PT724588E

PT724588E - Proteina de ligacao a farmacos

Info

Publication number: PT724588E
Application number: PT94928616T
Authority: PT
Inventors: John C Lee; Jerry L Adams; Timothy F Gallagher; David W Green; John Richard Heys; Peter C Mcdonnell; Dean E Mcnulty; James E Strickler; Peter R Young
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 2000-05-31
Also published as: DK0724588T3; US5777097A; ATE186551T1; EP0724588A1; JP3377529B2; GR3032635T3; DE69421624T2; CA2171982A1; EP0724588B1; AU686669B2; DE69421624D1; EP0724588A4; CN1048731C; ES2140561T3; JPH09502873A; CA2171982C; CN1134704A; HK1012399A1; US5871934A; US5955366A

Description

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DESCRICÃQ “Proteína de ligação a fármacos”

Campo do Invento: O presente invento refere-se a proteínas de ligação a fármacos, a genes que codificam as mesmas e a ensaios e métodos para pesquisa de especialidades farmacêuticas. Mais especificamente, o presente invento refere-se a proteínas de ligação a fármacos anti-inflamatórios supressores de citóquinas (CSAID - “Cytokine Suppressive Anti-lnflammatory Drug”), a genes que codificam as mesmas e a ensaios e pesquisas úteis na avaliação e caracterização de fármacos desta classe farmacológica.

Antecedentes do Invento:

As citóquinas desempenham um papel importante na regulação da resposta celular durante a inflamação e outras funções imunitárias. De particular interesse são as citóquinas interleucina-1 (IL-1, α e β) e o factor de necrose tumoral (TNF, α e β), as quais são as proteínas intercelulares envolvidas no passo inicial da cascata da resposta inflamatória (Arai, et ai, Ann. Rev. Biochem. 59: 783-836 (1990)). Assim, tem havido uma substancial investigação recentemente dedicada a interferir na produção de IL-1 e TNF em resposta a um estímulo inflamatório.

Uma abordagem terapêutica envolve a supressão da produção de IL-1 e TNF ao nível da transcrição e/ou tradução e/ou secreção. As actividades associadas a certos piridinil-imidazolos conduzem a uma classe de compostos referidos como “CSAID” ou fármacos anti-inflamatórios supressores de citóquinas (“Cytokine Supressing Anti-lnflammatory Drugs") (Figura 1). Estes compostos parecem parar a expressão de IL-1 e TNF predominantemente ao nível da tradução, embora tenha também sido observado um efeito menor sobre a transcrição mas não podem ser excluídos efeitos noutros passos. O piridinil-imidazolo, 5-(4-piridil)-6(4-fluorofenil)-2,3-di-hidroimidazo(2,1 -b)-tiazolo (SK&F 86002) foi identificado como o CSAID prototípico. As bases para a sua actividade foram estabelecidas e caracterizadas (Lee, et ai, lnt'l J. Immunopharm. 10(71: 835-843 (1988L Aaents and Actions 27(3/41: 277-279 (1989) e lnt'l J. Immunother. 6(1): 1-12 (1990)). Os estudos de SAR (aqui discutidos)

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 2 sugerem que ο efeito supressor de citóquinas dos piridinil-imidazolos representa uma actividade única independente dos seus efeitos inibidores da produção de eicosanóides e leucotrienos. No entanto, nenhum composto da série inicial foi selectivo para actividade supressora de citóquinas ou foi particularmente potente.

Uma vez que os CSAID possuem potencial substancial como novos agentes terapêuticos anti-inflamatórios, existe um interesse significativo na caracterização do seu mecanismo de acção ao nível molecular, bem como na obtenção de compostos com maior selectividade e potência. Especificamente, a identificação e caracterização do alvo molecular dos CSAID melhoraria a compreensão dos processos bioquímicos envolvidos na inflamação e ajudaria na concepção e pesquisa de mais fármacos anti-inflamatórios potentes. Este invento divulga, inter alia, a purificação e caracterização de tais proteínas de ligação a CSAID (CSBP).

Os ADN deste invento, tais como as sequências específicas aqui divulgadas, são úteis na medida em que codificam a informação genética necessária para a expressão das novas CSBP. Adicionalmente, as sequências podem ser utilizadas como sondas de forma a isolar e identificar quaisquer outros membros da família de CSBP bem como constituindo as bases da terapia anti-sentido para condições de doença que são caracterizadas por expressão atípica do gene de CSBP. A própria nova proteína é útil directamente como agente terapêutico ou de diagnóstico bem como componente num sistema de pesquisa para compostos que sejam antagonistas ou agonistas da actividade de ligação a CSAID. A proteína é também útil para provocar a produção de anticorpos em espécies heterólogas, sendo os referidos anticorpos úteis para as aplicações acima referidas de diagnóstico, terapêuticas e de pesquisa. Estas e outras utilizações dos reagentes aqui descritos tomar-se-ão evidentes para os de vulgar perícia na arte após a leitura deste fascículo. i

Breve Descrição do Invento

Este invento proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma proteína de ligação a CSAID, incluindo ARNm, ADN, ADNc bem como análogos anti-sentido destes e fragmentos destes biologicamente activos e úteis para diagnóstico ou terapia.

Este invento proporciona também vectores recombinantes, tais como plasmídeos de clonagem e de expressão úteis como reagentes na produção

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 3 recombinante de proteínas ou péptidos de ligação a CSAID, bem como células hospedeiras recombinantes procarióticas e/ou eucarióticas compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica a CSBP.

Este invento proporciona também métodos de identificação de ligandos capazes de se ligar à CSBP através da medição da ligação do ligando a ser identificado em relação a ligandos conhecidos.

Este invento proporciona também métodos para pesquisa de fármacos para identificar compostos que interajam e se liguem à CSBP. A proteína de ligação pode estar na forma isolada em solução ou na forma imobilizada, ou pode estar geneticamente modificada para ser expressa à superfície de células hospedeiras recombinantes tal como num sistema de expressão fágico ou como proteínas de fusão. Alternativamente, podem ser empregues em protocolos de pesquisa células completas ou fracções citosólicas compreendendo a CSBP. Independentemente da forma da proteína de ligação, uma pluralidade de compostos são postos em contacto com a proteína de ligação sob condições suficientes para formarem um complexo composto/proteína de ligação e são detectados os compostos capazes de formar, melhorar ou interferir com os referidos complexos.

Este invento proporciona também sondas de ácido nucleico que compreendem moléculas de ácido nucleico de comprimento suficiente para hibridarem especificamente com sequências semelhantes a proteínas de ligação a CSAID.

Este invento proporciona também um oligonucleótido anti-sentido que possui uma sequência capaz de se ligar a ARNm que codificam a CSBP de forma a evitar a tradução do referido ARNm.

Este invento proporciona também proteínas de fusão compreendendo um domínio de ligação a CSAID e um domínio indicador de ligação a proteína de ligação/ligando capaz de proporcionar um sinal analiticamente detectável. São também proporcionados métodos de pesquisa de fármacos através da formação, melhoramento ou interferência com o sinal detectável.

Este invento proporciona também um método de pesquisa de compostos para identificar os compostos que se ligam a uma proteína de ligação a CSAID compreendendo: proporcionar uma célula hospedeira recombinante que expresse 4 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ à sua superfície uma proteína de ligação a CSAID, estando a referida proteína associada a um segundo componente capaz de proporcionar um sinal detectável em resposta à ligação de um composto à referida proteína; pôr em contacto uma pluralidade de compostos candidatos com as referidas células hospedeiras sob condições suficientes para permitir a ligação dos compostos à proteína de ligação; e identificar os compostos capazes de ligação através da detecção do sinal produzido pelo referido segundo componente.

Breve descricão das Fiauras A Figura 1 ilustra a correlação de Cl50 dos CSAID piridinil-imidazolos para a biossíntese de IL-1 β em células THP.1 e monócitos humanos. Foi criado um gráfico de dispersão de pontos log-log de «50 compostos em relação às suas Cl50 para inibir IL-1 ou TNF. Foi efectuada análise de regressão e o coeficiente de correlação é 0,881. A Figura 2 ilustra a captação dependente do tempo e reversível de 3H-Composto I em células THP.1 intactas. Foram incubadas 2 milhões de células THP.1 sozinhas (controlo de solvente apropriado) ou com Composto I marcado radioactivamente (50 nM) na ausência (0-0) ou presença de um excesso de ligando não radioactivo Composto I (50 μΜ) (quadrado) e Composto VIII (triângulo). A vários intervalos, as células foram centrifugadas sobre uma almofada de sacarose a 8% e a pelete celular foi avaliada quanto à radioactividade através de contagem de cintilações. A ligação saturável foi alcançada aos 15 minutos. A Figura 3 ilustra a localização subcelular da actividade de ligação. Foram incubadas 10 milhões de células THP.1 com Composto I marcado radioactivamente 50 nM durante 30 minutos a 22°C. As células foram destruídas por homogeneização. O lisado celular foi fraccionado em fracção nuclear, particulada e solúvel por centrifugação diferencial. A massa de radioactividade estava associada à fracção citosólica. Um resultado idêntico foi obtido num ensaio de ligação utilizando amostras previamente fraccionadas. A Figura 4 ilustra a análise de isotérmica de ligação e gráfico de "Scatchard” da ligação do Composto I pelo citosol de THP.1. Foi efectuada a titulação do Composto marcado radioactivamente (de 0 a 1 μΜ) na presença de um excesso constante de ligando frio (50 μΜ) no ensaio de ligação utilizando citosol bruto de THP.1. A ligação específica é saturável. A análise do gráfico "Scatchard" mostrou

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 5 uma Kd de 3,6 ηΜ e Bmáx de 5 pmol/mg de proteína e um único local de ligação. A Figura 5 ilustra a especificidade da actividade de ligação a CSAID. Foi testada uma grande quantidade de compostos piridinil-imidazolo abrangendo três classes estruturais diferentes com Cl50 conhecidos para a inibição da síntese de citóquinas num ensaio de ligação competitiva no qual foi utilizado o Composto I marcado radioactivamente. Houve um elevado grau de correlação entre as duas actividades (R=0,889) sugerindo que o evento de ligação é um passo necessário na inibição da produção de citóquinas. A Figura 6 ilustra a regiosselectividade dos CSAID. Foram testados quatro pares de formas regioisoméricas dos CSAID no bioensaio e no ensaio de ligação competitiva. Apenas uma forma isomérica do respectivo par estava activa com Cl50 idênticas em ambos os ensaios. A Figura 7 ilustra que a ligação de SB 202190 marcado radioactivamente é saturável, específica e reversível. Foi incubado citosol de THP.1 com Composto I SB marcado radioactivamente 50 nM durante 15 minutos para permitir uma ligação saturável para equilibrar, tempo ao fim do qual foi adicionado 30 μΜ do ligando frio e em vários intervalos foi determinada a ligação específica. A ligação é reversível com o Composto VII e numa menor extensão, com o Composto XI e de forma nenhuma com o Composto VIII, as Cl50 destes compostos no bioensaio foram de 20 nM, 50 nM e >5 μΜ, respectivamente. A Figura 8 ilustra que a actividade de ligação a CSAID é sensível a proteases e ao calor. Citosol de THP.1 foi sujeito a tratamento com tripsina (lOOpg/ml) (Painel A) e com calor (56°C) (Painel B). A anulação máxima da actividade de ligação foi alcançada em 2 minutos após o tratamento com tripsina. A actividade de ligação foi anulada após a incubação a 56°C, mostrou uma perda gradual a 37°C e era relativamente estável a 22°C e a 4°C. A Figura 9 ilustra a análise de marcação por fotoafinidade de CSBP através de SDS-PAGE e Autorradiografia. Foram pré-incubados aproximadamente 40 pg de proteína com os inibidores listados sobre o gel a 10 μΜ antes da marcação por fotoafinidade com 125l-Composto IV (2,5 nM). As reacções foram analisadas por SDS-PAGE e autorradiografia tal como aqui descrito. A Figura 10 ilustra a análise de fracções por focagem isoeléctrica

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 6 preparativa. Foi aplicada proteína marcada com 125l-Composto IV a Rainin RF3 e analisada tal como aqui descrito. ( A Figura 11 ilustra a análise de fracções de SDS-PAGE preparativa através de (A) SDS-PAGE e Coloração com Prata e (B) Radioactividade. As fracções foram analisadas tal como aqui e abaixo descrito. A Figura 12 ilustra a homologia da única sequência de aminoácidos identificada durante a análise de CSBP para a quinase MAP. A sequência peptídica (SEQ ID NO: 1) é listada abaixo da representação linear da quinase MAP dos 15 resíduos; 9 idênticos (60%), 13 idênticos ou homólogos (87%). A Figura 13 ilustra a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 6) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de uma porção da Proteína de ligação a CSAID. A Figura 14 ilustra a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 8) de uma segunda porção da Proteína de Ligação a CSAID. A Figura 15 ilustra diagramaticamente os vários ADNc das CSBP aqui descritas. A Figura 16 ilustra o ADNc (nucleótidos 356-1467 de SEQ ID NO: 11) e a sequência de aminoácidos de uma das CSBP aqui divulgadas. A Figura .17 ilustra a diferença nas sequências nucleotídica (nucleótidos 1054 a 1126 de SEQ ID NO: 11 e 13) e de aminoácidos (aminoácidos 230 a 255 de SEQ ID NO: 12 e 14) entre CSBP-1 e CSBP-2. A Figura 18 ilustra uma árvore filogenética de várias proteína-quinases. A Figura 19 ilustra o alinhamento das sequências de aminoácidos de CSBP-1 (SEQ ID NO: 12) e CSBP-2 (SEQ ID NO: 14) com membros seleccionados da família das proteína-quinases. A Figura 20 ilustra os resultados da expressão de CSBP (SEQ ID NO: 12 ou 14) em E. coli.

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 7 A Figura 21 ilustra a sequência de ácido nucleico completa do ADNc de CSBP-1 (SEQ ID NO: 11). A Figura 22 ilustra a sequência de ácido nucleico completa do ADNc de CSBP-2 (SEQ ID NO: 13).

Descricão Detalhada do Invento:

Ao aprofundar a descrição do presente invento, serão empregues os seguintes termos adicionais e pretende-se que sejam definidos tal como abaixo indicado.

Um “antigénio” refere-se a uma molécula contendo um ou mais epitopos que estimulará o sistema imunitário de um hospedeiro para produzir uma resposta humoral e/ou celular específica para o antigénio. O termo é também aqui utilizado indiferentemente em relação a “imunogénio”. O termo “epitopo” refere-se ao local num antigénio ou hapteno ao qual se liga uma molécula de anticorpo específica. O termo é também aqui utilizado indiferentemente em relação a “determinante antigénico” ou “local determinante antigénico”. “Proteína de fusão” é uma proteína que resulta da expressão de pelo menos duas sequências de codificação heterólogas ligadas operativamente. A proteína que compreende uma proteína de ligação a CSAID ou fragmento desta e uma segunda sequência peptídica não relacionada é um exemplo de uma proteína de fusão.

Uma sequência de codificação está “operativamente ligada a” outra sequência de codificação quando a ARN-polimerase transcrever as duas sequências de codificação num único ARNm, o qual é então traduzido num único polipéptido possuindo aminoácidos derivados de ambas as sequências de codificação. As sequências de codificação não necessitam de ser contíguas uma relativamente à outra desde que a sequência expressa seja no final processada para produzir a proteína desejada.

Polipéptidos “recombinantes” referem-se a polipéptidos produzidos por técnicas de ADN recombinante; i.e., produzidos a partir de células transformadas

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 8 por uma construção de ADN exógena que codifique o polipéptido desejado. Polipéptidos “sintéticos” são os preparados através de síntese química.

Um “replicão” é qualquer elemento genético (p. ex., plasmídeo, cromossoma, vírus) que funcione como uma unidade autónoma de replicação de ADN in vivo; i.e., capaz de replicação sob o seu próprio controlo.

Um “vector” é um replicão, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual pode ser ligado outro segmento de ADN de forma a causar a replicação do segmento ligado.

Uma “molécula de ADN de cadeia dupla” refere-se à forma polimérica de desoxirribonucleótidos (bases adenina, guanina, timina ou citosina) numa hélice de cadeia dupla, ambas relaxadas e super-enroladas. Este termo refere-se apenas às estruturas primária e secundária da molécula e não a limita a quaisquer formas terciárias em particular. Assim, este termo inclui o ADN de cadeia dupla encontrado, inter alia, em moléculas de ADN lineares (p. ex., fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos e cromossomas. Na discussão da estrutura de determinadas moléculas de ADN de cadeia dupla, as sequências podem ser aqui descritas de acordo com a convenção normal de dar apenas a sequência no sentido 5’ para 3’ ao longo da cadeia não transcrita de ADN (i.e., a cadeia que possui a sequência homóloga ao ARNm).

Uma “sequência de codificação de” ADN ou uma “sequência nucleotídica que codifica” uma determinada proteína, é uma sequência de ADN a qual é transcrita e traduzida num polipéptido quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas.

Uma “sequência promotora” é uma região de ADN reguladora capaz de se ligar à ARN-polimerase numa célula e de iniciar a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (no sentido 3’). Para fins de definição do presente invento, a sequência promotora está ligada na extremidade 3’ através de um códão de iniciação da tradução (p. ex., ATG) de uma sequência de codificação e estende-se para montante (no sentido 5’) de modo a incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do ruído de fundo. Dentro da sequência promotora será encontrado um local de iniciação da transcrição (convenientemente definido através de mapeamento com nuclease S1), bem como domínios de ligação a proteínas (sequências de

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 9 consenso) responsáveis pela ligação à ARN-polimerase. Os promotores eucarióticos conterão frequentemente, mas nem sempre, caixas “TATA” e caixas “CAT”. Os promotores procarióticos contêm sequências de Shine-Dalgarno em adição às sequências de consenso -10 e -35. “Sequências de controlo” de ADN referem-se colectivamente a sequências promotoras, locais de ligação a ribossomas, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores a montante, estimuladores e semelhantes, os quais colectivamente proporcionam a expressão (i.e., a transcrição e tradução) de uma sequência de codificação numa célula hospedeira.

Uma sequência de controlo “dirige a expressão” de uma sequência de codificação numa célula quando a ARN-polimerase se liga à sequência promotora a transcreve a sequência de codificação em ARNm, o qual é então traduzido no polipéptido codificado pela sequência de codificação.

Uma “célula hospedeira” é uma célula que foi transformada ou transfectada, ou que é capaz de transformação ou transfecção por uma sequência de ADN exógena.

Uma célula foi “transformada” por ADN exógeno quando tal ADN exógeno foi introduzido no interior da membrana celular. O ADN exógeno pode estar ou não integrado (ligado covalentemente) no ADN cromossómico que constitui o genoma da célula. Em procariotas e leveduras, por exemplo, o ADN exógeno pode ser mantido num elemento epissomal, tal como um plasmídeo. Em relação às células eucarióticas, uma célula transformada ou transfectada de forma estável é uma célula na qual o ADN exógeno se integrou no cromossoma de forma que é herdado pelas células filhas através da replicação dos cromossomas. Esta estabilidade é demonstrada através da capacidade da célula eucariótica para estabelecer linhas celulares ou clones constituídos por uma população de células filhas contendo o ADN exógeno.

Um “clone” é uma população de células derivadas de uma única célula ou ancestral comum através de mitoses. Uma “linha celular” é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro durante muitas gerações.

Duas sequências de ADN ou polipeptídicas são “substancialmente homólogas” ou “substancialmente as mesmas” quando pelo menos cerca de 85% 10 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ (de preferência pelo menos cerca de 90%, sendo mais preferível pelo menos cerca de 95%) dos nucleótidos ou aminoácidos coincidem ao longo de um determinado comprimento da molécula. Tal como aqui utilizado, substancialmente homólogas refere-se também a sequências que mostram identidade com a sequência de ADN ou polipeptídica especificada. As sequência de ADN que sâo substancialmente homólogas podem ser identificadas numa experiência de hibridação de “Southern” sob, por exemplo, condições rigorosas, tal como definido para esse sistema em particular. A definição das condições de hibridação apropriadas está dentro da perícia na arte. Ver, p. ex., “Current Protocols in Mol. Biol.” Vol. I & II, Wiley Interscience. Ausbel, et a/., (ed.) (1992). As sequências proteicas que são substancialmente as mesmas podem ser identificadas através de digestão proteolítica, electroforese em gel e micro-sequenciação.

Com o termo “funcionalmente equivalente" em relação a CSBP pretende-se que a sequência de aminoácidos da proteína em questão seja uma sequência que apresente a actividade de ligação a CSAID aqui divulgada.

Uma região “heteróloga” de uma construção de ADN é um segmento identificável de ADN no interior, ou ligado a outra molécula de ADN que não se encontra em associação com a outra molécula na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de um receptor, o gene estará normalmente flanqueado por ADN que não flanqueia o gene no genoma do animal de origem. Outro exemplo de uma sequência de codificação heteróloga é uma construção em que a própria sequência de codificação não se encontra na natureza (p. ex., sequências sintéticas que possuem codões diferentes dos do gene nativo). Variação alélica, união alternativa ou acontecimentos mutacionais de ocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga de ADN, tal como aqui se utiliza.

Desenvolvimento de Reagentes Moleculares: Síntese de Radioliaandos

De forma a isolar e purificar a CSBP deste invento, foi primeiro necessário proporcionar vários reagentes moleculares marcados. O triaril-imidazolo fenólico, Composto I, foi escolhido como radioligando alternativo devido à sua potência nanomolar e à síntese relativamente fácil do composto radioactivamente marcado através de redução catalítica do brometo de arilo correspondente na presença de gás de tritio. i 11 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

12 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ β Ο Composto I foi preparado de acordo com o seguinte protocolo de reacção:

2-(3,5-Dibromo-4-hidroxifenil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridil)imidazolo PM.489,141 2,9 mg

4-(4-Fluorofenil)-2-(4-hidroxi-fenil-3,5-t2)-5-(4-piridil)imidazolo 331,349 48,6 mCi 2-(3-B romo-4-hid roxi-5-t)-4-(4-fluoro- fenil)-5-(4-piridil)imidazolo P.M. 410,245 10,1 mCi

4-(4-Fluorofenil)- 2-(4-hidroxifenil-3,5-^)-5-(4-piridil)imidazol Composto I 9,3 mCi

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Preparação de 4-(fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil-3,5-t2)-5-(4-piridil)imidazolo, (Composto I).

Foi dissolvida uma porção de 2,9 mg (0,0059 mmol) de 2-(3,5-dibromo-4-hidroxifenil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridil)imidazolo, Composto l(p), em 0,95 ml de DMF seco e 0,05 ml de trietilamina num balão de fundo redondo de 2,4 ml equipado com uma pequena barra magnética de agitação. Foi adicionada uma porção de 1,7 mg de Pd/C a 5% (lote Engelhard 28845) e o balão foi ligado ao aplicador de trítio de aço inoxidável. Removeu-se o gás da mistura através de quatro ciclos de congelação-bombeamento-descongelação, sendo depois introduzido gás de trítio (5,3 Ci, 0,091 mmol). Deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se vigorosamente durante 20 h. A mistura foi congelada em azoto líquido, o gás de trítio remanescente (2,4 Ci) foi removido e o balão foi removido do aplicador. A mistura reaccional foi transferida, utilizando 3 χ 1 ml de metanol como lavagens, para um balão de fundo redondo de 10 ml e os solventes foram removidos por transferência estática em vácuo. Foi adicionada uma porção de 1,5 ml de metanol ao resíduo, removida depois por transferência estática em vácuo. Foi repetido o último processo. Finalmente, o resíduo foi suspenso em 1,5 ml de etanol e filtrado através de um filtro Millipore de ponta de seringa (0,5 micron), juntamente com lavagens com 3 χ 1 ml ca. de etanol. O volume total do filtrado foi determinado como sendo 3,9 ml e a radioactividade total, 94,2 mCi. A solução foi determinada como sendo 3,9 ml e a radioactividade total, 94,2 mCi. A análise por HPLC do filtrado (Partisil 5 ODS-3, 4,6 mm I.D. χ 25 cm, 1 ml/min de água/acetonitrilo/ácido trifluoroacético 70:30:01, radiodetector Radiomatic Flo-One Beta com 3 ml/min de mistura Ecoscint-H através de uma célula de 0,75 ml) mostrou a presença de Composto I (Rt = 60 min. ca. 37% da radioactividade total) e um intermediário discreto que se presume ser o derivado de monobromo, Composto la (Rt = 11,8 min, ca. 9%). A solução de filtrado foi evaporada até quase à secura com uma corrente de azoto e o resíduo foi dissolvido em cerca de 1,2 ml da fase móvel de HPLC. A solução foi separada por HPLC tal como mostrado abaixo e os picos correspondentes aos Compostos I e la e SB foram recolhidos em separado . 14 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Método de HPLC

Coluna

Fase Móvel

Caudal Detecção por UV Volumes de Injecção Tempos de Retenção

Altex Ultrasphere D.l. de 10 mm χ 25 cm 70:30:0,1 água/acetonitrilo/ácido trifluoroacético 5 ml/min 210 nm 0,05 - 0,4 ml Composto I, 7,8 min Composto la, 24 min

As fracções reunidas de Composto I totalizaram 32 ml de volume e a concentração radioactiva foi de 1,52 mCi/ml (total 48,6 mCi). As fracções de Composto la [3H] SB reunidas (totalizando 10,1 mCi) foram evaporadas até à secura e o resíduo foi transferido quantitativamente para um frasco de vidro utilizando 3,8 ml de etanol absoluto para análises posteriores.

Uma porção de 8 ml (12,2 mCi) de Composto I foi evaporada até à secura in vacuo a <35°C, dissolvida depois em 0,5 ml de fase móvel. O volume total foi injectado no sistema de HPLC acima descrito e o pico apropriado foi recolhido. A evaporação do eluato recolhido in vacuo a <35°C e a transferência do resíduo amarelo para um frasco com etanol absoluto proporcionou uma solução (3,8 ml, 2,44 mCi/ml) de Composto I. A porção desta solução utilizada para análise de RMN foi primeiro evaporada até à secura utilizando uma corrente de azoto e depois tomada em CD3OD.

Análise de 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil-3,5-t2)-5-(4-piridil)imidazolo, Composto I.

Pureza Radioauímica por HPLC Método Coluna

Fase Móvel

Caudal Detecção de Massa

Ultrasphere Octyl, 5 μιτι, 4,6 mm D.l. χ 25 cm, Beckman 350:150:0,5 (v/v/v) água/acetonitrilo/ácido trifluoroacético 1,0 ml/min UV a 210 nm 15 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Detecção de Radioactividade Detector de fluxo de radioactividade

Ramona-D

Cintilador Tru-Count (Tru-Lab Supply Co.) Caudal Volume Celular Tempo de Retenção Resultado 5,0 ml/min 0,75 ml 7.7 min 98.7

Concentração de Radioactividade por Contagem de Cintilações Método

Cintilador Ready Safe (Beckman Instruments, Inc.) Instrumento Eficiência Resultado Modelo analítico TM 6881 Cálculo automático de DPM a partir da curva de extinção 2,44 mCi/ml

Actividade Específica por Espectrometria de Massa Método CI-MS, gás reagente NH3

Resultado 20,0 Ci/mmol Distribuição de 3H: Não marcado 44% Marcação simples 43% Marcação dupla 13% 3H-RMN9 Método Instrumento Experiência Pico de Referência Solvente Resultado Brunker AM 400 3H-RMN de protão desacoplado 3H-RMN de protão não desacoplado 3H-RMN de protão não desacoplado Pico de Solvente de metanol d 3.3 Metanol-d4 O trítio é incorporado exclusivamente nos átomos de carbono orto no grupo hidroxilo aromático 16 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Resumo Analítico

Ensaio Resultado

Pureza radioquímica determinada por HPLC 98,7%

Concentração de radiactividade determinada 2,44 mCi/ml por contagem de cintilações

Actividade específica determinada por 20,0 Ci/mmol espectrometria de massa 3H-RMN concorda com a estrutura proposta

Liaando de fotoafinidade radioactivamente marcado

Adicionalmente, foi sintetizado uma marcador radioactivo de fotoafinidade. Idealmente, o reagente de radiofotoafinidade devia ter uma afinidade de ligação submicromolar, um local conveniente para a ligação de um marcador radioactivo (de preferência um emissor gama) e permitir o posicionamento do grupo fotorreactivo, (p. ex. uma azida) próximo do local de ligação. A SAR que conduz à proposta do Composto IV como candidato para reagente de fotoafinidade está ilustrada na Tabela I abaixo.

Fórmula II

Fórmula III 17 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Tabela I

Composto X BioEnsaio CI50, μΜ Composto Y BioEnsaio Cl50, μΜ lia 4-F >0,1 11 la H 0,15 llb 4-H 0,5 lllb 4-N3 0,05 llc 4-CI 0,05 lllc 3-l-4-NH2 0,48 lld 3-CI 0,04 II Id 4-NH2 0,28 lie 2-CI 0,25 iif 4-I 0,58 Mg 3-I 0,05

Adicionalmente, pode também ser empregue de forma útil um ensaio ELISA específico para determinar os níveis de iL-1 β e TNFa (ver: Pedidos PCT US93/00674 e US93/00675)

Cl50 de ligação a CSAID = 0,72 μΜ A síntese do marcador de fotoafinidade radioiodado, Composto IV, empregou uma estanilação mediada por paládio do iodeto de arilo e subsequente radioiodação electrofílica, de acordo com o seguinte protocolo. 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

18

[3-[2-(4-azidofenil)-5-(4-piridinil)-1H-(4-piridinil)-imidazol-4-il]fenil]fenil]tributilestanano Ρ.Μ. 627,40 Composto IV (ρ) 250 pg

4-[2-(azidofenil)-5-(3-125lodofenil)-1H-imidazol-4-il]piridina Composto IV 3,60 mCi

Descrição do Processo Síntese e purificação de 4-[2-(4-azidofenil)-5-(3-125lodofenil)-1/-/-imidazol-4-il]piridina.

Dissolveu-se [3-[2-(4-azidofenil)-5-(4-piridinil)-1H-imidazol-4-il]fenil]tributiles-tanano, Composto IV (p) (250 pg, 0,398 pmol) em 100 pl de ácido acético a 3% em etanol. A esta solução foram adicionados 2,85 pg de hidrato de cloramina-T (0,013 pmol) em 11,4 pl de água e 5,19 mCi de sódio-[125l]iodo em 45 pl de hidróxido de sódio 0,1 N. Foram adicionados mais 50 pl de ácido acético a 3% em

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 19 etanol para tornar a mistura reaccional homogénea. A reacção foi agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente (no escuro). A reacção foi então soprada até à secura sob uma corrente de azoto seco e o resíduo foi submetido a partição entre clorofórmio (1 ml) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (1 ml). A camada aquosa foi extractada com clorofórmio (2 χ 1 ml), as camadas orgânicas foram combinadas e secas por passagem através de uma pipeta cheia com sulfato de sódio granular. O solvente foi removido sob corrente de azoto seco; verificou-se que o resíduo continha 4,36 mCi de iodo-125 (ensaiado no calibrador de doses Capintec). Verificou-se que as camadas aquosas continham 310 μΟί de iodo-125. O resíduo da camada orgânica foi retomado em 80 μΙ de fase móvel de HPLC e purificado numa coluna de Si02 Baker, 5 μπι, D.l. de 4,6 mm χ 250 mm, eluído a 1,5 ml/min com hexano/isopropanol/trietilamina 90:10:1 (v/v/v), com monitorização por UV a 260 nm. As fracções de produto foram combinadas e sopradas até à secura sob uma corrente de azoto seco. O produto foi retomado em 3,0 ml de etanol absoluto. Este procedimento deu 3,60 mCi de Composto IV com uma pureza radioquímica de 99,0%, concentração radioactiva de 1,20 mCi/ml e uma actividade específica de 1736 Ci/mmol.

Análise de 4-[(2-azidofenil)-5-(3-iodo-125l-fenil)-1 /-/-imidazol-4-il]piridina, Composto IV.

Pureza Radioquímica por HPLC Método

Coluna

Fase Móvel Caudal

Detecção de Massa Detecção de Radioactividade Detector Cintilador Caudal

Tamanho Celular Tempo de Retenção Resultado

Baker, Sílica, 5 μηπ, 120 A, D.l. de 4,6 mm χ 25 cm. 90:10:1 (v/v/v) hexano/isopropanol/trietilamina 1,3 ml/min UV a 260 nm detector de fluxo de radioactividade β-RAM Tru-Count (Tru-Lab Supply Co.) 5.0 ml/min 0,8 ml 17.0 min 99.0% 20 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Concentração de Massa através de HPLC Método Coluna Fase Móvel Caudal Detecção de Massa Tempo de Retenção Resultado

Baker, Sílica, 5 ,um, 120 A, D.l. de 4,6 mm x 25 cm. 90:10:1 (v/v/v) hexano/isopropanol/trietilamina I, 5 ml/min UV a 260 nm II, 2 min 99.0%

Concentração Radioactiva por Contagem de Cintilações - método do padrão externoMétodo

Solvente Instrumento EficiênciaResultado

Ready Safe (Beckman) Modelo analítico TM 6881 Cálculo automático de DPM a partir da curva de extinção 1,2 mCi/ml

Actividade Específica Derivada das Concentrações de Massa e Radioactiva Método derivado das concentrações de massa e radioactiva Resultado 1736Ci/mmol

Resumo Analítico Ensaio Pureza radioquímica por HPLC Concentração de massa por HPLC Concentração radioactiva Actividade específica derivada concentrações de massa e radioactiva

Resultado 99,0% 0,32 pg/ml 1,2 mCi/ml das 1736Ci/mmol O marcador de fotoafinidade tem uma Cl50 de 0,5-0,8 μΜ num ensaio de ligação competitiva e uma Cl50 de 3 μΜ num bioensaio com CSAID.

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 21

Bioensaio com CSAID Ο ensaio biológico empregue para avaliar a actividade de CSAID foi o ensaio de indução de EL-4/IL-2 dependente de IL-1 (Simon, P.L. et ai, J. Immuno. Meth. 84: 85-94 (1985)). Resumidamente, foram plaqueados monócitos humanos em placas de 24 poços em meios RPMI 1640 isentos de LPS contendo soro AB humano a 1% numa concentração de 106 por milímetro por poço e permitiu-se a aderência durante 1 h a 37°C; as células não aderentes foram removidas através de lavagem cuidadosa. Os compostos ou meios de teste foram adicionados às células 0 ou 1 hora antes da adição de lipopolissacárido bacteriano (£. coli 001 :B4; Difco, Detroit) a 10 ng/ml. As culturas foram então incubadas a vários intervalos tal como indicado a 37°C numa atmosfera húmida de C02 a 5%. No final do período de incubação, os sobrenadantes das culturas foram recolhidos. Os monócitos aderentes residuais foram lisados num tampão contendo octil-glucopiranósido 0,15 M, Hepes 25 mM e fenilmetilsulfonilfluoreto 0,5 mM em solução salina. Tantos os sobrenadantes como os lisados celulares foram clarificados por centrifugação e ensaiados quanto à actividade de IL-1. A actividade de IL-1 foi medida através da sua capacidade para estimular a secreção de IL-2 por células EL-4 (ATCC TIB181) na presença de ionóforo A23187. Foram incubadas diluições em série das amostras com 105 células EL-4 na presença de ionóforo de cálcio A23187, 2x10'7 M. Após incubação de um dia para o outro, foi retirado 0,1 ml de um sobrenadante sem células de cada uma das culturas e incubado com 104 células CTLL-20 (ATCC-TIB214) dependentes de IL-2. Após mais 20 horas de incubação, as culturas foram sujeitas a pulsos de 1 μΟΐ de timidina tritiada durante 4 h. As células foram então colhidas para filtros de fibra de vidro e foi determinada a radioactividade por contagem de cintilação líquida. Todas as determinações da actividade de IL-1 foram feitas em comparação com um padrão.

Ensaio de Liaação a CSAID A fase seguinte do isolamento e purificação de CSBP necessitou do desenvolvimento e validação de um ensaio de ligação a CSAID baseado em células. Tal como acima mencionado, os primeiros estudos de CSAID foram conduzidos em monócitos humanos. Foi seleccionada uma fonte celular mais conveniente, a linha celular de leucemia monocítica humana, THP.1 (ATCC TIB202) e foi mostrado ser uma fonte celular substituta adequada para estudos 22 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ mecanísticos em virtude da sua resposta aos estímulos para produzir IL-1 e TNF bem como uma sensibilidade para CSAID comparável à dos monócitos humanos (Figura 1). O Composto I radioactivamente marcado foi absorvido por células THP.1 intactas de uma forma dependente do tempo (Figura 2). A captação do marcador radioactivo foi rápida e atingiu um nível máximo aos 3-5 minutos a 37°C. Adicionalmente, a captação do marcador radioactivo foi saturável e específica.

Após fraccionamento subcelular das células THP.1 carregadas de ligando radioactivamente marcado, verificou-se que o local subcelular predominante de acumulação da radioactividade era o citosol (Figura 3).

Foi desenvolvido um ensaio específico e reprodutível de ligação a CSAID utilizando a fracção citosólica solúvel de células THP.1 e o Composto I radioactivamente marcado. Resumidamente, citosol de THP.1 foi rotineiramente preparado a partir do lisado celular obtido através de cavitação com azoto seguido por uma centrifugação de baixa velocidade a 10 K xg e uma de alta velocidade a 100 K xg, cujo sobrenadante foi designado como a fracção citosólica. O citosol de THP.1 foi incubado com radioligando apropriadamente diluído à temperatura ambiente durante um tempo predeterminado para permitir que a ligação atingisse o equilíbrio. A amostra foi adicionada a uma coluna G-10 e eluída com TRN 20 mM, β-mercaptoetanol 50 μΜ, NaN3. A fracção que engloba o volume vazio foi recolhida e a radioactividade foi avaliada por contagem de cintilações líquida. Isto foi determinado para reflectir o radioligando ligado uma vez que o sinal radioactivo era anulado pela presença de excesso de ligando frio na mistura de incubação ou quando não estava presente a fracção citosólica.

Mais especificamente, o Ensaio de Ligação a CSAID é efectuado tal como se segue:

Materiais:

Tampão de incubação: Tris 20 mM, MgCI2 1 mM, Hepes 20 μΜ, NaN3 a 0,02%, armazenado a 4°C. Tampão de eluição: Tris 20 mM, 2-mercaptoetanol 50 μΜ, NaN3, armazenado a 4°C. G-10 Sephadex: adicionar 100 g de Sephadex G-10 (Pharmacia, Uppsala,

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Suécia) a 400 ml de H20dd e permitir que inche à temperatura ambiente durante 2 horas. Decantar os finos e lavar 3 vezes. Adicionar NaN3 e QS com H2Odd para 500 ml e armazenar a 4°C.

Montagem das Colunas: Encher a coluna, filtrar a frita e a ponta (Konotes, SP 420160-000, 420162-002). Tubos de baixa aderência (Nunc) utilizados na reacção de ligação. O citosol de THP.1 é centrifugado a 15000 rpm durante 5 min para clarificação. O citosol de THP.1 é preparado através de tratamento hipnótico das células e lise por descompressão em azoto. Os fragmentos nucleares e membranares são removidos por centrifugação diferencial (10000 g durante 1 hora e 100000 g durante 1 hora).

Compostos: Composto I não radioactivo com o correspondente controlo de EtOH (diluições feitas em tampão de incubação) e 3H-Composto I (diluições em tampão de incubação). Método A. Preparação da Coluna 1. Começar 30 min antes da eluição antecipada da mistura reaccional. 2. Adicionar 3 ml da pasta de G-10 à coluna até um volume de leito de 1,5 ml. 3. Lavar com 7 ml de tampão de eluição (encher até ao topo da coluna). 4. Cortar as colunas à medida. B. Incubação da Amostra 1. Incubação de 15 min a 4°C. 2. Mistura reaccional de ligação; 100 μΙ de citosol, 10 μΙ de Composto I frio ou controlo de EtOH, 10 μΙ de 3H-Composto I (a concentração molar depende da natureza do estudo). 3. Controlo “livre" = 100 μΙ de tampão de incubação em vez da preparação de citosol. C. Eluição da Amostra 1. Eluir a 4°C. 2. Adicionar o volume total de reacção à coluna de G-10. 3. Adicionar 400 μΙ de tampão de eluição à coluna e descartar o eluato. 4. Adicionar 500 μΙ de tampão de eluição à coluna, recolhendo o volume

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 24 eluído num frasco de cintilação de 20 ml. 5. Adicionar 15 ml de fluído de cintilação Ready Safe. 6. Sujeitar a vórtex e contar em contador de cintilação líquida durante 5 minutos. Incluir um “controlo de contagens totais de entrada” (10 μΙ de ligando marcado). D. Análise dos Dados 1. Representar DPMS graficamente como resultado e analisar através de análise de regressão e programa “Lundon ligand binding” para a determinação de Cl50 e Kd/Ki respectivamente. 2. Ordenar as IC50 dos compostos testados no bioensaio de CSAID e comparar com as geradas pelo ensaio de ligação a CSAID e estabelecer uma curva de correlação. O ensaio de ligação foi ainda validado pelos seguintes critérios: • O citosol de THP.1 demonstrou uma ligação saturável e específica do Composto I radioactivamente marcado (Figura 4). • Foi testado um número substancial de CSAID piridinil-imidazolos no ensaio de ligação competitiva com marcador radioactivo. A potência e as Cl50 ordenadas dos compostos tinham elevada correlação relativamente às determinadas pelo bioensaio de monócitos humanos (Figura 5). Para além disso, a actividade de ligação competitiva foi regiosselectiva (Figura 6). Estes resultados sublinham a particular utilidade do ensaio de ligação para os efeitos supressores de citóquinas destes compostos e é considerado como particularmente vantajoso para o desenvolvimento de SAR e para proporcionar os meios para ajudar a esclarecer o alvo molecular. • A ligação é altamente específica para os CSAID piridinil-imidazolos. Foi testada uma série de compostos de várias actividades farmacológicas não estruturalmente relacionados no ensaio de ligação competitiva. Estes incluem os inibidores específicos da ciclo-oxigenase, inibidores da 5-lipoxigenase, inibidores duplos de CO/LO, inibidores de PDE IV, macrólidos imunossupressores, esteróides e outros (Tabela II). Nenhum dos compostos testados a 100 μΜ demonstrou ligação competitiva.

Na Tabela II é proporcionada uma lista dos CSAID que não piridinil-imidazolos, compostos anti-inflamatórios ou imunossupressores relacionados testados no ensaio de ligação competitiva a CSAID. A menos que indicado em

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 25 contrário, não foi observada qualquer ligação competitiva até aos 100 μΜ.

TABELA II

Inibidores da Ciclo-oxigenase • Indometacina • Naproxeno Esteróide • Dexametasona Inibidores Selectivos da 5-Lipoxigenase Novos Anti-lnflamatórios • Classe da Hidroxiureia • IX270 • Classe do Aminofenol • Tenidap (Cl50 = 139 μΜ) • Romazarit Inibidor da Translocação da 5- Proliferadores de Peroxissomas Lipoxigenase • MK886 • Wyeth 14643 • Clofibrato Inibidores Duplos Agonistas do Receptor AH • Fenidona • 3-Metilcolantreno . NDGA(CI50 = 154 μΜ) • pNaftoflavona Imunossupressores Miscelâneos # FK506 • Tibenelast • Azaspirano • Tetrandrina • Rapamicina & Análogos Inibidor de PDE,V • Rolipram

Após o estabelecimento de uma fonte celular e de um ensaio de ligação, uma posterior caracterização de CSBP estabeleceu que a ligação a CSAID é saturável, específica e reversível (Figura 7), segue uma rápida taxa de início e terminação, a actividade de ligação é sensível a tratamento com proteases e com calor (Figura 8) e depende da concentração proteica (dados não mostrados). A actividade de ligação a CSAID em monócitos humanos é indiferenciável da determinada para THP.1 através dos critérios estabelecidos para a actividade de ligação acima listados. A ligação é dependente do pH com uma gama de pH óptimo de 5 a 8 e é independente de catiões bivalentes e é sensível a elevadas concentrações salinas o que é reversível. 26 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Purificação de CSBP A purificação das CSBP a partir de células THP.1 foi alcançada tal como se segue:

Materiais:

Foram sintetizados os seguintes compostos através dos métodos delineados nos pedidos PCT, US93/00674 e US93/00675 ambos apresentados em 13 de Janeiro de 1993.

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Os compostos radioactivamente marcados II e IV foram preparados tal como acima descrito. Foram adquiridos em ICN Biomedicals anticorpos policlonais e monoclonais contra actina (coelho (cat #65-096) e ratinho (cat. #69-100), respectivamente). O péptido NH2-lle-Thr-Ala-Ala-Gln-Ala-Leu-Ala-His-Ala-Tyr-Phe-Ala-GIn-Tyr-Cys-COOH (SEQ ID NO. 1) foi sintetizado pela química do FMOC padrão em fase sólida (ver por exemplo: Fields, G.B., et ai, lnt’l Peptide Protein Res. 35: 161-214 (1990), purificado e conjugado com hemocianina de lapa do género Fissurella (KLH) activada por maleimida (Pierce Chemical Co. Cat #77105A) através de métodos convencionais e utilizado para inocular coelhos. Todos os outros produtos químicos tinham pureza de reagente e a menos que especificado em contrário, não foram adquiridos a partir de vendedores particulares.

Crescimento das Células THP.1

As células THP.1 cresceram e foram processadas tal como se segue:

As células THP.1 crescem em meio RPMI-1640 com Hepes 25 mM, FBS a 10% (a 8% em reactores), glutamina 10 mM e F-68 plurónico a 0,05%. As células passaram por um ciclo de 3/4 dias com uma contagem média de células de 2x106 (densidade de sementeira entre 2x105e 3x105). Foi utilizada uma reciclagem de elevada densidade celular em balões de agitação para aumentar de escala para os reactores grandes. Neste processo, o volume total do balão de agitação foi centrifugado e ressuspenso com o mesmo volume de meio fresco. Portanto, a densidade de sementeira aumentou em cada passagem, dando uma densidade maior de células por volume. As densidades variaram de 6x106 a 12x106.

A partir dos balões de agitação, foram utilizados dois procedimentos de aumento de escala para obter os volumes desejados. Inicialmente, foram utilizados dois reactores Artisan de 80 I (volume útil de 60 I). Cada cinco dias foram retirados 50 I de ambos os reactores e colhidos. As células foram então alimentadas com mais 50 I até ser atingido o volume total necessário. Alternativamente, as células cresceram num Artisan de 30 I e foram utilizadas para semear o reactor Abec de 250 I (totalizando um volume útil de 150 I). Foram colhidos 120 I cada cinco dias e os 30 I restantes foram realimentados. A densidade de sementeira foi de entre 3χ105 e 5x105. O pH de ambos os tipos de reactores foi controlado entre 7,0 e 7,2. Foi utilizado C02 como ácido de controlo e bicarbonato de sódio como tampão. A

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 28 D.O. estabelecida a 30 porcento para os reactores Artisan e a 20 porcento para o reactor Abec.

Preparação do Citosol de THP.1

As células foram lisadas através de cavitação com azoto em TrisHCI 20 mM pH 7,4, MgCI21 mM, PMSF 1 mM, pepstatina A 1 μΜ e ieupeptina 1 μΜ. O material insolúvel foi sedimentado numa pelete a 10000 xg durante 10 min e o sobrenadante foi ainda clarificado através de uma centrifugação a 100000 xg durante 1 h a 4°C. O sobrenadante da centrifugação final foi recolhido e é daqui em diante referido como citosol de THP.1.

Medição da Actividade de Liaaçáo a CSAID

Foi incubado o mesmo (tipicamente 200 pg de proteína) com 3H-Composto I apropriadamente diluído (50 nM) à temperatura ambiente durante 60 min para permitir que a ligação atingisse o equilíbrio. O ligando livre foi separado do ligando ligado numa coluna de Sephadex G-10 de 1,5 ml em TrisHCI 20 mM pH 7,4. A fracção abrangendo o volume vazio foi recolhida e foi avaliada a radioactividade por contagem de cintilação líquida. As concentrações proteicas foram determinadas pelo ensaio do ácido bicinconínico (Pierce).

Cromatoarafia em Suoerose 12

Foram aplicados aproximadamente 100 a 250 ml de citosol de THP.1 a 14,5 cm h'1 numa coluna de Superose 12 de 5 I (Pharmacia; 11,5 x 50 cm) equilibrada com NaP04 10 mM pH 7,0 e NaCI 150 mM a 4°C. As fracções foram recolhidas (50 ml) e ensaiadas quanto à actividade de ligação a CSAID; foi reunido um único pico de actividade correspondente a um volume de eluição para uma proteína de Mr« 50000 (200 a 500 ml).

Cromatoarafia em Hidroxilapatite O material da coluna de Superose 12 foi aplicado a 30 cm h'1 numa coluna de Hidroxilapatite HA de 160 ml (Cal. Biochem; 5,0 χ 8,0 cm) equilibrada em NaP04 10 mM pH 7,0 à temperatura ambiente. A coluna foi eluída com um gradiente de NaP0410 a 200 mM ao longo de 2,5 volumes da coluna. As fracções (30 ml) foram recolhidas e ensaiadas quanto à actividade de ligação a CSAID. Um pico proteico

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 29 contendo aproximadamente 60% da actividade de ligação a CSAID aplicada na coluna foi reunido (50 a 250 ml).

Marcacão por Radiofotoafinidade de CSBP O seguinte protocolo foi utilizado para cerca de 30 ml da amostra mas pode ser adaptado para volumes maiores ou menores. A hidroxilapatite reunida foi concentrada para cerca de 30 ml utilizando uma célula de agitação Amicon (membrana YM30, N270 psi). O material insolúvel no concentrado foi removido por centrifugação (10000 xg durante 30 min num rotor SS34 a 4°C). O sobrenadante (450 mg de proteína) foi utilizado nas reacções de marcação, as quais foram efectuadas em placas de microtítulo de 6 poços (Nunc). Foram efectuadas seis reacções utilizando os seguintes reagentes e protocolo. Foram adicionados aprox. 60 mg de proteína (4 ml) a 0,25 ml de tampão (NaP04 10 mM pH 7,0, NaCI 150 mM) e 0,25 ml de 125l-Composto IV radioactivo (i.e. “quente”) 50 nM (concentração final de 2,5 nM, 250 μΟι) no escuro e deixou-se estar em gelo durante 10 a 15 min. A placa de microtítulo foi exposta a luz de >300 nm a uma distância de 5 a 10 cm durante 2 min enquanto no gelo. As reacções foram seguidas com Composto VI (sendo o composto VI a forma “fria” (i.e. não radioactiva) do Composto IV) tal como se segue. Foi preparada uma solução-mãe 1 mM de Composto VI adicionando 0,3 ml de Composto VI 10 mM a 2,7 ml de etanol a 50% em NaP0410 mM pH 7,0 e NaCI 150 mM. Foi adicionado Composto VI (0,5 ml 1 mM) a cada uma das reacções de marcação no escuro e deixou-se ficar durante 10 a 15 min em gelo. As reacções foram expostas a luz tal como para a marcação radioactiva. Os Compostos IV e VI que não reagiram podem ser removidos da proteína marcada através dos passos de focagem isoeléctrica preparativa ou electroforese; ou para amostras de menor volume, removidos por cromatografia de filtração em gel em Sephadex G-25 (1,6 χ 12 cm) em NaP04 20 mM pH 7,4 e NaC1150 mM.

Electroforese Analítica. Autorradioarafia e Imunotransferência

Foi efectuada electroforese em gel de dodecilssulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições redutoras essencialmente como descrito por Smith B.J., Meth. in Mol. Biol.. Vol I, págs. 44-57 (1984). As amostras foram corridas em placas de gel de 16 cm (a 4% para acumulação, a 10 ou 12% para separação) ou de 10 cm (a 12% pré-conformadas, Jule) de 0,75 mm de espessura utilizando os sistemas de electroforese Hoefer SE 600 ou Mighty Small, respectivamente. A proteína foi corada com azul de Coomassie R350 (Pharmacia) ou prata (Silver 30 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Stain Plus, BioRad). Os padrões de peso molecular de proteínas foram adquiridos em Amersham ou BioRad. Para a transferência, as proteínas foram transferidas para uma membrana de polivinilideno-difluoreto (Millipore) em glicina 192 mM/Tris 25 mM pH 8,3 e metanol a 20% (v/v) utilizando um aparelho de transferência electroforético Genie (Idea Scientific) a 15 V. A proteína marcada com 125l foi visualizada através de autorradiografia utilizando Hyperfilm-MP (Amersham) após exposições de um dia para o outro a -70°C. A membrana foi bloqueada com gelatina a 5% em TrisHCI 20 mM pH 7,5 e NaCI 500 mM antes da incubação vcom o anti-soro apropriado diluído 1000 a 5000 vezes em tampão. Os complexos de anticorpo foram detectados com imunoglobulina G anti-ratinho ou anti-coelho (Amersham) conjugada com peroxidase de rábano e visualizados por fosforescência de luminol em Hyperfilm-ECL (Amersham).

Focagem Isoeléctrica Preparativa

Foi efectuada focagem isoélectrica preparativa utilizando um fraccionador de proteínas por focagem de fluxo livre com reciclagem Rainin RF3 a 4°C de um dia para o outro, concentrada para cerca de 3 ml com uma célula de agitação Amicon (membrana YM30, N2 70 psi) e tomada em glicerol a 10% e anfolito a 1% (Pharmacia Ampholine ou Pharmalyte pH 4 a 6) para um volume final de cerca de 10 ml. Antes da amostra ser aplicada ao RF3, foi pré-focada uma solução de anfolito a 1%/glicerol a 10% durante 1 a 1,5 h (até a voltagem, a corrente, a potência e a temperatura estarem nos valores da linha de base). A amostra foi injectada na entrada 14 utilizando uma agulha e seringa. Deixou-se o sistema equilibrar tal como para a pré-focagem antes de recolher as fracções de 3 ml. A CSBP marcada foi identificada através de monitorização da radioactividade e as fracções apropriadas foram reunidas. SDS-PAGE Preparativa

Foi efectuada SDS-PAGE preparativa utilizando a célula Preparativa BioRad Modelo 491. As fracções reunidas da focagem isoeléctrica preparativa foram concentradas para 2 a 3 ml com uma célula de agitação Amicon (membrana YM30, N2 70 psi). Aproximadamente 2 a 2,5 ml do concentrado foram tomados em cerca de 3 ml em Tris 100 mM, pH 6,8, SDS a 2%, 2-mercaptoetanol 100 mM, glicerol a 10% e azul de bromofenilo a 0,01% antes da incubação a 100°C durante 3 a 5 min. A amostra foi aplicada ao gel (2 cm de gel de acumulação a 4%, 6 cm de gel de separação a 11%) e operada a 40 mA em glicina 192 mM/Tris 25 mM, pH 8,3 e

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 31 SDS a 0,1% à temperatura ambiente. As fracções (2,5 ml) foram recolhidas e ensaiadas quanto à radioactividade de forma a identificar onde eluiu do gel a CSBP marcada.

Resultados

Purificação Parcial de CSBP

Uma purificação parcial típica de CSBP a partir do citosol de THP.1 está resumida na Tabela III. Tal como indicado, a recuperação de actividade é de 20% e o nível de purificação é de 3 vezes. Isto foi característico da recuperação e purificação de CSBP durante a avaliação de várias resinas de cromatografia (permuta aniónica e catiónica, interacção hidrófoba com (NH4)2S04, Sepharose azul, Sepharose com heparina, etc.); o esquema de purificação tal como listado na Tabela III deu os melhores resultados de recuperação e os mais reprodutíveis. Uma vez que as tentativas para purificar ainda mais a CSBP enquanto se seguia a actividade de ligação a CSAID resultaram em pouca recuperação de actividade, não se purificou mais antes da marcação por fotoafinidade.

Tabela III

Purificação de CSBP a partir de citosol de THP.1

Amostra Actividade, dpma Proteína, mg Actividade Específica, dpm mg'1 Citosol de THP.1b 5,0 x 108 6800 7,4 x 104 Superose 12 1,6 x 108 1200 1,3 x 105 Hidroxilapatite 9,6 x 107 500 1,9 x 105 aactividade expressa como a radioactividade de 3H (desinl egração por minuto, dpm) recolhida na ligação a CSAID ensaiada tal como acima descrito e corrigida para a amostra total. bo citosol de THP.1 foi preparado a partir de material inicial equivalente a aproximadamente 1011 células.

Marcacão por Fotoafinidade de CSBP A CSBP foi covalentemente marcada com 125l-Composto IV derivado de CSAID aril-azida. A reacção foi muito específica tal como ilustrado na Figura 9, a qual mostra que foi marcada uma única proteína de Mr 43000 (as pistas marcadas 32 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ “Nenhum”). Durante a purificação parcial acima descrita a actividade de ligação a CSAID eluída como um pico único da cromatografia de filtração em gel de Superose 12 com um peso molecular que corresponde a uma proteína de Mr 45000 a 50000. Colectivamente, estas duas análises indicam que CSBP é uma proteína de cadeia simples, ou “monomérica” de Mr 43000. A Figura 9 ilustra também a especificidade da marcação. Nas pistas do meio do gel, a proteína foi pré-incubada com um CSAID não radioactivo (10 μΜ) antes da marcação por fotoafinidade com 125l-Composto IV (2,5 nM). O ponto até ao qual cada CSAID competiu com o marcador de fotoafinidade correlaciona-se bem com a sua potência num ensaio celular. Isto é, quanto mais potente é o composto na sua capacidade para suprimir a produção de IL-1 em monócitos humanos, mais eficazmente é evitada a marcação por fotoafinidade da CSBP. Assim, a CSBP é a proteína marcada com o Composto IV.

Purificação da CSBP Marcada

De forma a identificar a CSBP através da sua sequência de aminoácidos, a proteína marcada foi ainda purificada a partir da CSBP parcialmente purificada utilizada para a marcação por fotoafinidade. A estratégia para alcançar isto foi focagem isoeléctrica preparativa, SDS-PAGE preparativa e HPLC de fase inversa. Os resultados da focagem isoeléctrica preparativa são mostrados na Figura 10. O ponto isoeléctrico da proteína marcada correspondeu a um pH de cerca de 4,5. A análise de “Western” indicou que alguma, mas não toda a actina foi removida por este procedimento. Adicionalmente, quase 70% da proteína aplicada eluiu com a proteína marcada (recuperação de 50% da radioactividade). Isto foi também demonstrado por análise de SDS-PAGE e coloração com prata (dados não mostrados). Assim, para esta aplicação a focagem isoeléctrica preparativa não proporcionava uma purificação substancial da proteína desejada. A purificação mais substancial de CSBP marcada foi obtida por SDS-PAGE preparativa. O material reunido a partir da focagem isoeléctrica preparativa foi aplicado num gel utilizando a Célula Preparativa BioRad Modelo 491. Tal como ilustrado na Figura 11, através deste procedimento foi removido da fracção radioactiva que corresponde a uma proteína de cerca de 43 kDa (fracção 56) pelo menos 90% da proteína não radioactiva. Adicionalmente é também removido o marcador não incorporado. 33 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Caracterização da CSBP

Após SDS-PAGE preparativa, a CSBP marcada foi aplicada a HPLC de fase inversa, onde foi recolhido um pico proteico que co-eluiu com a radioactividade. A comparação da concentração proteica (determinada através da análise dos aminoácidos) com a radioactividade específica da amostra demonstrou que apenas 10% desta proteína estava marcada (assumindo uma Mr da proteína de 43000). A análise da sequência N-terminal identificou sequências de actina que correspondem a 30 a 40 aminoácidos a jusante do terminal amino esperado. A análise da sequência interna após fragmentação com tripsina ou CNBr gerou aproximadamente 90% de sequências de actina, mas cerca de 10% dos péptidos deram sequências únicas. Uma das sequências da digestão tríptica tinha forte homologia (85%), mas não era idêntica, a uma sequência C-terminal encontrada numa família de Ser/Thr proteína-quinases conhecidas como as quinases activadas por mitogénio (MAP) (Figura 12; Ver também: Ray, L.B. & Sturgill, T.W., Proc. Natl. Acad. Sei. (USAI. 85: 3753-3757 (1988)).

Foi sintetizado um péptido baseado na sequência com homologia com as quinases MAP e foi utilizado para inocular coelhos para a produção de anti-soros. A análise de “Western" e a autorradiografia de geles 2-D de citosol de THP.1 marcado demonstraram que 1) anticorpos contra actina ou quinases MAP reconheceram proteínas transferidas, mas não a proteína radioactivamente marcada; 2) o anticorpo preparado a partir do péptido tríptico reconheceu a proteína radioactivamente marcada. Assim, a CSBP parece ter homologia com, mas ser distinta das quinases MAP. Dado o papel das quinases na regulação da tradução (Pelech e Sanghera, Science 257: 1355-66 (1992)) e o efeito dos CSAID na tradução de IL-1 e TNF, não é inconsistente ser uma quinase o alvo molecular dos CSAID.

Isolamento e Caracterização do Gene da CSBP:

Este invento proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a CSBP humana. Foram obtidas duas sequências peptídicas amino-terminais a partir da fraeção proteica que co-migrou com a sonda de fotoafinidade radioactiva. Uma destas era derivada de uma digestão com tripsina da fraeção proteica radioactiva mas não era ela própria radioactiva e tinha a sequência: lie Thr Ala Ala Gin Ala Leu Ala His Ala Tyr Phe Ala Gin Tyr (SEQ ID NO. 1)

A segunda foi obtida a partir de um fragmento de brometo de cianogénio de 8 kDa associado a radioactividade e tinha a sequência: XXX (Gin) Leu Leu Asn Asn lie (Val/Phe) Lys (Phe) Gin Lys Leu Thr (SEQ ID NO. 2) onde ( ) representa uma determinação incerta e/ou representa uma incerteza entre dois aminoácidos. XXX é um aminoácido desconhecido. Uma pesquisa no Genbank indicou que a sequência peptídica I.D. NO. 1 era homóloga à família de quinases MAP das proteína-quinases, enquanto que a sequência peptídica I.D. NO: 2 era única. Com base nestas duas sequências, foram sintetizadas duas sondas oligonucleotídicas de ADN degeneradas utilizando o código genético para traduzir de forma inversa as sequências proteicas e tabelas de preferências de códões para células de mamífero (Grantham, R. et ai., Nucl. Acid Res. 9: (1981)). 1. GCYCAYGCTAYTTYGCYCARTA (SEQ ID NO. 3) e

2. AAYAAYATYKTBAARTTYCAAA (SEQ ID NO. 4) onde Y = C ou T

R = A ou G K = G ou T B = G, C ou T

Por este motivo os dois oligonucleótidos misturados consistem em 128 e 384 sequências únicas respectivamente. Uma biblioteca de ADNc feita a partir de monócitos humanos tratados com GM-CSF (Livi, G.P. et al., Mol. Cell Biol. 10: 2678-86 (1990) no vector comercial λΖΑΡ (Stratagene) a qual foi pesquisada com baixo rigor por hibridação com uma combinação de 50:50 das duas misturas oligonucleotídicas sintéticas marcadas com γ-32Ρ-ΑΤΡ. A marcação dos oligonucleótidos seguiu métodos publicados (Current Protocols in Molecular Biology), marcando tipicamente 3 μg de oligonucleótido misturado com γ-32Ρ-ΑΤΡ 250 pCi e utilizando tudo isto num volume de hibridação de 250 μΙ. As condições recomendadas pelo fabricante para o plaqueamento e levantamento do fago foram seguidas (ver protocolo λΖΑΡ de Stratagene, Stratagene, La Jolla, Ca.) utilizando a estirpe hospedeira BB4. Um passo adicional foi a pré-lavagem dos levantamentos do filtro a 65°C em 2x SSPE/SDS a 0,1% duas vezes durante 30 min antes da pré-hibridação para remover restos bacterianos.

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Subsequentemente, a pré-hibridação e a hibridação com as sondas oligonucleotídicas marcadas foram efectuadas a 37°C durante 24-72 h em 6x SSPE, 5x solução de Denhardt, SDS a 0,1% e 100 μς/ιηΙ de ARNt de levedura extraído com fenol/clorofórmio. (20x SSPE é NaCI 3 M, NaH2P04 0,2 M, EDTA 0,02 M pH 7,4. 50x solução de Denhardt é 10 g de polivinilpirrolidona (PM 40000), 10 g de albumina de soro bovino e 10 g de Ficoll 400 por litro de H20).

Após a hibridação os filtros foram lavados duas vezes sob cada uma das seguintes condições. 1. 6x SSPE, SDS a 0,1%, temp. ambiente, 10-15 min. 2. 6x SSPE, SDS a 0,1%, 37°C, 10-15 min. 3. Solução de cloreto de tetrametilamónio 3 M (500 g Me4NCI, 1,38 litros de H20, 73 ml de Tris 1 M pH 8,0, 5,8 ml de EDTA 0,5 M, 7,3 ml; SDS a 20% filtrado através de um filtro de 0,45 pm). 37°C, 30 min (ver: Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 82: 1585-1588 (1985) para uma descrição desta técnica).

Os filtros foram expostos a uma película Kodak durante 3-5 dias na presença de écrans intensificadores e os positivos sobrepostos em filtros duplicado foram apanhados e sujeitos a ciclos através do mesmo procedimento até serem obtidas placas puras. O fago foi excisado com o fago ajudante M13 R408 no hospedeiro E. coli recA* azul XL-1 de acordo com os procedimentos do fabricante (Stratagene).

Após dois ciclos subsequentes de plaqueamento e hibridação de placas positivamente hibridadas utilizando apenas a mistura oligonucleotídica #1, foi obtido um único fago homogéneo que hibridou numa mancha de “Southern” com o oligonucleótido #1 (SEQ ID NO: 3) mas não com o oligonucleótido #2 (SEQ ID NO: 4). A sequenciação da inserção de ADN neste fago revelou uma estrutura de leitura aberta numa extremidade que codificava parte da sequência peptídica única NO: 2, acima I.D NO: 2. A sequência de aminoácidos assim codificada era:

Asn lie Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr (SEQ ID NO: 5). O resto da estrutura de leitura aberta (Figura 13) SEQ ID NO: 6 e 7 era homólogo a várias proteína-quinases incluindo as famílias de quinases cdc2 e MAP. Com base nesta homologia, prevê-se que faltem aproximadamente 130 aminoácidos no terminal amino os quais são obtidos através de um segundo ciclo

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 36 de pesquisa da biblioteca com a região amino-terminal do clone de ADNc obtido. A outra extremidade do ADNc contém a sequência poli-A que corresponde ao terminal 3’ do ARNm a partir do qual esta foi obtida (Figura 14, SEQ ID NO: 8).

De acordo com isto, com base no ADNc inicial (Figura 13), foram concebidos oligonucleótidos (5’-CCTCGGAGAATTTGGTAGATAAGG-3’ (SEQ ID NO: 9) e 5'-AACATTGTGAAATGTCAGAAGCTTACAGATGACCAT-3’ (SEQ ID NO: 10)) a partir da extremidade 5’ da cadeia com sentido e utilizados para pesquisar ADNc que codifiquem o terminal amino de CSBP. Os oligonucleótidos foram marcados nas suas extremidades 5’ com polinucleótido-quinase e γ32Ρ-ΑΤΡ. 106 placas de uma biblioteca de monócitos humanos estimulados com GM-CSF construída em λΖΑΡ foram pesquisadas em filtros duplicado de nitrocelulose os quais tinham sido pré-lavados antes da hibridação em 2x SSPE, SDS a 0,1% a 50°C. Após o bloqueio durante 48 h com formamida a 50%, 6x SSPE, 5x solução de Denhardt e 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado e desnaturado, os filtros foram hibridados no mesmo tampão com os oligonucleótidos marcados de cima durante 24 horas a 42°C. Os filtros foram então lavados duas vezes com 2x SSPE, SDS a 0,1% à temperatura ambiente, seguindo-se duas lavagens com 1x SSPE, SDS a 0,1 % a 42°C e duas lavagens com 0,5x SSPE, SDS a 0,1% a 42°C antes da detecção das placas hibridadas por autorradiografia. As placas positivas que * apareceram nos filtros duplicado foram recolhidas e novamente plaqueadas e o procedimento foi repetido duas vezes até poderem ser isoladas placas únicas e o ADN fagemídico ser libertado de acordo com o protocolo do fabricante (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA). Os ADNc foram sequenciados num sequenciador de ADN automático de Applied Biosystems (ABI 373A) utilizando iniciadores oligonucleotídicos universais e específicos e sequenciação cíclica com polimerase Taq e as sequências foram fundidas e examinadas utilizando o programa informático Lasergene num Macintosh llci. Ambas as cadeias foram completamente sequenciadas pelo menos uma vez em cada clone de ADNc.

Descrição dos ADNc

Um resumo dos ADNc isolados é ilustrado esquematicamente na Figura 15. Existem quatro ADNc diferentes os quais foram completamente sequenciados e são idênticos em regiões de sobreposição, com uma excepção que é descrita abaixo. BP01/02 é o primeiro ADNc acima isolado, cuja sequência parcial é dada nas Figuras 13 e 14. O ADNc mais comprido tem 3,8 kb de comprimento (N5) 37 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 11 e SEQ ID ΝΟ: 12 e contém 370 nucleótidos de sequência 5’ não traduzida, uma região de codificação de 1,1 kb e 2,4 kb de sequência 3’ não traduzida. O fim da extremidade 3’ é terminado por uma porção poli-A característica de ARNm e é antecedido pela sequência de consenso esperada para poliadenilação. O ADNc N7 tem uma região 3’ não traduzida de apenas 1,4 kb que termina num local e extensão poli-A sugerindo um local alternativo de poliadenilação. Numa transferência de “Northern” uma sonda derivada da região de codificação hibrida com um ARNm de 4,2 kb ca. sugerindo que o ADNc isolado mais longo está próximo do comprimento total. A codificação traduz-se numa proteína de 360 aminoácidos com um peso molecular calculado de 41,5 kDa, coincidindo com o tamanho da proteína identificada através de ligação cruzada de fotoafinidade com o Composto IV marcado com 125l (Figura 16). O ponto isoeléctrico previsto (ca. 5,6) também está próximo do observado (Ca. 5,0). O exame da sequência indica que esta contém tanto a sequência peptídica tríptica ITAAQ... (em caixa) (SEQ ID NO: 1) como a sequência de brometo de cianogénio XXXLNNIVK...(em caixa) (SEQ ID NO: 2) obtida por sequenciação da proteína de ligação a CSAID em células THP.1. Estas sequências são antecedidas pelos locais de clivagem apropriados (setas). O tamanho previsto do fragmento de brometo de cianogénio (8 kDa) coincide com o tamanho do fragmento que permanece associado com o marcador de radiofotoafinidade marcado com 125l [Composto IV] após tratamento com brometo de cianogénio da proteína de ligação a CSAID. O ADNc N13 (Figura 15) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 é idêntico aos outros três ADNc com a excepção de uma região de 75 nucleótidos que começa na posição 1054 do ADNc N5. Esta diferença resulta numa proteína de tamanho idêntico com os aminoácidos 230-255 alterados (Figura 17). As duas sequências diferentes são 43% idênticas ao nível nucleotídico e 44% idênticas ao nível dos aminoácidos. Sem querer estar presos a qualquer teoria em particular, é provável que as duas variantes resultem de união interna dos exões alternativa, embora não possa ser excluída a variação alélica. Para facilidade de descrição, duas proteínas são aqui referidas como CSBP1 (correspondendo ao ADNc N5) e CSBP2 (correspondendo ao ADNc N13). A comparação da sequência da CSBP com proteínas nas bases de dados GenBank/EMBL ou Swissprot indicou íntima homologia com uma família de proteínas conhecidas como MAP (Proteína Açtivada por Mitogénio) ou quinases 38 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ erk (reguladas extracelularmente) (Boulton, et ai, “Erks; A family of Protein Serine-Threonine Kinases that are Activated and Tyrosine Phosphorylated in Response to Insuline and NGF”, Cell. 65: 663-675 (1993). Esta família de proteína-quinases é consen/ada das leveduras até ao homem tal como indicado na árvore filogenética na Figura 18 sendo o homólogo publicado mais próximo o gene HOG1 de levedura (Brewster et ai, Science 259: 1760-63 (1993)). Um alinhamento das CSBP com membros seleccionados desta família (Figura 19) mostra uma conservação de todos os 11 motivos de proteína-quínase (de I até XI), incluindo resíduos idênticos em todas as proteína-quinases (a cheio) (Hanks et ai, Science. 241: 42-52 (1988). Dois motivos em caixas nas regiões VI e VIII indicam que as quinases fosforilam serinas e treoninas (Hanks et ai, 1988). Por este motivo as CSBP são proteína-quinases.

Uma treonina e uma tirosina numa sequência TxY (asteriscos) próxima do domínio VIII são conhecidas como sendo locais de fosforilação reguladores para Erk 1 e Erk 2 (Payne et ai, EMBO J.. 10: 885-892 (1991)). Estes dois resíduos são fosforilados por MEK (quinases MAPK ou ERK (“MAPK ou ERK Kinase”) em resposta a vários sinais extracelulares, resultando numa activação da actividade de serina/treonina-quinase das quinases MAP (Kosako, et ai, EMBO J„ 12: 787-794 (1993)). A conservação destes aminoácidos nas CSBP sugere que elas também são reguladas por uma MEK em resposta a estímulos extracelulares tais como LPS. Estas verificações sugerem que as CSBP se encontram numa cascata de acontecimentos de fosforilação proteica os quais comunicam estímulos à superfície da célula a acontecimentos tais como regulação da tradução, dentro da célula. Muito do comportamento da CSBP em células estimuladas adequadamente pode ser previsto com base na analogia com as propriedades conhecidas e comportamento das quinases MAP (Marshal, et ai, Curr. Qpin. Genetics & Develop.. 4: 82-89 (1994).

Uma transferência de “Northern” de múltiplos tecidos com uma sonda de ADNc para a região de codificação sugere a expressão de ARNm de CSBP na maioria dos tecidos. Uma transferência de “Southern” com condições muito rigorosas (SSPE a 0,1%, SDS a 0,1%) sugeriu um único gene; no entanto lavagens com condições menos rigorosas podem revelar quinases intimamente relacionadas. Experiências de mapeamento génico utilizando um painel de linhas celulares híbridas de humano/ratinho comercialmente disponíveis indicaram que o gene para CSBP reside no cromossoma 6 humano.

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Expressão em Ε. coli

Para confirmar que as proteínas codificadas pelos ADNc isolados se podem ligar a CSAID, os ADNc foram expressos em E. coli e leveduras. Em E. coli as CSBP foram expressas como proteínas de fusão com β-galactosidase e/ou um epitopo marcador FLAG clivável por uma enteroquinase (Figura 20) (FLAG é um epitopo comercial para o qual estão disponíveis reagentes de IBI-Kodak). No último caso isto foi alcançado pela concepção de um ligante oligonucleotídico sintético com um local de iniciação, uma sequência de reconhecimento do anticorpo e um local de clivagem por uma enteroquinase. As proteínas foram expressas sob o controlo dos promotores pLac (p. ex., vector Bluescript KS de Stratagene, LaJolla, CA) ou λρΙ_ (Shatzman, et ai, N.Y. Acad. Sei.. 478: 233-248 (1986)) e mostrou-se que a sonda de radiofotoafinidade [Composto IV] se ligava especificamente de forma cruzada a proteínas dos tamanhos esperados nos lisados celulares. Os lisados contêm também actividade de ligação específica ao Composto IA. Pode-se concluir que ambas as CSBP1 e CSBP2 são os alvos moleculares dos CSAID dentro das células. A proteína expressa em E. coli foi purificada por passagem ao longo de uma matriz de afinidade contendo um anticorpo monoclonal para o epitopo FLAG de acordo com as instruções do fabricante.

Expressão em Leveduras

Um sistema alternativo para expressão de CSBP é Saccharomyces cerevisiae, não apenas para purificação mas também para avaliar a função. O gene HOG1 de levedura (resposta de Glicerol a Elevada Osmolaridade), Brewster et al., supra) codifica uma quinase MAP que é um homólogo íntimo de CSBP. As estirpes mutantes hoa1 D mostram um crescimento reduzido em meio com elevada osmolaridade e foi testada a complementação funcional deste fenótipo com CSBP. A CSBP2 foi modificada para expressão em leveduras tal como se segue. Foi introduzido um local Xho\ no códão de iniciação de CSBP2 através de reacção em cadeia com polimerase (Mullis e Faloona, Method in Enzvmol. 155: 335-50 (1987) utilizando os seguintes iniciadores oligonucleotídicos: 5’-CGCCCTCGAGATGTCTCAGGAGAGGCCCACG-3\ SEQ ID NO: 15 e 3’-CTAAGACCTAAAACCTGACCG-5’, SEQ ID NO: 16. O fragmento de PCR de 525 pb foi digerido com Xho\ e BglW e subclonado nos mesmos locais em 40 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ p138NBU, uma modificação de ρ138ΝΒ (McHale et ai, Mol, Pharm. 39: 109-113 (1991) no qual o marcador seleccionável TRP1 foi substituído por URA3. O plasmídeo resultante foi então digerido com BglU e Sa/I e ligado com um fragmento Bgl\\-Xho\\ contendo a extremidade 3’ de CSBP2. A construção final contém sequências parciais de 2 micra para manutenção num elevado número de cópias, com a expressão do ARNm de CSBP2 conduzida pelo promotor CUP1 indutível por cobre e terminada pelo terminador da transcrição CYC1 de leveduras. Verificou-se que o plasmídeo p138NBU-CSBPN13B codificava a proteína CSBP2 de tipo selvagem. Foram isoladas transformações das estirpes progenitoras (YPH499 MATa ura3-52 /ys2-801am ade2-101 frp1-D63 /ws3D200 /eu2-D1) e ftoglD (JBY10 [YPH499 + hog^.:ΎBP^]) (Brewster et ai, J. Bacteriol. 153: 163-168 (1983) Ura+ prototróficas e foram cultivadas até A^q de 1,0 em meio sintético completo sem uracilo (Hicks et ai, Genetics 83: 245 (1976). A expressão de CSBP2 foi induzida pela adição de CuS04 150 mM. As células foram colhidas às 5 h, ressuspensas em Tris-HCI 20 mM pH 7, MgCI21 mM, fenilmetilsulfonilfluoreto 1 mM e rebentadas por agitação em vórtex na presença de contas de vidro de 0,45 mm. Os extractos foram centrifugados a 1500 xg durante 5 min a 4°C.

Mostrou-se que a sonda de radiofotoafinidade (Composto IV) se ligava especificamente de forma cruzada a uma proteína do tamanho esperado nos lisados de ambos p138NBU-CSBPN13A e p138NBU-CSBP13B, a qual não estava presente nas estirpes de tipo selvagem ou hog^Ό contendo o plasmídeo de controlo (p138NBU) e que cresceram sob condições semelhantes. Os lisados continham também actividade de ligação específica para 3H-Composto la, portanto tanto CSBP1 (SEQ ID NO: 12) como CSBP2 (SEQ ID NO: 14) se ligam a CSAID.

As proteínas deste invento são feitas de preferência através de técnicas de engenharia genética recombinante. Os ácidos nucleicos isolados, particularmente os ADN, podem ser introduzidos em vectores de expressão ligando operativamente o ADN às regiões de controlo da expressão necessárias (p. ex., regiões reguladoras) requeridas para a expressão génica. Os vectores podem ser introduzidos nas células hospedeiras apropriadas tais como células procarióticas (p. ex., bacterianas) ou eucarióticas (p. ex., de leveduras ou de mamífero) através de métodos bem conhecidos na arte (Ausubel et ai, supra). As sequências de codificação para as proteínas desejadas após terem sido preparadas ou isoladas, podem ser clonadas em qualquer vector ou replicão adequado. São conhecidos dos peritos na arte vários vectores de clonagem e a selecção de um vector de clonagem apropriado é uma questão de preferência. Exemplos de vectores de ADN 41 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ recombinante para clonagem e de células hospedeiras que estes podem transformar incluem o bacteriófago λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYCI77 (E. coli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGV1106 (bactérias gram-negativas), pLAFRI (bactérias gram-negativas), pME290 (bactérias gram-negativas que não E. coli), pHV14 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), plJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Ylp5 (Saccharomyces), um sistema de baculovírus/células de insecto, YCp19 (Saccharomyces). Ver, genericamente, “DNA Cloning”: Vols. I & II, Glover et ai, eds. IRL Press Oxford (1985) (1987) e; T. Maniatis et ai, “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). O gene pode ser colocado sob o controlo de um promotor, local de ligação a ribossomas (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador (colectivamente aqui referidos como elementos de “controlo”), de forma a que a sequência de ADN que codifica a proteína desejada seja transcrita para ARN na célula hospedeira transformada por um vector contendo esta construção de expressão. A sequência de codificação pode ou não conter um péptido de sinal ou uma sequência de comando. Os antigénios de subunidades do presente invento podem ser expressos utilizando, por exemplo, o promotor tac de E. coli ou o promotor e a sequência de sinal do gene da proteína A (spa). As sequências de comando podem ser removidas pelo hospedeiro bacteriano no processamento pós-tradução. Ver, p. ex., Patente U.S. Nos. 4431739; 4425437; 4338397.

Adicionalmente às sequências de controlo, pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão das sequências proteicas relativamente ao crescimento da célula hospedeira. As sequências reguladoras são conhecidas dos peritos na arte e os exemplos incluem as que provocam o início ou a terminação da expressão de um gene em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Outros tipos de elementos reguladores podem também estar presentes no vector, por exemplo, sequências estimuladoras.

Um vector de expressão é construído de forma a que uma determinada sequência de codificação esteja localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, sendo o posicionamento e a orientação da sequência de codificação em relação às sequências de controlo tal que a sequência de codificação seja transcrita sob o “controlo” das sequências de controlo (i.e., a ARN-polimerase que se liga à molécula de ADN nas sequências de controlo transcreve a sequência de codificação). Para se alcançar este fim pode ser 42 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ desejável a modificação das sequências que codificam a proteína específica de interesse. Por exemplo, nalguns casos pode ser necessário modificar a sequência de forma a que esta possa ser ligada a sequências de controlo com a orientação apropriada; i.e., para manter a estrutura de leitura. As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência de codificação antes da inserção num vector, tal como os vectores de clonagem acima descritos. Alternativamente, a sequência de codificação pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contenha as sequências de controlo e um local de restrição apropriado.

Nalguns casos, pode ser desejável adicionar sequências que causem a secreção do polipéptido a partir do organismo hospedeiro, com subsequente clivagem do sinal secretor. Alternativamente, podem ser criadas fusões de genes em que o gene que codifica a proteína de ligação de interesse é fundido com um gene que codifica um produto com outras propriedades desejáveis. Por exemplo, um parceiro de fusão podia proporcionar uma actividade testável conhecida (p. ex., enzimática) que pudesse ser utilizada como meio alternativo de selecção da proteína de ligação. O parceiro de fusão podia ser um elemento estrutural, tal como um elemento da superfície celular de tal forma que a proteína de ligação (um componente normalmente citosólico) pudesse ser apresentada na superfície celular na forma de uma proteína de fusão. Pode também ser desejável produzir mutantes ou análogos da proteína de interesse. Os mutantes ou análogos podem ser preparados através da deteção de uma porção da sequência que codifica a proteína, através da inserção de uma sequência e/ou através da substituição de um ou mais nucleótidos na sequência. As técnicas para modificar sequências nucleotídicas, tais como mutagénese dirigida ao locus e a formação de proteínas de fusão, são bem conhecidas dos peritos na arte. Ver, p. ex., T. Maniatis et ai, supra; DNA Clonina. Vols. I e II, supra; Nucleic Acid Hvbridization. supra. São conhecidos na arte vários vectores de expressão procarióticos. Ver, p. ex., Patente U.S. Nos. 4578355; 4440859; 4436815; 4431740; 4431739; 4428941; 4425437; 4418149; 4411994; 4366246; 4342832; ver também Pedidos de Patente U.K. GB 2121054; GB 2008123; GB 2007675; e Pedido de Patente Europeia 103395. Os vectores de expressão de leveduras também são conhecidos na arte. Ver, p. ex., Patente U.S. Nos. 4446235; 4443539; 4430428; ver também Pedidos de Patente Europeia 103409; 100561; 96491. pSV2neo (tal como descrito em J. Mol. AddI. Genet. 1: 327-341) que utiliza o promotor tardio de SV40 para conduzir a expressão em células de mamífero ou pCDNAIneo, um vector derivado de

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 43 pCDNAI (Mol. Cell Biol. 7:4125-29) que utiliza o promotor de CMV para conduzir a expressão. Ambos estes dois últimos vectores podem ser empregues para expressão transiente ou estável (p. ex. utilizando resistência a G418 ou higromicina) em células de mamífero. Os sistemas de expressão em células de insecto, p. ex., Drosophila, são também úteis, ver por exemplo, pedidos PCT US 89/05155 e US 91/06838 bem como pedido EP 88/304093.3 e sistemas de expressão de Baculovírus.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionado, as proteínas do presente invento são produzidas fazendo o crescimento de células hospedeiras transformadas com um vector de expressão acima descrito sob condições nas quais a proteína de interesse é expressa. A proteína é então isolada das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão segrega a proteína para os meios de crescimento, a proteína pode ser purificada directamente a partir dos meios. Se a proteína não for segregada, é isolada a partir dos lisados celulares ou recuperada a partir da fracção membranar celular. A selecção das condições de crescimento apropriadas e dos métodos de recuperação estão dentro da perícia na arte.

Um método alternativo para identificar proteínas do presente invento é através da construção de bibliotecas génicas, utilizando os clones resultantes para transformar E. coli e reunindo e pesquisando colónias individuais utilizando soro policional ou anticorpos monoclonais para a proteína de ligação desejada.

As proteínas do presente invento podem também ser produzidas por síntese química tal como síntese peptídica em fase sólida, utilizando sequências de aminoácidos conhecidas ou sequências de aminoácidos derivadas da sequência de ADN dos genes de interesse. Tais métodos são conhecidos dos peritos na arte. A síntese química de péptidos não é particularmente preferida.

As proteínas de ligação do presente invento ou fragmentos destas compreendendo pelo menos um epitopo podem ser utilizadas para produzir anticorpos, tanto policlonais como monoclonais. Se forem desejados anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado (p. ex., ratinho, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com uma proteína de ligação do presente invento, ou um fragmento desta, ou com uma proteína de ligação mutada. O soro do animal imunizado é recolhido e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Quando é utilizado soro contendo anticorpos policlonais, os anticorpos policlonais podem ser

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 44 purificados por cromatografia de imunoafinidade ou outros procedimentos conhecidos.

Anticorpos monoclonais para as proteínas do presente invento, e para fragmentos destas, podem também ser prontamente produzidos por um perito na arte. A metodologia geral para preparar anticorpos monoclonais utilizando tecnologia de hibridomas é bem conhecida. Podem ser criadas linhas celulares imortais produtoras de anticorpos através de fusão celular e também através de outras técnicas tais como transformação directa de linfócitos B com ADN oncogénico ou transfecção com vírus de Epstein-Barr. Ver p. ex., M. Schreier et al., “Hybridoma Techniques” (1980); Hammerling et al., “Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas” (1981); Kennett et al., “Monoclonal Antibodies” (1980); ver também Patente U.S. Nos. 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4452570; 4466917; 4472500; 4491632 e 4493890. Podem ser pesquisados painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra a proteína de interesse, ou fragmento desta, quanto a várias propriedades; i.e., quanto ao isotipo, a epitopos, afinidade, etc. Alternativamente, os genes que codificam os anticorpos monoclonais de interesse podem ser isolados a partir dos hibridomas por técnicas de PCR conhecidas na arte e clonados e expressos nos vectores apropriados. Os anticorpos monoclonais são úteis na purificação, utilizando técnicas de imunoafinidade, das proteínas individuais contra as quais são dirigidos. Os anticorpos deste invento, quer sejam policlonais ou monoclonais têm uma utilidade adicional na medida em que podem ser empregues como reagentes em imunoensaios, RIA, ELISA e semelhantes. Adicionalmente podem ser utilizados para isolar a CSBP de células humanas e determinar o efeito de diferentes estímulos e compostos no estado de fosforilação e actividade de proteína-quinase da CSBP endógena. Os anticorpos poderiam ser utilizados para estabelecer um ensaio baseado em cultura de tecidos para a identificação ou modificação de novos compostos que bloqueiem a fosforilação ou a actividade de quinase da CSBP. Um exemplo de tal ensaio seria incubar monócitos humanos ou linhas celulares monocíticas com um composto ou mistura de compostos antes do tratamento com LPS durante um período de tempo definido, seguido de imunoprecipitação da CSBP com anticorpo e avaliação do seu estado de fosforilação através de imunotransferência ou cromatografia ou medição da sua actividade de quinase com substrato proteico ou peptídico apropriado.

Este invento proporciona um método para determinar se um ligando que anteriormente se desconhecia que se ligasse a uma CSBP se pode ligar a uma tal 45 84 8Q7 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ proteína. Ο método compreende pôr em contacto o ligando a ser identificado com a fracção citosólica de células THP.1 e a medição da sua capacidade para competir com um CSAID radioactivo conhecido, tal como acima descrito, num ensaio de ligação a CSAID. Os métodos alternativos incluem pôr em contacto o ligando a ser identificado com uma célula completa que expresse a sequência de codificação de uma CSBP sob as condições suficientes para a ligação de ligandos previamente identificados como capazes de se ligarem a um tal receptor. Noutras concretizações podem ser utilizadas fracções membranares celulares compreendendo as fusões de CSBP ou CSBP isolada livre ou imobilizada em suportes sólidos para medir a ligação do ligando a ser testado. Quando são utilizadas células recombinantes com o objectivo de expressar a CSBP é preferível utilizar células com pouca ou nenhuma actividade de CSBP endógena de forma a que se houver alguma ligação seja devida à presença da proteína de interesse expressa. Tal como anteriormente mencionado, pode ser construído um indicador de ligação ao receptor especificamente concebido. Por exemplo pode ser feita uma proteína de fusão através da fusão da CSBP deste invento com um domínio proteico que seja sensível à ligação CSBP/ligando. Tal domínio aqui referido como domínio indicador é capaz, por si próprio ou em associação com moléculas acessórias, de criar um sinal analiticamente detectável que seja indicativo de ligação do ligando ao receptor. Uma variação desta abordagem consiste em expressar CSBP como uma proteína de fusão (p. ex., fundida com o péptido FLAG) em THP.1 ou noutras células de mamífero e utilizar o péptido de fusão como meio de isolamento da CSBP recombinante após estimulação adequada e pré-tratamento das células THP.1. Tal expressão pode ser alcançada com vários vectores de expressão de mamífero que utilizam promotores virais, p. ex. CMV, RSV e sequências de poliadenilação, et. SV40, hormona do crescimento bovina e um marcador seleccionável tal como G418 ou higromicina para selecção dos transfectantes estáveis.

Podem ser empregues preparações citosólicas de células transfectadas ou transformadas que expressem tais fusões. Todas as técnicas de cima que são úteis para identificação do ligando são também úteis na pesquisa de fármacos e protocolos de desenvolvimento de fármacos.

Alternativamente, a proteína recombinante purificada pode ser utilizada para substituir lisados celulares brutos de THP.1 num ensaio de ligação competitiva com o Composto la. Este ensaio é útil para pesquisar novos compostos que se liguem a CSBP, ou como via para avaliar alterações nos compostos que se sabe ligarem-se.

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 46 A disponibilidade da proteína purificada permite configurações do ensaio alternativas às descritas anteriormente para o material em bruto. Por exemplo, se a proteína estiver covalentemente ligada a um marcador, tal como um local de ligação a proteínas para configuração num ensaio colorimétrico, p. ex. anticorpo conjugado, ou a uma enzima para detecção directa da actividade enzimática, p. ex. peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina, a ligação a novos compostos apresentados numa matriz sólida podia ser detectada. Tais compostos podem incluir moléculas orgânicas de baixo peso molecular, péptidos, peptóides e proteínas. No último caso, a proteína pode ser utilizada como um meio~para isolar outras proteínas na sua cascata de sinalização, por exemplo, as que estão na via para activação da tradução de citóquinas em monócitos activados. A proteína pode também ser utilizada para isolar moléculas reguladoras de ocorrência natural em células de mamífero que actuem através de um mecanismo de ligação a CSAID. Finalmente, a proteína pode ser utilizada para identificar péptidos alvo que se apresentem à superfície de fagos. O conhecimento de que as CSBP codificam proteína-quinases sugere que as formas recombinantes podem ser utilizadas para estabelecer uma actividade de proteína-quinase. Tipicamente isto envolveria a incubação directa da CSBP com um substrato proteico ou peptídico na presença de γ32-Ρ-ΑΤΡ, seguido pela medição da radioactividade incorporada no substrato por separação e contagem. Os métodos de separação incluem imunoprecipitação, conjugação do substrato com uma conta que permita a separação por centrifugação ou determinação da incorporação através do ensaio de proximidade de cintilação, SDS-PAGE seguida de autorradiografia ou análise por biosensor. Embora os substratos específicos ainda não sejam conhecidos, os candidatos incluem a própria CSBP (autofosforilação) e péptidos relacionados com substratos conhecidos de quinases MAP. Outras substâncias podem ser identificadas incubando CSBP com péptidos ao acaso conjugados com suportes sólidos ou que são apresentados por fagos (ver acima) ou incubando CSBP com lisados de células de mamífero (p. ex. lisados de células THP.1) e γ32-Ρ-ΑΤΡ, seguido de separação das proteínas alvo marcadas e sequenciação. A actividade de quinase também pode ser detectada através da utilização de anticorpos anti-fosfotirosina. A actividade de proteína-quinase da CSBP pode necessitar de incubação com uma MEK específica. Isto pode ser alcançado pré-incubando a CSBP com lisados de células eucarióticas estimuladas (p. ex., células THP.1 tratadas com LPS) e ATP. Alternativamente, pode ser possível isolar uma forma mais activa de CSBP de estirpes de deleção HOG1 de leveduras que expressem a CSBP humana e que crescem em condições de

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ elevada osmolaridade.

Estes ensaios permitem a identificação e a modificação de compostos os quais inibem a actividade de quinase da CSBP in vitro. Seria de esperar que tais compostos bloqueassem a síntese de citóquinas de um modo comparável aos compostos aqui descritos. Eles poderiam também conduzir à identificação de novos substratos que por si pudessem ser alvos viáveis para a identificação de novos compostos que bloqueiem a produção de citóquinas.

Espera-se que as CSBP, tal como outras quinases MAP, sejam activadas por uma MEK, a proteína recombinante permitindo assim o estabelecimento de um segundo ensaio que meça a capacidade da CSBP para ser fosforilada por MEK putativas. Neste caso são incubadas fracções de lisados de células estimuladas (p. ex., células THP.1 estimuladas com LPS) com CSBP na presença de γ32-Ρ-ΑΤΡ e a incorporação do marcador 32P na CSBP é medida por separação e contagem. A separação pode ser alcançada de várias formas: uma forma é utilizar uma CSBP fundida com um péptido ou proteína e separar através de cromatografia de afinidade ou imunoprecipitação com o anticorpo dirigido ao péptido ou proteína. Alternativamente, a CSBP pode ser directamente conjugada com contas ou ligada através de um péptido ou proteína de fusão (p. ex., (péptido) FLAG, glutationa-S-transferase) e separada por centrifugação após incubação com lisados celulares. Também a fosforilação da tirosina de CSBP podia ser detectada por imunoprecipitação ou imunotransferência com anticorpos anti-fosfotirosina comercialmente disponíveis.

Estes ensaios podem ser utilizados para identificar compostos que bloqueiem a activação da actividade de proteína-quinase de CSBP e para melhorar a potência de compostos já identificados. Seria de esperar que estes compostos tivessem utilidade devido ao seu bloqueio da síntese de citóquinas. Os ensaios são também úteis para identificar novas MEK que por si se pudessem tornar alvos para novos compostos que bloqueiam a síntese de citóquinas. A capacidade da CSBP humana para recuperar uma estirpe de deleção HOG1 após crescimento em condições de elevada osmolaridade permite a pesquisa directa de compostos que bloqueiem a actividade de CSBP in vivo. Por exemplo, os compostos podiam ser pesquisados quanto à sua capacidade para bloquear o crescimento de uma estirpe de levedura CSBP+/HOG1- em elevada osmolaridade mas que não tenham efeito sobre o crescimento da mesma estirpe

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 48 em osmolaridade padrão ou numa CSBP-/HOG1+ em elevada osmolaridade. A sensibilidade do ensaio com base em leveduras pode ser aumentada introduzindo mutações nos hospedeiros que afectem a membrana celular e a permeabilidade (Gaber, et ai. Mol. Cell Biol. 9: 3447-3456 (1989).

Numa concretização de pesquisa de compostos deste invento, a CSBP na forma isolada, imobilizada ou ligada a células é posta em contacto com várias moléculas candidatas e dessas candidatas são seleccionadas as que se ligam e interagem com a proteína. A ligação ou interacção pode ser medida directamente utilizando o candidato de interesse marcado radioactivamente ou indirectamente medindo um efeito resultante da interacção ou ligação do composto candidato. Alternativamente, os compostos candidatos podem ser sujeitos a ensaios de pesquisa de competição, nos quais um ligando conhecido, de preferência marcado com um reagente analiticamente detectável, mais particularmente radioactividade, é introduzido com os compostos a serem testados e é medida a capacidade dos compostos para inibir ou intensificar a ligação do ligando marcado. Os compostos são pesquisados quanto à sua aumentada selectividade e afinidade para a CSBP.

Para ilustrar este aspecto do invento foi efectuada uma pesquisa de um produto natural. O ensaio padrão no qual o ligando ligado é separado do livre por cromatografia de exclusão utilizando mini-colunas foi utilizado para iniciar um esforço de pesquisa. Aproximadamente 625 extractos de material marinho, 202 extractos de material microbiano e 233 extractos de material vegetal foram testados quanto à inibição da ligação de 3H-Composto I ao citosol de THP.1. Confirmaram-se dois extractos como antagonistas desta ligação, com Cl50s de cerca de 200 e 80 μg/ml, respectivamente. Esta baixa taxa de sucesso (0,2%) juntamente com nenhuma observação de inibição por nenhum dos grupos seleccionados de “extractos de pesquisa” indica que o ensaio é suficientemente selectivo e robusto para apoiar um esforço de pesquisa. Embora a potência destes dois êxitos seja bastante fraca, estes foram no entanto aceites como pistas para o isolamento do seu princípio activo de forma a que o ensaio primário pudesse ser avaliado bem como para a identificação dos compostos bioactivos. Os dois extractos foram subsequentemente fraccionados e caracterizados.

Pode ser alcançado um maior refinamento do ensaio de ligação para facilitar uma elevada capacidade de pesquisa através da pequena modificação na

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 49 separação do ligando ligado do ligando livre utilizando colunas giratórias.

Este invento contempla também composições farmacêuticas compreendendo compostos quando identificados através dos métodos anteriores e um transportador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas dos fármacos proteicos deste invento são particularmente úteis para administração parentérica, i.e., subcutânea, intramuscular ou intravenosa. As composições para administração parentérica compreenderão normalmente uma solução dos compostos do invento ou uma mistura destes dissolvida num transportador aceitável, de preferência um transportador aquoso. Pode ser empregue uma variedade de transportadores aquosos, p. ex., água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria particulada. Estas soluções podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais e bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas tais como para o ajustamento do pH e agentes tamponantes, etc. A concentração do composto do invento em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, i.e., de menos de cerca de 0,5%, usualmente a ou pelo menos cerca de 1% até tanto como 15 ou 20% em peso e será seleccionada em primeiro lugar com base nos volumes dos fluídos, viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de administração seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica do invento para injecção intramuscular podia ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de um composto do invento. De forma semelhante, uma composição farmacêutica do invento para infusão intravenosa podia ser preparada de modo a conter 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de um composto do invento. Os métodos actuais para preparação de composições administráveis parentericamente são bem conhecidos ou serão evidentes para os peritos na arte e estão descritos com mais pormenor em, por exemplo, Reminaton’s Pharmaceutical Science. 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Os compostos aqui descritos podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num transportador adequado antes da utilização. Esta técnica mostrou ser eficaz com proteínas convencionais e podem ser empregues técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na arte. 50 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

Em situações onde ο fármaco identificado não é proteico, este pode ser administrado sozinho ou em combinação com transportadores farmaceuticamente aceitáveis. A sua proporção é determinada pela solubilidade e natureza química do composto, pela via de administração escolhida e pela prática farmacêutica padrão. Por exemplo, podem ser administrados oralmente na forma de comprimidos ou cápsulas contendo excipientes tais como amido, açúcar láctico, certos tipos de argilas, etc. Estes podem ser administrados sob a língua na forma de trociscos ou pastilhas nos quais o ingrediente activo é misturado com açúcar ou xaropes de milho, agentes aromatizantes e corantes; e depois desidratados o suficiente para os tornar adequados para compressão numa forma sólida. Podem ser administrados oralmente na forma de soluções as quais podem ser injectadas parentericamente, isto é, intramuscular, intravenosa ou subcutaneamente. Para administração parentérica podem ser utilizados na forma de uma solução estéril contendo outros solutos, por exemplo, suficiente solução salina ou glucose para tornar a solução isotónica. O médico determinará a dosagem dos presentes agentes terapêuticos a qual será a mais adequada e variará com a forma de administração e com o composto específico escolhido e para além disso, variará com o doente em particular sob tratamento. Ele desejará geralmente iniciar o tratamento com pequenas dosagens substancialmente inferiores à dose óptima do composto e aumentar a dosagem através de pequenos incrementos até ser alcançado o efeito óptimo dadas as condições. Será normalmente verificado que quando a composição é administrada oralmente, serão necessárias maiores quantidades de agente activo para produzir o mesmo efeito que com uma menor quantidade dada parentericamente. Os compostos são úteis do mesmo modo que outros agentes serotonérgicos e o nível de dosagem é da mesma ordem de grandeza que o normalmente empregue com este outros agentes terapêuticos. A dosagem terapêutica será normalmente de 1 a 10 miligramas por dia e superior embora possam ser administrados em várias unidades de dosagem diferentes. São particularmente úteis os comprimidos contendo de 0,5 a 10 mg de agente activo.

Dependendo da condição do doente, a composição farmacêutica do invento pode ser administrada para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Na aplicação terapêutica, as composições são administradas a um doente que já sofre de uma doença, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos para parcialmente parar a doença e as suas complicações. Em aplicações profiláticas, as composições contendo os presentes compostos ou uma mistura destes são

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 51 administradas a um doente que ainda não esteja no estado de doença para aumentar a resistência do doente.

Podem ser efectuadas administrações únicas ou múltiplas das composições farmacêuticas sendo os níveis e esquema de doses escolhidos pelo médico responsável. Em qualquer caso, a composição farmacêutica do invento deve proporcionar uma quantidade dos compostos do invento suficiente para tratar eficazmente o doente. A concretização de ácido nucleico deste invento é particularmente útil ao proporcionar sondas capazes de hibridação específica com as sequências da CSBP humana. A tecnologia de sondagem é bem conhecida na arte e admite-se que o tamanho das sondas possa variar largamente mas é preferível que a sonda tenha pelo menos 15 nucleótidos de comprimento. Admite-se também que tais sondas possam, e sejam de preferência, marcadas com um reagente analiticamente detectável para facilitar a identificação da sonda. Os reagentes úteis incluem mas não se limitam a radioactividade, corantes fluorescentes ou enzimas capazes de catalisar a formação de um produto detectável. Este invento contempla, por exemplo, a utilização de sondas que codifiquem receptores no diagnóstico e avaliação dos estados da doença caracterizados por um nível anormal, i.e. aumentado ou diminuído, da expressão do gene de um receptor. Alternativamente, as sondas podem ser utilizadas para identificar indivíduos que possuam mutações cromossómicas ou moleculares no gene que codifica o receptor. Dependendo das condições empregues pelo comum perito, as sondas podem ser utilizadas para identificar e recuperar exemplos adicionais deste receptor (na sua forma genómica ou de ADNc) de outros tipos de células e indivíduos. Como regra geral quanto mais rigorosas forem as condições de hibridação mais infimamente relacionados serão os genes que são recuperados.

Estão também dentro do âmbito deste invento oligonucleótidos anti-sentido baseados nas sequências aqui divulgadas para a CSBP. São concebidos oligonucleótidos sintéticos ou análogos químicos estruturais anti-sentido relacionados para reconhecerem e se ligarem especificamente a um ácido nucleico alvo que codifique o gene do receptor e inibirem a expressão do gene, p. ex., a tradução do gene quando o ácido nucleico alvo é ARNm. Embora não querendo ficar presos a qualquer teoria em particular para o mecanismo de acção de fármacos anti-sentido, acredita-se que tais fármacos possam agir através de um ou mais dos seguintes mecanismos: pela ligação ao ARNm e indução da degradação

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 52 por nucleases endógenas tais como ARNase I ou pela inibição da tradução de ARNm inibindo a sua ligação a factores reguladores ou componentes ribossómicos necessários para a síntese proteica produtiva. Adicionalmente, as sequências anti-sentido podem ser utilizadas como componentes de arranjos macromoleculares complexos nos quais as sequências são combinadas com sequências de ribozimas ou grupos químicos reactivos e são utilizadas para se dirigirem especificamente a ARNm de interesse e degradarem ou modificarem quimicamente os referidos ARNm. O campo genérico da tecnologia anti-sentido é ilustrado pelas seguintes divulgações que são aqui incorporadas por referência com o objectivo de apoiar os antecedentes (Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sei. 10: 435 (1989) e Weintraub, H.M. Scientific American Jan. (1990) na pág 40).

Este invento contempla também a utilização das sequências de ADN aqui divulgadas em terapia genética. Devido à CSBP ser uma proteína-quinase é possível fazer um mutante específico num local que seja inactivo como quinase mas que bloqueará a activação da CSBP endógena quando co-expresso na mesma célula, i.e., é um mutante negativo dominante (Kolch et ai., Nature 349: 426-428 (1991). O ADN que codifica esta proteína mutante podia ser utilizado em terapia genética para reduzir a inflamação crónica. Existem muitos vectores e sistemas de entrega disponíveis para dirigir ADN para células alvo in vivo, p. ex., adenovírus, retrovírus.

Este invento contempla também anticorpos, monoclonais ou policlonais, dirigidos a epitopos que correspondem a sequências de aminoácidos aqui divulgadas da CSBP. As regiões particularmente importantes do receptor para fins imunológicos são as regiões associadas a domínios de ligação ao ligando da proteína. Os anticorpos dirigidos às regiões são particularmente úteis em aplicações de diagnóstico e terapêuticas devido ao seu efeito após a interaeção proteína-ligando. Os métodos para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais são bem conhecidos, ver por exemplo Cap. 11 de Ausubel et ai., (supra).

Este invento proporciona também composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de anticorpo ou fragmento deste dirigido contra a CSBP para bloquear a ligação de ligandos de ocorrência natural a essa proteína de forma a tratar ou melhorar estados de doença associados a activação da proteína.

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Podem ser obtidos animais transgénicos não humanos transfectando ovos fertilizados ou embriões apropriados de um hospedeiro com ácidos nucleicos que codifiquem a CSBP aqui divulgada, ver por exemplo Patentes U.S. Nos. 4736866; 5175385; 5175384 e 5175386. O animal transgénico resultante pode ser utilizado como modelo para o estudo da interacção CSBP/ligando. Particularmente, os animais transgénicos úteis são os que apresentam um fenótipo detectável associado à expressão da proteína. Os fármacos podem então ser pesquisados quanto à sua capacidade para reverter ou exacerbar o fenótipo relevante. Este invento contempla também a ligação operativa do gene que codifica a CSBP a elementos reguladores que respondam diferentemente a várias condições de temperatura ou metabólicas, iniciando ou parando assim eficazmente a expressão fenotípica em resposta a essas condições.

As sondas de ácido nucleico aqui divulgadas podem ser utilizadas para clonar a versão cognata do gene da CSBP humana a partir de uma espécie animal experimental desejada; por exemplo a versão de murídeo. Podem ser desenvolvidas estirpes de ratinhos nas quais o referido gene foi eliminado através de tecnologia de eliminação ("knock-out") de genes convencional. O gene pode ser então substituído/ou trocado pelo ADN da CSBP humana deste invento para produzir um ratinho para pesquisa de fármacos candidatos in vivo. Estudos semelhantes de eliminação de genes e de inibição de proteína humana podem também ser efectuados com leveduras. A proteína purificada deste invento é também útil num reagente para estudos estruturais com e sem candidatos a fármacos ligados como meio para a concepção racional de novos fármacos que afectem a CSBP. Por exemplo, a proteína recombinante pode ser utilizada para derivar a estrutura da proteína sozinha ou complexada com Composto la e composto relacionados através de cristalografia de raios X, RMN ou modelação a partir de estruturas publicadas de proteína-quinases relacionadas, p. ex., CSK. Uma estrutura fomenta uma compreensão de como os compostos inibidores se ligam e pode conduzir à concepção ou identificação de mais compostos que possam bloquear a actividade de CSBP e por isso serem inibidores da síntese de citóquinas. Existem agora vários exemplos de tal concepção com base na estrutura para outros alvos proteicos, p. ex., protease de HIV. Dada a semelhança da CSBP com várias outras quinases (p. ex., as quinases MAP e CDC), tal informação sobre a estrutura será útil na concepção de novos compostos que inibam outros membros da família das quinases. 54 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Lee, John C.

Adams, Jerry L.

Gallagher, Timothy F.

Green, David W.

Heys, J. Richard McDonnelI, Peter McNulty, Dean E.

Strickler, James E.

Young, Peter R. (ii) TÍTULO DO INVENTO: Proteína de Ligação a Fármacos (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 16 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: SmithKline Beecham Corporation (B) RUA: Corporate Intellectual Property/P.O. Box 1539 (C) CIDADE: King of Prussia

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 19406-0939 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/123175 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 17-Set-1993 (vii)

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 55 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Jervis, Herbert H. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31171 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: P50195-1 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (610) 270-5019 (B) TELEFAX: (610)270-5090 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (H) LINHA CELULAR: THP.1

Ala Gin Tyr 15

Phe (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: lie Thr Ala Ala Gin Ala Leu Ala His Ala Tyr 1 5 10

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (H) LINHA CELULAR: THP.1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Xaa Gln Leu Leu Asn Asn lie Vai Lys Phe Gin Lys Leu Thr 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 57 (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GCYCAYGCTA YTTYGCYCAR TA 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: AAYAAYATYK TBAARTTYCA AA 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 58 (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: Interno (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (H) LINHA CELULAR: THP.1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Asn lie Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 285 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (H) LINHA CELULAR: THP.1 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..285 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 59 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

AAC ATT GTG AAA TGT CAG AAG CTT ACA GAT GAC CAT GTT CAG TTC CTT 48 Asn Ile Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr Asp Asp His Vai Gin Phe Leu 1 5 10 15 ATC TAC CAA ATT CTC CGA GGT CTA AAG TAT ATA CAT TCA GCT GAC ATA 96 Ile Tyr Gin Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile 20 25 30 ATT CAC AGG GAC CTA AAA CCT AGT AAT CTA GCT GTG AAT GAA GAC TGT 144 Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Vai Asn Glu Asp Cys 35 40 45 GAG CTG AAG ATT CTG GAT TTT GGA CTG GCT CGG CAC ACA GAT GAT GAA 192 Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp Asp Glu 50 55 60 ATG ACA GGC TAC GTG GCC ACT AGG TGG TAC AGG GCT CCT GAG ATC ATG 240 Met Thr Gly Tyr Vai Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met 65 70 75 80 CTG AAC TGG ATG CAT TAC AAC CAG ACA GGT GGT ATT TGG GTC AAG 285 Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gin Thr Gly Gly Ile Trp Vai Lys 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 95 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Asn Ile Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr Asp Asp His Vai Gin Phe Leu 5 10 15 1

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 60

Ile Tyr Gin Xle Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile 20 25 30

Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Vai Asn Glu Asp Cys 35 40 45

Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp Asp Glu 50 55 60

Met Thr Gly Tyr Vai Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met 65 70 75 80

Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gin Thr Gly Gly Ile Trp Vai Lys 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 392 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (H) LINHA CELULAR: THP.1 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: 3’UTR 60 61 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ (Β) LOCALIZAÇÃO: 1..392 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

CAAGTCCCAA TCCTCCCCAA CCACAGCAAG TTGAA7TTAT CAACCATGTT GGGTTGTAAA 120 180 240 300 360 392

TGCTCGTGTG AT7TCCTACA AGAAATACCT GCTCTGAATA TTTTTGTAAT AAAGGTCTTT GCACATGTGA CCCACAATAC GTGTTAGGAG CCTGCATGCT CTGGAAGCCT GGACTCTAAG C7GGAGCTCT TGGAAGAGCT CTTCGGTTTC TGAGGA7AAT GCTCCCATCT CCTGATTTCT CTGAACAGAA AACAAAAGAG AGAATGAGGG AAATTGCTAT TTTATTTGTA TTGATGAACT TGGCTGTAAT CAGTTATGCC GTATAGGATG TCAGACAATA CCAC7GGTTA AAATAAAGCC TATTTTTCAA atttaaaaaa aaaaaaaaaa aa (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 62 (χί) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: CCTCGGAGAA TTTGGTAGAT AAGG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: AACATTGTGA AATGTCAGAA GCTTACAGAT GACCAT 36 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3813 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 63

(vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 379..1461 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

CCTCCTGGTA TAATCTGGAA CCGCGACCAC TGGAGCCTTA GCGGGCGCAG CAGCTGGAAC SO GGGAGTAC7G CGACGCAGCC CGGAGTCGGC CTTGTAGGGG CGAAGGTGCA GGGAGATCGC 120 GGCGGGCGCA GTCTTGAGCG CCGGAGCGCG TCCCTGCGCT TAGCGGGGCT TGCCCCAGTC 180 GCAGGGGCAC ATCCAGCCGC TGCGGCTGAC AGCAGCCGCG CGCGCGGGAG TCTGCGGGGT 240 CGCGGCAGCC GCACCTGCGC GGGCGACCAG CGCAAGG7CC CCGCCCGGCT GGGCGGGCAG 300 CAAGGGCCGG GGAGAGGGTG CGGGTGCAGG CGGGGGCCCC ACAGGGCCAC CTTCTTGCCC 360 GGCGGCTGCC GCTGGAAA ATG TCT CAG GAG AGG CCC ACG TTC TAC CGG CAG 411 Met Ser Gin Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gin 1 5 10 GAG CTG AAC AAG ACA ATC TGG GAG GTG CCC GAG CGT TAC CAG AAC CTG 459 Glu Leu Asn Lys Thr Ile Trp Glu Vai Pro Glu Arg Tyr Gin Asn Leu 15 20 25 TCT CCA GTG GGC TCT GGC GCC TAT GGC TCT GTG TGT GCT GCT TTT GAC 507 Ser Pro Vai Gly Ser Gly Ala Tyr Gly Ser Vai Cys Ala Ala Phe Asp 30 35 40 ACA AAA ACG GGG TTA CGT GTG GCA GTG AAG AAG CTC TCC AGA CCA 777 555 Thr Lys Thr Gly Leu Arg Vai Ala Vai Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe 45 50 55 CAG TCC ATC ATT CAT GCG AAA AGA ACC TAC AGA GAA CTG CGG TTA CTT 603 Gin Ser Ile Ile His Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu 60 65 70 75 64 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ ΑΑΑ CAT ATG ΑΛΑ CAT GAA ΑΑΤ GTG ATT GGT CTG TTG GAC GTT ΤΤΤ ACA 651

Lys His Met Lys His Glu Asn Vai Ile Gly Leu Leu Asp Vai Phe Thr 80 85 90 CCT GCA AGG TCT CTG GAG GAA TTC AAT GAT GTG TAT CTG GTG ACC CAT 699

Pro Ala Arg Ser Leu Glu Glu Phe Asn Asp Vai Tyr Leu Vai Thr His 95 100 105 CTC ATG GGG GCA GAT CTG AAC AAC ATT GTG AAA TGT CAG AAG CTT ACA 747

Leu Met Gly Ala Asp Leu Asn Asn Ile Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr 110 115 120 GAT GAC CAT GTT CAG TTC CTT ATC TAC CAA ATT CTC CGA GGT CTA AAG 795

Asp Asp His Vai Gin Phe Leu Ile Tyr Gin Ile Leu Arg Gly Leu Lys 125 130 135 TAT ATA CAT TCA GCT GAC ATA ATT CAC AGG GAC CTA AAA CCT AGT AAT 843

Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn 140 145 150 155 CTA GCT GTG AAT GAA GAC TGT GAG CTG AAG ATT CTG GAT TTT GGA CTG 891

Leu Ala Vai Asn Glu Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu 160 165 170 GCT CGG CAC ACA GAT GAT GAA ATG ACA GGC TAC GTG GCC ACT AGG TGG 939

Ala Arg His Thr Asp Asp Glu Met Thr Gly Tyr Vai Ala Thr Arg Trp 175 180 185 TAC AGG GCT CCT GAG ATC ATG CTG AAC TGG ATG CAT TAC AAC CAG ACA 987

Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gin Thr 190 195 200 GTT GAT ATT TGG TCA GTG GGA TGC ATA ATG GCC GAG CTG TTG ACT GGA 1035

Vai Asp Ile Trp Ser Vai Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly 205 210 215 AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT AAC CAG CTT CAG CAG ATT 1083

Arg Thr Leu Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asn Gin Leu Gin Gin Ile 220 225 230 235

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 65 ATG CGT CTG ACA GGA ACA CCC CCC GCT TAT CTC ATT AAC AGG ATG CCA 1131 MeC Ar? Leu Thr Gly Thr Pro Pro Ala Tyr Leu Ile Asn Arg Met Pro 240 245 250 AGC CAT GAG GCA AGA AAC TAT ATT CAG TCT TTG ACT CAG ATG CCG AAG 1179 Ser HiS Glu Ala Arg Asn Tyr Ile Gin Ser Leu Thr Gin Met Pro Lys 255 260 265 ATG AAC TTT GCG AAT GTA TTT ATT GGT GCC AAT CCC CTG GCT GTC GAC 1227 Met Asn Phe Ala Asn Vai Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala val Asp 270 275 280 TTG CTG GAG AAG ATG CTT GTA TTG GAC TCA GAT AAG AGA ATT ACA GCG 1275 Leu Leu Glu Lys Met Leu Vai Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala 285 290 295 GCC CAA GCC CTT GCA CAT GCC TAC TTT GCT CAG TAC CAC GAT CCT GAT 1323 Ala Gin Ala Leu Ala Ris Ala Tyr Phe Ala Gin Tyr HiS Asp Pro Asp 300 305 310 315 GAT GAA CCA GTG GCC GAT CCT TAT GAT CAG TCC TTT GAA AGC AGG GAC 1371 Asp Glu Pro Vai Ala Asp Pro Tyr Asp Gin Ser Phe Glu Ser Arg Asp 320 325 330 CTC CTT ATA GAT GAG TGG AAA AGC CTG ACC TAT GAT GAA GTC ATC AGC 1419 Leu Leu Ile Asp Glu Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Vai Ile Ser 335 340 345 TXT GTG CCA CCA CCC CTT GAC CAA GAA GAG ATG GAG TCC TGAGCACCTG 1468 Phe Vai Pro Pro Pro Leu Asp Gin Glu Glu Met Glu Ser 350 355 360 GTTTCTGTTC TGTTGATCCC ACTTCACTGT GAGGGGAAGG CCTTTTCACG GGAACTCTCC 1528 ΑΑΑΤΑΤΤΑΤΤ CAAGTGCCTC TTGTTGCAGA GATTTCCTCC ATGGTGGAAG GGGGTGTGCG 1588 TGCGTGTGCG TGCGTGTTAG TGTGTGTGCA TGTGTGTGTC TGTCTTTGTG GGAGGGTAAG 1648 ACAATATGAA CAAACTATGA TCACAGTGAC TTTACAGGAG GTTGTGGATG CTCCAGGGCA 1708 GCCTCCACCT TGCTCTTCTT TCTGAGAGTT GGCTCAGGCA GACAAGAGCT GCTGTCCTTT 1768 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 66

TAGGAATATG TTCAATGCAA AGTAAAAAAA TATGAATTGT CCCCAATCCC GG7CA7GC77 TTGCCACTTT GGCTTCTCCT GTGACCCCAC C77GACGG7G GGGCG7AGAC TTGACAACAT CCCACAG7GG CACGGAGAGA AGGCCCA7AC CTTCTGGTTG C7TCAGACC7 GACACCGTCC C7CAG7GA7A CG7ACAGCCA AAAAGGACCA AC7GGC77C7 G7GCAC7AGC CTGTGATTAA C77GC77AG7 A7GG77C7CA GATCTTGACA GTATATTTGA AACTGTAAAT A7G777G7GC C77AAAAGGA GAGAAGAAAG 7G7AGA7AG7 7AAAAGAC7G CAGC7GC7GA AG77C7GAGC CGGGCAAGTC GAGAGGGCTG 77GGACAGC7 GC77G7GGGC CCGGAG7AA7 CAGGCAGCCT TCATAGGCGG 7CATG7G7GC ATGTGAGCAC A7GCG7A7A7 G7GCG7C7C7 C777C7CCC7 CACCCCCAGG 7G77GCCA77 7C7C7GC77A CCC77CACC7 7TGG7GCAGA GG777C77GA A7A7C7GCCC CAG7AG7CAG AAGCAGG77C 77GA7G7CA7 G7AC77CC7G 7G7AC7C777 ATT7C7AGCA GAG7GAGGA7 G7G7777GCA CG7C77GC7A 7T7GAGCA7G CACAGC7GC7 7G7CC7GC7C 7CT7CAGGAG GCCC7GG7G7 CAGGCAGGT7 7GCCAG7GAA GAC77C77GG G7AG7T7AGA 7CCCA7G7CA CC7CAGC7GA 7AT7ATGGCA AG7GA7ATCA CC7C7C77CA GCCCC7AGTG C7A77C7G7G T7GAACACAA T7GA7ACT7C AGG7GC7777 GATG7GAAAA 7CATGAAAAG AGGAACAGGT GGA7GTATAG CA77777A77 CA7GCCA7C7 GTT77CAACC AACTA7777T GAGGAAT7A7 CATGGGAAAA GACCAGGGC7 777CCCAGGA ATATCCCAAA C77CGGAAAC AAG77A77C7 C77CAC7CCC AA7AAC7AA7 GC7AAGAAA7 GC7GAAAA7C AAAGTAAAAA ATTAAAGCCC A7AAGGCCAG AAAC7CC777 7GC7G7C777 CTC7AAATAT GAT7AC777A ΑΑΑ7ΑΑΑΑΑΑ G7AACAAGG7 G7C7777CCA C7CC7A7GGA AAAGGGTCTT CT7GGCAGC7 7AACATTGAC 77C77GG777 GGGGAGAAA7 AAA7777G77 7CAGAA7777 1828 1888 1948 2008 2068 2128 2188 2248 2308 2368 2428 2488 2548 2608 2668 2728 2788 2848 2908 2968

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 67 GTATATTGTA GGAATCCCTT TGAGAATGTG ATTCCTTTTG ATGGGGAGAA AGGGCAAA7T 3028 ΑΤΤΤΤΑΑΤΑΤ TTTGTATTTT CAACTTTATA AAGATAAAAT ATCCTCAGGS GTGGAGAAGT 3088 GTCGTTTTCA TAACTTGCTG AATTTCAGGC ATTTTGTTCT ACATGAGGAC TCATATATTT 3148 AAGCCTTTTG TGTAATAAGA AAGTATAAAG TCACTTCCAG TGTTGGCTGT GTGACAGAAT 3208 CTTGTATTTG GGCCAAGGTG TTTCCATTTC TCAATCAGTG CAGTGATACA TGTACTCCAG 3268 AGGGACGGGT GGACCCCCTG AGTCAACTGG AGCAAGAAGG AAGGAGGCAG AC7GATGGCG 3328 ATTCCCTCTC ACCCGGGACT CTCCCCCTTT CAAGGAAAGT GAACCTTTAA AGTAAAGGCC 3388 TCATCTCCTT TATTGCAGTT CAAATCCTCA CCATCCACAG CAAGATGAAT TTTATCAGCC 3448 ATGTTTGGTT GTAAATGCTC GTGTGATTTC CTACAGAAAT ACTGCTCTGA ATATTTTGTA 3S08 ATAAAGGTCT TTGCACATGT GACCACATAC GTGTTAGGAG GC7GCA7GC7 CTGGAAGCCT 3568 GGACTCTAAG CTGGAGCTCT TGGAAGAGCT CTTCGGTTTC TGAGCATAAT GCTCCCATCT 3628 CCTGATTTCT CTGAACAGAA AACAAAAGAG AGAATGAGGG AAATTGCTAT TTTATTTGTA 3688 TTCATGAACT TGGCTGTAAT CAGTTATGCC GTATAGGATG TCAGACAATA CCACTGGTTA 3748 AAATAAAGCC TATTTTTCAA ATTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAGTCCAGCA ATTTCGTTAC 3808 TTATG 3813

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 68 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 360 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Met Ser Gin Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gin Glu Leu Asn Lys Thr 15 10 15

Ile Trp Glu Vai Pro Glu Arg Tyr Gin Asn Leu Ser Pro Vai Gly Ser 20 25 30

Gly Ala Tyr Gly Ser Vai Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu 35 40 45

Arg Vai Ala Vai Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gin Ser Ile Ile His 50 55 60

Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His 65 70 75 80

Glu Asn Vai Ile Gly Leu Leu Asp Vai Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu 85 90 9S

Glu Glu Phe Asn Asp Vai Tyr Leu Vai Thr His Leu Met Gly Ala Asp 100 105 110

Leu Asn Asn Ile Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr Asp Asp His Vai Gin 115 120 125

Phe Leu Ile Tyr Gin Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 130 135 140

Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Vai Asn Glu 145 150 155 160

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 69

Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala· Arg His Thr Asp 165 170 175

Asp Glu Met Thr Gly Tyr Vai Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu 180 185 190

Ile Met Leu Asn Trp Met Hls Tyr Asn Gin Thr Vai Asp Ile Trp Ser 195 200 205 \

Vai Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro 210 215 220

Gly Thr Asp His Ile Asn Gin Leu Gin Gin Ile Met Arg Leu Thr Gly 225 230 235 240

Thr Pro Pro Ala Tyr Leu Ile Asn Arg Met Pro Ser His Glu Ala Arg 245 250 255

Asn Tyr Ile Gin Ser Leu Thr Gin Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn 260 265 270

Vai Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Vai Asp Leu Leu Glu Lys Met 275 280 285

Leu Vai Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gin Ala Leu Ala 290 295 300

His Ala Tyr Phe Ala Gin Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Vai Ala 305 310 315 320

Asp Pro Tyr Asp Gin Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu 325 330 335

Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Vai Ile Ser Phe Vai Pro Pro Pro 340 345 350

Leu Asp Gin Glu Glu Met Glu Ser 355 360

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1423 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (G) TIPO CELULAR: Monócito (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 227..1309 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: 60 120 180 235

CCACTCCTGG TATAATCTCG CCCCAGTCGC AGGGGCACAT CCAGCCGCTG CGGCTGACAG

CAGCCGCGCG CGCGGGAGTC TGCGGGGTCG CGGCAGCCGC ACCTGCGCGG GCGACCAGCG

CAAGGTCCCC GCCCGGCTGG GCGGGCAGCA AGGGCCGGGG AGAGGGTGCG GGTGCAGGCG

GGGGCCCCAC AGGGCCACCT TCTTGCCCGG CGGCTGCCGC TGGAAA ATG TCT CAG

Met Ser Gin 1 GAG AGG CCC ACG TTC TAC CGG CAG GAG CTG AAC AAG ACA ATC TGG GAG Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gin Glu Leu Asn Lys Thr Ile Trp Glu 5 10 15 283 71 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ ' GTG CCC GAG CGT TAC CAG AAC CTG TCT CCA GTG GGC TCT GGC GCC TAT 331 Vai Pro Glu Arg Tyr Gin Asn Leu Ser Pro Vai Gly Ser Gly Ala Tyr 20 25 30 35 GGC TCT GTG TGT GCT GCT TTT GAC ACA AAA ACG GGG TTA CGT GTG GCA 379 Gly Ser Vai Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu Arg Vai Ala 40 45 50 GTG AAG AAG CTC TCC AGA CCA TTT CAG TCC ATC ATT CAT GCG AAA AGA 427 Vai Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gin Ser Ile Ile HiS Ala Lys Arg 55 60 65 ACC TAC AGA GAA CTG CGG TTA CTT AAA CAT ATG AAA CAT GAA AAT GTG 475 Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His Glu Asn Val 70 75 80 ATT GGT CTG TTG GAC GTT TTT ACA CCT GCA AGG TCT CTG GAG GAA TTC 523 Ile Gly Leu Leu Asp Vai Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu Glu Glu Phe 85 90 95 AAT GAT GTG TAT CTG GTG ACC CAT CTC ATG GGG GCA GAT CTG AAC AAC 571 Asn Asp Vai Tyr Leu val Thr His Leu Met Gly Ala Asp Leu Asn Asn 100 105 110 115 ATT GTG AAA TGT CAG AAG CTT ACA GAT GAC CAT GTT CAG TTC CTT ATC 619 Ile Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gin Phe Leu Ile 120 125 130 TAC CAA ATT CTC CGA GGT CTA AAG TAT ATA CAT TCA GCT GAC ATA ATT 667 Tyr Gin Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asp Ile Ile 135 140 145 CAC AGG GAC CTA AAA CCT AGT AAT CTA GCT GTG AAT GAA GAC TGT GAG 715 His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu Asp Cys Glu 150 155 160 CTG AAG ATT CTG GAT TTT GGA CTG GCT CGG CAC ACA GAT GAT GAA ATG 763

Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu 165 170

Ala Arg His Thr Asp Asp Glu Met 175

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 72 ACA GGC TAC GTG GCC ACT AGG TGG TAC AGG GCT CCT .GAG ATC ATG CTG 811 Thr Gly Tyr Vai Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu 180 185 190 195 AAC TGG ATG CAT TAC AAC CAG ACA GTT GAT ATT TGG TCA GTG GGA TGC 859 Asn Trp Met His Tyr Asn Gin Thr Vai Asp Ile Trp Ser Vai Gly Cys 200 205 210 ΑΤΑ ATG GCC GAG CTG TTG ACT GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC 907 Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro Gly Thr Asp 215 220 225 CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC ATT TTA AGA CTC GTT GGA ACC CCA GGG 955 His Ile Asp Gin Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Vai Gly Thr Pro Gly 230 235 240 GCT GAG CTT TTG AAG AAA ATC TCC TCA GAG TCT GCA AGA AAC TAT ATT 1003 Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg Asn Tyr Ile 245 250 255 CAG TCT TTG ACT CAG ATG CCG AAG ATG AAC TTT GCG AAT GTA TTT ATT 1051 Gin Ser Leu Thr Gin Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn Vai Phe Ile 260 265 270 275 GGT GCC AAT CCC CTG GCT GTC GAC TTG CTG GAG AAG ATG CTT GTA TTG 1099 Gly Ala Asn Pro Leu Ala Vai Asp Leu Leu Glu Lys Met Leu Vai Leu 280 285 290 GAC TCA GAT AAG AGA ATT ACA GCG GCC CAA GCC CTT GCA CAT GCC TAC 1147 Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gin Ala Leu Ala His Ala Tyr 295 300 305 TTT GCT CAG TAC CAC GAT CCT GAT GAT GAA CCA GTG GCC GAT CCT TAT 1195 Phe Ala Gin Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Vai Ala Asp Pro Tyr 310 315 320 GAT CAG TCC TTT GAA AGC AGG GAC CTC CTT ATA GAT GAG TGG AAA AGC 1243 Asp Gin Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu Trp Lys Ser 325 330 335 1291 73 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ

CTG ACC ΤΑΤ GAT GAA GTC ATC AGC ΤΤΤ GTG CCA CCA CCC CTT GAC CAA

Leu Thr Tyr Asp Glu Vai Ile Ser Phe Vai Pro Pro Pro Leu Asp Gin 340 345 350 355 1346 1406 1423 GAA GAG ATG GAG TCC TGAGCACC7G GTTTCTGTTC TGTTGATCCC ACTTCACTG7

Glu Glu Met Glu Ser 360

GAGGGGAAGG CCTTTTCACG GGAAC7CTCC AAA7A77A77 CAAG7GCCAA AAAGG7CCAG CAA777CG77 AC77A7G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 360 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Met Ser Gin Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gin Glu Leu Asn Lys Thr 15 10 15

Ile Trp Glu Vai Pro Glu Arg Tyr Gin Asn Leu Ser Pro Vai Gly Ser 20 25 30

Gly Ala Tyr Gly Ser Vai Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu 35 40 45

Arg Vai Ala Vai Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gin Ser Ile Ile Ris 50 55 60

Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His 65 70 75 80

Glu Asn Vai Ile Gly Leu Leu Asp Vai Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu 85 90 95

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 74

Glu Glu Phe Asn Asp Vai Tyr Leu Vai Thr His Leu Met Gly Ala Asp 100 105 110

Leu Asn Asn Ile Vai Lys Cys Gin Lys Leu Thr Asp Asp His Vai Gin 115 120 125

Phe Leu Ile Tyr Gin Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 130 135 140

Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Vai Asn Glu 145 150 155 160

Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp 165 170 175

Asp Glu Met Thr Gly Tyr Vai Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu 180 185 190

Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gin Thr Vai Asp Ile Trp Ser 195 200 205

Vai Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro 210 215 220

Gly Thr Asp His Ile Asp Gin Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Vai Gly 225 230 235 240

Thr Pro Gly Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg 245 250 255

Asn Tyr Ile Gin Ser Leu Thr Gin Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn 260 265 270

Vai Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Vai Asp Leu Leu Glu Lys Met 275 280 285

Leu Vai Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gin Ala Leu Ala 290 295 300

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 75

His Ala Tyr Phe Ala Gin Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Vai Ala 305 310 315 320

Asp Pro Tyr Asp Gin Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu 325 330 335

Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Vai Ile Ser Phe Vai Pro Pro Pro 340 345 350

Leu Asp Gin Glu Glu Met Glu Ser 355 360 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: CGCCCTCGAG ATGTCTCAGG AGAGGCCCAC G 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc Á 76 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: GCCAGTCCAA AATCCAGAAT C 21

Lisboa, “9. FEV. 2000

Por SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION -oAGEBTmífò-

íffo· ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. <ua das Flores, 74 - 4,® 1200 LISBOA

Claims

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína isolada a qual é uma proteína humana de ligação a fármacos anti-inflamatórios supressores de citóquinas (CSBP).
2. Proteína de acordo com a reivindicação 1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 14.
3. Proteína de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade ao longo de todo o comprimento com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou 14.
4. Proteína de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade ao longo de todo o comprimento com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou 14.
5. Proteína de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade ao longo de todo o comprimento com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou 14.
6. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores a qual é isolável a partir de monócitos humanos, possuindo Pm de cerca de 43000 e possuindo um pl de cerca de 4,5.
7. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma CSBP de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
8. Molécula de acordo com a reivindicação 8 possuindo a sequência de ADN de SEQ ID NO: 11 ou 13.
9. Vector compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7 ou 8.
10. Célula hospedeira recombinante isolada compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 9.
11. Método para a produção de CSBP compreendendo a cultura de uma célula hospedeira recombinante capaz de expressar CSBP num meio e sob

84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 2/3 condições suficientes para tal expressão e recuperação da CSBP proveniente da célula hospedeira.
12. Método para identificação de um composto tal como um fármaco anti-inflamatório supressor de citóquinas (CSAID) compreendendo: (a) pôr em contacto um CSAID conhecido marcado com um reagente analiticamente detectável com uma CSBP sob condições suficientes para formar um complexo CSAID/CSBP; (b) pôr o referido complexo em contacto com uma amostra compreendendo um composto a ser identificado; e (c) identificar o composto como CSAID através da detecção da capacidade do referido composto para alterar a quantidade de CSAID marcado no referido complexo.
13. Método para identificação de um composto tal como um CSAID compreendendo: a. formação de uma fracção citosólica solúvel a partir de uma célula que expressa uma CSBP; b. pôr em contacto a referida fracção com um CSAID marcado com um reagente analiticamente detectável sob condições suficientes para formar um complexo CSAID/CSBP reagente; c. pôr em contacto o referido complexo com uma amostra contendo um CSAID; e d. detecção do CSAID medindo uma diminuição na quantidade de reagente no complexo CSAID/CSBP marcado.
14. Método para identificação de ligandos capazes de ligação a uma CSBP compreendendo: pôr em contacto uma célula hospedeira recombinante que expressa uma CSBP com um ligando a ser identificado sob condições que permitam a ligação e a detecção da presença de qualquer proteína ligada ao ligando.
15. Oligonucleótido anti-sentido possuindo uma sequência capaz de se ligar especificamente a qualquer sequência de uma molécula de ARNm que codifique a CSBP humana contendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou 14 de forma a evitar a sua tradução.
16. Anticorpo dirigido à CSBP humana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6. 84 397 ΕΡ Ο 724 588/ ΡΤ 3/3
17. Método de pesquisa de compostos para identificar os compostos que se ligam a uma CSBP humana compreendendo pôr em contacto a proteína de fusão que compreende um domínio de CSBP e um domínio indicador de ligação proteína de ligação/ligando com uma pluralidade de compostos, sob condições que permitem a ligação ao domínio de CSBP e identificação dos compostos capazes de aumentar ou inibira actividade do domínio indicador de ligação proteína/ligando. Lisboa, _9 pEy 2000 Por SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION - O AGENTE OFICIAL -

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