JPH06500017A - ｎＫ＋チャンネル発現に基づくアッセイ、方法及び生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２５、請求項２１に記載のＤＮＡを含むベクター。

明　細　書 ｎＫ”チャンネル発現に基づくアッセイ、方法及び生成物本発明は米国立衛生研 究所により与えられたグランド番号Ａｌ２４７８３、Ａ１２１３６６、Ｎ５２６ ７２９、ＮＳ　１４６０９及びＧＮ４２３６５に基づき、合衆国政府の支援を受 けて行われた。合衆国政府は本発明に関し一定の権利を有する。

を特色付けるために有用な生理学的方法及び組み換えＤＮＡの方法に関する。特 に本発明は、特定のトランスメンブレンイオンチャンネルの分子的同定、該チャ ンネルの生物物理学的特性の解明、該チャンネルをコードする遺伝子の発現産物 及び当該産物の用途に関する。より具体的には、本発明は、ＭＫ３遺伝子のＤＮ ＡシークエンスがＴリンパ球のｎ梨に″″チヤンネルコードするという確定の結 果から、部分的に得られた。

従来の技術 哺乳類細胞の表面に見られる膜は、細胞と組織の保全及び活性に関して非常に重 要な機能を果たす。特に興味深いものは、イオンチャンネルの生化学的、生理学 的、薬理学的及びバイオキネティクス的研究である。ナトリウム（Ｎａ）、カリ ウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）チャンネルを含むこれらのイオンチャンネルは 、すべての哺乳類細胞に存在し、様々な生理学的及び薬理学的プロセスを制御す る。カリウムチャンネルは、特に正常細胞の恒常性における該チャンネルの関与 及び関連性、並びに様々な病的状態及び免疫応答に関するその障害が注目されて いる。多くの研究が行われ、そのような重篤な疾患に対する治療及び予防法を発 見するためだけでなく、もし存在するならば共通の基準（これによりこれらの疾 患を克服するための攻撃計画がより直接的なものとなろう）についての理解を進 めることを可能にする、基礎となる病因学を解明するために、現時点で多（の研 究が進行中である。該チャンネルと特別な関係をもつ疾患には、自己免疫疾患及 びその他の増殖性疾患、例えば癌が含まれる。自己免疫疾患には、いくつか名を 挙げれば、リウマチ性関節炎、Ｉ型真性糖尿病（インシュリン依存性）、多発性 硬化症、重症性筋無力症、全身性エリテマトーデス、シエーグレン症候群、混合 結合組織病、実験的アレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）が含まれる。

殆どの場合、自己免疫疾患は、免疫系の異常細胞が標的組織を直接壊死させるか 、又は自己抗体を産生することにより破壊する結果であると考えられている。

ある者は歴史的な自己免疫疾患の実証に集中するかもしれない。それらの１つは 、いわゆる全身性エリテマトーデス（Ｓ　Ｌ　Ｅ）である。ＳＬＥでは、異常５ ９２８球は、陽性に荷電された抗ＤＮＡ抗体を産生じ、陰性に荷電された腎細胞 上に凝集し、ＳＬＨの症状である炎症と腎炎を引き起こす。真性糖尿病では、異 常Ｔ細胞は系統的に膵臓の高細胞を破壊するので、核細胞は生物の適切な代謝バ ランスのために必要なホルモンであるインシュリンを産生できなくなる。多発性 硬化症では、異常Ｔｍ胞はミニリン塩基性タンパク質（神経細胞の主成分）を破 壊すると考えられている。これは系統的に特定の神経細胞を破壊し、一連の神経 学的症状を引き起こす。今日までに研究されてきた自己免疫疾患では、特定の標 的組織を破壊又は妨害して、そのような病的状態に対して明らかな症状を引き起 こす物質を産生する異常な免疫系細胞の共通のパターンが浮かび上がるように思 える。

さらに同種異系移植又は異種移植は、ドナーの細胞膜上に存在する抗原成分に対 するレシピエンドの細胞介在性又は液性免疫反応により拒絶され得る。拒絶の主 なメカニズムは、移植抗原に対する即時型リンパ球介在性免疫反応（宿主対移植 片反応）である。免疫生物学的拒絶の特別な関心は、治療に対する反応を評価す る手段及び移植片の機能的変性に先んじて拒絶を知ることであった。しかしなが ら、完全に信頼できかつ再現可能な免疫応答のモニタリング法は、なお確立され ていない。

さらに他の細胞増殖性状態、特に癌や腫瘍に関するものも、免疫学的因子と類似 の関係をもつかもしれない。例えば、宿主−腫瘍免疫因子は悪性病巣の臨床経過 において役割を果たす。肉腫をもつ患者における液性及び細胞性免疫不能も報告 されている。さらに、免疫応答の一般的な低下とその後の症状の進行との間の相 関性も示されている。しかし免疫学的なモニタリングを日常的なものとして使用 することは未だ実験の域を出ず、その臨床上の育用性も未知である。

これらの反応及び疾患に対する現時点の処置は、なお実験段階にあり、それはス テロイド又は他の免疫抑制剤による全般的な免疫抑制の惹起に基づくものである 。このような治療手段は、付随する重篤な副作用を含む他の問題を伴うものでも ある。さらに、それらは、このような自己免疫疾患の自然な進行を遅らせるだけ の作用しかもたない。治療のための有効な方法は（治癒は言うまでもなく）、現 在の医療技術では無理である。これら種々の自己免疫疾患、免疫反応及び腫瘍化 を生じる免疫系の異常は、当該分野において為された広範な研究にも拘らず、良 （理解されていない。例えば、チオフィロブロス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏ ｓ）ら、Ａｄｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　３７．２６９．　（１９８５）を参照のこと。

この疾患の病因論について重要な知見を提供してきた、様々なマウスモデルの使 用に焦点を合わせた研究が行われたが、臨床症状及び免疫学的異常性は、系統間 で大きく異なり、完璧な研究には至らなかった。従って、普遍的な基礎となるこ れらすべての疾患について共通の細胞性又は分子性欠陥は未だ同定されてなく、 あったとしても当該技術分野の現在の技術レベルにおける提案にすぎない。

数種類のに３チヤンネルが、神経系における電気的興奮性の調節と同様に、多様 な細胞タイプにおける膜電位の維持及び細胞容積の調節に関与している（１）。

カリウムチャンネルは、活動電位の再分極相を制御し、さらに活動ニューロン（ ｆｉｒｉｎｇ　ｎｅｕｒｏｎｓ）及び他の細胞のパターンを制御することが示さ れた。カリウム電流は、ナトリウム又はカルシウム電流よりさらに多様であり、 細胞が外部刺激に反応する方法を決定することにおいて、中心的な役割を果たす ことが示された。

例えば、シナプス性インプットに対してニューロンが反応する順応速度又は遅れ は、異なるクラスのに＋チャンネルの存在により強く影響される。Ｋ０チャンネ ルの多様性を生じる分子メカニズムは、ショウジヨウバエのシェーカー遺伝子座 （Ｓｈａｋｅｒ　１ｏｃｕｓ）で最もよく分かっている。これは、１３０ｋｂに わたり広がっている２１個のエクソンを含み、単一初期転写物の異なるスプライ シングにより、４個の異なるに０チヤンネルタンパク質を生じる（２）。アフリ カッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞でのこれらのｃＤＮＡの発現によって 、明瞭な生理学的特性を有する電圧依存性に＋電流が発生する（３）。関連する ショウジヨウバエに＋チャンネル遺伝子シェップ（Ｓｈａｂ）もまた、初期転写 物の異なるスプライシングを示し、２個の別個のタンパク質質を生じる（４）。

従って、イオンチャンネルそれ自体に注意が向けられた。薬理学的及び電気生理 学的に分類された３つのイオンチャンネルの型が同定されており、これは、いわ ゆる旦、ｎ’及び上型である。本目的において、末梢リンパ組織中のＴ細胞は関 連タイプ：ＣＤ４”ＣＤ８−、ＣＤ４−ＣＤ８”、ＣＤ４−ＣＤ８−　として特 性細胞は、細胞膜たりおよそ２００チヤンネルを発現し、３タイプがすべて存在 すると考えられている。例えばマイトジェンによる活性誘発を示す正常な免疫反 応での増加を示す。

Ｋ０チャンネルに関する最初のオリジナルな研究により、ｌＫ９チャンネルの発 現は自己免疫疾患状態に関連しているという明瞭な発見がもたらされた。その結 果、アッセイ及び治療法並びに当該発明に関連する事柄がカヘラン（Ｃａｈａｌ ａｎ）らにより特許出願された（ＩＪ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／３９１．４ ９９．１９８９年３月６日受理）。チャンディー（Ｃｈａｎｄｙ）らによる学術 的報告書（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｎｕｎｏｌｏｇｙ 、２０゜７４７−７５１（１９９０）　）　も参照のこと。

従って、当該技術におけるゴールは、様々な病的状態、例えば癌におけるメディ エータ−と考えられるＴ細胞が、Ｋ″″″チヤンネル発現ンクしているのか否か 、もしその通りであるならば、どのようにしてリンクしているのかを明瞭にする ために、代表的なモデルによる実験を行うことである。

チャンディー博士らのグループは、この発見についての最初の予備的な見解を１ ９９０年２月のポスターセツションで（生物物理学会、バルチモア（ＭＤ））発 表し、要約は、１９９０年７月２９日から８月３日までバンク−バー（カナダ） で開かれる第１Ｏ回国際生物物理会ＩＩ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃｓ　ｃｏｎｇｒｅｓｓ）の準備中に提出された。またチャンディー らの文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７．９７３（１９９０）　（１２）も参照のこ と。この中ではとりわけＭＫ３遺伝子のシーフェンスがそれとして開示されてい る。さらに７−８及び２８の文献と同様、ダグラス（Ｄｏｕｇｌａｓｓ）らのＪ 。

ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４４．４８４１（１９９０年６月））も参照のこと。

本発明の背景を明らかにするために使用した出版物及びその他のもの並びにその 実際に関してより詳細な清瞭を提供するために用いた特定の事例は、援用して本 明細書の一部としており、便宜上、以下の文章では数字を用いて引用し、付属の 文献目録でそれぞれまとめである。

コードするという、明瞭かつ驚くべき発見に基づいている。それに続く重要な研 究により、ＭＫ３遺伝子のコード化ＤＮＡの機能的ｎＫ’チャンネル発現産物、 又は機能的に生物活性がある同等物は、動物（ネズミ属だけでなく）及び同様に ヒトでの薬理学的な用途のためのアッセイ、方法及び生成物を開発する手段を提 供するという結果が明らかになった。

従って本発明は、哺乳類におけるｎＫ”チャンネル発現の調節効果を有する物質 を同定するためのアッセイを提供し、これは、次のステップを含む：ＭＫ３遺伝 子のコード化ＤＮＡの機能的ｎＫ″″チャンネル発現産物又は機能的に生物活性 がある同等物を生成する発現システムを提供する；該産物又は同等物の生物活性 におけるその調節効果を確定するため、該発現システム又は該発現システムの産 物もしくはその同等物を、１つ又は２つ以上の物質と接触させる、さらにｎＫ’ ″チャンネル発現を調節することができる単−又は複数の候補物質をこれら物質 から選択する。

アッセイのこの選択ステップは、該産物又はその同等物の生物活性をブロックす る物質の能力を、好ましくは、測定するものであり得る。好ましい具体例では、 物を含み得る。この機能的に活性な生物学的同等物は、好ましい具体例では、ヒ ）ｎＫ”チャンネル発現産物の機能的ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）を含むこ とができ、さらにまた合成された誘導体を含み得る。好ましい具体例では、該発 現システムは、トランスフエクタントを含むことができ、このトランスフェクタ ントは、該産物又は同等物を有効にコードするＤＮＡを宿す哺乳類細胞を含むこ とが最も好ましい。

本発明の別の局面によると、哺乳類Ｔ細胞の活性化を抑制するために有用な方法 が提供される。該方法は、上記に引用のアッセイで概略したステップを実施する こと、及びその後該哺乳類Ｔ細胞をそのアッセイで選ばれた候補物質と接触させ ることを含む。この方法で用いられる接触ステップは、好ましくは、必須成分と して、該候補物質を含む組成物を介して実施される。最も好ましくは、この接触 は人体への投与により達成される。

別の好ましい具体例では、哺乳類Ｔ細胞の活性化抑制に有用なこの方法は、Ｔ細 胞が組織移植レシピエンドのものである移植組織拒絶反応を抑制するためにも有 用であり得る。別の好ましい具体例では、゛この方法は、Ｔ細胞が腫瘍の疑いの ある個々人のものである場合、腫瘍性の存在について個々人のスクリーニングに 有用である。

本発明の別の局面によると、ｎＫ”チャンネル発現仲介性Ｔ細胞活性化に関連す る病的状態の診断用アッセイが提供される。該アッセイは次のステップを含性が ある産物、又は機能的に生物活性がある同等物を基にした標識手段を用いて、ｎ Ｋ”チャンネル発現を測定することによって、全Ｔ細胞集団に対する該Ｔ細胞の 活性化を測定する。

本発明のまた別の具体例には、ｎＫ９チャンネル発現仲介性Ｔ細胞活性化に関連 する病的状態の検出に有用なテストキットがあり、これは、被験者からのｎＫ３ チャンネル含有Ｔ細胞培養物を収容しテストするための構成物と、この培養Ｔ細 胞集団から活性化Ｔ細胞を同定し、ＭＫ３遺伝子のコード化ＤＮＡの機能的に生 物活性がある産物、又は機能的に生物活性がある同等物を基にした標識手段を用 いて当該細胞のｎ型に′″チヤンネル相対的な数を測定する手段を含む。さらに 本発明は、詮所又はスクリーニングアッセイを行うための付随構成物、試薬及び 手段を含むキットも開示する。

本発明のまた別の具体例では、上記に開示された用途のために、ＭＫ３遺伝子産 物又は機能的に生物活性があるその同等物をコードするＤＮＡ　（組み換えＤＮ Ａ又はｃＤＮＡ）、ベクター及び当該物を有効に宿すトランスフェクシントを提 供する。好ましい具体例では、該ＤＮＡは該ＭＫ３遺伝子産物をコードする。別 の好ましい具体例では、ＭＫ３遺伝子産物又は機能的に生物活性があるその同等 物をコードするＤＮＡを含むトランスフェクトされた細胞を提供する。特に好ま しい具体例では、トランスフェクトされた細胞は哺乳類細胞である。さらに別の 好ましい具体例では、ＭＫ３遺伝子産物又は機能的に生物活性があるその同等物 をコードするＤＮＡを含むベクターが提供される。

本発明はさらに、機能的に生物活性がある同等物のＭＫ３遺伝子産物をコードす るＤＮＡ単離物をも開示する。さらに本発明は、このようなりＮＡの発現のため に選択された組み換え体宿主中で働く発現制御エレメントを含み、さらに好まし くは、トランスフェクション、場合によっては宿主ゲノムへの直接的組み込みと 併用することによる、組み換え体宿主中への発現ベクターの組み込みを機能的に 助ける、適切な終結、複製及び他のシーフェンスを含む、このようなりＮＡを宿 す発現ベクターも教示する。

本発明の組み換えＤＮＡについては、当該技術は、そのすべての局面、例えばク ロスハイブリダイズ可能なりＮＡ単離物を含むＤＮＡ単離物の作成：そのための 発現ベクターの考案：及びトランスフェクトした宿主の作成に直接利用できる。

さらに本発明は、前出の局面を教示し、それらすべての局面に付随する具体例は 、当業者の技術の範囲内のものである。

図面の簡単な説明 図１は、ＭＫ３ｍＲＮＡを注入した卵母細胞の外側表（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ ）バッチでのに′″電流表している。膜電位は一８０ｍＶで、脱分極パルスは４ ５秒毎に行われた。

テスト電位は、１０ｍＶずつ上昇させながら−５０から５０ｍＶまで変えた。Ｂ ）Ａで示されたＫ”電流についてのビークＫ“コンダクタンス−電圧関係。点を 結ぶ線はボルツマンの方程式に当てはめた： Ｓｔ　（Ｅ）＝Ｓ、ｍａｘ／（１＋ｅｘｐ　［（Ｅ、−Ｅ）／ｋ］　）ここでパ ラメーターの数値は： Ｓｔｍａ　ｘ＝３．９ｎＳ　；　Ｅ、＝−４０，２ｍＭ；活性化（Ｃ）及び不活 性化（Ｄ）の時間定数ｒ、及びｒ、は、次のホジキン−ハクスレーのタイプｎ’ ｈモデルにより（Ａ）で示されたような同様のトレースの電流データの点をつな ぐ曲線に当てはめて得られた。

■１゜＋ａ＋＝ ＩＫｍａｘ　［１−ｅｘｐ　（−ｔ／ｒ、）］　’ｅｘｐ　（−ｔ／ｒｈ）（Ｃ ）及び（Ｄ）の点は、５つの異なるパッチから得られたｒ、及びｒｈの平均図２ 人は、ＭＫ３ｍＲＮＡを注入した卵母細胞の外側表パッチでのＭＫ３Ｋ”電流の 蓄積性（使用依存性）不活性化（左）を、またヒト末梢血リンパ球から得られた に９電流のそれ（右）を示す。電流は、−８０ｍＶの保持電位から毎秒１回、４ ０ｍＶまで一連の６脱分極電圧ステップによって誘発された。テストパルスの持 続時間は２００ｍ５であった。Ｋ′″電流のアンプリチュードは、この一連のパ ルスの間で最大（最初）から最小（最後）へと実質的に減少した。

図２Ｂは、ＭＫ３ｍＲＮＡを注入した卵母細胞の外側表バッチでのＭＫ３Ｋ”電 流の不活性化のキネティクス（左）を、さらにヒト末梢血リンパ球から得られた に＋電流のそれ（右）を示す。テール電流は、４０ｍＶまでの１５ｍ５の脱分極 プレパルスの後、−１００から一４０ｍＶまでの電圧ステップにより誘発された 。テール電流減衰時定数ｒ１は単一の指数関数に当てはめられ、減衰中に用いた 膜電位Ｅに対してプロットした（右）。黒丸はＭＫ３のｒ、を、白四角はＴ細胞 のｒ、を表す。

図２０は、ＭＫ３ｍＲＮＡを注入した卵母細胞の外側表パッチでのＭＫ３Ｋ”電 流の単一チャンネル電流を示す。左：膜電位は、電流トレースの左側に示された 電位で保持した。当該パッチでのチャンネルの殆どが不活性化した後、種々の保 持電位における異なるアンプリチュードの単一チャンネル電流をモニターするこ とができた。図の右側に、単一チャンネルの開放により発生した電流アンプリチ ュードが、異なる保持電位に対してプロットされている。点をつなぐ直線の勾配 により、単一チャンネルコンダクタンスの概数は１３ｐＳとなり、この直線は電 圧軸を一７６ｍＶで切るが、これはＫ”イオンにおける逆転電位（ｒｅｖｅｒｓ ａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の計算値に近い。

図３は、ＭＫ３Ｋ“チャンネルの薬理学に関するデータを提供する。

図３Ａは、ＭＫ３ｍＲＮＡを注入した卵母細胞の外側表パッチでのＭＫ３に’″ 電流対する１Ｏ１４０及び１６０ｍＭのＴＥＡの影響を示している。種々のＴＥ Ａ濃度による処理前及び処理中における、４５ｓ毎の一８０ｍＶの保持電位から ４０ｍＶまでの脱分極パルスで、Ｋ１電流が誘発された。

図３Ｂは、図３Ａと同じパルスプロトコールを用いたときの、別の外側表パッチ でのＭＫ　３　Ｋ”電流に対する３　ｎＭのＣＴＸの影響を示している。図３０ は、ＭＫ３Ｋ”を流をブロックする異なる薬剤のドースリスポンス曲線を表し、 ベクタ（ミル、キニーネ、４−ＡＰ及びＴＥＡのに、ｓはそれぞれ４　ｔｔＭ、 　４０μＭ、　０．４ｍＭ及びｌｌ感（であった。

図４は、ＥＬ４ＲＮＡのｌ７１ｂｐフラグメントの増幅を示す。レーン１：分子 量マーカー、ラムダＢｔｔ−Ｅｌ；７２ｂｐマーカーは染色バンドでは不明瞭で ある。

：レーン２：ＥＬ４ＲＮＡから増幅された１７１ｂｐフラグメント：このレーン には５μＩのＰＣＲ生成物がロードされた。：レーン３：ＰＣＲ前にＲＮＡ５ｅ で前処理したＥＬ４ＲＮＡ、ＰＣＲ生成物の２０μｌがこのレーンではロードさ れた。

；　１７１ｂｐフラグメントは見えない。

図５は、ＭＫ２及びＭＫ３の染色体上の位置決定をグラフで示している。＋はヒ トの染色体が細胞の少なくとも８０％に存在することを示している。：★はヒト の染色体が細胞の５０−８０％に存在することを示している。；ｄはヒトの染色 体が部分的に欠失していることを示している。：Ｐ及びＱはそれぞれ染色体の単 に短腕又は長腕だけが存在することを示している。ＭＫ２は１２番目染色体に対 する不一致のクローンがないことを示し、一方ＭＫ３は１３番目染色体に対する 不一致のクローンがないことを示す。

本文中の［物質Ｊ　（ｍａｔｅｒｉａｌ）なる用語は、ユ型に１チヤンネル及び ／又は（活性化）Ｔ細胞に関して、通常存在しないか又は機能をもたず、しかも これらのものに影響を与える一切のものを指す。従って、該用語は機能的な定義 をもち、旦に′″チヤンネル発現及び／又は関連するＴ細胞に対して、調節効果 を有することが本明細書中で示され、同定された既知の及び特に未知のものを含 む。

この中でｒ調節効果Ｊ　（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ）なる用語、又 は文法的にそれと同等な用語は、ｎ型に′″チヤンネルび／又はＴ細胞に対する 能動的及び受動的の両方の影響を指す。これらには、該チャンネルもしくは該チ ャンネルタンパク質の機能のブロック、細胞膜たりのイオンチャンネルの数の減 少、及び初期の異常細胞に影響を与えるための二次細胞又はチャンネルの使用が 含まれるが、これらに限ると解釈してはならない。

本文中のｎ型に０チヤンネル及び／又はＴ細胞に対する物質の影響に関して「測 定Ｊ　（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）なる用語は、当該チャンネル／細胞に対する物質 の影響を測定するための既知の方法又はこのために考案された一切の方法を指す 。これらには電流の測定、膜電位の測定、例えば放射能活性トレーサーを用いる に１流量の測定、Ｋ９ａ度の測定並びに他のりセラター、セカンドメツセンジャ ー及び／又はチャンネルへの間接的な結果の測定が含まれるが、これらに限ると 解釈してはならない。

本文中のｎＫ”チャンネル発現産物に関して「機能的Ｊ　（ｆｕｎｃｔｉｏｎａ ｌ）なる用語は、生成物がその意図した目的のために作用すること、すなわちＭ Ｋ３遺伝子の直接的生成物と同等の生物反応性を有するということを意味する。

本文中の「機能的に生物活性を育する同等物Ｊ　（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　 ｂｉｏａｃｔｉｖｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）なる用語は、言及されたものが、Ｍ Ｋ３遺伝子の発現産物と実質的に同じ結果をもたらすために、実質的に同じ方法 で、実質的に同じことをするものを意味する。

この中で［発現システム」なる用語は、機能的なｎＫ”チャンネル発現産物を生 成することができるものを指す。好ましい具体例では、そのようなシステムは、 そのような機能的ｎＫ＋チャンネル発現産物をコードするＤＮＡｙｆ−有効に宿 す微生物又は細胞培養物である。「有効に」又は文法的にこれと同等のものは、 該当するＤＮＡシークエンスが有効に働くこと、すなわちその意図された目的の ために機能することを意味する。従って、該ＤＮＡは好ましくは、組み換えに適 切な宿主細胞にトランスフェクトするために用いられる発現ベクター内に含まれ ている。本明細書中に開示されているベクター及び方法は、広範囲の原核及び真 核生物の宿主細胞に用いるのに適している。「トランスフェクシントＪは、アフ リカッメガエル及び牛皮（ｖａｃｃｉｎａ　）を含む（ただしこれらに限らない ）発現システムを含む、組み換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターでトラ ンスフェクト又は形質転換した細胞及びウィルスを指す。

一般に、本発明に有用なベクターを構築するＤＮＡシークエンスのクローニング には、原核細胞が好ましい。例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）が特に有用である。使用できる他の微生物株には、 例えば、大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）（７） ような大腸菌株が含まれる。これらの例は勿論、限定ではなく説明のために挙げ たものである。

原核細胞は、また発現のためにも用いることができる。前出の株の他、大腸菌Ｗ ３１１０（Ｆ−、ラムダ−１原栄養体性、ＡＴＣＣＮｏ、２７２３５）、枯草菌 のような桿菌及びネズミチフス菌又はセラシア・マルセステンス（Ｓｅｒｒａｔ ｉａｍｒｃｅｓｔｅｎｓ＞のような腸内細菌並びに種々のシュードモナス種が用 いられ得る。

一般に、宿主細胞と折り合いの良い種からのレプリコン及び制御シーフェンスを 含むプラスミドベクターが、これら宿主と組み合わせて用いられる。このベクタ ーは、ごく普通に複製点の他、トランスフェクトされた細胞を表現システムで選 別することができるように標識シーフェンスも含んでいる。例えば、大腸菌は、 典型的には大腸菌種由来プラスミドであるｐＢＲ３２２［ポリバー（Ｂｏｌｉｖ ａｒ）ら。

ＧＥＮＥ、　２．９５（１９７７）］を用いてトランスフオームされる。ｐＢＲ ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従ってトラン スフェクトされた細胞を同定する簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミ ド又は他の微生物プラスミドは、それ自身のタンパク質の発現のために該微生物 が使用できるプロモーターも含み、又は含むように修飾されなければならない。

組み換えＤＮＡの構築に最も普通に眉いられるこれらプロモーターには、β−ラ クタマーゼ（べ二シリナーゼ）及びラクトースプロモーター系［チャン（Ｃｈａ ｎｇ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５．６１７（１９７８）、イタクラ（Ｉｔａｋ ｕｒａ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９８．１０５６　（１９７７）］［ゲゲラデル Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１．５４４（１９７９）　］及びトリ プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［ゲラデルら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　、　８．４０５７（１９８０）　；欧州特許出願公開第００３６ ７７６号］が含まれる。これらが最も普通に用いられる一方、他の微生物プロモ ーターも見いだされ利用され、それらのヌクレオチドシーフェンスに関する詳細 はすでに発表されており、熟練者にはそれらが機能できるようにプラスミドベク ターに連結することができる［シーベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら、Ｃ ｅ１ｌ　２０．２６９（１９８０）］。

原核細胞に加え、培養酵母のような真核微生物も用いることができる。真核微生 物では、ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又 は通常のパン酵母が普通に用いられるが、他の多くの株、例えばピシア（Ｐｉｃ ｈｉａ）株も普通に用いられる。

酵母ベクターの適切な開始シーフェンスには、３−ホスホグリセレートキナーゼ のプロモーター［ヒララマン（Ｈ４ｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、　２５５，１２０７３（１９８０）　］又は他の糖分解酵素［ヘス（Ｈｅｓｓ ）ら、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７．１４９（１９６８）及びホー ランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７．４９００（１ ９７８月、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド ロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクト キナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレー トムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホス ホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼの、プロモーターが含まれる。好 適な発現プラスミドの構築では、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終結（ｔａｒｍ ｉｎａｔｉｏｎ）のために、発現が所望される発現ベクター中に、シーフェンス の３゛側に、これら遺伝子に関連する終結シーフェンスも連結される。生育条件 により制御される転写について更なる利点を有する他のプロモーターは、ピシア ・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のメタノール調節性アルコー ルオキシダーゼＩ　（ＡＯＸＩ）（欧州特許出願公開第１８３０７１号参照）、 アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒 素代謝に関する分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ）酵素、上記のグリセルアルデヒ ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトース利用 に関わる酵素（ホーランド、前出）のためのプロモーター領域である。酵母に適 合するプロモーター、複製開始点及び終結シーフェンスを含むいずれのプラスミ ドベクターも好適である。

微生物に加え、多細胞生物由来の細胞培養も、を推動物、無背椎動物培養にかか わらず利用できる。しかし最大の関心は背椎動物細胞にあり、を推動物細胞培養 （組織培養）の調製は、ここ数年に日常的な操作となった［組織培養（Ｔｉｓｓ ｕｅＣｕｌｔｕｒｅ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、クルーズ（Ｋｒｕｓｅ ）及びバターラン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編（１９７３）］。そのような有用な 宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａＪＩ胞、チャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞株並びにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯ３−７及びＭＤＣＫ細胞株であ る。そのような有用な細胞株は、ＣＨＯ株、ＣＨＯ−ＫＩ　ＡＴＣＣＦ　Ｎｏ、 ＣＣＬ６１である。そのような細胞のための発現ベクターには、−切の必要なリ ポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結シ ーフェンスと共に、通常（必要な場合には）、複製開始点、発現される遺伝子の 前に位置するプロモーターが含まれる。

哺乳類細胞の場合は、発現ベクターに対する制御機能は、しばしばウィルス由来 物質により提供される。例えば、普通に用いられるプロモーターは、ポリオーマ 、アデノウィルス２及び最もよく用いられるものであるシミアンウィルス４゜（ ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、両者 ともＳＶ４０ウィルスの複製開始点をも含むフラグメントとして、該ウィルスか ら容易に得ることができるので、特に有用である［フィアース（Ｐｉｅｒｓ）ら 、Ｎａｔｕｒｅ２７３、１２３（１９７８）コ。）Ｉｊｎｄｒ１１部位から該ウ ィルスの複製開始点中に存在するＢｇ１１部位に広がる、およそ２５０ｂｐシー クエンスを含むことを条件として、これより小さい又は大きいＳＶ４０フラグメ ントも用いることができる。さらに可能でしばしば望ましいことは、所望の遺伝 子に通常付随するプロモーター又は制御シーフェンスを利用することである。た だしそのようなシーフェンスは、宿主細胞系に適合するものであることが条件で ある。

複製開始点は、外米性の開始点、例えばＳＶ４０由来又は他のウィルス起源（例 えばポリオーマ、アゾ人ＶＳＶ、ＢＰＶなど）のものを含むベクターの構築によ るか、又は宿主細胞染色体の複製メカニズムにより提供され得る。ベクターか宿 主細胞染色体に組み込まれる場合には、後者で足りることが多い。

宿主細胞として強靭な細胞膜バリアーをもたない細胞が用いられる場合は、トラ ンスフェクションは、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びパンダーニブ（Ｖａｎ　ｄ ｅｒ　Ｅｂ）が報告したリン酸カルシウム沈殿法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．４ ５６（１９７３）　］によって実施される。

しかし細胞内にＤＮＡを導入する他の方法、例えば核酸注入又はプロトブラスト 融合による方法も用いることができる。

原核細胞又は実質的な細胞壁構造物を有する細胞を用いる場合は、トランスフェ クションの好ましい方法は、コーエン（Ｆ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）らが報告した 塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である［コーエンら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　６９゜２１１０（１９７２）］。

所望のコード化シークエンス及び制御シーフェンスを有する好ましいベクターの 構築には、標準的なライゲーション技術が用いられる。必要とされるプラスミド を作成するために、単離プラスミド又はＤＮＡフラグメントが切断され、目的に 合わせて作り直され、所望の形に再連結される。

切断は、適切な緩衝液中で１種又は複薮種の制限酵素で処理することにより行わ れる。一般には、およそ１μＩのプラスミド又はＤＮＡが、およそ２０μｌの緩 衝液中の１単位の酵素と共に用いられる。（特定の制限酵素に対する適切な緩衝 液及び基質は製造元により特定される。）３７°Ｃでおよそ１時間、インキュベ ーションを行うことができる。インキュベーション後、フェノール及びクロロホ ルムで抽出してタンパク質を除去し、エタノールで沈殿させて水性分画から核酸 を回収する。

平滑末端が必要な場合は、該調製物をＩＯ単位のポリメラーゼＩ（フレノウ）で １５°ＣＩ５分処理し、フェノール−クロロホルム抽出しさらにエタノール沈殿 を行う。

切断フラグメントのサイズによる分離は、例えば、Ｄ、ゲラデルら、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　８．４０５７　（１９８０）により報告された６ ％ポリアクリルアミドゲルを用いて行われる。

ライゲーションには、正確なマツチングが行われるように末端を適切に仕立てた 所望の成分をおよそ等しい分子数とし、ＤＮＡ０．５μｇ当たりおよそＩＯ単位 のＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する。（成分として切断ベクターが用いられる場合 、細菌のアルカリホスファターゼで前処理して切断ベクターの再連結を防止する ことが育用である。） 構築されたプラスミド中のシーフェンスが正確であることを確認するためには、 該ライゲーション混合物は、大腸菌に１２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４ ６）を形質転換することに用いることができ、アンピシリン又はテトラサイクリ ン耐性により形質転換が行われたものが選別される。形質転換体からのプラスミ ドは調製され、制限酵素により解析され及び／又はメジング（Ｍｅｓｓｉｎｇ） ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９．３０９（１９８１）の方法又は マキサム（Ｍａｘｉａｍ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６ ５、４９９（１９８０）の方法によりシーフェンス決定される。

上記の記載及び現存文献技術の種々の引用に加え、本発明に含まれる基本的な技 術を実施するための限定、並びに方法及び手段が記載されている分子生物学の標 準的教科書も引用される。例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのＭｏ ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　 コールドスプリングハーバ−研究所、　ニー：ｘ−ヨーク）及び本明細書中に引 用した種々の文献を参照のこと。本明細書に引用した印刷物はすべて、援用して 本文の一部としている。

本発明は、従って、病的状態の同定、処置、診断及び／又は制御を目的とし、次 のものを含む： （１）予後診断ツールとしての用途、例えばｎ型に０チヤンネルに対して反応性 の抗体を作成し、その数を測定すること、及び／又は（２）診断薬としての用途 として、ｎ型に＋チャンネルの好ましい選択的調節剤及び／又はブロック物質を 選択的にスクリーニングすること、及び／又は（３）治療薬としての用途として 、ｎ型に′″チヤンネルび／又は付随Ｔ細胞反応を選択的にブロックし、遅らせ 、調節し又は排除すること。

治療のこれら最終点を達成するためのテストキットが、当該分野の現存技術を用 いて構成される。

細胞活性化により仲介される病的状態に関連するＭＫ３遺伝子産物を同定し、単 離し、その特性を調べ、さらにその重要性を認識するために、本研究者により最 初に用いられた方法が説明されている。当業者には、ここに詳述したようなＭＫ ３遺伝子に関する情報を提供することにより、本研究の再現のために労力をかけ てこれら詳細を繰り返すことは不要であり、おそらく学術的にも得策でないとい うことは理解されよう。それよりむしろ、当業者は別の信頼できる既知の方法を 選択し、採用し得る。従って当業者は、例えば、反応決定基に対して産生された 抗体との免疫交叉反応を介して、関連ポリペプチドを同定することができる。類 似又は他の適切な、機能を存する発現ベクター及び培養系における有効な利用の ために、基礎となるＤＮＡシークエンスを合成することもてきる。上記のように 有効利用のための全コード化ＤＮＡの単離における遺伝子ライブラリーのスクリ ーニング用プローブを、好ましくはＮ−末端及びＣ−末端の両領域から作成する ために、本明細書中のシーフェンスを有効利用することができる。当業者は、他 種の関連遺伝子産物をコードするＤＮＡ、又は同種もしくは他種の関連（例えば 遺伝子ファミリー）遺伝子産物をコードするＤＮＡを単離し、特性を調べさらに 上記のように有効利用するために、又は、そのような特性決定、用途及び有効利 用に、１つ又は２つ以上のアミノ酸がＭＫ３遺伝子産物と異なる、もしくは糖付 加パターンが異なる、もしくは結合形状構造が異なる上記のすべてと機能的に同 等な遺伝子産物をコードするＤＮＡを考案するために、本文中のシーフェンス情 報をクロスハイブリッド形成手法に用いることができる。

従って、実際に用いた詳細を提供することに加え、本明細書の開示により、本発 明の利点を有する当該分野における技術を用いて、開示されたＭＫ３遺伝子産物 及び機能的生物活性がある同等物の再生が可能となる。そのような手段のすべて は、本発明の範囲内及び本発明により可能となる範囲内に含まれる。

Ｔリンパ球におけるｎＷＫ”チャンネルの分子の同定を確立するために、２つの アプローチが用いられた。最初のものは、ＭＫ３ｍＲＮＡの注入後の卵母細胞の 電流について、その生物物理特性を比較することであった。ＭＫ３遺伝子により コードされたチャンネルの開閉の電圧依存性、コンダクタンス特性及び薬理学的 感受性が調べられ、ＭＫ３遺伝子のこれらの特性は、マウス及びヒトの両方でｎ 型に０チヤンネルのものと同じであることが分かった（表１に要約）。

表！ ＭＫ３−３５−ｆｉ、３２５０５５１３１１Ｏ，４４０４＜１．０Ｔ細胞におい てＭＫ３が転写され発現されることを示すために、第二のアプローチとしてＰＣ Ｒが用いられた。ＭＫ３の特徴的な５ｌ−３２インタードメイン領域に由来する オリゴヌクレオチドブライマーを用いて、ＭＫ３シークエンスのものと予測され る＋７１ｂｐフラグメントを、Ｔ細胞ＲＮＡから増幅させた（１２）。

このデータに基づき、ＭＫ３はリンパ球のｎ型Ｋ“チャンネルをコードすると推 論される。

ＭＫＩ、ＭＫ２及びＭＫ３は、コード化領域のシーフェンスについておよそ７０ ％の同一性を共有するが、それらの近隣の非コード化領域のシーフェンスについ ては、認識できるようなシーフェンスの同一性はない（１２）。３つの遺伝子は すべて、分断されていない単一のエクソン中に含まれるコード化領域を有し、共 通の祖先からの遺伝子里腹により生じたと思われる遺伝子ファミリーを構成して いる（１２）。近縁遺伝子ファミリーの仲間は、しばしば１つの染色体上に一緒 に存在する。ＭＫｌ−３がこの様式で編成されているかどうかを調べるために、 ＭＫ２−及びＭＫ３−特異的非コード化領域プローブ（１２）を、これら２１［ の遺伝子の染色体上の位置を確認するために用いた。驚くべきことに、ＭＫ２及 びＭＫ３は別個の染色体、すなわちＭＫ２はヒト１２番目染色体に、ＭＫ３はヒ ト１３番目染色体に存在している。ＧＡＢＡＡレセプターのアルファサブユニッ トの３つのアイソフオームも、同様に３つの異なる染色体に位置している（２６ ）。

レトロウィルス及びレトロトランスポゾンは、処理を受けた遺伝子を真核細胞ゲ ノムに挿入し、近縁遺伝子に様々な染色体上の位置を与えると仮定されている（ ２７）。しかし、ＭＫｌ−３は５゛側の非コード化領域内にイントロンを持ち（ １２）、それゆえ処理を受けることはない。従ってレトロウィルス又はレトロト ランスポゾンの挿入現象では、ＭＫ２及びＭＫ３が異なる染色体に位置すること を説明できない。

この数は、成熟した不活性Ｔ細胞に分化する間に、およそ１０−２０／細胞にま で減少する（ｌ、５）。成熟Ｔ細胞の活性化はに０チヤンネルの数を２０倍増加 させる。

この増加はもっばら立型に起こる（３）。立型に９チヤンネル発現におけるこれ らの変化をもたらす分子的メカニズムは不明である。Ｔ細胞成熟及び活性化過程 におけるＭＫ３遺伝子並びにその調節エレメントの今後の特徴付けは、これらの 問題を明らかにするであろう。

リンパ球は、成熟過程中及び活性化状態中、機能的サブセットにより、３つの異 なる型の電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）　Ｋ”チャンネルを発現す る（１−６）。

いくつかの証拠により、マウス及びヒトのＴリンパ球のｎＷＫ”チャンネルは、 Ｔ細胞増殖胸腺細胞サブセット及びマイトジェン刺激後の成熟細胞において本質 的な役割を果たし、Ｋ０チャンネルブロッカ−は、マイトジェン誘発細胞分裂及 びインターロイキン−２の分泌を抑制すると示唆されている（６−９）、さらに 立型チャンネルは、高張処理に反応した体積調節中のに１流出の基礎となり得る （１０．１１）。このチャンネルをコードする遺伝子は以前には同定されていな かった。

ＭＫＬＭＫ２及びＭＫ３は、イントロンを含まないコード化領域をもつシェーカ ー（Ｓｈａｋｅｒ）関連に＋チャンネル遺伝子ファミリーを構成する（１２）。

アフリカッメガエル卵母細胞におけるＭＫ３コード化領域の発現は、電位依存性 ｎ型に′″チヤンネル電圧依存性に＋電流を発生させるということが、ここで示 されている。さらに、ＭＫ３遺伝子はＴ細胞で発現されるということを示すため に、ポリメラーゼ連鎖反応増幅手法（ＰＣＲ）が用いられた。ＭＫ３の特徴的な ５゛側非コード化領域から調製したプローブ（１２）が、１３番目ヒト染色体上 のＭＫ３の位置決めに用いられた。

Ｃ３材料及び方法 １、アフリカッメガエル卵母細胞でのＭＫ３の構築及び発現ＭＫ３コード化領域 を、以下のようにｐＳＰ６４Ｔクローニングベクターに挿入した。ＭＫ３プラス ミドＤＮＡをＢａｎ１で切断した。これは、ＡＴＧ開始コドン後の９ヌクレオチ ド及びＴＡＡ終止コドン後の６０ヌクレオチドを切断し、はぼ完全なコード化領 域を含むＩ　７７４ｂｐフラグメントを生じる（１２）。このＤＮＡをフレノウ ポリメラーゼで充填し、最初の９ヌクレオチドを生成しさらにＢｇｌＩ［認識部 位を含む、合成オリゴヌクレオチド（ＣＡＣＧＧＴＣＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡ ＣＣＧＴＧ）に連結した。その後このフラグメントをＢｇｒｒ［（これはコード 化領域内を切断しない）で切断し、ｐＳＰ６４Ｔの単−Ｂｇｌｌｌサイズに挿入 した。

方向が適切か否かを調べるために、ミニブレツブ（１４）をＳｅａ　Ｉで分解し 解析した。シーフェンス決定キット（［１，Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ク リーブランド、オハイオ州）を使用し、ジデオキシ鎖停止法（！５）による二本 鎖ＤＮＡシークエンス決定により、該構築物を明らかにした。転写のために、こ のプラスミドをＥｃｏＲＩで分解して、直線状とした。ＲＮＡが転写され、これ を前述のように卵母細胞に注入した（１６）。

電気生理学＝２電極膜電位固定（ｖｏｌ　ｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法及びパッチ クランプ技法（Ｉ７）を用いて、アフリカッメガエル卵母細胞で実験を行った。

すべての実験は室温（２２−２６℃）で実施した。この２電極電位位固定実験の ために、９６ｍＭＮａＣ１，１，８ｍ１ＪＣａ　Ｃ１＊及び１　ｍＭＭ　ｇ　Ｃ １ｔを含む卵母細胞リンゲル液に細胞を浸けた。ピペット溶液は３ＭのＫＣＩで ありだ。パッチクランプ実験は、１６０ｍＭＮａＣ１＊　、４．５ｍＭ　ＫＣＩ 、　２ｍ１ＪＣａＣ１！、１　ｍｌＪＭｇ　Ｃｌ　を及び５ｍＭＨＥＰＥＳを含 みＮａＯＨでｐＨ７，４に調節した２９０−３２０ｍｏｓｍｏｌの哺乳類リンゲ ル液を用いて、卵母細胞及びＴ細胞で同一条件下で行った。内部（ピペット）液 は１４０ｍ１ＪＫＦ、２ｍＭＭｇＣ１，，５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１ｍＭＫ＊　 −ＥＧＴＡを含んでいた。

カリブトトキシン（ＣＴＸ）はクリス・ミラー（Ｃｈｒｉｓ　Ｍｉｌｌｅｒ）博 士（ＧｒａｄｕａｔｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、Ｂｒａｎｄｅｉｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ウォノはム、メリーランド州）及 びマリ７−ガルシ７（Ｍａｒｉａ　Ｇａｒｃｉａ）博士（Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅ、　ｏ−’７エ＋。

ニューシャーシー州）から贈与された。

パッチクランプアンブリファイヤー（Ｌｉｓｔ　Ｌ／Ｍ−ＥＰＣ７，Ａｄａｍｓ 　ａｎｄ　Ｌｉ５ｔＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｌｔｄ、　、グレートネック、ニ ューヨーク州）を、電圧−クランプモードで一連の抵抗補償なしで用いた。パッ チクランプ電極は、Ａｃｃｕ−ｆｉｌｌ　９０１Ｊｉｃｒ。

ｐｅｔｓ（Ｂｅｃｔｏｎ、　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　＆　Ｃｏ、　、パーシバニー 、ニューシャーシー州）から３段階で引き、シルガード（Ｓｙ１ｇａｒｄＸダウ コーニング社、ミツドランド、ミシガン州）で被覆し、抵抗（２−７Ｍでバス中 で測定）に対してはファイヤーポリッシュ（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈ）を行った 。すべてのパッチクランプ実験では、パッチクランプアンブリファイヤーのコマ ンドインプットは、デジタル−アナログコンバーターによりコンピューター（Ｐ ＤＰｌ　１／７３）で制御し、電位流は２ＫＨ２のバンド幅で記録した。保持電 位は、すべての実験でＥ　＝　−８０ｍＶに調整した。受容電流（ｃａｐａｃｉ ｔａｔｉｖｅ　５ｕｒｒｅｎｔｓ）の訂正はアナログサブトラクシコン（ａｎａ ｌｏｇ　５ｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）によって実施した。ＭＫ３ｍＲＮＡの注入後 の卵母細胞で示されたに０電流のアンプリチュードは、外側表パッチでの記録中 に著しく減少した。このに０電流アンプリチユードは、各パッチでの記録の開始 と比較して、ｌＯ及び２０分後、５３±８％及び３４±１３％（平均値±ＳＥＭ ；ｎ＝６）までそれぞれ減少した。この消耗のために、全ブロッカ−の能力は、 薬剤処理前及び処理後の平均に゛電流の減少としてめた。

２、オリゴヌクレオチドブライマー ２つのオリゴヌクレオチドブライマーは、ＭＫ３の８１及びＳ２トランスメンブ レンセグメント間のループに接する特徴的な領域から調製された（ＣｈｅｍＧｅ ｎｅｓＣｏｒｐ、、ニーダム、マサチューセッツ州）（１２）。この上流及び下 流プライマーは、５゛−ＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＣＡＧＴＧＣ−３″ （これはＭＫ３のＳｔ）ランスメンブレンへりクスに広がっている）及び、５° −ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧ−３’　（これはＭＫ３の ５ｔ−Ｓ２ループの特徴的な３゛末端の３’−５’相補物である）であった。

３゜ＥＬ４ＲＮＡからのＭＫ３のポリメラーゼ連鎖反応増幅グアシルジニウム（ ｇｕａｎｌｄｉｎｉｕｍ）イソチオシアネート法（１４）によりマウスＴ細胞株 ＥＬ４から全ＲＮＡが単離され、これを、ランダムプライマーによりＣＤＮＡ産 物を生成するために用いた（１８）。２０μｌの反応混合物は、４８単位のＡＭ Ｖ逆転写酵素（Ｌ汀ｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　、２０単位のＲＮＡ５ｊｎ（ベー リンガーマンハイム）、１００９Ｍのランダムへキサヌクレオチド混合物（ベー リンガーマンハイムバイオケミカルス、インディアナポリス、インディアナ州） 、１８ｇの全ＥＬ４ＲＮＡ、及び各々１ｍ１ＪのｄｎＴＰ（シーンアンプキット （ＧｅｎｅＡｍｐ　Ｋｉｔ）、パーキン−エルマー−シータス、ノーウオーク、 コネティカット州）を含んでいた。平行して行った実験では、Ｅ　Ｌ　４　ＲＮ Ａは、３０分間、３μｇの煮沸したＲＮＡ５ｅＡ（シグマ、セントルイス）及び ＲＮＡ５ｅＨ（ファルマシア）で調製され、反応は２０単位のＲＮＡ５ｉｎの添 加により停止され、ｃＤＮＡ合成が開始された。

その後このＣＤＮＡ産物は、ＴＡＱポリメラーゼ（シーンアンプキット、パーキ ン−エルマー−シータス、ノーウオーク、コネティカット州）により、４ｏサイ クル（アニーリング温度５０”Ｃ）で増幅された。この反応混合物は、各々５０ ９Ｍのプライマー及び２μｍのｃＤＮＡの鋳型を含んでいた。この増幅産物（５ −２０１１）は、その後ＴＡＥ緩衝液で２．２％アガロースゲルに泳動された。

４、染色体上の位置決定 ＭＫＩ、ＭＫ２及びＭＫ３の近隣の非コード化領域はシーフェンス同一性をお互 いに一切共有しない（１２）ので、ＭＫ３及びＭＫ２特異的プローブは、これら 遺伝子の５゛側ＮＣＲから作成した。０．９ｋｂのＨ３／Ｐｓｔフラグメントは ＭＫ２の５゛側ＮＣＲから調製され（１２）　、０．７ｋｂのＰｓｔフラグメン トはＭＫ３の５゛側ＮＣＲから単離された（１２）。これらのプローブは、ラン ダムプライマー法で比活性１０’ｃｐｍ／μｇに標識（１９）ｔ、てから、染色 体実験に用いた。ＭＫ２及びＭＫ３遺伝子座の染色体上の位置は、２９のヒト− チャイニーズハムスター細胞ハイブリッドのパネルを、サザンブロッティング法 で解析して決定した（２ｏ１２１）。このハイブリッドは、種々の選択マーカー を用いて単離された（２ｏ。

２１）。どのヒト染色体が保持されているかを決定するために、全ハイブリッド は、トリパンーギムザバンディング（Ｇ−バンディング）及びＧ−１１染色によ り、細胞遺伝学的な特性を調べられた。この解析は、ＤＮＡ調製のために細胞を 採取する度に繰り返された。いずれの場合にも、２ｏの中期染色体を分散したも のが試験された。このハイブリッドのヒト染色体内容物は、図５に示されている 。

プローブＭＫ２又はプローブＭＫ３により検出される、ヒト特異的な制限フラグ メントの存在又は欠如は、この種ｗＩＩＭ胞ハイブリッドの異なるヒト染色体の 存在と相関性を有していた。

５、卵母細胞におけるＭＫ３の発現 アフリカッメガエル卵母細胞は、７０ｎ　Ｉの０．０１μｇ／μｌのＭＫ３ｍＲ ＮＡを注入後、高濃度の電圧活性化に０チヤンネルを発現する。２電極電圧クラ ンピングを用いて、＋　４０１Ｊｖのテスト電位で２０μＡを越える電流が観察 できた（データは掲載していない）。卵母細胞膜（７０ｎｌの０．１μｇ／μｌ 　ＭＫ３ｍＲＮＡを注入）の外側表パッチは、ゲーティングキネティクス、薬理 学的感受性、及び単一チャンネル特性の測定のために用いられた。卵母細胞全体 からのミクロ電極記録で見られた大電流を反映して、パッチの電流強度は太き（ なり、しばしばパッチ当たり１０００チヤンネル（８４０±２４２Ｋ”チャンネ ル／パッチ：平均値子ＳＥＭ；ｎ＝１１）を表していた。

６、ＭＫ３の電圧依存 卵母細胞パッチ電流は、ヒトＴリンパ球を用いた以前の研究で見られた細胞全体 のに゛電流と殆ど同じであった（６．９．２２）。チャンネル特性の比較のため に、哺乳類のイオン強度において同じ溶液（２９０−３１−ｍｏｓｍ／ｋｇ）を 、卵母細胞パッチ及びリンパ球に用いた。図１はＭＫ３遺伝子産物を発現してい る卵母細胞のに′″電流記録及び解析を示している。外向きの電流は、およそ５ ０Ｍｖ陽性のポテンシャルで活性化状態になる、Ｋ０チャンネルの単一集団を表 しているように思える。脱分極においては、このチャンネルはＳ字型のタイムコ ースで開き、およそ１０ｍ５ｅｃ以内でピークに達し、その後２００−４００ｍ ｓｅｃの範囲の時間定数で不活性となる。図ＩＢで示されたコンダクタンス−電 圧関係から、該チャンネルは非常に電圧依存性で、４ｍＶ当たり０倍変化するコ ンダクタンスを有し、−４０ｍＶのミツドポイントをもつ。これらの値は、また 、ヒトＴリンパ球の完全細胞形態で記録されたに″″電流特色でもある。従って 、ＭＫ３電流のに１チヤンネル活性における電圧依存性は、ｎ型リンパ球に′″ 電流それとつりあう。

７、活性化及び不活性化キネティクス 活性化及び不活性化のキネティック特性も、ＭＫ３を流とリンパ球のｎ型電流と の間で同様である。５卵母細胞のに″″電流タイムコースを、活性化（ｎ４）及 び不活性化（Ｄに関する改変ホジキン−ハックスレーのキネッティクモデルを用 いて解析したところ、ゲーティングに対する特定のメカニズムは示唆されなかっ た。

図ＩＣ及びＩＤは、卵母細胞で発現されたＭＫ３遺伝子のについての開放及び不 活性化のに＋チャンネルキネティクスを示している。チャンネル活性化及び不活 性化の速度は、これまでに報告されたヒトＴリンパ球のそれと同様であった（２ ２）。特にチャンネル不活性化は、Ｋ“チャンネルの様々な型を区別するための 便利な特性を提供する。ｎ型リンパ球チャンネルの不活性化は、１００ｎｓｅｃ 以下で不活性化する古典的大電流と、１　ｓｅｃより遅い時間定数で不活性化す る遅延整流器（ｄｅｌａｙｅｄ　ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ）　（２３参照）との間の 速度で進行する。のみならず、ｎ型チャンネルの不活性化は、ｌＨｚで与えられ る反復脱分極パルスの間に蓄積される。なぜならば、パルスとパルスの間の回復 が不完全だからである。

卵母細胞で発現されるＭＫ３に″″電流より示される、不活性化のタイムコース と使用依存性は共に、図ＩＤ及び２Ａで示されるように、リンパ球のそれと同じ である。最後に、図２Ｂで示したように、再分極の際のチャンネル閉鎖は、ｎ型 に″″電流卵母細胞で発現されたＭＫ３遺伝子産物との間で同様である。

８、単一チャンネルコンダクタンス さらに、単一チャンネルコンダクタンスの測定は、ＭＫ３遺伝子を、リンパ球ｎ 型に０チヤンネルをコードする遺伝子として同定し得る。多くのに９チヤンネル を含む卵母細胞パッチで、種々の脱分極レベルで膜電位を保持することにより単 一チャンネル電流を測定することができる。不活性化か進むにつれ、図２０に示 したように、最終的に単一チャンネル電流を認めることができる。これらの電流 は、およそ１３ｐＳの単一チャンネルコンダクタンスと一致し、ヒトＴ細胞で報 告された９ｐＳ及び１６ｐＳ（２２）及びマウスＴ細胞の１３ｐＳ（２）及びｔ ｓｐｓ　（１”）と同様である。

９、ＭＫ３及びｎ型に＋チャンネルは類似する薬理学的特性を共有する薬剤によ るブロックは、Ｋ＋チャンネルの分類のための更なるテストを提供する。リンパ 球のｎ型にゝチャンネルは、（能力の弱いものから順に）テトラエチルアンモニ ウム（ＴＥＡ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、キニーネ、ベラパミル及び ＣＴＸを含む、広スペクトルの薬剤（６，８，９，２２，２４）によるブロック に対して感受性を有する。ＭＫ３ｍＲＮＡの注入後の卵母細胞に′″電流、図３ に示したように完全に同じ薬理特性を示した。両方のＣＴＸ　（Ｃ，ミラー贈与 分及びＭ、ガルシア贈与分）とも、リンパ球でそれらがブロックしたように（２ ４Ｌ卵母細胞でＭＫ３チャンネルをブロックした。ｎ型及びＭＫ３電流の半ブロ ツクドース（表１に要約）は、非常に類似している。

１０、ＭＫ３はＥＬ４Ｔ細胞で発現されるＥＬ４細胞は、内向き整流器に９チヤ ンネルと共に、電位依存ｎ型に０チヤンネル（−２００／細胞）を示す（２５） 。これらの細胞の全ＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲで解析した。我々は、ＭＫ３のＳ ｌ及びＳ２トランスメンブレンへりクスにリンクするループから、プライマーを 作成することにした。なぜならば、この領域は、近縁のＭＫＩ及びＭＫ２遺伝子 からさえも、ＭＫ３を識別できる特徴的なシーフェンスを有するからである（１ ２）。ＭＫ３シークエンスから予測される１７１ｂ＋１フラグメントをＥ　Ｌ　 ４　ＲＮＡから増幅した（図４のレーン２）。このフラグメントがＥＬ４ＲＮＡ に由来するのか、又は夾雑しているジェノミックＤＮＡに由来するのかを調べる ために、ＥＬ４ＲＮＡを、ＤＮＡ５ｅを含まないＲＮＡ５ｅＡ及びＨ（ＤＮＡに 影響を与えないでＲＮＡを分解する）で前処理し、それからＰＣＲを実施した。

ＲＮＡＳｅ処理ＥＬ４ＲＮＡでは＋７１ｂｐフラグメントを増幅することができ なかった（図４のレーン３）。このことは、このフラグメントは該ＲＮＡに由来 し、ジェノミックＤＮＡの夾雑物の可能性はないことを示している。これらのデ ータを総合すれば、ＥＬ４Ｔ細胞でＭＫ３が発現されていることが支持される。

１１、ＭＫ２及びＭＫ３の染色体上の位置決定２９のヒト−チャイニーズハムス ター細胞ハイブリッドのパネルのサザンブロッティング解析に基づき、ＭＫ２は ヒト１２番目染色体に、ＭＫ３はヒト１３番目染色体に位置が決定された。表２ に示されたように、ＭＫ２は１２番目染色体に１００％合致し、ＭＫ３は１３番 目染色体に１００％合致した。

１２、物質テスト 影響は、好ましくは電気生理学的に、例えば不活性化特性のモニタリング、チャ ンネルクロージングキネティクス、又は電圧依存のブロックもしくはシフト、単 一チャンネルアンプリチュードの活性化もしくは変化などによりモニターするこ とができる。同じ発現産物に対する、又はＴ細胞もしくはｎ型に９チヤンネルを 含む他の細胞に対する物質のバッテリーをスクリーニングするために、同じ操作 候補物質として同定される。

えば、ウィアー（Ｗｅｉｒ）らが記載した方法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、３　（＋９８６）及び他の利用可能な書物）により単離する。ｎ型にゝ チャンネルに対する抗体を調製するための抗原として使用されるｎ型にゝチャン ネルタンパク質又はペプチドを調製するための鋳型として、これらの遺伝子を用 いる。ｎ型に９チヤンネルに対する抗体を調製する第二の方法は、大量のｎＵＫ ＋チャンネルを発現している細胞を用い、これらの細胞の細胞表面タンパク質を 単離し、抗体調製のために抗原としてこれらのタンパク質を使用する。これらの 抗体は、（ａ）先に述べたようにｎ型に＋チャンネルに対して電気生理学的な影 響を与える能力、（ｂ）該抗体を細胞毒と結合させたとき、又は補体の存在下で 該抗体を細胞と結合させたとき、該抗体がｎ型に０チヤンネルを発現している細 胞を破壊する活性、又は（Ｃ）放射性同位元素、色素もしくは酵素結合抗体が細 胞に結合する能力について、結合を蛍光顕微鏡、蛍光細胞ソーティング、放射能 計測、酵素結合免疫吸着アッセイ又は他の適切な技術によりモニターして、スク リーニングされる。

１４、自己免疫疾患における薬剤及び／又は抗体テストユ型に０チヤンネルのた めに選択される候補物質として、上記に記載された方法により同定された薬剤又 は抗体を含む物質を、適切な動物モデルにおける生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での 有効性について、例えば免疫反応、自己免疫疾患、細胞増殖性疾患又は逆免疫疾 患の開始及び進行を遅らせる能力についてテストすることができる。薬剤／抗体 の投与経路は経口、非経口、直腸経由が可能で、さらに薬剤は主剤として単独で 投与することもでき、また他の薬剤もしくは抗体と組み合わせて投与することも でき、さらに規則的な間隔で投与することも、また−回投与も、標準的な構成の 継続的な輸液もできる。上記に記載された薬剤又は抗体は、例えば自己免疫患者 の、又は自己抗体を分泌するモデル動物のＢ細胞刺激活性能について、試験管内 （ｉｌｌ　ｙｉｔｒｏ）アッセイでテストすることもできる。

１５、処置プロトコール 上記に記載されたアッセイにより同定された物質又は候補物質は、合衆国政府の ガイドラインによるヒトに対する安全性をテストされる。上記のこれらの候補物 質は、標準的な組成物を介して疾患を有する患者に、経口的、非経口的、もしく は直腸に、単独もしくは組み合わせて、規則的間隔、−回投与もしくは継続輸液 として、Ｔ細胞のｎ型に４チヤンネルを調節し、それによって異常な付帯的ヘル パー機能を停止させ、該疾患の進行に影響を与えるために投与される。

引用が特定の好ましい具体例に対するものであるにも拘らず、本発明はそのよう なものに限定されるものと解釈すべきではなく、むしろ付随する請求の範囲の法 的範囲に制限されることは理解されるであろう。

文献目録 １、　Ｒ，Ｓ、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）及びＭ、　Ｄ、カヘラン（１９８８）、５ ｃｉｅｎｃｅ　２３９゜７７１−７７５゜ ２、　Ｔ、Ｅ、デコーシ−（ＤｅＣｏｕｒｓｅｙ）　、Ｋ、　Ｇ、チャンディー 、Ｓ、ギュブタ（Ｇｕｐｔａ）及びＭ、　Ｄ、カヘラン（１９８７）　Ｊ、Ｇｅ ｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８９．３７９−４０４゜３、　Ｔ、Ｅ、デコーシー、Ｋ 、　Ｇ、チャンディー、Ｓ、ギュブタ及びＭ、　Ｄ。

カヘラン（１９８７）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８９，４０５−４２０ ゜４、Ｄ、　マー７キンノン（ＩＪｃＫｉ　ｎｎｏｎ）及びＲ，セレディッヒ（ Ｃｅｒｅｄｉｇ）　（１９８６）Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６４．１８４６−１ ８６１゜５、Ｓ、グリス７　（Ｇｒｉｓｓｍｅｒ）、Ｍ、　Ｄ、カヘラン及びに 、　Ｇ、チャンディー　（１９８８）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１．１１３ ７−１１４２゜６、　Ｔ、Ｅ、デコーシー、Ｋ、　Ｇ、チャンディー、Ｓ、ギュ ブタ及びＭ、　Ｄ。

カヘラン（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０７．４６５−４６８゜７、　Ｋ、　 Ｇ、チャンディー、Ｔ、Ｅ、デコーシー、Ｍ、フィッシュバッハ（Ｆｉｓｃｈｂ ａｃｈ）　、Ｎ、タライ（Ｔａｌａｉ）　、Ｍ、　Ｄ、カヘラン及びＳ、ギュブ タ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３．１１９７−１２００゜８、　Ｋ、　Ｇ 、チャンディー、Ｔ、Ｅ、デコーシー、Ｍ、　Ｄ、　カヘラン、Ｃ，マクロ−リ ン（ＭｃＬａｕｇｈｌ　ｉｎ）及びＳ、ギュブタ（１９８４）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、　１６０．３６９−３８５゜９、　Ｔ、Ｅ、デコーシー、Ｋ、　Ｇ、’チ ャンディー、Ｓ、ギュブタ及びＭ、　Ｄ。

カヘラン（１９８５）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、　１０．７１−９５゜ １０、Ｍ、Ｄ、カヘラン及びＲ，Ｓ、ルイス（１９８８）血液の細胞生理学（Ｃ ｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ）　（Ｒ，ガン（Ｇｕｎｎ） 、Ｊ、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）Ｉｉ。

２０８−３０１．ロックフェラー大学出版局、ニューヨーク）１１、Ｓ、グリン シュタイン（Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ）及びＪ、　Ｄ、スミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）（１ ９９０）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９５．９７−１２０゜１２、　Ｋ、 　Ｇ、チャンディー、Ｃ，Ｂ、　ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、Ｒ，Ｈ。

スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）　、Ｂ、　Ａ、アギター（Ａｇｕｉｌａｒ）　、 Ｓ、ギャンシャニー（Ｇｈａｎｓｈａｎｉ）　、Ｂ、　Ｌ、テンベル（Ｔｅｍｐ ｅｌ）及びＧ、　Ａ、ガトマン（Ｇｕｔｍａｎ）　（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ 　２４７．９７３−９７９゜１３、Ｐ、　Ａ、クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）及びり、 　Ａ、　メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）　（１９８４）Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１２．７０５７−７０７０゜１４、　Ｔ、　ｖ＝アティス（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ）、フリッチ（ｐｒｉ　ｔｓｃｈ）及びＪ、サムブルク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） 　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　：Ｉ−ルドXブリ ンクハーバー研究所、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク１５、Ｆ、サ ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、３．＝−７クレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ）及びＡ、　Ｒ， カルノン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７゜１６、Ｖ、Ｊ、オールド（Ａｕ　 ｌｄ）、Ａ、　Ｌ、ゴルディン（Ｇｏｌｄｉｎ）、Ｄ、　Ｓ、クラフト（Ｋｒａ ｆｔｅ）、Ｊ、　Ｊ、　ｖ−シャル（Ｍａｒｓｈａｌ　ｌ）、Ｍ、ダン（Ｄｕｎ ｎ）、Ｗ、　Ａ、カッターロール（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ）　、Ｈ，Ａ、レスター （Ｌｅｓｔｅｒ）、Ｎ、デービッドラン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）及びＲ，Ｊ、ダン （Ｄｕｎｎ）　（１９８８）　Ｎｅｕｒｏｎ　１．４４９−４６１゜１７、　Ｏ ，Ｐ、　ハミル（Ｈａｍｉｌｌ）、Ａ、マーティー（Ｍａｒｔｙ）　、Ｅ、ネー ハー（Ｎｅｈｅｒ）　、Ｂ、サックマン（Ｓａｋｍａｎｎ）及びＦ、　Ｊ、ジグ ワース（Ｓｉｇｗｏｒｔｈ）　（１９８１）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ　Ａｒｃｈｉｖ、 　３９１．８５−１００゜１８、　Ｍ、　Ｓ、フラッグ（Ｋｒｕｇ）及びＳ、　 Ｌ、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）　（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ 、　１５２．３１６−３２５゜１９、　Ａ、　Ｐ、ハインベルグ（Ｆｅｉｎｂｅ ｒｇ）及びＢ、フォーゲルシュタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　（１９８３） 　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２．６−１３゜２０、　Ｒ，Ｅ、キル口（ Ｃｉｒｕｌｌｏ）　、Ｆ、　Ｘ、アレンドーベガ（Ａｒｒｅｎｄｏ−Ｖｅｇａ） 、Ｍ、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びＪ、　Ｊ、ワスマス（Ｗａｓｍｕｔｈ）　（１ ９８３）　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌＧｅｎｅｔｉｃｓ　９．２１５−２３３゜ ２１、Ｊ、オーバーハウサー（Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ）、Ｊ、メマホンＱｌｅｍ ａｈｏｎ）及びＪ。

Ｊ、ワスマス（１９８７）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　２５．４６１７− ４６２７゜２２、　Ｍ、　Ｄ、　カヘラン、Ｋ、　Ｇ、チャンディー、Ｔ、Ｅ、 デコーシー及びＳ、ギュブタ（１９８５）　Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３５８，１ ９７−２３７゜２３、Ｂ、ヒル（Ｈｉｌｌｅ）　（１９８４）　興奮性膜のイオ ンチャンネル（Ｉｏｎｉｃｃｈａｎｎｅｌｓ　ｏｆ　ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　ｍｅ ｍｂｒａｎｅｓ）、　５ｉｎａｕｅｒ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ、、サン ダーラ■ ド、マサチューセッツ ２４、　Ｓ、Ｂ、サンダ（Ｓａｎｄｓ）　、　Ｒ，Ｓ、ルイス及びＭ、　Ｄ、カ ヘラン（１９８９）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９３．１０６１−１０７ ４゜２５、Ｍ、Ｄ、カヘラン、Ｋ、Ｇ、チャンディー、Ｔ、Ｅ、デコーシー、Ｓ 。

ギュブタ、Ｒ，Ｓ、　ルイス及びＪ、サトウ口（Ｓｕｔｒｏ）　（１９８７）　 ！Ｊンパ球活性イヒと免疫調節のメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｌ ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ａｃ１ｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＩｍｍｕｎｅＲｅｇｕ ｌａｔｉｏｎ）　（Ｓ、ギュブタ、Ａ、Ｓ、ファージ（Ｆａｕｃｉ）　Ｉｉ、８ ５−１０２．　ブレナム、ニューヨーク） ２６、　Ｖ、　Ｊ、バックル（Ｂｕｃｋｌｅ）、Ｎ、フジタ（Ｆｕｊｉｔａ）、 Ａ、　Ｓ、ライダーＨ、シーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）　、Ａ、　Ｎ、ベートノ ン（Ｂａｔｅｓｏｎ）　、Ｍ、　Ｇ、　ダ−ＩＪ”ノン（Ｄａｒｌｉｓｏｎ）及 びＥ、　Ａ、パーナート（１９８９）　Ｎｅｕｒｏｎ　３．６４７−６４５゜２ ７、　Ａ、　Ｍ、ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、Ｐ、　Ｌ、ダイニンガー（Ｄｅ　 ｉｎ　ｉｎｇｅｒ）及びＡ、　エファトラテイアーテイス（Ｅｆａｔｒａｔｉａ ｔｉｓ）　（１９８６）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５５゜６３１− ６６１゜ ’　２８．Ｓ、　グリスｖ−（Ｇｒｉｓｓｍｅｒ）、Ａ、Ｌ、ゴルディン（Ｇｏ ｌｄｉｎ）、Ｇ、　Ａ。

ガトマン（Ｇｕｔｍａｎ）、Ｍ、　Ｄ、カヘラン及びに、　Ｇ、チャンディー、 アブストラクト：生物物理国際会議、バンク−パー、カナダ（１９９０年７月） ＦＩＧ、　ＩＢ　９Ｋ　＜、ｓ＞ ＦＩＧ、　ＩＣＦＩＧ、　ＩＤ τ。　（ｍｓ）　τ）１　（ｍｓ） Ｅ　（ｍＶ）　Ｅ　（ｍＶ） （ｍｓ） （ｍＭ）　（ｎＭ） １００ｍｓ　５０ｍ５ ＦＩＧ、　３Ｇ ０．０１　１　１００ 濃度　（ｍＭ） ＦＩＧ、　５ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１１０２　 ６８０７−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｋ　８３１０−２Ｊ（７２）発明者　グリスマー、ステ ファンアメリカ合衆国　９２７１７　カリフォルニア州　アーバイン　シー　サ ウス　サークルビュー　ドライブ　２０１５ （７２）発明者　ゴルディン、アラン　エル。

アメリカ合衆国　９２７１５　カリフォルニア州　アーバイン　ディケンズ　コ ート　１９Ｉ （７２）発明者　デスレフス、ブレンド　エイ。

アメリカ合衆国　９２７０８　カリフォルニア州　ファウンテン　バリイー　ハ ーバーポウレヴアード　１６３５０　ナンバー　２２０８（７２）発明者　ガト マン、ジョージ　エイ。

アメリカ合衆国　９２６２６　カリフォルニア）　州　コスタ　メサ　タイラー 　ウェイ（７２）発明者　ワスマス、ジョン　ジェイ。

アメリカ合衆国　９２６５３　カリフォルニア州　ラグナヒルズ　ウールウィッ チ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類におけるｎＫ＋チャンネル発現に対して調節効果を有する物質の同定 のためのアッセイであって： ａ．ＭＫ３遺伝子のコード化ＤＮＡの機能的ｎＫ＋チャンネル発現産物、又は機 能的に生物活性がある同等物を生成する発現システムを提供する；ｂ．該産物又 は同等物の生物活性に対するその調節効果を決定するために、該システム又は該 産物もしくは同等物を、１つ又は２つ以上の物質と接触させる；ｃ．該ｎＫ＋チ ャンネル発現を調節することができる単一又は複数の候補物質を、該物質から選 択することを含む当該アッセイ。
2. ２．該選択ステップが、該産物又は同等物の生物活性に対する調節効果を測定す ることを含む、請求項１に記載のアッセイ。
3. ３．調節効果が、該産物又は同等物の生物活性効果をブロックする能力を含む、 請求項２に記載のアッセイ。
4. ４．該機能的ｎＫ＋チャンネル発現産物が、単一のＫ＋チャンネル発現産物であ る、請求項１に記載のアッセイ。
5. ５．該ＭＫ３遺伝子がマウスｎＫ＋チャンネル遺伝子を含む、請求項１に記載の アッセイ。
6. ６．該機能的に生物活性がある同等物が、機能的なヒトｎＫ＋チャンネル発現産 物を含む、請求項１に記載のアッセイ。
7. ７．該機能的に生物活性がある同等物が、該ヒトｎＫ＋チャンネル発現産物の機 能的なホモログを含む、請求項６に記載のアッセイ。
8. ８．該機能的に生物活性がある同等物が、合成で誘導された産物を含む、請求項 １に記載のアッセイ。
9. ９．該発現システムがトランスフェクタントを含む、請求項１に記載のアッセイ 。
10. １０．該トランスフェクタントが、該産物又は同等物を有効にコードするＤＮＡ を宿す哺乳類細胞である、請求項９に記載のアッセイ。
11. １１．哺乳類Ｔ細胞の活性化を抑制するために有用な方法であって：ａ．請求項 １に記載のアッセイステップを実施する；ｂ．場合によっては該単一又は複数の 候補物質を単離する；ｃ．哺乳類Ｔ細胞を該単一又は複数の候補物質と接触させ ることを含む方法。
12. １２．該接触が、本質的な成分として該候補物質を含む組成物を介して達成され る、請求項１１に記載の方法。
13. １３．該接触が、人体への投与を介して達成される、請求項１１又は１２に記載 の方法。
14. １４．組織移植拒絶反応を抑制するために有用な方法であって、該Ｔ細胞が組織 移植レシピエントのそれである、請求項１１に記載の方法。
15. １５．腫瘍性の存在について個々人をスクリーニングするために有用な方法であ って、該Ｔ細胞が腫瘍の疑いのある個々人のそれである、請求項１１に記載の方 法。
16. １６．ｎＫ＋チャンネル発現仲介性Ｔ細胞活性化に関連する病的状態の診断用ア ッセイであって： ａ．被験者のｎＫ＋チャンネル含有Ｔ細胞を提供する；ｂ．ステップａのＴ細胞 集団中から活性化ｎＫ＋Ｔ細胞を同定する；ｃ．ＭＫ３遺伝子のコード化ＤＮＡ の機能的に生物活性がある産物、又は機能的に生物活性がある同等物を基にした 標識手段を用いて、ｎＫ＋チャンネル発現を測定することにより、全Ｔ細胞集団 に対する当該Ｔ細胞の活性化を測定するステップを含むアッセイ。
17. １７．ｎＫ＋チャンネル発現仲介性Ｔ細胞活性化に関連した病的状態の検出のた めに有用なテストキットであって、被験者のｎＫ＋チャンネル含有Ｔ細胞培養物 を収容し、テストするための構成物を含み、さらに、１）該培養物のＴ細胞集団 中から活性化Ｔ細胞を同定する、２）ＭＫ３遺伝子のコード化ＤＮＡの機能的に 生物活性がある産物、又は機能的に生物活性がある同等物を基にした標識手段を 用いて、該細胞のｎ型Ｋ＋チャンネルの相対的な数を測定するための手段を含む テストキット。
18. １８．本質的成分として請求項１で規定された候補物質を含む組成物であって、 該組成物が生体内で哺乳類Ｔ細胞と接触するときに、その調節特性を与えるため に有用である当該組成物。
19. １９．哺乳類Ｔ細胞の活性化を抑制する方法であって、請求項１８に記載の組成 物を該Ｔ細胞に接触させることを含む方法。
20. ２０．哺乳類Ｔ細胞の活性化を抑制する方法であって、請求項１記載の候補物質 を該Ｔ細胞と接触させることを含む方法。
21. ２１．請求項１に記載のアッセイ、又は請求項１１に記載の方法、又は請求項１ ６に記載のアッセイで用いられる場合の、ＭＫ３遺伝子産物又は機能的に活性が あるその同等物をコードするＤＮＡ。
22. ２２．ＭＫ３遺伝子産物をコードする、請求項１９に記載のＤＮＡ。
23. ２３．請求項２１に記載のＤＮＡを含むトランスフェクトされた細胞。
24. ２４．該細胞が哺乳類細胞である、請求項２３に記載のトランスフェクトされた 細胞。
25. ２５．請求項２１に記載のＤＮＡを含むベクター。