BRPI0709763A2 - métodos de condicionamento de estresse e de monitoramento da eficácia de condicionamento, estojo para condução de um ensaio e microdisposição ou gene chip - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE CONDICIONAMENTO DE ESTRESSE E DE MONITORAMENTO DA EFICáCIA DE CONDICIONAMENTO, ESTOJO PARA CONDUçãO DE UM ENSAIO E MICRODISPOSIçãO OU GENE CHIP. A presente invenção refere-se a um modo único de ação para Fotoferese Extracorpórea (ECP). ECP pode agir através da modulação de respostas a estresse celular características de mecanismo evolucionariamente conservado para responder a estresse ambiental (isto é, respostas à infecção e disponibilidade de nutriente variada, obesidade, xenobióticos). Um curso específico, o curso metabólico de hexosamina parece modular esta resposta a estresse ao alterar composição de glicoproteina O ligada celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE CONDICIONAMENTO DE ESTRESSE E DE MONITORAMENTO DA EFICÁCIA DE CONDICIONAMENTO, ESTOJO PARA CONDUÇÃO DE UM ENSAIO E MICRODISPOSIÇÃO OU GENE CHIP".

Antecedentes da Invenção

Células e organismos respondem a estresses ambientais de uma maneira evolucionariamente conservada como um mecanismo para manter homeostase. Respostas a estresse aberrante ou prolongado basei- am mais de 100 doenças sérias (Xu e outros (2005)) e impactam o sucesso de muitos procedimentos médicos.

Respostas a estresse celular características de mecanismo evo- lucionariamente conservado para responder a estresse ambiental (isto é, respostas à infecção e disponibilidade de nutriente variada, obesidade, xe- nobióticos) incluem aquelas que envolvem as chamadas "proteínas de cho- que térmico" (HSPs). HSPs formam uma família de proteínas altamente con- servadas que são amplamente distribuídas pelos reinos de planta e animal. Embora HSPs fossem originalmente identificadas em células submetidas a estresse de calor, elas foram verificadas estar associadas com muitas outras formas de estresse, tal como infecções, e são então mais geralmente co- nhecidas como "proteínas de estresse" (SPs).

A função biológica de uma proteína depende de sua estrutura tridimensional, que é determinada em grande parte por sua seqüência de aminoácido, mas também pelo ambiente. Na verdade, conformação de pro- teína governa sua interação com outros fatores, que podem participar na regulagem de função de proteína. A falha de polipeptídios em adotar e man- ter sua estrutura apropriada através de enovelamento de proteína apropriado é uma ameaça grande a funcionamento e viabilidade celular. Conseqüente- mente, sistemas elaborados se desenvolveram para proteger células dos efeitos prejudiciais de proteínas com erro de enoveiamento.

Conseqüentemente, anormalidades de enovelamento de proteí- na, oligomerização, agregação ou deposição podem desempenhar um papel importante na patofisiológica de um conjunto diverso de distúrbios degenera- tivos cronicamente progressivos. Exemplos não-limitantes de tais doenças incluem o que segue: Doença de Parkinson (PD), demência do corpo de Lewy difuso (DLBD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), distrofia miotônica, atrofia dentatorrubro-palidolusiana (DRPLA), ataxia de Friedreich, síndrome do X frágil, retardo mental XE frágil, Doença de Machado-Joseph, atrofia muscular espinobulbar (também conhecida como Doença de Kennedy), ata- xia espinocerebelar, doença de Huntington (HD)1 encefalopatia familiar com corpos de inclusão de neuroserpina (FENIB), doença de Pick, degeneração corticobasal (CBD), palsia supranuclear progressiva (PSP), complexo escle- rose amiotrófica lateral/demência de parkinsonismo, Esclerose Amiotrófica Lateral (ALS), síndrome de Down, Degeneração Macular Relacionada com a Idade, Catarata e Doença de Wilson. Em muitos casos, mutações genéticas baseando as formas familiares dessas doenças foram identificadas. Na mai- oria dos casos, no entanto, o evento idiopático inicial facilitando ou disparan- do a transição conformacional da proteína alvo é desconhecido, mas por fim resulta no processamento anormal, enovelamento errado, oligomerização ou agregação de proteína, que dispara toxidez celular. Como uma parte de uma desintoxicação celular, estratégia de defesa ou como uma tentativa em de- gradar as proteínas anormalmente enoveladas, tais proteínas anormais fre- qüentemente acumulam em vários tipos de inclusões ou agressomas celula- res. Essas inclusões ou agressomas se tornaram então uma das marcas patológicas do conjunto diverso de condições degenerativas. Até agora, tais agentes terapêuticos e tratamentos completamente eficazes para essas do- enças não estão disponíveis.

Irradiação de luz ou fototerapia tem sido amplamente usada nas ciências químicas e biológicas por muitos anos. Irradiação de luz ultravioleta (UV) de sangue foi usada nos anos 30, 40 e 50 para o tratamento de muitas condições. Essas condições incluíam doenças bacterianas tal como septi- cemias, pneumonias, peritonite, infecção de ferida, infecções virais incluindo hepatite aguda e crônica, poliomelite, sarampo, caxumba e mononucleose. Fototerapia ou irradiação de luz também inclui os processos de exposição de alvos fotoativáveis ou fotossensibilizáveis, tal como células, produtos de sangue, fluidos corporais, moléculas químicas, tecidos, vírus e compostos de fármaco, à energia de luz, o que induz uma alteração em ou para os alvos. Nos últimos anos, as aplicações de fototerapia estão aumentando no campo médico. Essas aplicações incluem a inativação de vírus contaminando san- gue ou produtos de sangue, o tratamento preventivo de todas as reações de imunização induzidas por infusão de concentrado de plaqueta e o tratamento de ambas as doenças auto-imunes e mediadas por célula T porque vários estados de doença humana, particularmente aqueles se relacionando com fluidos biológicos tal como sangue, respondem favoravelmente a tratamento por irradiação de luz visível ou UV.

Aplicações de irradiação podem também incluir a esterilização por irradiação de fluidos que contêm microorganismos indesejáveis, tal como bactérias ou vírus. Irradiação de luz pode ser também eficaz para eliminar imunogenicidade em células, inativar ou matar células selecionadas, inativar vírus ou bactérias ou ativar respostas imunes desejáveis. Fototerapia pode ser usada como um tratamento antiviral para certos componentes do sangue ou sangue integral. Por exemplo, um vírus patogênico em um concentrado de plaqueta doado pode ser inativado por exposição de luz UV. WO 97/36634.

Embora irradiação de luz possa ser eficaz por si só, sem a intro- dução de agentes ou compostos externos, ela pode também envolver a in- trodução de agentes ou catalisadores específicos, tal como, por exemplo, fármacos fotoativáveis. Em uma aplicação particular, é bem conhecido que vários estados de doença humana podem ser caracterizados pela superpro- dução de certos tipos de leucócitos, incluindo linfócitos, em comparação com outra população de células que normalmente compreende sangue integral. Populações de linfócito anormais excessivas resultam em vários efeitos ad- versos em pacientes incluindo o prejuízo funcional de órgãos do corpo, do- enças autoimunes mediadas por leucócito e distúrbios relacionados com leucemia muitos dos quais freqüentemente resultam por fim em fatalidade. Na verdade, usos desses fármacos fotoativáveis podem envolver tratamento do sangue de um paciente doente onde células de sangue específicas se 4 tornaram patogênicas como uma conseqüência do estado de doença. Os métodos geralmente podem envolver tratamento das células sangüíneas patogênicas, tal como linfócitos, com um fármaco fotoativável, tal como um psoraleno, que é capaz de formar fotoadutos com DNA de linfócito quando exposto à irradiação UV.

Fotoferese usando um psoraleno tal como metoxsaleno pode causar uma imunização contra as células T anormais (cancerosas, no caso de CTCL). Durante a fotoferese, metoxsaleno entra nos núcleos da célula sangüínea branca e intercala na hélice do DNA de filamento duplo. Em um circuito extracorpóreo, luz ultravioleta de onda longa é direcionada no volu- me de sangue enriquecido em leucócito. O metoxsaleno, respondendo à e- nergia ultravioleta, se liga à base timidina na hélice de DNA. Isto resulta na reticulação de bases timidina que previne o desenrolamento do DNA durante a transcrição. Luz ultravioleta A (UVA) danifica células T anormais tornando- as mais imunogênicas. Outros psoralenos ou derivados de psoraleno podem agir através de outro curso. Não obstante, após as células serem fotoativa- das, reinfusão dessas células T alteradas causa uma reação imunológica que se direciona a células T carregando os mesmos antígenos de superfície. Edelson (1991) Ann. NY Acad. Sci., 636:154-64. Isto resulta na produção de uma resposta imune altamente específica contra as células anormais (ou um clone de câncer ou talvez células T que expressam antígenos virais em sua superfície). É estimado que aproximadamente 25-50% do compartimento 5 de célula mononuclear de sangue periférico total sejam tratados por sessão de fotoferese (programa de 2 dias consecutivos). Sumário da Invenção

A presente invenção provê um modo único de ação para Fotofe- rese Extracorpórea (ECP). ECP pode agir através da modulação de respos- tas a estresse celular características de mecanismos evolucionariamente conservados para reposta a estresse ambiental (isto é, resposta à infecção e disponibilidade de nutriente variada, obesidade, xenobióticos). Um curso es- pecífico, o curso metabólico de hexosamina, parece modular esta resposta a estresse alterando a composição da glicoproteína O ligada celular. Os dados apresentados aqui apoiam a reivindicação que este curso age como um sensor de morte de célula apoptótica, e pode fazer parte da resposta a es- tresse que segue ECP. Dado que apenas duas enzimas são conhecidas por afetar este curso, e que este curso foi implicado no início e patologias de diabetes, este curso provê novos alvos para terapia de ECP.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra o procedimento clínico para fotoferese extra-

corpórea.

A Figura 2 mostra gráficos de barra mostrando que ECP melhora inflamação em um modelo de asma de camundongo.

A Figura 3 mostra gráficos mostrando que ECP protege camun- dongos NOD/Ltj de diabetes e suas complicações.

A Figura 4 mostra um gráfico de barras mostrando que ECP em- bota o efeito diabetogênico de STZ em um modelo de camundongo de T1DM.

A Figura 5 mostra o mecanismo imunológico de ação de ECP.

A Figura 6 é um gráfico de barras mostrando padrão de secre- ção de citocina de células dendríticas co-culturadas com células tratadas com ECP.

A Figura 7 é um gráfico de barras mostrando Treg regenerada in vitro usando AC para suprimir proliferação de célula T em um MLR.

A Figura 8 é uma série de gráficos de barras mostrando o efeito de regime de ECP sobre proteínas de fase aguda.

A Figura 9 é um gráfico de barras mostrando que ECP modula insulina e glucagon em um modelo de camundongo de inflamação pulmonar.

A Figura 10 mostra gráficos de barras mostrando efeitos de ECP sobre biomarcadores com o tempo (mudança de enovelamento de linha de base v tempo).

Figura 11 é um gráfico de barras mostrando secreção de leptina 30 induzida por ECP em um modelo de camundongo de inflamação pulmonar.

A Figura 12 é um gráfico mostrando o curso de tempo de bio- marcadores em camundongos saudáveis. A Figura 13 é uma série de gráficos de barra mostrando relações de dose-resposta de célula em camundongos saudáveis tratados com ECP.

A Figura 14 é uma serie de gráficos de barra mostrando que e- feito dependente de dose sobre atividade de CD mTOR após engolfamento de AC é dependente do estado de maturação de DC.

A Figura 15 é um gráfico de barras mostrando o efeito de inibi- ção de O-GIcNAc sobre tolerogênese de AC em um MLR.

A Figura 16 mostra que Alloxan reverte efeitos de ECP em MLR através da estimulação de proliferação de célula T.

A Figura 17 mostra animais e células em pré-condições de ECP contra estressores químicos.

A Figura 18 mostra que tratamento com ECP induz secreção de TSP-1 em PBMC.

A Figura 19 mostra que bloqueio de TSP-1 atenua efeitos tolero- gênicos de ECP em MLR.

Descrição Detalhada da Invenção

Muitas das doenças crônicas mais prevalentes, incluindo diabe- tes, são dirigidas por respostas mal-adaptativas a estresse. Estresse, aqui definido amplamente como um estado de homeostase ameaçado, é provo- cado por uma exibição de estímulos incluindo demandas psicológicas, ambi- entais e fisiológicas. Fotoferese extracorpórea (ECP) foi agora mostrada ser uma terapia que pode modular respostas a estresse, e facilitar adaptação. Este processo aumenta reparo de célula e tecido e acelera a resolução de patologia de doença. Esta terapia então oferece uma abordagem nova, se- gura, para tratar doenças atualmente intratáveis e tipicamente fatais. ECP é uma terapia imunomoduladora segura e eficaz com utilidade demonstrada em várias condições inflamatórias. O benefício terapêutico de ECP parece surgir da indução de tolerância imune, em parte pela indução de células T reguladoras (Treg). A presente invenção provê cursos de sinalização que modulam função de ECP in vitro, conforme confirmado por modelos in vivo de doença inflamatória, incluindo T1DM.

Em modelos animais e pacientes, melhores resultados típica- mente acontecem após vários tratamentos com ECP. Na verdade, para vá- rias doenças, é raro que uma resposta seja vista até após vários ciclos de tratamento.

Em contraste com tratamentos imunossupressores, pacientes recebendo ECP não mostram nenhuma taxa de infecção ou câncer aumen- tada. Resultados de modelos animais mostram que respostas imunes são preservadas, surgindo com velocidade e intensidade essencialmente iguais a controles não-tratados, mas elas resolvem mais rapidamente com trata- mento com ECP.

Tratamento de células e animais com fármacos de classes am- plamente diferentes potencializa ECP in vitro e in vivo. Sinergias são vistas com fármacos afetando sistemas críticos para respostas a estresse celular e cursos de sinalização distintos.

Traçado de perfil de expressão de gene de ECP mostrou que ECP elicita mudanças em abundâncias de transcrito de genes responsivos a estresse, incluindo muitos que têm estado implicados em respostas a es- tresse programadas, estereotípicas.

Consistente com os dados de disposição de gene da requerente, dois pontos de controle específicos para tolerância imune, um conhecido e um novo, são modulados por ECP. Ambos os cursos, o curso biossintético de hexosamina (HBP) e a cascata de sinalização de mTOR, estão implica- dos em absorção de nutriente e diabetes. Ambos responderam normalmente a estresse de baixo nível para tornar células mais tolerantes a provocações subseqüentes, sugerindo um efeito de condicionamento de estresse induzido por ECP.

ECP é protetora sob condições de estresse agudo, melhorando resultados clínicos após transplante de medula óssea mieloablativo, prote- gendo células em cultura de insultos pró-apoptóticos e parando a progressão de diabetes em modelos de camundongo genéticos e quimicamente induzi- dos.

Essas observações estão consistentes com respostas de condi- cionamento induzidas por estresse, melhor caracterizadas por pré- condicionamento isquêmico. Pré-condicionamento elicita mudanças funcio- nais e estruturais adaptativas que reduzem ou previnem dano de estresses subseqüentes. Mudanças epigenéticas resultantes de tal "condicionamento de estresse" alteram padrões de expressão de gene, afetando ambos a res- posta de estresse aguda e sua resolução, e estabelecendo proteção durável. A presente invenção demonstra que ECP pode elicitar tal resposta, refor- çando capacidades celular e organismal para estresse. No tratamento de doença preexistente, ECP elicita uma resolução mais rápida de patologia através de uma forma de pós-condicionamento, onde mudanças fisiológicas elicitadas pelo regime de condicionamento permitem reparo e um retorno mais rápido para homeostase.

Exemplos de condicionamento de estresse de respostas imunes foram relatados. Dados experimentais mostram que condicionamento com estressores exógenos é possível, mas as opções são inerentemente arrisca- das. Por exemplo, regimes de isquemia, irradiação, hiper- ou hipotermia, anestesia, exposição de endotoxina-, adjuvante- ou patógeno e fármacos relativamente tóxicos mostraram eficácia em modelos animais e alguns tes- tes clínicos.

O meio através do qual condicionando pode ser seguramente conseguido tem eludido investigadores e clínicos por décadas. Foi agora mostrado que ECP provê os meios para atingir este objetivo.

A presente invenção mostra que a resposta a estresse pode ser seguramente modulada, revelando uma abordagem de tratamento nova e novos alvos de fármaco para doenças afetando milhões de pessoas em todo o mundo e demonstra uma nova ligação entre respostas a estresse e o sis- tema imune. Infusão de célula apoptótica (AC), como em ECP, é conhecida induzir Treg e células dendríticas tolerogênicas, mas depois da eliminação forçada de AC (eferocitose), o mecanismo de indução não é claro. A presen- te invenção mostra que várias classes de compostos, notavelmente rapami- cina, antioxidantes e Celastrol, foram sinergísticas com AC in vitro. Esses fármacos modificam respostas a estresse, e a presente invenção mostra que eferocitose pode também. Na verdade, infusão de AC alterou os perfis de expressão de genes responsivos a estresse e metabólicos in vivo e em célu- las dendríticas in vivo. Um exemplo é a proteína extracelular trombospondi- na-1. TSP-1 é responsiva a estresse (Zebo e outro (2005); e Favier e outros (2005)), é liberada por ambas as células apoptóticas e fagocíticas e foi mos- trada gerar APCs tolerogênicas e Tregs in vitro através de interações de re- ceptor específicas. Krispin e outros (2006); e Grimbert e outros (2006). Con- firmação dessas constatações in vitro mostra que o efeito é dependente do método de indução de apoptose. Genes de controle metabólico foram exa- minados também. Uma vez que estressores têm efeitos significantes sobre o sistema imune, evidenciados por mudanças em expressão de gene e meta- bolismo de energia (Fox e outros (2005)), marcadores no soro de metabo- lismo de energia são aqui mostrados para mudar em resposta à ECP. Na verdade, as concentrações de insulina, glucagon e IGF-1 foram moduladas por ECP de uma maneira dependente da dose e tempo em camundongos tratados. Dado que os animais com metabolismo desregulado podem ter respostas de pré-condicionamento anormais (Katakam e outros, (2006)) a requerente examinou expressão de gene em cursos relevantes, incluindo enzimas do curso biossintético de hexosamina (HBP). Expressão de O- GIcNAcase é responsiva à eferocitose, e sua inibição ou aquela da enzima do HBP contra-reguladora O-GIcNAc transferase significantemente altera tolerogênese in vitro. Kudlow (2006); e Dauphinee e outros (2005). Especifi- camente, PUGNAc e Estreptozocina, inibidores de O-GIcNAcase1 potenciali- zam o efeito de AC, enquanto inibição de OGT com Alloxan completamente o reverte. O HBP é responsivo a estresse, e está implicado em quimiotaxia de neutrófilo. Zachara e outros (2004); e Kneass e outros (2005). A modula- ção simultânea de tolerância imune e respostas de estresse pelo HBP era até agora desconhecida e tem implicações poderosas, incluindo novos insi- ghts para patologias comuns em distúrbios metabólicos, neurológicos e car- diovasculares. Lehman e outros (2005); Katakam e outros (2006); Mattson e outros (1999); e Hashizuma e outros (2006).

Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados intercomutavel- mente e referem-se a um animal, de preferência um mamífero e com mais preferência um ser humano.

Uma "população de célula" geralmente inclui um tipo de célula encontrado no sangue. O termo pode incluir um ou mais tipos de células sangüíneas, especificamente, células sangüíneas vermelhas, plaquetas e células sangüíneas brancas. Uma população de célula pode compreender subtipos de células sangüíneas brancas, por exemplo, células T, células dendríticas, células B, etc. Em uma modalidade, uma população de célula pode compreender uma mistura ou grupo de tipos de célula. Alternativamen- te, uma população de célula pode compreender um tipo substancialmente purificado de células, por exemplo, células T ou células dendríticas (DCs).

"Procedimento de ECP" ou "ECP" refere-se à fotoferese extra- corpórea, também conhecida como fototerapia extracorpórea. Ela é um tra- tamento de população de células que foi submetida à luz UVA e um compos- to fotoativável. De preferência a população de células é de um órgão ou te- cido; com mais preferência, a população de células é uma porção de san- gue; e com mais preferência, a população de células é uma camada de célu- las brancas. ECP é algumas vezes usada para se referir a um processo on- de uma população de célula foi submetida a um procedimento de indução de apoptose com luz UVA na presença de um agente de reticulação de DNA tal como um psoraleno (de preferência 8-MOP).

Na modalidade mais preferida da invenção, ECP é usada. Méto- dos de uso de ECP para induzir apoptose e uso das células são descritos na US20050163778. Isto envolve um composto fotoativável adicionado a uma população de célula ex vivo. O composto fotossensível pode ser administra- do a uma população de célula compreendendo células sangüíneas seguindo sua retirada do indivíduo, recipiente ou doador, conforme for o caso, e antes da ou contemporaneamente com exposição à luz ultravioleta. O composto fotossensível pode ser administrado a uma população de célula compreen- dendo sangue integral ou uma fração dele contanto que as células sanguí- neas alvo ou componentes do sangue recebam o composto fotossensível. Em outra modalidade, uma porção do sangue do indivíduo, sangue do reci- piente ou do sangue do doador poderia ser primeiro processada usando mé- todos conhecidos para substancialmente remover os eritrócitos e o compos- to fotoativo pode ser então administrado à população de célula resultante compreendendo a fração de leucócito enriquecida.

Em uma modalidade alternativa, o composto fotoativável pode ser administrado in vivo. O composto fotossensível, quando administrado a uma população de célula compreendendo o sangue do indivíduo, sangue do recipiente ou sangue do doador, conforme for o caso, pode, in vivo, ser ad- ministrado oralmente, mas também pode ser administrado intravenosamente e/ou através de outras vias de administração convencionais. A dosagem oral do composto fotossensível pode estar na faixa de cerca de 0,3 a cerca de 0,7 mg/kg, mais especificamente, cerca de 0,6 mg/kg. Quando administrado oralmente, o composto fotossensível pode ser administrado pelo menos cer- ca de uma hora antes do tratamento de fotoferese e não mais do que cerca de três horas antes do tratamento de fotoferese.

Compostos fotoativáveis para uso de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, compostos conhecidos como psoralenos (ou furocumarinas) bem como derivados de psoraleno tal como aqueles descritos nas, por exemplo, US4321919 e US5399719. Compostos preferidos incluem 8-metoxipsoraleno; 4,5',8-trimetilpsoraleno; 5-metoxipso- raleno; 4-metilpsoraleno; 4,4-dimetilpsoraleno; 4,5'-dimetilpsoraleno; 4'-ami- nometil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4',8- metoxipsoraleno; e um 4'-(omega-amino-2-oxa)alquil-4,5',8-trimetilpsoraleno, incluindo, mas não limitado a, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. Em uma modalidade, o composto fotossensível que pode ser usado com- preende o derivado de psoraleno, amotosaleno (S-59) (Cerus, Corp., Con- cord, CA). Em outra modalidade, o composto fotossensível compreende 8- metoxipsoraleno (8 MOP).

A população de célula à qual o composto fotoativável foi adicio- nado é tratada com uma luz de um comprimento de onda que ativa o com- posto fotoativável. A etapa de tratamento que ativa o composto fotoativável é de preferência realizada usando luz ultravioleta de comprimento de onda longo (UVA), por exemplo, em um comprimento de onda dentro da faixa de 320 a 400 nm. A exposição à luz ultravioleta durante o tratamento de fotofe- rese é de preferência administrada por uma duração de tempo suficiente para aplicar cerca de 1 -2 J/cm2 à população de célula.

Aparelhos de fotoferese extracorpórea úteis nos métodos de a- cordo com a invenção incluem aqueles fabricados pela Therakos, Inc., (Ex- ton, Pa.), sob a nome UVAR®. Uma descrição de tal aparelho é encontrada na US4683889. O UVAR® System usa um sistema de tratamento e consiste em três fases incluindo: 1) a coleta de uma fração de camada branca (rica em leucócito), 2) irradiação da fração de camada branca coletada e 3) rein- fusão das células sangüíneas brancas tratadas. A fase de coleta tem seis ciclos de etapas de retirada, centrifugação e reinfusão de sangue. Durante cada ciclo, sangue integral é centrifugado e separado em uma bacia de fere- se. A partir desta separação, plasma (volume em cada ciclo é determinado pelo operador do instrumento UVAR®) e 40 ml de camada branca são guar- dados em cada ciclo de coleta. As células vermelhas e todo o plasma adi- cional são reinfundidos no paciente antes de começar o próximo ciclo de coleta. Finalmente, um total de 240 ml de camada branca e 300 ml de plas- ma são separados e guardados para irradiação por UV.

A irradiação do sangue enriquecido com leucócito dentro do cir- cuito de irradiação começa durante a coleta da camada branca do primeiro ciclo de coleta. O plasma e a camada branca coletados são misturados com 200 ml de solução salina normal heparinizada e 200 mg de UVADEX® (8- metoxipsoralina solúvel em água). Esta mistura flui em uma camada de 1,4 mm de espessura através da Câmara de Fotoativação PHOTOCEPTO®, que é inserida entre dois bancos de lâmpadas UVA da PHOTOSETTE®. Lâmpa- das UVA PHOTOSETTE® irradiam ambos os lados desta câmara PHOTO- CEPTOR® transparente à UVA, permitindo uma exposição de 180 minutos à luz ultravioleta A, dando uma exposição média por linfócito de 1-2 J/cm2. A preparação de camada branca final contém uma estimativa de 20% a 25% do componente de célula mononuclear de sangue periférico total e tem um hematócrito de 2,5% a 7%. Seguindo o período de fotoativação, o volume é reinfundido ao paciente durante um período de 30 a 45 minutos. A US20030181305 descreve outro sistema para uso na administração de ECP. Os US5951509; US5985914; US5984887; US4464166; US4428744; US4398906; US4321919; W097/36634; e WO 97/36581 também contêm descrição de dispositivos e métodos úteis com relação a isso.

Outro sistema que pode ser útil nos métodos da presente inven- ção é descrito na US6793643. Este sistema inclui um aparelho através do qual o volume de fluido líquido coletado ou removido de um indivíduo pode ser reduzido durante ECP. A quantidade eficaz de energia de luz que é apli- cada a uma população de célula pode ser determinada usando os métodos e sistemas descritos na US6219584.

Uma variedade de outros métodos para indução de apoptose em uma população de célula é bem conhecida e pode ser adotada para uso na presente invenção. Um tal tratamento compreende submeter uma população de célula à radiação por ionização (raios γ, raios x, etc.) e/ou radiação ele- tromagnética não-ionizante incluindo luz ultravioleta, aquecimento, esfria- mento, privação de soro, privação de fator de crescimento, acidificação, dilu- ição, alcalização, mudança de resistência tônica, privação de soro, irradiação ou uma combinação delas. Alternativamente, apoptose pode ser induzida submetendo uma população de célula a ultra-som.

Ainda outro método de indução de apoptose compreende a apli- cação extracorpórea de estresse oxidativo a uma população de célula. Isto pode ser conseguido tratando a população de célula, em suspensão, com agentes oxidantes químicos tal como peróxido de hidrogênio, outros peróxi- dos e hidroperóxidos, ozônio, permanganatos, periodatos e similar. Agentes de oxidação biologicamente aceitáveis podem ser usados para reduzir pro- blemas potenciais associados com resíduos e contaminações da população de célula induzida por apoptose então formada.

Na preparação de uma população de célula induzida por apop- tose, deve ser tomado cuidado para não aplicar níveis excessivos de estres- se oxidativo, radiação, tratamento de fármaco, etc., porque de outro modo pode haver um risco significante de causar necrose de pelo menos algumas das células sob tratamento. Necrose causa ruptura da membrana celular e a liberação de conteúdos celulares freqüentemente com resultados biologica- mente prejudiciais, particularmente eventos inflamatórios, de modo que a presença de células necróticas e seus componentes junto com a população de célula compreendendo células apoptóticas é melhor evitada. Níveis apro- priados de tratamento da população de célula para induzir apoptose e o tipo de tratamento escolhido para induzir apoptose são prontamente determiná- veis por aqueles versados na técnica.

Um processo de acordo com a presente invenção envolve a cul- tura de células do indivíduo ou uma linhagem de célula de mamífero compa- tível. As células culturadas podem então ser tratadas extracorporeamente para induzir apoptose e criar uma população de célula nelas. O tratamento extracorpóreo pode ser selecionado do grupo consistindo em anticorpos, agentes quimioterapêuticos, radiação, fotoferese extracorpórea, ultra-som, proteínas e agentes oxidantes. As células, suspensas no plasma do indiví- duo ou outro meio de suspensão adequado, tal como solução salina ou um meio de cultura de célula de mamífero equilibrado, podem então ser admi- nistradas ao paciente.

Métodos para a detecção e quantificação de apoptose são úteis para determinação da presença e nível de apoptose na preparação a ser administrada ao indivíduo na presente invenção. O número de células apop- tóticas em uma população de célula requerida para obter o benefício clínico requerido em um indivíduo pode variar dependendo da fonte de células, da condição do indivíduo, da idade e peso do indivíduo e outros fatores relevan- tes, que são prontamente determináveis através de outros métodos bem co- nhecidos. De preferência, o número de células apoptóticas que são adminis- tradas a um paciente são 0,1 a 50 bilhões, com mais preferência 1 a 10 e com mais preferência 2,5 a 7,5 bilhões.

Em uma modalidade, células sofrendo apoptose podem ser iden- tificadas por uma fragmentação "ladderinçf de DNA característico visto em eletroforese em gel de agarose, resultante da clivagem de DNA em uma sé- rie de fragmentos. Em outra modalidade, a expressão de superfície de fosfa- tidilserina em células pode ser usada para identificar e/ou quantificar uma população de célula induzida por apoptose. Medição de mudanças em po- tencial de membrana mitocondrial, refletindo mudanças em permeabilidade de membrana mitocondrial, é outro método reconhecido de identificação de uma população de célula. Vários outros métodos de identificação de células sofrendo apoptose e de uma população de célula, muitos usando anticorpos monoclonais contra marcadores específicos para uma população de célula, foram também descritos na literatura científica.

Modificação de terapia de ECP para otimizar o efeito de ECP sobre resposta a estresse, talvez através do curso de hexosamina, oferece- ria novas oportunidades terapêuticas. Otimizando ECP para melhor modular o sistema imune através desta "resposta a estresse integrada" (ISR, também conhecida como a resposta de proteína não-enovelada", "estresse de retícu- lo endoplásmico (ER)" e outros nomes) expande ECP para estados de do- ença previamente não-examinados onde esta resposta a estresse é acredi- tada desempenhar um papel patológico. Essas doenças incluem patologias da maioria dos sistemas de órgão, que são atualmente intratáveis e tipica- mente fatais. Este modo de ação envolve condicionamento de células para tolerar estresse através da administração única ou repetida de um número adequado de células apoptóticas, que serve como um estressor de nível bai- xo para o sistema imune. Estudos anteriores mostraram que outros estresso- res podem induzir tal pré-condicionamento, mas esses estressores seriam provavelmente inseguros como tratamentos. Deste modo ECP, uma terapia comercializada segura e eficaz provê um método para especificamente mo- dificar a resposta de estresse e alterar progressão ou suscetibilidade à doença.

Esta resposta a estresse é induzida por vários estímulos que evocam sinais indicativos de estresse do ER impondo demanda ao ER que não está preparado para lidar naquele momento do estímulo. Esses estres- sores incluem condições onde uma perda de controle celular do hospedei- ro/paciente de expressão de proteína acontece. Isto inclui vários eventos de sinalização celular que levam à disfunção do ER (isto é, uma taxa de tradu- ção de proteína que excede a capacidade celular em modificar ou de outro modo apropriadamente processar proteínas). Parece que este condiciona- mento de resposta a estresse é induzido não apenas nas células que reali- zam fagocitose na célula apoptótica, mas também como um resultado de sinalização dessas células para outros tecidos de uma maneira que propaga sinal(ais) que um grande estresse está presente. Tal resposta requer uma mudança adaptativa pelos tecidos afetados para apropriadamente se recu- perarem dos estresses iniciando ou conseqüentes sob os quais o sistema é provável sofrer. Deste modo, a presente invenção estende o uso de ECP a doenças infecciosas e terapias relacionadas incluindo infecção viral, (isto é, exposição a RNA de filamento duplo patológico ou terapeuticamente induzi- do), em terapia de câncer onde transformação ambos induz estresse de ER e não leva em conta as respostas de morte celular e reparadoras normais, em doenças renais associadas com enovelamento errado ou superexpres- são de proteína, e doenças fibróticas onde vários estímulos induzem a su- perexpressão de proteínas de matriz extracelular e crescimento exagerado de célula.

A presente invenção expande o uso de regimes terapêuticos existentes a estados de doenças incluindo doenças de agregação de proteí- na incluindo, sem limitação, doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Coréia de Huntington; e doenças debilitantes incluindo, sem limitação, as encefalopatias espongiformes de infecção por Príon e doença Creutzfeldt- Jacob variante herdada ("vCJD"). Doenças relacionadas a estresse metabó- Iicas e imunes que envolvem resistência à insulina e defeitos em células se- cretoras incluindo diabetes, Síndrome Metabólica e outras patologias rela- cionadas com obesidade foram relacionadas à resposta de proteína não- enovelada, e são então tratáveis para terapia com ECP. Isto inclui, sem limi- tação, aterosclerose e doenças cardiovasculares relacionadas onde super- produção celular de proteínas leva à deposição patológica de proteínas e seus agregados, e doenças de qualquer uma das células secretoras que produzem em excesso proteínas como parte de suas histórias naturais nor- mais ou patológicas. Células freqüentemente consideradas entre esta cate- goria secretora incluem, sem limitação, células beta pancreáticas, tecidos da próstata, células imunes que secretam quantidades significantes de imuno- globulina (isto é, células de plasma) ou outras proteínas (isto é, produção de interferon gama por célula dendrítica) e células secretoras mucosais (isto é, células secretando mucina no trato gastrintestinal e vias aéreas).

Células que são estimuladas para alterar seu fenótipo para pro- duzir quantidades grandes de proteína podem ser afetadas por esse estres- se, e doenças onde uma disfunção nesta capacidade de produção resulta de uma resposta patológica a esse estresse provêem tecidos alvo adicionais para os quais ECP provê benefício terapêutico. Isto inclui, sem limitação, células de produção de enzima do fígado e estômago, neurônios de secre- ção de peptídeo e tecidos neuroendócrinos, e células que são estimuladas para secretar matriz extracelular e proteínas de remodelagem de tecido em resposta à lesão (isto é, em cicatrização de ferida, resposta a dano por radi- ação).

Qualquer célula exposta a estresse por temperatura ou estresse oxidativo pode requerer uma resposta a estresse apropriada, e condiciona- mento de ECP pode agora beneficiar muitos tais casos, uma vez que tal condicionamento pode prover resistência a dano ou aumentar o reparo de dano resultante de tais estresses. Então várias exposições a insultos ambi- entais que dão espécies reativas de oxigênio, peroxinitrilas ou outros estres- ses oxidativos são um alvo de terapia de ECP. Isto incluindo, sem limitação, envenenamento (isto é, com agroquímicos tal como paraquate), exposição à radiação, exercício extremo, quimioterapia, anestesia, exposições hiperbári- cas, pré-condições genéticas que elicitam espécies reativas de oxigênio (isto é, aquelas produzidas pelo sistema de sinalização de receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta ("PDGF")) e trauma.

Alterações em metabolismo celular que resultam de respostas a estresse são conhecidas por afetar transporte celular de moléculas peque- nas em adição a alterar tráfico de proteína. Perfis de expressão de gene mostram que ECP altera beneficamente a expressão de transportadores de resistência a multifármaco ("MDR"). ECP otimizada altera a expulsão de fár- macos da célula limitando ou alterando a expressão de bombas e transpor- tadores de MDR1 deste modo afetando a resistência a fármaco (isto é, em quimioterapia de câncer ou tratamentos antibióticos/antivirais). Em outros casos ECP pode ser otimizada para aumentar a absorção de fármacos na célula.

Uma hipótese amplamente aceita diz que o processo de enve- lhecimento é dirigido pelo efeito cumulativo de estresse oxidativo sobre um organismo. Restrição calórica foi mostrada prolongar o tempo de vida em parte ao alterar respostas celulares a estresse oxidativo ou a geração deste estresse por metabolismo normal ou excesso. Dado que a resposta a es- tresse induzida por ECP envolve mecanismos similares àqueles induzidos por restrição calórica, ECP modifica os efeitos do envelhecimento.

Métodos existentes podem ser usados para permitir esta otimi- zação de ECP. Primeiro, a resposta a estresse integrada induz união alter- nativa em vários transcritos conhecidos, incluindo transcritos diretamente envolvidos no processo reparador e parada traducional característicos desta resposta a estresse, e a alternativa apoptótica a reparo que segue quando a célula é incapaz de superar o estresse do ER.

União alternativa de mRNA Xbp-1 foi mostrada ocorrer na res- posta a estresse, e pode ser medida através de qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, PCR quantitativa usando biópsias de sangue periférico ou tecido fino. Alternativamente, monitoramento da ativi- dade de mTOR serve como um biomarcador da resposta a estresse, uma vez que respostas a estresse caracterizadas até agora sinalizam através do curso de mTOR. A fosforilação de S6 cinase, o substrato a jusante imediato de mTOR, tem sido usada como um marcador farmacodinâmico para moni- torar imunossupressão em pacientes sofrendo tratamento com Rapamicina. Embora trabalhos publicados descrevam um método Western blot, reagen- tes estão disponíveis que foram demonstrados ser úteis na atividade de mTOR de análise citométrica em linhagens celulares. Monitoramento da ati- vidade de mTOR em sangue periférico é possível usando métodos conheci- dos na técnica, incluindo, sem limitação, citometria de fluxo e imunohisto- química. Conforme mostrado nos Exemplos providos aqui, monitoramento da resposta a condições de ECP diferentes usando biomarcadores da res- posta de estresse e apoptose provê um método para determinar a eficácia de ECP em doenças e condições relacionadas a estresse. Ao alterar a dose celular e regime de dosagem usando esses biomarcadores, é possível apli- car ECP com uma precisão clínica anteriormente não conseguida. Isto ma- ximiza o potencial terapêutico de ECP como uma terapia única e permite a otimização da combinação de ECP com outras farmacoterapias imunomodu- ladoras e regimes de tratamento.

Um biomarcador são quaisquer indícios do nível de expressão de um gene Marcador indicado. Os indícios podem ser diretos ou indiretos e medem super- ou subexpressão do gene dados os parâmetros fisiológicos e em comparação com um controle interno, tecido normal ou outro carcinoma. Biomarcadores incluem, sem limitação, ácidos nucléicos (ambos super- e subexpressão e diretos e indiretos). Uso de ácidos nucléicos como Biomar- cadores pode incluir qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, medição de amplificação de DNA, RNA, micro-RNA, perda de he- terozigosidade (LOH), polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs, Brooker (1999)), DNA microssatélite, hipo- ou hipermetilação de DNA. Uso de proteí- nas como Biomarcadores inclui qualquer método conhecido na técnica inclu- indo, sem limitação, medição da quantidade, atividade, modificações tal co- mo glicosilação, fosforilação, ribosilação de ADP, ubiquitinação, etc, ou imu- noistoquímica (IHC). Outros biomarcadores incluem imagem, contagem celu- lar e Marcadores de apoptose.

Um ácido nucléico Marcador corresponde à seqüência designa- da por uma SEQ ID NO quando ele contém esta seqüência. Um segmento ou fragmento de gene corresponde à seqüência de tal gene quando ele con- tém uma porção da seqüência referida ou seu complemento suficiente para distingui-la como sendo a seqüência do gene. Um produto de expressão de gene corresponde a tal seqüência quando seu RNA, mRNA, miRNA ou cD- NA hibridiza para a composição tendo tal seqüência (por exemplo, uma son- da) ou, no caso de um peptídeo ou proteína, ele é codificado por tal mRNA. Um segmento ou fragmento de um produto de expressão de gene corres- ponde à seqüência de tal gene ou produto de expressão de gene quando ele contém uma porção do produto de expressão de gene referido ou seu com- plemento suficiente para distingui-lo como sendo a seqüência do gene ou produto de expressão de gene.

Os métodos, composições, artigos e estojos da invenção descri- tos e reivindicados no presente pedido incluem um ou mais genes Marcado- res. "Marcador" ou "gene Marcador" é usado em todo o relatório para se re- ferir a genes e produtos de expressão de gene que correspondem com qual- quer gene cuja super- ou subexpressão está associada com uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória.

A presente invenção provê ainda microdisposições e gene chips para realização dos métodos descritos aqui.

A presente invenção provê ainda portfólios de diagnósti- co/prognóstico contendo reagentes adequados para medição de Biomarca- dores tal como seqüências de ácido nucléico isoladas, seus complementos ou suas porções ou uma combinação de genes conforme descrito aqui onde a combinação é suficiente para medir ou caracterizar expressão de gene em uma amostra biológica.

Qualquer método descrito na presente invenção pode ainda in- cluir medição da expressão de pelo menos um gene constitutivamente ex- presso na amostra.

A invenção provê ainda um método para provisão de direção de terapia através da identificação de uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória de acordo com os métodos descritos aqui e identificação do tra- tamento apropriado para ela.

A invenção provê ainda um método para provisão de um prog- nóstico através da identificação de uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória de acordo com os métodos descritos aqui e identificação do prognóstico correspondente para ela.

A invenção provê ainda um método para encontro de Biomarca- dores compreendendo determinação do nível de expressão de um gene Marcador, medição de um Biomarcador para o gene Marcador para determi- nar sua expressão, análise da expressão do gene Marcador de acordo com os métodos descritos aqui e determinação de se o gene Marcador é eficaz- mente específico para uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória.

A invenção provê ainda estojos, artigos, microdisposições e ge- ne chip, portfólios de diagnóstico/prognóstico para condução dos ensaios descritos aqui e relatos de pacientes para relatório dos resultados obtidos pelos presentes métodos.

A mera presença ou ausência de seqüências de ácido nucléico particulares em uma amostra de tecido foi raramente verificada ter valor di- agnóstico ou prognóstico. Informação sobre a expressão de várias proteínas, peptídeos ou mRNA, por outro lado, está sendo vista cada vez mais como importante. A mera presença de seqüências de ácido nucléico tendo o po- tencial em expressar proteínas, peptídeos ou mRNA (tal como seqüências referidas como "genes") dentro do genoma por si só não é determinante de se uma proteína, peptídeo ou mRNA é expresso em uma dada célula. Se ou não um dado gene capaz de expressar proteínas, peptídeos ou mRNA o faz e até qual ponto tal expressão acontece, se acontece, são determinados por uma variedade de fatores complexos. Sem importar as dificuldades na com- preensão e avaliação desses fatores, ensaio de expressão de gene pode prover informação útil sobre a ocorrência de eventos importantes tal como respostas relacionada a estresse ou inflamatória, e outros fenômenos clini- camente relevantes. Indicações relativas do grau até o qual os genes são ativos ou inativos podem ser encontradas em perfis de expressão de gene.

Métodos preferidos para estabelecimento dos perfis de expres- são de gene incluem determinação da quantidade de RNA que é produzida por um gene que pode codificar uma proteína ou peptídeo. Isto é realizado através de PCR de transcriptase reversa (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR de tempo real, RT-PCR de display diferencial, análise Northern Blot e outros testes relacionados. Embora seja possível conduzir essas técnicas usando reações de PCR individuais, é melhor amplificar DNA complementar (cDNA) ou RNA complementar (cRNA) produzido a partir de mRNA e anali- sá-lo através de microdisposição. Várias configurações de disposição dife- rentes e métodos para sua produção são conhecidos daqueles de habilidade na técnica e são descritos, por exemplo, 5445934; 5532128; 5556752; 5242974; 5384261 ; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327;

5472672; 5527681 ; 5529756; 5545531; 5554501 ; 5561071; 5571639; 5593839; 5599695; 5624711 ; 5658734; e 5700637.

Tecnologia de microdisposição permite medição do nível de mRNA ou miRNA de estado uniforme de milhares de genes simultaneamen- te provendo uma ferramenta poderosa para identificação de efeitos tal como o início ou modulação de uma resposta relacionada a estresse ou inflamató- ria. Duas tecnologias de microdisposição estão atualmente em amplo uso, disposições de cDNA e oligonucleotídeo. Embora diferenças existam na construção desses chips, essencialmente toda análise de dados a jusante e resultado são iguais. O produto dessas análises são tipicamente medições da intensidade do sinal recebido de uma sonda marcada usada para detec- tar uma seqüência de cDNA da amostra que hibridiza para uma seqüência de ácido nucléico em um local conhecido na microdisposição. Tipicamente, a intensidade do sinal é proporcional à quantidade de cDNA, e então mRNA ou miRNA, expresso nas células de amostra. Um grande número de tais técnicas está disponível e útil. Métodos preferidos podem ser encontrados nos 6271002; 6218122; 6218114; 6004755; e Keene e outros (2006) RIP- Chip: the isolation and identification of mfíNAs, microRNAs e protein compo- nents of ribonucleoprotein complexes from cell extracts Nature Protocols 1:302-307.

Análise dos níveis de expressão é conduzida comparando tais intensidades de sinal. Isto é feito melhor através da geração de uma matriz de razão das intensidades de expressão de genes em uma amostra de teste versus aquelas em uma amostra controle. Por exemplo, as intensidades de expressão de gene de um tecido doente podem ser comparadas com as in- tensidades de expressão geradas de tecido normal do mesmo tipo. Uma ra- zão dessas intensidades de expressão indica as vezes em expressão de gene entre as amostras de teste e controle. A seleção pode ser baseada em testes estatísticos que produ- zem listas classificadas com relação à evidência de significância para cada expressão diferencial de gene entre fatores relacionados a uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória. Exemplos de tais testes incluem ANOVA e Kruskal-Wallis. As classificações podem ser usadas como ponde- rações em um modelo projetado para interpretar a soma de tais pesos, até um ponto de corte, como a preponderância de evidência em favor de uma classe sobre outra. Evidência anterior conforme descrito na literatura pode também ser usada para ajustar as ponderações.

Perfis de expressão de gene podem ser mostrados de várias maneiras. A mais comum é dispor intensidades de fluorescência brutas ou matriz de razão em um dendograma gráfico onde colunas indicam amostras de teste e fileiras indicam genes. Os dados são dispostos de modo que ge- nes que têm perfis de expressão de gene similares estão próximos uns dos outros. A razão de expressão para cada gene é visualizada como uma cor. Por exemplo, a razão menos do que um (sub-regulagem) aparece na porção azul do espectro, enquanto a razão maior de que um (supra-regulagem) apa- rece na porção vermelha do espectro. Programas de software de computa- dor comercialmente disponíveis estão disponíveis para mostrar tais dados incluindo "GeneSpring" (Silicon Genetics, Inc.) e "Discovery" e "lnfer" (Par- tek, Inc.).

No caso de medição de níveis de proteína para determinar expressão de gene, qualquer método conhecido na técnica é adequado con- tanto que ele resulte em especificidade e sensibilidade adequadas. Por exemplo, níveis de proteína podem ser medidos ligando a um anticorpo ou fragmento de anticorpo específico para a proteína e medindo a quantidade de proteína ligada a anticorpo. Anticorpos podem ser marcados por reagen- tes radioativos, fluorescentes ou outros detectáveis para facilitar detecção.

Métodos de detecção incluem, sem limitação, técnicas de ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima (ELISA) e immunoblot.

Os perfis de expressão de gene da presente invenção podem ser também usados em conjunto com outros métodos de diagnóstico não- genéticos úteis em diagnóstico, prognóstico ou monitoramento de tratamen- to. Por exemplo, em algumas circunstâncias é benéfico combinar o poder de diagnóstico dos métodos baseados em expressão de gene descritos acima com dados de Marcadores convencionais tal como Marcadores de proteína do soro. Em tal método, sangue é periodicamente tomado de um paciente e então submetido a um imunoensaio de enzima para um Marcador de soro tal como albumina. Quando a concentração do Marcador sugere a probabilida- de de uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória, uma fonte de amostra condescendente à análise de expressão de gene é obtida. Esta a- bordagem pode ser particularmente útil quando outro teste produz resultados ambíguos.

Estojos feitos de acordo com a invenção incluem ensaios forma- tados para determinação da expressão de Biomarcador. Esses podem incluir todos ou alguns dos materiais necessários para conduzir os ensaios tal co- mo reagentes e instruções e um meio através do qual Biomarcadores são ensaiados.

Artigos da presente invenção incluem representações da ex- pressão do Biomarcador útil para tratamento, diagnóstico, prognóstico e de outra forma avaliação de doenças. Essas representações de perfil são redu- zidas para um meio que pode ser automaticamente lido por uma máquina tal como meios lidos por computador (magnéticos, ópticos e similar). Os artigos podem também incluir instruções para avaliação dos perfis de expressão de gene em tais meios. Por exemplo, os artigos podem compreender um CD ROM tendo instruções de computador para comparação de perfis de expres- são de gene dos portfólios de genes descritos acima. Os artigos podem também ter perfis de expressão de gene digitalmente registrados neles de modo que eles podem ser comparados com dados de expressão de gene de amostras de paciente. Alternativamente, os perfis podem ser registrados em formato representacional diferente. Um registro gráfico é um tal formato. Al- goritmos de agrupamento tal como aqueles incorporados ao softwares "DIS- COVERY" e "INFER" da Partek, Inc., mencionados acima podem auxiliar melhor na visualização de tais dados. Tipos diferentes de artigos de fabricação de acordo com a in- venção são meios ou ensaios formatados usados para revelar perfis de ex- pressão de gene. Esses podem compreender, por exemplo, microdisposi- ções onde complementos ou sondas de seqüência são afixados a uma ma· triz à qual as seqüências indicativas dos genes de interesse combinam cri- ando um determinante de sua presença que pode ser lido. Alternativamente, artigos de acordo com a invenção podem ser criados em estojos de reagente para condução de hibridização, amplificação e geração de sinal indicativas do nível de expressão dos genes de interesse para previsão ou monitora- mento de uma resposta relacionada a estresse ou inflamatória.

Os Exemplos que seguem são providos para ilustrar, mas não limitar, a invenção. Todas as referências citadas aqui são então incorpora- das aqui a título de referência. Exemplo 1

Fotoferese extracorpórea é uma terapia celular imune inovadora aprovada nos Estados Unidos para o tratamento paliativo de Iinfoma cutâneo de célula T (CTCL) e na Europa para o tratamento de CTCL e condições imunomediadas, incluindo doença enxerto vs. hospedeiro, esclerose sistêmi- ca, artrite reumatóide, doença de Crohn, HIV e transplante de órgão sólido. Suri e outros (2006). Fotoferese da Therakos emprega um dispositivo de aférese de teste rápido (point of care) conectado ao paciente, estéril, de anel fechado, que retira e isola aproximadamente 3-5% de células mononuclea- res de sangue periférico em circulação (PBMC). As células coletadas são tratadas ex vivo com o agente de sensibilização de UV 8-metoxipsoraleno (UVADEX®), que é então ativado pela exposição à UV-A e retornado rapi- damente para o paciente (Vide Figura 1). Células tratadas com ECP subse- qüentemente morrem através de apoptose (uma forma de morte de célula programada). A reinfusão intravenosa de células apoptóticas (AC) foi mos- trada sub-regular respostas imunes através da modulação de citocinas, a geração de células dendríticas tolerogênicas (DCs) e a geração de Treg. Me- Ioni e outros (2007). Exemplo 2

A ação antiinflamatória de ECP em modelos de camundongo

Foi mostrado pela requerente que ECP reduz processos inflama- tórios associados com hiper-responsividade da via área induzida por OVA em camundongos. Conforme mostrado na Figura 2, doses altas de células tratadas com ECP têm uma habilidade dependente da dose em reduzir cons- trição da via aérea (painel da esquerda) e patologia inflamatória (infiltrados de célula imune, painel da direita) após provocação antigênica de camun- dongos sensibilizados com OVA. Dose de ECP e freqüência de tratamento foram estudadas em ambos modelos de camundongo. Coletivamente, os dados demonstram que dose de célula de ECP e freqüência de tratamento altas estão associadas com melhores resultados, especialmente se ECP for dada antes do estabelecimento de respostas imunes significantes.

Exemplo 3

ECP em modelos de camundongo de Diabetes

A eficácia de ECP em modelos de camundongo de diabetes foi relatada. Marks e outros (1991). Os estudos anteriores mostraram uma inci- dência reduzida de diabetes em camundongos NOD/Lt e NOD/Wehi tratados com ciclofosfamida usando aplicação semanal de células tratadas com ECP. A experiência da requerente em modelos de murino de diabetes é similar. Camundongos NOD/LtJ tratados uma vez por semana com 10 milhões de células, começando em 11 semanas de vida, após dano pancreático ser es- tabelecido, e os camundongos começam a mostrar evidência de diabetes clinicamente evidente. Turley e outros (2003). Não obstante, animais trata- dos com ECP têm níveis de glicose no sangue menores do que controles NOD não-tratados (Figura 3, painel superior). O suplemento nesta figura mostra que a taxa de diabetes em animais não-tratados em 20 semanas de vida é 60%; enquanto apenas dois de nove (22%) dos animais tratados com ECP são diabéticos. Animais tratados com ECP são mais saudáveis em ou- tras considerações. Polidipsia e poliuréia são reduzidas ou ausentes em ca- mundongos tratados com ECP e animais tratados com ECP ganham peso normalmente. Camundongos NOD/LtJ não-tratados, no entanto, mostram uma perda de peso pronunciada (Figura 3, painel inferior, -8% de perda média de peso de peso médio de pico).

Exemplo 4

A requerente realizou estudos para examinar a habilidade de ECP em prevenir dano pancreático em um modelo de Estreptozotocina (STZ) de baixa dose múltipla de T1DM. Como no modelo NOD, níveis de glicose no sangue são menores do que controles em camundongos tratados com 10 milhões de células tratadas com ECP nos dias -7, -3 e O ou dias -3, O e +2 com relação à administração da primeira dose de STZ. Os resultados deste experimento mostram que ECP pode prover proteção substancial de diabetes quimicamente induzido (~=0,1, η = 5-7). Figura 4.

Exemplo 5

Indução de tolerância imune por ECP

Apoptose de células é um evento extremamente comum, mesmo em organismos saudáveis, e serve importantes funções em desenvolvimento e na manutenção de tecidos. Krysko e outros (2006). Apoptose e outras for- mas de morte de célula programada são distinguidas de muitas maneiras da morte necrótica que pode resultar de dano ou infecção. Uma tal distinção é criticamente importante com relação ao sistema imune. Morte de célula que envolve a liberação de teores intracelulares diferentes, como em necrose, tende a evocar uma resposta inflamatória. Este processo, onde "sinais peri- gosos" levam à inflamação, é contrastado pelo sistema homeostático com o que AC são eliminadas por fagócitos sem elicitação de uma resposta infla- matória. Matzinger (2002). De fato, a eliminação de AC elicita a resposta oposta, tolerância imune. Os mecanismos que dirigem este processo não são ainda claros, mas dados recentes destacam dois componentes-chave de indução de tolerância.

AC são eliminadas pelas células apresentando antígeno residen- tes no paciente (APC, por exemplo, iDC e macrófagos). Este processo rapi- damente elimina AC, e leva ao empenho de receptores de superfície celular que sinalizam para ativamente inibir maturação de DC, e reduzir a expressão de moléculas co-estimuladoras e citocinas pró-inflamatórias. Mahnke e ou- tros (2003); e Morelli e outros (2003). Também, há um aumento em produ- ção de citocina antiinflamatória e indução de Treg, todas as quais fazem a mediação de tolerância imune.

Essas propriedades biológicas de células apoptóticas são roti- neiramente exploradas terapeuticamente com ECP, limitando ativa- ção/maturação de DC e então sub-regulando respostas de célula T prejudi- ciais. A hipótese atual explicando o mecanismo de ação de ECP é mostrado na Figura 5. ECP é acreditada elicitar efeitos imunomoduladores, recrutando sistemas endógenos para realizar reparo e resolução.

Exemplo 6

Estudos In vitro de MOA de ECP

Evidência em apoio deste mecanismo é encontrada em estudos examinando a modulação de Funcionamento de DC por células tratadas com ECP in vitro. iDC quiescente estimulada para amadurecer in vitro com ligante CD40 produz níveis reduzidos de IL-12 quando co-culturadas com células tratadas com ECP e estimuladas com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS, Figura 6, painel da esquerda). Resultados similares são vistos para outras citocinas pró-inflamatórias incluindo IL-1 β, IL-6 e TNFa. Por outro la- do, a adição de células tratadas com ECP para ativar culturas de DC estimu- la produção alta de citocina antiinflamatória TGFp (Figura 6, painel da direi- ta). Então o efeito antiinflamatório é duplo, alterando ambos processos pró- e antiinflamatórios.

Exemplo 7

Estudos in vivo

Um modelo de ECP foi desenvolvido em camundongos, permi- tindo a combinação de estudos animais vivos com modelos in vitro. Por e- xemplo, APC isolada dos baços de camundongos administrados com AC tratada com ECP intravenosamente demonstrou uma capacidade reduzida de estimular uma MLR quando co-culturada com células T alogenéicas. Si- milarmente, células T humanas alogenéicas não proliferam tão robustamente quando DCs e células T imaturas são co-culturadas com células tratadas com ECP. Então "alimentação" de AC induz um fenótipo tolerogênico em DCs, reduzindo sua capacidade em estimular resposta de célula T (vide Fi- guras 14 e 15).

Há evidência em camundongos e seres humanos que infusão de AC induz Treg. Maeda e colaboradores mostraram em um modelo de hiper- sensibilidade de contato que modulação imune de ECP é mediada por Treg. Maeda e outros (2005). Kleinclauss e colegas relataram que aplicação intra- venosa de células apoptóticas induz expansão de célula Treg dependente de TGF3 em um modelo de murino de doença enxerto-versus-hospedeiro. Kle- inclauss e outros (2006). Em seres humanos, supra-regulagem de células CD4+ CD25+ é vista em pacientes de transplante de órgão sólido tratados com ECP. Lamioni e outros (2005). Foi mostrado pela requerente que célu- las tratadas com ECP podem dirigir geração de Treg in vitro. Strobl e outros (2006). Treg mantém tolerância periférica ao ativamente inibir respostas imu- nes. Tang e outros (2006). Co-cultura de células tratadas com ECP com cé- lulas T humanas puras por 6-8 dias leva à geração de uma população de célula T que é capaz de suprimir proliferação de célula T e produção de IFNy em um MLR. Isto é ilustrado na Figura 7. Treg gerada por ECP expressa um fenótipo anérgico, que pode ser revertido pela adição de IL-2. Exemplo 8

Respostas a estresse sistêmicas e tolerância imune induzida por ECP

T1DM resulta da destruição autoimune de células β pancreáticas produtoras de insulina por células T e macrófagos que infiltram ilhotas pan- creáticas. Barker (2006). Um fator-chave nesta destruição de células β é a quebra de tolerância imune. Atualmente, há inúmeras terapias imunossu- pressoras sendo testadas que se direcionam a respostas de célula T diabe- togênicas. Ciclosporina, hOKT3Yl(Ala-Ala), anti-CD3 e Rapamicina, que se direcionam a células T, mostraram eficácia em estudos clínicos de pacientes com T1DM. Staeva-Vierira e outros (2007). Muitas dessas estratégias, no entanto, induzem imunossupressão crônica ou têm toxidez associadas que limitam seu uso. Terapias que induzem tolerância e especificamente contro- lam células T auto-reativas são uma opção atraente para prevenção de T1DM. Battaglia e outros (2006). Em particular, estratégias terapêuticas que direcionam a ação de Treg in vivo oferecem uma opção atraente para terapia.

Foi agora mostrado que ECP age como um estressor ambiental de baixo nível, evocando uma resposta parecida com uma resposta de fase aguda. O efeito terapêutico de ECP neste cenário surge de uma forma de "condicionamento de estresse", onde ECP induz respostas adaptativas para prevenir dano adicional e auxiliar na recuperação. Apesar dos pontos finais causadores de doença comuns em diabetes tipo 1 e tipo 2 (isto é, apoptose de célula β) fatores diferentes dirigem o resultado final em cada manifesta- ção de diabetes. Eizirik e outros (2001); e Cnop e outros (2005). Estressores ambientais desempenham um papel em ambas as doenças, sugerindo que responsividade a estresse reforçada poderia alterar processos patogênicos subcelulares. Dahlquist (2006); Ludvigsson (2006); e Knip e outros (2005). ECP é então eficaz no tratamento de doenças que surgem de má adaptação a estresse sustentado, incluindo diabetes.

Estressores ambientais e celulares têm impactos significantes sobre a função imune. O sistema nervoso central (CNS) foi mostrado modu- lar a resposta imune, função pancreática e a suscetibilidade de células a a- gentes diabetogênicos, demonstrando a conexão íntima entre respostas a estresse sistêmicas e efeitos celulares. Flesner (2005); Ader e outros (1992); Morrell e outros (1988); e Coskun e outros (2004). Ligações entre os siste- mas imune e central são bem estabelecidas, e são mais freqüentemente ilustradas por efeitos supressores de estresse crônico sobre imunidade. Des- prezadas, no entanto, são conexões consolidadas (hard-wired) do "reflexo inflamatório", com o que infecção e dano a tecido ativam agudamente com- ponentes da luta ou fuga (fight ou flight response), temporariamente aumen- tando a imunidade inata. Baumann e outros (1994); e Baumann e outros (1990). Estão ação recíproca entre sistemas reguladores principais oferece oportunidades para mau funcionamento e doença, mas também para inter- venção e cura. Nesta seção a requerente apresenta evidência que ECP po- de modular sistemas de resposta a estresse sistêmica e então alterar função imune.

A resposta a estresse sistêmica arquétipa envolve a ativação do eixo Hipotálamo-Pituitária-Adrenal (ΗΡΑ) e outros cursos neuroendócrinos. Esses são processos bem compreendidos, levando a respostas sistêmicas previsíveis da luta ou fuga. Mais geralmente vista como uma resposta a es- tímulo externo (por exemplo, combate ou escape de predação) a ativação desses cursos é essencialmente idêntica quando o estressor surge de den- tro. Por exemplo, a ativação de respostas a estresse neuroendócrino por percepções psicológicas (e erro de percepção) pode gerar a mesma reação fisiológica que o leão hipotético nas moitas, e impacta o sistema imune da mesma maneira. Rohleder e outros (2006); Jara e outros (2006); Leonard (2005); e Gold e outros (2005).

Estresse e inflamação são processos de energia intensiva. A requerente examinou o impacto de tratamento com ECP sobre marcadores endócrinos de metabolismo de energia em camundongos. A requerente rea- lizou imunoensaios multiplex na plataforma Luminex, examinando 59 anali- tos concomitantemente. Consistente com a hipótese de condicionamento de estresse da requerente, concentrações circulantes de vários analitos são afetadas por ECP de uma maneira dependente da dose que varia com o programa de tratamento. A parte principal deste trabalho foi feita em um mo- delo de camundongo de inflamação pulmonar, com o que "pré-tratamento" com ECP foi testado como um profilático para a prevenção de inflamação de provocações antigênicas subseqüentes.

Neste estudo, animais foram sensibilizados e mais tarde provo- cados com OVA para elicitar uma resposta tipo asma. Teste fisiológico e co- leta de tecido foram realizados 72 horas após a provocação inflamatória (isto é, 96 horas após a última dose de células tratadas com ECP). Vários regi- mes de ECP foram testados quanto à sua habilidade em reduzir inflamação. Conforme mostrado previamente na Figura 2, ECP leva a uma redução de- pendente da dose de célula em hiper-responsividade da via aérea e inflama- ção pulmonar neste modelo. A Figura 8 mostra resultados de um experimen- to separado. Doses de uma vez por semana de 50 milhões de células trata- das com ECP foram dadas em tempos variáveis durante os 22 dias entre sensibilização e provocação. Aqui, todos os três regimes de ECP foram efi- cazes a pontos diferentes como terapias profiláticas, refletido em várias me- didas diferentes de fisiologia e patologia inflamatória.

Inesperadamente, mudanças induzidas por ECP no perfil de bi- omarcadores inflamatórios lembravam uma resposta de fase aguda (APR).

Proteína C-reativa do soro (CRP), hormônio do crescimento (GH), fator Von Willebrand (vWF) e haptoglobina foram todos alterados de uma maneira de- pendente de ECP. Não mostrado, mas são também afetadas por ECP prote- ínas de fase aguda positivas (APP) leptina, fator inibidor de leucemia (LIF), insulina e fibrinogênio, que são supra-regulados em resposta a dano a teci- do, infecção e outros estressores. Baumann e outros (1994). A leptina, em adição a seus papéis em modulação da massa de gordura e saciedade, é uma adipocina pró-inflamatória putativa. Materese e outros (2005). Proteínas pró-inflamatórias, vasoativas e hemostáticas adicionais conhecidas ser alte- radas por respostas inflamatórias sistêmicas mostraram responsividade à ECP, incluindo fator de tecido (TF), fator Vll (F7), proteína-1 quimiotática de monócito (MCP-1).

É aparente a partir desses dados que todos os regimes de ECP afetaram essas APP, e que o momento de administração de ECP é crítico. Quatro tratamentos de dose de célula igual tiveram um impacto maior sobre biomarcadores quando dados em dias consecutivos logo antes da provoca- ção com OVA do que quando separados durante o período de três semanas entre sensibilização e provocação. Consideravelmente, tratamento dos ca- mundongos no dia de provocação com OVA e nos próximos dois dias teve o maior impacto na maioria desses biomarcadores de ECP. Interessantemen- te, perfis de biomarcador de regimes anteriores, onde até 6 doses de ECP foram dadas não mais do que 11 dias após sensibilização, foram indistínguí- veis do regime de uma vez por semana sem importar o número de tratamen- tos. Novamente, aqueles perfis lembraram um APR. Efeitos dependentes da dose de célula e regime similares sobre biomarcadores de soro foram repro- duzidos em outros modelos de camundongos de doença inflamatória. A di- versidade desses modelos, que incluíam hipersensibilidade de contato, LPS de baixa dose, transplante de anel traqueal alogenéico e até mesmo camun- dongos saudáveis, sugere que este é um fenômeno generalizado resultante de ECP ao invés do insulto inflamatório de um dado modelo.

Uma APR seria esperada aumentar demandas metabólicas, en- tão a requerente focou em biomarcadores de APP relevantes que refletem metabolismo aumentado. Richardson e outros (2003). Insulina, que é conhe- cida modular a expressão de APP, e glucagon, outra APP, foram medidos em modelo de inflamação pulmonar. Campos e outros (1992). Comparado com os camundongos não-tratados, insulina e glucagon no soro foram redu- zidos em camundongos tratados com ECP 72 horas após provocação com OVA intranasal (Figura 9, n=18-21, p<0,01 e 0,05, respectivamente).

72 horas após provocação com OVA, perfis de biomarcador in- duzido por ECP não são diferentes do controle negativo, enquanto animais não-tratados mostram elevações em ambos insulina e glucagon. Esses per- fis de biomarcador, ocorrendo simultaneamente com reduções relacionadas com tratamento em inflamação, levaram a requerente a propor que amostras de 72 horas pós-provocação refletem a fase de recuperação de grupos de tratamento neste modelo, com animais tratados com ECP se recuperando mais rapidamente do que controles. Esta teoria foi testada diretamente atra- vés de amostragem em pontos de tempo anteriores no mesmo modelo (Fi- guralO).

Esses resultados mostram que ECP induz aumentos em insulina (painel da esquerda) e glucagon (painel da direita) em circulação quando comparado com controles negativos. Esses analitos surgem em tandem em ambos controle positivo e animais tratados com ECP com relação a animais controle negativos. Como visto na Figura 9, ambos biomarcadores retornam para linha de base em 72 horas em camundongos tratados com ECP, mas nenhuma indicação de resolução é vista em animais controle não-tratados naquele momento.

Este aumento simultâneo em dois hormônios pancreáticos com efeitos opostos sobre metabolismo de energia primeiro pareceu contraditó- rio. Insulina é amplamente acreditada ser um hormônio anabólico, enquanto glucagon é tipicamente visto como um direcionador de catabolismo. Traba- Ihos do início dos anos 70 demonstraram sinergia entre insulina e glucagon em auxiliar a recuperação de ratos de hepatectomia parcial e estudos sub- seqüentes mostraram aumento nas concentrações no plasma de epinefrina, norepinefrina, glucagon e corticosterona após infusão de endotoxina ou Iiga- ção cecal e punção, dois modelos de sepse. Bucher e outros (1973). Aumen- tos de glucagon no plasma nesses modelos foram mais tarde correlaciona- dos com o aparecimento de TNF-α, IFN-a e IL-6, levando à sugestão de que glucagon pode alterar metabolismo de glicose hepática para administrar ne- cessidades simultâneas para hiperglicemia e absorção de glicose em tecido aumentada durante inflamação. Bucher e outros (1975).

LPS e citocinas são também conhecidos aumentar secreção de Ieptina (54). A requerente examinou Ieptina no soro e viu seu aumento, em- bora com um pico posterior que permanece elevado por pelo menos uma semana neste modelo (Figura 11). Esses efeitos dependentes de ECP sobre leptina no soro também lembram um APR. Em seguida a requerente exami- nou o perfil de Ieptina nas mesmas amostras mostradas na Figura 10 para determinar o curso de tempo de liberação de leptina. Novamente, Ieptina é aumentada da linha de base em ambos camundongos não-tratados e trata- dos com ECP. De acordo com os perfis publicados, leptina atinge pico mais tarde na APR do que genes de resposta precoce tal como IL-1 β e TNFa. Bornstein e outros (1998); e Granowitz e outros (1999).

Deste modo, esses efeitos endócrinos como apenas um reflexo da energia consumida durante inflamação e sua resolução. Em outras pala- vras, ao invés de um resultado baseado em mecanismo, essas constatações são meramente uma conseqüência indireta de atividade de ECP. Embora insulina seja aparentemente um hormônio antiinflamatório, os aumentos em GH e leptina pareciam inconsistentes com uma resposta terapêutica antiin- flamatória. Viardot e outros (2007). Isto levou a requerente imediatamente a considerar uma hipótese alternativa.

Considerando esses dados, foi proposto pela requerente que a própria ECP induz um efeito pró-inflamatório transiente, leve, não diferente de uma APR, que poderia servir como um "estresse de condicionamento" terapêutico. Isto foi endereçado experimentalmente. Células tratadas com ECP foram infundidas em camundongos saudáveis e os mesmos biomarca- dores foram examinados. Resultados na Figura 12 mostra que insulina, Iep- tina e glucagon são elevados em camundongos tratados com ECP compa- rado com controles negativos. O curso de tempo dessas mudanças mostra que as concentrações de pico aparecem 24 horas após tratamento, e resol- vem quase que completamente em 48 horas. Isto é diferente do curso de tempo visto em modelos inflamatórios, onde mudanças induzidas por ECP atingem pico 48 horas após o último tratamento com ECP.

Cortisol (CORT, corticosterona em roedores) é outro reagente de fase aguda que está relacionado com Ieptina na APR. Faggioni e outros (1999). CORT foi também medido neste experimento, e aumenta em tandem com os outros três biomarcadores. Liberação de corticosteróide tal como aquela mostrada aqui é um sinal clássico que a fuga ou luta foi ativada. Har- buz (2002). CORT então provê uma ligação crucial para respostas de es- tresse sistêmicas e o sistema nervoso central, sugerindo um mecanismo com o que infusão de AC na circulação periférica afeta muitos tecidos e do- enças muito diferentes.

Para reforçar a ligação entre esses marcadores e MOA de ECP, em seguida a requerente examinou relações de dose-resposta de biomarca- dor em camundongos saudáveis. A Figura 13 mostra o efeito de infusão de números diferentes de AC sobre CORT (painel da esquerda), insulina (meio) e Ieptina (painel da esquerda). Todas as amostras foram coletadas 24 horas após ECP. Como acontece com outros biomarcadores proximais a meca- nismo, esses hormônios mudam em proporção à exposição, aqui refletido na dose de célula. Colburn (2003).

A requerente então proveu evidência de que ECP induz respos- tas a estresse sistêmicas em camundongos que são reminiscentes da fuga ou luta clássica e respostas de fase aguda. Na seção seguinte, a requerente liga ECP a respostas de estresse celular e apresenta um modelo mecanísti- co para condicionamento de estresse induzido por ECP. Exemplo 9

Evidências molecular e celular ligando ECP a respostas de estresse

Inerente na idéia que um estressor sistêmico pode realizar mu- danças em órgãos, tecidos e células está um mecanismo através do qual estresse sistêmico induz essas respostas reparadoras. Evidência abundante mostra que hormônios de estresse afetam metabolismo de energia em res- posta a estímulos de luta ou fuga, redistribuindo fontes de energia para lon- ge de sistemas menos essenciais. Essas respostas sistêmicas a catecolami- nas e outros mediadores de estresse surgem de eventos mediados por re- ceptor no nível celular, levando a mudanças adaptativas no nível organismal.

Células individuais respondem a mudanças ambientais locais de uma maneira que espelha respostas a estresse sistemáticas. Células fazem mudanças fundamentais em seu uso de energia e distribuição de recurso para que se adaptem melhor a uma dada provocação com que pode ser descrita como uma luta ou fuga subcelular. O curso estratégico anterior leva à adaptação celular, com o que mudanças estruturais e funcionais "se unem em batalha" para satisfazer demandas ambientais recém-alteradas. A última (fuga) elicita sinais de alarme celular, levando à inflamação localizada ou sistêmica. Em adição a programas de reparo, essas respostas podem elicitar a morte apoptótica de células que falham em se ajustar adequadamente. Marciniak e outros (2004). Esta forma de "fuga" deixa seus recursos disponí- veis ao organismo para o processo restaurador.

A versão sistêmica desta resposta deixa espaço para erro a cur- to prazo, mas células são extremamente conservadores com relação a isso. Mesmo pequenos atrasos em passagem de ponto de checagem de resposta de dano causam apoptose em células normais. Isto foi chamado a lei Samu- rai de biologia celular, onde "é melhor ser morto do que errado". Skulachev (2001). Para manter homeostase, essas respostas de reparo e adaptativas à ECP devem ocorrer em cada célula afetada, e surgir após a detecção de mudanças ambientais induzidas por estresse. Falha em satisfazer qualquer um desses pontos finais homeostáticos é uma causa de base de diabetes e outras doenças crônicas. Marciniak e outros (2006). O processo de tradução de proteína, particularmente biogênese de ribossoma e alongamento de peptídeo, está dentre os processos mais in- tensivos de energia em uma célula. Para combater um estresse e tentar repa- ro, uma célula tipicamente pára a tradução de proteínas "não-essenciais", muda em direção a uso de energia catabólica e cria capacidade biossintética maior. Dada a frugalidade da natureza, sistemas que realizam esta função em face flutuações ambientais normais em recursos parecem servir papéis adi- cionais na manutenção de homeostase em face de estressores. Pelo menos três sistemas sensíveis a nutriente foram identificados que realizam este pa- pel. A resposta de proteína não-enovelada dependente de ER (UPR) e as respostas independentes de ER mediadas pelo alvo da rapamicina em mamí- fero (mTOR) e pelo curso biossintético de hexosamina (HBP) são ativadas em resposta a estressores diversos. Nesta seção a requerente descreve esses cursos e introduz evidência implicando-os em atividade de ECP.

A resposta de proteína não-enovelada Doenças de enovelamento de proteína tal como T1DM resultam de disfunções em respostas a estresse celular, especialmente na "resposta de proteína não-enovelada" (UPR) evolucionariamente conservada. Harding e outros (2004). Este programa estereotípico, algumas vezes chamado a resposta de estresse do retículo endoplasmático (ER), é dirigido pelas prote- ínas residentes no ER e tipicamente permite um retorno à homeostase celu- lar. Este processo, quando repetido entre as células afetadas de um dado tecido, pode dirigir a recuperação deste tecido de insultos ambientais. A UPR desempenha um papel em tecidos saudáveis também, uma vez que sinais externos que aumentam demandas em uma célula normal podem ini- ciar uma UPR. Por exemplo, ligação aguda de antígeno a receptor de célula B ativa a célula e dirige seu desenvolvimento e expansão para células de plasma secretando anticorpo. Isto requer uma "remodelagem" grande do mecanismo biossintético da célula, e serve como um estressor que inicia a UPR. Iwakoshi e outros (2003).

A UPR é um sistema de resposta rápida, e faz a mediação da fosforilação do fator de iniciação eucariótico 2a (EIF2a) para parar a tradu- ção. Harding e outros (2003). Este componente do mecanismo traducional é necessário para a iniciação de "tradução dependente de cap", que dirige a produção da maioria das proteínas celulares. Kozak (1999). Um subconjunto de genes é traduzido por um sistema independente de cap usando sítios de entrada ribossomal internos (IRES) para traduzir mRNA. Hellen e outros (2001). Tal tradução de IRES é encontrada em genes que dirigem a UPR1 tipicamente codificando enzimas biossintéticas, canais de transmembrana e transportadores que aumentam a disponibilidade de matérias-primas, proteí- nas envolvidas em controle de qualidade traducional e pós-traducinal e sis- temas de defesa antioxidantes. Komar e outros (2005); e Lin e outros (2007).

Pelo menos quatro cursos distintos levam à fosforilação de EIF2a para iniciar componentes diferentes da UPR. Por exemplo, supra- regulagem da capacidade antioxidante e certos genes de resposta de UPR a jusante é dirigida por um processo conhecido como a resposta a estresse integrada (ISR), e mediada pela ativação de fator de transcrição 4 (ATF4). PERK é uma cinase de inativação de EIF2a que dirige a inibição de tradução dependente de cap, levando a demandas menores para ATP em tradução e enovelamento de proteínas não-essenciais. IRE1 e ATF6 iniciam respostas de URP adicionais para supra-regular genes específicos envolvidos em mo- dulação de estrutura secundária de proteína e a degradação de produtos de tradução enovelada com erro. Estresse de ER agudo extremo ou ativação prolongada desses cursos, como em células β pancreáticas supercarrega- das ou de outro modo estressadas, leva à apoptose dependente de ER atra- vés de vários cursos diferentes. Szegezdi e outros (2006). Falha desses e- ventos reparadores e apoptóticos em face de estresse de ER continuado pode ser um fator de base na patologia de doenças de UPR. Um objetivo desta proposta é melhor compreender o papel que a URP desempenha na modulação de tolerância imune in vitro.

A HBP e mTOR são sensores de estresse de nutriente e ambiental que fazem a mediação de respostas a estresse celular independentes de UPR Tradução dependente de Cap é também regulada por outro cur- so de sinalização responsivo a estresse, independente de sinais de UPR. Significantemente, a maioria desses efeitos alternativos sobre tradução é mediada por mTOR, também conhecido como o Alvo da Rapamicina, uma proteína cinase relacionada à fosfatidilinositol 3-cinase central para o contro- le de crescimento e proliferação celular. Sarbassov e outros (2005). mTOR se encontra a jusante de vários cursos de sinalização de percepção de nutri- ente e fator de crescimento, e controla componentes críticos do mecanismo biossintético de proteína para alterar tamanho e divisão celular, biogênese de ribossoma e utilização de nutriente. Fosforilação de componentes-chave de complexos de iniciação de tradução por mTOR permite tradução depen- dente de cap prosseguir.

A natureza de percepção de nutriente e estresse de sinalização de mTOR desempenha um papel-chave em assegurar que processos celula- res condizam apropriadamente com seu ambiente. Cursos sensíveis a nutri- ente são conhecidos alterar atividade de mTOR, ou a localização de seus alvos, adicionando outro nível de complexidade a controle traducional. Sinais a montante incluem Akt, uma cinase de sobrevivência efetora de receptores de insulina e fator de crescimento, e AMPK, um sensor de disponibilidade de energia na célula. Reioling e outros (2006). A Figura 14 mostra evidência ligando engolfamento de AC à sinalização de mTOR. DC foram co- culturadas com AC em razões de AC:DC diferentes (marcado ao longo da abscissa). Células foram incubadas por várias vezes, e fosforilação de S6 cinase, uma medida da atividade de mTOR, foi medida através de citometria de fluxo. Hinton e outros (2004). Ambos painéis mostram um efeito depen- dente de dose celular em iDC e mDC. Interessantemente, há uma diferença dependente de estado de maturação de DC significante nessas respostas.

Os cursos de UPR e mTOR são diretamente afetados por dispo- nibilidade de nutriente e indiretamente afetados por estresse. (Carreterp e outros; (2007). O curso biossintético de exosamina é um terceiro tal sistema. A HBP é ativada em proporção direta à concentração intracelular de glicose. Love e outros (2005). O resultado final de ativação de HBP, um aumento na modificação de proteínas com O-GIcNAC, resulta em sintomas associados com diabetes. Amdra;o e outros; (2007). Uma célula pode então sentir e res- ponder à disponibilidade de glicose intracelular e a uma variedade de estres- sores celulares usando este curso. Uma conseqüência de ativação de HBP é adaptação. A HBP dirige esta resposta, e faz a mediação de condicionamen- to de estresse.

Condicionamento de estresse através de cursos de percepção de nutriente Estressores e glicose aumentam a atividade de HBP e aumen- tam a resistência a estresse subseqüente. Zachara e outros (2004). Gluta- mina:frutose-6-fosfato amidotransferase (GFAT) é a primeira enzima e Iimi- tante de dose no HBP1 e desempenha um papel em percepção de glicose e saciedade. Geração mediada por GFAT de UDP-N-Acetilglicosamina (UDP- GIcNAc) provê este precursor essencial para glicosilação de proteínas N- e O-Iigadas pós-traducionais. Buse (2006). Uma tal reação envolve a adição do monossacarídeo GIcNAc a resíduos serina e treonina de proteínas madu- ras. Isto é dirigido pela O-GIcNAc transferase (OGT) uma enzima-chave no HBP, e pode ambos alterar estrutura terciária de proteína e a acessibilidade limite daqueles resíduos Ser/Thr e sítios vizinhos a proteína cinases. Yang (2005). Esses eventos podem causar modular a participação de substratos de OGT em certas cascatas de sinalização e alterar sua localização na célu- la. A última conseqüência é devido à alteração de interações proteína- proteína, notavelmente com Iecitinas e chaperonas celulares. Guinez e ou- tros (2004). Isso pode afetar sua habilidade em participar em regulagem e/ou tradução de gene. Exemplos importantes disto são vistos nos efeitos inibido- res de ativação de HBP sobre atividade proteassomal e sobre a localização de vários fatores de transcrição. Gao e outros (2003). Hiperglicemia aumenta a atividade deHBP, e aumenta o teor de O-GIcNAc de NeuroDI, um fator de transcrição pancreático. Isto afeta a localização de NeuroDI, então aumen- tando a transcrição de gene de insulina.

Embora uma ligação direta entre a HBP e a UPR não tenha sido descrita, a HBP pode alterar tradução, pelo menos indiretamente. A HBP foi mostrada alterar sinalização a jusante de mTOR, afetando a localização celu- lar de alfa4. Esta proteína é um substrato de mTOR que complexa com e re- gula certas fosfatases para modular p70S6 cinase e componentes do curso de sinalização JAK/STAT. Dauphinee e outros (2005). Uma vez que alfa4 não tem um sinal de localização nuclear, sua distribuição entre o citoplasma e o núcleo é controlada por interações proteína-proteína. Rompimento dessas interações acontece com as modificações resultantes da ativação de HBP1 fazendo com que alfa4 permaneça citosólica e incapaz de modular tradução.

Esses sistemas de percepção de nutriente são sensíveis a es- tresse e, tal como UPR1 podem alterar funções celulares para satisfazer à demanda por e disponibilidade de recursos. Em outra similaridade com sis- temas responsivos a estresse de ER, modulação transiente de mTOR e da HBP protege contra estressores subseqüentes. Por exemplo, uma variedade de estressores altera a atividade de HBP in vitro, e imitadores farmacológi- cos de ativação de HPB têm um efeito de condicionamento adaptativo. A rapamicina foi recentemente mostrada induzir um efeito de pré- condicionamento também, protegendo contra estressores pró-apoptóticos subseqüentes, mais provavelmente através de seus efeitos sobre a p70S6 cinase e autofagia. Ravikumar e outros (2006). Isto é especialmente relevan- te em diabetes, que é ligada à atividade de ambas HBP e mTOR. Marshall (2006). O curso de mTOR ocupa um ponto de controle crítico para sinais mediados por nutriente e desempenha um papel em desenvolvimento e fun- ção pancreáticos. Bussier e outros (2006).

Evidência adicional ligando respostas de nutriente/estresse à função imune foi obtida usando o MLR. A requerente usou fármacos conhe- cidos inibir as duas enzimas-chave na N-acetil-beta-D- glicosaminidase sele- tiva de HBP, OGT e O-GIcNAc (O-GIcNAcase), que adiciona e remove a porção O-GIcNAc de proteínas, respectivamente. A requerente examinou MLR na presença ou de Estreptozocina (STZ) ou PUGNAc, dois antibióticos conhecidos inibir O-GIcNAcase e aumentar a quantidade de proteínas celu- lares com a modificação de O-GIcNAc. Arias e outros (2004). Em ambos ca- sos, os inibidores potencializaram ECP, aumentando a natureza tolerogênica de AC. Isto acontece em concentrações de fármaco bem abaixo da faixa tóxica para DC e células Τ. A Figura 15 mostra resultados usando PUGNAc. Este fármaco não tem nenhum efeito apreciável sobre o próprio MLR em todas as doses testadas, refletido na ausência de inibição de proliferação no ensaio. Quando AC são adicionadas, no entanto, "tolerogênese" induzida por ECP é aumentada em até cerca de 50% acima desta resposta de AC típica (-30% de inibição, vide resultado PUGNAC 0 mM). Esta constatação foi reproduzida usando STZ, outro inibidor de O-GIcNAcase.

Evidência adicional implicando a HBP em função imune é vista quando a enzima oposta, OGT, é inibida usando Alloxan (Allx, Figura 16). Alloxan tem um efeito oposto sobre MLR comparado com PUGNAc, e afeta mDC e iDC diferentemente. Notavelmente, reproducibilidade de Allx potenci- aliza proliferação no MRL quando iDC são usadas como APC (painel da es- querda). Alloxan não tem essencialmente nenhum efeito sobre MLR quando usando mDC (não mostrado). Dados preliminares adicionais analisando re- dução de alamar blue como uma medida de viabilidade mostraram prolifera- ção alta induzida por Allx de células T em cultura nas faixas testadas (Figura 16, painel da direita). Vide Tabela 1.

Tabela 1: Lista de transcritos mais afetados por ECP

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Procurando por insights adicionais em MOA celular e molecular de ECP1 a requerente usou disposições de expressão de gene Affymetrix e abordagens de bioinformática padrão para examinar perfis de RNA em vá- rios tecidos de modelos de inflamação de camundongo. Em órgãos linfóides secundários, a requerente observou mudanças significantes em expressão dentro de um conjunto de genes que freqüentemente muda como parte de respostas a estresse celular programadas. Conforme ilustrado na Tabela 1, 96 horas após a última infusão de AC, ECP alterou a expressão de genes envolvidos em cursos metabólicos, genes envolvidos em síntese e proces- samento de proteína e cursos responsivos a estresse (por exemplo, O-GIcNAcase). Isto sugere ainda que cursos de resposta a estresse são modificados por ECP, mas experimentos adicionais serão necessários para avaliar o papel de genes individuais na resposta de ECP. Exemplo 10

Condicionamento de estresse terapêutico Doenças de enovelamento de proteína incluem as doenças crô- nicas mais prevalentes e estão associadas com altos graus de morbidez e mortalidade. Xu e outros (2005). Tratamento eficaz para a maioria dessas condições é limitado, devido em grande parte à pobre compreensão de suas etiologias de base. É bastante aparente que muitas das seqüelas debilitan- tes e por fim fatais de doenças de enovelamento de proteína incluem um componente inflamatório. Yoshida (2007). Terapias existentes tipicamente visam limitar inflamação sem alterar sua causa de base. Exemplos importan- tes desta abordagem incluem esteróides, NSAIDs e terapias anticitocina. No caso de doenças de URP e suas combinações.

Estratégias mais novas vão provavelmente se direcionar a cau- sas de base desta inflamação (por exemplo, prevenção de agregados de proteína ou aceleração de sua eliminação). Boyce e outros (2005). A maiori- a, se não todas essas terapias, vai empregar compostos terapêuticos exó- genos ou materiais biológicos que podem ter toxidez sistêmica associada. ECP oferece uma nova abordagem pelo fato de que ela usa recursos endó- genos para fundamentalmente alterar ambas a disfunção causadora de do- ença e sua inflamação resultante. A requerente toma como hipótese que ECP pode ambos prevenir e resolver complicações de doenças de UPR re- lacionadas a estresse através de sua habilidade em modificar cursos de res- posta a estresse.

Aumento da capacidade de estresse de uma célula permite a ela reparar e eliminar seus componentes celulares danificados, e pode ajudar a resolver doença. Badin e outros (2006). Isto foi demonstrado usando proteí- nas de choque térmico superexpressas ou "chaperonas químicas" para auxi- liar na secreção de proteínas enoveladas erroneamente, e através de modi- ficação química do arredor celular para melhorar funcionamento de ER. Ima- izumi e outros (2001). Embora essas estratégias tenham mostrado sucesso em sistemas de superexpressão de proteína e em linhagens celulares, elas tipicamente devem ser otimizadas para uma dada proteína erroneamente enovelada. Regimes de condicionamento de estresse oferecem uma abor- dagem mais global, recrutando uma variedade de sistemas de reparo celu- lar, simultaneamente remediando tipos diferentes de estresse celular.

Manipulação simultânea de sistemas de resposta a estresse ce- lular é uma terapia experimental estabelecida. Duas décadas de pesquisa viram a publicação de mais de 4000 trabalhos sobre condição isquêmica sozinha. Isquemia transiente é o regime de condicionamento mais geralmen- te estudado, e experimentos mostraram a eficácia em medicina cardiovascu- lar, neurologia e transplante de órgão sólido. Kuntscher e outros (2005). Es- ses estudos mostram que lesão por isquemia-reperfusão (l/R) pode ser dras- ticamente reduzida por pré- ou pós-tratamento com períodos breves de is- quemia e recuperação. Esta abordagem é ainda experimental, mas seu valor é apoiado por epidemiologia, uma vez que uma redução em dano a tecido após derrame ou infarto do miocárdio é vista se precedida por um ataque isquêmico transiente ou angina instável, respectivamente. Liberato e outros (2005). Regimes de condicionamento também têm valor terapêutico quando estressores heterólogos são empregados, sugerindo que qualquer regime de condicionamento terapêutico ofereceria proteção de uma disposição diversa de estressores. Notavelmente, foi também mostrado que condicionamento de um órgão ou tecido distante pode conferir proteção a um organismo intei- ro (um efeito conhecido como condicionamento remoto). Condicionamento foi examinado em testes clínicos em cirurgia cardíaca, mas sua compreen- são por médicos tem sido muito limitada, mais provavelmente devido ao pe- rigo inerente de agentes de condicionamento e métodos existentes. EPC Aqe como um Regime de Condicionamento de Estresse

Experiência clínica mostrando o momento de respostas de tra- tamento, a preservação de função imune e a geração de Treg em pacientes sugeriu que ECP oferece uma nova abordagem terapêutica para mitigar in- flamação. Os dados preliminares descritos aqui sugerem que a ação tera- pêutica de ECP elicita uma resposta adaptativa através da ação como um estressor de nível baixo. Evidência farmacológica e bioquímica implica sis- temas de resposta de estresse sistêmica e subcelular, alguns novos, que modulam tolerância imune. "Condicionamento de estresse" induzido por ECP então leva vantagem de um fenômeno adaptativo bem descrito, habitu- ação, de células, órgãos e organismos. Condicionamento oferece proteção a estressores subseqüentes, mais intensos, e pode elicitar mudanças proteto- ras, de duração longa, na estrutura e funcionamento de células e tecidos. Essas mudanças de longa duração, em adição a proteger de estresse sub- seqüente, podem afetar drasticamente progressão de doença e acelerar processos de reparo.

Certas predições surgem desta hipótese, incluindo resistência celular e organismal aumentada a uma variedade de estressores. Foi de- monstrado pela requerente que ECP protege camundongos de provocação antigênica em modelos pulmonares de asma, hipersensibilidade de contato e transplante de órgão. Resistência a estresse químico, especificamente os efeitos diabetogênicos de STZ (Figura 17, painel da esquerda) é uma exten- são surpreendente da utilidade terapêutica de ECP. No nível celular, foi de- monstrado pela requerente que DC pré-tratada com AC tolera estresse ribo- tóxico induzido por Anisomicina melhor do que controles não-tratados (Figu- ra 17, painel da direita). ECP então demonstra as características que defi- nem regimes de pré-condicionamento. De nota, os dados de NOD/Ltj apre- sentados acima mostram que ECP é protetora mesmo após dano pancreáti- co significante ter acontecido. Esses experimentos oferecem um exemplo de pós-condicionamento usando ECP.

Os fenômenos acima, quando considerados juntos, apontam para o valor potencial de condicionamento de estresse como uma nova a- bordagem terapêutica para doenças de UPR. Se, como a requerente acredi- ta, ECP for uma terapia de condicionamento de estresse, ela terá uma utili- dade incalculável na prevenção e tratamento de doenças induzidas por es- tresse. Este novo conceito surge após a requerente reconhecer conexões que ligam vários campos de pesquisa de outro modo muito diferentes. Espe- cificamente, publicações recentes ligam condicionamento de estresse no nível celular com as respostas de estresse celulares e sistêmicas descritas acima. Em um estudo, por exemplo, linhagens de célula de macrófago foram pré-condicionadas contra uma variedade de estressores, aumentando so- brevivência e preservando funcionamento em cultura. Lu e outros (2004). Isto combinado com a conexão do eixo UPR-HPA mencionada acima sugere que modificação de respostas a estresse celulares pode, em adição a resol- ver causas de base de patologia, proteger de provocações subseqüentes. Efeitos de condicionamento podem ser mediados por células imunes

É bem estabelecido que células imunes são mediadores patogê- nicos de lesão isquêmica; no entanto, seu papel em pré-condicionamento isquêmico não é claro. Transferência adotiva de células do baço de camun- dongos isquemicamente pré-condicionadas para recipientes deficientes em célula T protege camundongos deficientes de lesão isquêmica subseqüente. Esses estudos sugerem fortemente que células imunes são mediadores de respostas de pré-condicionamento isquêmico protetor. A célula protetora não foi identificada neste estudo. No entanto, conforme acima mencionado, há precedente para geração de Treg como um resultado de respostas a estresse sistêmicas. MacConmara e outros (2006). É então sensato propor que uma população de célula T reguladora surge após a isquemia inicial, permitindo Tregtransferida conferir proteção nos recipientes.

Exemplo 11

Trombospondina-1 Iiqa respostas a estresse, Trgg e ECP

Trorpbospondina-1 (TSP-1) uma proteína matricelular que con- tribui para ambos estrutura de tecido e função celular, é massivamente su- pra-regulada na maioria das células em resposta à lesão ou dano a tecido, fatores de crescimento, condições nutricionais e vários estressores ambien- tais. Murphy-Ullrich (2001). Proteínas matricelulares, incluindo TPS-1, são pensadas prover informação contextual a células sobre seu ambiente. Isto é relevante em função imune, uma vez que TSP-1 é uma proteína antiinflama- tória potente que é secretada por e modula células apresentando antígeno e células T. Doyen e outros (2003). As propriedades imunomoduladoras de TSP-1, combinadas com o fato que TSP-1 secretada de células em resposta a estresse, posiciona esta molécula entre estresse e imunidade. Aqui a re- querente mostra que TSP-1 é um efetor potencial para ECP.

TSP-1 se liga a CD36 em APC e a CD47 e α4β1 em células T. Chen e outros (2000). TSP-1 aumenta a habilidade de fagócitos em engolfar células apoptóticas e inibe sua maturação e habilidade em produzir citocinas pró-inflamatórias. Em células T, TSP-1 foi mostrada supra-regular transdu- ção de sinal de TCR bem como responsividade à IL-12. Li e outros (2002). TSP-1 é um ativador fisiológico principal de TGFp e recentemente foi mos- trada induzir um fenótipo Treg Fox3+ em células T CD4+ CD25- humanas ati- vadas. Grimbert e outros (2006). Indução de Treg pode conter e resolver in- flamação e seu dano. Em camundongos nulos em TSP-1, cicatrização de ferida retardada, respostas antiinflamatórias reduzidas e níveis baixos de TGFp são vistos. Agah e outros (2002).

No pâncreas, células ilhotas expressam TSP-1, e camundongos nulos em TSP-1 demonstram inflamação, hiperplasia de célula ilhota e hipo- plasia acinar, todas as quais foram atribuídas a uma falta de ativação de TGFp. Crawford e outros (1998). O pâncreas de camundongos nulos em TSP-1 sistemicamente tratados com peptídeo derivado de TSP-1 reverteu para um fenótipo mais normal. Essas observações sugerem que TSP-1 é um regulador importante de desenvolvimento pancreático e pode ser importante para processos imunes e exócrinos dentro do microambiente. Interessante- mente, hiperglicemia foi recentemente ligada à expressão de TSP-1 na vas- culatura de rato diabético Zucker. Raman e outros (2007). A supra- regulagem de TSP-1 foi diretamente ligada à HBP, e expressão de TSP-1 foi proporcional às concentrações de glicose. Dados esses dados, é uma possi- bilidade forte que terapias de modulação de TSP-1 interfiram com a progres- são de patologia em doenças tal como diabetes.

A requerente, e outros, mostraram que TPS-1 é secretada em grandes quantidades a partir de células apoptóticas. Conforme mostrado na Figura 18, um aumento dependente de dose de célula em TSP-1 é visto a- pós tratamento com ECP e PBMC. Monócitos secretam o bruto da TSP-1 produzida em suspensões de PBMC tratadas com ECP, e bloqueio da ativi- dade de TSP-1 reduz a habilidade de ECP em dirigir geração de Treg. Isto está de acordo com os resultados não-publicados adicionais da requerente mostrando que monócitos são essenciais para geração in vitro de Treg-

A Figura 19 mostra que, como na Figura 7, células T isoladas de co-culturas de PBMC tratadas com ECP com células T puras mostram um fenótipo tolerogênico. Se, no entanto, esta co-cultura incluir neutralização de anticorpos monoclonais anti-CD36 e anti-CD47, sozinhos ou em combinação, o fenótipo tolerogênico é embotado. A requerente está atualmente investigan- do se TSP-1 é necessária para mediação dos efeitos imunológicos dirigidos por ECP in vivo, e propõe investigar se TSP-1 desempenha um papel em pro- teção pela ECP de funcionamento de célula β em modelos de diabetes. Referências:

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2103

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Claims (14)

1. Método de condicionamento de estresse caracterizado pelo fato de que compreende: a) identificação de um evento estressante ao qual um indivíduo será ou está sendo submetido, e b) condução de ECP de acordo com um programa e com uma dose eficaz para melhorar o efeito do evento estressante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito evento estressante é um trauma ou exposição tóxica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o trauma é isquemia, derrame, descompressão, terapia hiperbá- rica (estresse oxidativo), acidental, cirurgia, queimadura, fumaça, fogo, bata- lha, exercício intenso, privação de sono, anormalidades de nutrição, má nutrição, viagem espacial, tortura, controle de desastre, infecção viral, infec- ção bacteriana, câncer ou transplante de órgão.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a exposição à toxina é quimioterapia, radiação, veneno, efeitos colaterais farmacêuticos, toxinas ambientais, ultra-som, luz de laser ou anti- bióticos.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda medição de um biomarcador onde aplicação de ECP é ajustada com base no nível ou metabolismo do dito biomarcador.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o biomarcador é selecionado do grupo consistindo nos genes listados na Tabela 1.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao dito indivíduo uma substância ou sinal ambiental que afeta o curso de mTOR.

8. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a Rapamicina é administrada ao dito indivíduo.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a substância ou sinal ambiental é administrado em quantidades e em intervalos suficientes para induzir estresse subcelular no indivíduo.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a substância é Iicopeno ou celestral.

11. Método de monitoramento da eficácia de condicionamento caracterizado pelo fato de que compreende identificação de modulação dife- rencial de um biomarcador selecionado do grupo consistindo naqueles na Tabela 1.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que o padrão da modulação do dito grupo de biomarcadores é comparado com padrões de modulação de biomarcador conhecidos ser efi- cazes.

13. Estojo para condução de um ensaio, como definido na rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: reagentes de de- tecção de biomarcador.

14. Microdisposição ou gene chip, caracterizado pelo fato de ser para realização do método como definido na reivindicação 1.