KR20210035643A - Ｍｙｏ１ｄ의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하여, 암세포의 생존 및 증식을 억제할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 암세포 내에서 EGFR 관련 세포신호전달 활성을 매우 효과적으로 억제함으로써, 암세포의 생존 및 증식을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 상기 MYO1D 단백질은 정상 대조군과 비교하여 암 환자 및 암세포 내에서만 현저하게 높게 발현되는 단백질에 해당하여 암을 효과적으로 진단할 수 있는 정보를 제공함으로써, 조기에 암을 진단하여 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

Description

ＭＹＯ１Ｄ의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of cancer containing the inhibitor of MYO1D expression}
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 MYO1D(Myosin-1D) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하여, 암세포의 생존 및 증식을 억제할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.
수용체 타이로신 인산화효소(receptor tyrosine kinases, RTK)는 세포 성장, 생존 및 분화를 포함한 주요 생물학적 과정의 주요 조절자이며, 원발암 유전자(proto-oncogene)로서 확립되어 있다. RTK의 비정상적 발현 또는 활성화는 종양 성장 및 진행과 관련이 있다 (Sweeney C. et.al., Br J Cancer., 90:289-293, 2004). 세포 표면 RTK 활성을 억제하고자, 세포는 RTK 수준을 조절하기 위한 여러 메커니즘, 예컨대, 리간드-자극된 하향조절, 전사 수준에서의 제어, 및 E3 유비퀴틴 리가아제를 통한 RTK 유비퀴틸화를 사용한다 (Goh LK. et.al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 5:a017459, 2013). 이러한 메커니즘은 함께 작동하여 세포 표면 RTK 수준을 정확하게 제어하여, 세포 사건(cellular event)에 대한 최적의 신호를 보장한다. 억제하지 않으면, 과다 신호전달(oversignaling)로 암과 같은 질병을 유발할 수 있다 (Fry WH. et.al., Exp Cell Res., 315:697-706, 2009). 그러나, RTK가 그들 각각의 리간드와 결합하기 전에 어떻게 원형질막에 유지되는지는 알려져 있지 않다.
RTK 및 이온 채널과 같은 막관통 단백질은 세포내 효과를 조절하기 위해 액틴 필라멘트 및 세포막에 동시에 결합하는 독특한(unconventional) 미오신-I이라는 단백질 패밀리와 상호작용한다 (McConnell RE. et.al., Trends Cell Biol., 20:418-26, 2010). 미오신-I 패밀리는 엔도사이토시스 및 엑소사이토시스와 세포 물질수송(cellular trafficking), 막-결합 세포소기관의 세포 내 수송, 및 특정 아세포 영역에서의 세포소기관 또는 단백질의 포획 및 유지와 같은 기계적 지지를 포함한 액틴-기반 분자 모터로서 다양한 역할을 수행한다 (Barylko B. et.al., Biochim Biophys Acta., 1496:23-35, 2000). 미오신-I은 세가지 구조적 도메인, ATP 및 액틴에 결합하는 촉매적 N-말단 헤드 도메인(head domain), 특정 아세포 위치에 대한 미오신의 표적화에 관여하는 것으로 여겨지는 C-말단 테일 도메인(tail domain), 및 헤드 도메인과 테일 도메인을 연결하고 경쇄와 상호작용하는 넥 도메(neck domain)을 갖는다. 과거에, 미오신-I이 테일에 결합된 카고(cargo)를 액틴이 풍부한 (actin-rich) 외피 배열에 어떻게 도킹(docking)시키는지에 대해 의문이 제기되었으나 (Mermall V. et.al., Science, 279:527-533, 1998), 현재까지 여전히 규명되지 않았다 (Barylko B. et.al., Acta Biochim Pol., 52:373-380, 2005). 이러한 의문은 세포외(extracellular) 리간드와 결합하기 위해 작동가능 상태(armed state)에 있도록, 어떤 분자가 원형질막에 단일 막-스패닝(spanning) RTK 단백질을 기계적으로 고정시키는지에 대한 의문을 가지게 한다. 이 고정 메커니즘(holding mechanism)은 또한 세포 표면에서 RTK의 제시를 조절할 것으로 예상된다. 최근, 비근육 미오신-Ⅱ(nonmuscle myosin-Ⅱ, NM-Ⅱ)는 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)와 상호작용하고, 클라트린-매개 엔도사이토시스의 내재화(internalization)에 필요한 것으로 보고되었다 (Chandrasekar I. et.al., Traffic., 15:418-432, 2014). 그러나, NM-Ⅱ의 넉다운이 EGF에 결합된(EGF-bound) EGFR의 막-국소화 양상을 교란시키지는 않았는데 (Kim JH. et.al., J Biol Chem., 287:27345-27358, 2012), 이는 원형질막에서 EGFR의 유지가 아직 확인되지 않은 경로에 의해 조절됨을 시사한다. 이에, 본 발명자들은 다운스트림(downstream) 신호전달의 활성화를 위해 RTK 단백질이 그들 각각의 세포외 리간드와 결합하기 전에 어떻게 원형질막에 유지되는지에 대해서 단백질-단백질 상호작용, 공동국소화(colocalization) 및 기능적 표현형 연구를 통해 조사하였다.
본 발명자들은 분자 모터 MYO1D가 인산화를 통해 이들이 활성화되기 전에 그들의 비인산화된 키나제 도메인과 결합하여 원형질막에 그들을 고정시킴으로써, 세포 표면 RTK 수준, 예컨대 EGFR 패밀리의 구성원 (ErbB3 제외)을 유지하는데 있어서 새로운 조절자로서 작용함을 규명하였다. 과발현된 MYO1D는 원형질막에서 EGFR을 상향조절함으로써 대장 종양 진행을 촉진하여, 그의 다운스트림 신호의 활성화를 증가시킨다. 따라서, 분자 모터 MYO1D가 암치료에 있어서 EGFR의 다운스트림 신호전달을 억제하기 위한 추가의 표적으로서 작용할 수 있다.
Sweeney C. et.al., Br J Cancer., 90:289-293, 2004 Goh LK. et.al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 5:a017459, 2013 Fry WH. et.al., Exp Cell Res., 315:697-706, 2009
본 발명의 목적은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질의 발현 수준 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 MYO1D(Myosin-1D)를 이용하여 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 MYO1D(Myosin-1D)를 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질의 발현 수준 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 MYO1D(Myosin-1D)를 이용하여 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 MYO1D(Myosin-1D)를 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
MYO1D(Myosin-1D) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암세포 내에서 EGFR 관련 세포신호전달 활성을 매우 효과적으로 억제함으로써, 암세포의 생존 및 증식을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 상기 MYO1D 단백질은 정상 대조군과 비교하여 암 환자 및 암세포 내에서만 현저하게 높게 발현되는 단백질에 해당하여 암을 효과적으로 진단할 수 있는 정보를 제공함으로써, 조기에 암을 진단하여 치료 효과를 상승시킬 수 있다.
도 1은 ErbB4/KITENIN 복합체의 발현 및 발암 작용을 조절하는 ErbB4-상호작용 단백질로서 MYO1D의 확인 결과를 나타낸 도이다. (a) 항-ErbB4 항체와 공동 면역침전된 단백질의 은 염색된 겔 사진으로, 엠프티 벡터 (Caco2/v) 또는 KITENIN (Caco2/KITENIN)으로 안정적으로 형질감염된 Caco2 세포를 항-ErbB4 항체로 면역침전시켰다. 화살표는 겔에서 슬라이스되어 질량분석법(mass spectrometry)에 의해 확인된 단백질의 위치를 나타낸다. (b) MYO1D 및 MYO1C는 내재성 ErbB4/KITENIN 복합체와 직접적으로 상호작용한다. Caco2/v 및 Caco2/KITENIN 세포를 항-ErbB4 또는 항-KITENIN 항체로 면역침전시키고 지시된 항체로 면역블롯팅하였다. (c) MYO1D의 넉다운은 ErbB4에 의해 향상된 침윤능(invasion capacity)을 억제한다. HCT116 세포를 48시간 동안 엠프티 벡터 또는 ErbB4 및 si-scr, MYO1C를 표적화하는 si-RNA 풀(pool) (si-MYO1C, 표 2), 또는 MYO1D를 표적화하는 si-RNA 풀 (si-MYO1D, 표 2)로 공동-형질감염시키고 트랜스웰 침윤 분석을 실시하였다. 침윤 분석에 사용된 동일한 세포로부터의 용해물에서 단백질 수준을 분석하였다. 사진은 3가지 독립적인 실험을 나타낸다. 히스토그램은 5개의 선택된 영역에서 계산되고 막대 그래프로 표시된 침윤 세포를 나타낸다 (평균±SEM, n=3). ErbB4는 밀도측정법(densitometry)에 의해 3반복 실험으로 측정되었고, 액틴과 비교하여 상대적 ErbB4 수준을 막대 그래프로 나타내었다 (평균±SEM, n=3). 별표(*)는 그룹 간 유의한 차이를 나타낸다 (NS, 유의하지 않음(not significant); *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). (d) KITENIN에 의해 향상된 침윤능에 대한 MYO1C-넉다운 또는 MYO1D-넉다운의 영향. Caco2/v 또는 Caco2/KITENIN 세포를 si-scr, si-MYO1C 또는 si-MYO1D로 48시간 동안 형질감염시키고 침윤 분석을 실시하였다. 동일한 세포로부터의 용해물을 분석하였으며, 침윤 분석 사진과 히스토그램, 및 상대적 EGFR 또는 c-Met 수준을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다.
도 2는 ErbB4 및 KITENIN과 MYO1D/MYO1C의 결합에 관한 도이다. (a) MYO1D는 ErbB4의 세포질 C-말단 영역과 상호작용한다. 상호작용 도메인을 확인하고자, Caco2 세포를 MYO1D-Myc 및 ErbB4-HA의 다양한 결실 돌연변이체 (WT, 야생형; ECD (1-676), CTF (677-1308))로 공동 형질감염시켰다. 형질감염(transfection) 후, 세포를 수확하여 용해시키고, HA 항체로 면역침전시키고 Myc 또는 HA 항체로 면역블롯팅하였다. 개략도는 아미노산 (aa) 수를 갖는 ErbB4-HA 유도체의 구조를 나타낸 것이다. 여기에서, ECD는 세포외 영역 및 막관통(transmembrane) 영역 (extracellular region plus transmembrane region)이고; CTF, 세포질 C-말단 단편 (cytoplasmic C-terminal fragment)이다. (b) MYO1D는 KITENIN의 C-말단 도메인과 상호작용한다. 상호작용 도메인을 확인하고자, Caco2 세포를 MYO1D-Myc 및 KITENIN-HA의 다양한 결실 돌연변이체 (WT, 야생형; ΔN (110-524), ΔC (1-240), NTD (1-110), CTD (218-524), ΔNΔC (218-524))로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 수확하여 용해시키고, Myc 항체로 면역침전시키고 Myc 또는 HA 항체로 면역블롯팅하였다. 개략도는 전장 KITENIN의 도메인 구조 및 아미노산 (aa) 수를 가진 KITENIN-HA 유도체의 구조를 나타낸 것이다. 여기에서, NTD는 N-말단 도메인(N-terminal domain)이고; T는 막관통 도메인(Transmembrane domain)이며; I는 세포내 도메인(Intracellular domain)이다.
도 3은 MYO1D가 결핍된 MCF-7 세포에서의 EGFR 패밀리의 발현 감소에 관한 도이다. MCF-7 세포를 si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염시키고, 지시된 항체로 면역블롯팅하여 총 세포 용해물을 분석하였다.
도 4는 MYO1D가 원형질막에서 ErbB4/KITENIN 복합체를 유지함에 관한 도이다. (a) MYO1D의 넉다운은 막 분획에서 ErbB4 및 KITENIN의 발현 수준을 억제한다. Caco2/ErbB4 세포를 si-scr, MYO1B를 표적화하는 si-RNA 풀 (si-MYO1B, 표 2), si-MYO1C 또는 si-MYO1D로 48시간 동안 형질감염시켰다. MYO1D의 넉다운은 또한 막 분획에서 EGFR의 수준을 감소시킨다. 아세포 분획(subcellular fraction)을 수득하고 항-튜불린 또는 항-Na+-K+-ATPase 항체로 확인하였다. (b) 원형질막에서의 여러 RTK 및 KITENIN의 발현은 MYO1D가 결핍된 세포에서 감소되었다. si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염된 Caco2 세포를 비오틴화하고 고정화된 아비딘 (풀-다운)을 사용하여 정제된 원형질막 제조물(preparation)을 지시된 항체로 분석하였다. (c) ErbB4 또는 KITENIN의 세포 표면 발현은 MYO1D가 결핍된 세포에서 감소된다. Caco2 세포를 si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염시켜 고정하고, 지시된 항체로 염색하여 이미지를 공초점 현미경으로 캡쳐하였다. 스케일 바: 10 ㎛. (d) MYO1D가 결핍된 세포에서 감소된 ErbB4/KITENIN 수준을 MG132로 처리함에 의해 회복시켰다. Caco2 세포를 ErbB4 및 si-scr 또는 si-MYO1D로 공동-형질감염시키고, 브레펠딘 A(Brefeldin A; 1㎎/㎖, 2시간), 다이나소레(dynasore; 80μM, 2시간), MG132 (25μM, 4시간) 또는 필리핀(Filipin; 3㎎/㎖, 2시간)으로 처리하여 형질감염 후 28시간째에 ErbB4, KITENIN 및 MYO1D의 수준을 평가하고자 분석하였다. 상대적 ErbB4 수준을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다. (e) MYO1D가 결핍된 CRC 세포에서 감소된 ErbB4 수준 및 침윤성을 MG132로 처리함으로써 부분적으로 회복시켰다. Caco2 세포를 ErbB4 및 si-scr 또는 si-MYO1D로 공동-형질감염시키고 MG132 (25 mM, 4시간)로 처리하였다. 침윤 분석의 사진 및 히스토그램을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다.
도 5는 MYO1B-결핍, MYO1C-결핍 및 MYO1D-결핍된 세포에서 여러 RTK 및 KITENIN의 발현 수준에 관한 도이다. (a) MYO1D의 넉다운은 막 분획에서 ErbB4 및 KITENIN의 발현 수준을 억제한다. Caco2/ErbB4 세포를 si-scr, MYO1B를 표적화하는 si-RNA 풀 (si-MYO1B), si-MYO1C 또는 si-MYO1D로 48시간 동안 형질감염시켰다. EGFR, ErbB4 및 KITENIN의 발현 수준을 밀도측정법으로 측정하고, si-scr 처리 후의 스코어를 100%로 설정하고 si-scr 처리에 대해 계산된 스코어를 나타내었다. (b) 원형질막에서 EGFR 및 KITENIN의 발현 수준은 MYO1D가 결핍된 세포에서 감소되었다. si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염된 Caco2 세포를 비오틴화하고 고정화된 아비딘 (풀-다운)을 사용하여 정제된 원형질막 제조물을 지시된 항체로 분석하였다. EGFR, KITENIN 및 MYO1D의 발현 수준은 밀도측정법(densitometry)에 의해 3반복 실험으로 측정되었고, si-scr 처리 후의 스코어를 100%로 설정하고 si-scr 처리에 대해 계산된 스코어를 나타내었다 (평균±SEM, n=3).
도 6은 MYO1D가 결핍된 MCF-7 세포에서 EGFR 패밀리의 발현과 막에서 EGFR 및 MYO1D의 국소화에 관한 공초점 이미지를 나타낸 도이다. (a) MYO1D가 결핍된 세포에서 EGFR 패밀리, KITENIN 및 MYO1C 발현의 공초점 이미지를 나타낸 도이다. MCF-7 세포를 si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염시킨 후 세포를 고정시켰다. 지시된 항체로 세포를 염색하고 이미지를 도 1의 (g)에서와 같이 공초점 현미경으로 캡쳐하였다. (b) TIRF 현미경을 이용하여 막에서 EGFR 및 MYO1D의 국소화를 확인한 도이다. 상단 패널을 보면, EGFR (녹색) 및 MYO1D (빨간색) 단백질 모두 막에 조밀하게 국소화되어 있다. 두 단백질 모두 상응하는 항체로 표지되었고, 2 ㎛ 두께의 스택(stacks)은 에피 조명(epi illumination)으로 이미지화되었다. 하단 패널을 보면, 바텀 글라스에 인접한 원형질막에서 TIRF 이미지를 수집하고, 표지된 스팟을 Imaris 스팟 분석 모듈로 자동적으로 계수하였다. 이미지의 아래쪽 절반에 나타낸 바와 같이, 표지된 스팟으로 계수된 것은 녹색 및 빨간색 점으로 표시되었다. 이 경우에, EGFP는 1,411개의 스팟 (녹색)을 나타내고, MYO1D는 2,047개의 스팟 (빨간색)을 나타내었다. 또한, 공동-국소화된 스팟을 분석하여 Imaris Coloc 모듈로 계수하고, 아래쪽 절반의 병합된(merged) 컬러 이미지에 나타낸 바와 같이, 파란색 스팟으로 표지되었다. 공동-국소화된 스팟 (파란색)의 수는 653개이다. 각 채널은 그레이 스케일(gray scale) (위쪽 절반에 나타낸 바와 같음)로 획득되고, 병합된 이미지에서 의색(pseudocolored; 상의 원래의 색이 아니고 상이 갖는 데이터를 표현하기 위해 거기에 주어지는 색)으로 표시되었다.
도 7은 MYO1D가 결핍된 세포에서의 감소된 ErbB4/KITENIN 수준은 수크로스 또는 클로르프로마진(chlorpromazine)으로 처리함에 의해 회복되지 않음을 나타낸 도이다. Caco2 세포를 ErbB4 및 si-scr 또는 si-MYO1D로 공동-형질감염시키고 수크로스(0.45M, 30분) 또는 클로르프로마진(15μM, 1시간)으로 처리하여 ErbB4의 수준을 평가하고자 분석하였다. 상대적 ErbB4 수준을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다.
도 8은 MYO1D가 또한 원형질막에서 EGFR을 유지함에 관한 도이다. (a) 암세포 침윤에 대한 MYO1C-넉다운 또는 MYO1D-넉다운의 효과를 나타낸 도이다. Caco2 세포를 si-scr, MYO1C를 표적화하는 si-RNA[si-MYO1C (#1) 및 MYO1C를 표적화하는 또 다른 독립적인 si-RNA (#2)], 또는 MYO1D를 표적화하는 si-RNA[si-MYO1D (#1) 및 MYO1D를 표적화하는 또 다른 독립적인 si-RNA (#2)]로 48시간 동안 형질감염시키고 침윤 분석을 수행하였다. 동일한 세포로부터의 용해물을 분석하였으며, 침윤 분석 사진과 히스토그램, 및 상대적 EGFR 수준을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다. (b) 원형질막에서 EGFR의 발현은 MYO1D가 결핍된 세포에서 감소되었다. Caco2 세포로부터의 이미지는 도 1의 (g)에서와 같이 캡쳐되었다. (c) MYO1D의 넉다운은 형질감염된 RTK에 의해 향상된 침윤능(invasion capacity)을 억제한다. Caco2 세포를 EGFR 또는 ErbB4, 및 si-scr, si-MYO1C 또는 si-MYO1D로 48시간 동안 공동-형질감염시키고 침윤 분석을 수행하였다. 동일한 세포로부터의 용해물을 분석하였으며, 침윤 분석 사진 및 히스토그램을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다. (d) MYO1D는 오로지 비인산화된 EGFR과 결합한다. MYO1D WT-Myc를 안정적으로 발현하는 Caco2 세포를 지시된 시간 동안 EGF (100ng/㎖)로 처리하고, 항-Myc 항체로 면역침전시켜 지시된 항체로 분석하였다. (e) EGF 자극에 의한 EGFR의 하향조절은 MYO1D의 넉다운 하에서 일어난다. Caco2 세포를 si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염시키고, 16시간 동안 혈청을 고갈시킨(serum-starved) 후, 지시된 시간 동안 EGF (100ng/㎖)를 처리하고 지시된 항체로 분석하였다. p-ERK는 EGF 자극에 대한 양성대조군으로서 사용하였다. EGF 처리 후 하향조절된 EGFR 수준을 si-scr 및 si-MYO1D 그룹 간의 밀도측정법으로 비교하였다 (오른측).
도 9는 MYO1C 또는 MYO1B의 넉다운은 Caco2 또는 MCF-7 세포에서 EGFR 패밀리의 수준에 영향을 미치지 않지만, MYO1B의 넉다운은 Caco2 또는 MCF-7 세포에서 일부 RTK를 증가시킴에 관한 도이다. Caco2 (a) 또는 MCF-7 (b) 세포를 si-scr 또는 si-MYO1C (#1, #2)로 형질감염시키고, 지시된 항체로 면역블롯팅하여 총 세포 용해물을 분석하였다. Caco2 (c) 또는 MCF-7 (d) 세포를 si-scr 또는 si-MYO1B로 형질감염시키고, 지시된 항체로 면역블롯팅하여 총 세포 용해물을 분석하였다.
도 10은 TIRF 현미경을 이용하여 원형질막에서의 EGFR 및 MYO1D 클러스터(cluster)를 직접 시각화하여 나타낸 도이다. (a) EGFR 점(puncta) 및 클러스터링된 EGFR-MYO1D는 MYO1D의 넉다운 또는 액틴 세포골격의 붕괴 하에 두드러지게 감소되었다. 글라스 커버슬립 상에서 배양된 동일한 MCF-7 세포의 TIRF 이미지를 나타내었다. 형광성 세포 표면 EGFR(녹색) 및 MYO1D(빨간색)는 si-scr이 처리된 모(parent) MCF-7 세포(첫번째 줄) 및 MYO1D가 결핍된 세포(두번째 줄), 그리고 액틴 네트워크 교란물질(disruptor)인 라트룬쿨린 B(latrunculin B)가 처리된 세포(세번째 및 네번째 줄)의 원형질막에서 TIRF 현미경에 의해 가시화되었다. Imaris 소프트웨어의 스팟 분석 모듈은 EGFR 및 MYO1D가 표지된 점(puncta) 및 그들의 공동-국소화를 정량적으로 측정하는데 사용되었다 (또한, 도 11 참조). 사진은 3가지 독립적인 실험을 나타내며, 히스토그램은 Imaris Spot으로부터 EGFR 및 MYO1D를 발현하는 세포를 나타내었다 (평균±SEM, n=7).별표(*)는 그룹 간 유의한 차이를 나타낸다(*P<0.05; ***P<0.001). 스케일 바: 10 ㎛. (b) EGF 처리 후 원형질막에서 감소된 EGFR 형광 검출 및 병합된 이미지를 나타낸 도이다. MCF-7 세포를 EGF (100 ng/㎖로 30분 동안)로 처리한 후, EGFR 및 MYO1D를 TIRF 현미경으로 가시화하였다. TIRF 이미지의 사진 및 히스토그램은 (a)에서와 같이 얻었다.
도 11은 MYO1D에 의한 원형질막에서의 EGFR의 고정에 대한 액틴 세포골격 교란의 효과에 관한 도이다. (a) MCF7 세포에서 액틴 세포골격 교란의 효과에 관한 도이다. 액틴 해중합의 효과를 테스트하고자, MCF7 세포를 라트룬쿨린 B(Lat B 5 μM 또는 20 μM)로 처리하고, 팔로이딘(phalloidine)으로 염색하여 액틴 네트워크를 표지한 다음, 이미지의 스택(stacks)을 에피 조명(epi-illumination) (상단, 첫번째 줄) 및 TIRF(상단, 두번째 줄)로 수집하였다. 액틴은 막 근처에 조밀하게 표지되었고, 개별 세포의 가장자리는 명확(well defined)하게 나타났다 (상단). TIRF 이미지는 또한 세포의 폭넓은 밑바탕을 보여주었다. 억제제가 처리된 경우, 액틴 네트워크가 붕괴되고 변형되었다 (상단). 세포의 F-액틴/G-액틴 비율은 웨스턴 블롯 분석으로부터 추산되었다 (하단). (b) 원형질막에서의 EGFR의 발현은 라트룬쿨린 B(Lat B 5 μM 또는 20 μM) 및 MYO1D가 결핍된 세포에 의해 감소되었다. 라트룬쿨린 B로 처리되고 si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염된 Caco2 세포를 비오틴화하고, 고정화된 아비딘 (풀-다운)을 사용하여 정제된 원형질막 제조물을 지시된 항체로 분석하였다. 세포의 F-액틴/G-액틴 비율은 Caco2 세포에서 액틴 네트워크 억제제(Lat B 5 μM)로 감소되었다. (c) 액틴이 결핍된 Caco2 세포에서의 EGFR, KITENIN 및 MYO1D의 발현 감소에 관한 도이다. RTK 및 MYO1D의 발현은 Caco2 세포에서 si-scr 또는 si-액틴의 형질감염 후 12, 24, 48, 72시간째에 측정되었다 (상측). 액틴-넉다운의 지시된 시점에서 EGFR/GADPH 또는 MYO1D/GADPH의 스코어를 나타내었다 (하측). EGFR 또는 MYO1D의 발현 수준은 si-scr 또는 si-액틴의 형질감염 후 12, 24, 48, 72 시간째에 밀도측정법으로 측정하였다.
도 12는 MYO1D가 세포 표면에 EGFR을 고정시켜 다운스트림 신호전달 및 후속 세포 생존 유지에 관한 도이다. (a) MYO1D의 넉다운은 EGFR의 다운스트림 신호를 억제한다. Caco2 세포를 엠프티(empty) 벡터 또는 EGFR 및 si-scr 또는 si-MYO1D로 48시간 동안 공동-형질감염시켰다. 세포를 수확하고 지시된 항체로 면역블롯팅하여 분석하였다. (b) MYO1D의 넉다운은 세포증식을 억제한다. Caco2 세포에서 si-scr 또는 si-MYO1D의 형질감염 후 24, 48, 72 시간째에 MTT 분석에 의해 세포증식을 측정하였다 (상측). 지시된 시점에서 MYO1D의 발현이 나타났다 (중간측). si-scr 또는 si-MYO1D의 형질감염 후 24, 48, 72 시간째에 밀도측정법으로 MYO1D의 발현 수준을 측정하였다. si-scr 처리 후의 MYO1D/액틴의 스코어를 100%로 설정하고, si-scr 처리에 대해 계산된 스코어를 나타내었다 (하측).
도 13은 과발현된 MYO1D는 SW620 또는 MDA-MB231 세포에서 세포 생존능 및 운동성을 향상시킴에 관한 도이다. (a) 과발현된 MYO1D는 세포 생존능을 향상시킨다. 안정적으로 엠프티 벡터- 또는 MYO1D-를 형질감염시킨 SW620 세포 (SW620/v 및 SW620/MYO1D) 또는 MDA-MB231 세포 (MDA-MB231/v 및 MDA-MB231/MYO1D)를 성장시키고, MTT 분석을 수행하였다. SW620/MYO1D 세포의 흡광도 값은 4일째부터 현저하게 증가하기 시작하였으며, MDA-MB231/MYO1 세포의 흡광도 값은 2일째부터 현저하게 증가하기 시작하였다. (b) SW620/v 및 SW620/MYO1D 세포 또는 MDA-MB231/v 및 MDA-MB231/MYO1D 세포로부터의 총 세포 용해물을 지시된 항체로 면역블롯팅하여 분석 하였다. (c) 과발현된 MYO1D는 SW620 및 MDA-MB231 세포의 고정-비의존성(anchorage-independent) 콜로니 형성을 증가시킨다. SW620/v 및 SW620/MYO1D 세포 또는 MDA-MB231/v 및 MDA-MB231/MYO1D 세포를 소프트 한천 콜로니 형성 분석에 사용하였다. 세포를 소프트 한천에 시딩(seeding)하고 37℃ 및 5% CO2에서 2주 동안 인큐베이션한 다음, 콜로니를 광학 현미경으로 촬영하였다. 대표적인 세포 콜로니를 나타내었다. 분석의 사진 및 히스토그램을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다.
도 14는 MYO1D TH1 도메인이 EGFR과 결합하여 전장(full-length) MYO1D의 발암 작용에 우성-음성 방식(dominant-negative manner)으로 작용함에 관한 도이다. (a) EGFR 및 MYO1D에 대한 작제물의 디자인 및 사용을 보여주는 개략도이다. 기능성 도메인은 색이 있는 막대에 상응한다 (주황색: 세포외 도메인 (25-645), 검은 색: 막관통 (646-668), 노란색: 키나제 도메인 (712-979), 녹색: EGFR에서의 세포질 도메인 (669-1210); 파란색: ATPase 모터 도메인 (9-695), 녹색: IQ 모티프 (699-719, 721-741), 노란색: Myosin 1D에서의 TH1 도메인 (812-1005)). 디자인되고 사용된 작제물은 색이 있는 막대 아래에 나타내었다 (ECD: 1-668, CTF1: 669-987, CTF2: 988-1210, CTD: 669-1210, FL: EGFR에서의 1-1210; TH-ΔC: 803-967, ATPase: 9-695, dATPase: 697-1006, dTH: 1-802, TH: 803-1006, WT FL: Myosin 1D에서의 1-1006). (b) MYO1D의 TH1 도메인은 EGFR 및 KITENIN과 결합한다. 각 결실 돌연변이체의 발현은 파란색 화살표로 표시되었다 (하측). (c) EGFR 및 KITENIN의 발현에 대한 MYO1D TH1 도메인의 효과에 관한 도이다. 엠프티 벡터, MYO1D WT-Myc, MYO1C의 C-말단 단편 (MYO1C TH1 도메인, 839-1017-Myc) 또는 MYO1D의 C-말단 단편 (MYO1D TH1 도메인, 803-1006-Myc)을 안정적으로 발현하는 Caco2 세포로부터 얻은 총 세포 용해물을 지시된 항체로 면역블롯팅하여 분석하였다. (d, e) 세포증식 및 침윤에 대한 MYO1D TH1 도메인의 효과에 관한 도이다. (c)에서와 같이, Caco2 세포를 사용하여 세포증식 (d) 및 침윤 (e)을 측정하였다. 침윤 분석의 사진 및 히스토그램을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다.
도 15는 MYO1D 및 ErbB 패밀리의 결실 작제물의 지도, 및 MYO1D 및 MYO1C의 TH1 도메인의 아미노산 조성을 나타낸 도이다. (a) 개략도는 아미노산 (aa) 수를 갖는 MYO1D-Myc 유도체의 도메인 구조를 나타낸다. MYO1D FL, MYO1D 전장(full-length) 작제물(construct); MYO1D dTH1, C-말단 TH1 도메인이 없는 MYO1D 결실 작제물; MYO1D TH1, C-말단 TH1 도메인만 있는 MYO1D 결실 작제물; MYO1D dATPase, N-말단 ATPase 도메인이 없는 MYO1D 결실 작제물; 및 MYO1D ATPase, N-말단 ATPase 도메인만 있는 MYO1D 결실 작제물. (b) TH1 도메인의 아미노산 조성을 인간 MYO1D 및 MYO1C 간에 비교하였다. 나선형(helix) 및 스트랜드형(strand)과 같은 이차 구조는 각각 빨간색과 녹색으로 나타내었다. 특히, β-미앤더(β-meander) 모티프로 알려져 있는 5개의 연속적인 β-시트 (8번째 내지 12번째)를 MYO1D 및 MYO1C간에 비교하였다. (c-f) 개략도는 EGFR (c), ErbB2 (d), ErbB3 (e) 및 ErbB4 (f)와 같은 아미노산 (aa) 수를 갖는 ErbB-HA 유도체의 도메인 구조를 나타낸 것이다.
도 16은 MYO1D TH1 도메인의 C-말단 영역은 RTK-결합 부위로서 작용하고, MYO1D는 EGFR 패밀리의 키나제 도메인과 상호작용함에 관한 도이다. (a) C-말단 영역 (TH-ΔC)이 없는 MYO1D TH1 도메인은 아니지만, MYO1D TH1 도메인 (TH)은 EGFR 또는 KITENIN과 상호작용하는 RTK-결합 부위로서 작용한다. (b) TH-ΔC는 TH와 비교하여 세포 침윤에 영향을 미치지 않는다. 침윤 분석의 사진 및 히스토그램을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다. (c-g) Caco2 세포를 EGFR (c), ErbB2 (d), ErbB3 (e), ErbB4 (f)의 각 결실 작제물로 형질감염시키고, 항-myc 항체로 면역침전시킨 후 항-HA 또는 지시된 항체로 면역블롯팅하였다. MYO1D는 EGFR (c), ErbB2 (d) 및 ErbB4 (f)의 해당 키나제 도메인과 상호작용한다. 그러나, MYO1D는 ErbB3 (e)의 유사-키나제(pseudo-kinase) 도메인과는 상호작용하지 않는다.
도 17은 MYO1D의 C-말단에서의 3개의 β-시트 (β10 및 β11 제외)는 RTK-결합 부위에 필수적임에 관한 도이다. Caco2 세포를 엠프티 벡터, MYO1D WT, MYO1D TH1 도메인 (TH), 또는 돌연변이된 TH1 작제물 (β8m, β9m, β10m, β11m 또는 β12m)으로 48시간 동안 공동-형질감염시키고 트랜스웰 침윤 분석을 수행하였다. β8m은 나머지 β-시트(β9, β10, β11 및 β12)는 온전하게 두면서, 한 번에 8번째 β-시트의 잔기를 알라닌으로 치환하여 제조하였다. 각각의 돌연변이된 TH1 작제물의 발현은 침윤 분석에 사용된 동일한 세포로부터의 용해물에서 확인되었다 (오른측). 침윤 분석의 사진 및 히스토그램을 도 1의 (c)에서와 같이 얻었다.
도 18은 과발현된 MYO1D가 생체내(in vivo) 종양 형성(tumorigenicity)을 증가시키고, MYO1D는 진행된 단계로부터의 인간 CRC 조직에서 상향조절됨에 관한 도이다. (a) 동종 마우스 이종이식 모델에서 CT-26 세포의 종양 형성에 대해 항시적으로 과발현된 MYO1D의 효과에 관한 도이다. 종양 부피는 평균±SEM으로 나타내었다. 선 그래프 및 히스토그램의 별표는 그룹 간의 유의한 차이를 나타낸다 (CT-26/벡터 대비(vs) CT-26/MYO1D, n=7, **P<0.01). (b) 각 그룹으로부터 분리된 종양 조직의 사진이다. 19일째에 종양 중량을 측정하였다. 히스토그램에서 별표는 그룹 간의 유의한 차이를 나타낸다. (c) 두 그룹의 분리된 종양 조직에서의 MYO1D, KITENIN 및 EGFR의 발현 정도를 나타낸 도이다. (d) EGFR 및 ErbB4의 면역조직화학적 발현 수준은 CT-26/MYO1D 그룹에서 MYO1D의 면역조직화학적 발현 수준과 대략 유사한 수준을 나타내었다. CT-26/MYO1D 그룹 및 CT-26/벡터 그룹으로부터 19일째에 수득하여 연속적으로(serially) 섹션된(sectioned) 마우스 종양 조직에서 MYO1D 뿐만 아니라 EGFR 및 ErbB4의 발현 정도를 면역조직화학 (암갈색) 분석으로 확인하였다. (e) CT-26/MYO1D 그룹에서 종양 무게와 MYO1D 발현 사이에 양의 상관 관계 (R2 =0.58, *P<0.05)가 있음을 밝혔다. (f) MYO1D는 진행된 대장 선암종 (colon adenocarcinoma) 조직에서 상향조절되었다. MYO1D의 발현은 I기, Ⅱ기, Ⅲ기, 및 Ⅳ기 CRC를 갖는 환자로부터 얻어 연속적으로 섹션된 인간 대장 조직에서 면역조직화학 (암갈색) 분석으로 확인되었다. 현미경 사진은 MYO1D 발현의 고배율 필드 뷰(high-power field view)를 나타낸 것이다. 스케일 바: 200 ㎛; 50 ㎛ (고배율). (g, h) MYO1D의 발현 수준 및 인간 CRC의 단계 간에 양의 상관관계가 있음을 밝혔다. MYO1D의 면역조직화학적 수준을 평가하고자, 하기 실시예 1-14에 기재된 바와 같이 스코어를 계산하였다. (i) MYO1D가 대장의 암발생(carcinogenesis)에 기여하는 가장 잘 알려진 막관통 수용체인 RTK, 예컨대 ErbB 패밀리 (ErbB3 제외)를 원형질막에서 어떻게 고정시키는 기능을 나타내는지를 보여주는 개략도이다. MYO1D는 원형질막에 EGFR을 고정하기 위한 지지체로서 작용하고, 이에 따라 고정된 EGFR이 EGF에 결합하여 세포 생존을 위한 이의 다운스트림 신호전달을 작동할 수 있게 한다. EGF가 EGFR에 결합한 후, 인산화된 EGFR은 후속 세포내 물질수송을 위해 기본 액틴 세포골격에 고정된 MYO1D로부터 방출된다.
세포 표면 수용체 티로신 키나제 (RTK)는 동적상태(dynamic state)로 존재하지만, 단일 막-스패닝 RTK 단백질이 그들의 활성화 전에 원형질막에 어떻게 유지되는지는 여전히 알려지지 않았다. 본 발명은 단백질-단백질 상호작용, 공동국소화(colocalization) 및 기능적 표현형 연구를 통해 RTK 단백질이 그들 각각의 세포외 리간드와 결합하기 전에 활성화를 위해 원형질막에 어떻게 고정되어 있는지 조사하기 위해 수행되었다. 여기서 본 발명자들은 독특한 미오신-I MYO1D가 원형질막에서 EGFR 패밀리 (ErbB3 제외)의 구성원을 고정하는 기능을 보여준다. MYO1D는 비인산화된 EGFR과 오로지 결합하여 원형질막에서 기본 액틴 세포골격에 그들을 고정시킨다. β-미앤더(β-meander) 모티프를 포함하는 MYO1D 테일 도메인의 C-말단 영역은 EGFR 패밀리의 키나제 도메인과의 직접적인 결합에 중요하며, 테일 도메인 단독의 발현은 전장(full-length) MYO1D의 발암 작용을 억제한다. 과발현된 MYO1D는 EGFR 수준을 상향조절함으로써 대장암 및 유방암 세포 운동성 및 생존력을 증가시키고, 이에 따라 동종 마우스 모델(syngeneic mouse model)에서 대장 종양 진행을 촉진시킨다. MYO1D는 진행 단계로부터의 인간 대장암 조직에서 상향조절된다. 종합적으로, 분자 모터 MYO1D는 그들의 활성화 전에 원형질막에서 이들을 고정함으로써 EGFR 패밀리 수준의 동적 조절에 있어서 뚜렷한 역할을 수행한다. 과발현된 MYO1D는 아마 새로운 종양유전자(oncogene)로서 대장의 암발생(carcinogenesis)에 기여하고, 이에 따라 암치료에 있어서 RTK 신호전달을 억제하기 위한 추가의 표적으로서 작용할 수 있다.
따라서 요약하면, 본 발명자들은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질이 세포내에서 EGFR과 관련된 세포 신호전달과 관련된 단백질의 발현을 유도하여, 암의 발생 및 암세포의 생존 유지에 관련이 있고, 상기 MYO1D를 코딩하는 mRNA에 특이적인 발현 억제제를 투여하는 경우 암세포의 생존 및 증식을 억제할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
하나의 양태로서, 본 발명은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "MYO1D(Myosin-1D)"는 액틴 필라멘트 및 세포막에 동시에 결합하는 독특한(unconventional) 미오신으로, 세포 성장, 생존 및 분화를 포함한 주요 생물학적 과정의 주요 조절자인 수용체 타이로신 인산화효소(receptor tyrosine kinases, RTK), 예컨대 EGFR 패밀리의 구성원 (ErbB3 제외) 및 이온 채널과 같은 막관통 단백질과 상호작용한다. 이러한 상호작용에 의하여 MYO1D는 EGFR의 다운스트림 신호를 활성화시켜 암 발생을 촉진하게 된다. 이에, 본 발명에서는 MYO1D 단백질을 암치료를 위한 표적으로 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 서열은 서열번호 75로 표시되는 것으로, 상기 서열번호 75는 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA의 변이체(variant)일 수 있다.
본 발명에서 상기 "mRNA 발현 억제제"는 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA가 코딩하는 단백질의 발현을 억제하는 것으로, 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 micro RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "siRNA"는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 침묵 RNA(silencing RNA)로, 길이가 20 내지 25 염기쌍을 가지며, RNAi 경로 내에서 작동하는 이중가닥 RNA 분자이다. 본 발명에서 상기 siRNA는 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA의 일부에 상보적인 서열을 가지고, 바람직하게는 서열번호 60 내지 서열번호 63 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "상보적인"은 핵산이 전통적인 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 또는 다른 비전통적 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일구체예에서 상기 암은 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 위암, 방광암, 간암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 대장암, 유방암 및 신장암으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있으나, EGFR(epidermal growth factor receptor)이 높은 수준으로 발현됨으로써 암세포의 생존 또는 성장을 유지하는 경우를 나타내는 암이라면, 이에 제한되지 아니하고 모두 포함될 수 있다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그 일 예로, 본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 항암제와 병용 투여할 수 있다. 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50㎎/㎏ 또는 0.001 내지 50㎎/㎏으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 MYO1D(Myosin-1D) 단백질의 발현 수준 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것인, 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 암 진단용 조성물에서 상기 MYO1D 단백질, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 같은 바, 이하 구체적인 기재를 생략한다.
본 발명에서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA의 서열은 서열번호 75로 표시되는 뉴클레오티드 일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 MYO1D 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 상기 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 상기 항체의 단편들도 포함될 수 있다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함되며, 신규한 항체 외에도 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체 역시 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 항체는 MYO1D 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 경우라면, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 상기 기능적 단편이란, 예를 들면 Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv 등이 있으나 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편이라면 이에 제한되지 아니하고 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 암 예후 예측용 조성물은 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 또는 용액 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 암 진단용 키트에서 상기 MYO1D 단백질, mRNA 발현 수준을 측정하는 제제, 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물 및 암 진단용 조성물에서 기재한 바와 같은 바, 이하 구체적인 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 "키트"는 특정한 목적, 구체적으로 암의 진단을 위해 필요한 조성물 및 부속품을 모아놓은 세트를 의미한다. 구체적으로 상기 키트에는 본 발명에 따른 암 진단용 조성물뿐만 아니라, 상기 단백질 및/또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 분석에 사용되는 본 발명의 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지를 위한 물질을 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 PBS와 같은 완충액, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 키트를 이용하는 경우, 목적하는 개체로부터 얻어진 시료와 정상 대조군에서 얻어진 시료로부터 MYO1D 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 비교하여, 목적하는 개체에 있어서, 암의 발생 여부 등을 조기에 예측하여 개별화된 환자에게 적극적인 치료 시행 및 세밀한 관찰요법 여부를 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 'RT-PCR 키트'라 함); 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 '유전자 칩 분석법 키트'라 함); 또는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 'ELISA 키트'라 함)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, 상기 "RT-PCR 키트"란, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있고, 정상 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "유전자 칩 분석법 키트"란, 상기 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제 및 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기판에 포함되는 cDNA는 정상 대조군 유전자 또는 그의 단편일 수 있다.
본 발명에서 상기 "ELISA 키트"란 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 MYO1D 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 항체와 컨주게이트 되어 있는 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료의 MYO1D(Myosin-1D) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 MYO1D 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 암 진단용 키트에서 상기 MYO1D 단백질, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 같은 바, 이하 구체적인 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"는 암의 발생 여부를 확인하고자 하는 개체를 의미한다. 또한, 상기 개체의 시료란 암 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있고, 이러한 시료는 상기 목적하는 개체에서 공지의 과정에 의해 수행됨으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 일구체예에서는 상기 (b) 단계 이후에, 상기 (a) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군의 시료의 발현 수준보다 높은 경우 암이 발병될 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 mRNA의 발현 수준의 측정은 정상 대조군, 즉 암이 발생하지 않은 개체에서의 유전자의 상보적 결합 복합체의 형성량과, 암 환자, 즉 목적하는 개체의 유전자의 상보적 결합 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 상기 유전자들에서 mRNA의 유의한 발현량의 변화 여부를 판단하여, 암의 발생 여부를 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 mRNA의 측정 수준이 암이 발생하지 않은 정상 대조군의 시료보다 높은 경우에 목적하는 개체에 암이 발생 했을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 MYO1D 단백질 수준의 측정을 통하여, 암이 존재하지 않는 정상 대조군 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량과, 암 환자, 즉 목적하는 개체의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 상기 단백질의 유의한 발현량 변화 여부를 판단하여, 암의 예후를 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질의 측정 수준이 정상 대조군의 시료보다 높은 경우에 목적하는 개체에 암이 발생 했을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "항원-항체 복합체"는 상기 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
본 발명에서 상기 "유전자 상보적 결합 복합체"는 상기 유전자와 이에 특이적인 프라이머 또는 프로브의 결합물을 의미하고, 유전자 상보적 결합 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
본 발명에서 상기 "검출 라벨은 효소"는, 예를 들면 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 검출 라벨로서 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며. 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 형광물로서 이용 가능한 것에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 리간드에는 비오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지의 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide tri-phosphate)가 존재하는 조건하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 형광성 분자 또는 동위원소 등으로 표지될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기의 핵산서열은 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 또는 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 핵산 서열은 검출 가능한 시그널(signal)을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는, 이에 제한되지 아니하지만 예를 들면 방사성 동위원소, 형광성 분자 또는 바이오틴 등의 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 항체를 이용하여 이와 결합한 표적 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "mRNA 수준의 측정방법"은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블롯 분석(Northern blot assay) 또는 유전자 칩에 의하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "단백질 수준의 측정 방법"이란 웨스턴 블롯 분석, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, MYO1D(Myosin-1D) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 유효량의 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 암 치료방법에서 상기 MYO1D 단백질, mRNA 발현 억제제, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 같은 바, 이하 구체적인 기재를 생략한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 목적하는 개체로부터 분리된 암세포 또는 암 세포주에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 후보물질에 접촉시킨 암세포에서 MYO1D(Myosin-1D) 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 정상 대조군으로부터 분리된 세포 또는 세포주에 후보물질을 접촉시킨 뒤, MYO1D 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (b) 단계의 발현 수준과 (c) 단계의 발현 수준을 비교하여, 상기 (b) 단계의 MYO1D 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준이 상기 (c) 단계의 MYO1D 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준에 비하여 감소한 경우 항암제로 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 항암제 스크리닝 방법에서 상기 MYO1D 단백질, 목적하는 개체, 정상 대조군, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 같은 바, 이하 구체적인 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 "후보물질"은 암에 의해 발생한 증상을 완화 또는 개선 시키거나, 증세가 호전되어 이롭게 변경될 수 있도록 하는 것이 예상되는 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 단백질, 유기화합물, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 임의의 분자를 포함할 수 있다. 상기 물질은 천연 물질로부터 추출된 성분 및 합성 과정에 의해 생산된 물질은 모두 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료 준비 및 실험 방법
실시예 1-1: 세포주 및 형질감염(transfection)
인간 CRC 세포주 (Caco2, HCT15, HCT116 및 SW-620), 인간 유방암 세포주 (MCF-7 및 MDA-MB231), 및 인간 배아 신장 (293T) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였으며, 종래 선행문헌에 기술되어 있는 바와 같이 증식시켰다(Cancer Res. 2004;64:4235-43; Cancer Res. 2005;65:8993-9003; Gut. 2009;58:509-19). 종래 선행문헌(Cancer Res. 2004;64:4235-43; Cancer Res. 2005;65:8993-9003; Gut. 2009;58:509-19)에 기술되어 있는 바와 같이, 구조물(constructs) 및 si-RNA (표 1 참조)는 FuGENE6, 리포펙타민 PLUS 및 RNAiMax를 사용하여 각각 세포내로 형질감염시켰다. 이때, 통상적인 넉다운 효율은 si-RNA 형질감염 후 표적 RNA의 Q-PCR 결과를 기반으로 70~80%이었다.
실시예 1-2: 플라스미드
발현 구조물인 Myc-태그된(tagged) MYO1D, Myc-태그된 MYO1D 결실 돌연변이체, MYC-태그된 MYO1C 결실 돌연변이체, HA-태그된 KITENIN, HA-태그된 KITENIN 결실 돌연변이체, HA-태그된 ErbB4 결실 돌연변이체, HA-태그된 EGFR 결실 돌연변이체, HA-태그된 ErbB2 결실 돌연변이체, 및 HA-태그된 ErbB3 결실 돌연변이체는 PCR-기반 방법으로 생성하였다. 모든 구조물은 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였으며, ErbB4 cDNA는 K. Elenius (투르쿠 대학교, 핀란드)로부터 제공받았다.
실시예 1-3: 시약
브레펠딘 A(Brefeldin A), 클로르프로마진(chlorpromazine), 다이나소레(dynasore), 필리핀(Filipin), MG132 및 수크로스 (Sigma)를 적절한 농도로 처리하였다. 라트룬큘린 B (Latrunculin B; Enzo Life Sciences)는 F-액틴-교란 약물에 사용되었다. 인간 재조합 EGF (R&D systems)를 100 ng/㎖의 농도로 사용하였다. 모든 실험에서, 세포를 먼저 밤새 혈청을 고갈시킨 (serum-starved) 다음 적절한 농도의 성장 인자로 자극 하였다.
실시예 1-4: 항체 및 면역침전
MYO1B, MYO1C, MYO1D, ErbB4, Na+-K+ ATPase 및 총(total) ERK (Santa Cruz Biotech)에 대한 항체; ErbB2, ErbB3, phospho-EGFR Tyr1096, c-Jun, p-c-Jun, p-JNK, JNK, p-ERK, p-p38, p38, AKT 및 p-AKT (Cell Signaling Technol)에 대한 항체; EGFR (Thermo)에 대한 항체; Myc (MBL)에 대한 항체; HA 및 Actin (Sigma)에 대한 항체; 및 Vangl1 (Atlas)에 대한 항체; phospho-EGFR Tyr1068 및 phospho-EGFR Tyr1092 (Abcam)에 대한 항체를 적합한 2차 항체 (MBL)와 함께 사용하였다. 일시적 형질감염 분석을 위해, 293T, MCF-7, 또는 Caco2 세포를 다양한 플라스미드로 형질감염시키고 형질감염 후 48시간 시점에서 면역블로팅 분석을 위해 회수하였다. 안정된 세포주를 사용한 대부분의 분석에서 클론 변이를 배제하기 위해 혼합된 다중클론 세포를 사용하였다. Cancer Res. 64:4235-4243 (2004)에 기술되어 있는 바와 같이, 세포 단백질을 분리하고, 트랜스퍼하여 면역블로팅을 수행하였다. 블롯은 로딩에 대한 대조군으로 항-액틴 항체를 재탐침하였다. Gut., 58:509-519 (2009)에 기술되어 있는 바와 같이, 293T, Caco2, MCF-7 및 HCT116 세포로부터의 세포 용해물을 면역침전 실험을 위해 사용하였다.
실시예 1-5: RT-PCR 및 RNA 간섭
RNA 준비 및 역전사는 Cancer Res. 64:4235-4243 (2004)에 기술되어 있는 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR 대수기는 GeneAmp PCR system(Eppendorf) 상에서 동일한 반응으로 제조된 다양한 cDNA를 정량적으로 비교 가능하게 하고자, 30 사이클로 설정하였다. siRNA 간섭(interference) 실험을 위해, 인간 KITENIN에 대해 특이적인 siRNA를 디자인하고, 인간 MYO1B, MYO1C, MYO1D (Santa Cruz Biotech, Thermo Scientific 및 Invitrogen)에 대해 특이적인 siRNA를 제조사로부터 구입하였다. 구체적으로, si-RNA 간섭 실험을 위해, 인간 KITENIN에 대해 특이적인 siRNA를 디자인하고, 인간 MYO1B, MYO1C 및 MYO1D에 특이적인 2종의 si-RNA, 예컨대 혼합 3 si-RNA (Santa Cruz Biotech) 또는 인간 MYO1C 및 MYO1D에 특이적인 개개의 독립 si-RNA (Thermo Scientific)를 제조사로부터 구입하였다. 비특이적 스크램블(scrambled) siRNA (si-scr)의 경우에는, All Stars Negative Control siRNA(Qiagen)를 사용하였다. si-RNA 듀플렉스(duplexe)를 준비하고 LipofectamineTM RNAiMAX에 의해 제공된 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 최대 넉다운을 위해 세포를 48 내지 72시간 처리하고, RT-PCR을 행한 후에 웨스턴 블로팅 분석 또는 침윤 분석에 사용하였다. PCR 프라이머 및 si-RNA 서열은 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열
프라미어명 방향 프라미어 서열 서열번호
MYOD-WT-F1 정방향 5'-GAGCAGGAGAGCCTGGAAT-3' 1
역방향 5'-AGGCGCTTGAAATCTTGAAA-3' 2
MYOD-WT-F2 정방향 5'-TGCCTCAGACAAAATTCTGGA-3' 3
역방향 5'-GACCCAGGACTCGGAGTGT-3' 4
MYO1C-TH1 정방향 5'-CCCAAGCTTCCATGAAGGCCGTGGCTAGTGA-3' 5
역방향 5'-GGCCAAGAACGGGCACCTCGAGCGG-3' 6
MYO1D-TH1 정방향 5'-CCCAAGCTTCCATGAAGGTTGCAGCCGTGGA-3' 7
역방향 5'-CAGCGTGCCCGGGAACCTCGAGCGG-3' 8
MYO1D-ATPase 정방향 5'-CTGGCTAGTTAAGCTTCCATGGCGGAGCAGGAGAG-3' 9
역방향 5'-AAGAACTCCGTGCCCAGCTCGAGTCTAGAGGGC-3' 10
MYO1D-dTH1 정방향 5'-CTGGCTAGTTAAGCTTCCATGGCGGAGCAGGAGAG-3' 11
역방향 5'-GCCCCAGGTCAGGGCACTCGAGTCTAGAGGGC-3' 12
MYO1D-dATPase 정방향 5'-CTGGCTAGTTAAGCTTCCATGCTCATAAGGATTGTCC-3' 13
역방향 5'-CAGCGTGCCCGGGAACCTCGAGTCTAGAGGGC-3' 14
MYO1D-TH1-C 정방향 5'-CCCAAGCTTCCATGAAGGTTGCAGCCGTGGA-3' 15
역방향 5'-GTGAACGTCACCAACCCACTCGAGCGG-3' 16
MYO1D-TH1-C' 정방향 5'-CTGGCTAGTTAAGCTTCCAAGGTTGCAGCCGTGGA-3' 17
역방향 5'-GAGAAGCGCCACCTTCAACTCGAGTCTAGAGGGC-3' 18
EGFR-ECD 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCATGCGACCCTCCGGGA-3' 19
역방향 5'-GGATCGGCCTCTTCATGTGACTCGAGCATGCATCT-3' 20
EGFR-CTD 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCCGAAGGCGCCACATCG-3' 21
역방향 5'-GTGAATTTATTGGAGCATGACTCGAGCATGCATCT-3' 22
EGFR-CTF1 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCCGAAGGCGCCACATCG-3' 23
역방향 5'-CAGGGGGATGAAAGAATGTGACTCGAGCATGCATCT-3' 24
EGFR-CTF2 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCCATTTGCCAAGTCCTACAG-3' 25
역방향 5'-TACGCTCGGGGTACCCATTTGCCAAGTCCTACAG-3' 26
EGFR2-WT 정방향 5'-TGCCTCTCCCGAATTCATGGAGCTGGCGGCCTTGTG-3' 27
역방향 5'-AATAGGGCCCTCTAGA-3' 28
ErbB2-ECD 정방향 5'-TGCCTCTCCCGAATTCATGGAGCTGGCGGCCTTGTG-3' 29
역방향 5'-AATAGGGCCCTCTAGATCAGATGAGGATCCCAAAGAC-3' 30
ErbB2-CTD 정방향 5'-TGCCTCTCCCGAATTCAAGCGAGGCAGCAGAAG-3' 31
역방향 5'-AATAGGGCCCTCTAGA-3' 32
ErbB2-CTF1 정방향 5'-TGCCTCTCCCGAATTCAAGCGAGGCAGCAGAAG-3' 33
역방향 5'-AATAGGGCCCTCTAGATCAGACCACAAAGCGCTGGG-3' 34
ErbB2-CTF2 정방향 5'-TGCCTCTCCCGAATTCATCCAGAATGAGGACTTGG-3' 35
역방향 5'-AATAGGGCCCTCTAGA-3' 36
ErbB3-CTF1 정방향 5'-CGGGATTCCATGAAGGAAGCTTAAAGT-3' 37
역방향 5'-CCGCTCGAGTTAGGTGAACTCATTGGCTA-3' 38
ErbB4-CTF1 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCAGAAGGAAGAGCATCAAAAA-3' 39
역방향 5'-CAGGGTGATGATCGTATGTAACTCGAGCATGCATCT-3' 40
ErbB4-CTF2 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCAAGCTTCCCAGTCCAAATG-3' 41
역방향 5'-CCGGAATACTGTGGTGTAACTCGAGCATGCATCT-3' 42
c-Met-ECD1 정방향 5'-GGGGTACCATGAAGGCCCCCGCTGTG-3' 43
역방향 5'-CCGCTCGAGCCTATTAAAGCAGTGCTC-3' 44
c-Met-ECD2 정방향 5'-GGGGTACCATGACACTTCTGAGAAATTCA-3' 45
역방향 5'-CCGCTCGAGTGTGAAATTCTGATCTGG-3' 46
c-Met-CTD 정방향 5'-TACGCTCGGGGTACCGGATTGATTGCTGGTGTTG-3' 47
역방향 5'-CTTCTGGGAGACATCATAGCTCGAGCATGCATCT-3' 48
c-Met-CTF1 정방향 5'-GGGGTACCATGAAAAACCTGAATTCA-3' 49
역방향 5'-CCGCTCGAGAATCAGGCTACTGGGA-3' 50
c-Met-CTF2 정방향 5'-GGGGTACCATGGTGCATTTCAATGAA-3' 51
역방향 5'-CCGCTCGAGCTATGATGTCTCCC-3' 52
siRNA 특이적 서열
siRNA 명 siRNA 서열 서열번호
Human MYO1B
 5'-CUGAAGAGCUCCUCAAUAATT-3' 53
5'-CACACUUCCUGCUAAUGAATT-3' 54
5'-GUAUCAAUGAGCUCACAAATT-3' 55
Human MYO1C 5'-AAAUCAAUGACUGUCAGAGCCUUCC-3' 56
5'-GUCCAGUAUUUCAACAACATT-3' 57
5'-CGUGCGGACAAUAAGCAAATT-3' 58
5'-CUUGGCACCUUGUCUUUCUTT-3' 59
Human MYO1D 5'-GCGCCUUAUGUAUAACAGUUCAAAU-3' 60
5'-CUCUCUACAUCUCCAGAAATT-3' 61
5'-CAGAAUUGCUCUCUACUAATT-3' 62
5'- CCAAGGAUCAUCUUACUUATT-3' 63
Human KITENIN 5'-GCUUGGACUUCAGCCUCGUAGUCAA-3' 64
실시예 1-6: 세포 침윤 분석 (Cell invasion assay)
세포 침윤은 Cancer Res. 64:4235-4243 (2004)에 기술되어 있는 방법에 따라 트랜스웰 이동 기구(Transwell migration apparatus)를 사용하여 측정하였다. 간략히 설명하면, 48시간 동안 siRNA를 전처리하여 배양된 세포 또는 안정하게 과발현된 세포를 24-웰 침윤 챔버 분석 플레이트(Costar) 상부에 로딩하였다. 화학유인물질로서 10 ㎍/㎖의 피브로넥틴(Calbiochem)을 포함한 컨디션드(conditioned) DMEM 배지를 하부 챔버에 가하였다. 24시간 인큐베이션한 후 세포를 염색하였다. 필터의 상부 표면에 있는 세포를 코튼볼(cotton ball)로 닦아내고, 하부 표면 상의 이동된 세포를 각 필터당 0.5 ㎜ × 0.5 ㎜의 5개의 임의의 사각형에서 계수하였다. 결과는 최소 3회의 독립적인 실험에 대해 필드당 세포수의 평균±SEM으로 표시하였다.
실시예 1-7: 아세포 분획(Subcellular fractionation)
세포질 및 막 분획은 아세포 단백질 분획 키트 (subcellular protein fractionation kit; Thermo Scientific)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 제조하였다. 각 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 EGFR, ErbB4, KITENIN, MYO1B, MYO1C 및 MYO1D에 대해 탐침하였다. 튜불린, Na+-K+ ATPase에 대해 탐침하여 분획 순도를 평가하였다.
실시예 1-8: 세포 표면 단백질 분리(Cell suface protein isolation)
세포 표면 단백질 분리 키트(Cell Surface Protein Isolation Kit Thermo Scientific)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라 표면 단백질을 분리하고 수집하였다. 간략하게는, 4℃에서 30분 동안 세포에 설포-NHS-SS-비오틴(Sulfo-NHS-SS-Biotin)을 처리한 후, 비오틴화 반응을 켄칭(quenching)시켰다. 세포를 세척하고, 부드럽게 스크래핑(scraping) 하여 수확하고, 프로테아제 억제제 칵테일(GeneDEPOT)의 존재하에 제공된 용해 버퍼를 사용하여 용해시켰다. 비오틴화된 (표면) 단백질을 포획하기 위해, 단백질 용해물을 컬럼(column)에서 2시간 동안 뉴트라비딘 아가로스 겔(Neutravidin Agarose gel)과 인큐베이션하였다. 세포내 분획을 나타내는 비결합된 (비오틴화되지 않은) 단백질을 컬럼의 원심분리에 의해 포획된 표면 단백질로부터 분리하였다. 세포내 분획을 -20℃에서 저장하여 표면 단백질 분리 공정을 위한 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. 마지막으로, 포획된 표면 단백질은 PBS 중 디티오트레이톨(dithiothreitol)를 사용하여 인큐베이션함에 의해 비오틴-뉴트라비딘 아가로스로부터 용리되었다. 용리된 단백질, 즉, 세포 표면 단백질은 컬럼 원심분리로 수집하였다.
실시예 1-9: 세포 생존능 분석
Caco2, SW620 및 MDA-MB231 세포의 세포 생존능은 EZ-Cytox 세포 생존능 분석 키트 (EZ-Cytox Cell viability assay kit; Daeil Lab Service Co., Korea)를 사용한 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석법으로 측정하였다. 간략하게는, 세포를 96-웰 플레이트 (5×103 세포/웰)에 플레이팅하고 배양하였다. 배양 배지는 24, 48, 또는 72시간 후에 제거하였다. 제거한 다음, 10 ㎖의 EZ-Cytox 시약을 각 웰에 첨가하고, 세포 생존력을 측정하기 전에 37℃에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 마이크로-플레이트 리더에서 450 ㎚의 테스트 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-10: 면역형광
Caco2 또는 MCF-7 세포를 피브로넥틴이 코팅된 세포 배양 슬라이드 (Becton Dickinson) 상에 시딩(seeding)하고, si-scr 또는 si-MYO1D로 형질감염시켰다. 48시간 후, 단층화된(monolayered) 세포를 고정하고 EGFR, ErbB4, KITENIN, MYO1C 및 MYO1D에 대한 항체로 개별적으로 표지하였다. Alexa 568-컨쥬게이션된 이차 항체 (Thermo Fisher)를 사용하여 단백질을 시각화하고, DAPI를 핵 대조염색(counter staining)에 사용하였다. 모든 이미지는 한국기초과학지원연구원 광주센터에서 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (Laser Scanning Confocal Microscope (Leica TCS SP5/AOBS/Tandem))으로 수집하였다.
실시예 1-11: 생체내( in vivo ) 종양 성장
동종 마우스 종양 모델이 단기 연구에서 후보물질의 항암 효과를 테스트하기에 적절한 것으로 보고되어 있으므로, CT-26 세포/동종 마우스 모델을 사용하여 대장의 종양형성(colorectal tumorigenesis)에 대한 MYO1D의 생체내 효과를 조사하였다. 수컷 Balb/c 마우스 (5주령)를 한국 다물 사이언스 (DaMul Science)에서 구입하였고, 동종 CT-26/벡터 및 CT-26/MYO1D 세포 (2×105)를 Cancer Res., 65:8993-9003 (2005)에 기술한 바와 같이 등 부분에 피하 주사하기 전에 1주일 동안 순응시켰다. 실험 프로토콜은 전남대학교 의과대학 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받았으며, 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 동물을 유지하고 모든 실험을 수행 하였다 (DHEW 발행, NIH 80-23). 종양 부피 (V)는 다음 식을 사용하여 계산되었다: V = 1/2×a×b 2, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 가장 긴 직경과 가장 짧은 직경 (㎜)이다. MYO1D의 효과를 확인하기 위해 이틀마다 19일 동안 종양 부피를 측정하였다. 19일 후에 모든 마우스를 희생시키고, 피하 종양 이식편을 외과적으로 절제하고 칭량하였다. 두 그룹으로부터의 종양 조직 섹션을 처리하였으며, 상세하게는 MYO1D, EGFR 및 ErbB4을 이용하여 염색하고, Gut., 58:509-519 (2009)에 기술된 바와 같이 검사하였다.
실시예 1-12: 소프트 한천 콜로니 형성 분석
SW-620 (1×105) 및 MDA-MB231(8×103) 세포를 1.5 ㎖의 소프트 한천 (DMEM 컴플리트 배지 내 0.35% 아가로스)에 현탁시키고, 6-웰 플레이트의 1.5 ㎖의 고형화한 한천 (DMEM 컴플리트 배지 내 0.6% 아가로스)에 도말하여 각각 14 내지 20일간 배양하였다. 콜로니 영역의 픽셀 강도는 각 플레이트에 대해 랜덤 현미경 뷰로부터 IMT iSolution 소프트웨어 (IMT i-Solution Inc.)로 측정하였다. 콜로니의 % 영역을 측정하고자, 콜로니 영역의 픽셀 수를 주어진 픽셀×픽셀 제곱으로 정규화하였다.
실시예 1-13: 환자 및 면역조직화학
2010년 내지 2014년 동안 전남대학교 병원에서 일상적인 수술 절차로 조직 샘플을 제작하였다. I기, Ⅱ기, Ⅲ기 및 Ⅳ기 CRC 환자 (각 단계, n=20)로부터 조직학적으로 정상 영역 및 대장의 종양 영역으로부터 조직 샘플을 수집하였다. 진단시 파라핀 왁스-포매된 종양 조직은 모든 포함된 경우에 이용 가능하였다. 환자들은 임상적으로 지시된 경우, 대장내시경 검사(colonoscopy), 흉부와 복부의 CT 스캔(computed tomographic scans) 및 양전자 방사 단층 촬영(positron emission tomography) 또는 뼈 스캔의 조합을 사용하여 단계화되었다. 연구 프로토콜은 전남 대학교 의과대학 연구소의 임상연구심의위원회에 의해 검토되고 승인되었다 (CNUHH 2014-109). 인권과 관련된 생의학 연구를 위한 헬싱키 선언의 권고가 준수되었다. 조직 절편은 파라핀을 제거하고 재수화하여 세척하였으며, MYO1D로 염색하고, Gut., 58:509-519 (2009)에 기술된 바와 같이 검사하였다.
실시예 1-14: CRC 시료에서 MYO1D 염색 평가
면역조직화학적 MYO1D 발현의 반정량화를 위해, 염색 강도를 Gut., 58:509-519 (2009)에 기술된 바와 같이 양성적으로 염색된 영역의 크기를 곱하여 스코어를 얻었다. 짙은 갈색으로 나타난 세포 염색의 강도는 다음의 척도에 따라 등급이 매겨졌다: 0, 염색 없음; 1+, 약간 염색됨; 2+, 중간 정도 염색됨; 3+, 현저하게 염색됨. 염색 면적은 다음의 척도로 평가되었다: 0, <5%의 세포가 양성으로 염색됨; 1+, 5% 내지 25%의 세포가 양성으로 염색됨; 2+, 25% 내지 50%의 세포가 양성으로 염색됨; 3+, >50%의 세포가 양성으로 염색됨. 최대 합계 스코어는 9이고, 최소 스코어는 0이다. 일반적으로 스코어가 4 보다 큰(>4) 시료는 후보 단백질 발현에 대해 양성으로 간주되었지만, 이 기준은 본 발명에서 사용되지 않았다.
실시예 1-15: 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)
MYO1C TH와 상이한 MYO1D TH의 말단 영역에서 7번째 내지 11번째 베타-가닥 (β7 내지 β11)의 알라닌 치환을 위해, EZchangeTM 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(Enzynomics)를 사용하였다. Nucleic Acids Res., 32:e115 (2004)에 기술된 바와 같이, PCR-기반 방법을 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유도를 수행하였다. 적절한 염기 치환을 포함하는 프라이머를 하기 표 3에 나타내었다. 1㎕ 주형 플라스미드 (Myosin 1d TH1/pcDNA6-myc/His-A), 1㎕의 효소 혼합물 및 1㎕의 프라이머 쌍을 사용하여 최종 부피 25㎕로 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 37℃에서 30분 동안 Dpn I을 이용하여 분해한 다음, 컴피턴트(competent) E. coli 5α 세포로 형질전환시켰다. 돌연변이는 시퀀싱(sequencing) 하여 확인하였다.
MYO1D TH1 도메인의 β-미앤더(β-meander) 모티프용 프라이머
프라미어명 방향 프라미어 서열 서열번호
β8 정방향 5'-GCAGCAACCAACCCAGTACAGTGCAG-3' 65
역방향 5'-TGCTGCAAGGTGGCGCTTCTCACTCT-3' 66
β9 정방향 5'-GCCGCAGCTCACGGGAAGAAGTGCACCG-3' 67
역방향 5'-CGCAGCTGCGTTGGTGACGTTCACTTGAAGGT-3' 68
β10 정방향 5'-GCCGCGGCTGCACGGCTCAACCAGCCCCAG-3' 69
역방향 5'-GGCCGCAGCTGCCTTCCCGTGCAGGCTGCA-3' 70
β11 정방향 5'-CAGCAAATCGCTCGGGCTTCATCC-3' 71
역방향 5'-CTGCTGCGGGCTGGGGCTGGTTGA-3' 72
β12 정방향 5'-GCTGCTGCGCCCGAGCGATTCTTGGT-3' 73
역방향 5'-AGCAGCACCCGGGAACCTCGAGTCTAG-3' 74
실시예 1-16: 전반사형광현미경(total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM) 분석
TIRF 현미경 분석을 위해, MCF7 세포를 no. 1.5 글라스 바텀을 가진 35 ㎜ 배양 디쉬(Greiner Bio One GmbH, Germany)에서 배양하였다. EGFR 및 Myo1D 단백질은 Alexa-488 및 568-컨쥬게이션된 이차 항체 (Thermo Fisher)로 이중 표지되었다. TIRF 이미지는 한국기초과학지원연구원 광주센터에서 Elyra 초해상도 현미경 시스템 (Elyra Super Resolution Microscope System; Carl Zeiss Microscopy, Germany)의 TIRF 모듈을 사용하여 수득하였다. 이중 표지된 단백질을 488 및 561 ㎚ 레이저 라인으로 연속하여 여기시키고, 100× 오일용 대물렌즈 (NA 1.46) 및 백-씬드(back-thinned) EMCCD 카메라 (Andor iXON 897)로 이미지화하였다. EGFR 및 Myo1D 단백질의 발현 수준을 정량화하고자, Imaris 소프트웨어(Bitplane, Switzerland)로 형광 표지된 스팟(spot)을 계수하였다. 또한, 두 단백질의 공동-국소화를 동일한 소프트웨어 패키지에서 Coloc 모듈로 측정하고 계수하였다.
실시예 1-17: G-액틴/F-액틴 생체내( in vivo ) 분석
Caco2 또는 MCF-7 세포에서 필라멘트상 액틴(F-액틴; filamentous actin) 및 구상 액틴 (G-액틴; globular actin)의 양을 시각화하고자, Cytoskeleton Inc.의 G-Actin/F-actin In Vivo Assay Biochem Kit를 키트 매뉴얼에 따라 사용하였다. 세포를 37℃에서 예열된 액틴 안정화 버퍼(100 mM 파이프(Pipes), pH 6.9, 5% 글리세롤, 5 mM MgCl2, 5mM EGTA, 1% 트리톤 X-100, 1 mM ATP 및 프로테아제 억제제)에 용해시키고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 테이블 탑(table top) 원심분리기를 사용하여 실온에서 5분 동안 1000 g 에서 원심분리하였다. 용해되지 않은 세포를 제거한 후, 용해물을 37℃에서 1시간 동안 100,000 g 에서 원심분리하였다. 상층액을 사용하여 G-액틴을 분석하고, F-액틴을 함유하는 펠렛(pellet)을 액틴 해중합 버퍼(actin depolymerization buffer; 100　mM 파이프(Pipes), pH　6.9, 1　mM MgCl2, 10　mM CaCl2 및 5　μM 사이토칼라신 D(cytochalasin D))로 가용화시키고 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액 [G-액틴 (구상 액틴)] 및 펠렛 [F-액틴] 분획을 SDS/PAGE로 분리한 후, 뒤이어 키트에 제공된 항-액틴 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 세포의 F-액틴/G-액틴 비율은 웨스턴 블롯 분석으로부터 추산되었다.
실시예 2: ErbB4/키테닌 복합체를 원형질막에 고정시키는 MYO1D의 기능 규명
본 발명자들은 이전 연구를 통해 공-발현된(co-expressed) ErbB4 및 키테닌(KITENIN; KAI1 C-terminal interacting tetraspanin) 하에서 작동하는 EGF의 새로운 EGFR-비의존성 종양성 신호(oncogenic signal)를 확인하였다 (Cancer Res. 2004;64:4235-43; Cancer Res. 2005;65:8993-9003; Gut. 2009;58:509-19; Clin Cancer Res. 2014;20:4115-28). 신호전달의 활성화를 위해, ErbB4/키테닌 복합체는 세포외 EGF를 충족시키기 위한 원형질막에 국한되어야 한다. 이에, 본 발명자들은 EGF-자극된 ErbB4/키테닌 복합체가 어떻게 원형질막에 고정되고 유지되는지를 명확히 하고자 하였으며, ErbB4-상호작용 단백질이 원형질막에서 ErbB4/키테닌 복합체 유지에 관련될 수 있음을 가설로 설정하였다.
구체적으로, Caco2 대장암 (colorectal cancer, CRC) 세포를 사용하여 ErbB4 항체와의 면역침강반응(immunoprecipitation, IP)을 통해 단백질 상호작용을 분석하였다. 공-면역침강된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 염색하였으며 (도 1의 a), 겔 추출하고 트립신 분해하여, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석기(liquid chromatography tandem mass spectroscopy)로 확인하였다. 그 결과, 5개의 단백질, 중금속 전위 P-형 ATPase(heavy metal translocating P-type ATPase), RNA 헬리카제 A(RNA helicase A), 파라인플루엔자 바이러스 5(parainfluenza virus 5)의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid), 및 독특한(unconventional) 미오신-I (myosin-I) MYO1D와 MYO1C가 확인되었다. 후보 단백질로서 상기 확인된 독특한 미오신-I에 대해 연구를 추가로 진행하였는데, 이는 일부 미오신이 활성 모터가 아닌 앵커(anchor)로서 작용하여, 액틴 필라멘트에 그들의 카고(cargo)를 고정시킴에 의해 특정 부위에서 세포소기관(organelle) 또는 단백질 축적을 촉진함에 대해 보고된 바 있기 때문이다.
먼저 Caco2 세포에서 MYO1D 및 MYO1C의 ErbB4/KITENIN과의 상호작용을 조사하였다. MYO1D 및 MYO1C는 ErbB4/KITENIN과 상호작용하였다 (도 1의 b). ErbB4 및 KITENIN의 다양한 결실 돌연변이체와 IP-면역블롯팅 분석을 사용하여, MYO1D 및 MYO1C가 ErbB4의 세포질 C-말단 단편 (C-terminal fragment, CTF) 또는 KITENIN의 C-말단 세포질 도메인 (C-terminal fragment, CTD)과 상호작용하여 (도 2), ErbB4/KITENIN/MYO1D 또는 ErbB4/KITENIN/MYO1C 복합체를 형성하는 것으로 나타났다.
MYO1D는 광범위한 조직에서 발현된다. 뇌에서 가장 높은 수준인 것으로 확인되었으며, MYO1D mRNA는 또한 장 및 CRC 조직에서 상대적으로 풍부하였다. MYO1D는 분극화된 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포에서의 재순환 경로(recycling pathway)에 있어서의 엔도사이틱 막 물질수송(endocytic membrane trafficking)과 중추 신경계 미엘린의 형성 및 유지 동안 미엘린 막 단백질의 랩핑(wrapping) 또는 수송에 있어서의 막 동력학과 관련이 있다. MYO1D는 섬모 기관지 및 표피 상피 세포의 평면 세포 극성(planar cell polarity)에도 필요하다. 대조적으로, MYO1C는 막 관통성 수송 단백질(cargo protein), 예컨대, Glut-4, Neph1, 및 VEFGR2의 원형질막 전달에 관여하며, PI3K 경로의 억제를 통해 종양 억제 기능을 발휘할 수도 있다. MYO1D 또는 MYO1C가 원형질막에서 ErbB4/KITENIN 복합체를 고정하는 작용을 하는 경우에, 작은 간섭 RNA (small interfering RNA; si-MYO1D 또는 si-MYO1C)의 처리를 통한 MYO1D 또는 MYO1C의 넉다운은 ErbB4 또는 KITENIN의 세포 표면 수준을 감소시켜 침입 세포의 조절을 유도할 수 있다. 원형질막에서 ErbB4/KITENIN에 의해, MYO1D 또는 MYO1C가 세포 운동성 조절에 관여하는지의 여부를 알아보고자 기능적 CRC 세포 침윤 분석을 수행하였다. 침윤 분석 결과는 MYO1D를 표적으로 하는 si-RNA 풀(pool) (si-MYO1D, 표 2 참조) 처리를 통해 모(parent) HCT116 CRC 세포의 세포 운동성 또는 ErbB4에 의해 강화된 HCT116 세포 운동성 (도 1의 c), 및 si-MYO1D의 처리를 통해 모(parent) Caco2 세포 또는 KITENIN에 의해 강화된 Caco2 세포 운동성 (도 1의 1d)이 현저히 감소되는 것으로 나타났다. MYO1C를 표적으로 하는 si-RNA 풀 (si-MYO1C, 표 2 참조)로 처리된 세포에서는 MYO1C의 넉다운 효과가 발견되지 않았다. si-MYO1D로 처리된 HCT116 및 Caco2 세포에서는 ErbB4 및 KITENIN의 수준이 각각 감소하였으나, si-MYO1C로 처리된 세포에서는 감소하지 않았다. si-MYO1D로 처리된 MCF-7 유방암 세포에서도 ErbB4 및 KITENIN의 감소된 수준이 관찰되었다 (도 3).
또한, 원형질막에서 ErbB4 또는 KITENIN의 발현이 si-MYO1D가 처리된 세포에서 영향을 받는지 그 여부를 하부세포 국소화(subcellular localization) 및 면역형광 연구를 통해 추가로 조사하였다. MYO1C가 아닌 MYO1D의 넉다운은 전체 및 막 분획에서 ErbB4 및 KITENIN의 수준을 감소시켰다 (도 4의 a, 도 5의 a). MYO1D가 막 분획 중 원형질 막에서 ErbB4 또는 KITENIN 수준에 영향을 미치는지의 여부를 확인하고자, si-MYO1D로 형질감염된 세포를 비오틴화하고(biotinylated), 정제된 원형질막 제조물(preparation)을 수득하였다. 키테닌(KITENIN)의 수준은 MYO1D가 결핍된(MYO1D-depleted) Caco2 세포로부터의 비오틴화된 막 제조물에서 감소되었다 (도 4의 b, 도 5의 b). 또한, 공초점 이미지는 MYO1D가 결핍된 Caco2 (도 4의 c) 및 MCF-7 유방암 세포 (도 6의 a)에서 ErbB4 및 KITENIN 둘 다 세포 표면 국소화가 는 약화되었으나, MYO1C가 결핍된 세포에서는 약화되지 않았음을 나타내었다. TIRF 현미경 관찰 결과는 EGFR 및 MYO1D 단백질이 막에 조밀하게 국소화되어 있음을 나타내었다 (도 6의 b). 이러한 결과는 si-MYO1D가 처리된 CRC 세포에서 ErbB4 또는 KITENIN에 의해 강화된 세포 운동성의 하향조절이 ErbB4 또는 KITENIN의 감소된 원형질막 수준의 결과일 수 있음을 시사한다.
실시예 3: MYO1D의 넉다운에 의한 ErbB4의 감소와 원형질막으로부터 분리된 ErbB4의 프로테아좀 분해와의 관련성
MYO1D의 결핍이 ErbB4/KITENIN의 원형질막 분획을 감소시키는 메커니즘인지를 확인하기 위해, RTK의 정방향 또는 역방향 물질수송을 차단함으로써 ErbB4/KITENIN에 대한 MYO1D-넉다운의 영향이 변경되었는지의 여부를 알아보고자 하였다. 따라서, 1) 소포체에서 골지로의 수송 억제제인 브레펠딘 A(Brefeldin A); 2) 클라트린(clathrin)-의존성 및 클라트린-비의존성 엔도사이틱 경로의 억제제인 다이나소레(dynasore); 3) 카베올라(caveolae)-매개 흡수 억제제인 필리핀(Filipin); 4) 클라트린-의존성 엔도사이틱 경로의 억제제인 저장성(hypotonic) 수크로스 및 클로르프로마진(chlorpromazine)을 처리한 후, ErbB4/KITENIN에 대한 MYO1D 넉다운의 영향을 조사하였다. MYO1D가 결핍된 세포에서 감소된 ErbB4/KITENIN은 브레펠딘 A, 다이나소레, 필리핀 (도 4의 d), 저장성 수크로스 또는 클로르프로마진 (도 7)을 처리하여도 회복되지 않았다. 따라서, MYO1D의 넉다운에 의해 감소된 ErbB4/KITENIN은 소포체-골지 수송에 의한 RTK의 막으로의 정방향 물질수송 또는 클라트린- 또는 카베올라-매개 경로에 의한 역방향 물질수송에 따른 영향을 받지 않았다. 많은 RTK가 리간드 결합 및 후속 리소좀 분해시 클라트린-매개 엔도사이토시스를 통해 내재화되므로, 다음으로 본 발명자들은 MYO1D의 넉다운에 의한 ErbB4/KITENIN의 감소가 프로테아좀 분해에 의해 매개되는지의 여부를 확인하였다. 본 발명자들은 프로테아좀 분해 억제제인 MG132 (도 4의 d)를 처리함에 의해 ErbB4/KITENIN이 회복되는 것을 확인하였다. ErbB4 분해에 대한 MG132의 효과를 재입증하고자, 세포 침윤 분석을 수행하여 시험관내 (in vitro) 상에서 표현형 분석을 통해 MYO1D 넉다운 세포에서 ErbB4 분해에 대한 MG132의 효과 정도를 평가하였다. 본 발명자들은 감소된 ErbB4 수준 및 MYO1D-넉다운 CRC 세포에서의 침윤이 MG132의 처리에 의해 부분적으로 회복됨을 확인하였으며 (도 4의 e), 이는 MG132의 처리가 MYO1D-넉다운 세포에서 ErbB4의 하향조절을 차단할 수 있음을 나타낸다. 이러한 발견은 MYO1D의 넉다운에 의해 감소된 ErbB4가 프로테아좀 분해와 관련이 있으나, ErbB4의 리간드-유도 내재화로부터 유발되지 않을 수 있음을 시사한다. 따라서, 이는 MYO1D이 손상되지 않은(intact) 세포에서는 ErbB4/KITENIN이 원형질막에 존재하나, MYO1D의 넉다운이 원형질막으로부터 시토졸(cytosol)로 ErbB4/KITENIN의 분리를 야기하는 것으로 해석된다. 분리된 ErbB4/KITENIN은 프로테아좀 분해를 통해 처리되어 원형질막에서 ErbB4/KITENIN의 수준은 하향조절된다. 결과적으로, MYO1D-넉다운 세포는 감소된 세포 침윤을 나타낸다. MYO1D를 통해 세포 표면에 ErbB4/KITENIN을 유지한다는 이러한 해석은 기관지 점막 표면에서 Vangl1 (KITENIN이라고도 함)의 비대칭적 과-발현 또는 국소화가 Myo1d-넉아웃 랫트에서 상실된다는 생체내(in vivo)의 결과로 부분적으로 뒷받침된다.
실시예 4: 원형질막에 EGFR 패밀리 (ErbB3 제외)를 고정시키는 MYO1D의 역할 규명
MYO1D의 넉다운 후 원형질막에서의 ErbB4의 발현이 영향을 받았기 때문에, 본 발명자들은 ErbB 패밀리의 다른 구성원의 발현이 또한 영향을 받는지 조사하였다. 본 발명자들은 먼저 대부분의 암세포의 진행을 양성적으로 조절하는 것으로 잘 알려져 있는 RTK인 EGFR을 선택하였다. si-MYO1C가 아닌 si-MYO1D (#1) 또는 MYO1D를 표적으로 하는 다른 독립적인 작은 간섭 RNA (#2, 표 2 참조)를 처리한 결과, Caco2 (도 8의 a 및 도 1의 d) 및 MCF-7 (도 3) 세포에서 EGFR 수준을 감소시켰을 뿐 아니라, EGFR의 막 분획도 감소시켰다 (도 4의 a). MYO1D의 넉다운은 또한 Caco2 (도 8의 b) 및 MCF7 (도 6의 a) 세포에서 EGFR의 세포 표면 국소화를 약화시켰다. 그러나, MYO1C는 MYO1D의 넉다운에 의해 영향을 받지 않았으며 (도 8의 b 및 도 6의 a), 이는 MYO1D가 MYO1C의 수준을 조절하지 않음을 시사한다.
본 발명자들은 원형질막에서의 EGFR의 발현은 MYO1D의 넉다운에 의해 영향을 받기 때문에, ErbB2 및 ErbB3와 같은 다른 EGFR 패밀리의 발현을 확인하였다. 그 결과, MCF-7 세포에서 MYO1D의 넉다운 후 (도 3), ErbB2의 수준은 감소되었으나 키나제 활성이 손상된 ErbB3의 수준은 감소되지 않음을 확인하였다. 또한, MYO1D이 결핍된 Caco2 세포로부터의 정제된 비오틴화된 원형질막 제조물(preparation)에서 감소된 수준의 EGFR이 관찰되었다 (도 4의 b). MYO1C (도 9의 a 및 도 9의 b) 이외에도, TGN(trans-Golgi network)에서 액틴 어셈블리 및 막 리모델링을 조절하여 후-골지(post-Golgi) 담체의 형성을 촉진하고, 수송체를 신장 세포의 정단(apical) 원형질막과 결합시켜 아미노산 수송을 조절하는 또 다른 작은 독특한 미오신-I 단백질인 MYO1B의 넉다운은 Caco2 및 MCF-7 세포에서 RTK의 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 9의 c 및 도 9의 d). 또한, MYO1B 및 MYO1C는 EGFR 수준의 막 분획에 영향을 미치지 않았다 (도 4의 a). 침윤 분석 결과는 si-MYO1D 처리시 EGFR에 의해 강화된 세포 침윤성을 억제함을 나타내었다 (도 8의 c). 이들 결과는 EGFR 패밀리의 발현 (ErbB3 제외) 및 침윤성에 대한 이들의 영향이 MYO1D의 넉다운 후에 감소됨을 나타냈다. 그러나, MYO1C 및 MYO1B는 원형질막에서 EGFR 패밀리를 유지하는 데 관여하지 않는다.
MYO1D가 원형질막에 EGFR 패밀리를 고정하는 기능을 할 수 있음을 고려하여, 본 발명자들은 다음으로 EGF과 이의 세포외 리간드인 EGFR이 결합하기 전에 MYO1D가 EGFR 단백질을 고정하는 기능을 하는지에 대해 확인하고자 하였다. EGFR은 EGF와 결합한 후 다운스트림 신호전달의 활성화를 위해 인산화되므로, EGF 처리 후 MYO1D가 결합된 EGFR의 인산화 상태를 확인하였다. 그 결과, 단지 비인산화된 EGFR만이 MYO1D와 결합하며 (도 8의 d), MYO1D가 EGFR이 인산화되고 EGF와의 결합 후에 활성화되기 전에 원형질막에서 EGFR을 고정하는 기능을 나타냄을 확인하였다. 또한, MYO1D의 결핍에 의한 RTK의 하향조절이 리간드에 의해 유도된 내재화로부터 야기되지 않음을 제안한다 (도 4의 d). 따라서, MYO1D의 결핍이 RTK의 리간드에 의해 유도된 하향조절에 영향을 미치는지의 여부를 확인하였으며, 이는 세포 표면 RTK 수를 조절하기 위한 장기적 메커니즘이다. 비록 규모는 작지만, EGF 자극에 의한 EGFR의 하향조절이 손상되지 않은 세포에서와 같이 MYO1D-넉다운 하에서 일어남을 밝혀내었다 (도 8의 e). 그러나, MYO1D의 발현은 EGF 자극의 타임-윈도우(time-window)에서 대략 유사한 수준을 보였다. 따라서, MYO1D에 의해 세포 표면에 EGFR을 유지하는 것은 RTK 수준의 리간드에 의해 유도된 조절과 무관하다. 더욱이, MYO1D는 EGF에 결합하기 전에 세포 표면 EGFR 수준의 유지를 위해 필요하다.
실시예 5: 세포 표면 상에서 MYO1D 및 EGFR 단백질의 공동-국소화(Co-localization)
전반사형광현미경(total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM)은 특히 원형질막에서 분자의 위치와 동역학을 분석하는 데 적합하다. 원형질막에서 MYO1D와 이의 수송 단백질(cargo protein)인 EGFR의 아세포(subcellular) 조직에 대한 깊은 이해를 얻고자 TIRFM을 사용하였다. 형광 표지된 EGFR 및 MYO1D를 MCF-7 세포의 원형질막에 클러스터링(clustering) 되었다 (도 10의 a, 상단 줄). 이는 MYO1D 및 EGFR 단백질 간에 적당한 공동-국소화 정도, 예컨대 MYO1D의 경우 22%, EGFR의 경우 39%가 원형질막에서 클러스터링 됨을 나타내었다. 이러한 결과는 원형질막에서 특이적이지만 독점적이지 않은 EGFR-MYO1D 상호작용의 존재를 시사한다. 다만, 모든 MYO1D가 EGFR와 클러스터링 되는 것은 아니다. EGFR과 비중첩된(non-overlapping) MYO1D는 원형질막에서 다른 RTK를 지지할 수 있다.
도 8의 e에서와 같이 EGF가 주어진 경우, 원형질막에서의 EGFR 형광 및 클러스터링된 EGFR-MYO1D은 현저하게 감소되었으며 (도 10의 b), 인산화를 통해 EGF와 결합하여 활성화된 EGFR은 원형질막으로부터의 내재화 및 세포내 물질수송을 하게 됨을 시사한다. 대조적으로, 원형질막에서의 EGFR의 분포 패턴은 MYO1D가 결핍된 MCF-7 세포에서 붕괴되었으며 (도 10의 a, 두번째 줄), 클러스터링된 EGFR-MYO1D는 두드러지게 감소하였다. si-scr이 처리된 세포와 비교하여 si-MYO1D가 처리된 세포에서는 EGFR 및 공동-국소화가 각각 33% 및 42% 만큼 현저하게 감소하였으며, 이는 MYO1D-결핍 하에 원형질막에서 감소된 EGFR-MYO1D 클러스터를 나타낸다. 이러한 결과는 EGFR 및 MYO1D의 상호작용이 MYO1D의 녹다운에 의해 하향조절될 수 있고, 이어서 원형질막에서 EGFR의 유지가 더 낮아짐을 보여주었다.
미오신-I이 N-말단 헤드 도메인을 통해 액틴과 결합하므로, 다음으로 본 발명자들은 원형질막에 EGFR을 고정하면서 MYO1D 기능에 대한 액틴 세포골격에서의 교란(perturbation)의 영향을 조사하였다. 액틴 네트워크 교란물질(disruptor)인 라트룬쿨린 B(latrunculin B)를 MCF-7 세포에 처리한 경우, 액틴 네트워크가 붕괴되고 변형되었으며, 세포의 F-액틴/G-액틴 비율도 두드러지게 감소하였다 (도 11의 a). 액틴 세포골격이 파괴되었을 때, EGFR 점(puncta) 및 클러스터링된 EGFR-MYO1D가 두드러지게 감소하였으며 (도 10의 a, 세번째 및 네번째 줄), 액틴 네트워크의 교란이 근복적인 세포골격으로부터 EGFR을 분리시킴을 시사한다. EGFR 및 MYO1D의 수준도 라트룬쿨린 B가 처리된 Caco2 세포로부터의 비오틴화된 막 제조물에서 감소되었다 (도 11의 b). 또한, 액틴-넉다운의 효과를 확인하였을 때, 액틴이 결핍된 Caco2 세포에서 EGFR과 MYO1D의 수준도 감소하였다 (도 11의 c). 따라서, 이러한 결과는 MYO1D가 원형질막에서 EGFR을 고정하고 이를 기본 액틴 세포골격에 고정시키는 기능을 한다는 세포 생물학 연구의 발견을 정량적으로 뒷받침한다.
실시예 6: MYO1D에 의한 세포 표면에서의 EGFR의 고정에 따른 EGFR의 다운스트림 신호전달 및 후속 세포 생존 유지
MYO1D는 원형질막에서 EGFR을 유지하는 작용을 하므로, 본 발명자들은 MYO1D의 넉다운이 EGFR 다운스트림 신호에 영향을 미쳐 세포증식에 영향을 미치는지의 여부를 확인하였다. MYO1D-넉다운 Caco2 세포에서 EGFR 다운스트림 신호, 예컨대 p-c-Jun, p-AKT, p-ERK, p-p38 및 p-JNK가 감소하였으며 (도 12의 a), 이는 세포 증식 및 이동과 관련이 있다. 또한, si-MYO1D를 일시적으로 발현하는 Caco2 세포는 24, 48 및 72시간에서 세포 증식의 현저한 감소를 나타내었다 (도 12의 b). 흥미롭게도, MYO1D의 발현 수준은 세포 증식의 타임 윈도우에서 점차적으로 증가되었다 (도 12의 b). 이러한 실험은 MYO1D가 원형질막 상에 EGFR을 유지함에 의해 EGFR의 다운스트림 신호전달을 조절함으로써 CRC 세포의 증식 및 이동을 조절하는데 가담할 수 있음을 나타내었다. 또한 대조적으로, 저수준의 MYO1D를 발현하는 SW620 CRC 및 MDA-MB231 유방암 세포를 사용하여 과발현된 MYO1D가 세포 운동성 및 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 안정적으로 발현되는 MYO1D를 갖는 SW620 및 MDA-MB 231 세포 둘다는 세포 증식에서 현저한 증가, 키테닌(KITENIN), EGFR 및 ErbB4의 상승된 단백질 수준, 및 벡터만이 발현되는 세포와 비교하여 증가된 고정-비의존성(anchorage-independent) 세포 성장을 나타내었다 (도 13). 이러한 데이터는 MYO1D에 의한 세포 표면 RTK의 기계적 고정이 RTK의 다운스트림 신호전달 및 후속 세포 생존을 유지하는데 필요하다는 것을 나타내었다. MYO1D가 세포 생존에 기여한다는 제안은 Myo1d-넉다운이 유의한 형태학적 변화를 유도하고 최종적으로 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하고, Myo1d-넉아웃 기관지 상피세포(tracheal epithelial cells)의 아폽토시스가 증가한다는 생체내(in vivo) 관찰에 의해 뒷받침된다.
실시예 7: MYO1D가 RTK와 상호작용하기 위해 필요하며, EGFR에 결합하기 위한 야생형 MYO1D와의 경쟁용 미끼(decoy) 펩티드로서 작용할 수 있는 MYO1D TH1 도메인의 평가
막 지질과 직접적으로 상호작용하는 독특한 미오신의 테일 호몰로지 1 (tail homology 1, TH1) 도메인은 적절한 아세포 국소화 및 카고(cargo) 결합의 특이성을 위해 필요하다. 따라서, 아마도 TH1 도메인은 원형질막을 액틴 필라멘트에 테더링(tethering) 하고, 미세융모 또는 부동섬모(stereocilia)와 같은 막-결합 돌출부의 형태를 유지하는 특정 기능을 갖는다. TH1 도메인은 다양한 길이 및 단백질 조성을 가지며 종종 다수의 별개의 표적 단백질에 결합할 수 있다. 본 발명자들은 다양한 결실 돌연변이체를 사용하여 Caco2 세포에서 MYO1D의 어느 영역이 RTK에 결합하는지를 조사하고(도 14의 a 및 도 15의 a), MYO1D 및 EGFR의 TH1 도메인과 KITENIN 간의 상호작용을 확인하였다 (도 14의 b). MYO1D TH1 도메인은 그의 카고(cargo)에 결합하는 데 필요하므로, 본 발명자들은 도메인이 EGFR을 유지하고 세포 증식 또는 침윤성을 증가시키는 데 있어서 전장(full-length) MYO1D에 대해 우성-음성(dominant-negative) 작용을 갖는지의 여부를 연구하였다. 음성 대조군으로서 MYO1D TH1 도메인 (MYO1D 803-1006-Myc) 또는 MYO1C TH1 도메인 (MYO1C 839-1017-Myc)을 안정적으로 발현하는 Caco2 세포를 제작하였다. 면역블롯 분석은 Caco2/MYO1C-TH1 세포에서는 아니나, Caco2/벡터 세포에서보다 Caco2/MYO1DTH1에서 감소된 EGFR 및 KITENIN의 단백질 수준을 나타내었다 (도 14의 c). 다음으로, 본 발명자들은 세포 증식 및 침윤에 있어서 MYO1D TH1 도메인 단독의 강제 발현 효과를 확인하였다. 세포증식 (도 14의 d) 및 침윤 (도 14의 e)은 Caco2/벡터 세포와 비교하여 안정적으로 발현하는 Caco2/MYO1D-TH1 세포에서 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 MYO1D TH1 도메인이 EGFR에 결합하는데 있어 야생형 MYO1D와 경쟁하는 미끼 펩티드(decoy peptide)로서 작용할 수 있고, 이에 의해 운동성 세포의 원형질막 상의 EGFR 수준을 감소시킬 수 있음을 시사하였다.
실시예 8: MYO1D에 대한 결합 부위로서 작용하는 EGFR 패밀리의 키나제 도메인과 EGFR 패밀리와의 결합에 있어서 중요한 MYO1D TH1 도메인의 C-말단 β-미앤더(β-meander) 모티프의 분석
MYO1D TH1 도메인은 추정상 플레크스트린(pleckstrin) 호몰로지 도메인을 포함하며 (도 15의 b), 이는 산성 인지질에 대한 결합력(affinity) 생성에 가담하고 막에 독특한 미오신-I 결합의 분자적 기초를 정의한다. MYO1D TH1 도메인의 어느 영역이 그의 카고(cargo) RTK에 결합되는지 확인하였다. 본 발명자들은 추정상 플레크스트린(pleckstrin) 호몰로지 도메인 바로 뒤에 위치한 MYO1D TH1 도메인 (962-1006 aa)의 C-말단의 구성이 MYO1C의 것과 다르며, β-미앤더(β-meander) 모티프로 알려져 있는 5개의 연속적인 β-시트 (8번째 내지 12번째)를 포함하고 있음에 주목하였다 (도 15의 b). 따라서, 상기 C-말단 영역이 EGFR과 결합하는 부위인지의 여부를 확인하였다. IP-면역블롯 분석 결과는 C-말단 영역이 EGFR 및 KITENIN과 상호작용함을 나타내었다 (도 16의 a). 대조적으로, IP-면역블롯 분석 (도 16의 a) 뿐만 아니라 침윤 분석 결과(도 16의 b)는 C-말단 영역을 갖지 않는 MYO1D TH1 도메인 (TH-ΔC)의 결실 돌연변이체가 EGFR에 결합하는데 있어 야생형 MYO1D와 경쟁하는 미끼 펩티드(decoy peptide)로서 작용하지 않았음을 나타내었다.
다음으로, 본 발명자들은 RTK의 세포질 단편 (CTD, 도 14의 a 및 도 2의 a) 내에서 MYO1D에 결합하는 영역을 확인하였다. 비인산화된 EGFR만이 MYO1D와 결합한 이전 결과 (도 8의 d)를 토대로 EGFR의 키나제 도메인이 그들의 상호작용을 담당하는지의 여부를 확인하는데 이르렀다. ErbB 패밀리의 다양한 결실 돌연변이체 (도 15의 c, d, e 및 f) 및 IP-면역블롯 분석을 사용하여, 본 발명자들은 MYO1D가 EGFR (도 16의 c), ErbB2 (도 16의 d) 및 ErbB4 (도 16의 f)와 상응하는 키나제 도메인과는 상호작용하지만, ErbB3의 유사-키나제(pseudo-kinase) 도메인 (도 16의 e)과는 상호작용하지 않음을 밝혀내었다. 이러한 결과는 β-미앤더(β-meander) 모티프를 포함하는 MYO1D TH1 도메인의 C-말단이 EGFR과 결합하는데 중요하고 EGFR 패밀리의 키나제 도메인이 MYO1D의 결합 부위로서 작용함을 나타내었다. 다음으로, 5개의 연속적인 β-시트 (8번째 내지 12번째) 내에서 β-시트 중 어느 것이 기능적으로 중요한지를 확인하고자 돌연변이 분석 및 침윤 분석을 하였다. 본 발명자들은 나머지 β-시트는 온전하게 두면서, 한 번에 하나의 β-시트의 잔기를 알라닌으로 치환하고, 돌연변이된 TH1 작제물(construct)이 야생형 TH1과 같은 미끼(decoy) 기능을 갖는지의 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 10번째 (도 17의 c) 및 11번째 (도 17의 d) 돌연변이된 TH1 작제물은 야생형 TH1과 거의 동일한 미끼(decoy) 기능을 가지고 있는 반면, 8번째 (도 17의 a), 9번째 (도 17의 b) 및 12번째 (도 17의 e) 돌연변이된 TH1 작제물은 야생형 TH1과 비교하여 미끼 기능을 가지고 있지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 TH1 도메인이 중요한 이차 구조로서 RTK와 결합하기 위해 3개의 β-시트, 8번째, 9번째 및 12번째가 필요하다는 것을 밝혀냈다.
실시예 9: 과발현된 MYO1D에 의한 종양형성(tumorigenicity) 증가의 생체내( in vivo ) 증거
MYO1D를 안정적으로 발현함으로써 세포 증식이 현저하게 증가되었기 때문에 (도 13의 a 및 도 14의 d), 동종 마우스 이종이식 모델(syngeneic mouse xenograft model)에서 종양 형성에 대한 과발현된 MYO1D의 효과를 조사하였다. SW620 및 MDA-MB231 세포에서와 같이 (도 13의 a), MYO1D를 안정적으로 발현하는 마우스 대장 선암종 (colon adenocarcinoma) CT-26 세포는 CT26/벡터 세포와 비교하여 증가된 세포 증식을 나타내었다. CT-26/벡터 세포와 비교하여 CT-26/MYO1D 세포를 주사한 Balb/c 마우스에서 현저히 빠른 종양 성장과 종양 부피 및 중량의 현저한 증가가 관찰되었다 (도 18의 a 및 도 18의 b). CT-26/MYO1D 그룹에서 19일째에 종양 조직에서 추출한 단백질의 면역블롯 분석 결과는 CT-26/벡터 그룹에서 상응하는 수준과 비교하여 상승된 수준의 EGFR 및 KITENIN 뿐만 아니라 상승된 MYO1D를 나타내었다 (도 18의 c). 19일째에 종양 조직의 면역조직화학 분석 결과는 CT-26/벡터 그룹에서 상응하는 수준과 비교하여 CT-26/MYO1D 그룹에서 상승된 수준의 EGFR 및 ErbB4 뿐만 아니라 상승된 MYO1D를 나타내었으며 (도 18의 d), EGFR 및 ErbB4의 발현 수준이 MYO1D의 발현 수준과 대략 유사하다는 것을 나타내었다. 또한, CT-26/MYO1D 마우스에서의 종양 중량은 종양 조직에서의 MYO1D 발현 수준과 양의 상관 관계가 있었다 (도 18의 e). 따라서, MYO1D는 마우스 이종이식 모델에서 생체내 종양 형성을 촉진시켰다.
다음으로, 본 발명자들은 면역조직화학을 사용하여, I기 내지 IV기의 CRC 환자로부터의 연속(serial) 대장암 조직 절편(section)에서 MYO1D의 발현 패턴을 확인하였다. I기 또는 Ⅱ기 CRC에서의 발현과 비교하여, MYO1D는 Ⅲ기 및 Ⅳ기 CRC로부터의 대장 종양 조직에서 높게 발현되었으며 (도 18의 f), MYO1D의 발현 수준은 CRC 세포의 국소 침윤성과 관련됨을 나타낸다. 면역조직화학적 MYO1D 발현을 정량적으로 평가하고자, 염색의 강도 및 양성적으로 염색된 영역의 크기를 사용하여 스코어를 계산하였다. MYO1D 발현 스코어는 상응하는 인접한 정상 대장 조직에서보다 모든 CRC 단계로부터의 종양 조직에서 현저하게 더 높았다 (p<0.001) (도 18의 g). 면역염색 (도 18의 f)에서와 같이, MYO1D 발현 스코어는 I기 및 Ⅱ기 (5.50±0.42 대비(vs) 5.55±0.63) 간에 그리고 Ⅲ기 및 Ⅳ기 (7.05±0.60 대비(vs) 7.05±0.43) 간에 유사하였지만, MYO1D 발현 스코어는 I기 및 Ⅱ기 CRC (n=40)로부터의 종양 조직에서보다 Ⅲ기 및 Ⅳ기 (n=40, p<0.01) CRC로부터의 종양 조직에서 현저하게 더 높았다 (도 18의 h). 이러한 결과는 MYO1D의 발현 수준과 인간 CRC의 진행된 단계 사이에 양의 상관관계가 존재함을 나타내고, CRC의 예후 지표로서 MYO1D의 발현 수준을 시사한다.
본 발명자들은 MYO1D의 넉다운은 원형질막으로부터 EGFR 패밀리와 같은 RTK의 분리를 초래하여 세포질로 들어가게 함에 따라 프로테아좀 분해를 통한 이의 하향조절을 야기하며, 원형질막에서 MYO1D에 의한 EGFR의 조절은 EGF에 의해 유도되는 EGFR 내재화와는 상이함을 밝혔다. 따라서, 본 발명의 결과는 MYO1D가 EGF와 이의 리간드인 EGFR과 결합하기 전에, 액틴 세포골격에 고정을 통해 원형질막에서 EGFR을 고정함으로써 세포 표면 상에 EGFR 수준을 유지하는 데 있어서 새로운 조절자로서 작용한다는 첫 번째 증거를 제공한다. 이 메커니즘은 RTK의 기존 내재화 및 재순환 조절과는 완전히 다르다. 따라서, 본 발명자들의 현재 연구 결과는 그들의 다운스트림 신호전달을 제어하는데 또한 기여하는 원형질막에 막-스패닝 단백질을 고정하는 설명에 대하여 재조명하였다.
MYO1D의 TH1 도메인이 내재성 전장 MYO1D의 주요 억제제로서 작용한다는 본 발명자들의 발견 (도 14의 c, d, e)은 N-말단 모터 도메인을 통한 액틴 세포골격과의 상호작용이 MYO1D가 원형질막에 EGFR을 고정하기 위해 필요하다는 것도 시사하였다. MYO1A 모터 도메인과 F-액틴의 상호작용은 확산 이동성을 제한하지만, TH1 도메인과 막의 상호작용은 세포 표면에 가까운 2차원 확산 이동성을 촉진하는 것으로 보고되었으며, EGFR은 2색 스토캐스틱 광학 재구성 현미경(stochastic optical reconstruction microscopy)을 사용하여 밝힌 바와 같이 액틴 세포골격 내에 위치한다. 이러한 보고를 고려할 때, 본 발명의 결과는 도 18의 i에 나타낸 바와 같이 요약할 수 있다. MYO1D는 EGF와 결합한 후 인산화되고 다운스트림 신호를 작동시키기 위해 활성화되기 전에 원형질막에 EGFR을 고정한다. MYO1D는 TH1 도메인 내의 막 결합 모티프를 통해 운동성 원형질막에서의 C-말단에 위치한 카고(cargo)-결합 부위에 결합된 그의 카고(cargo) EGFR을 유지하며, EGFR의 고정은 N-말단 헤드 도메인을 통해 기본 액틴 필라멘트에 동시 고정함에 의해 지지된다. EGF가 EGFR에 결합한 후, 인산화된 EGFR은 후속의 세포내 물질수송, 예컨대 클라트린-코팅된 피트(pit)로의 이동을 위해 기본 액틴 세포골격에 고정된 MYO1D로부터 방출된다. 기본 액틴 상에 고정이 RTK의 확산 이동성을 세포 표면의 국소화된 영역으로 제한하고, 액틴 교란이 기본 세포골격으로부터 EGFR을 분리시키는 것을 고려하면 (도 11), 하나의 MYO1D에 의해 지지되는 EGFR은 지질 라프트(lipid rafts)와 같이 제한된 국소 영역에서만 기능하는 것으로 보인다.
더욱이, 종양 성장이 MYO1D 수준에 의존함을 보여주는 마우스 종양 모델 및 MYO1D 수준이 CRC의 진행 단계로부터의 종양 조직에서 더 높다는 인간 연구에서의 결과는 MYO1D가 과발현된 ErbB 패밀리를 갖는 종양 조직에서 종양유전자(oncogene)에 의해 가능한 한 발암(carcinogenesis)을 촉진한다는 것을 시사한다. 따라서, MYO1D 기능의 차단은 암세포에서 EGFR의 다운스트림 신호전달을 차단하여 다양한 ErbB-과발현 종양의 성장을 억제하고 항-ErbB 작용제에 대한 내성을 극복하기 위한 새로운 접근법을 제공할 수 있다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION OF SUNCHON NATIONAL UNIVERSITY <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating of cancer containing the inhibitor of MYO1D expression or activity <130> PA-19-0157 <160> 75 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOD-WT-F1_F <400> 1 gagcaggaga gcctggaat 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOD-WT-F1_R <400> 2 aggcgcttga aatcttgaaa 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOD-WT-F2_F <400> 3 tgcctcagac aaaattctgg a 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOD-WT-F2_R <400> 4 gacccaggac tcggagtgt 19 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1C-TH1_F <400> 5 cccaagcttc catgaaggcc gtggctagtg a 31 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1C-TH1_R <400> 6 ggccaagaac gggcacctcg agcgg 25 <210> 7 <211> 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aatagggccc tctagatcag atgaggatcc caaagac 37 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB2-CTD_F <400> 31 tgcctctccc gaattcaagc gaggcagcag aag 33 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB2-CTD_R <400> 32 aatagggccc tctaga 16 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB2-CTF1_F <400> 33 tgcctctccc gaattcaagc gaggcagcag aag 33 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB2-CTF1_R <400> 34 aatagggccc tctagatcag accacaaagc gctggg 36 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB2-CTF2_F <400> 35 tgcctctccc gaattcatcc agaatgagga cttgg 35 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB2-CTF2_R <400> 36 aatagggccc tctaga 16 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB3-CTF1_F <400> 37 cgggattcca tgaaggaagc ttaaagt 27 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB3-CTF1_R <400> 38 ccgctcgagt taggtgaact cattggcta 29 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB4-CTF1_F <400> 39 tacgctcggg gtaccagaag gaagagcatc aaaaa 35 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB4-CTF1_R <400> 40 cagggtgatg atcgtatgta actcgagcat gcatct 36 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB4-CTF2_F <400> 41 tacgctcggg gtaccaagct tcccagtcca aatg 34 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ErbB4-CTF2_R <400> 42 ccggaatact gtggtgtaac tcgagcatgc atct 34 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-ECD1_F <400> 43 ggggtaccat gaaggccccc gctgtg 26 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-ECD1_R <400> 44 ccgctcgagc ctattaaagc agtgctc 27 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-ECD2_F <400> 45 ggggtaccat gacacttctg agaaattca 29 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-ECD2_R <400> 46 ccgctcgagt gtgaaattct gatctgg 27 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CTD_F <400> 47 tacgctcggg gtaccggatt gattgctggt gttg 34 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CTD_R <400> 48 cttctgggag acatcatagc tcgagcatgc atct 34 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CTF1_F <400> 49 ggggtaccat gaaaaacctg aattca 26 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CTF1_R <400> 50 ccgctcgaga atcaggctac tggga 25 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CTF2_F <400> 51 ggggtaccat ggtgcatttc aatgaa 26 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Met-CTF2_R <400> 52 ccgctcgagc tatgatgtct ccc 23 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1B_siRNA_1 <400> 53 cugaagagcu ccucaauaat t 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1B_siRNA_2 <400> 54 cacacuuccu gcuaaugaat t 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1B_siRNA_3 <400> 55 guaucaauga gcucacaaat t 21 <210> 56 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1C_siRNA_1 <400> 56 aaaucaauga cugucagagc cuucc 25 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1C_siRNA_2 <400> 57 guccaguauu ucaacaacat t 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1C_siRNA_3 <400> 58 cgugcggaca auaagcaaat t 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1C_siRNA_4 <400> 59 cuuggcaccu ugucuuucut t 21 <210> 60 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1D_siRNA_1 <400> 60 gcgccuuaug uauaacaguu caaau 25 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1D_siRNA_2 <400> 61 cucucuacau cuccagaaat t 21 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1D_siRNA_3 <400> 62 cagaauugcu cucuacuaat t 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MYO1D_siRNA_4 <400> 63 ccaaggauca ucuuacuuat t 21 <210> 64 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human KITENIN_siRNA <400> 64 gcuuggacuu cagccucgua gucaa 25 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta8_F <400> 65 gcagcaacca acccagtaca gtgcag 26 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta8_R <400> 66 tgctgcaagg tggcgcttct cactct 26 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta9_F <400> 67 gccgcagctc acgggaagaa gtgcaccg 28 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta9_R <400> 68 cgcagctgcg ttggtgacgt tcacttgaag gt 32 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta10_F <400> 69 gccgcggctg cacggctcaa ccagccccag 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta10_R <400> 70 ggccgcagct gccttcccgt gcaggctgca 30 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta11_F <400> 71 cagcaaatcg ctcgggcttc atcc 24 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta11_R <400> 72 ctgctgcggg ctggggctgg ttga 24 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta12_F <400> 73 gctgctgcgc ccgagcgatt cttggt 26 <210> 74 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYO1D TH1-beta12_R <400> 74 agcagcaccc gggaacctcg agtctag 27 <210> 75 <211> 5510 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 acagcgcccg gcagccgcgg cgggaggagc ggaaactgtc gggtgcgtcc cgttcggagc 60 cgcgccggcc gagaaggcgc cgaggagcag cgaggcggcc tctgtccggc ccggacccgc 120 cgagcggcgt gcgcgccccc tccccgtagc ctcgcggcgc ggcctcgccc cggcccctcc 180 cgagctcatc gcgggcccac ggagcggccc cggaggcccg agcgcgccca cctgagcccc 240 cgcgctggcg ccatggcgga gcaggagagc ctggaattcg gcaaggcaga cttcgtgctg 300 atggacaccg tctccatgcc cgagttcatg gccaacctca ggctcagatt tgaaaaaggg 360 cgcatctata cgttcattgg agaagtcgtc gtttctgtga acccttacaa gttgttgaac 420 atctatggaa gagacacaat tgagcagtat aaaggccgtg agctgtatga gagaccgcct 480 cacctttttg ctattgcgga tgctgcttac aaggctatga agaggcgatc aaaagacact 540 tgtattgtga tatcagggga aagtggagct ggtaaaacgg aagccagtaa gtacattatg 600 cagtatattg cggccatcac caaccccagt cagagagcag aggttgaaag agtgaagaat 660 atgttgctta agtccaactg tgttttggaa gcttttggaa atgccaaaac caaccgtaat 720 gacaactcaa gcaggtttgg aaaatacatg gatatcaact ttgacttcaa gggtgaccct 780 attggtgggc atatcaataa ctacttacta gaaaagtctc gagtgattgt gcaacagcca 840 ggagaaagaa gctttcattc tttctatcag ctactccaag gaggttcaga acaaatgcta 900 cgctctctac atctccagaa atccctttca tcctacaact atattcatgt gggagctcaa 960 ttaaagtctt ctatcaatga tgctgccgaa ttcagagttg ttgctgatgc catgaaagtc 1020 attggcttca aacctgagga gatccaaaca gtgtataaga ttttggctgc tattctgcac 1080 ttgggaaatt taaaatttgt agtagatggt gacacgcctc ttattgagaa tggcaaagta 1140 gtatctatca tagcagaatt gctctctact aagacagata tggttgagaa agcccttctt 1200 taccggactg tggccacagg ccgtgacatc attgacaagc agcacacaga acaagaggcc 1260 agctacggca gagacgcctt tgccaaggca atatatgagc gccttttttg ttggatcgtt 1320 actcgcatca atgatattat tgaggtcaag aactatgaca ccacaatcca tgggaaaaac 1380 actgttattg gtgtcttgga tatctatggc tttgaaatct ttgacaacaa cagttttgaa 1440 caattctgta tcaattactg caatgagaaa ctgcagcagc tatttattca gctggttctg 1500 aagcaagaac aagaggaata ccagcgggaa gggatcccct ggaaacatat tgactacttc 1560 aacaatcaga tcattgttga cctcgtggag caacagcaca aagggatcat tgcaatcctt 1620 gatgatgctt gcatgaatgt cggcaaagtc accgatgaaa tgtttcttga agcacttaac 1680 agtaaattgg gcaaacacgc ccatttttcc agccgaaagc tctgtgcctc agacaaaatt 1740 ctggagtttg atcgagattt tcgaattcga cattatgcag gcgatgtagt ctattctgtc 1800 attggtttta ttgacaaaaa taaagatact ttatttcaag atttcaagcg ccttatgtat 1860 aacagttcaa atcctgtgct caagaatatg tggcctgaag gcaaactgag cattacagag 1920 gtgaccaagc gacctctgac tgctgctacc ttgtttaaga attctatgat tgctctagta 1980 gacaaccttg catcaaagga accatattac gttcgttgca tcaaacccaa tgacaagaaa 2040 tctccacaga tatttgatga tgaacgctgc cggcaccaag tagaatatct tggactactg 2100 gaaaatgtga gagtgcgtcg ggcaggattt gccttccgcc agacatacga gaagtttctt 2160 cacaggtata agatgatctc tgaattcacc tggcccaacc atgaccttcc ttcagacaaa 2220 gaggctgtca agaaactaat tgaacggtgt ggttttcagg atgatgtagc ttatgggaag 2280 accaaaattt tcattcgaac accccgaaca ttgtttacct tggaagaact ccgtgcccag 2340 atgctcataa ggattgtcct ctttctacaa aaggtgtggc ggggcaccct ggcccgcatg 2400 cggtacaaaa gaaccaaggc agctctgaca ataatcaggt actaccggcg ctacaaagtg 2460 aagtcgtaca tccacgaggt ggccagacgc ttccatggcg tcaagaccat gcgagactac 2520 gggaagcacg tgaagtggcc aagccctcct aaagttcttc gccgttttga ggaggccctg 2580 cagacgattt tcaatagatg gagagcatcc cagctcatca agagcattcc ggcctcagac 2640 ctgccccagg tcagggcaaa ggttgcagcc gtggaaatgt tgaagggtca aagggctgac 2700 ctcgggctcc agagggcctg ggagggcaac tatcttgctt caaagccaga tacacctcag 2760 acctcaggca cttttgtccc tgttgctaat gaattgaaac ggaaggacaa atacatgaat 2820 gtcctctttt cctgtcacgt ccgtaaggta aatcgattta gtaaggtgga agacagagca 2880 atttttgtca ctgaccgtca cctgtataaa atggatccca ctaaacagta caaggtgatg 2940 aagactatcc ctctatacaa tttgactggt ctgagtgtct ccaatggaaa ggaccaactt 3000 gtagtgttcc atacgaaaga caacaaagac ctcattgtct gcctcttcag caaacagcca 3060 acccatgaga gtcgaattgg agaacttgtt ggagtgctgg tgaatcattt caagagtgag 3120 aagcgccacc ttcaagtgaa cgtcaccaac ccagtacagt gcagcctgca cgggaagaag 3180 tgcaccgtct ccgtggagac gcggctcaac cagccccagc ccgacttcac caagaatcgc 3240 tcgggcttca tcctcagcgt gcccgggaac tgacgccccg cggaggcctg gcccggagcc 3300 cggccacact ccgagtcctg ggtcccagtc cagctgctgc ctcccaaccc atgcccgcta 3360 gaaacctgct gcgagggccc ctcccagagg agccccgccc ctgtaagatt tccttcctgg 3420 ttttctgcct ttggtatcat cttcctctgt ccttactgtc cacggtccct gttcaataag 3480 ccaaagaccc tggtgccccg cccagacccc tgggctgacg tccagaccaa tctcacccca 3540 gaggcaactg gatggtgcct ttagttggtg cggatgcccc gtggccaggt caagtcagag 3600 cacctggaca ggtgtcctcc ctgctgctga ccctgcagag ggaaggggtg gggatgcagg 3660 accccactct gcgggagccc catagccacc tctcttgccc aaggtgagcc agccctgggg 3720 acccagctca gggaggctct gctcagagtt cggcggaccc accccaaccc aactcccagc 3780 cgccagccaa agccactggg tgagcagagt cacccacagg gccagcccct cagccaggag 3840 ccagtggcag gagcggaaca gcccatccag cagagtgagt ccatccttcc caggttctcc 3900 cctgggagac tccctttgcc accaaggccc ccaccagggc ctctgaccac cgctctggag 3960 aggacagtgt ggcatgctcc aaggatcatc ttacttaact cgcagcctgt ggctgtggtc 4020 ctcttataga tactttcacc gtttgcaggg ttgctaatca gatacctgct gtcaccacac 4080 ttgggtcagg aaccctaatg agaacgggga gctgccaggg tgagggcagc cctcagggtc 4140 ggccgctttc cctctggacc acctcccgct gcgtttccta ctcagagaaa cagcaagggc 4200 ggggtcaaga cacgggatga cgggaagcag gaagcggggc agcagcacag cgtggggtcc 4260 tggcactgca ggccaggcca ggatgcccac cccgccctct acacggcccc ttggggcctg 4320 cgcccgtgaa actggtgcca gggagcactg ccagcttgcc agtttctgcc cagcaaaagc 4380 acgtatgctt caggggcctt ctgagaccac cttccccact gagccccagc tgctgagaag 4440 gccttgaggg aagtagaggc tgggagcaaa tgccccatgc ggtgagagga tgaggggagc 4500 ctacgcctca ggcatgtggt gagaggatga gggggaggga gccaacgcct caggtggagt 4560 gggcagaggt gcaagagagg gatgtactga agcttcttcc cgtcctgcca cagacacttc 4620 tcctgccttc ccaccctgac ccggcagaac ccaccaagtg cctgtgtgca gcctcctgtg 4680 cctcacccag ggcctgaccc cagagtggtc ccaacaaccc ggtctcatgc ccactcccca 4740 tccctgcttc ccaaaaattg cactgtgtgc agtttgcaac aaagaatccc gctggcatcc 4800 tgtccttggg aaccctttct cattctccaa gcctggtcag ctgcctgcac aggcagaggt 4860 gccctcagcc cagattagca acactcatag ttttgccaat taccagtaga cactagtgga 4920 accatctaac tggaacttcc tctctccttc cacttatttc ctcaaacttg ttgctttaca 4980 ctagacacat gcaaatgtat gttttaaaca caccaaaaca gatcatgcca aatgagttgc 5040 ctgtcaaagg ctggagggca ggaggagggc ctgggtttgg gttctttcct cccagccttt 5100 ggatggtgcc ttgggcccct tagccccagc gccagggcct cccagctgag gccacaggac 5160 aagcactttt ttatgatgta ctaaaagcca cagtatgtgg caactgcaaa aggatcagga 5220 atttagggta tgatctcggt cacgtgtccc gggcgctgag gggaaaggaa gcgggcatga 5280 ttgtagacaa tgagggggtt ctcttgatgt aatgaaatgc aattttatgg tttggtgcaa 5340 aaactcctat tttccagtaa attaacttta tttctaaagc atattttgat ttgccatcaa 5400 gagcaataaa gcattaaatc ttatttttaa aggtgttctg cttatctgtc actgaaaact 5460 tggtgaaatt tttgcttaaa taaagtcaac cattatctgg gaggatagaa 5510

Claims (15)

  1. MYO1D(Myosin-1D) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 서열은 서열번호 75로 표시되는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 mRNA 발현 억제제는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 micro RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 60 내지 서열번호 63 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 위암, 방광암, 간암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것인, 약학 조성물.
  6. MYO1D(Myosin-1D) 단백질의 발현 수준 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것인, 암 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 암 진단용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 암 진단용 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 위암, 방광암, 간암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것인, 암 진단용 조성물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트.
  11. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료의 MYO1D(Myosin-1D) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 MYO1D 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군의 시료의 발현 수준보다 높은 경우 암이 발병될 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 위암, 방광암, 간암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것인, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  14. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 암세포 또는 암 세포주에 후보물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 후보물질에 접촉시킨 암세포에서 MYO1D(Myosin-1D) 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 정상 대조군으로부터 분리된 세포 또는 세포주에 후보물질을 접촉시킨 뒤, MYO1D 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 (b) 단계의 발현 수준과 (c) 단계의 발현 수준을 비교하여, 상기 (b) 단계의 MYO1D 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준이 상기 (c) 단계의 MYO1D 단백질 또는 상기 MYO1D 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준에 비하여 감소한 경우 항암제로 선별하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 신장암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 위암, 방광암, 간암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것인, 항암제 스크리닝 방법.
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Fry WH. et.al., Exp Cell Res., 315:697-706, 2009
Goh LK. et.al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 5:a017459, 2013
Sweeney C. et.al., Br J Cancer., 90:289-293, 2004

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