KR20180075265A - 항암제 내성 특이 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제 내성 조절 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하며, 상기 유전자의 발현 억제에 의한 항암제 내성 획득 및 암세포 생존율 증가를 실험적으로 확인하였는바, 암 치료에 있어서, 보다 효과적으로 접근하여 타겟 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항암제 내성 특이 유전자 및 이의 용도 {Gene that is specific to anti-cancer drug resistance and use thereof}

본 발명은 항암제 내성 관련 특이 유전자 및 이의 용도로서, 보다 구체적으로 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학적 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

암은 우리나라 성인의 사망 원인 중 1위 또는 2위를 다투는 중요한 질병으로서, 많은 연구에도 불구하고 암 환자의 약 과반수 가량이 결국에는 사망에 이르고 있다. 현재까지 유효한 것으로 알려져 있는 암 치료 방법으로는 수술, 방사사선 항암제 치료법이 있으며, 이 중에서 수술과 방사선 치료법은 절제 부위 또는 방사선 조사부위에만 효과가 있는 국소 요법이고, 항암제 치료 요법은 전신에 효과를 나타내는 전신 요법이라는 점에서 차이가 있다.

현재까지 많은 항암제의 개발에도 불구하고, 항암제만으로 완치가 가능한 암은 백혈병, 악성 림프종, 고환암 등 소수의 암에 불과하며, 이는 항암제를 이용한 암 치료시 항암제에 암세포가 반응을 하지 않거나 초기에는 효과적으로 종양이 줄어들지만 치료 도중 또는 치료 후에 항암제 치료에 대한 내성이 생기기 때문이다. 항암제 내성이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있었으나, 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 이 경우, 치료에 사용된 항암제 뿐 아니라, 다른 종류의 항암제에 대해서도 내성을 나타내는 이른바, 다중 약제 내성 (MDR; multi-drug resistance)을 나타내기 때문에 일단 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하면, 이 후, 암 치료에 있어서 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.

따라서, 효과적인 항암제 치료를 위해서는 상기와 같은 항암제에 대한 암세포 내성을 극복해야 하며, 이를 위해서는 항암제에 대한 암세포의 내성에 관련된 유전자를 규명할 필요가 있다. 지금까지 P-당단백질 (P-glycoprotein : PgP), 다약제 내성 관련 단백질 (Multidrug Resistance-associated Protein, MRP) 등이 항암제 내성 관련 인자로 알려져 있으며, 이에 대한 다양한 연구가 진행되고 있으나, (한국 특허공개번호 10-2007-0101610), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 암 치료의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현 억제에 의한 항암제 내성 촉진 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 a) in vitro 상에서 암세포에 후보 물질을 처리하는 단계; b) 상기 암세포의 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군에 비해 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 증진시키는 물질을 항암제 내성 억제물질로 선정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제물질 스크리닝 방법을 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 CARD6 단백질은 서열번호 1로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 CARD6 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 NSD1 단백질은 서열번호 3 또는 4로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 NSD1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 6으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 항암제는 독소루비신 (doxorubicin)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 교아세포종 (glioblastoma)에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명은 a) in vitro 상에서 암세포에 후보 물질을 처리하는 단계; b) 상기 암세포의 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군에 비해 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 증진시키는 물질을 항암제 내성 억제물질로 선정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 암세포는 교아세포종 (glioblastoma) 세포일 수 있다.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 상기 약학적 조성물의 암의 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하며, 상기 유전자의 발현 억제에 의한 항암제 내성 획득 및 암세포의 생존율 증가를 실험적으로 확인하였는바, 항암제 내성 억제 및 이를 통한 암 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 항암제 내성 유전자 도출을 위한 엑솜 염기서열 분석 (Exome sequencing)의 개략적인 모식도이다.
도 2는 4 가지 분석 프로그램 (MuTect, Strelka, VarScan2, 및 Virmid)에서 항암제 내성 세포 내 단일 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 검출 결과를 밴다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 3은 내성 세포에서 CARD6의 stop-gain 돌연변이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CARD6 넉다운 (Knock down) 세포들의 독소루비신 내성촉진효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 CARD6 관련 siRNA의 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 NSD1에서 missense 돌연변이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 NSD1 넉다운 (Knock down) 세포들의 독소루비신 내성촉진효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 NSD1 관련 siRNA의 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은, 항암제 내성과 관련된 유전자 변이를 확인하고자 항암제 내성 암세포의 엑솜 염기서열 분석 (Exome sequencing)을 실시하였다. 그 결과, 상기 암세포에서 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1)의 변이를 관찰하였으며, 상기 유전자를 넉다운 (knock down)시킨 경우, 항암제에 대한 내성이 증가됨을 실험적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "항암제"란, 종양의 치료를 위하여 사용되는 화학 요법제를 총칭하는 것으로서, 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 물질을 의미한다. 다만, 항암제를 이용한 치료가 장기화되는 과정에서 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하게 되어 암 치료 효율을 떨어지게 하는바, 항암제 내성은 암 치료에 있어서 어려움을 겪고 있는 실정이다. 본 발명에서, 항암제는 바람직하게는 독소루비신 (doxorubicin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 교아세포종 (glioblastoma)에 적용될 수 있으나, 항암제 내성을 나타내는 암세포라면 제한 없이 적용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "항암제 내성"이란, 항암제를 이용한 암 치료에서, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있었으나, 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 이에, 본 발명자들은 암 치료의 커다란 걸림돌인 항암제 내성을 극복하고자 항암제 내성과 관련된 유전자를 규명하고자 하였다.

그 결과, 항암제 내성 세포에서, stop-gain 변이된 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6)유전자, missense 변이된 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1)유전자를 확인하였다. 상기 CARD6 단백질은 서열번호 1, CARD6 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어질 수 있고, 상기 NSD1 단백질은 서열번호 3 또는 4, NSD1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 6으로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 약물 내성 암세포 (U87-DR)에 대한 엑솜 염기서열 분석을 실시하여 항암제 내성과 관련된 2 가지 indels, 5 가지 stop-gain 변이 및 54 가지 missense 변이 (표 1 참조)를 포함한 107 가지의 변이 유전자를 확인하였으며 (실시예 1 내지 3 참조), 또한, 변이에 대한 분자 기능 분석을 실시하여, 'carbohydrate derivative binding', 'nucleoside binding' 및 'ATP-dependent helicase activity' 기능과 관련된 변이를 통해 항암제의 구체적인 작용 기전을 확인하였으며 (실시예 4 참조), 아울러, 상기 항암제 내성 관련 유전자 중 CARD6 또는 NSD1 유전자를 넉다운 (knock down)시킨 경우, 항암제 내성을 가진 암세포가 현저히 증가함을 확인하였는바, 항암제 내성 억제물질 스크리닝 방법으로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 6 또는 7 참조).

이에, 본 발명은 a) in vitro 상에서 암세포에 후보 물질을 처리하는 단계; b) 상기 암세포의 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6)유전자, 또는 missense 변이된 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군에 비해 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6)유전자, missense 변이된 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현이 증진된 물질을 치료제로 선정하는 단계를 포함하는, 항암제 내성 억제물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 상기 암세포는 바람직하게 인간 교아세포종 (glioblastoma) 세포일 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 독소루비신 내성 암세포주 (U87-DR) 배양

항암제 (Doxorubicin) 내성 발달에 영향을 미치는 유전자 변이를 확인하기 위하여, 약물내성 암세포를 준비하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자가 종래 출원한 (출원번호 2015-0068217) 특허 문헌을 통해 제조한 CDRA 칩을 이용하여, 인간 교아세포종 (human glioblastoma) 유래 U87 세포를 10 % (v:v) FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 MEM에서 배양하고, 위생 처리를 위해서, 70 %의 에탄올을 needle-free syringe를 사용하여 칩 중심의 셀 장착 구멍을 통해 칩에 조심스럽게 주입한 다음 항암제인 독소루비신 (doxorubicin)을 농도 구배에 따라 노출시킨 후, 이들 중 생존한 세포 (U87-DR 세포)가 부착된 세포배양 접시의 표면으로부터 육각형의 마이크로챔버 어레이를 제거하였다. 이 후, 트립신화시키고, 세포를 수득한 후, 새로운 배양 접시로 옮겨 정상적인 성장 배지 (MEM)에서 일주일간 배양하였다.

1-2. Drug efflux assay

다중약제내성은 세포의 MDR 1　（다중약제내성 단백질) 및 MRP1 (다중약제내성 관련 단백질 1) 유전자의 기질인 형광염료 Rhodamine 123 (Sigma-Aldrich)을 압출하는 능력을 검정함으로써 결정하였다. 보다 구체적으로, 세포를 아이스에서 30분 동안 Rhodamine 123을 미리 로딩한 다음 37 ℃에서 1 시간동안 배양하여 MDR 단백질 매개 염료의 유출을 허용하고, 세포는 propidum iodide (Pl; Sigama-Aldrich)로 염색하여 아이스에서 유지시켰다. 염색 유출은 분석으로부터 PI-양성 사균을 제외하고 유동 세포 계측법 (BD Biosciences, San Jose, CA)으로 분석하였으며, 또한 형광 측정 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 Rhodamine 123의 유출 속도를 평가하였다. 또한, 세포 현탁액을 염료 유출 전후에 96-웰 플레이트의 분주하여 형광 광도는 485 ㎚ (여기) 및 530 ㎚ (방출)에서 측정하였다.

1-3. drug-free 상태에서의 세포 증식 분석

U87-WT 및 U87-DR 세포의 세포 증식을 측정하기 위해서, EZ-Cytox 세포 생존률 측정 키트 (Daeillab Service, Korea)를 사용하여 측정 하였다. 보다 구체적으로, 세포 (1 × 10³ 내지 3 × 10⁴)를 180 ㎕의 배지를 함유한 96 웰에 접종하고 6 시간동안 배양을 진행하였으며, 이 후, 20 ㎕의 EZ-Cytox 시약을 각 웰에 첨가하고 1 시간 동안 배양 하였다. 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 생성된 WST-포르마잔의 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

1-4. 유전자 특이 siRNA 및 siRNA 트랜스펙션

CARD6 및 NSD1의 넉다운 실험을 위해서, 미리 설계된 siRNA (HsCARD6 5 및 HsCARD6 6의 ID를 갖는 CARD6에 대한 FlexiTube GeneSolution GS84674; Hs NSD1 3 및 Hs NSD1 8의 ID를 갖는 NSD1에 대한 FlexiTube GeneSolution GS64324) 및 스크램블된 음성 대조군 siRNA는 Qiagen (독일)에서 구입하였으며, 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 사용하여 U87 세포에 siRNA 이중 가닥을 형질 감염시켰다.

1-5. 유전자 넉다운을 위한 세포 증식 분석

세포 증식은 EZ-ytox 세포 생존력 측정 키트 (Daeillab Service, Korea)를 사용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, U87의 3000 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 다음 날 20 nM의 표적 siRNA으로 트랜스펙션시킨 다음 6 시간 후, 배양 배지에 독소루비신으로 세포를 처리하고 3 일간 배양하였다. 이 후, EZ-Cytox 용액을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였으며, 배양이 완료되면, 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 또한, 독소루비신이 없는 상태에서 값을 정규화하여 생존율을 결정하였다.

1-6. RNA-Seq 데이터 처리

제조업체의 지침에 따라 Direct-zol™ RNA MiniPrep 키트 (Zymo Research, Irvine, CA)를 사용하여 U87-WT 및 U87-DR 세포에서 총 RNA를 추출하였으며, RNA 시퀀싱은 Illumina HiSeq-2500 시퀀싱 플랫폼 (Illumina, San Diego, CA)에서 101bp pair-end run을 사용하여 수행하였다. 또한, Fastx 툴킷 (version 0.0.13.2)은 로우 시퀀싱 데이터의 사전 처리에 사용하였으며, 상기 리드는 MapSplice 2 (version 2.1.7)를 사용하여 참조 유전체 (human reference genome, hg19)를 정렬하였다. 다음으로 RSEM (version 1.2.12)을 사용하여 mRNA abundance를 정량화하였고, U87과 U87-DR 세포 사이의 차등 발현은 edgeR 프로그램 (version 3.8.6)에 의해 얻어졌다. 이 때, 상기 차등 발현 유전자 (DEGs)는 P-value < 0.01 이하에서 선택되었다.

실시예 2. 엑솜 염기서열 분석 ( Exome sequencing)

제조사의 지시에 따라 게놈 DNA 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 U87-WT 및 U87-DR 세포로부터 총 DNA를 추출하였다. 또한, Agilent Sure Select Human All Exon V4 with post-capture kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 엑솜을 농축시켰으며, 엑솜 염기서열 분석은 101 염기쌍 페어드 엔드 런(Paired-end runs)을 이용한 Illumina HiSeq-2000 sequencing platform (Illumina, San Diego, CA, USA)으로 실시하였다. 또한, 도 1에 나타낸 바와 같이 엑솜 염기서열분석을 진행하였으며, 보다 구체적으로 Fastx_toolkit (version 0.0.13.2)(http://hannonlab.cshl.edu/fastx toolkit/)를 이용하여 어댑터 시퀀스 트리밍, 아티팩트 필터링, 20 이하 quality score를 갖는 서열조각 (리드, read)의 제거를 통해 염기서열의 quality를 조절하였다(Sequence quality control). 상기 리드는 bowtie2 (version 2.1.0)의 default 설정을 이용하여 참조 유전체 (human reference genome, hg19)를 정렬 (alignment) 하였다 (pre-alignment). 다음으로 Genome anlysis Toolkit (GATK, version 2.5.2) 및 Picard (version 1.92)를 이용하여, 중복된 리드의 제거, 국소적 재정렬 (realignment), quality scores의 재측정을 실시하였다. 평균 정렬된 리드의 수는 8 천백만 개였으며, 타겟 부분의 평균 read depth는 187X였다.

실시예 3. 약물 내성 세포의 변이 검출

독소루비신 저항성 세포의 변이를 확인하기 위해서, 도 2에 나타낸 바와 같이, 약물 내성 세포의 변이 검출을 진행하였다.

보다 구체적으로, U87 야생형을 대조군으로 하여, 체세포 돌연변이를 총 4가지 분석 프로그램 MuTect (version 1.1.4), Strelka (version 1.0.7), VarScan2 (version 2.3.5) 및 Virmid (version 1.1.0)을 통하여 확인하였다.

그 결과, 다중 (≥2) 프로그램에 의해 확인된 신체 변이가 신뢰할만한 대체물로 분류되었으며, 2 개의 indels, 5 개의 stop-gain 변이 및 54 개의 missense 변이 (표 1 참조)를 포함한 107 가지의 변이형을 얻었다. 또한, 삽입 및 결실 변이 (INDEl)는 2가지 분석 프로그램 (Strelka (version 1.0.7), VarScan2 (version 2.3.5))을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 암세포 내성 관련 변이를 도출하였으며, 기능 변형은 ANNOVAR 프로그램을 사용하여 주석을 달고 통합 유전체 뷰어 (IGV)는 판독 정렬의 육안 검사에 사용되었다.

[표 1]

실시예 4. 변이에 대한 분자 기능 분석

Gene Ontology (GO) 기능 및 경로에 대한 유전자 세트 분석은 웹 기반 Gene Set Analysis Toolkit (WebGestalt) 웹 서버를 사용하여 수행하였으며, 이 때, 체외 돌연변이와 차별적으로 발현된 유전자 (DEG)를 분석에 포함하였다 (각각 표 2).

[표 2]

그 결과, 'carbohydrate derivative binding', 'nucleoside binding' 및 'ATP-dependent helicase activity' 기능과 관련된 변이를 확인하였는바, 이를 통해서, 독소루비신은 DNA 이중 나선의 두 염기쌍 사이에 삽입되어 topoisomerase Ⅱ를 방해한다는 이전 연구결과를 뒷받침한다.

이 때, topoisomerase Ⅱ의 헬리케이즈 활성은 독소루비신과 같은 안트라사이클린 항생제에 의해 강력하게 억제되는 것으로 나타났으며, 독소루비신의 4'- epi-isomer 인 epirubicin의 타겟으로 알려진 CHD1 (choromodomain helicase DNA binding protein 1)에서 유전자 변이를 관찰하였다.

또 다른 주목할만한 돌연변이는 filamin-A (FLNA) 유전자에 프레임 이동 삽입 (frame-shift insertion)으로, 그 손실은 topoisomerase Ⅱ 독소의 유입과 유출을 조절함으로써 독소루비신 내성을 촉진시키는 것으로 확인하였다.

실시예 5. 내성 발달을 위한 전사체 시퀀싱 및 신호전달 경로 분석

약물 내성의 관여하는 변화된 경로와 분자 과정을 더 확인하기 위해서, CDRA 칩에서 7일간 성장 후 얻은 U87 야생형 및 내성 세포주에 대한 RNA-seq데이터를 생성하였다.

[표 3]

[표 4]

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 83개의 DEG를 확인했으며, 그 중 77개가 상향 조절되었고, 6개가 하향 조절되었음을 확인하였으며, 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 83개의 DEG에 대한 GO 기능의 유전자 세트 분석은 '상처에 대한 반응', '염증 반응', '백혈구 화학 주성', '저산소 반응', '세포 증식 조절' 및 '사이토카인 활성'과 관련되어 있다. 특히, 가장 관련된 기능은 독소루비신을 독소루비시놀 (Doxorubicinol)로 전환시키는 4개의 알도-케토 환원 효소 (AKR; AKR1B1, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3)로 대표되는 독소루비신 대사 과정 (FDR = 3.89e-6)이다. 이 때, 독소루비신과 비교하여 독소루비시놀은 현저하게 감소된 세포 독성, 감소된 DNA-결합 활성 및 핵 외 리소좀 (extra-nuclear lysosomes)에 강한 발현 위치를 나타내었다.

또한, WebGestalt를 이용한 83 DEG의 교토 백과사전 유전자 및 게놈 (KEGG) 경로 분석은 NOD 유사 수용체 신호 전달 경로 (FDR = 1.33e-6) 및 사이토카인 - 사이토카인 수용체 상호 작용 경로 (FDR = 2.46e-8)를 산출했다. 이러한 경로에 관여하는 DEG는 NF-κB 경로에 의해 조절되는 대부분 케모카인 및 전 염증성 사이토카인 (예 : CCL2, CXCL1, CXCL2, CXCL3, IL1B, IL6, IL8 및 IL11)을 포함한다.

이때, NF-κB 활성화는 독소루비신 및 그 유사체의 세포 독성 효과에 필수적인 것으로 알려져 있으며, 엑솜 염기서열 데이터로부터 NF-κB 활성화와 관련있는 3개의 돌연변이 유전자 (CARD6, NSD1 및 NLRP13)을 확인하였다.

특히, CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6)는 인간 배아 신장 유도 HEK293T 세포에서 NOD1 (nucleotide-binding oligomerization domain containing 1) 수용체에 의한 NF-κB 활성화를 음성 조절하는 반면에, 간세포 암 기원의 Huh7 세포에서는 양성 조절자로 작용한다. 따라서, NF-κB 활성화에서 CARD6의 역할은 세포 유효 특이적일 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. CARD6 변이에 의한 항암제 내성 촉진효과 확인

본 발명자들은 in silico 분석에 대한 사전 검증을 수행하고자, 우선, FLNA에서 frameshift 돌연변이의 효과를 특정 siRNA로 넉다운 (knock down)하여 모방하고자 하였다.

보다 구체적으로, 내성 세포에서 CARD6의 stop-gain 돌연변이 (c.G2014T of NM 032587 encoding p.Gly672*)를 관찰하였으며 (도 3 참조), CARD6에 대한 siRNA로 넉다운 (knock down)하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, CARD6에 특이적인 siRNA를 가진 U87 세포의 처리는 이들 세포에서 NF-κB 신호전달 경로의 하향 조절과 일치하는 독소루비신 내성을 증가시키는 것을 확인하였으며, 이 때, CARD6에 대한 siRNA의 넉다운 효율을 도 5에 나타내었다.

실시예 7. NSD1 변이에 의한 항암제 내성 촉진효과 확인

NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1)에서 NF-κB 활성화를 감소시키는 것으로 알려진 missense 돌연변이 (c.T3380G of NM 02245 encoding p.Leu1127Arg)를 확인하였으며 (도 6 참조), 상기와 같이, NSD1을 넉다운 (knock down)시켰다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, NSD1의 넉다운 (knock down)은 감소된 NF-κB 활성화와 일치하는 독소루비신 내성을 증가시키고, 아폽토시스를 감소시키는 것을 확인하였으며, 이 때, NSD1에 대한 siRNA의 넉다운 효율을 도 8에 나타내었다.

상기 결과들을 통해서, 암세포의 CARD6 또는 NSD1의 발현을 억제함으로써, 항암제 내성을 촉진시킬 수 있음을 나타내는 것으로, CARD6 또는 NSD1과 항암제 내성간 높은 관련성이 있음을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Gene that is specific to anti-cancer drug resistance and use thereof <130> MP16-500 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1037 <212> PRT <213> CARD6 protein <400> 1 Met Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ser Glu Ile Ile Glu Arg Glu Arg Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ile Leu Gln His Asp Pro Asp Ser Ile Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Thr Ser Arg Arg Leu Ile Ser Glu Glu Glu Tyr Glu Thr Leu Glu 35 40 45 Asn Val Thr Asp Leu Leu Lys Lys Ser Arg Lys Leu Leu Ile Leu Val 50 55 60 Gln Lys Lys Gly Glu Ala Thr Cys Gln His Phe Leu Lys Cys Leu Phe 65 70 75 80 Ser Thr Phe Pro Gln Ser Ala Ala Ile Cys Gly Leu Arg His Glu Val 85 90 95 Leu Lys His Glu Asn Thr Val Pro Pro Gln Ser Met Gly Ala Ser Ser 100 105 110 Asn Ser Glu Asp Ala Phe Ser Pro Gly Ile Lys Gln Pro Glu Ala Pro 115 120 125 Glu Ile Thr Val Phe Phe Ser Glu Lys Glu His Leu Asp Leu Glu Thr 130 135 140 Ser Glu Phe Phe Arg Asp Lys Lys Thr Ser 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tgggtcagag 2280 cagaggccta agtggttcca tcctttgcct tttcagaatg caggggccca gggccgaggt 2340 aaaagttttg gtattcaatc cttccatccc cagatatttt attcaggtga aagattcatg 2400 aaattttcca gagttgctcg gggatgtcac tcgaatggaa catttgggag actgccaaga 2460 cccatttgtc agcatgtaca ggcctgccct gagagaccac aaatgatggg aactcttgaa 2520 aggtctaggg cagtagcctc caagataggt cactcctatt ccctggattc acagccagca 2580 agagcagtag ggaagccatg gcctcagcaa gcttgcacca gggtaacaga gttaactgaa 2640 gcaactggaa aactgataag aacatcccat attggaaagc ctcaccctca gtcctttcaa 2700 ccagcagcag ccacacaaaa actaagacct gcttctcagc aaggagtcca gatgaagaca 2760 caaggtgggg cttcaaatcc agctctccaa atagggtccc atcccatgtg caagagctct 2820 cagttcaaat ccgatcagtc caacccatcc acagtcaaac actcccagcc taaacccttc 2880 cattctgtgc cctctcaacc taaatcctct cagacaaaat cctgtcagtc ccagccctcc 2940 caaactaaac cttctccatg caaatctact cagcctaagc caagccagcc ctggcctccc 3000 cagtctaagc cttctcagcc cagaccccct caacctaagt catcctcaac caatccttca 3060 caagctaagg cacaccactc aaaagcaggg cagaagaggg gagggaagca ttaa 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Claims (9)

1. CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 CARD6 단백질은 서열번호 1로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 CARD6 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 NSD1 단백질은 서열번호 3 또는 4로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 NSD1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 6으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 항암제는 독소루비신 (doxorubicin)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 교아세포종 (glioblastoma)에 적용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 하기 단계를 포함하는 항암제 내성 억제물질 스크리닝 방법:
   a) in vitro 상에서 암세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
   b) 상기 암세포의 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 측정하는 단계; 및
   c) 비처리군에 비해 CARD6 (caspase activation and recruitment domain family, member 6) 또는 NSD1 (nuclear receptor binding SET domain protein 1) 발현을 증진시키는 물질을 항암제 내성 억제물질로 선정하는 단계.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 암세포는 교아세포종 (glioblastoma) 세포인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.

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