスタリスクとして示す：（＊）ｐ≦０．０５、（＊＊）ｐ≦０．０１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１及び（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。Ｅ４Ｅ４ビヒクル処理（Ｅ４Ｅ４ ＶＣ）とＥ３Ｅ３ビヒクル処理（Ｅ３Ｅ３ ＶＣ）ニューロンとの比較により、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ及びＢＤＮＦの発現が、Ｅ３Ｅ３ビヒクル処理（Ｅ３Ｅ３ ＶＣ）ニューロンと比較してＥ４Ｅ４ビヒクル処理（Ｅ４Ｅ４ ＶＣ）ニューロンにおいて下方制御されることが明らかになった。ＩＴＧＢ３の発現は、Ｅ３Ｅ３ビヒクル処理（Ｅ３Ｅ３ ＶＣ）ニューロンと比較して、Ｅ４Ｅ４ビヒクル処理（Ｅ４Ｅ４ ＶＣ）ニューロンにおいて上方制御された。
例１０：例示的ＧＰＲ４アゴニストＳＬＣ２００４によるＥ４Ｅ４ニューロンの処理は、遺伝子の発現をモジュレーションする。前の例に開示されるように生成された試料を、例７に開示されるように遺伝子の発現レベルについて分析した。これらの遺伝子には、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３が含まれた。Ｅ４Ｅ４ ＳＬＣ２００４処理ニューロンと比較したＥ４Ｅ４ビヒクル処理ニューロンにおけるこれらの遺伝子の差次的発現を図２に示す。相対的発現レベルを、平均±平均の標準誤差として示す。Ｅ３Ｅ３ビヒクル処理ニューロンを比較のために示す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＥ４Ｅ４ ＳＬＣ２００４処理ニューロン及びＥ３Ｅ３ビヒクル処理ニューロンと比較したＥ４Ｅ４ビヒクル処理ニューロンにおけるこれらの遺伝子の発現レベルを比較するダネットの多重比較検定によって行った。Ｐ値は、以下の意味を有するアスタリスクとして示す：（＊）ｐ≦０．０５、（＊＊）ｐ≦０．０１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１及び（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４ニューロンとＥ４Ｅ４ビヒクル処理ニューロンとの比較により、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ及びＢＤＮＦの発現が、１０マイクロモル濃度のＳＬＣ２００４処理後に上方制御されることが明らかになった（図２）。ＳＬＣ２００４で処理したＥ４Ｅ４ニューロンとＥ４Ｅ４ビヒクル処理ニューロンとの比較により、ＶＣＬ及びＣＣＮＤ３の発現が、３マイクロモル濃度のＳＬＣ２００４処理後に上方制御されることが明らかになった（図２）。ＩＴＧＢ３は、３マイクロモル濃度のＳＬＣ２００４処理後に下方制御された（図２）。
例１１：例示的ＧＰＲ４アンタゴニストＳＬＣ２００２によるＥ３Ｅ３ニューロンの処理は、遺伝子の発現をモジュレーションする。前の例に開示されるように生成された試料を、例８に開示されるように遺伝子の発現レベルについて分析した。これらの遺伝子には、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ、ＢＤＮＦ及びＩＴＧＢ３が含まれた。Ｅ３Ｅ３ ＳＬＣ２００２処理ニューロンと比較したＥ３Ｅ３ビヒクル処理ニューロンにおけるこれらの遺伝子の差次的発現を図３に示す。相対的発現レベルを、平均±平均の標準誤差として示す。Ｅ４Ｅ４ビヒクル処理ニューロンを比較のために示す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＥ３Ｅ３ ＳＬＣ２００２処理ニューロンと比較したＥ３Ｅ３ビヒクル処理ニューロンにおける遺伝子ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ及びＢＤＮＦの発現レベルを比較するダネットの多重比較検定によって行った。Ｅ３Ｅ３ ＳＬＣ２００２処理ニューロン及びＥ４Ｅ４ビヒクル処理ニューロンと比較したＥ３Ｅ３ビヒクル処理ニューロンにおけるＩＴＧＢ３レベルの統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてフィッシャーの最小有意差検定によって行った。Ｐ値は、以下の意味を有するアスタリスクとして示す：（＊）ｐ≦０．０５、（＊＊）ｐ≦０．０１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１及び（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。ＳＬＣ２００２で処理したＥ３Ｅ３ニューロンとＥ３Ｅ３ビヒクル処理ニューロンとの比較により、ＹＡＰ１、ＶＣＬ、ＣＣＮＤ３、ＣＴＧＦ及びＢＤＮＦの発現が、１マイクロモル濃度のＳＬＣ２００２処理後に下方制御されることが明らかになった（図３）。ＩＴＧＢ３は、１マイクロモル濃度のＳＬＣ２００２処理後に上方制御された（図３）。
本発明のさらなる目的、利点、及び新規な特徴は、限定することを意図するものではない以下の例を検討することによって当業者に明らかになるであろう。例では、法定の実施化がされた手順が現在時制で記載されており、実験室で行われた手順が過去時制で記載されている。
引用文献
Figure 2023510297000002

Figure 2023510297000003

Figure 2023510297000004

Figure 2023510297000005

Claims (34)

  1. 以下を含む、アルツハイマー病もしくは軽度認知障害と診断された、又はその素因を有する対象を治療する方法：
    治療有効量の、ＧＰＲ４の活性を増加させる分子を投与すること、
    ただし前記投与は、前記対象におけるＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる。
  2. 分子がＧＰＲ４のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
  3. 分子がＧＰＲ４の正のアロステリックモジュレーターである、請求項１に記載の方法。
  4. 対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
  5. 対象がＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有する、請求項１に記載の方法。
  6. 対象が、ＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性であるヒトと比較して、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の減少又はＩＴＧＢ３の発現の増加を示す、請求項５に記載の方法。
  7. 治療有効量が、ＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性であるヒトに匹敵するレベルまで、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる、請求項６に記載の方法。
  8. アルツハイマー病又は軽度認知障害の対象の治療に潜在的に有用なＧＰＲ４の前記モジュレーターの治療有効性を測定する方法であって、
    ＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有する神経細胞におけるＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される遺伝子とＡＰＯＥ３対立遺伝子についてホモ接合性の神経細胞との差次的発現に対するモジュレーターの効果を決定することによる方法であり、
    前記モジュレーターが、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される遺伝子の発現を増加させるか、又はＩＴＧＢ３の発現を減少させる場合、前記モジュレーターが治療上有効である、方法。
  9. 神経細胞がＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項８に記載の方法。
  10. モジュレーターが小分子である、請求項８に記載の方法。
  11. モジュレーターがＧＰＲ４のアゴニストである、請求項８に記載の方法。
  12. モジュレーターがＧＰＲ４の正のアロステリックモジュレーターである、請求項８に記載の方法。
  13. 神経細胞が細胞培養物中で維持される、請求項８に記載の方法。
  14. 神経細胞がオルガノイド内に位置する、請求項８に記載の方法。
  15. 神経細胞がヒト神経細胞である、請求項８に記載の方法。
  16. ヒト神経細胞が、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有する個体の脳に位置する、請求項１５に記載の方法。
  17. 以下を含む、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有するリスクがあるＡＰＯＥ４対立遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性の対象を診断する方法で：
    ＧＰＲ４の発現産物の発現又は活性のレベルを決定すること、及び；
    前記対象の組織、細胞又は体液中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現産物のレベルを決定すること、ならびに
    ただし、ＧＰＲ４について、遺伝子発現又は活性は低下していて、
    ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬの少なくとも１つについて、遺伝子の発現産物のレベルが減少、又はＩＴＧＢ３について増加していることが、アルツハイマー病又は軽度認知障害のリスクが上昇していることを示す。
  18. 対象がヒトである、請求項１７に記載の方法。
  19. 対象がＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項１８に記載の方法。
  20. 細胞がヒトリンパ球である、請求項１８に記載の方法。
  21. 以下を含む、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有するか、又は有するリスクがある対象に投与するためのＧＰＲ４の治療モジュレーターを選択する方法：
    前記対象からの生物学的試料中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＩＴＧＢ３及びＶＣＬから選択される遺伝子の発現レベルを測定すること、及び；
    前記対象が前記試料中のＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦもしくはＶＣＬについてのその発現産物の減少又はＩＴＧＢ３についての発現産物の増加を示すか否かに基づいて、前記治療モジュレーターを選択すること。
  22. 以下を含む、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３の中から選択される遺伝子又はタンパク質の発現のモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイ：
    ＡＰＯＥ４対立遺伝子を有する細胞を提供すること、
    ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現を測定すること、
    前記細胞を、ＧＰＲ４活性のモジュレーターであるモジュレーターに曝露すること、
    前記曝露後の細胞における、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現を測定すること、ならびに
    ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ、ＶＣＬ及びＩＴＧＢ３の少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現を変化させるモジュレーターを同定すること。
  23. モジュレーターが小分子である、請求項２２に記載の方法。
  24. 細胞が神経細胞である、請求項２２に記載の方法。
  25. 細胞がリンパ球である、請求項２２に記載の方法。
  26. 細胞が細胞培養物中で維持される、請求項２２に記載の方法。
  27. 細胞が、ＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項２２に記載の方法。
  28. 神経細胞がオルガノイド内に位置する、請求項２２に記載の方法。
  29. 細胞がヒトの細胞である、請求項２２に記載の方法。
  30. 細胞がマウスの細胞である、請求項２２に記載の方法。
  31. モジュレーターが、ＹＡＰ１、ＣＴＧＦ、ＣＣＮＤ３、ＢＤＮＦ及びＶＣＬから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させる、請求項２２に記載の方法。
  32. モジュレーターがＩＴＧＢ３の発現を減少させる、請求項２２に記載の方法。
  33. ヒト神経細胞が、アルツハイマー病又は軽度認知障害を有する個体の脳に位置する、請求項２２に記載の方法。
  34. スクリーンがハイスループットスクリーンである、請求項２２に記載の方法。
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