MX2008014111A - Metodos para tratar enfermedades qie implican enfermedades y condiciones relacionadas con estres. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee un modo de acción único para la fotoféresis extracorpórea, ECP; la ECP puede actuar a través de la modulación de respuestas al estrés celular características de un mecanismo evolutivamente conservado para responder al estrés ambiental, es decir, respuestas a infección y disponibilidad de nutrientes variada, obesidad o xenobiáticos; una vía específica, la vía metabólica de la hexosamina, parece modular esta respuesta al estrés alterando la composición celular de glucoproteínas O-enlazadas.

Description

METODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES QUE IMPLICAN ENFERMEDADES Y CONDICIONES RELACIONADAS CON ESTRES ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células y los organismos responden a las condiciones de estrés ambiental en una manera evolutivamente conservada como un mecanismo para mantener la homeostasis. Respuestas aberrantes o prolongadas al estrés sustentan más de 100 enfermedades serias (Xu et al., (2005)), y tienen impacto sobre el éxito de muchos procedimientos médicos. Las respuestas al estrés celular características del mecanismo evolutivamente conservado para responder al estrés ambiental (es decir, respuestas a la infección y disponibilidad de nutrientes variada, obesidad, xenobióticos), incluyen aquellas que implican las denominadas "proteínas de choque térmico" (HSPs). Las HSPs forman una familia de proteínas altamente conservadas que están ampliamente distribuidas en los reinos vegetal y animal. Aunque las HSPs se identificaron originalmente en células sujetas a estrés térmico, se ha encontrado que están asociadas con muchas otras formas de estrés, tales como infecciones, y de esta manera se conocen más comúnmente como "proteínas de estrés" (SPs). La función biológica de una proteína depende de su estructura tridimensional, que es determinada en gran parte por su secuencia de aminoácidos, pero también por el ambiente. De hecho, la conformación de las proteínas gobierna su interacción con otros factores, que pueden participar en la regulación de la función de las proteínas. La falla de los polipéptidos para adoptar y mantener su estructura adecuada a través del plegamiento adecuado de la proteína, es una amenaza principal para la función y viabilidad de las células. En consecuencia, han evolucionado sistemas elaborados que protegen a las células de los efectos deletéreos de las proteínas mal plegadas. En consecuencia, anormalidades del plegamiento, oligomerización, agregación o deposición de las proteínas, pueden desempeñar una función importante en la fisiopatología de una serie diversa de trastornos degenerativos crónicamente progresivos. Ejemplos no limitativos de dichas enfermedades incluyen las siguientes: enfermedad de Parkinson (PD), demencia del cuerpo de Lewy difusa (DLBD), atrofia de sistemas múltiples (MSA), distrofia miotónica, atrofia dentatorrubro-palidoluisiana (DRPLA), ataxia de Friedreich, síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental por el cromosoma XE frágil, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia muscular espinobulbar (conocida también como enfermedad de Kennedy), ataxia espirocerebelar, enfermedad de Huntington (HD), encefalopatía familiar con cuerpos de inclusión de neuroserpina (FENIB), enfermedad de Pick, degeneración corticobasal (CBD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), complejo de esclerosis lateral amiotrófica/demencia por parkinsonismo, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), síndrome de Down, degeneración macular relacionada con la edad, cataratas y enfermedad de Wilson. En muchos casos, se han identificado mutaciones genéticas que sustentan las formas familiares de estas enfermedades. Sin embargo, en la mayoría de los casos, se desconoce el evento idiopático de iniciación que facilita o que desencadena la transición conformacional de la proteína objetivo, pero resulta finalmente en el procesamiento anormal, mal plegamiento, oligomerización o agregación de la proteína, lo cual desencadena toxicidad celular. Como parte de una destoxificación celular, estrategia de defensa o como un intento por degradar las proteínas anormalmente plegadas, dichas proteínas anormales se acumulan con frecuencia en varios tipos de inclusiones celulares o agregosomas. Estas inclusiones o agregosomas han llegado a ser de esta manera uno de los distintivos patológicos de esta serie diversa de condiciones degenerativas. Hasta la fecha, no están disponibles dichos agentes terapéuticos y tratamientos completamente efectivos para estas enfermedades. La irradiación de luz o fototerapia se ha usado ampliamente en las ciencias químicas y biológicas por muchos años. La irradiación de la sangre con luz ultravioleta (UV) se usó en la década de los treinta, cuarenta y cincuenta para el tratamiento de muchas condiciones. Estas condiciones incluyeron enfermedades bacterianas tales como septicemias, neumonías, peritonitis, infección de heridas, infecciones virales que incluyen hepatitis aguda y crónica, poliomielitis, sarampión, parotiditis y mononucleosis. La fototerapia o irradiación de luz incluye también los procedimientos de exponer objetivos fotoactivables o fotosensibilizables, tales como células, productos sanguíneos, fluidos corporales, moléculas químicas, tejidos, virus y compuestos de fármaco, a energía luminosa que induce una alteración en o a los objetivos. En años recientes, las aplicaciones de la fototerapia están aumentando en el campo médico. Estas aplicaciones incluyen la inactivación de virus que contaminan sangre o productos sanguíneos y el tratamiento preventivo de todas las reacciones de inmunización inducidas por infusión del concentrado de plaquetas, y el tratamiento de enfermedades autoinmunes y mediadas por células T debidas a numerosos estados de enfermedad en humanos, en particular aquellos que se relacionan con fluidos biológicos tales como sangre, responde favorablemente al tratamiento por irradiación de luz visible o UV. Aplicaciones de la irradiación pueden incluir también la esterilización de fluidos por irradiación que contienen microorganismos indeseables, tales como bacterias o virus. La irradiación de luz puede ser también efectiva para eliminar la inmunogenicidad en células, inactivar o destruir células seleccionadas, inactivar virus o bacterias, o activar respuestas inmunes deseables. Puede usarse la fototerapia como un tratamiento antiviral para ciertos componentes sanguíneos o sangre entera. Por ejemplo, un virus patogénico en un concentrado de plaquetas donado, puede ser inactivado por exposición a la luz UV. Véase el documento WO 97/36634. Aunque la irradiación de luz puede ser efectiva por sí misma, sin la introducción de agentes o compuestos externos, puede implicar también la introducción de agentes o catalizadores específicos tales como, por ejemplo, fármacos fotoactivables. En una aplicación particular, es bien sabido que muchos estados de enfermedad en humanos pueden caracterizarse por la sobreproducción de ciertos tipos de leucocitos, incluyendo linfocitos, en comparación con otra población de células que comprenden normalmente sangre entera. Poblaciones de linfocitos anormales excesivos resultan en numerosos efectos adversos en pacientes, que incluyen el deterioro funcional de órganos corporales, enfermedades autoinmunes mediadas por leucocitos y trastornos relacionados con leucemia, muchos de los cuales finalmente resultan con frecuencia en fatalidad. Por supuesto, los usos de estos fármacos fotoactivables pueden implicar el tratamiento de la sangre de un paciente enfermo, en donde células sanguíneas específicas se han vuelto patogénicas como una consecuencia del estado de enfermedad. Los métodos pueden implicar generalmente tratar las células sanguíneas patogénicas, tales como linfocitos, con un fármaco fotoactivable, tal como un psoraleno, que sea capaz de formar fotoaductos con el ADN de los linfocitos cuando es expuesto a radiación UV. La fotoféresis que usa un psoraleno tal como metoxsaleno, puede causar una inmunización contra las células T anormales (cancerosas, en el caso de CTCL). Durante la fotoféresis, el metoxsaleno entra en los núcleos de los glóbulos blancos, y se intercala en la hélice del ADN de doble cadena. En un circuito extracorpóreo, luz ultravioleta de onda larga es dirigida en el volumen de sangre enriquecido con leucocitos. El metoxsaleno, que responde a la energía ultravioleta, se enlaza a la base timidina en la hélice de ADN. Esto resulta en el entrelazamiento de bases de timidina que previene el desenrollamiento del ADN durante la transcripción. La luz ultravioleta A (UVA) daña a las células T anormales, haciéndolas más inmunógenas. Otros psoralenos o derivados de psoraleno pueden actuar por medio de otra vía. Sin embargo, después de que las células son fotoactivadas, la reinfusión de estas células T alteradas causa una reacción inmunológica que elige como objetivo células T que poseen los mismos antígenos de superficie. Véase Edelson (1991) Ann NY Acad Sci 636: 154-64. Esto resulta en la producción de una respuesta inmune altamente especifica contra las células anormales (ya sea un clon de cáncer o quizá células T que expresan antígenos virales sobre su superficie). Se estima que aproximadamente 25 a 50% del total de cinco compartimientos de células mononucleares de sangre periférica, se tratan por sesión de fotoféresis (plan de 2 días consecutivos).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee un modo de acción único para fotoféresis extracorpórea (ECP). La ECP puede actuar a través de la modulación de respuestas a! estrés celular características de! mecanismo evolutivamente conservado para responder al estrés ambiental (es decir, respuestas a infección y disponibilidad de nutrientes variada, obesidad, xenobióticos). Una vía específica, la vía metabólica de la hexosamina, parece modular esta respuesta al estrés alterando la composición celular de glucoproteinas O-enlazadas. Los datos presentados en la presente apoyan el reclamo de que esta vía actúa como un sensor de muerte celular apoptótica, y puede tomar parte en la respuesta al estrés que resulta después de la ECP. Dado que sólo se conocen dos enzimas que afectan esta vía, y que esta vía ha sido implicada en el inicio y las patologías de la diabetes, esta vía provee nuevos objetivos para la terapia con ECP.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 describe el procedimiento clínico para fotoféresis extracorpórea. Las figuras 2A-2B describen gráficas de barras que muestran que la ECP mejora la inflamación en un modelo de asma en ratones. Las figuras 3A-3B describen gráficas que muestran que la ECP protege a ratones NOD/LtJ de la diabetes y sus complicaciones. La figura 4 describe una gráfica de barras que muestra que la ECP mitiga el efecto diabetogénico de la STZ en un modelo de diabetes mellitus tipo 1 en ratones. La figura 5 describe el mecanismo de acción inmunológico de la ECP. Las figuras 6A-6B son una gráfica de barras que muestra el patrón de secreción de citocinas de células dendríticas co-cultivadas con células tratadas con ECP.

La figura 7 es una gráfica de barras que muestra células Treg generadas in vitro usando AC que suprimen la proliferación de células T en una MLR. Las figuras 8A-8D son una serie de gráficas de barras que muestran el efecto del régimen de ECP sobre proteínas de la fase aguda. La figura 9 es una gráfica de barras que muestra que la ECP modula la insulina y el glucagon en un modelo de inflamación pulmonar en ratones. La figuras 10A-10B describen gráficas de barras que muestran los efectos de la ECP sobre biomarcadores con el tiempo (cambio en número de veces del punto de partida contra el tiempo). La figura 1 1 es una gráfica de barras que muestra la secreción de leptina inducida por ECP en un modelo de inflamación pulmonar en ratones. La figura 12 es una gráfica que muestra el curso de tiempo de biomarcadores en ratones sanos. Las figuras 13A-13C son una serie de gráficas de barras que muestran relaciones de respuesta-dosis de células en ratones sanos tratados con ECP. Las figuras 14A-14B son una serie de gráficas de barras que muestran que el efecto dependiente de la dosis sobre la actividad de mTOR de DC después del engullimiento de AC, depende del estado de maduración de DC.

La figura 15 es una gráfica de barras que muestra el efecto de la inhibición de O-GIcNAc sobre la tolerogénesis de AC en una MLR. Las figuras 16A-16B muestran que la aloxana revierte los efectos de la ECP en la MLR, estimulando la proliferación de células T. Las figuras 17A-17B muestran que la ECP pre-condiciona a animales y células contra agresivos psíquicos químicos. La figura 18 muestra que el tratamiento con ECP induce secreción de TSP- en PBMC. La figura 19 muestra que el bloqueo de TSP-1 atenúa los efectos tolerogénicos de la ECP en la MLR.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Muchas de las enfermedades crónicas más frecuentes, incluyendo la diabetes, son dirigidas por respuestas adaptativas inadecuadas al estrés. El estrés, definido en la presente ampliamente como un estado de homeostasis amenazada, es provocado por una gama de estímulos que incluyen demandas psicológicas, ambientales y fisiológicas. Se ha mostrado ahora que la fotoféresis extracorpórea {ECP) es una terapia que puede modular las respuestas al estrés, y facilitar la adaptación. Este procedimiento mejora la reparación de células y tejidos, y acelera la resolución de la patología de la enfermedad. Esta terapia ofrece de esta manera una alternativa novedosa segura al tratamiento de enfermedades comúnmente intratables y típicamente fatales. La ECP es una terapia ¡nmunomoduladora segura y efectiva con utilidad demostrada en numerosas condiciones inflamatorias. El beneficio terapéutico de la ECP parece surgir de la inducción de tolerancia inmune, en parte por la inducción de células T reguladoras (Treg). La presente invención provee vias de señalización que modulan la función de la ECP in vitro, según se confirma por modelos in vivo de enfermedad inflamatoria, incluyendo diabetes mellitus tipo 1. En pacientes y modelos animales, mejores resultados ocurren típicamente después de numerosos tratamientos con ECP. Por supuesto, para varias enfermedades, es raro que se observe una respuesta hasta después de varios ciclos de tratamiento. En contraste con los tratamientos inmunosupresores, los pacientes que reciben ECP no muestran índice incrementado de infección o cáncer. Los resultados de modelos animales muestran que las respuestas inmunes son preservadas, surgiendo con velocidad e intensidad esencialmente igual que controles sin tratar, pero se resuelven más rápidamente con el tratamiento con ECP. El tratamiento de células y animales con fármacos de clases ampliamente diferentes, potencia ia ECP in vitro e in vivo. Se observan sinergias con fármacos que afectan sistemas críticos a las respuestas al estrés celular y vías de señalización distintas. El análisis de la expresión génica de la ECP mostró que la ECP induce cambios en la abundancia de transcritos de genes sensibles al estrés, incluyendo muchos que han sido implicados en respuestas al estrés programadas estereotípicas. Consistente con los datos de la disposición de genes de los presentes inventores, dos puntos de control específicos para tolerancia inmune, uno conocido y uno novedoso, son modulados por la ECP. Ambas vías, la vía de biosintesis de la hexosamina (HBP) y la cascada de señalización de mTOR, están implicadas en la detección de nutrientes y la diabetes. Ambas responden normalmente al estrés de bajo nivel que hace que las células sean más tolerantes a desafíos subsiguientes, sugiriendo un efecto de condicionamiento al estrés inducido por la ECP. La ECP es protectora bajo condiciones de estrés agudo, mejorando resultados clínicos después de trasplante mieloablativo de médula ósea, protegiendo a las células en cultivo de ataques pro-apoptóticos, y deteniendo la progresión de diabetes en modelos de ratón genéticos y químicamente inducidos. Estas observaciones son consistentes con las respuestas de condicionamiento inducidas por el estrés, caracterizadas mejor por el pre-condicionamiento isquémico. El pre-condicionamiento induce cambios funcionales y estrucíuraies adaptativos que reducen o previenen ei daño por agresivos psíquicos subsiguientes. Los cambios epigenéticos que resultan de dicho "condicionamiento al estrés" alteran los patrones de expresión génica, afectando la respuesta al estrés agudo y su resolución, y estableciendo protección durable. La presente invención demuestra que la ECP puede inducir dicha respuesta, sosteniendo capacidad celular y organismal por estrés. En el tratamiento de enfermedad preexistente, la ECP induce una resolución más rápida de la patología por medio de una forma de postcondicionamiento, en donde cambios fisiológicos inducidos por el régimen de condicionamiento permiten la reparación y un regreso más rápido a la homeostasis. Se han reportado ejemplos de condicionamiento de respuestas inmunes al estrés. Datos experimentales muestran que el condicionamiento con agresivos psíquicos exógenos es posible, pero las opciones son inherentemente riesgosas. Por ejemplo, regímenes de isquemia, irradiación, hipertermia o hipotermia, anestesia, exposición a endotoxinas, adyuvantes o patógenos y fármacos relativos tóxicos, han mostrado eficacia en modelos animales y unas cuantas pruebas clínicas. Los medios por los cuales el condicionamiento puede lograrse con seguridad, han eludido a los investigadores y médicos clínicos por décadas. Se ha mostrado ahora que la ECP provee los medios para lograr este propósito. La presente invención muestra que la respuesta al estrés puede modularse con seguridad, revelando una alternativa de tratamiento novedosa y nuevos objetivos de fármaco para enfermedades que afectan a millones de personas en todo el mundo, y demuestra un nuevo enlace entre las respuestas al estrés y el sistema inmune. Se sabe que la infusión de células apoptóticas (AC), como en la ECP, induce células Treg y células dendríticas tolerogénicas, pero más allá de la depuración obligada de AC (eferocitosis), el mecanismo de inducción es incierto. La presente invención muestra que varias clases de compuestos, notablemente la rapamicina, los antioxidantes y Celastrol, fueron sinergísticos con la AC in vitro. Estos fármacos modifican las respuestas al estrés, y la presente invención muestra que la eferocitosis puede también. Por supuesto, la infusión de AC alteró los perfiles de expresión de genes metabólicos y sensibles al estrés in vivo y en células dendríticas in vitro. Un ejemplo es la proteina extracelular trombospondina-1. La TSP-1 es sensible al estrés (Zebo et al. (2005); y Favier et al. (2005)), es liberada por células apoptóticas y fagocíticas, y se ha mostrado que genera Tregs y APCs tolerogénicas in vitro a través de interacciones específicas con receptores. Véase Krispin et al. (2006); y Grimbert et al. (2006). La confirmación de estos hallazgos in vitro, muestra que el efecto es independiente del método de inducción de apoptosis. Se examinaron también genes de control metabólico. Puesto que los agresivos psíquicos tienen efectos significativos sobre el sistema inmune, evidenciados por cambios en la expresión génica y el metabolismo de la energía (Fox et al. (2005)), se muestra en la presente que los marcadores en suero del metabolismo de la energía cambian en respuesta a la ECP. Por supuesto, las concentraciones de insulina, glucagon e IGF-1 fueron moduladas por la ECP en una manera dependiente de la dosis y el tiempo en ratones tratados. Dado que los animales con metabolismo disregulado pueden tener respuestas de pre-condicionamiento anormales (Katakam et al. (2006)), los presentes inventores examinaron la expresión génica en vías relevantes, incluyendo enzimas de la vía de biosíntesis de hexosamina (HBP). La expresión de O-GIcNAcasa es sensible a la eferocitosis, y su inhibición o la inhibición de la enzima O-GIcNAc transferasa de la HBP contra-reguladora, altera significativamente la tolerogénesis in vitro. Véase Kudlow (2006); y Dauphinee et al. (2005). Específicamente, PUGNAc y estreptozotocina, inhibidores de la O-GIcNAcasa, potenciaron el efecto de AC, mientras que la inhibición de OGT con aloxana, lo revertió por completo. La HBP es sensible al estrés, y está implicada en la quimiotaxis de neutrófilos. Véase Zachara et al. (2004); y Kneass et al. (2005). La modulación simultánea de la tolerancia inmune y las respuestas al estrés por la HBP era hasta ahora desconocida, y tiene implicaciones de largo alcance, que incluyen nuevos discernimientos en patologías comunes en trastornos metabólicos, neurológicos y cardiovasculares. Véase Lehman et al. (2005); Katakam et al. (2006); Mattson et al. (1999); y Hashizume et al. (2006). Los términos "sujeto" o "paciente" se usan intercambiablemente, y se refieren a un animal, de preferencia un mamífero, y más preferiblemente un humano. Una "población de células" incluye en general un tipo de célula encontrado en la sangre. El término puede incluir uno o más tipos de células sanguíneas, específicamente, glóbulos rojos, plaquetas y glóbulos blancos. Una población de células puede comprender subtipos de glóbulos blancos, por ejemplo, células T, células dendríticas, células B, etc. En una modalidad, una población de células puede comprender una mezcla o grupo de tipos de células. En forma alternativa, una población de células puede comprender un tipo de células sustancialmente purificadas, por ejemplo, células T o células dendriticas (DCs). El "procedimiento de ECP" o "ECP" se refiere a fotoféresis extracorpórea, conocida también como fototerapia extracorpórea. Es un tratamiento de una población de células que ha sido sometida a luz UVA y un compuesto fotoactivable. De preferencia, la población de células es de un órgano o tejido; más preferiblemente, la población de células es una porción de sangre; y muy preferiblemente, la población de células es una cubierta amarilla. La ECP se usa a veces para referirse a un procedimiento en el cual una población de células ha sido sometida a un procedimiento inductor de apoptosis con luz UVA en presencia de un agente de entrelazamiento de ADN tal como un psoraleno (de preferencia, 8-MOP). En la modalidad más preferida de la invención, se usa ECP.

Métodos de uso de la ECP para inducir apoptosis y el uso de las células, se describen en el documento US20050163778. Esto implica un compuesto fotoactivable añadido a una población de células ex vivo. El compuesto fotosensible puede administrarse a una población de células que comprenda células sanguíneas después de su retiro del sujeto, receptor o donador, según pueda ser el caso, y antes de o contemporáneamente con, la exposición a la luz ultravioleta. El compuesto fotosensible puede administrarse a una población de células que comprenda sangre entera o una fracción de la misma, siempre que las células sanguíneas o los componentes sanguíneos objetivo reciban el compuesto fotosensible. En otra modalidad, una porción de sangre del sujeto, sangre del receptor o sangre del donador podría ser procesada primero usando métodos conocidos que remueven sustancialmente los eritrocitos, y el compuesto fotoactivo puede administrarse entonces a la población de células resultante que comprenda la fracción de leucocitos enriquecida. En una modalidad alternativa, el compuesto fotoactivable puede administrarse in vivo. El compuesto fotosensible, cuando se administra a una población de células que comprende la sangre del sujeto, sangre del receptor o sangre del donador, según pueda ser el caso, in vivo, puede administrarse oralmente, pero también puede administrarse intravenosamente y/o por otras vías de administración convencionales. La dosificación oral del compuesto fotosensible puede estar en la escala de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.7 mg/kg, más específicamente, aproximadamente 0.6 mg/kg. Cuando se administra oralmente, el compuesto fotosensible puede administrarse por lo menos aproximadamente una hora antes del tratamiento de fotoféresis, y no más de aproximadamente tres horas antes del tratamiento de fotoféresis. Compuestos fotoactivables para su uso de conformidad con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, compuestos conocidos como psoralenos (o furocumarinas), así como derivados de psoraleno tales como aquellos descritos, por ejemplo, en los documentos US4321919 y US5399719. Compuestos preferidos incluyen 8-metoxipsoraleno; 4,5'8-trimetilpsoraleno; 5-metoxipsoraleno¡ 4-metilpsoraleno¡ 4,4-dimetilpsoraleno; 4-5'-dimetilpsoraleno; 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4', 8-metoxipsoraleno; y un 4'-(omega-amino-2-oxa) alquil-4,5'8-trimetilpsoraleno que incluye, pero no está limitado a, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. En una modalidad, el compuesto fotosensible que puede usarse comprende el derivado de psoraleno, amotosaleno (S-59) (Cerus, Corp., Concord, CA). En otra modalidad, el compuesto fotosensible comprende 8-metoxipsoraleno (8 MOP). La población de células a la cual el compuesto fotoactivable se ha añadido, se trata con una luz de una longitud de onda que active al compuesto fotoactivable. El paso de tratamiento que activa al compuesto fotoactivable se lleva a cabo de preferencia usando luz ultravioleta (UVA) de longitud de onda larga, por ejemplo, a una longitud de onda dentro de la escala de 320 a 400 nm. La exposición a la luz ultravioleta durante el tratamiento de fotoféresis, se administra de preferencia por una duración suficiente que suministre aproximadamente 1-2 J/cm2 a la población de células. Aparatos para fotoféresis extracorpórea útiles en los métodos de conformidad con la invención incluyen los fabricados por Therakos, Inc., (Exton, Pa.) bajo el nombre UVAR™. Una descripción de dicho aparato se encuentra en el documento US4683889. El sistema UVAR™ usa un sistema de tratamiento, y consiste de tres fases que incluyen: 1) la colecta de una fracción de cubierta amarilla (enriquecida en leucocitos), 2) irradiación de la fracción de cubierta amarilla colectada, y 3) reinfusión de los glóbulos blancos tratados. La fase de colecta tiene seis ciclos de extracción de sangre, centrifugación y pasos de reinfusión. Durante cada ciclo, sangre entera se centrifuga y se separa en un tazón de féresis. De esta separación, plasma (el volumen en cada ciclo es determinada por el operador del instrumento UVAR™) y 40 mi de cubierta amarilla se guardan en cada ciclo de colecta. Los eritrocitos y todo el plasma adicional son reinfundidos en el paciente antes de que comience el siguiente ciclo de colecta. Por último, un total de 240 mi de cubierta amarilla y 300 mi de plasma se separan y se guardan para irradiación con luz UVA. La irradiación de la sangre enriquecida en leucocitos dentro del circuito de irradiación, comienza durante la colecta de la cubierta amarilla del primer ciclo de colecta. El plasma y la cubierta amarilla colectados se mezclan con 200 mi de solución salina normal heparinizada y 200 mg de UVADEX™ (8-metoxipsoraleno soluble en agua). Esta mezcla fluye en una capa de 1.4 mm de espesor a través de la cámara de fotoactivación PHOTOCEPTOR™, la cual es insertada entre dos bancos de lámparas de luz UVA PHOTOSETTE™. Las lámparas de luz UVA PHOTOSETTE™ irradian ambos lados de esta cámara PHOTOCEPTOR™ transparente a la luz UVA, permitiendo una exposición por 180 minutos a luz ultravioleta A, dando una exposición promedio por linfocito de 1-2 J/cm2. La preparación final de la cubierta amarilla contiene aproximadamente 20% a 25% del componente total de células mononucleares de sangre periférica, y tiene un hematócrito de 2.5% a 7%. Después del período de fotoactivación, el volumen es reinfundido en el paciente durante un período de 30 a 45 minutos. El documento US20030181305 describe otro sistema para su uso en la administración de ECP. Los documentos US5951509; US5985914; US5984887; US4464166; US4428744; US4398906; US4321919; WO 97/36634; y WO 97/36581 contienen también una descripción de dispositivos y métodos útiles a este respecto. Otro sistema que puede ser útil en los métodos de la presente invención se describe en el documento US6793643. Ese sistema incluye un aparato por el cual el volumen de fluido neto colectado o removido de un sujeto puede ser reducido durante la ECP. La cantidad efectiva de energía luminosa que se suministra a una población de células puede determinarse usando los métodos y sistemas descritos en el documento US6219584. Una variedad de otros métodos para inducir apoptosis en una población de células, es bien conocido y puede adoptarse para su uso en la presente invención. Uno de dichos tratamientos comprende someter una población de células a radiación ionizante (rayos ?, rayos x, etc.) y/o radiación electromagnética no ionizante que incluye luz ultravioleta, calentamiento, enfriamiento, privación de suero, privación de factor de crecimiento, acidificación, dilución, alcalinización, cambio de concentración iónica, privación de suero, irradiación, o una combinación de los mismos. En forma alternativa, puede inducirse apoptosis sometiendo una población de células a ultrasonido. Otro método para inducir apoptosis, comprende la aplicación extracorporea de estrés oxidativo a una población de células. Esto puede lograrse tratando la población de células, en suspensión, con agentes oxidantes químicos tales como peróxido de hidrógeno, otros peróxidos e hidroperóxidos, ozono, permanganatos, peryodatos, y similares. Pueden usarse agentes oxidantes biológicamente aceptables para reducir problemas potenciales asociados con residuos y contaminaciones de la población de células inducidos por apoptosis formada de esta manera. En la preparación de una población de células inducida por apoptosis, debe tenerse cuidado de no aplicar niveles excesivos de estrés oxidativo, radiación, tratamiento con fármacos, etc., debido a que de otra manera puede haber un riesgo significativo de que se cause necrosis de por lo menos algunas de las células bajo tratamiento. La necrosis hace que la membrana celular se rompa, y causa la liberación de contenidos celulares con frecuencia con resultados biológicamente nocivos, en particular eventos inflamatorios, de modo que se evita mejor la presencia de células necróticas y sus componentes junto con la población de células que comprende células apoptóticas. Niveles adecuados de tratamiento de la población de células para inducir apoptosis, y el tipo de tratamiento elegido para inducir apoptosis, son fácilmente determinables por los expertos en la técnica.

Un procedimiento de conformidad con la presente invención implica el cultivo de células del sujeto, o una línea de células de mamífero compatible. Las células cultivadas pueden tratarse entonces extracorpóreamente para inducir apoptosis y crear en la misma una población de células. El tratamiento extracorporeo puede seleccionarse del grupo que consiste de anticuerpos, agentes quimioterapéuticos, radiación, fotoféresis extracorpórea, ultrasonido, proteínas y agentes oxidantes. Las células, suspendidas en el plasma del sujeto u otro medio de suspensión adecuado, tal como solución salina o un medio de cultivo de células de mamífero balanceado, pueden administrarse entonces al paciente. Métodos para la detección y cuantificación de apoptosis son útiles para determinar la presencia y el nivel de apoptosis en la preparación que se va a administrar al sujeto en la presente invención. El número de células apoptóticas en una población de células que se requiere para obtener el beneficio clínico requerido en un sujeto puede variar, dependiendo de la fuente de células, la condición del sujeto, la edad y el peso del sujeto, y otros factores relevantes, los cuales son fácilmente determinables por métodos bien conocidos. De preferencia, el número de células apoptóticas que se administran a un paciente son de 0.1 a 50 mi! millones, más preferiblemente de mil millones a 10 mil millones, y muy preferiblemente de 2.5 a 7.5 mil millones. En una modalidad, las células que sufren apoptosis pueden identificarse mediante una "disposición en escalera" característica de ADN vista en electroforesis sobre gel de agarosa, que resulta de la digestión de ADN en una serie de fragmentos. En otra modalidad, la expresión de superficie de fosfatidilserina sobre células puede usarse para identificar y/o cuantificar una población de células inducida por apoptosis. La medición de cambios en el potencial de membrana mitocondrial, que refleja cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, es otro método reconocido de identificación de una población de células. Muchos otros métodos de identificación de células que sufren apoptosis y de una población de células, muchos usando anticuerpos monoclonales contra marcadores específicos para una población de células, se han descrito también en la literatura científica. La modificación de la terapia con ECP para optimizar el efecto de la ECP sobre la respuesta al estrés, quizá por medio de la vía de la hexosamina, ofrecería nuevas oportunidades terapéuticas. Mediante la optimización de la ECP para modular mejor el sistema inmune por medio de esta "respuesta integrada al estrés" (ISR, conocida también como la "respuesta de la proteína no plegada", "estrés del retículo endoplásmico (ER)" y otros nombres), expande la ECP en estados de enfermedad previamente no examinados en los cuales se cree que esta respuesta a! estrés desempeña una función bíopatológica. Estas enfermedades incluyen patologías de la mayoría de los sistemas de órganos, las cuales son comúnmente intratables y típicamente fatales. Este modo de acción implica condicionar las células para que toleren el estrés a través de la administración individual o repetida de un número adecuado de células apoptóticas, que funcionan como un agresivo psíquico de bajo nivel para el sistema inmune. Estudios previos han mostrado que otros agresivos psíquicos pueden inducir dicho pre-condicionamiento, pero estos agresivos psíquicos probablemente serían inseguros como tratamientos. Por lo tanto, la ECP, una terapia segura y efectiva puesta en el mercado, provee un método para modificar específicamente la respuesta al estrés y alterar la progresión o susceptibilidad de la enfermedad. Esta respuesta al estrés es inducida por numerosos estímulos que evocan señales indicativas de estrés del ER, poniendo demandas sobre el ER que no está preparado para manejar al mismo tiempo el estímulo. Estos agresivos psíquicos incluyen condiciones en donde ocurre una pérdida de control celular de la expresión de las proteínas en el hospedero/paciente. Esto incluye numerosos eventos de señalización celular que llevan a la disfunción del ER (es decir, una velocidad de traducción de proteínas que excede la capacidad celular para modificar o de otra manera procesar adecuadamente las proteínas). Parece ser que este condicionamiento de la respuesta al estrés es inducido no sólo en las células que fagocitan la célula apoptótica, sino también como un resultado de señalización de aquellas células hacia otros tejidos en una manera que propaga señales de que un estrés incrementado está presente. Dicha respuesta requiere un cambio adaptativo por tejidos afectados que se recuperan adecuadamente de las condiciones de estrés de inicio o consecuentes bajo las cuales es probable que el sistema sufra. Por lo tanto, esta invención extiende el uso de la ECP en enfermedades infecciosas y terapias relacionadas que incluyen infección viral (es decir, exposición a ARN de doble cadena patológico o terapéuticamente inducido), en terapia del cáncer en donde la transformación induce estrés del ER y hace caso omiso de la muerte normal de las células y respuestas reparativas, en enfermedades renales asociadas con mal plegamiento o sobreexpresion de proteínas, y enfermedades fibróticas en donde varios estímulos inducen la sobreexpresion de proteínas de la matriz extracelular y crecimiento celular excesivo. Esta invención expande el uso de regímenes terapéuticos existentes en estados de enfermedad que incluyen enfermedades de agregación de proteínas que incluyen, sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington; y enfermedades debilitadoras que incluyen, sin limitación, las encefalopatías espongiformes de infección por priones y la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob variante ("vCJD") heredada. Enfermedades metabólicas e inmunes relacionadas con estrés, que implican resistencia a la insulina y defectos en células secretorias, incluyendo diabetes, síndrome metabólico y otras patologías relacionadas con obesidad, se han relacionado con la respuesta de proteínas no plegadas, y de esta manera son tratables con la terapia con ECP. Esto incluye, sin limitación, aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares relacionadas, en donde la sobreproducción celular de proteínas lleva a deposición patológica de proteínas y sus agregados, y enfermedades de cualquiera de las células secretorias que sobreproducen proteínas como parte de sus historias naturales normal o patológica. Células consideradas con frecuencia entre esta categoría secretoria incluyen, sin limitación, células beta pancreáticas, tejidos de próstata, células inmunes que secretan cantidades significativas de inmunoglobulinas (es decir, células plasmáticas) u otras proteínas (es decir, producción de interferón-gamma por células dendríticas) y células secretorias de mucosas (es decir, células que secretan mucina en el tracto gastrointestinal y las vías respiratorias). Las células que son estimuladas para que alteren su fenotipo para producir cantidades incrementadas de proteína pueden ser afectadas por este estrés, y enfermedades en donde una dísfunción en esta capacidad de producción resulta de una respuesta patológica a ese estrés, proveen tejidos objetivo adicionales para los cuales la ECP provee un beneficio terapéutico. Esto incluye, sin limitación, células del hígado y estómago que producen enzimas, tejidos neuroendocrinos y neuronas que secretan péptidos, y células que son estimuladas para que secreten matriz extracelular y proteínas para la reconstrucción de tejidos en respuesta a lesión (es decir, en curación de heridas o respuesta a daño por radiación). Cualquier célula expuesta al estrés de temperatura o estrés oxidativo puede requerir una respuesta adecuada al estrés, y el condicionamiento de la ECP puede beneficiar ahora muchos de dichos casos, puesto que dicho condicionamiento puede proveer resistencia a daño, o mejorar la reparación del daño que resulta de dichas condiciones de estrés. Por lo tanto, varias exposiciones a ataques ambientales que dan especies de oxígeno reactivas, peroxinitritos, u otras condiciones de estrés oxidativas, son un objetivo de la terapia de ECP. Esto incluye, sin limitación, envenenamiento (es decir, con agroquímicos tales como el paraquat), exposición a radiaciones, ejercicio extremo, quimioterapia, anestesia, exposiciones hiperbáricas, precondiciones genéticas que inducen especies de oxígeno reactivas (es decir, aquellas producidas por el sistema de señalización del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGF")), y trauma. Se sabe que alteraciones en el metabolismo celular que resultan de respuestas al estrés, afectan el transporte celular de pequeñas moléculas además de que alteran el tráfico de proteínas. Los análisis de la expresión génica muestran que la ECP altera benéficamente la expresión de transportadores de resistencia de fármacos múltiples ("MDR"). La ECP optimizada altera la expulsión de fármacos de la célula, limitando o alterando la expresión de bombas y transportadores de MDR, afectando de esta manera la resistencia a fármacos (es decir, en quimioterapia del cáncer o tratamientos con antivirales/antibióticos). En otros casos, la ECP puede ser optimizada para mejorar la captación de fármacos en la célula. Una hipótesis ampliamente aceptada, postula que el proceso de envejecimiento es dirigido por el efecto acumulativo de estrés oxidativo sobre un organismo. Se ha mostrado que !a restricción calórica extiende la duración de vida en parte alterando respuestas celulares al estrés oxidativo, o la generación de ese estrés por el metabolismo normal o excesivo. Dado que la respuesta al estrés inducida por la ECP implica mecanismos similares a los inducidos por la restricción calórica, la ECP modifica los efectos de envejecimiento. Pueden usarse métodos existentes que permiten esta optimización de la ECP. Primero, la respuesta integrada al estrés induce empalme alternativo en varios transcritos conocidos, incluyendo transcritos directamente implicados en el proceso reparativo e interrupción de la traducción característica de esta respuesta al estrés, y la alternativa apoptótica a la reparación, que resulta cuando la célula es incapaz de superar el estrés del ER. Se ha mostrado que el empalme alternativo de ARN mensajero de Xbp-1 ocurre en la respuesta al estrés, y puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica que incluye, sin limitación, PCR cuantitativa usando sangre periférica o biopsias finas de tejido. En forma alternativa, el monitoreo de la actividad de mTOR funciona como un biomarcador de la respuesta al estrés, puesto que las respuestas al estrés caracterizadas hasta la fecha señalizan por medio de la vía de mTOR. La fosforilación de S6 cinasa, el substrato corriente abajo inmediato de mTOR, se ha usado como un marcador farmacodinámico para monitorear la inmunosupresión en pacientes que sufren tratamiento con raparnicina. Aunque los reportes publicados describen un método de Western blot, están disponibles reactivos que se ha demostrado son útiles en el análisis citométrico de flujo de la actividad de mTOR en líneas de células. El monitoreo de la actividad de mTOR en sangre periférica es posible usando métodos conocidos en la técnica que incluyen, sin limitación, citometria de flujo e inmunohistoquímica. Como se muestra en los ejemplos provistos en la presente, el monitoreo de la respuesta a diferentes condiciones de ECP usando biomarcadores de la respuesta al estrés y apoptosis, provee un método para determinar la eficacia de la ECP en enfermedades y condiciones relacionadas con estrés. Mediante la alteración de la dosis de células y el régimen de dosificación usando estos biomarcadores, es posible suministrar ECP con una precisión clínica previamente inalcanzable. Esto aumenta al máximo el potencial terapéutico de la ECP como una terapia independiente, y permite la optimización de la combinación de la ECP con otras farmacoterapias inmunomoduladoras y regímenes de tratamiento. Un biomarcador es cualquier indicio del nivel de expresión de un gen marcador indicado. Los indicios pueden ser directos o indirectos, y miden la sobreexpresión o subexpresión del gen dados los parámetros fisiológicos y en comparación con un control interno, tejido normal u otro carcinoma. Los biomarcadores incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos (sobreexpresión y subexpresión y directos e indirectos). El uso de ácidos nucleicos como biomarcadores puede incluir cualquier método conocido en la técnica que incluye, sin limitación, medición de la amplificación de ADN, ARN, micro ARN, pérdida de heterocigosidad (LOH), polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs, Brookes (1999)), ADN de microsatélites e hipometilación o hipermetilación de ADN. El uso de proteínas como biomarcadores incluye cualquier método conocido en la técnica que incluye, sin limitación, medición de cantidad, actividad, modificaciones tales como glucosilación, fosforilación, ribosilación de ADP, ubiquitinación, etc., o inmunohistoquímica (IHC). Otros biomarcadores incluyen formación de imágenes, conteo de células y marcadores de apoptosis. Un ácido nucleico marcador corresponde a la secuencia designada por una SEQ ID NO cuando contiene esa secuencia. Un segmento o fragmento de gen corresponde a la secuencia de dicho gen, cuando contiene una porción de la secuencia referida o su complemento suficiente para distinguirlo como la secuencia del gen. Un producto de expresión génica corresponde a dicha secuencia cuando su ARN, ARN mensajero, ARNmi o ADNc híbrida con la composición que tiene dicha secuencia (por ejemplo, una sonda) o, en el caso de un péptido o proteína, es codificado por dicho ARN mensajero. Un segmento o fragmento de un producto de expresión génica corresponde a la secuencia de dicho gen o producto de expresión génica, cuando contiene una porción del producto de expresión génica referido o su complemento suficiente para distinguirlo como la secuencia del gen o producto de expresión génica.

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El término "marcador" o "gen marcador", se usa a lo largo de esta especificación para referirse a genes y productos de expresión génica que corresponden con cualquier gen cuya sobreexpresion o subexpresion está asociada con una respuesta relacionada con estrés o con inflamación. La presente invención provee además microdisposiciones o chips de genes para realizar los métodos descritos en la presente. La presente invención provee además carpetas de diagnóstico/pronóstico que contienen reactivos adecuados para medir biomarcadores tales como secuencias de ácido nucleico aisladas, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes como se describen en la presente, en donde la combinación es suficiente para medir o caracterizar la expresión génica en una muestra biológica. Cualquier método descrito en la presente invención puede incluir además la medición de la expresión de por lo menos un gen expresado constitutivamente en la muestra. La invención provee además un método para proveer dirección de la terapia, identificando una respuesta relacionada con estrés o con inflamación de acuerdo con los métodos descritos en la presente, e identificando el tratamiento adecuado para la misma. La invención provee además un método para proveer un pronóstico, identificando una respuesta relacionada con estrés o con inflamación de acuerdo con los métodos descritos en la presente, e identificando el pronóstico correspondiente para la misma. La invención provee además un método para encontrar biomarcadores, que comprende determinar el nivel de expresión de un gen marcador, medir un biomarcador para el gen marcador para determinar la expresión del mismo, analizar la expresión del gen marcador de acuerdo con los métodos descritos en la presente, y determinar si el gen marcador es efectivamente específico para una respuesta relacionada con estrés o con inflamación. La invención provee además equipos, artículos, microdisposiciones o chips de genes, carpetas de diagnóstico/pronóstico para llevar a cabo las pruebas descritas en la presente, y reportes de pacientes para reportar los resultados obtenidos mediante los presentes métodos. La sola presencia o ausencia de secuencias de ácido nucleico particulares en una muestra de tejido, sólo rara vez se ha encontrado tiene valor de diagnóstico o pronóstico. La información acerca de la expresión de varias proteínas, péptidos o ARN mensajero, por otra parte, está viéndose cada vez más como importante. La sola presencia de secuencias de ácido nucleico que tienen el potencial de expresar proteínas, péptidos o ARN mensajero (dichas secuencias referidas como "genes") dentro del genoma por sí misma no es determinativa de si una proteína, péptido o ARN mensajero es expresado en una célula dada. Si o no un gen dado capaz de expresar proteínas, péptidos o ARN mensajero !o hace, y a qué grado dicha expresión ocurre, si la hay, es determinado por una variedad de factores complejos. Sin tener en cuenta las dificultades para entender y evaluar estos factores, la prueba de la expresión génica puede proveer información útil acerca de la ocurrencia de eventos importantes tales como una respuesta relacionada con estrés o con inflamación, y otros fenómenos clínicamente relevantes. Indicaciones relativas del grado al cual los genes son activos o inactivos, pueden encontrarse en perfiles de la expresión génica. Métodos preferidos para establecer perfiles de la expresión génica, incluyen determinar la cantidad de ARN que es producida por un gen que puede codificar para una proteína o péptido. Esto se logra por medio de transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR de exhibición diferencial, análisis Northern Blot y otras pruebas relacionadas. Mientras que sea posible llevar a cabo estas técnicas usando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar ADN complementario (ADNc) o ARN complementario (ARNc) producido a partir de ARN mensajero, y analizarlo por medio de microdisposiciones. Muchas configuraciones de disposiciones diferentes y métodos para su producción son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos 5445934; 5532128; 5556752; 5242974; 5384261 ; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327; 5472672; 5527681 ; 5529756; 5545531 ; 5554501 ; 5561071 ; 5571639; 5593839; 5599695; 5624711 ; 5658734; y 5700637. La tecnología de microdisposiciones permite medir el nivel de ARN mensajero o ARNmi de estado estable de miles de genes simultáneamente, proveyendo una herramienta útil para identificar efectos tales como el inicio o la modulación de una respuesta relacionada con estrés o con inflamación. Dos tecnologías de microdisposiciones están actualmente en uso amplio, disposiciones de oligonucleótidos y de ADNc. Aunque existen diferencias en la construcción de estos chips, esencialmente todo el análisis de datos corriente abajo y resultado son los mismos. El producto de estos análisis, son típicamente mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda marcada usada para detectar una secuencia de ADNc de la muestra que híbrida con una secuencia de ácido nucleico en un sitio conocido sobre la microdisposición. Típicamente, la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc, y de esta manera ARN mensajero o ARNmi, expresada en las células de la muestra. Un gran número de dichas técnicas está disponible y es útil. Métodos preferidos pueden encontrarse en los documentos 6271002; 6218122; 62181 14; y 6004755; y en Keene et al. (2006) RIP-Chip: the isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols 1 : 302-307. El análisis de los niveles de expresión se lleva a cabo comparando dichas intensidades de las señales. Esto se hace mejor generando una matriz de relaciones de las intensidades de expresión de genes en una muestra de prueba, contra aquellas en una muestra control. Por ejemplo, las intensidades de la expresión génica de un tejido enfermo pueden compararse con las intensidades de expresión generadas de tejido normal del mismo tipo. Una relación de estas intensidades de expresión indica el cambio en número de veces en la expresión génica entre las muestras de prueba y control.

La selección puede basarse en pruebas estadísticas que producen listas clasificadas relacionadas con la evidencia de significancia de la expresión diferencial de cada gen entre factores relacionados con una respuesta relacionada con estrés o con inflamación. Ejemplos de dichas pruebas incluyen las pruebas de ANOVA y de Kruskal-Wallis. Las clasificaciones pueden usarse como ponderaciones en un modelo diseñado para interpretar la sumatoria de dichos pesos, hasta un límite, como la preponderancia de evidencia en favor de una clase sobre otra. Evidencia previa como se describe en la literatura, puede usarse también para ajustar las ponderaciones. Los perfiles de expresión génica pueden exhibirse de muchas maneras. La más común es disponer intensidades de fluorescencia o matriz de relaciones sin elaborar en un dendrograma gráfico, en donde columnas indican muestras de prueba y flechas indican genes. Los datos se disponen de modo que genes que tengan perfiles de expresión similares, están próximos entre sí. La relación de expresión para cada gen se visualiza como un color. Por ejemplo, una relación menor de uno (subregulación) aparece en la porción azul del espectro, mientras que una relación mayor de uno (sobrerregulación) aparece en la porción roja de! espectro. Están disponibles programas de software de cómputo disponibles comercialmente que exhiben dichos datos, incluyendo "GeneSpring" (Silicon Genetícs, Inc.) y "Discovery" e "Infer" (Partek, Inc.). En caso de que se midan niveles de proteína para determinar la expresión génica, cualquier método conocido en la técnica es adecuado, siempre que resulte en especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, pueden medirse niveles de proteína por unión a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para la proteína, y midiendo la cantidad de proteína unida al anticuerpo. Los anticuerpos pueden marcarse usando reactivos radiactivos o fluorescentes u otros reactivos detectables que faciliten la detección. Métodos de detección incluyen, sin limitación, prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y técnicas immunoblot. Los perfiles de expresión génica de esta invención pueden usarse también en conjunto con otros métodos de diagnóstico no genéticos útiles en diagnóstico, pronóstico o monitoreo del tratamiento. Por ejemplo, en algunas circunstancias, es benéfico combinar el poder de diagnóstico de los métodos basados en la expresión génica descritos anteriormente, con datos de marcadores convencionales tales como marcadores de proteínas del suero. En uno de dichos métodos, se toma periódicamente sangre de un paciente, y entonces se somete a un inmunoensayo de enzimas para un marcador del suero tal como albúmina. Cuando la concentración del marcador sugiera la probabilidad de una respuesta relacionada con estrés o con inflamación, se toma una muestra fuente sujeta a análisis de la expresión génica. Este procedimiento puede ser particularmente útil cuando otras pruebas dan resultados ambiguos. Los equipos producidos de conformidad con la invención incluyen pruebas formateadas para determinar la expresión de biomarcadores. Estos pueden incluir la totalidad de los materiales o algunos de ellos necesarios para llevar a cabo las pruebas, tales como reactivos e instrucciones, y un medio a través del cual los biomarcadores se ponen a prueba. Los artículos de esta invención incluyen representaciones de la expresión de biomarcadores útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y de otra manera evaluar enfermedades. Estas representaciones de los perfiles son reducidas a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina, como es el caso de medios legibles en computadora (magnéticos, ópticos, y similares). Los artículos pueden incluir también instrucciones para evaluar los perfiles de expresión génica en dichos medios. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tenga instrucciones de cómputo para comparar perfiles de expresión génica de las carpetas de genes descritas anteriormente. Los artículos pueden tener también perfiles de expresión génica registrados digitalmente en los mismos, de modo que puedan compararse con datos de la expresión génica de muestras del paciente. En forma alternativa, los perfiles pueden registrarse en diferente formato de representación. Un registro gráfico, es uno de dichos formatos. Algoritmos de agrupación tales como los incorporados en el software "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. mencionado anteriormente, pueden ayudar mejor en la visualización de dichos datos. Diferentes tipos de artículos de fabricación de conformidad con la invención, son medios o pruebas formateadas usados para revelar perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, microdisposiciones en las cuales complementos de secuencia o sondas son adheridos a una matriz a la cual las secuencias indicativas de los genes de interés se combinan, creando un determinante legible de su presencia. En forma alternativa, los artículos de conformidad con la invención pueden ser adaptados en equipos de reactivos para llevar a cabo hibridación, amplificación y generación de señales indicativas del nivel de expresión de los genes de interés para predecir o monitorear una respuesta relacionada con estrés o con inflamación. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar, pero no para limitar, la invención. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la misma como referencia.

EJEMPLO 1 La fotoféresis extracorpórea es una terapia innovadora con células inmunes aprobada en los Estados Unidos para el tratamiento paliativo de linfoma cutáneo de células T (CTCL), y en Europa para el tratamiento de CTCL y condiciones mediadas por la respuesta inmune, incluyendo enfermedad de injerto contra hospedero, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, VIH y trasplante de órganos sólidos. Véase Suri et al. (2006). La fotoféresis Therakos usa un dispositivo de aféresis de punto de cuidado de circuito cerrado, estéril y conectado al paciente, que extrae y aisla aproximadamente 3 a 5% de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) circulantes. Las células colectadas se tratan ex vivo con el agente de sensibilización con radiación UV 8-metoxipsoraleno (UVADEX®), que es activado entonces por exposición a UV-A y regresado prontamente al paciente (véase la figura 1 ). Las células tratadas con ECP mueren subsiguientemente por medio de apoptosis (una forma de muerte celular programada). Se ha mostrado que la reinfusión intravenosa de células apoptóticas (AC) subregula respuestas inmunes a través de la modulación de citocinas, la generación de células dendríticas tolerogénicas (DCs), y la generación de células Treg. Véase Meloni et al. (2007).

EJEMPLO 2 Acción antiinflamatoria de la ECP en modelos de ratón Los presentes inventores han mostrado que la ECP reduce los procesos inflamatorios asociados con la hipersensibilidad de las vías respiratorias inducida por OVA en ratones. Como se muestra en las figuras 2A-2B, dosis crecientes de células tratadas con ECP tienen una capacidad dependiente de la dosis de reducir !a constricción de las vías respiratorias (panel izquierdo) y patología inflamatoria (infiltrados de células inmunes, panel derecho) después del desafío antigénico de ratones sensibilizados con OVA. La dosis de ECP y la frecuencia de tratamiento se han estudiado en estos modelos de ratón. En conjunto, los datos demuestran que el aumento de la dosis de células y la frecuencia de tratamiento en la ECP están asociados con mejores resultados, especialmente si la ECP se da antes del establecimiento de respuestas inmunes significativas.

EJEMPLO 3 ECP en modelos de diabetes en ratones Se ha reportado la eficacia de la ECP en modelos de diabetes en ratones. Véase Marks et al. (1991 ). Los primeros estudios mostraron una incidencia reducida de diabetes en ratones NOD/Lt y ratones NOD/Wehi tratados con ciclofosfamida, usando suministro semanal de células tratadas con ECP. La experiencia de los presentes inventores con la ECP en modelos de diabetes en murinos, es similar. Ratones NOD/LtJ tratados una vez por semana con 10 millones de células, comenzando a las 11 semanas de edad, después de que se establece daño pancreático, comienzan a mostrar evidencia de diabetes franca. Véase Turley et al. (2003). Sin embargo, los animales tratados con ECP tienen menores niveles de glucosa en sangre que los ratones NOD control sin tratar (figura 3A). La inserción en esta figura muestra que e! índice de diabetes en animales sin tratar a las 20 semanas de edad es de 60%, mientras que sólo dos de nueve (22%) de los animales tratados con ECP son diabéticos. Los animales tratados con ECP son más sanos en otros respectos. La polidipsia y la poliurea son reducidas o están ausentes en ratones tratados con ECP, y los animales tratados con ECP ganan peso normalmente. Sin embargo, los ratones NOD/LtJ sin tratar, muestran una pérdida de peso pronunciada (figura 3B, aproximadamente 8% de pérdida promedio a partir del peso pico promedio).

EJEMPLO 4 Los presentes inventores realizaron estudios para examinar la capacidad de la ECP para prevenir daño pancreático en un modelo de diabetes mellitus tipo 1 con baja dosis múltiple de estreptozotocina (STZ). Como en el modelo de ratones NOD, los niveles de glucosa en sangre son menores que los controles en ratones tratados con 10 millones de células tratadas con ECP en los días -7, -3 y 0 o los días -3, 0 y +2 respecto a la administración de la primera dosis de STZ. Los resultados de este experimento muestran que la ECP puede proveer protección sustancial ante diabetes químicamente inducida (p=0.1 , n=5-7). Véase figura 4.

EJEMPLO 5 Inducción de tolerancia inmune por la ECP La apoptosis de células es un evento extremadamente común, incluso en organismos sanos, y cumple funciones importantes en el desarrollo y el mantenimiento de tejidos. Véase Krysko et al. (2006). La apoptosis y otras formas de muerte celular programada se distinguen en muchas formas de la muerte necrótica que puede resultar de daño o infección. Una de dichas distinciones es críticamente importante con respecto al sistema inmune. La muerte celular que implica la liberación de contenidos de otra manera intracelulares, como en la necrosis, tiende a evocar una respuesta inflamatoria. Este proceso, en donde "señales de peligro" llevan a inflamación, es contrastado por el sistema homeostático, por lo cual las AC son depuradas por fagocitos sin que induzcan una respuesta inflamatoria. Véase Matzinger (2002). De hecho, la depuración de AC induce la respuesta opuesta, tolerancia inmune. Los mecanismos que dirigen este proceso son aún inciertos, pero datos recientes resaltan dos componentes clave de la inducción de tolerancia. Las AC son depuradas por las células que presentan antígenos (APC, por ejemplo, ¡DC y macrófagos) residentes del paciente. Este proceso depura rápidamente las AC, y lleva al engranaje de receptores de superficie de la célula que señalizan para inhibir activamente la maduración de DC, y reducen la expresión de moléculas co-estimuladoras y citocinas proinflamatorias. Véase Mahnke et al. (2003); y Morelli et al. (2003). Asimismo, existe un incremento en la producción de citocinas antiinflamatorias e inducción de células Treg, todas las cuales median la tolerancia inmune. Estas propiedades biológicas de las células apoptóticas son habitualmente explotadas terapéuticamente con la ECP, limitando la activación/maduración de DC, y subregulando de esta manera respuestas de células T perjudiciales. La hipótesis actual que explica el mecanismo de acción de la ECP, se esboza en la figura 5. Se cree que la ECP induce efectos inmunomoduladores, enlistando sistemas endógenos que efectúan reparación y resolución.

EJEMPLO 6 Estudios in vitro de la MOA de la ECP La evidencia en apoyo de este mecanismo se encuentra en estudios que examinan la modulación de la función de DC por células tratadas con ECP in vitro. ¡DC en reposo estimuladas para madurar in vitro con ligando de CD40, producen niveles reducidos de IL-12 cuando son co-cultivadas con células tratadas con ECP y estimuladas con lipopolisacárido bacteriano (LPS, figura 6A). Se observan resultados similares para otras citocinas proinflamatorias que incluyen IL-? ß, IL-6 y FNTa. A la inversa, la adición de células tratadas con ECP a cultivos de DC activados, estimula la producción incrementada de la citocina antiinflamatoria TGFp (figura 6B). De esta manera, el efecto antiinflamatorio es de doble filo, alterando procesos proinflamatorios y antiinflamatorios.

EJEMPLO 7 Estudios in vivo Se ha desarrollado un modelo de ECP en ratones, que permite la combinación de estudios en animales vivos con modelos in vitro. Por ejemplo, APC aisladas de los bazos de ratones a los que se les administraron intravenosamente AC tratadas con ECP, demuestran una capacidad reducida para estimular una MLR cuando son co-cultivadas con células T alogénicas. Asimismo, células T humanas alogénicas no proliferan tan vigorosamente cuando DCs y células T inmaduras son co-cultivadas con células tratadas con ECP. De esta manera, la provisión de AC induce un fenotipo tolerogénico en DCs, reduciendo su capacidad para estimular respuestas de células T (véase figuras 14A-14B y 15). Existe evidencia en ratones y humanos que la infusión de AC induce células Treg. Maeda y colaboradores mostraron en un modelo de hipersensibilidad por contacto, que la modulación inmune de ECP es mediada por células Treg. Véase Maeda et al. (2005). Kleinclauss y colaboradores reportaron que el suministro intravenoso de células apoptóticas induce expansión de células Treg dependiente de! ?T?ß en un modelo de enfermedad de injerto contra hospedero en murinos. Véase Kleinclauss et al. (2006). En humanos, se observa sobrerregulación de células CD4+CD25+ en pacientes con trasplante de órganos sólidos tratados con ECP. Véase Lamioni et al. (2005). Los presentes inventores han mostrado que células tratadas con ECP pueden dirigir la generación de células Treg in vitro. Véase Strobl et al. (2006). Células Treg mantienen tolerancia periférica, inhibiendo activamente respuestas inmunes. Véase Tang et al. (2006). El co-cultivo de células tratadas con ECP con células T humanas no afectadas por 6 a 8 días, lleva a la generación de una población de células T que es capaz de suprimir la proliferación de células T y la producción de IFNy en una MLR. Esto se ilustra en la figura 7. Células Treg generadas con ECP expresan un fenotipo anérgico, el cual puede ser revertido por la adición de IL-2.

EJEMPLO 8 Respuestas al estrés sistémico y tolerancia inmune inducida por la ECP La diabetes mellitus tipo 1 resulta de la destrucción autoinmune de células ß pancreáticas que producen insulina, por células T y macrófagos que se infiltran en los islotes pancreáticos. Véase Barker (2006). Un factor clave en esta destrucción de células ß, es la degradación de la tolerancia inmune. Actualmente, existen muchas terapias inmunosupresoras que se están poniendo a prueba que eligen como objetivo respuestas diabetogénicas uc ciuia i . ??????µ?? ?? ?a , ) , au u- L y i apaiTiit_.ii ia , (_|ue eligen como objetivo células T, han mostrado eficacia en estudios clínicos de pacientes con diabetes mellitus tipo 1. Véase Staeva-Vierira et al. (2007). Sin embargo, muchas de estas estrategias inducen inmunosupresión crónica o tienen toxicidades asociadas que limitan su uso. Terapias que inducen tolerancia y específicamente controlan células T auto-reactivas, son una opción atractiva para la prevención de diabetes mellitus tipo 1. Véase Battaglia et al. (2006). En particular, estrategias terapéuticas que eligen como objetivo la acción de células Treg in vivo, ofrecen una opción atractiva para terapia. Se ha mostrado ahora que la ECP actúa como un agresivo psíquico ambiental de bajo nivel, invocando una respuesta semejante a una respuesta de fase aguda. El efecto terapéutico de la ECP en este panorama surge de una forma de "condicionamiento al estrés", en donde la ECP induce respuestas adaptativas que previenen daño adicional y ayudan en la recuperación. A pesar de extremos comunes que causan enfermedades en diabetes tipo 1 y tipo 2 (es decir, apoptosis de células ß), diferentes factores dirigen el resultado final en cada manifestación de diabetes. Véase Eizirik et al. (2001 ); y Cnop et al. (2005). Los agresivos psíquicos ambientales desempeñan una función en ambas enfermedades, sugiriendo que la sensibilidad al estrés de refuerzo podría alterar procesos patogénicos subcelulares. Véase Dahlquist (2006); Ludvigsson (2006); y Knip ef al. (2005). La ECP es de esta manera efectiva en el tratamiento de enfermedades que surgen de mala adaptación a estrés sostenido, incluyendo diabetes. Los agresivos psíquicos ambientales y celulares tienen impactos significativos sobre la función inmune. Se ha mostrado que el sistema nervioso central (SNC) modula la respuesta inmune, la función pancreática y la susceptibilidad de las células a agentes diabetogénicos, demostrando la estrecha conexión entre las respuestas al estrés sistémico y los efectos celulares. Véase Flesner (2005); Ader et al. (1992); Morrell et al. (1988); y Coskun et al. (2004). Enlaces entre los sistemas nerviosos central e inmune están bien establecidos, y son ilustrados con más frecuencia por efectos supresores de estrés crónico o inmunidad. Sin embargo, olvidadas son las conexiones cableadas del "reflejo inflamatorio", por el cual la infección y el daño a tejidos activa agudamente componentes de la respuesta de lucha o vuelo, mejorando temporalmente la inmunidad innata. Véase Baumann et al. (1994); y Baumann et al. (1990). Esta interacción entre sistemas reguladores principales, ofrece oportunidades para mal funcionamiento y enfermedad, pero también para intervención y cura. En esta sección se presenta evidencia de que la ECP puede modular sistemas de respuesta al estrés sistémico, y que puede alterar de esta manera la función inmune. La respuesta al estrés sistémico arquetipo implica la activación del eje hipotálamo-pituitaria-glándulas suprarrenales (HPA) y otras vías neuroendocrinas. Estos son procesos bien entendidos, que llevan a las respuestas sistémicas predecibles de la respuesta de lucha o vuelo. Vista más comúnmente como una respuesta a estímulos externos (por ejemplo, combate o escape de la depredación), la activación de estas vías es esencialmente idéntica cuando el agresivo psíquico surge desde el interior. Por ejemplo, la activación de respuestas a estrés neuroendocrino por percepciones psicológicas (y percepciones erróneas), puede generar la misma reacción fisiológica que el león hipotético en los arbustos, e impacta sobre el sistema inmune de la misma manera. Véase Rohleder et al. (2006); Jara et al. (2006); Leonard (2005); y Gold et al. (2005). El estrés y la inflamación son procesos intensivos de energía. Los presentes inventores han examinado el impacto del tratamiento con ECP sobre marcadores endocrinos del metabolismo de la energía en ratones. Realizaron inmunoensayos múltiplex en la plataforma Luminex, examinando 59 analitos concurrentemente. Consistente con la hipótesis de condicionamiento al estrés, las concentraciones circulantes de numerosos analitos es afectada por la ECP en una manera dependiente de la dosis que varía con el plan de tratamiento. El volumen de este trabajo se hizo en un modelo de inflamación pulmonar en ratones, por el cual se puso a prueba el "pretratamiento" con ECP como profilaxis para la prevención de inflamación por desafíos antigénicos subsiguientes. En este estudio se sensibilizó a animales, y se desafió después a los mismos con OVA para inducir una respuesta tipo asma. La prueba fisiológica y la colecta de tejidos se realizaron 72 horas después del desafío inflamatorio (es decir, 96 horas después de la última dosis de células tratadas con ECP). Varios regímenes de ECP se pusieron a prueba para su capacidad para reducir la inflamación. Como se mostró previamente en las figuras 2A-2B, la ECP lleva a una reducción dependiente de !a dosis de células en hipersensibilidad de las vías respiratorias e inflamación pulmonar en este modelo. Las figuras 8A-8D muestran los resultados de un experimento separado. Se dieron dosis una vez por semana de 50 millones de células tratadas con ECP a tiempos variables durante los 22 días entre la sensibilización y el desafío. Aquí, los tres regímenes de ECP fueron efectivos a diferentes grados como terapias profilácticas, reflejadas en varias medidas diferentes de fisiología y patología inflamatoria. Inesperadamente, los cambios inducidos por la ECP en el perfil de biomarcadores inflamatorios, asemejaron una respuesta de fase aguda (APR). Proteína C reactiva (CRP) en suero, hormona de crecimiento (GH), factor de von Willebrand (vWF) y haptoglobina, fueron alterados en una forma dependiente de la ECP. No mostradas, pero también afectadas por la ECP, son las proteínas positivas de fase aguda (APP) leptina, factor inhibidor de leucemia (LIF), insulina y fibrinógeno, los cuales son sobrerregulados en respuesta a daño tisular, infección y otros agresivos psíquicos. Véase Baumann ef al. (1994). La leptina, además de sus funciones en la modulación de la masa grasa y la saciedad, es una adipocina proinflamatoria putativa. Véase Materese et al. (2005). Otras proteínas proinflamatorias, vasoactivas y hemostáticas conocidas por ser alteradas por respuestas inflamatorias sistémicas, mostraron sensibilidad a la ECP, incluyendo el factor tisular (TF), el factor VII (F7) y la proteína 1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1 ). Es evidente de estos datos que todos los regímenes de ECP afectaron estas APP, y que la oportunidad de la administración de la ECP es crítica. Cuatro tratamientos de igual dosis de células tuvieron un mayor impacto sobre biomarcadores cuando se dieron en días consecutivos poco antes del desafío con OVA, que cuando se extendieron sobre el período de tres semanas entre la sensibilización y el desafío. Notablemente, el tratamiento de los ratones en el día del desafío con OVA y los dos días siguientes, tuvieron el mayor impacto sobre la mayoría de estos biomarcadores de ECP. De modo interesante, los perfiles de biomarcadores de los primeros regímenes, en donde hasta 6 dosis de ECP se dieron no después de 1 1 días después de la sensibilización, fueron indistinguibles del régimen de una vez por semana a pesar del número de tratamientos. De nuevo, esos perfiles asemejaron una APR. Efectos similares dependientes del régimen y de la dosis de células sobre biomarcadores del suero, fueron reproducidos en otros modelos de enfermedad inflamatoria en ratones. La diversidad de esos modelos, que incluyó hipersensibilidad por contacto, baja dosis de LPS, trasplante alogénico de anillo traqueal e incluso ratones sanos, sugiere que éste es un fenómeno generalizado que resulta de la ECP más que el ataque inflamatorio de un modelo dado. Se esperaría que una APR incremente las demandas metabólicas, de modo que los presentes inventores se enfocaron en biomarcadores de APP relevantes que reflejan metabolismo incrementado. Véase Richardson et al. (2003). La insulina, que es conocida por modular la expresión de APP, y el glucagon, otra APP, se midieron en un modelo de inflamación pulmonar. Véase Campos et a!. (1992). En comparación con los ratones sin tratar, el glucagon y la insulina en suero fueron reducidos en ratones tratados con ECP 72 horas después del desafío con OVA intranasal (figura 9, n = 18-21 , p<0.01 y 0.05, respectivamente). 72 horas después del desafío con OVA, los perfiles de biomarcadores inducidos por ECP no son diferentes del control negativo, mientras que los animales sin tratar muestran elevaciones tanto en insulina como en glucagon. Estos perfiles de biomarcadores, ocurriendo simultáneamente con reducciones en inflamación relacionadas con el tratamiento, llevaron a proponer que 72 horas post-desafío, las muestras reflejan la fase de recuperación de grupos de tratamiento en este modelo, recuperándose los animales tratados con ECP más rápidamente que los controles. Esta teoría se puso a prueba directamente por muestreo en puntos de tiempo tempranos en el mismo modelo (figuras 10A-10B). Estos resultados muestran que la ECP induce incrementos en la insulina circulante (panel izquierdo) y el glucagon (panel derecho), cuando se comparan con los controles negativos. Estos analitos aumentan en tándem en animales tratados con ECP y control positivo, respecto a animales control negativo. Como se ve en la figura 9, ambos biomarcadores regresan al punto de partida alrededor de 72 horas en ratones tratados con ECP, pero ninguna indicación de resolución se observa en animales control sin tratar en ese tiempo. Este aumento simultáneo en dos hormonas pancreáticas con efectos opuestos sobre el metabolismo de !a energía, pareció ser contradictorio al principio. Se sostiene ampliamente que la insulina es una hormona anabólica, mientras que se considera típicamente al glucagon como un conductor de catabolismo. Reportes de principios de la década de los setenta, demostraron sinergia entre la insulina y el glucagon en la facilitación de la recuperación de ratas ante la hepatectomía parcial, y estudios subsiguientes mostraron concentraciones en plasma incrementadas de epinefrina, norepinefrina, glucagon y corticosterona después de la infusión de endotoxinas o la pinchadura y ligación cecal, dos modelos de sepsis. Véase Bucher et al. (1973). Los incrementos en el glucagon en plasma en aquellos modelos se correlacionaron después con la aparición de FNT-a, IFN-? e IL-6, llevando a la sugerencia de que el glucagon puede alterar el metabolismo de la glucosa hepática para manejar necesidades simultáneas de hiperglucemia, y captación incrementada de glucosa tisular durante la inflamación. Véase Bucher ef al. (1975). El LPS y las citocinas son conocidos también por incrementar la secreción de leptina. Los presentes inventores examinaron la leptina en suero y vieron que aumenta, aunque con un pico posterior que continúa siendo elevado por cuando menos una semana en este modelo (figura 1 1 ). Estos efectos dependientes de la ECP sobre la leptina en suero asemejan también una APR. Los presentes inventores examinaron después el perfil de leptina en las mismas muestras descritas en las figuras 10A-10B, para determinar el curso de tiempo de la liberación de leptina. De nuevo, la leptina se incrementa ci u n iw c al iiua cu l aiuncs aiauus ??? i i_\^ r y ?? ? ? ii aicii . Consistente con los perfiles publicados, la leptina alcanza un pico después en la APR que los genes de respuesta temprana tales como IL-1 ß y FNTa. Véase Bornstein er a/. (1998); y Granowitz et al. (1999). Por lo tanto, estos efectos endocrinos son solamente un reflejo de la energía consumida durante la inflamación y su resolución. En otras palabras, más que un resultado basado en mecanismo, estos hallazgos son solamente una consecuencia indirecta de la actividad de la ECP. Aunque la insulina es supuestamente una hormona antiinflamatoria, los incrementos en GH y leptina parecieron ser inconsistentes con una respuesta terapéutica antiinflamatoria. Véase Viardot et al. (2007). Esto aprontó considerar una hipótesis alternativa. Considerando estos datos, los presentes inventores propusieron que la ECP misma induce un efecto proinflamatorio transitorio leve, no diferente de una APR, que podría funcionar como un "estrés de condicionamiento" terapéutico. Esto se consignó experimentalmente. Se infundieron células tratadas con ECP en ratones sanos, y se examinaron los mismos biomarcadores. Los resultados en la figura 12 muestran que la insulina, la leptina y el glucagon están elevados en ratones tratados con ECP en comparación con los controles negativos. El curso de tiempo de estos cambios muestra que las concentraciones pico aparecieron 24 horas después del tratamiento, y se resolvieron casi por completo alrededor de las 48 horas. Esto es diferente del curso de tiempo visto en modelos inflamatorios, en donde cambios inducidos por la ECP alcanzan un pico 48 horas después de! último tratamiento con ECP. El cortisol (CORT, corticosterona en roedores) es otro reactivo de fase aguda que se correlaciona con la leptina en la APR. Véase Faggioni et al. (1999). El CORT se midió también en este experimento, y aumenta en tándem con los otros tres biomarcadores. La liberación de corticosteroide tal como la que se muestra aquí, es un signo clásico de que la respuesta de lucha o vuelo ha sido activada. Véase Harbuz (2002). El CORT provee de esta manera un enlace crucial con respuestas al estrés sistémico y el sistema nervioso central, sugiriendo un mecanismo por el cual la infusión de AC en la circulación periférica afecta muchos tejidos y enfermedades diferentes. Para reforzar el enlace entre estos marcadores y la MOA de la ECP, los presentes inventores examinaron a continuación relaciones de respuesta a la dosis de biomarcadores en ratones sanos. Las figuras 13A-13C muestran el efecto de infundir diferentes números de AC sobre CORT (figura 13A), insulina (figura 13B) y leptina (figura 13C). Todas las muestras se colectaron 24 horas después de la ECP. Como ocurre con otros biomarcadores próximos al mecanismo, estas hormonas cambian en proporción a la exposición, reflejada aquí en la dosis de células. Véase Colbum (2003). Los presentes inventores han provisto de esta manera evidencia de que la ECP induce respuestas al estrés sistémico en ratones, que son reminiscencias de las respuestas clásicas de fase aguda y de lucha o vuelo. En la siguiente sección, se enlaza la ECP a respuestas a! estrés celular, y se presenta un modelo mecanicista para el condicionamiento al estrés inducido por la ECP.

EJEMPLO 9 Evidencia molecular y celular que enlaza la ECP a las respuestas al estrés Inherente en la ¡dea de que un agresivo psíquico sistémico puede efectuar cambios en órganos, tejidos y células, es un mecanismo por el cual el estrés sistémico induce esas respuestas reparativas. Evidencia abundante muestra que las hormonas del estrés afectan el metabolismo de la energía en respuesta a estímulos de lucha o vuelo, proporcionando de nuevo fuentes listas de energía lejos de sistemas menos esenciales. Estas respuestas sistémicas a catecolaminas y otros mediadores de estrés surgen de eventos mediados por receptores al nivel celular, que llevan a cambios adaptativos al nivel de organismo. Las células individuales responden a cambios ambientales locales en una manera que refleja respuestas al estrés sistemático. Las células hacen cambios fundamentales en su uso de la energía y distribución de recursos para adaptarse mejor a un desafío dado con lo que puede describirse como una respuesta subcelular de lucha o vuelo. La primera vía estratégica lleva a adaptación celular, por la cual cambios estructurales y funcionales "se unen en batalla" para satisfacer demandas ambientales recién alteradas. La última vía (vuelo) induce señales de alarma celulares, que lleva a inflamación sistémica o localizada. Además de programas de reparación, estas respuestas pueden inducir la muerte apoptótica de células que no pueden ajustarse adecuadamente. Véase Marciniak et al. (2004). Esta forma de "vuelo" hace que sus recursos estén disponibles para el organismo para el proceso de restauración. La versión sistémica de esta respuesta deja sitio para error a corto plazo, pero las células son extremadamente conservativas a este respecto. Demoras incluso ligeras en el paso de puntos de control de respuesta al daño, causan apoptosis en células normales. Esto se ha denominado la ley Samurai de la biología celular, en donde "es mejor estar muerto que estar equivocado". Véase Skulachev (2001 ). Para mantener la homeostasis, estas respuestas de reparación y adaptativas a la ECP deben ocurrir en cualquier célula afectada, y deben surgir después de la detección de cambios ambientales inducidos por estrés. La imposibilidad de satisfacer cualquiera de estos dos extremos homeostáticos, es una causa subyacente de diabetes y otras enfermedades crónicas. Véase Marciniak et al. (2006). El proceso de traducción de proteínas, en particular la biogénesis de ribosomas y el alargamiento de los péptidos, está entre los procesos que demandan más energía en una célula. Para engranar un estrés e intentar la reparación, una célula detiene típicamente la traducción de proteínas "no esenciales", cambia hacia uso catabólico de la energía, y desarrolla capacidad de biosíntesís incrementada. Dada la frugalidad de la naturaleza, los sistemas que llevan a cabo esta función a pesar de las fluctuaciones ambientales normales en los recursos, parecen cumplir probablemente funciones adicionales en el mantenimiento de la homeostasis a pesar de los agresivos psíquicos. Se han identificado por lo menos tres sistemas sensibles a nutrientes que cumplen esta función. La respuesta de proteínas no plegadas (UPR) dependiente del ER y respuestas independientes del ER mediadas por el objetivo de rapamicina de mamíferos (mTOR), y la vía de biosíntesis de hexosamina (HBP), son activadas en respuesta a diversos agresivos psíquicos. En esta sección se describen estas vías, y se introduce evidencia que las implica en la actividad de la ECP.

Respuesta de las proteínas no plegadas Enfermedades del plegamiento de proteínas tales como la diabetes mellitus tipo 1 , resultan de disfunciones en respuestas al estrés celular, especialmente la "respuesta de las proteínas no plegadas" (UPR) evolutivamente conservada. Véase Harding et al. (2004). Este programa estereotípico, denominado a veces la respuesta al estrés del retículo endoplásmico (ER), es dirigido por proteínas residentes en el ER, y permite típicamente un retorno a la homeostasis celular. Este proceso, cuando se repite entre las células afectadas de un tejido dado, puede dirigir la recuperación de ese tejido ante ataques ambientales. La UPR desempeña también una función en tejidos sanos, puesto que señales externas que incrementan las demandas en una célula normal, pueden iniciar una UPR. Por ejemplo, la unión aguda de un antígeno al receptor de células B activa a la célula, y dirige su desarrollo y expansión en células plasmáticas que secretan anticuerpos. Esto requiere una "reorganización" mayor de la maquinaria de biosíntesis de la célula, y funciona como un agresivo psíquico que inicia la UPR. Véase Iwakoshi et al. (2003). La UPR es un sistema de respuesta rápida, y media la fosforilación del factor de iniciación 2a eucariótico (EIF2a) que detiene la traducción. Véase Harding et al. (2003). Este componente de la maquinaria de traducción es necesario para la iniciación de la "traducción dependiente del capuchón", que dirige la producción de la mayoría de las proteínas celulares. Véase Kozak (1999). Un subgrupo de genes es traducido por un sistema independiente del capuchón usando sitios internos de entrada del ribosoma (IRES) que traducen ARN mensajero. Véase Hellen et al. (2001 ). Dicha traducción por IRES se encuentra en genes que dirigen la UPR, codificando típicamente para enzimas de biosíntesis, canales de transmembrana y transportadores que incrementan la disponibilidad de materias primas, proteínas implicadas en control de calidad de traducción y post-traducción, y sistemas de defensa antioxidantes. Véase Komar et al. (2005); y Lin et al. (2007). Por lo menos cuatro vías distintas llevan a la fosforilación de EIF2a que inicia diferentes componentes de la UPR. Por ejemplo, la sobrcrrcgulación de la capacidad aníioxidante y ciertos genes de respuesta de la UPR corriente abajo, es dirigida por un proceso conocido como la respuesta integrada al estrés (ISR), y mediada por la activación del factor de transcripción 4 (ATF4). PERK, es una cinasa de inactivación de EIF2a que dirige la inhibición de la traducción dependiente del capuchón, llevando a demandas disminuidas de ATP en la traducción y el plegamiento de proteínas no esenciales. IRE1 y ATF6 inician respuestas de UPR adicionales que sobrerregulan genes específicos implicados en la modulación de la estructura secundaria de las proteínas y la degradación de productos de traducción mal plegados. El estrés agudo extremo del ER o la activación prolongada de estas vías, como en células ß pancreáticas sobrecargadas o de otra manera bajo estrés, llevan a apoptosis dependiente del ER por varias vías diferentes. Véase Szegezdi et al. (2006). La falla de estos eventos apoptóticos y reparativos a pesar del estrés continuo del ER, puede ser un factor subyacente en la patología de enfermedades de la UPR. Un objetivo de esta propuesta es entender mejor la función que la URP desempeña en la modulación de la tolerancia inmune in vitro.

La HBP y mTOR son sensores de estrés ambiental y de nutrientes que median respuestas al estrés celular independientes de la UPR La traducción dependiente del capuchón es regulada también por otra vía de señalización sensible al estrés, independiente de las señales de la UPR. Significativamente, la mayoría de estos efectos alternativos sobre ia traducción son mediados por mTOR, conocido también como e¡ objetivo de rapamicina, una proteína cinasa relacionada con fosfatidilinositol 3-cinasa central para el control del crecimiento y la proliferación celular. Véase Sarbassov et al. (2005). mTOR está corriente abajo de numerosas vías de señalización que detectan el factor de crecimiento y nutrientes, y controla componentes críticos de la maquinaria de biosíntesis de proteínas que alteran el tamaño y la división de las células, la biogénesis de ribosomas y uso de nutrientes. La fosforilación de componentes clave de complejos de inicio de la traducción por mTOR, permite que proceda la traducción dependiente del capuchón. La naturaleza sensible al estrés y nutrientes de la señalización de mTOR, desempeña una función clave que asegura que los procesos celulares se acoplen adecuadamente con su ambiente. Se sabe que vías sensibles a nutrientes alteran la actividad de mTOR, o la localización de sus objetivos, añadiendo otro nivel de complejidad al control de la traducción. Señales corriente arriba incluyen Akt, un efector de cinasa de supervivencia de insulina y receptores del factor de crecimiento, y AMPK, un sensor de disponibilidad de energía en la célula. Véase Reioling et al. (2006). Las figuras 14A-14B muestran evidencia que enlaza el engullimiento de AC con la señalización de mTOR. Se co-cultivaron DC con AC a diferentes relaciones de AC:DC (denotadas a lo largo de la abscisa). Las células se incubaron varias veces, y la fosforilación de S6 cinasa, una medida de la actividad de mTOR, se midió por citometría de flujo. Véase Hinton et al. (2004). Ambos paneles i i iuccati dN un eieoiu UCJJCI luiente uc ?a uusis uc uciuiai cu ILO y I I IU . modo interesante, existe una diferencia significativa dependiente del estado de maduración de DC en estas respuestas. Las vías de UPR y mTOR son afectadas directamente por la disponibilidad de nutrientes, e indirectamente por el estrés. Véase Carreterp et al. (2007). La vía de biosíntesis de hexosamina es el tercero de dichos sistemas. La HBP es activada en proporción directa con la concentración intracelular de glucosa. Véase Love et al. (2005). El resultado final de la activación de HBP, un incremento en la modificación de proteínas con O-GIcNAc, resulta en síntomas asociados con diabetes. Véase Amdra et al. (2007). Una célula puede detectar y responder de esta manera a la disponibilidad de glucosa intracelular y a una variedad de agresivos psíquicos celulares usando esta vía. Una consecuencia de la activación de HBP es la adaptación. La HBP dirige esta respuesta, y media el condicionamiento al estrés.

Condicionamiento al estrés por medio de vías que detectan nutrientes Los agresivos psíquicos y la glucosa incrementan la actividad de HBP e incrementan la resistencia al estrés subsiguiente. Véase Zachara ef al. (2004). La glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) es la enzima primaria y limitativa de velocidad en la HBP, y desempeña una función en la detección de glucosa y la saciedad. Véase Cooksey ef al. (2002). La generación de UDP- -acetilglucosamina (UDP-GIcNAc) mediada por GFAT, provee este precursor esencial para la glucosilación N- y O-enlazada de proteínas post-traducción. Véase Buse (2006). Una de dichas reacciones implica la adición del monosacárido GIcNAc a residuos de serina y treonina de proteínas maduras. Esta es dirigida por la O-GIcNAc transferasa (OGT), una enzima clave en la HBP, y puede alterar la estructura terciaria de las proteínas y limitar la accesibilidad de aquellos residuos de Ser Thr y sitios vecinos hacia las proteina cinasas. Véase Yang (2005). Estos eventos pueden causar y modular la participación de substratos de OGT en ciertas cascadas de señalización, y alterar su localización en la célula. La última consecuencia se debe a la alteración de interacciones de proteína-proteína, notablemente con lectinas y chaperones celulares. Véase Guinez et al. (2004). Esto puede afectar su capacidad para participar en la regulación y/o traducción de genes. Ejemplos prominentes de esto se ven en los efectos inhibidores de la activación de HBP sobre la actividad de proteasomas y sobre la localización de varios factores de transcripción. Véase Gao ef al. (2003). La hiperglucemia incrementa la actividad de HBP, e incrementa el contenido de O-GIcNAc de NeuroDI , un factor de transcripción pancreático. Esto afecta la localización de NeuroDI , incrementando de esta manera la transcripción de genes de insulina. Aunque no se ha descrito un enlace directo entre la HBP y la UPR, la HBP puede alterar la traducción, por lo menos indirectamente. Se ha mostrado que la HBP altera la señalización corriente debajo de mTOR, mTOR que se combina con, y regula, ciertas fosfatasas que modulan la p70S6 cinasa y componentes de la vía de señalización de JAK/STAT. Véase Dauphinee et al. (2005). Puesto que alfa4 carece de una señal de localización nuclear, su distribución entre el citoplasma y el núcleo es controlada por interacciones de proteína-proteína. La interrupción de estas interacciones ocurre con las modificaciones que resultan de la activación de HBP, que hacen que alfa4 continúe siendo citosólica y sean capaz de modular la traducción. Estos sistemas que detectan nutrientes son sensibles al estrés y, al igual que la UPR, pueden alterar funciones celulares que acoplan las demandas y la disponibilidad de recursos. En otra similitud con sistemas sensibles al estrés del ER, la modulación transitoria de mTOR y la HBP protege contra agresivos psíquicos subsiguientes. Por ejemplo, una variedad de agresivos psíquicos alteran la actividad de HBP in v¡trot y los miméticos farmacológicos de la activación de HBP tienen un efecto de condicionamiento adaptativo. Se ha mostrado recientemente que la rapamicina induce también un efecto de pre-condicionamiento, protegiendo contra agresivos psíquicos pro-apoptóticos subsiguientes, más probablemente a través de sus efectos sobre p70S6 cinasa y autofagia. Véase Ravikumar et al. (2006). Esto es especialmente relevante en diabetes, que está enlazada a la actividad de HBP y mTOR. Véase Marshall (2006). La vía de mTOR ocupa un punto de control crítico para señales mediadas por nutrientes, y desempeña una función en el desarrollo y la función pancreática. Véase Bussier et al. (2006). Más evidencia que enlaza respuestas al estrés/nutrientes con la función inmune, se obtuvo usando la MLR. Los presentes inventores usaron fármacos que se sabe inhiben las dos enzimas clave en la HBP, OGT y N-acetil-beta-D-glucosamínidasa (O-GIcNAcasa) selectiva de O-GIcNAc, que añaden y remueven la porción de O-GIcNAc de las proteínas, respectivamente. Los presentes inventores examinaron la MLR en presencia de estreptozotocina (STZ) o PUGNAc, dos antibióticos que se sabe inhiben a la O-GIcNAcasa, e incrementan la cantidad de proteínas celulares con la modificación de O-GIcNAc. Véase Arias eí al. (2004). En ambos casos, los inhibidores potenciaron la ECP, aumentando la naturaleza tolerogéníca de AC. Esto ocurre a concentraciones de fármaco bien por debajo de la escala tóxica para células T y DC. La figura 15 muestra los resultados del uso de PUGNAc. Este fármaco no tiene efecto apreciable sobre la MLR misma a través de todas las dosis puestas a prueba, reflejado en ausencia de inhibición de la proliferación en la prueba. Sin embargo, cuando se añaden AC, la "tolerogénesis" inducida por la ECP se incrementa hasta por aproximadamente 50% arriba de esta respuesta de AC típica (aproximadamente 30% de inhibición, véase el resultado de PUGNAc 0 mM). Este hallazgo se reprodujo usando STZ, otro inhibidor de O-GIcNAcasa. Más evidencia que implica la HBP en la función inmune se ve cuando la enzima de oposición, OGT, es inhibida usando aloxana (Allx, figuras 16A-16B). La aloxana tiene un efecto opuesto sobre la MLR en comparación con PUGNAc, y afecta diferencialmenie a rnDC e iDC. Notablemente, la aloxana potencia reproduciblemente la proliferación en la MLR cuando se usan iDC como APC (figura 16A). La aloxana no tiene esencialmente efecto alguno sobre la MLR cuando se usan rnDC (datos no mostrados). Datos preliminares adicionales que analizan la reducción de azul de alamar como una medida de la viabilidad, mostraron proliferación incrementada de células T inducida por aloxana en cultivo a través de las escalas puestas a prueba (figura 16B). Véase cuadro 1.

CUADRO 1 Lista de transcritos más afectados por la ECP Cambio Gen Descripción/anotación Hacia CD126 Il6ra Receptor alfa de interleucina-6 abajo Hacia Antizima 2 de ornitina Inhibidor del crecimiento y la Oaz2 abajo descarboxilasa proliferación celulares Inhibidor de crecimiento Hacia Inhibidor del crecimiento y la tipo RAS regulado por Rerg abajo proliferación celulares estrógeno Hacia Aminoadipato- Aass Catabolismo de lisina abajo semialdehído sintasa Hacia Gen 5 de proteina de Gata5 Factor de transcripción abajo unión a GATA Gen 1 especifico de Hacia interrupción del Gas1 Inhibidor del ciclo celular abajo crecimiento Hacia Co-transportador de Sic5a1 Transporte de glucosa abajo sodio/glucosa Hacia Gen tipo desoxirribosa- Dera Enzima glucolítica abajo fosfato aldolasa Gen 5 de antígeno Hacia expresado por Mgea5 O-GIcNAcasa abajo meningioma (hialuronidasa) Hacia Citohesina Pscd3 Estructura y función del Golgi arriba Gen relacionado con Hacia ataxia telangiectasia y Atr PI3K sensible al daño del ADN arriba rad3 Subunidad H2 del Hacia complejo de condensina II Ncaph2 Epigenética arriba sin SMC Hacia Subunidad de proteasoma, Psma6 Proteasoma arriba tipo 6 alfa Hacia Dominio 2 de repetición de Gen sensible al estrés de Pctd2 arriba pentatricopéptido función desconocida Presentación del Hacia GRP94 Hsp90b1 antígeno/proteína de choque arriba térmico CUADRO 1 (CONTINUACION) Gran molécula Hacia embrionaria derivada del elys Factor de transcripción arriba saco vitelino Hacia Secuencia de fusión de L- Rlf Regulación de la transcripción arriba myc reordenada Hacia Subunidad 3 del factor de Sf3b3 Espliceosoma arriba empalme 3b Hacia Gen 4 que contiene Epigenética: lisina Setd4 arriba dominio Set metiltransferasa Buscando discernimientos adicionales en la MOA de la ECP celular y molecular, los presentes inventores usaron disposiciones de expresión génica Affymetrix y procedimientos de bioinformática estándar, para examinar perfiles de ARN mensajero en varios tejidos a partir de modelos de inflamación en ratones. En órganos linfoides secundarios, observaron cambios significativos en la expresión dentro de una serie de genes que cambian con frecuencia como parte de respuestas al estrés celular programadas. Como se ilustra en cuadro 1 , 96 horas después de la última infusión de AC, la ECP alteró la expresión de genes implicados en vías metabólicas, genes implicados en la síntesis y procesamiento de proteínas, y vías sensibles al estrés (por ejemplo, O-GIcNAcasa). Esto sugiere además que las vías de respuesta al estrés son modificadas por la ECP, pero se necesitarán respuesta de ECP.

EJEMPLO 10 Condicionamiento al estrés terapéutico Las enfermedades por el plegamiento de proteínas incluyen las enfermedades crónicas más frecuentes, y están asociadas con altos grados de morbilidad y mortalidad. Véase Xu et al. (2005). El tratamiento efectivo de la mayoría de estas condiciones es limitado, debido en gran parte al poco entendimiento de sus etiologías subyacentes. Es cada vez más evidente que muchas de las secuelas debilitadoras y finalmente fatales de las enfermedades por el plegamiento de proteínas, incluyen un componente inflamatorio. Véase Yoshida et al. (2007). Las terapias existentes están dirigidas típicamente a limitar la inflamación sin que se altere su causa subyacente. Ejemplos prominentes de esta alternativa incluyen esferoides, AINEs y terapias anti-citocinas, en el caso de enfermedades de UPR y sus complicaciones. Las estrategias más nuevas probablemente elegirán como objetivo causas subyacentes de esa inflamación (por ejemplo, prevención de agregados de proteínas o aceleración de su depuración). Véase Boyce et al. (2005). La mayoría de estas terapias, si no todas, usarán compuestos terapéuticos exógenos o materiales biológicos que puedan tener toxicidad sistémica asociada. La ECP ofrece un procedimiento novedoso, porque usa recursos endógenos que alteran fundamentalmente la disfunción que causa la enfermedad y su inflamación resultante. Los presentes inventores formulan la hipótesis de que la ECP puede prevenir y resolver complicaciones de enfermedades de la UPR relacionadas con el estrés, a través de su capacidad para modificar vías de respuesta al estrés. El incremento de la capacidad de una célula al estrés le permite reparar y depurar sus componentes celulares dañados, y puede ayudar a resolver la enfermedad. Véase Badin et al. (2006). Esto se ha demostrado usando proteínas de choque térmico sobreexpresadas o "chaperones químicos" que ayudan en la secreción de proteínas mal plegadas, y modificando químicamente el ambiente celular para mejorar la función del ER. Véase Imaizumi et al. (2001 ). Mientras que estas estrategias han mostrado éxito en sistemas de sobreexpresión de proteínas y en líneas de células, típicamente deben ser optimizadas para una proteína dada mal plegada. Los regímenes de condicionamiento al estrés ofrecen un procedimiento más global, enlistando una variedad de sistemas de reparación celular, aliviando simultáneamente diferentes tipos de estrés celular. La manipulación simultánea de sistemas de respuesta al estrés celular, es una terapia experimental establecida. Dos décadas de investigación ha sido la publicación de bien arriba de 4000 artículos tan sólo de! condicionamiento isquémico. La isquemia transitoria es el régimen de condicionamiento más comúnmente estudiado, y experimentos han mostrado eficacia en medicina cardiovascular, neurología y trasplante de órganos sólidos. Véase Kuntscher et al. (2005). Dichos estudios muestran que la lesión por reperfusión-isquemia (l/R) puede ser reducida dramáticamente mediante pretratamiento post-tratamiento con períodos breves de isquemia y recuperación. Este procedimiento es aún experimental, pero su valor es apoyado por la epidemiología, puesto que se observa una reducción en el daño tisular después de accidente cerebrovascular o infarto al miocardio si va precedido de ataques isquémicos transitorios o angina inestable, respectivamente. Véase Liberato et al. (2005). Los regímenes de condicionamiento tienen también valor terapéutico cuando se usan agresivos psíquicos heterólogos, sugiriendo que cualquier régimen de condicionamiento terapéutico podría ofrecer protección ante una gama de agresivos psíquicos diversos. Notablemente, se ha mostrado también que el condicionamiento de un órgano o tejido distante puede conferir protección a un organismo entero (un efecto conocido como condicionamiento remoto). El condicionamiento se ha examinado en pruebas clínicas en cirugía cardiaca, pero su captación por médicos ha sido muy limitada, más probablemente debido al riesgo inherente de métodos y agentes de condicionamiento existentes.

La ECP actúa como un régimen de condicionamiento al estrés La experiencia clínica que muestra la oportunidad de respuestas de tratamiento, la preservación de !a función inmune y la generación de células Treg en pacientes, sugirió que la ECP ofrece un procedimiento terapéutico novedoso a la mitigación de la inflamación. Los datos preliminares que se describen aquí, les sugieren a los presentes inventores que la acción terapéutica de la ECP induce una respuesta adaptativa actuando como un agresivo psíquico de bajo nivel. La evidencia bioquímica y farmacológica implica sistemas de respuesta a estrés subcelular y sistémico, algunos novedosos, que modulan la tolerancia inmune. El "condicionamiento al estrés" inducido por la ECP saca ventaja de esta manera de un fenómeno adaptativo bien descrito, la habituación, de células, órganos y organismos. El condicionamiento confiere protección ante agresivos psíquicos subsiguientes más intensos, y puede inducir cambios protectores duraderos en la estructura y función de células y tejidos. Estos cambios duraderos, además de que protegen ante el estrés subsiguiente, pueden afectar drásticamente la progresión de la enfermedad y acelerar los procesos de reparación. Ciertas predicciones surgen de esta hipótesis, incluyendo resistencia celular y organismal incrementada a una variedad de agresivos psíquicos. Los presentes inventores han demostrado que la ECP protege a ratones del desafío antigénico en modelos de asma pulmonar, hipersensibilidad por contacto y trasplante de órganos. La resistencia al estrés químico, específicamente los efectos diabetogénicos de la STZ (figura 17A), es una extensión dramática de la utilidad terapéutica de la ECP. Al nivel celular, los presentes inventores demuestran que DC pretratadas con AC toleran el estrés ribotoxico inducido por an¡somic¡na mejor que los controles sin tratar (figura 17B). La ECP demuestra de esta manera las características que definen los regímenes de pre-condicionamiento. De notar, los datos de ratones NOD/LtJ presentados anteriormente, muestran que la ECP es protectora incluso después de que haya ocurrido daño pancreático significativo. Dichos experimentos ofrecen un ejemplo de postcondicionamiento usando ECP. Los fenómenos anteriores, cuando se consideran en conjunto, apuntan hacia el valor potencial del condicionamiento al estrés como un nuevo procedimiento terapéutico para enfermedades de la UPR. Si, como creen los presentes inventores, la ECP es una terapia de condicionamiento al estrés, tendrá utilidad invaluable en la prevención y el tratamiento de enfermedades inducidas por estrés. Este concepto novedoso surgió después de que los presentes inventores reconocieron conexiones que enlazan varios campos de investigación de otra manera diferentes. Específicamente, publicaciones recientes enlazan el condicionamiento al estrés al nivel celular con las respuestas al estrés celular y sistémico descritas anteriormente. En un estudio, por ejemplo, líneas de células de macrófagos fueron pre-condicionadas contra una variedad de agresivos psíquicos, mejorando la supervivencia y preservando la función en cultivo. Véase Lu et al. (2004). Esto combinado con la conexión del eje de UPR-HPA mencionado anteriormente, sugiere que la modificación de las respuestas al estrés celular pueden, además de que resuelven causas subyacentes de patología, proteger ante desafíos subsiguientes.

Los efectos de condicionamiento pueden ser mediados por células inmunes Está bien establecido que las células inmunes son mediadores patogénicos de lesión isquémica; sin embargo, su función en el pre-condicionamiento isquémico no es clara. La transferencia adoptiva de células de bazo de ratones isquémicamente pre-condicionados en receptores deficientes en células T, protege a ratones receptores de lesión isquémica subsiguiente. Véase Ascon et al. (2006). Estos estudios sugieren fuertemente que las células inmunes son mediadores de respuestas de pre-condicionamiento isquémico protectoras. No se identificó la célula protectora en este estudio. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, existe precedente para la generación de células Treg como resultado de respuestas al estrés sistémico. Véase MacConmara ef al. (2006). Es por lo tanto razonable proponer que una población de células T reguladora surgió después de la isquemia inicial, permitiendo que las células Treg transferidas confieran protección en los receptores.

EJEMPLO 11 La trornbospondina- enlaza respuestas ai estrés, células Treg y ECP La trombospondina-1 (TSP-1), una proteína de la matriz celular que contribuye a la estructura de los tejidos y la función de las células, es sobrerregulada masivamente en la mayoría de las células en respuesta a lesión o daño tisular, factores de crecimiento, condiciones nutricionales y varios agresivos psíquicos ambientales. Véase Murphy-Ullrich (2001 ). Se piensa que las proteínas de la matriz celular, incluyendo la TSP-1 , proveen información contextual a las células acerca de su ambiente. Esto es relevante en la función inmune, puesto que la TSP-1 es una proteína antiinflamatoria potente que es secretada por, y modula, células que presentan antígenos y células T. Véase Doyen et al. (2003). Las propiedades inmunomoduladoras de la TSP-1 , combinadas con el hecho de que la TSP-1 es secretada de las células en respuesta al estrés, posiciona a esta molécula entre el estrés y la inmunidad. Los presentes inventores muestran aquí que la TSP-1 es un efector potencial para ECP. La TSP-1 se une a CD36 en APC, y a CD47 y a4ß1 en células T. Véase Chen et al. (2000). La TSP-1 mejora la capacidad de los fagocitos para engullir células apoptóticas, e inhibe su maduración y capacidad para producir citocinas proinflamatorias. En células T, se ha mostrado que la TSP-1 subregula la transducción de señales de TCR, así como la sensibilidad a IL-12. Véase Li et al. (2002). La TSP-1 es un activador fisiológico principal del TGFp, y se mostró recientemente que induce el fenotipo Foxp3+ de células Treg en células T CD4+CD25" humanas activadas. Véase Grimbert et ai. (2006). La inducción de células Treg puede contener y resolver la inflamación y su daño. En ratones sin expresión de TSP-1 , se observan curación de heridas retardada, respuestas antíinflamatorías reducidas, y niveles disminuidos del TGFp. Véase Agah et al. (2002).

En el páncreas, las células de los islotes expresan TSP-1 , y ratones sin expresión de TSP-1 demuestran inflamación, hiperplasia de las células de los islotes, e hipoplasia acinar, todos los cuales se atribuyeron a una falta de activación del TGF . Véase Crawford et al. (1998). El páncreas de ratones sin expresión de TSP-1 tratados sistémicamente con un péptido derivado de TSP-1 , revertió a un fenotipo más normal. Estas observaciones sugieren que la TSP-1 es un regulador importante del desarrollo pancreático, y puede ser importante para procesos inmunes y exocrinos dentro de su microambiente. De modo interesante, se vinculó recientemente a la hiperglucemia con la expresión de TSP-1 en la vasculatura de ratas diabéticas Zucker. Véase Raman et al. (2007). La sobrerregulación de TSP-1 fue enlazada directamente a la HBP, y la expresión de TSP-1 fue proporcional a las concentraciones de glucosa. Dados estos datos, es una fuerte posibilidad que las terapias que modulan a la TSP-1 interfieran con la progresión de la patología en enfermedades tipo diabetes. Los presentes inventores, y otros, han mostrado que la TSP-1 es secretada en grandes cantidades de células apoptóticas. Como se muestra en la figura 18, un incremento en TSP-1 dependiente de la dosis de células se observa después de¡ tratamiento de PB C con ECP. Los monocitos secretan el volumen de la TSP-1 producida en suspensiones de PBMC tratadas con ECP, y el bloqueo de la actividad de TSP-1 reduce la capacidad de la ECP para dirigir la generación de células Treg. Esto es consistente con los resultados no publicados adicionales de los inventores, que muestran que los monocitos son esenciales para la generación in vitro de células Treg. La figura 19 muestra que, como en la figura 7, células T aisladas de co-cultivos de PBMC tratadas con ECP con células T no afectadas, exhiben un fenotipo tolerogénico. Sin embargo, si este co-cultivo incluye anticuerpos monoclonales anti-CD36 o anti-CD47 neutralizantes, solos o en combinación, el fenotipo tolerogénico es mitigado. Los presentes inventores están investigando actualmente si la TSP-1 es necesaria para mediar los efectos inmunológicos dirigidos por la ECP in vivo, y han propuesto investigar si la TSP-1 desempeña una función en la protección de la función de células beta por la ECP en modelos de diabetes.

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Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método de condicionamiento al estrés, que comprende: a) identificar un evento lleno de tensiones al cual un sujeto será o ha sido sometido, y b) llevar a cabo ECP de acuerdo con un plan, y con una dosis efectiva para mejorar el efecto del evento lleno de tensiones.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el evento lleno de tensiones es un trauma o exposición a toxinas.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el trauma es isquemia, accidente cerebrovascular, descompresión, terapia hiperbárica (estrés oxidativo), accidente, cirugía, quemadura, humo, fuego, batalla, ejercicio intenso, privación del sueño, anormalidades de nutrición, desnutrición, viaje al espacio, tortura, manejo de desastres, infección viral, infección bacteriana, cáncer o trasplante de órganos.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la exposición a toxinas es quimioterapia, radiación, veneno, efectos secundarios farmacéuticos, toxinas ambientales, ultrasonido, luz láser o antibióticos.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente medir un biomarcador, en donde el suministro de ECP es ajustado con base en el nivel o metabolismo de dicho biomarcador.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de los siguientes genes: M6ra, Oaz2, Rerg Aass, Gata5, Gas1 , Slc5a1 , Dera, Mgea5, Pscd3, Atr, Ncaph2, Psma6, Ptcd2, Hsp90b1 , elys, Rlf, Sf3b3 y Setd4.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente administrar a dicho sujeto una sustancia o señal ambiental que afecte la vía de mTOR.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque se administra rapamicina a dicho sujeto.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la sustancia o señal ambiental se administra en cantidades y a intervalos suficientes para inducir estrés subcelular en el sujeto.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la sustancia es licopeno o celestral.

11.- Un método para monitorear la eficacia de condicionamiento, que comprende identificar la modulación diferencial de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste de los siguientes genes: Il6ra, Oaz2, Rerg Aass, Gata5, Gas1 , Slc5a1 , Dera, Mgea5, Pscd3, Atr, Ncaph2, Psma6, Ptcd2, Hsp90b1 , elys, Rlf, Sf3b3 y Setd4.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el patrón de la modulación de dicho grupo de biomarcadores se compara con los patrones de modulación de biomarcadores que se sabe son eficaces. 3. - Un equipo para llevar a cabo una prueba de la reivindicación 1 , que comprende reactivos de detección de biomarcadores. 14. - Una microdisposición o chip de genes para realizar el método de la reivindicación 1.