JP2002532515A

JP2002532515A - 蛋白質チロシンホスファターゼｔｃ−ｐｔｐの治療的および診断的利用

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Publication number: JP2002532515A
Application number: JP2000588360A
Authority: JP
Inventors: マイケルトレンブレイ; サンチェスマリアドジーザスイバーラ; ポールダニエルシモンシック
Original assignee: マクギルユニバーシティー
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2002-10-02
Also published as: US6534056B1; EP1137780A1; CA2353997A1; WO2000036111A1; AU1543600A

Abstract

(57)【要約】 T細胞蛋白質チロシンホスファターゼ（TC-PTP）活性の操作により、DNA傷害因子に対する細胞の感受性、および細胞周期の進行を調整する。TC-PTPを欠失した細胞の表現型特徴付けにより、細胞周期の進行の欠陥、およびDNA傷害因子に対する感受性が示された。TC-PTPとその基質であるp62dokとの相互作用に関するアッセイ法を含む、TC-PTPの活性に影響を及ぼす作用物質を選択するためのスクリーニングアッセイ法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、DNA傷害因子（DNA damaging agent）に対する細胞の感受性を調整
するため、および細胞周期を調節するためのT細胞チロシンホスファターゼ（TC-
PTP）の使用に関する。

【０００２】発明の背景蛋白質のリン酸化は、調節シグナルを細胞外から核へと運ぶ蛋白質を選択的に
修飾するために細胞が用いている一般的な調節機構である。これらの生化学的修
飾を行う蛋白質は、プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼとして
知られる一群の酵素である。最初の蛋白質チロシンホスファターゼはトンクス（
Tonks）ら（1988）J. Biol. Chem. 263：6722〜6730によって10年以上前に特徴
付けが行われ、それ以来、ファミリーのメンバーがほかにも数多くクローニング
され、生化学的な特徴付けがなされた。しかし、生物的機能が明らかになってい
るのはファミリーの少数のメンバーに過ぎない。

【０００３】最も以前に報告されたPTP酵素の一つは、T細胞蛋白質チロシンホスファターゼ
（TC-PTP）であった。TC-PTPをコードするcDNAは、最初はヒトT細胞ライブラリ
ーから単離されたが（Coolら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. 86：5257〜5261
）、これは広範に発現されている。マウスおよびラットにも非常に類似した相同
体があり、それぞれMPTPおよびPTPSと命名されている（Mosingerら（1992）P.N.
A.S. 89：499〜503；Radhaら（1997）FEBS Lett 409：33〜36）。

【０００４】 TC-PTPは最初に同定されたホスファターゼの一つであったが、このPTPの機能
は不明である。上皮増殖因子受容体（EGFR）およびSHCアダプター蛋白質と基質
捕捉性TC-PTP C216S変異体との特異的な会合に基づき、TC-PTPが受容体キナーゼ
シグナル伝達に役割を果たす可能性が提唱された（Tiganisら（1998）Mol. Cell
. Biol. 18：1622〜1634）。TC-PTP mRNAレベルが細胞周期特異的な様式で変動
するという報告により、TC-PTPの機能には別の側面もあることが示唆されている
。TC-PTP mRNAレベルはG0期およびG1前期に上昇し、細胞周期の他の時期には低
下するように思われる（Tillmannら、前記）。これとは異なり、ラットPTPS相同
体の蛋白質レベルには細胞周期による変動はみられないが、核区画と細胞質区画
との間で変化があるように思われる。これと類似した局在性の変動はヒト45kDa
蛋白質についても報告された。

【０００５】 TC-PTPノックアウトマウスに関する最近の刊行物では（You-Tenら（1997）J.
Exp. Med. 186：683〜693）、ホモ接合型動物が生後3〜5週で死亡することが示
されており、これは一部には赤血球産生不全による重症貧血に起因する。このTC
-PTP-/-マウスでは、間質細胞がほとんどないことに起因する骨髄微小環境の欠
陥がみられ、コンカナバリンAまたはリポ多糖（LPS）のいずれかによる全般的な
細胞活性化を行ってもT細胞およびB細胞が増殖能を示さない。

【０００６】細胞周期は、相互作用する蛋白質の複雑なネットワークによって調節され、こ
れらの蛋白質の活性は、リン酸化反応によって調整される。この調節により、DN
A複製へとつながる協調的な下流工程が行われる。細胞周期は主として、サイク
リン依存性キナーゼ（Cdk）およびその調節性サブユニットであるサイクリンと
いう2つの異なる蛋白質ファミリーによって制御されている。シェル（Sherr）ら
（1996）Science 274：1672〜1677。特定のサイクリン／Cdk複合体の集合および
分解は、細胞周期における中心的な事象である。G1期を介した進行は、G1前期に
活性があるサイクリンD／Cdk4,6、およびG後期に活性が高いサイクリンE／Cdk2
という2つの異なる複合体によって制御される。この2つの複合体の主な基質は網
膜芽細胞腫遺伝子Rbの産物である。Rb蛋白質はS期への進行に対するリプレッサ
ーであることが知られている。RbがG1前期にはサイクリンD／Cdk4,6によって、G
1後期にはサイクリンE／Cdk2によってリン酸化されると、E2F転写因子に対する
その親和性が低下し、S期のために重要な遺伝子の転写が開始される。

【０００７】癌の多段階進行の過程では、正常細胞が調節の手がかりを喪失または獲得し、
それによって変化が生じて無秩序な増殖に至ることがある。これらの変化には、
腫瘍細胞の細胞周期、DNA修復、分裂、およびアポトーシスの性質に影響を及ぼ
すシグナル伝達事象が含まれる。DNA修復および細胞周期の調節が正常発生およ
び腫瘍発生のいずれの過程にも重要なことを考慮すれば、TC-PTPによってもたら
される、またはそれに作用するシグナル伝達事象、作用機序、および調節には大
きな関心がもたれる。

【０００８】発明の概要 T細胞蛋白質チロシンホスファターゼ（TC-PTP）活性の操作によって、DNA傷害
因子に対する細胞の感受性を調整するための方法および組成物が提供される。TC
-PTP活性を変化させることによって細胞周期の進行を調節する方法も提供される
。TC-PTPを欠失した細胞の表現型特徴付けにより、細胞周期の進行の欠陥、およ
びDNA傷害因子に対する感受性が示された。TC-PTPとその基質であるp62dokとの
相互作用に関するアッセイ法を含む、TC-PTPの活性に影響を及ぼす作用因子を選
択するためのスクリーニングアッセイ法が提供される。

【０００９】本発明の1つの態様では、DNA傷害因子に対する感受性を誘導するために、例え
ばDNA傷害性の化学療法または放射線療法に対する感受性のある腫瘍の感受性を
高めるために、TC-PTP活性の阻害因子を用いる。阻害因子には、ドミナントネガ
ティブ変異体、TC-PTP基質蛋白質の阻害性断片または変異体、アンチセンス核酸
、低分子阻害物質などが含まれる。

【００１０】本発明のもう1つの態様では、DNA損傷に対する防御策として、TC-PTP活性をア
ップレギュレートするかまたは別の様式で細胞に提供する。特に関心がもたれる
のは、例えば、血管拡張性失調症およびDNA修復に欠陥のある他の疾患などの、D
NA損傷に対する急性的または慢性的な感受性がある患者に対してTC-PTP活性を提
供することである。

【００１１】特定の態様の詳細な説明 DNA傷害因子に対する細胞の感受性を変化させるため、および細胞周期の進行
を調節するために、T細胞蛋白質チロシンホスファターゼ（TC-PTP）活性の操作
を用いる。TC-PTPを欠失した細胞の表現型特徴付けにより、細胞周期の進行の欠
陥、およびDNA傷害因子に対する感受性が示された。TC-PTPとその基質であるp62
dokとの相互作用に関するアッセイ法を含む、TC-PTPの活性に影響を及ぼす作用
因子を選択するためのスクリーニングアッセイ法が提供される。

【００１２】 T細胞ホスファターゼ（TC-PTP）は、蛋白質チロシンホスファターゼ遺伝子フ
ァミリーに属し、遍在性に発現される。増殖アッセイ法およびフローサイトメト
リーにより、TC-PTP-/-線維芽細胞および細胞系はG1期の遅延を呈することが示
されている。また、これらの細胞はさまざまなDNA傷害因子に対する過敏性を示
すほか、アポトーシスの発生率も高い。相同的および非相同的な組換えは、DNA
鎖の切断修復のための重要な機構であるが、TC-PTP活性がないと著しく減少する
。さらに、TC-PTPの基質は、DNA修復応答に関与することが知られているp62dok
であることが示されている。TC-PTPの過剰発現は多数の癌細胞で認められており
、腫瘍の検出および病期判定のための診断アッセイ法にTC-PTPレベルの検出を用
いうる可能性もある。

【００１３】細胞におけるTC-PTP活性のレベルを変化させることにより、標的細胞における
細胞周期およびDNA修復を操作することが可能である。TC-PTPをアップレギュレ
ートすることにより、γ線照射、UVC照射、メチルメタンスルホネート処理など
のDNA傷害因子に対する細胞の抵抗性が高まる。一方、TC-PTPを阻害すれば、細
胞の感受性が高まる。TC-PTPの阻害には、細胞をG1期に遅延させ、治療処置のた
めにより同調化された細胞集団が得られるようにする効果もある。

【００１４】腫瘍細胞の化学療法薬および放射線照射に対する感受性を高めることは、例え
ば、低線量の放射線照射または低用量の治療薬の致死性を高めるためには望まし
いと思われる。逆に、この種の薬剤または放射線照射に対する患者の骨髄細胞の
感受性を低下させることも非常に有益と思われる。TC-PTP活性を変化させるため
には種々の方法および組成物を用いうる。阻害因子としては、アンチセンス核酸
、抗体、またはそれに由来する断片、基質もしくは他の調節分子に由来するペプ
チド、および低分子阻害物質などを投与しうる。活性を高めるために、外因性核
酸構築物の発現、内因性コード配列のアップレギュレーションなどにより、TC-P
TPを蛋白質として送達することが可能である。

【００１５】定義本発明は、特定の方法、プロトコール、細胞系、動物種または属、および記載
される試薬に限定されることなく、このようなものは変化しうることが理解され
る必要がある。また、本明細書で用いる用語は、特定の態様を説明することのみ
を目的としており、本発明の範囲を制限するものではなく、それは添付の特許請
求の範囲のみによって制限されると考えられる。

【００１６】本明細書で用いる単数形の「1つの（a, an）」および「その（the）」は、そ
の文脈で別の指示が明らかになされない限り、複数のものに関する言及も含む。
したがって、例えば、「1つの（a）細胞」という言及は複数のこのような細胞を
含み、「その（the）キナーゼ」という言及は1つまたは複数のキナーゼ蛋白質お
よび当技術分野で既知のその同等物に対する言及を含み、その他も同様である。
本明細書で用いる別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語
および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味を
持つものとする。

【００１７】 T細胞蛋白質チロシンホスファターゼ：哺乳動物蛋白質チロシンホスファター
ゼの一つである。ヒトTC-PTPコード配列の配列は、ゲンバンク（Genbank）アク
セッション番号M25393で見ることができる。TC-PTPは最初にクール（Cool）ら（
前記）によってクローニングされ、すべてのPTPアーゼに存在する236アミノ酸の
コア領域においてそのPTP1Bとのアミノ酸配列同一性が72％であることが示され
た。

【００１８】マウス酵素は、ヒト相同体と93.2％の同一性を示し、PTP1Bとは95％の同一性
を示した。TC-PTPは触媒ドメインに加えて非触媒性C末端ドメインを含み、その
サイズおよび疎水性は選択的スプライシングのためにさまざまである。ヒトおよ
び齧歯類ではTC-PTPに関して主に2種類のスプライス形態が見いだされている（C
hampion-Arnaudら（1991）Oncogene、6：1203〜1209；Mosingerら（1992）Proc.
Natl. Acad. Sci. 89：499〜503）。この2つのmRNAはスプライス供与部位の使
用に伴って3'コード配列が異なり、その結果、特有のカルボキシル末端を有する
48kDaまたは45kDa蛋白質が合成される。

【００１９】ヒト細胞では、48kDa TC-PTPは主として、界面活性剤による処理を必要とする
細胞抽出物の画分に局在する。この48kDa TC-PTPは19個の疎水性アミノ酸残基を
C末端に含み、これが、TC-PTPが小胞体（ER）に標的化することに寄与している
（Kamatkarら（1996）J. Biol. Chem. 271：26755〜26761）。45kDa型はC末端に
疎水性セグメントがなく、代わりに8個の塩基性アミノ酸ドメインがあり、45kDa
が核に局在する原因となっている。この核局在化シグナル（Tillmannら（1994）
Mol. Cell. Biol. 14：3030〜3040）に加えて、核内輸送因子p97が45kDaアイソ
フォームのカルボキシル末端と会合することが報告されている。この両方の形態
のTC-PTPの生物的機能はその局在に応じて異なるという可能性が示唆されている
。

【００２０】 TC-PTPの基質はp62dokであり、これは活性化チロシンキナーゼを含む多くの細
胞で高度にリン酸化されている62kDa蛋白質である。p62dokには既知の蛋白質と
の相同性はほとんどないが、SH2結合部位と推測される顕著な一連のチロシンお
よび隣接配列を有する。p62dokの配列はゲンバンク（Genbank）アクセッション
番号U78818で得ることができる。

【００２１】 DNA傷害因子：本明細書で用いる場合、これは、UV照射、γ線照射、X線、アル
キル化剤、DNAとの結合によってDNA損傷を誘発する抗生物質、トポイソメラーゼ
の阻害物質、およびDNA損傷を引き起こすことによって作用する化学療法に用い
られる任意の化合物を含む、細胞におけるDNA損傷を誘発する任意の物質または
処理を意味する。有用と考えられる化学療法薬には、VM-26、プロカルバジン、
アドリアマイシン、5-フルオロウラシル（5FU）、エトポシド（VP-16）、カンプ
トテシン、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン（CDDP）、さ
らには過酸化水素が含まれる。また、本発明は、X線とシスプラチンの併用また
はシスプラチンとエトポシドの併用といったように、放射線を用いるものか実際
の化合物であるかにかかわらず、1つまたは複数のDNA傷害因子の使用も含む。

【００２２】 TC-PTP阻害因子：DNA傷害因子に対する感受性を高めるのに有用な作用因子はT
C-PTPを阻害しうる。有効量は、一般にホスファターゼ活性の少なくとも約50％
、通常は少なくとも約90％を阻害するものと考えられ、さらには約95％またはそ
れ以上を阻害してもよい。阻害因子の一般的なクラスには、アンチセンス核酸、
抗体、TC-PTP基質蛋白質の断片または変異体、および低分子阻害物質が含まれる
。

【００２３】バナジン酸塩は蛋白質-チロシンホスファターゼを阻害するが、バナジウムを
用いたホスファターゼ阻害因子は比較的特異性が低い。しかし、補助リガンドを
設計することにより、バナジン酸化合物の特異性を高めることができる（Posner
ら（1994）J. Biol. Chem. 269：4596〜4604）。

【００２４】阻害化合物は、p62dokを含むTC-PTP基質の配列に由来するものでもよい。TC-P
TPと相互作用するその他の候補には、DNA修復蛋白質RAD51およびRNAポリメラー
ゼII CTDドメインがあり、これらはc-abl基質である。生理的基質に関する基準
は、それがインビトロでC→S変異体によって特異的にトラップされること、およ
び-/-細胞内またはホモ接合型ノックアウトマウスの組織中で過剰リン酸化を受
けることである。

【００２５】例えば、ホスホノメチルフェニルアラニン（Zhangら（1994）Biochemistry 33
：2285〜2290）；ジフルオロホスホノメチルフェニルアラニン（Burkら（1991）
Synthesis 11：1019〜1020）；L-O-マロニルチロシン（Koleら（1995）Biochem.
Biophys. Res. Commun. 209：817〜822）；ケイ皮酸（Moranら（1995）J. Am.
Chem. Soc. 117：10787〜10788；Gaoら（1995）Bioorganic Med. Chem. Lett. 5
：2953〜2958）；スルホチロシル（Liottaら（1994）J. Biol. Chem. 269：2296
9〜23001）などの、非加水分解性のリン酸チロシン類似体を特異的なペプチド基
質に組み入れてもよい。ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニンまたはスル
ホチロシルを含むペプチド類似体を、チロシンの置換物として用いることも可能
である（Chenら（1995）Biochem. Biophys. Res. Commun. 216：976〜984）。

【００２６】ホスファターゼの天然の阻害因子には、オカダ酸、タウトマイシン、カリキュ
リンA、チルシフェリル（thyrsiferyl）-23-アセテート、カンタリジン、ミクロ
シスチンLR、ノジュラリン（nodularin）、モツポリン（motuporin）などが含ま
れる。

【００２７】または、化学的ライブラリーをTC-PTP活性の阻害に関してスクリーニングして
もよい。この目的には、標識リン酸の放出、放射線感受性の上昇、インビトロ蛋
白質-蛋白質結合アッセイ法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、蛋白質結合に
関するイムノアッセイ法などを含む多種多様なアッセイ法を用いうる。特に関心
がもたれるのは、TC-PTPとその特異的基質との間の相互作用を利用するアッセイ
法である。

【００２８】本明細書で用いる「作用因子（agent）」という用語は、TC-PTPの酵素活性を
阻害しうる任意の分子、例えば蛋白質または医薬品を表す。一般には、種々の濃
度に対する反応の差を調べるために、複数のアッセイ混合物に対してさまざまな
濃度の作用因子を同時並行的に用いる。典型的には、これらの濃度の一つが陰性
対照、すなわちゼロ濃度または検出限界以下としての役割を果たす。

【００２９】候補作用因子には数多くの化学物質群が含まれるが、それらは一般には有機分
子、好ましくは分子量が50ダルトンよりも高く約2,500ダルトンよりも低い低分
子有機化合物である。候補作用因子は、蛋白質との構造的相互作用、特に水素結
合のために必要な官能基を含み、一般にはアミン、カルボニル、ヒドロキシル、
またはカルボキシル基を少なくとも1つ含み、好ましくはこのような化学官能基
を少なくとも2つ含む。候補作用因子はしばしば、1つまたは複数の上記の官能基
によって置換された、環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もし
くは多環芳香族構造を含む。候補作用因子は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロ
イド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの組み合わせを
含む、生体分子からも見いだされる。

【００３０】候補作用因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、多種多
様な供給源から得られる。例えば、ランダムなオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび
定方向的な合成のための数多くの手段を用いうる。または、細菌、真菌、植物お
よび動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーが入手可能であり、また
はそれらを容易に作製することが可能である。加えて、天然または合成的に作製
されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的な
手段によって容易に改変し、コンビナトリアルライブラリーの作製に用いること
もできる。構造類似体を作製するために、既知の薬物に、アシル化、アルキル化
、エステル化、アミド化などの定方向的またはランダムな化学修飾を行ってもよ
い。

【００３１】スクリーニングアッセイ法が結合アッセイ法である場合には、分子の1つまた
は複数を、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する標識と結合させ
てもよい。種々の標識があり、これには放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、
酵素、特異的結合分子、磁気粒子などの粒子といったものが含まれる。特異的結
合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンな
どの対が含まれる。特異的結合のメンバーについては、通常、既知の手順に従い
、相補的なメンバーを検出用の分子によって標識する。

【００３２】または、細胞におけるTC-PTPの発現をダウンレギュレートするためにアンチセ
ンス分子が用いられる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
（ODN）、特に天然の核酸に化学的修飾がなされた合成ODN、またはこのようなア
ンチセンス分子をRNAとして発現する核酸構築物であってもよい。アンチセンス
オリゴヌクレオチドを当技術分野で既知の方法によって化学合成することもでき
る。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性および結合親和性を高めるた
めに天然のホスホジエステル構造に化学的修飾が加えられたものである。骨格、
糖、または複素環式塩基の化学特性を変化させるこのような修飾は、文献に数多
く記載されている。

【００３３】アンチセンス配列は標的TC-PTP遺伝子のmRNAに対して相補的であり、遺伝子産
物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、翻訳に利用されるmRNAの量の減少、
RNAアーゼHの活性化、または立体阻害といった種々の機序を介して遺伝子発現を
阻害する。投与するアンチセンス分子は1種類でも複数の組み合わせでもよく、
その組み合わせには多数の異なる配列が含まれうる。

【００３４】アンチセンス分子を、アンチセンス鎖がRNA分子として産生されるように転写
開始の方向づけがなされた、適切なベクターにおける標的遺伝子配列の全体また
は一部の発現によって産生してもよい。または、アンチセンス分子は合成オリゴ
ヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に少なくとも約
7ヌクレオチド長、通常は少なくとも約12ヌクレオチド長、より一般的には少な
くとも約20ヌクレオチド長であり、且つ約500ヌクレオチド長以下、通常は約50
ヌクレオチド長以下、より一般的には約35ヌクレオチド長以下であり、その長さ
は阻害効率、交差反応性がないことを含む特異性などによって決定される。

【００３５】内因性センス鎖mRNAの1つまたは複数の特異的領域が、アンチセンス配列に対
して相補的となる。オリゴヌクレオチドに対する特異配列の選択には、インビト
ロまたは動物モデルにおける標的遺伝子の発現阻害に関していくつかの候補配列
をアッセイする経験的な方法を用いてもよい。mRNA配列のいくつかの領域をアン
チセンス相補性に関して選択する、配列の組み合わせを用いることもできる。

【００３６】抗体またはそれに由来するFAb断片などの結合断片を阻害因子として用いても
よい。ドメインまたは天然蛋白質に対応するペプチドを単離するためには、抗体
を野生型または変異型のTC-PTPに対して産生させるとよい。

【００３７】抗体は、発現されたポリペプチドまたは蛋白質を、単独、またはKLH、プレ-S
HBsAg、他のウイルス性もしくは真核生物蛋白質などの免疫原性担体と結合させ
た上で免疫原として用いる、従来の方式に従って調製される。一連の注射ととも
に種々のアジュバントを適宜用いてもよい。モノクローナル抗体に関しては、1
回または複数回の追加抗原注射を行った後に脾臓を摘出し、細胞融合によってリ
ンパ球を不死化した後に、高親和性抗体結合に関してスクリーニングする。続い
て、望ましい抗体を産生する不死化細胞、すなわちハイブリドーマを増殖させる
。必要に応じて、抗体の親和性をさらに高めるために、重鎖および軽鎖をコード
するmRNAを単離し、大腸菌におけるクローニングによって変異を誘発した上で重
鎖および軽鎖を混合してもよい。抗体産生の方法としてインビボ免疫処置に代わ
る選択肢にはファージディスプレイライブラリーとの結合が含まれ、これは通常
はインビトロ親和性成熟とともに行われる。

【００３８】 TC-PTP活性の増強因子（enhancer）ほとんどの場合、TC-PTP活性が増強され
ると標的細胞における蛋白質レベルは上昇すると考えられる。蛋白質の増加はTC
-PTP蛋白質またはそれに由来する活性断片が直接導入されることの結果である場
合もある。または、内因性TC-PTP遺伝子の発現をアップレギュレートしてもよく
、TC-PTPをコードする外因性構築物を細胞に導入してもよい。

【００３９】 TC-PTP遺伝子を細胞に導入するために発現ベクターを用いてもよい。このよう
なベクターでは一般に、核酸配列が挿入されるようにプロモーター配列の付近に
好都合な制限酵素部位が位置している。転写開始領域、標的遺伝子またはその断
片、および転写終結領域を含む転写カセットを調製してもよい。通常は少なくと
も約1日、より一般的には少なくともほぼ数日から数週間の期間にわたって細胞
内に一過的または安定的に維持されうるようなベクターであるプラスミド；レン
チウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルスなどの種々のベクター中に転
写カセットを導入してもよい。

【００４０】遺伝子または蛋白質は、ウイルス感染、マイクロインジェクション、または小
胞もしくはミトコンドリアの融合を含む、任意の数の経路によって組織または宿
主細胞に導入しうる。フース（Furth）ら（1992）Anal Biochem 205：365〜368
に記載されたジェット式注射を筋肉内注射に用いてもよい。DNAを金粒子の表面
にコーティングし、金微粒子に蛋白質またはDNAをコーティングした後に皮膚細
胞内に射入する、文献（例えば、Tangら（1992）Nature 356：152〜154を参照）
に記載された微粒子銃装置または「遺伝子銃」によって皮内に送達してもよい。

【００４１】 TC-PTPの発現の検出腫瘍細胞などの細胞の表現型は、TC-PTP酵素活性レベル
を分析し、対応する非形質転換細胞または正常細胞と比較することによって評価
しうる。または、TC-PTPコード配列の過剰発現を検討してもよい。本明細書で用
いる過剰発現とは、対応する非形質転換細胞種と比べて発現レベルが少なくとも
2倍、通常は少なくとも約5倍、さらには10倍またはそれ以上でもありうる細胞に
対する言及である。過剰発現に関するアッセイ法は、実験の項で述べるもののよ
うに、適切なmRNA、コード蛋白質のレベルを検出するものでもよく、機能アッセ
イ法を用いたものであってもよい。特定の配列の存在に関して核酸を分析するた
めの方法は、その配列とノーザンブロット、RNA、ドットブロットなどとのハイ
ブリダイゼーション、RT-PCRによるものなど数多くのものが利用可能である。

【００４２】特定のポリペプチドの存在を検出する方法は、対象ポリペプチドに対して特異
的な結合試薬を定量化のために用いる、ELISA、RIA、アフィニティークロマトグ
ラフィーなどを含め、当技術分野でも周知である。

【００４３】使用方法 TC-PTP活性の阻害因子は、例えば、DNA損傷をもたらす化学療法または放射線
療法に対する感受性のある腫瘍の感受性を高めることを目的として、DNA傷害因
子に対する感受性を誘導するために用いられる。細胞周期に対するTC-PTPの効果
は、細胞がG1期にある時間を延長させ、より同調化された細胞集団を得るために
も有効である。

【００４４】宿主または患者は、任意の哺乳動物種であってもよく、例えば霊長類種、特に
ヒト；マウス、ラットおよびハムスターを含む齧歯類；ウサギ；ウマ、ウシ、イ
ヌ、ネコなどであってもよい。実験的検討のためには、ヒト疾患の治療のモデル
となる動物モデルに特に関心がもたれる。

【００４５】 TC-PTP遺伝子の過剰発現との関連が知られている腫瘍には大腸癌が含まれる。
関心対象のその他の腫瘍には、前立腺癌、乳癌、胆管癌、子宮内膜癌、胃癌、口
腔粘膜異形成、浸潤性口腔癌、非小細胞肺癌、尿路の移行上皮癌および扁平上皮
癌などの癌；神経芽細胞腫、神経膠腫などの神経悪性腫瘍；小児急性白血病、非
ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性皮膚T細胞、菌状息肉腫、非MF皮
膚T細胞性リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、T細胞に富む皮膚リンパ球腫、水泡性類
天疱瘡、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬などの血液悪性腫瘍などが含まれる
。TC-PTPの発現を、治療法に加えて、腫瘍の特徴決定および病期判定を補助する
ための診断法として用いてもよい。

【００４６】 TC-PTPの阻害因子は、感受性のある腫瘍に罹患した宿主に投与される。投与は
特定の疾患に応じて局所塗布でも局所投与でも全身投与でもよい。本発明の化合
物は、腫瘍細胞集団の感受性を高める一方で、副作用が最小限に抑えられるよう
な投与量で投与される。本組成物は、インビボ使用のためには医師の指示の下で
入手および使用がなされるべきと考えられる。治療的製剤の投与量は、疾患の性
質、投与頻度、投与様式、薬剤の宿主からの排出などに応じて大きく異なると考
えられる。

【００４７】特定の腫瘍細胞の感作および死滅に対する感受性は、新たに単離または固定さ
れた生検組織におけるDNA損傷の修復能によって推定しうると思われ、可能であ
ればインビトロ検査によっても推定しうる。インビトロ検査の場合には、腫瘍の
生検試料由来の培養細胞をさまざまな濃度の阻害因子と、阻害因子が作用するの
に十分な時間、通常は約10分から1日の範囲にわたって共存させる。続いて、腫
瘍細胞に放射線照射を行うか、またはDNA傷害因子による別の処理を行い、誘導
後に生存している細胞を算定する。

【００４８】本発明のもう1つの態様では、DNA損傷に対する防御策として、TC-PTP活性をア
ップレギュレートするか、または別の形で細胞に提供する。放射線照射または他
のDNA傷害処理に対する防御が必要な患者では、上記の通りにTC-PTP活性を上昇
させる。

【００４９】 TC-PTP調節性化合物は、治療的投与のための種々の製剤に組み入れることがで
きる。より詳細には、本発明の化合物は、薬理学的に許容される適切な担体また
は希釈剤と組み合わせて医薬組成物として製剤化することが可能であり、且つ錠
剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、
細粒剤およびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体、または気体の剤形として
製剤化されうる。このため、化合物の投与は、経口、口腔内、直腸内、非経口的
、腹腔内、皮内、経皮的、気管内（intracheal）などの投与を含む、さまざまな
方式で行うことができる。阻害因子は投与後に全身性に移行してもよく、または
局所投与、壁内投与、もしくは移植部位で有効量を維持するように作用するイン
プラントを用いて局在化させてもよい。

【００５０】本発明の化合物は単独で投与することも互いに併用することもでき、またはそ
れらを他の既知の化合物と併用することもできる。医薬品の剤形の場合には、本
化合物を薬学的に許容される塩の形態で投与してもよく、またはそれらを単独も
しくは適切な組み合わせて用いてもよく、さらには他の薬学的活性化合物と併用
してもよい。

【００５１】媒体、アジュバント、担体、または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は
容易に広く入手可能である。さらに、pH調製剤および緩衝剤、張度調整剤、安定
化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も容易に公的に入手可能である
。

【００５２】全身投与用の典型的な投与量は、1回の投与につき、被験者の体重1kg当たり0.
1ng〜100mgの範囲である。典型的な投与は、静脈内投与に適した液剤；1錠を1日
2〜6回服用すること、または有効成分の含有量が比例して高い徐放性カプセル剤
または錠剤を1日1回服用することなどである。徐放効果は、さまざまなpH値で溶
解するカプセル材料、浸透圧による徐放性のカプセル剤、または制御的放出のた
めの任意の他の手段によって得ることができる。

【００５３】当業者は、用量レベルが特定の化合物、症状の重症度、および被験者の副作用
に対する感受性の関数として変化しうることを容易に理解すると考えられる。い
くつかの特定の化合物は他のものよりも効力が強い。当業者は種々の手段によっ
て所与の化合物に関する好ましい投与量を容易に決定することができる。好まし
い手段の一つは、所与の化合物の生理的効力を計測することである。

【００５４】本方法における使用のために、阻害因子を薬学的活性のある他の薬剤、特に他
の転移抑制剤、抗腫瘍剤または血管新生抑制剤とともに製剤化してもよい。関心
対象の血管新生抑制化合物には、アンジオスタチン、エンドスタチン、αコラー
ゲンのカルボキシル末端ペプチド（XV）などが含まれる。関心対象の細胞毒性物
質および静細胞因子には、アドリアマイシン、アルケラン、Ara-C、BICNU、ブス
ルファン、CNNU、シスプラチン、サイトキサン、ダウノルピシン、DTIC、5-FU、
ハイドレア、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイ
シン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、ベルバン、ビンクリスチ
ン、ビンブラスチン、VP-16、カーボプラチン、フルダラビン（fludarabine）、
ゲムシタビン（gemcitabine）、イダルビシン、イリノテカン、ロイスタチン（l
eustatin）、ナベルビン（navelbine）、タキソール、タキソテール、トポテカ
ン（topotecan）などが含まれる。

【００５５】感作手順に続いて、腫瘍細胞に対して、例えば、放射線照射、シスプラチンな
どの致死量のDNA傷害因子を投与する。投与量は用いる特定の細胞毒性物質、腫
瘍の種類、患者の状態などによって異なると考えられ、一般には通常量と考えら
れる。放射線療法の例には、腫瘍細胞集団を実質的に除去するのに十分であって
同時に患者の生存性が保たれるような有効量での、全身照射、半身照射、および
局所遠隔照射、または近接照射療法もしくは放射免疫療法が含まれる。場合によ
っては、患者の造血機能を回復させるために、放射線照射と幹細胞補充療法を併
用してもよい。

【００５６】本発明が、記載される特定の方法、プロトコール、細胞系、動物種または属、
構築物、および試薬に制限されることなく、それらが異なってもよいことが理解
される必要がある。また、本明細書で用いる用語は特定の態様を説明することの
みを目的としており、本発明の範囲を制限するものではなく、その範囲は特許請
求の範囲における記載によって決定されることも理解される必要がある。

【００５７】別に特記する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語
は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。本発
明の実施または検討のために、本明細書に記載したものと同様または同等の任意
の方法、装置および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置および材
料は以下に説明するものである。

【００５８】本明細書で言及するすべての刊行物は、例えば、ここに述べる発明とともに用
いうると考えられる刊行物に記載された細胞系、構築物、および方法を説明およ
び開示する目的などの、すべての関連した目的に関して、参照として本明細書に
組み入れられる。以上の部分および本文の全体を通じて考察される刊行物は、本
出願の提出日の以前にさかのぼってそれらの開示を提供する目的のみで提供され
る。本明細書中のいかなる記載も、本発明者らが先行発明によるこのような開示
に先行する権利を持たないことを認めたものとみなされるべきではない。

【００５９】以下の実施例は、本発明の作成および使用の方式に関する完全な開示および説
明を当業者に提供するために記載されており、発明とみなしている内容の範囲を
制限するものではない。使用する数字（例えば、量、温度、濃度など）に関して
正確であるように努力は払っているが、ある程度の実験的誤差および偏差は許容
されるべきである。別に特記しない限り、各部分は総重量にしめる部分重量であ
り、分子量は平均分子量であり、温度は℃で示され、且つ圧力は大気圧またはそ
の近傍圧である。

【００６０】実施例実施例1 材料および方法マウス胚線維芽細胞および細胞系の作製。ヘテロ接合型TC-PTP変異マウスの交
配による妊娠14日目に解剖した同腹仔胚のトリプシン処理により、マウス胚線維
芽細胞（MEF）を単離した。各胚を別々に採取し、脳および内部器官を除去した
後胴体をこまぎれにし、トリプシンと共に37℃で30分間〜45分間インキュベート
した。均質の細胞懸濁液を、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改
変イーグル培地（DMEM）の入った10cm培養皿に播いた。MEFを用いる実験には初
期継代物（P6）を用いた。自発性の細胞系が得られるまで、3日毎に細胞を広げ
た。以前に記載された通り（You-Tenら、前記）、サザンブロット分析によって
遺伝子型を証明した。

【００６１】 G0同調化 10^６個の細胞を10cm培養皿に播き、10％FBSを添加したDMEM中で4日
間、集密になるまで増殖させた。線維芽細胞をPBSで2回洗浄し、0.1％FBSを加え
たDMEMとともに2日間インキュベートした。

【００６２】細胞の増殖および生存初代MEF+/+細胞系および初代MEF-/-細胞系、ならびに
TC-PTP+/+細胞系およびTC-PTP-/-細胞系を個／cm^２の密度で、10％FBSを加え
たDMEMを入れた24ウェル細胞培養プレートに播いた。プレーティングの1日後、3
日後、5日後および7日後、トリパンブルー圧排法またはMTTアッセイ法（Mosmann
（1983）J. Immunol. Methods. 62：55〜63）を用いたトリプシン処理の後に細
胞数を決定した。137Csを線源とするガンマセル（Gammacell）1000（Atomic Ene
rgy of Canada）、およびストラタリンカー（Stratalinker）（Stratagene）を
それぞれ用いた、示された線量のγ線照射またはUV照射によって、細胞を処理し
た。照射後に細胞を24ウェルプレートに3通り播いた。照射48時間後に、MTT生死
判別アッセイ法によって生存率を評価した。

【００６３】細胞周期の分析同調細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理を行った後、DMEM
＋10％FBSを入れた10cm培養皿に1×10^４個／cm^２で播いた。示された時点でトリ
プシン処理によって細胞を収集し、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した
。その後PBSで洗浄し、4℃の70％エタノール中に一晩維持した。細胞を2000rpm
で遠心分離し、2μg/mlのRNaseA（Boehringer Mannheim）を含むPBS中で37℃で
インキュベートした。最終濃度0.2mg／mlのヨウ化プロピジウム（PI；Sigma Che
mical Co.）によって細胞を染色した。試料をFACScan（Becton Dickinson）によ
って処理した。

【００６４】イムノブロット法：野生型TC-PTP細胞系およびノックアウトTC-PTP細胞系を、
プロテアーゼインヒビター反応混液（完全（Complete）、EDTA非含有；Boehring
er Mannheim）を含む0.1％NP-40、125mM NaCl、25mM Tris HCl pH 7.2に溶解し
た。50μgの蛋白質をSDS-PAGEによって分画し、イモビロン-P（Immobilon-P） P
VDF膜（Millipore Corp.、Bedford、MA）に転写した。5％脱脂粉乳を含むTBS-T
（10mM Tris HCl［pH 7.5］、150mM NaCl、0.03％Tween 20）によって膜をブロ
ックした。TC-PTPを、マウス抗TC-PTP（クローン3E2；You-Tenら、前記）を用い
て検出した。細胞周期蛋白質の検出には以下の市販の抗体を用いた：ウサギ抗サ
イクリンE；ウサギ抗Cdk2（Santa Cruz Biotechnology）；およびマウス抗Rb（P
harMingen G3-245）。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた、マウスIgGま
たはウサギIgGに対するヤギ二次抗体（Jackson lmmunoresearch）を用いた。化
学発光法（NEN Life Science Products）によって検出を行った。

【００６５】インビトロ組換えアッセイ法：インビトロ組換えアッセイ法のために、100μ
lの反応混合物（20mM Tris-HCl pH 7.5、10mM MgSO4、85mM NaCl、1mM ATP、各1
00μMのdNTP、および0.001％ゼラチン）中で、pBR322-D1プラスミドDNAおよびpB
R322-2プラスミドDNA各0.5μgを、30μgの蛋白質と混合した。反応を37℃で60分
間インキュベートした後、25mM EDTAおよび100μg/mlのプロナーゼの添加によっ
て停止させた。DNAをフェノール-クロロホルム抽出し、-80℃で45分間エタノー
ル沈殿をさせた。DNAをMCT緩衝液（10mM MgCl２、10mM CaCl２、10mM Tris-HCl
、pH 7.5）中で再懸濁し、DH1細胞またはDH5細胞の形質転換に用いた。アンピシ
リン耐性およびテトラサイクリン耐性コロニーの数を決定し、それに従って組換
え頻度を算出した。

【００６６】インビトロ非相同末端連結アッセイ法組換えアッセイ法に関して記載された
ものと同様の方法を用いて非相同末端連結活性を決定した。本アッセイ法におけ
る基質は、制限酵素EcoRVを用いて線状化したpBR322-D2とした。

【００６７】結果 TC-PTP+/+マウス胚線維芽細胞およびTC-PTP-/-マウス胚線維芽細胞の確立。細
胞増殖におけるTC-PTPの生物的機能を定義するために、本発明者らは14日齢胚か
ら野生型およびTC-PTP-/-マウス胚線維芽細胞（MEF）を単離した。6つの初期継
代物のみ由来の初代MEFを用い、自発性の細胞系を得るために培養を続けた。初
代MEFおよび細胞系の遺伝子型判定をサザンブロット分析によって行い、上方の7
.6kbのバンドはノックアウトTC-PTP対立遺伝子を表し、野生型対立遺伝子を下方
の5.2kbのバンドが示す（図1A、図1B）。初代マウス胚線維芽細胞、ならびに野
生型（+/+）、ヘテロ接合型（+/-）およびノックアウト（-/-）由来の細胞系は
、材料および方法の項に記載したように確立した。（図1A）初代MEFの遺伝子型
判定、種々の胚由来の初代MEFからのゲノムDNAをBglIIで消化し、サザンブロッ
ト分析のためにハイボンド（Hybond）N⁺に転写した。（図1B）EFM7+/+細胞系、E
FM3+/-細胞系およびFFM4-/-細胞系の遺伝子型判定はAと同様に行った。

【００６８】本発明者らは、TC-PTPに対するモノクローナル抗体を用いたイムノブロット法
を用いて、TC-PTP-/-細胞にこの蛋白質が全く存在しないことを確認した。初代M
EFおよび細胞系におけるTC-PTP-/-では、45kDaのバンドが全く存在しなかった（
図1C、図1D）。（図1C）初代MEFのウエスタンブロット分析。初代MEFから蛋白質
試料を抽出し、同量（25μg）の蛋白質を10％SDS-PAGEでロードし、抗TC-PTP抗
体によるイムノブロット法を行った。（図1D）EFM7+/+細胞系、EFM3+/-細胞系お
よびEFM4-/-細胞系のウエスタンブロット分析はCと同様に行った。

【００６９】 MTTまたはトリパンブルー圧排法を用いた増殖アッセイ法によって初代MEFおよ
び細胞系を試験した。その結果、TC-PTP-/-初代MEFの増殖速度はTC-PTP+/+細胞
よりもはるかに低い（30％未満）ことが示された（図2A）。野生型、ヘテロ接合
型およびノックアウトの初代MEFおよび細胞系を1×10^４個／cm^２で24ウェル細胞
培養プレートに播き、10％ウシ胎児血清を加えたDMEM中でインキュベートした。
（図2A）プレーティングから1日後、3日後、5日後および7日後のMTTの減少によ
り、2つのTC-PTP+/+MEFおよび3つのTC-PTP-/-MEFの増殖を評価した。結果を3通
りのプレートの平均として示す。（図2B）トリプシン処理後の細胞数を計測する
ことにより、EFM7+/+細胞系、EFM3+/-細胞系およびEFM4-/-細胞系の増殖速度を
評価した。これらの実験を3回繰り返したが、すべて同様の結果が得られた。代
表的な実験の結果を示す。

【００７０】確立された細胞系EFM7+/+およびEFM4-/-を用いた場合にも同様の結果が得られ
た。また、ヘテロ接合型細胞系EFM3+/-がEFM7+/+細胞系と類似した挙動を示すこ
とが本発明者らにより観察された（図2B）。

【００７１】 TC-PTP-/-細胞はG1調節の変化を示す。TC-PTP-/-細胞の増殖の遅さが細胞周期
の1つの特定の時期に影響を及ぼすかどうかを調べるために、本発明者らは、蛍
光標示式細胞分取器（FACS）分析によってEFM7+/+細胞およびEFM4-/-細胞におけ
る細胞周期の進行を評価した。興味深いことに、EFM4-/-細胞のG1期はEFM7+/+細
胞よりも長かった（図3A〜図3G）。同調細胞系をトリプシン処理し、10％ウシ胎
児血清を加えたDMEMの入った10cm培養皿に1×10^４個／cm^２で播いた。プレーテ
ィングから0時間後、12時間後、16時間後、20時間後、24時間後、28時間後およ
び32時間後に細胞のトリプシン処理を行った。細胞を4％パラホルムアルデヒド
で固定し、0.2μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色した後FACSによって分析した
。示されている各領域はM1（亜（sub-）G1期）、M2（G1期）、M3（S期）、M4（G
2期〜M期）である。

【００７２】これは細胞周期の開始後20時間および24時間において特に顕著である。細胞周
期のこれらの時点においては、EFM7+/+細胞のそれぞれ25％および16％がG1期に
あるのに対して、EFM4-/-細胞集団ではそれぞれ41％および35％がG1期にあった
（図3Dおよび図3E）。28時間後において、G1期にあるEFM7+/+細胞のの区域が再
び増加するのが本研究者らにより観察され、このことからこれらの細胞が2回目
の周期に入ったことが示された。一方、対応するEFM4-/-集団は依然としてG1期
にあり、S期にあると思われる集団の増加が続いていた（図3F）。スキャンによ
る亜G1（M1）部分には有意差は認められず、どの遺伝子型の細胞集団も有意なア
ポトーシス性事象を示さないことが示唆された。

【００７３】 G1期の進行は、サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）とその確定サイクリン随伴
パートナーとの間の蛋白質-蛋白質相互作用およびリン酸化反応からなる複雑な
システムによって制御される。G0前期からG1前期への移行においては、サイクリ
ン阻害因子が不活性化されるとともにCDK4などの細胞周期促進性CDKが活性化さ
れる必要がある。細胞周期の適切な活性化がなされていることを立証するために
、本発明者らは、血清除去によって同調化させ、15％FCSの再添加によって細胞
周期の進行を誘発した細胞からのサイクリンD1の出現および細胞周期阻害因子p2
7KIP1の消失を、ウエスタンブロット法によって測定した（図4A）。野生型細胞
においては、血清刺激から0時間後〜8時間後にかけてサイクリンD1が増加し、こ
れと同調化して血清処理の12時間後に阻害因子p27KIP1が消失した。これに対し
て、TC-PTP-/-細胞では新たに産生されたサイクリンD1のレベルの減少、および
細胞周期阻害因子p27KIP消失の遅れが認められた。

【００７４】 TC-PTP-/-細胞におけるG1期障害の分子機構をさらに解明するために、本発明
者らは細胞周期進行のG1／S移行に関する3つの重要なマーカー、すなわちサイク
リンEの発現ならびにCdk2およびRbのリン酸化による活性化について評価した。
細胞周期のさまざまな時点において、同調化させたEFM7+/+細胞およびEFM4-/-細
胞由来の蛋白質を、抗サイクリンE抗体とのウエスタンブロット分析に供した。
サイクリンEの発現はCdk2の活性化をもたらすG1後期のみに生じた。この結果はE
FM4-/-細胞でサイクリンEの発現が遅延したことを示しており、EFM4-/-では24時
間後に生じた一方、EFM7+/+では20時間後に生じた（図4B）。細胞周期の開始か
ら0時間後、16時間後、20時間後、24時間後および28時間後に、同調化させたEFM
7+/+およびEFM4-/-から同量（25μg）の蛋白質を採取した。蛋白質試料を12％SD
S-PAGEによって分離し、抗Cdk2またはサイクリンEを用いたイムノブロット法を
行った。Rbについては、蛋白質を7.5％SDS-PAGEで分離し、抗Rbを用いてイムノ
ブロット法を行った（図4B）。

【００７５】 EFM7+/+において、リン酸化修飾型Cdk2（下方のバンドは活性のあるThr-160リ
ン酸化型を表す；Guら、1992）は20時間で電気泳動移動度の増加を示したが、一
方、EFM4-/-細胞では活性化型Cdk2は28時間まで検出可能であった（図4）。最終
的に、Cdk2活性化の遅延と一致して、過剰リン酸化型のRb蛋白質もまた、EFM7+/
+細胞と比べてEFM4-/-細胞においては遅延した（図4）。総合すると、TC-PTPの
消失は、哺乳動物細胞における細胞周期進行の大半の遅延と相関しており、この
遅延が細胞周期のG0期からG1前期への移行時に起こると思われることが、これら
の結果から立証された。

【００７６】 TC-PTR-/-細胞のDNA傷害作用因子に対する過敏性反応細胞周期チェックポイントの機能は、ゲノムDNAの物理的状態を確認すること
である。例えば、DNA損傷に応答して、細胞周期はG1/S移行期またはG2/M移行期
で妨害されるが、これは一部にはDNA複製の進行または有糸分裂への移行の前に
障害細胞にDNA損傷を修復させるためである。TC-PTP-/-細胞に対する、γ線照射
、UV-C照射およびメタンスルホン酸メチル（MMS）処理などのDNA傷害作用因子の
影響を評価するために、本発明者らはまず、処理後のさまざまな時点におけるEF
M7+/+細胞、EFM3+/-細胞およびEFM4-/-細胞の生存に対する1000ラドのγ線照射
の影響を評価した。細胞（1×10４個／cm２）を1000ラドのγ線照射によって処
理した。処理から8時間後、24時間後および48時間後のMTTの変換を生存の指標と
して評価し、それを非処理ウェルに対する処理ウェルのOD570測定値の割合とし
て表した。3回の独立した実験から得た標準誤差を示す。

【００７７】図5Aに示されている通り、EFM4-/-細胞は対応するEFM7+/+と比べてγ線照射に
対して過敏性であった。500ラドという低い照射線量でも、生存したEFM4-/-細胞
は30％に過ぎず、高い過敏性が示された。また、48時間においてEFM7+/+は回復
したと思われるが、一方EFM4-/-の生存率は低下し続けていることが示された。
これはEFM4-/-細胞におけるDNA損傷への反応に関する障害による可能性がある。
これに比べ、γ線照射線量の増加に伴うEFM7+/+細胞およびEFM3+/-細胞の生存率
の低下はより遅かった（図5B）。さらに、すべての線量および時点において、ヘ
テロ接合型細胞系EFM3+/-の感受性はEFM7+/+と比べて中程度であった（図5A、B
）。

【００７８】本発明者らは、EFM7+/+、EFM3+/-およびEFM4-/-のUV-C処理に対する応答も試
験した。このアッセイ法では、EFM7+/+は15J／m２のUV-C処理後も完全に生存し
たままであった。これに対して、EFM4-/-全集団の生存率は48時間後に50％減少
した（図5C）。

【００７９】用いたもう1つのDNA傷害因子はMMSであり、これは一本鎖の切断を引き起こすD
NAアルキル化剤である。EFM7+/+およびEFM4-/-をさまざまな用量のMMSで処理し
た。EFM4-/-の生存率は5μMという低濃度で大きく低下したが、これに対して同
濃度のMMSの下でのEFM7+/+の生存率の低下はわずかであった。最終的にはMMS濃
度の上昇は細胞に対して強い毒性を示したが、これは大量のDNA損傷により、細
胞死が誘導されたためと考えられる（図5D）。一定範囲の用量のメタンスルホン
酸メチルによる処理から24時間後にEFM7+/+およびEFM4-/-の生存を評価した。そ
の結果をAと同様に示す。

【００８０】これらの結果から、TC-PTP-/-細胞がDNAの切断を引き起こすさまざまな作用因
子に対して過敏性であることが確認された。TC-PTP-/-細胞死がアポトーシスに
より起こるのか否かを試験するために、UV-C処理細胞をヨウ化プロピジウムで染
色し、FACS分析によって試験した。このアッセイ法においては、アポトーシス細
胞は一般に亜G0／G1ピークとしてあらわれる。80J／m２のUV-Cによる処理後にEF
M7+/+細胞においては5％が誘導されたのに比べ（図6）、EFM4-/-集団の61％がア
ポトーシスを誘導された（亜G1／M2によって表された）。細胞周期同調細胞系を
トリプシン処理し、10％ウシ胎児血清を加えたDMEMの入った10cm培養皿に1×10
^４個／cm^２で播いた。細胞をトリプシン処理し、80J／m２のUV-Cで処理した。ト
リプシン処理直後に細胞を固定したのをゼロ時点とした。処理後に細胞を播き、
24時間後にトリプシン処理によって収集した。細胞を4％パラホルムアルデヒド
で固定し、0.2μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色した後、FACScanによって分析
した。

【００８１】これらのデータは、哺乳動物細胞におけるTC-PTP酵素の発現が、DNA傷害因子
に対する至適防御に必要であることを示唆する。

【００８２】 TC-PTP-/-マウスはγ線照射に対して過敏性である本発明者らは以前、TC-PT
P-/-マウスが生後3週間〜5週間で100％致死性を示し、これがおそらく骨髄機能
の欠損およびそれに伴う重症貧血によることを報告した（You-Tenら、前記）。T
C-PTP-/-ホモ接合型マウスが照射に対して感受性を示すかどうかを確認するため
に、本発明者らは生後24時間以内のホモ接合型動物および野生型動物を100ラド
のγ線照射に供した。照射後にマウスを観察下におき、3日毎に体重を測定した
。TC-PTP-/-マウスは照射5日後に急速に瀕死状態になり、9日目に死亡した。照
射を受けた野生型マウスは非照射マウスと比べて照射TC-PTP-/-マウスのように
劇的な成長遅延は示さなかった（図7）。生後24時間以内の野生型マウスおよびT
C-PTP-/-マウスに137Cs線源を用いて100ラドを照射した。非照射野生型マウス、
TC-PTP+/-マウスおよびTC-PTP-/-マウスを比較のために示す。個々のマウスの体
重を経時的にプロットしている。その後、TC-PTP-/-マウスが照射後第7日に死亡
した。これらの結果から、ホモ接合型TC-PTP-/-マウスも、TC-PTP-/-線維芽細胞
が示したのと同じ現象である、γ線照射に対する劇的な感受性を示すことが確か
められた。

【００８３】 TC-PTP-/-細胞は不完全なDNA修復を示す電離放射線、UV光およびMMSなどの
遺伝毒性因子はDNAに重大な損傷をもたらすことが知られている。これらの損傷
を修復するために、照射を受けた細胞はDNA修復機構を活性化することによって
打ち消す。TC-PTP-/-細胞およびホモ接合型動物の照射感受性と同様に、TC-PTP-
/-細胞において検出されたG1細胞周期の変化から、TC-PTP欠陥細胞におけるDNA
修復機構の状態の特徴付けが行われた。本発明者らは、TC-PTP+/+およびTC-PTP-
/-が欠損DNA鎖を再結合する能力を試験するために、相同組換えおよび非相同末
端連結（NHEJ）のインビトロアッセイ法を用いた。3回の独立した実験の結果に
おいて、相同組換えアッセイ法で示された通り、TC-PTP-/-細胞では二本鎖／一
本鎖（ds/ss）および二本鎖／二本鎖DNA組換え過程が減少しているという結果が
示された（表1）。NHEJアッセイ法においてもまた、TC-PTP-/-細胞の示した事象
の方がTC-PTP+/+細胞よりも少なかった（表1）。これらの結果は、DNAを修復で
きないことがG1／S移行期の遅延およびTC-PTP-/-細胞のDNA傷害因子に対する過
敏性をもたらすことを示唆する。このため、これらの結果は、TC-PTPが少なくと
も一部にはDNA損傷から細胞を防御するように働くというモデルを裏づけるもの
である。

【００８４】 TC-PTP-/-細胞におけるTC-PTP C-Sトラッピングによりp62dokとの結合が示さ
れる基質トラップ技法により、蛋白質チロシンホスファターゼの基質の同定が
可能となる。src形質転換細胞抽出物を触媒的に不活性なC→S GST-TC-PTP変異体
とともに用いると、62kDaの蛋白質がこの変異体と会合する。この蛋白質はp62do
kであることがウエスタンブロット法によって同定されている（図8a）。この蛋
白質は、DNA修復応答の下流にあるものを含む、いくつかのシグナル伝達経路と
関連がある。TC-PTP-/-マウスの作製により、コート（Cote）ら（1998）Biochem
istry 37（38）：13128〜37に記載された方法を用いる、C→S基質トラップ法を
改良するための特に優れたシステムが供給される。TC-PTP-/-脾臓抽出物を、触
媒的に欠陥のあるTC-PTP C→S、TC-PTP D→NまたはTC-PTP CS→DN変異体を用い
る基質トラップ技法に用いた場合には、野生型由来の脾臓抽出物と比べて、ノッ
クアウト抽出物においては62kDaの少なくとも1つの蛋白質がチロシンの部位で過
剰リン酸化される（図8b）。これらの結果は、-/-細胞が、少なくとも1つのTC-P
TPの生理的基質の同定を可能にしたことだけでなく、DNA修復シグナル伝達経路
に特異的基質が関与することも示唆している。

【００８５】 tat送達システムにおける活性TC-PTPの産生 DNA損傷に対する哺乳動物細胞の
感受性を左右するため、またはその増殖速度を調節するためには、種々の様式の
送達を開発して野生型またはドミナントネガティブ変異型どちらかのTC-PTPを導
入する必要がある。tat-融合蛋白質システムにより、種々のペプチドおよび蛋白
質を哺乳動物細胞に直接導入することが可能になる。本発明者らは、tat-野生型
TC-PTP（図9a）およびC→S／D→N TC-PTP（図9c）を作製し、それらをヒト癌細
胞に導入した結果として生じる表現型の特徴付けをするためにこのシステムを用
いた。tat-野生型TC-PTP融合蛋白質を大腸菌内で産生させ、精製することができ
る（図9b）。tat-野生型TC-PTP融合蛋白質をチロシンリン酸化ペプチドに対して
アッセイすると顕著なホスファターゼ活性が認められる（図10）。哺乳動物細胞
へのtat-野生型TC-PTP融合蛋白質の導入は抗TC-PTPモノクローナル抗体を用いた
ウエスタンブロット法によって検出されうる（図11）。ヒト乳癌細胞系は一般に
高レベルのTC-PTPを発現するにもかかわらず（図13）、ヒト乳癌細胞をtat-野生
型TC-PTP蛋白質で処理することにより、4つの細胞系のうち3つ（図12a、b、c）
でγ線照射に対する検出可能かつ顕著な防御が得られた。これらの結果は、TC-P
TP蛋白質の哺乳動物細胞への導入により、DNA傷害因子に対する防御が得られる
ことを示している。

【００８６】ヒト大腸癌組織におけるTC-PTPの発現 c-mycなどの癌遺伝子を高レベルに発現するヒト腫瘍がいくつか存在すること
から、TC-PTPの発現がc-mycによって制御される場合には、TC-PTPの発現レベル
が関連するヒト癌細胞で上昇している可能性が示唆される。ヒト腫瘍におけるTC
-PTPの発現レベルを試験するために、本発明者らは、大腸癌の患者から取り除い
た14対の正常組織および腫瘍組織の試料を入手した。本発明者らは、蛋白質抽出
物の標準化のためにp130cas発現を用いて、TC-PTPのレベルをウエスタンブロッ
ト法によって評価し、14試料のうち10試料でTC-PTP蛋白質が増加していることを
見いだした（図14A、図14B）。これらの結果は、TC-PTPが細胞増殖の増加に一定
の役割を果たしている可能性を示唆する。さらに、TC-PTP-/-細胞系によって示
される通り、この酵素はまた癌治療のための標的として確認された。

【００８７】 TC-PTPの細胞機能を検討するために、本発明者らは、TC-PTP+/+初代MEFおよび
TC-PTP-/-初代MEF、同様に+/+自発性不死化線維芽細胞細胞系、+/-自発性不死化
線維芽細胞細胞系および-/-自発性不死化線維芽細胞細胞系を作製した。これら
の細胞の表現型分析により、TC-PTPが細胞周期のG1期の進行およびDNA傷害作用
因子に対する細胞の防御に関与することが示された。本データはTC-PTP-/-細胞
が増殖速度の低下を引き起こすことを示し、これは細胞増殖の調節におけるTC-P
TPの実際の役割を示している。TC-PTP-/細胞における成長速度の低下は細胞周期
における長いG1期によるものである。この所見の裏づけとして、本発明者らは、
TC-PTP-/-細胞においてはサイクリンE／Cdk2複合体およびRbもまた影響されるこ
とを示した。これらの細胞においてはサイクリンEの発現が遅れ、その結果、パ
ートナーであるCdk2の活性化も遅れる。さらに、Rb蛋白質も長期間不活性な低リ
ン酸化型のままである。既知のG1期調節機構の1つがDNA修復機構に影響を及ぼす
ことから、本発明者らは、γ線照射に対するTC-PTP-/-細胞の反応を試験した。T
C-PTP欠損細胞の生存能力は照射後に劇的に低下し、TC-PTP-/-マウスの生存率も
また、インビボにおいてホモ接合型動物が照射に対して高感受性がであることを
示した。さらに本発明者らは、一本鎖および二本鎖の切断依存的なDNA修復のレ
ベルを直接評価することにより、これらの結果を確認した。このインビトロアッ
セイ法から、TC-PTP-/-細胞のDNA修復機構は対応する野生型よりも少なくとも10
倍活性が低いことが示された。

【００８８】増殖制御は主として細胞周期のG1期に行われることが知られている。G1期が完
了するには、他のシグナル伝達制御に加えて、G1前期におけるサイクリンD／Cdk
4およびG1後期におけるサイクリンE／Cdk2という2つの蛋白質複合体が必要であ
る。それらの機能はRb蛋白質をリン酸化してG1期からS期への移行を行わせるこ
とである。サイクリンE／Cdk2はG1後期にRbをリン酸化する。過剰リン酸化され
ると、RbはE2Fとの複合体から遊離する。その後E2FはS期に重要な遺伝子の転写
を開始する。TC-PTP-/-細胞においては増殖が遅くG1期が長いという初期の観察
結果から、本発明者らは、G1／S移行に重要な複合体の1つであり、その活性化に
著しい遅延が認められるサイクリンE／Cdk2の活性化について試験した。TC-PTP-
/-細胞におけるサイクリンE／Cdk2の活性化の遅延による主な結果は、非常に長
期間低リン酸化型のままであるRbのリン酸化の状態、およびその後のG1期からS
期への移行の遅延に反映される。これらの所見は、G1期を介した進行を調節する
上流シグナル伝達における正のエフェクターとしてのTC-PTPの重要性を暗示する
。さらに、これらの結果は、核型TC-PTPの過剰発現によって細胞の増殖速度が増
加するという以前の報告ともよく相関する（Radhaら（1997）FEBS letters 409
：33〜36）。

【００８９】また、本発明者らは、TC-PTP-/-細胞がγ線照射に対して過敏であることも示
した。本発明者らがTC-PTP+/+細胞を単線量のγ線照射で処理した場合には、細
胞の生存率の低下はわずかに過ぎず、このことはDNA修復機構が一定期間後に再
び活性化されて、細胞が増殖を再開したことを示している。この現象はTC-PTP-/
-細胞では起こらず、処理後に生存率が劇的に低下した。UV-CおよびMMSなどの他
のDNA傷害作用因子で処理したTC-PTP-/-細胞の過敏性もγ線照射と同程度であり
、このことはTC-PTP-/-にはDNA修復機構に欠陥があることを示唆している。重要
なことに、TC-PTP-/-マウスもまたγ線照射に対して同様の過敏性を示す。電離
放射線はDNAの二本鎖切断（DSB）だけでなく、修復機構に関する核活性の上昇も
もたらすことが公知である。二本鎖切断を防止するために、哺乳動物細胞は相同
組換え（HR）および非相同末端連結（NHEJ）という2つの異なる修復機構を備え
ている。サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）とは異なり、NHEJは哺
乳動物細胞における主要なDSE修復機構である。インビトロにおけるDNA修復機構
の試験において、本発明者らは、TC-PTP+/+細胞と比べてHR機構およびNHEJ機構
の双方においてTC-PTP-/-細胞にはDNA修復能に欠陥があることを見いだした。通
常の速度で適切な修復を行えないため、DSBを除去しようとして、G1チェックポ
イント制御により強制的にTC-PTP-/-細胞の細胞周期をこの時期に維持させてい
る可能性がある。

【００９０】遺伝毒性ストレスによるDNA損傷によって、いくつかの経路が活性化されると
考えられている。DNA損傷後に起こる最初の事象の1つは、二本鎖切断の存在によ
るDNA-PK酵素の活性化である。DNA-PKはSCIDマウスに存在せず、Ku70および86kD
aサブユニット蛋白質ならびに大型の触媒サブユニットDNA-PKcsを含む蛋白質の
ヘテロ複合体である。この酵素はセリンまたはトレオニンのリン酸化を介して下
流にシグナルを伝達すると考えられる。DNA損傷と細胞周期との関係を提供するD
NA-PKのいくつかの基質が同定されている。その中でも、DNA-PKはDNA損傷後にp5
3と物理的に会合してリン酸化することから、p53がp16ink4Aおよびp21Waflなど
の細胞周期阻害因子を誘導し、それがG1期における細胞周期の遅延に用いられう
るという機構が示唆される。さらに、p53が、DNA組換えおよび修復の両方に関与
する蛋白質であるヒトRad51蛋白質と直接会合するという所見から、p53はまたDN
A修復にも直接関与するという証拠が示唆されている。本発明者らが初代細胞な
らびに細胞系の両方で細胞周期の遅延を同定したという事実は、p53欠損環境に
おいてさえも、TC-PTPの機能が必要であるという可能性を示唆する。p21の活性
化に至る、p53に非依存的な経路も報告されている。例えば、BRCA1依存的なp21
トランス活性化は、DNA傷害性処理後にG1チェックポイントにおけるp53-/-細胞
の停止または遅延の手段を提供する。

【００９１】両方の型のDNA修復機構の欠陥から、TC-PTPの作用は、DNA修復酵素の上流また
はその制御に直接かかわるものと位置づけられる。その核内の局在性同様、G1後
期におけるmRNA発現レベルの高さもまた、このような調節機能とよく相関する。
TC-PTPはホスホチロシン特異的ホスファターゼである。このため、この種の修飾
基質はDNA修復の制御にも関与するはずと考えられる。

【００９２】興味深いことに、電離放射線に対する細胞応答を調整することが判明している
チロシンキナーゼc-Ablはこの修復機構の上流に位置する。例えば、c-Abl-/-線
維芽細胞は照射に対する抵抗性がより高く、これはTC PTP-/-細胞とは反対の表
現型である。照射による損傷後、c-Ablは血管拡張性運動失調症遺伝子の産物で
あるATMおよびDNA-PKの両方と会合し、その基質となることが明らかになってい
る。その活性化後のc-Ablの照射依存性リン酸化が起こった時の潜在的な結果の
一つは、Rad51蛋白質のチロシン54におけるリン酸化である。Rad51は、DNA二本
鎖切断の修復において機能する細菌recA蛋白質の哺乳動物相同体である。重要な
ことに、癌遺伝子BCR-ablはTC-PTPチロシンホスファターゼの基質であるp62dok
をリン酸化することが示されている。

【００９３】最近では、上皮増殖因子受容体（EGFR）チロシンキナーゼが関わるもう1つの
経路が、DNA-PKとEGFRとの特異的相互作用に伴い、照射に伴う損傷に関与するこ
とも提唱されている。この所見は、EGFRの下流の有糸分裂シグナル伝達とDNA修
復の間に相互干渉が存在し、それがDNA傷害因子に対する細胞応答の調節に重要
な役割を果たす可能性を示唆している。基質トラップ法によってEGFRおよびSHC
アダプター蛋白質がインビトロ基質として同定されたことにより（Tiganisら、1
998）、新たな経路におけるTC-PTPの関与が裏づけられた。

【００９４】 TC-PTP-/-線維芽細胞の表現型によって示された通り、TC-PTP-/-マウスの作製
はTC-PTP酵素の機能に関する重要な情報を提供する。以前の研究で、本発明者ら
はTC-PTP-/-マウスが生後3週間〜5週間で死亡し、T脾細胞およびB脾細胞の増殖
障害、ならびに骨髄間質細胞の消失による完全な骨髄機能不全を呈することを報
告した。T細胞およびB細胞の成熟には、DNA二本鎖切断に関与するV（D）J組換え
が必要であるため、この増殖阻害はまたTC-PTP-/-リンパ球が非相同末端連結（N
HEJ）によるDNA修復を行えないことの現れとも考えられる。興味深いことに、DN
A-PKが欠損しているSCIDマウス、およびKu80-/-マウスはいずれも免疫機能不全
およびDNA修復機能不全を呈する。総合すると、本発明者らのデータにより、TC-
PTPの主な機能のうち少なくとも一つは、DNA傷害作用因子から細胞を防御するた
めにDNA修復機構を調整することにあると示唆される。

【００９５】実施例2 c-mycによるTC-PTP発現の調節 TC-PTPプロモーター-CATレポータープラスミドの発現に対するc-mycの影響を
試験したところ、c-mycがG1後期におけるTC-PTPの転写を上方制御しうることが
見出された。c-mycはマイトジェンによって普遍的に誘導されるほか、成長阻害
作用因子によって下方制御されることが非常に多いため、TC-PTPがc-myc転写因
子の転写標的であることを確認するための実験を行う。

【００９６】 2つの推定myc結合部位の欠失変異体を作製し、c-mycによる同時トランスフェ
クションアッセイ法で検討する。G0期、G1前期またはG1後期にある細胞からの抽
出物を用いて、2つの結合部位を用いたDNAフットプリント法および電気泳動移動
度シフトアッセイ法（EMSA）を行い、発現の調節と欠失データとの相関を調べる
。c-myc発現の増強が知られている形質転換細胞および腫瘍試料におけるc-mycの
発現とTC-PTPの発現増強との相関を試験する。

【００９７】プロモーターでの検討はウィー（Wee）ら（1999）Gene 237（2）：351〜60に
おいて記載されている。さらに以下の実験を行う。

【００９８】シス作用性S期リプレッサー本発明者らは、AUG開始コドンに対して-2200〜-716の間にあり、S期抑制の原
因となるシス作用性エレメントのマッピングを行っている。より定義された変異
体を用いた詳細なマッピングにより、TC-PTPの発現を制御する特異的な抑制機構
の同定が可能になる。

【００９９】開始エレメントと重複する、PEA3に対する結合部位転写複合体と転写因子PEA3との競合の存在を試験する。

【０１００】造血細胞におけるTC-PTPの高発現の根拠ウィー（Wee）ら、1999に記載された、CAT構築物と連結した本発明者らのプロ
モーター欠失ライブラリーを用いて、造血細胞特異的な転写因子によるTC-PTPの
上方制御の根拠を同定する。

【０１０１】造血細胞における高発現のために必要なシス作用性調節エレメントが2Kbpの転
写開始部位に含まれるかどうかを決定にするために、TC-PTP遺伝子の上流にある
配列を含む発現構築物によってリンパ性ジャーカット細胞へのトランスフェクシ
ョンを行う。

【０１０２】実施例3 TC-PTPの翻訳後プロセシング TC-PTPは、それぞれ細胞質および核に局在する48kDaおよび45kDaの2種類の形
態で存在する。マウスTC-PTPは1つのmRNAによってコードされ、SDS PAGEによっ
て検出される様々な形態は翻訳後プロセシングによって作製されることが提唱さ
れている。興味深いことに、細胞周期を通してTC-PTP蛋白質を試験すると、45kD
aの量は48kDa型の増加と同時に減少するように思われる。TC-PTPの機能を理解す
るためには、これらの蛋白質種のしっかりとした生化学的な理解が不可欠である
。

【０１０３】リン酸化これらの種がリン酸化によって作製されることを確認するために、NIH-3T3細
胞抽出物をジャガイモ酸性ホスファターゼで処理し、TC-PTP分子量における変化
の有無を確認する。

【０１０４】 TC-PTPのリン酸化の状態を確認するために、インビボにおける³²Pオルトリン
酸標識細胞を用いて抗TC-PTP mAbとの免疫沈降（IP）を行う。これらの³²P標識T
C-PTP精製蛋白質のホスホアミノ酸分析は完了している。高速蛋白質液体クロマ
トグラフィー（FPLC）およびser／thr／tyr変異体の作製によるペプチドマッピ
ングを用いて、リン酸化部位のマッピングを行う。TC-PTPには2つの推定ATM／DN
A-PKリン酸化部位（S／TQxxP）がスレオニン106位およびセリン324位にあり、CD
K様の部位がセリン52位およびセリン319位にある。リン酸化部位の機能を確認す
るためにインビトロ変異誘発法を行う。ATMまたはDNA-PKによるTC-PTPのリン酸
化は、γ線照射細胞由来のこれらのキナーゼの免疫沈降、その後の細菌的に産生
されたTC-PTPのインビトロリン酸化を行うことによって迅速に試験される。

【０１０５】他の修飾もまた同定されうる。細胞周期依存的な修飾によって45kDaが48kDaへ
と修飾されるかどうかを確認するには、NIH-3T3における３５S-メチオニンを用
いたパルスチェイスの標識試験を用いる。45kDaおよび48kDaのバンドを精製した
後に、それらをトリプシンペプチドによって分析し、カルボキシペプチドの配列
を決定する。各ペプチドの同定は、あらかじめ多数のTC-PTP欠失変異体を作製し
ておくことによって容易になる。

【０１０６】実施例4 TC-PTPの基質および会合蛋白質実施例1に提示したデータは、p62dokがTC-PTP C-S変異体と再現性を伴って会
合することを示している。血清除去および再刺激後の+/+および-/-線維芽細胞に
おけるp62dokのリン酸化の状態を確かめる。TC-PTPとの相互作用がそのp120ras-
gapとの会合に波及するか否かを明らかにするために、蛋白質-蛋白質相互作用が
保護される条件下でp62dokの免疫沈降を行う。p62dokの免疫沈降に伴って沈降し
たp120ras-gapの量を測定するためには、市販の抗体（抗p120ras-gapおよび抗ホ
スホチロシン）によるウエスタンブロット法を用いる。TC-PTP-/-細胞ではp62do
kのリン酸化が増え、且つ同時に会合性p120ras-gapの量も増加することが予想さ
れる。この複合体のMAPキナーゼシグナル伝達に対する影響を確かめるために、
これらの細胞におけるC-rasの活性化の状態をGST-rafトラップアッセイ法を用い
て追跡する。TC-PTPおよびp62dokの双方のレベルを最適化するために、ノックア
ウト動物の造血細胞（すなわち、脾臓および胸腺）を用い、さらにγ線照射、U.
V.および他のDNA傷害因子を含む刺激後に、これらの実験を繰り返して行う。

【０１０７】 p62dokに加えて、ガンマ線を照射した-/-線維芽細胞においてチロシンリン酸
化の増加を示す25kDa蛋白質が同定されている。この蛋白質は、DNA修復／細胞周
期経路で作用する同一分子量の既知の蛋白質に対する入手可能な抗体を用いて同
定される。この蛋白質の精製は、照射TC-PTPノックアウト細胞の抽出物に対する
抗ホスホチロシン抗体によるアフィニティー精製後に、他のFPLC精製段階および
蛋白質配列決定を用いて行う。

【０１０８】 TC-PTPが、その酵素活性をインビボで修飾しうると思われる他の非基質蛋白質
と会合するかどうかを確かめるために、酵母ツーハイブリッドシステムにおける
蛋白質-蛋白質相互作用試験を行うための発現ベクターが作製されている。この
ハイブリッド蛋白質は、本酵素の触媒的に不活性なカルボキシ部分と連結された
GAL4 DNA結合ドメインを含む。この融合蛋白質は酵母で非常によく発現される。
この酵母システムにおいて相互作用を行う蛋白質を、インビトロでのファーウエ
スタンブロット法、ならびにインビボでの免疫共沈降法および免疫蛍光法によっ
て、TC-PTPとの会合に関してさらに検討する。TC-PTP活性の調節に関する検討の
ためには、同定した結合パートナーの存在下でTC-PTP触媒活性アッセイ法を行う
。または、蛋白質-蛋白質相互作用が維持される条件下で、３５S-メチオニンで
標識した正常またはγ線照射後の野生型線維芽細胞細胞からのTC-PTPの免疫沈降
を行う。

【０１０９】実施例5 c-ablキナーゼおよびTC-PTPホスファターゼの拮抗的機能表2に示す通り、TC-PTPおよびc-ablの生物的機能は、いずれの酵素も同じくp6
2dok基質を標的とするにもかかわらず拮抗的である。拮抗的なキナーゼおよびホ
スファターゼにより、チロシンリン酸化のバランスが適切に調整される。

【０１１０】

【表２】

【０１１１】 abl遺伝子に関してホモ接合型ノックアウトである細胞系は、放射線照射に対
して抵抗性である。放射線抵抗性はこれらの細胞においてドミナントネガティブ
TC-PTP（CysからSer、またはDからA）変異体を発現させることによって改変され
る。これらの細胞系で放射線照射に対する感受性が高いという所見は、TC-PTPお
よびc-abl酵素が同一のDNA修復性シグナル伝達経路で作用することを示唆するも
のと思われる。

【０１１２】 TC-PTPおよびc-ablのダブルノックアウト体は、2種類のマウス系統を交配する
ことによって作製される。寿命、リンパ球減少、T細胞およびB細胞の増殖、なら
びに脾腫を含む、双方の動物モデルに関してすでに報告されている表現型の欠陥
について評価する。放射線抵抗性、チロシンリン酸化のパターン、および増殖特
性に関して組織培養物における表現型を検討するためには、ダブルノックアウト
線維芽細胞細胞系を単離する。

【０１１３】実施例6 細胞周期およびアポトーシスに対するTC-PTPの作用機序 TC-PTP+/-マウスをp53-/-マウスと交配させる。二重ヘテロ接合型動物（p53+/
- TC-PTP+/- X p53+/- TC-PTP+/-）のF1交配による子孫の1／16はダブルノック
アウト体のはずである。線維芽細胞系を14〜16日齢胚から単離し、サザンブロッ
ト法によって両方の遺伝子座の遺伝子型を分析する。ダブルノックアウト体の表
現型分析を行う。種々の初代細胞遺伝子型における電離放射線感受性を確かめる
。TC-PTPの作用がp53依存性経路を介したものである場合に、ダブルノックアウ
ト線維芽細胞における放射線抵抗性が増強されることが予想される。

【０１１４】 TC PTP-/-およびTC-PTP/p53ダブルノックアウト細胞において、p21およびp16
を含む、細胞周期の他の調節因子を検討する。これらの試験においてp21WAF1を
検討する。p21Waf1-/-細胞およびマウスを用いることにより、p21がp53依存的お
よび非依存的な様式によってアポトーシス、DNA修復、および細胞周期に影響を
及ぼしうることが示された。これらの試験を、TC-PTPを過剰発現する安定的細胞
系を用いる過剰発現試験によって補足する。

【０１１５】二重変異体（abl-/- TC-PTP-/-；p53-/- TC-PTP-/-）線維芽細胞に対する細胞
周期の影響を明らかにする。細胞同調化、FACS分析、およびサイクリン複合蛋白
質に関するウエスタンブロット法によって細胞を検討する。

【０１１６】実施例7 腫瘍発生能の惹起または維持におけるTC-PTPの関与 TC-PTPの過剰発現は細胞増殖の亢進を引き起こすことが示されており、このこ
とからc-myc依存的な細胞増殖の亢進への関与が示唆される。TC-PTPの増加はc-m
yc放射線抵抗性表現型の原因であると考えられる。これらの仮説を検証する最初
の段階として、本発明者らは、14件のヒト大腸癌のうち10件で、p130cas構造蛋
白質レベルによる蛋白質の標準化を行った後に、TC-PTP蛋白質レベルが上昇して
いることを見いだした（図12a、b）。これらの所見は、TC-PTPが増殖に作用する
可能性を裏づけるものである。放射線抵抗性との関連は、腫瘍の放射線抵抗性、
または放射線療法後の再発と大腸癌試料におけるTC-PTP発現レベルとの相関を調
べることによって確かめられる。

【０１１７】ヒト腺癌および対照正常隣接組織からなる対応させた試料を検討する。悪性の
病期にあるあらかじめ同定された試料を含めることにより、TC-PTPの増加と特定
の発癌段階との相関を調べる。データ解析は標準的な統計解析に従って行う。さ
らに検討を行うために、CMVプロモーターによって高レベルのTC-PTPを偏在的に
発現するトランスジェニック動物を作製する。

【０１１８】実施例8 TC-PTP-/-マウスに生じる表現型の欠陥 TC-PTPノックアウトマウスは、重症の免疫抑制、および例えば動物の急性GVHD
において出現する表現型を呈する。GVHDでは、炎症性サイトカインおよび一酸化
窒素（NO）などの他の分子が病的に産生される「サイトカイン・ストーム（cyto
kine storm）」がみられる。本発明者らはさらに、TC-PTP-/-表現型をGVHDマウ
スの表現型と比較しようと考えている。

【０１１９】 TC-PTPノックアウトマウスをGVHD動物と比較する。炎症誘発因子、炎症因子、
および造血因子について調べるために、マルチプローブ付きの市販のRNAアーゼ
保護アッセイキット（最大12種のサイトカイン／キット）を用いるRNAアーゼ保
護アッセイ法により、サイトカインおよび増殖因子の転写アップレギュレーショ
ンまたはダウンレギュレーションに関してアッセイする。これらの所見を蛋白質
レベルで確認するためにウエスタンブロット法および／またはELISAを用いる。

【０１２０】出生直後から死亡時までのTC-PTP-/-マウスの骨髄間質における組織学的変化
と増殖因子の産生の変化との相関を調べる。

【０１２１】 GVHDマウスの胃内のグラム陰性菌からのエンドトキシンは、GVHDに随伴する敗
血症性ショック様症状を惹起する。このため、TC-PTP-/-免疫抑制マウスで生じ
る消耗性のショック様表現型における微生物叢の役割を明らかにすることが重要
である。

【０１２２】帝王切開で得たTC-PTP仔を市販のCDI無菌母体によって里子哺育することによ
り、TC-PTP無菌動物（無菌）を作製する。S状腸（S gut）に細菌叢が存在しない
場合に、宿主現象に対する移植片のサイトカイン応答は劇的に低下することが示
されている。

【０１２３】本発明をその特定の態様に関連して説明してきたが、さらなる改変も可能であ
り、本出願は、本発明が属する技術の範囲内にある周知または習慣的な実践から
の本開示のそのような変形を含む、本発明の原理に一般に準拠する発明のあらゆ
る変更、用途、または適合物に及んでおり、上記の本明細書における本質的な特
徴および特許請求の範囲に従って適用されることが理解される必要がある。

【０１２４】

【表１】インビトロでのプラスミド-プラスミド組換えおよびNHEJアッセイ法

【図面の簡単な説明】

【図１】 TC-PTP野生型およびノックアウト初代マウス胚線維芽細胞ならび
に細胞系の単離を示す。

【図２】 TC-PTP+/+、TC-PTP+/-およびTC-PTP-/-の初代MEFならびに細胞系
の増殖速度を比較して示す。

【図３】 EFM7+/+およびEFM4-/-の細胞周期の進行を示す。

【図４】 EFM7+/+およびEFM4-/-におけるサイクリンE、Cdk2、およびRb蛋
白質のイムノブロット分析を示す。

【図５】 DNA傷害因子による処理後のEFM7+/+、EFM3+/-、およびEFM4-/-細
胞の生存率を示す。

【図６】 UV-C処理後のEFM7+/+およびEFM4-/-におけるアポトーシスの誘導
を示す。

【図７】 TC PTP-/-マウスのγ線照射に対する過敏性を示す。

【図８】生理的TC-PTP基質を発見するためのTC-PTP-/- マウスおよび基質
トラップ法の使用を、蛋白質p62DOKに関して示す。

【図９】 wtまたはCS-DN TC-PTP変異体を送達するためのtat-TC-PTPベクタ
ー系の細菌産生における構築物の使用を示す。

【図１０】 tat-TC-PTP蛋白質がヒト癌細胞の細胞抽出物中にPTP酵素活性
を急速に輸送しうることを示す。

【図１１】 tat-TC-PTP融合蛋白質が哺乳動物細胞内に存在することを示す
。

【図１２】外因性TC-PTP蛋白質を発現させることによって哺乳動物細胞に
放射線抵抗性を提供しうることを示す。

【図１３】ヒト乳癌細胞株にTC-PTP蛋白質が著しく存在することを示す。

【図１４】大腸癌の70％以上でTC-PTPレベルの上昇が認められることを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８５Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１４Ｃ０８６ 43/00 １１１Ｃ１２Ｑ 1/42 ４Ｃ０８７Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 15/09 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/42 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 33/573 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 35/76 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 33/573 15/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シモンシックポールダニエルカナダ国オンタリオ州ミシソーガパインスモーククレセント 3431 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA29 CB02 DA20 FB01 FB03 4B024 AA01 BA10 CA02 CA20 DA02 GA11 HA17 4B063 QA05 QQ61 QQ89 QR07 QR42 QR48 QR50 QR57 QX07 4B065 AA91X AA91Y AB01 AC14 AC20 BA01 BA30 CA29 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA13 AA20 BA44 CA53 NA14 ZB262 ZC202 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC20 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZB26 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞におけるDNA傷害因子（DNA damaging agent）に対する
細胞の感受性を調整する方法であって、該細胞におけるT細胞蛋白質チロシンホスファターゼ（TC-PTP）活性のレベル
を変化させる段階を含む方法。
【請求項２】方法が、細胞におけるDNA傷害因子に対する感受性を誘導す
るためにTC-PTPの阻害因子を投与する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】細胞が細胞周期のG1期を延長している、請求項2記載の方法
。
【請求項４】 TC-PTP阻害因子が低分子阻害物質である、請求項2記載の方
法。
【請求項５】阻害因子がTC-PTPに対して特異的な抗体である、請求項2記
載の方法。
【請求項６】阻害因子がTC-PTPに対して特異的なアンチセンス核酸である
、請求項2記載の方法。
【請求項７】阻害因子がTC-PTPの蛋白質基質に由来する、請求項2記載の
方法。
【請求項８】基質がp62dokである、請求項7記載の方法。
【請求項９】細胞が腫瘍細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項１０】腫瘍細胞に有効量のDNA傷害因子を投与する段階をさらに
含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】方法が、細胞におけるDNA傷害因子に対する防御能を誘導
するためにTC-PTP活性の増強因子を投与する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】増強因子がTC-PTPをコードする外因性核酸である、請求項
11記載の方法。
【請求項１３】増強因子がTC-PTP蛋白質である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】 TC-PTP活性を調整する作用因子に関するスクリーニングの
方法であって、候補作用因子をTC-PTPと共存させる段階、および細胞周期またはDNA修復に対する該候補作用因子の効果を判定する段階を含む方法。
【請求項１５】 TC-PTP活性を調整する作用因子に関するスクリーニングの
方法であって、候補作用因子をTC-PTPおよび蛋白質基質と共存させる段階、ならびに該基質のリン酸化に対する該候補作用因子の効果を判定する段階を含む方法。
【請求項１６】蛋白質基質がp62dokである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】有効量のTC-PTP阻害因子および薬学的に許容される担体を
含む、細胞においてDNA損傷に対する感受性を誘導するための組成物。
【請求項１８】 TC-PTP阻害因子が低分子阻害物質である、請求項17記載の
組成物。
【請求項１９】阻害因子がTC-PTPに対して特異的な抗体である、請求項17
記載の組成物。
【請求項２０】阻害因子がTC-PTPに対して特異的なアンチセンス核酸であ
る、請求項17記載の組成物。
【請求項２１】阻害因子がTC-PTPの蛋白質基質に由来する、請求項17記載
の組成物。
【請求項２２】基質がp62dokである、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】有効量のTC-PTP増強因子および薬学的に許容される担体を
含む、細胞においてDNA損傷に対する抵抗性を誘導するための組成物。
【請求項２４】増強因子がTC-PTPをコードする外因性核酸である、請求項
23記載の組成物。
【請求項２５】増強因子がTC-PTP蛋白質である、請求項23記載の組成物。