CN104540382A - 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物 - Google Patents

用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供用序列特异性核酸酶产生条件性敲除等位基因的方法和组合物。

Description

用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年6月12日提交的美国临时申请号61/658,670的权益，该美国临时申请的公开内容在此完整引入作为参考。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，在此完整引入作为参考。于2013年6月12日创建的该ASCII拷贝命名为P4905R1WO_PCTSequenceListing.txt，大小为49,214字节。
技术领域
本发明涉及产生遗传改造的条件性敲除等位基因的新方法。
背景技术
单个基因表达的选择性抑制或增强已极大地辅助了体外和体内基因功能的研究。使用同源重组的鼠胚胎干(ES)细胞的基因靶向是用于操作鼠基因组的完善方法，且已允许创造就所研究的基因而言的无效或“敲除”小鼠。最近，条件性或诱导性敲除技术推进了在全身缺失时导致胚胎或围产期致死率的基因的研究(例如Lakso,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6232-36(1992)；Jacks,T.等,Nature 359:295-300(1992))。条件性敲除小鼠还可以用来研究在特定组织中选择性缺失基因的作用，同时保持其在其他组织中的功能完整。但是，用于产生条件性敲除动物的常规方法费力、低效，且需要得到胚胎干细胞。
改造的序列特异性核酸酶已用于产生敲除等位基因。这类序列特异性内切核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)，其由与内切核酸酶效应结构域融合的序列特异性DNA结合结构域组成(Porteus,M.H.和Caroll,D.,Nat.Biotechnol.23,967-973(2005))。序列特异性核酸酶的另一实例是转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)，其由与TAL效应蛋白融合的核酸酶结构域组成(Miller,J.C.等,Nat.Biotechnol.29,143-148(2011)；Cermak,T.等,NucleicAcid Res.39,e82(2011))。序列特异性内切核酸酶是自然界中的模块，通过排列一个或多个模块来获得DNA结合特异性。例如，ZFN中的锌指结构域各识别三个碱基对(Bibikova,M.等,Mol.Cell.Biol.21,289–297(2001))，而TALEN中的单个TAL结构域各通过唯一密码识别一个碱基对(Boch,J.等,Science 326,1509–1512(2009))。序列特异性核酸酶的另一实例包括RNA指导的DNA核酸酶，例如CRISPR/Cas系统。
已用ZFN、TALEN和最近的CRISPR/Cas介导的基因编辑来有效和直接地产生基因敲除等位基因(Geurts,A.M.等,Science 325,433(2009)；Mashimo,T.等,PLoS ONE 5,e8870(2010)；Carbery,I.D.等,Genetics 186,451–459(2010)；Tesson,L.等,Nat.Biotech.29,695-696(2011))。认为敲除等位基因由内切核酸酶介导的双链断裂(DSB)的易错非同源末端连接(NHEJ)产生。
最近，ZFN在小鼠和大鼠二者中成功地用于通过所靶向的染色体基因座与供体DNA的同源重组来靶向插入(敲入)报道基因(Meyer,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107,15022–15026(2010)；Cui,X.等,Nat.Biotechnol.29(1),64-67(2010))。已提出供体序列的序列特异性插入经由通过供体和发生双链断裂的基因座之间的同源重组进行的双链断裂修复的合成依赖性链退火(SDSA)模型而发生(Moehle,E.A.等,Proc Natl Acad Sci USA 104,3055–3060(2007))。根据此模型，内切核酸酶介导的双链断裂和链切除之后，单链染色体末端退火至存在于供体DNA上的同源区，然后用供体插入片段作为模板进行合成。
尽管有这些进展，但本领域仍存在对产生条件性敲除等位基因和将此技术扩展至其他物种的新方法的需要。本发明满足此需要，并提供其他益处。
发明概述
本发明涉及用于产生条件性敲除等位基因的新方法和组合物。具体而言，本发明涉及用特异性供体构建体与序列特异性核酸酶一起来产生条件性敲除等位基因。
在一方面，提供在包含靶基因的细胞中产生条件性敲除等位基因的方法。该方法包括步骤：
1.向该细胞中引入供体构建体，其中该供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中该供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；和
2.向该细胞中引入切割靶基因内的序列的序列特异性核酸酶，从而在该细胞中产生条件性敲除等位基因。
在某些实施方案中，该序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)或RNA指导的DNA内切核酸酶。在某些实施方案中，该序列特异性核酸酶仅切割靶基因一次。在某些实施方案中，将该序列特异性核酸酶作为蛋白质、mRNA或cDNA引入细胞。
在某些实施方案中，该重组酶识别位点是loxP位点、rox位点或frt位点。在某些实施方案中，该供体序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个中性突变。在某些实施方案中，该供体序列和该靶序列之间的同源性为51-99％。在某些实施方案中，该供体序列和该靶序列之间的同源性为78％。在某些实施方案中，该供体构建体包含图4A或图4B中所示的序列。在某些实施方案中，该5'同源区包含至少1.1kb，且其中该3’同源区包含至少1kb。在某些实施方案中，该靶基因是Lrp5。
在另一实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该哺乳动物细胞是小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猫、狗、绵羊、马、牛、猴或人细胞。在某些实施方案中，该细胞来自非人动物。在某些实施方案中，该细胞是体细胞、合子或多能干细胞。
在另一方面，提供产生条件性敲除动物的方法，该方法包括步骤：
1.向包含靶基因的细胞中引入供体构建体，其中该供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中该供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；
2.向该细胞中引入序列特异性核酸酶，其中该核酸酶切割靶基因；和
3.将该细胞引入载体动物中，以从该细胞产生条件性敲除动物。
在一些实施方案中，该动物是小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、狗、绵羊、猪、马、牛或猴。在某些实施方案中，该细胞来自非人动物。在一些实施方案中，该细胞是合子或多能干细胞。
在另一方面，提供产生敲除动物的方法，该方法包括步骤：
1.向包含靶基因的合子中引入供体构建体，其中该供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中该供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；
2.向该合子中引入序列特异性核酸酶，其中该核酸酶切割靶基因；
3.将该合子引入载体动物中，以从该合子产生条件性敲除动物；和
4.使该条件性敲除动物与具有编码催化5’和3’重组酶识别位点处的重组的重组酶的转基因的转基因动物交配，从而产生敲除动物。
在某些实施方案中，该重组酶识别位点是loxP位点，该重组酶是Cre重组酶。在某些实施方案中，该重组酶识别位点是frt位点，该重组酶是flippase。在某些实施方案中，该重组酶识别位点是rox位点，该重组酶是Dre重组酶。在某些实施方案中，该编码重组酶的转基因处于组织特异性启动子的控制下。
在本发明的另一方面，提供用于产生靶基因的条件性敲除等位基因的组合物，其包含：
1.包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区的供体构建体，其中该供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；和
2.识别该靶基因的序列特异性核酸酶。
在某些实施方案中，该序列特异性核酸酶是ZFN、ZFN二聚体、ZFNickase、TALEN或RNA指导的DNA内切核酸酶。在某些实施方案中，该重组酶识别位点是loxP位点、frt位点或rox位点。
在本发明的另一方面，提供包含图4A(SEQ ID NO:30)、图4B(SEQID NO:31)或图14C(SEQ ID NOS:44-46)中所示的序列的供体构建体。
在本发明的另一方面，提供包含含有图4A(SEQ ID NO:30)、图4B或图14C(SEQ ID NOS:44-46)中所示的序列的供体构建体的细胞。在某些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该哺乳动物细胞是小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猫、狗、绵羊、马、牛、猴或人细胞。在某些实施方案中，该细胞来自非人动物。在某些实施方案中，该细胞是体细胞、合子或多能干细胞。
在本发明的另一方面，提供按照本文所述的方法制备的非人条件性敲除动物。
附图简述
图1显示ZFN介导的突变体Lrp5等位基因在活产小鼠中的分布。缺失和插入的大小在x轴上以碱基对表示。复合KO：具有同一基因的两个独立的突变体等位基因而检测不到该基因的野生型等位基因的动物；多等位基因：携带超过两个等位基因的嵌合动物；SKG->WTD：TCCAAGGGT(ZFN切割位点下划线)的缺失。
图2A-E显示在Lrp5中具有复合的符合读框和不符合读框的缺失的2月龄小鼠的血管表型。542：携带具有表现为沉默的3bp符合读框的缺失的等位基因和具有1bp不符合读框的缺失的等位基因的嵌合功能性杂合小鼠(对照)；495：携带4bp不符合读框的缺失等位基因和1bp不符合读框的缺失等位基因的小鼠；519：携带29bp不符合读框的缺失等位基因和17bp不符合读框的缺失等位基因的小鼠；555：携带3bp符合读框的缺失等位基因和1bp不符合读框的缺失等位基因且是功能性杂合子的功能性杂合小鼠；FA：荧光血管造影术；IB4：同工凝集素B4；NFL：神经纤维层；IPL：内网层；OPL：外网层。
图3A-B显示从Lrp5外显子2ZFN和供体质粒的共显微注射或共电穿孔获得的条件性敲除等位基因。图3A显示通过合成依赖性链退火进行的双链断裂修复的示意图。箭头代表重组酶识别位点；步骤1中的大箭头代表靶序列；带星号的大箭头代表供体序列；星号代表中性突变；半箭头表示引物位置。图3B显示从幼犬的尾样品(左图)或ES细胞(右图)分离的DNA的聚合酶链反应(PCR)分析的结果。左侧显示用于分析的各引物对(引物位置如图3A中所示)。
图4A-C显示以正确的方向用于质粒且具有掺入片段侧翼序列的供体序列(分别为SEQ ID NOS:30-32，按出现的顺序)。
图5A-B显示从5'loxP至3'loxP位点的三个Lrp5CKO DNA供体(分别为SEQ ID NOS 33-35，按出现的顺序)的序列比对。大写黑体字母表示loxP位点；小写字母表示内含子序列；大写字母表示外显子2(野生型或修饰)序列；虚线框表示ZFN结合位点；实线框表示沉默突变；下划线字母表示ZFN切割野生型外显子2处的序列。
图6A-E显示携带密码子修饰的Lrp5条件性敲除等位基因的小鼠的正常视网膜表型。图6A-D显示用同工凝集素B4染色的视网膜全样载片的共焦投射(比例尺：50μm)。图6E显示用IB4、MECA32和DAPI染色的图6A-D中所示的那些的对侧眼的视网膜横切片。箭头指向所示的实例染色。+/+：野生型对照；KO/KO：Lrp5纯合敲除；KO/+：Lrp5杂合敲除；CKO/KO：Lrp5条件性敲除/Lrp5敲除复合杂合；IB4：同工凝集素B4；NFL：神经纤维层；IPL：内网层；OPL：外网层。
图7A-D显示产生所观察到的供体衍生的Lrp5等位基因中的每一种的可能的机制的图示。显示与所得到的等位基因结合的引物。星号表示中性突变。
图8显示将锌指对(pZFN1+pZFN2)或Cas9(+pRK5-hCas9)与靶向Lrp5外显子2的指导RNA(p_gRNA T2、p_gRNA T5或p_gRNA T7)或对照质粒(PMAXGFP)一起引入NIH/3T3细胞或Hepa1-6细胞后的SURVEYOR测定的结果。
图9A-B显示Hepa1-6鼠肝癌细胞中Lrp5外显子2基因组基因座处的gRNA/Cas9突变率(图9A)和缺失大小(图9B)的总结。细胞接受靶向Lrp5的gRNA连同mRNA(Cas9mRNA+gRNA T2，实心条)或质粒(Cas9质粒+gRNA T2，空心条)，或编码靶向Lrp5的外显子2的锌指对的两种质粒(ZFN质粒，灰色条)。
图10显示使用对CO外显子2序列特异的正向引物和同源臂外侧的反向引物，以鉴定供体外显子在Lrp5基因座中的整合的PCR分析的结果。鼠Hepa1-6细胞接受编码Cas9的质粒(pRK5-hCas9)或mRNA(hCas9mRNA)连同指导RNA单独(p_gRNA T2)、指导RNA和供体质粒(p_gRNAT2+p_供体1)或对照质粒(PMAXGFP)。一些细胞接受供体连同Lrp5锌指对(pZFN1+pZFN2+p_供体1)。
图11显示使用检测Lrp5基因组基因座中的5’(上，引物P9和P10)和3’(下，引物P11和P12)loxP位点整合的引物的PCR分析的结果。处理组如图10中所述。用来自杂合Lrp5条件性敲除(小鼠CKO/wt)的DNA作为阳性对照。
图12显示将Cas9(p_hCas9)与指导RNA和靶向Lrp5(Lrp5外显子2；p_gRNA T7+p_Lrp5_供体1)、Usp10(Usp10外显子3；p_gRNAT1+p_Usp10_供体1)或Notch3(Notch3外显子3；p_gRNA T1+p_Notch3_供体1)的各供体构建体一起引入Hepa1-6细胞后的SURVEYOR测定的结果。
图13显示Cas9/gRNA和供体施用后，使用检测Nnmt外显子2基因组基因座中的5’loxP位点整合(左图，引物P26和P27)或Notch3外显子3基因组基因座中的3’loxP位点整合(右图，引物P25和P28)的引物的PCR分析的结果。
图14A-D显示用于小鼠Lrp5、Usp10、Nnmt和Notch3基因组基因座的Cas9/CRISPR靶向的序列(分别为SEQ ID NOS:36-46，按出现的顺序)。显示指导RNA(gRNA)的序列，对Lrp5、Usp10、Nnmt和Notch3特异的序列，及Usp10、Nnmt和Notch3的供体质粒序列。此外，显示用于哺乳动物表达的Cas9cDNA序列和体外转录(mRNA)。
发明详述
I.定义
为了解释本说明书的目的，以下定义将适用，无论何时适当，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。在下文所示的任意定义与本文引入作为参考的任意文件冲突时，将以下文所示的定义为准。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“供体构建体”指包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区的多核苷酸。供体构建体可以进一步包含附加序列，如支持供体构建体的繁殖或含有该构建体的细胞的选择的序列。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“供体序列”指具有这样的序列的核酸，该序列与靶基因的序列的部分相比包含具有至少一个中性突变的靶序列。因此，供体序列包含这样的核酸，该核酸编码与靶基因的部分编码的多肽在功能上基本相似或不可区分的多肽。因此，供体序列可以在其在靶基因中的位置处取代靶基因的同源(cognate)部分而基本上不改变靶基因编码的蛋白质的功能特性。供体序列可以包含某些非编码序列，如内含子序列或调节序列。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“同源区”指供体构建体中与靶序列的侧翼核酸同源的核酸。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“重组酶识别位点”指供体构建体中具有重组酶识别的序列的核酸。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“重组酶”指这样的酶，该酶识别间插多核苷酸侧翼的特异性多核苷酸序列(重组酶识别位点)，并催化交互链交换，导致间插多核苷酸的倒位或切除。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“靶基因”指编码细胞内的多肽的核酸。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“靶序列”指靶基因的部分，例如靶基因一个或多个外显子序列，内含子序列，或靶基因的调节序列，或靶基因的外显子和内含子序列、内含子和调节序列、外显子和调节序列、或外显子、内含子和调节序列的组合。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“序列特异性内切核酸酶”或“序列特异性核酸酶”指在特异性核苷酸序列处识别和结合多核苷酸(例如靶基因)并催化该多核苷酸中的单链或双链断裂的蛋白质。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“RNA指导的DNA核酸酶”或“RNA指导的DNA核酸酶”或“RNA指导的内切核酸酶”指在特异性核苷酸序列处识别和结合指导RNA和多核苷酸(例如靶基因)并催化该多核苷酸中的单链或双链断裂的蛋白质。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“条件性敲除等位基因”指包含侧翼为重组酶识别位点的多核苷酸序列但产生与同源野生型等位基因所产生的表型不可区分的表型的等位基因。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“中性突变”指供体序列中的突变，其降低供体序列和靶序列之间的总体同源性，但保持供体序列能够编码功能性多肽。中性突变的实例包括沉默突变，即改变核苷酸序列但不改变所编码的多肽序列的突变。中性突变的实例还包括保守突变，如点突变(例如取代)、插入和缺失，即改变核苷酸序列和所编码多肽序列但基本上不改变所产生的多肽的功能的突变。保守取代突变的实例在表8中显示。中性突变还可以包括沉默突变的组合、保守突变的组合或沉默突变和保守突变的组合。
除非明确地另有说明，本文所用的术语“动物”指任意非人动物，包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如非人灵长类，如猴)、兔、鱼、啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)和非脊椎动物(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))。
除非明确地另有说明，“分离的”核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，该核酸分子包含在通常含有该核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
除非明确地另有说明，“分离的编码蛋白质的核酸”指一个或多个编码蛋白质(或其片段)的核酸分子，包括单个载体或分开的载体中的这种(类)核酸分子，及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这种(类)核酸分子。
本文就供体和靶基因多核苷酸序列所用的术语“序列同源性”定义为在比对序列并根据需要引入缺口来达到最大百分比序列同一性之后，供体序列中与靶基因序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。可以以本领域技术之内的多种方式达到以测定百分比核苷酸序列同源性为目的的比对，例如，使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定适当的参数用于比对序列，包括在所比较的序列全长内达到最大比对所需的任意算法。
II.本发明的实施方案
本发明部分涉及与用序列特异性内切核酸酶与侧翼有重组酶识别序列的供体序列的组合产生条件性敲除等位基因相关的技术挑战的识别和解决。此方法依赖于用识别和结合这类序列并在核酸分子中诱导双链断裂的内切核酸酶靶向核酸分子(如染色体)的特异性序列。双链断裂通过易错非同源末端连接或通过同源重组修复。如果反式提供用于同源重组的模板，则双链断裂可以用所提供的模板修复。与基于常规同源重组的基因靶向相比，最初的双链断裂使靶向的频率提高了几个数量级。基本上，此方法可以用来在修复位点处插入任意序列，只要它的侧翼是与双链断裂附近的序列同源的适当区域。但是，在应用于产生条件性敲除等位基因时，此方法与某些挑战相关。条件性敲除等位基因通常包括某些重组酶识别序列，如loxP位点，其位于基因或基因的部分的侧翼，但保持其功能完整，使得条件性敲除等位基因产生基本上类似于未修饰的等位基因的功能性多肽，但可以通过识别该识别序列的重组酶的存在来在某时间或在某些组织内使其无功能。
与上述产生条件性敲除等位基因残基的方法相关的第一挑战在于这样的事实，在序列特异性内切核酸酶催化的双链断裂之后，由于它们就彼此而言的序列同一性，不希望的重组可以发生在供体外显子和染色体(靶)外显子之间，而不是侧翼为重组酶识别序列的供体外侧的同源区。这将产生缺乏一个或两个重组酶识别序列的等位基因。第二挑战在于这样的事实，序列特异性内切核酸酶不仅可以识别和切割靶基因，还可以在供体外显子可以作为修复的模板发挥作用之前识别和切割它。本文所述的方法和组合物提供了这些挑战的解决方案。
A.示例性方法
在本发明的多种方面，提供在包含靶基因的细胞中产生条件性敲除等位基因的方法。该方法包括向具有靶基因的细胞中引入供体构建体和切割该靶基因内的序列但不抑制该供体构建体的功能的序列特异性核酸酶的步骤，从而在该细胞中产生条件性敲除等位基因。下文描述本发明的这些及其他方面。
在本发明的具体方面中，通过向细胞中引入包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区的供体构建体来在包含靶基因的细胞中产生条件性敲除等位基因。该供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列的序列。在某些实施方案中，除该至少一个中性突变外，该供体序列和该靶序列相同。中性突变意指供体序列的核苷酸序列中的任意突变，该突变降低供体序列和靶序列之间的同源性，但保持供体编码完整的功能性多肽的潜能。与野生型序列相比，中性突变减少供体序列和靶序列之间不产生条件性敲除等位基因的不希望的同源重组事件的数目(图7B、C、D)。在一些实施方案中，中性突变还废除了序列特异性核酸酶与供体序列的结合。
中性突变的实例包括沉默突变，即改变核苷酸序列但不改变所编码的多肽序列的突变。中性突变还包括保守突变，即改变核苷酸序列和所编码的多肽序列但基本上不改变所产生的多肽的功能的突变。这是例如用另一具有相似特性(大小、电荷等)的氨基酸取代一个氨基酸时的情况。例如，氨基酸可以按照共有的侧链特性分组：
(1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
保守取代的实例在表8中显示。在某些实施方案中，供体序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50个沉默突变。在某些实施方案中，供体序列和靶序列之间的同源性是99％、98％、95％、90％、85％、80％、78％、75％、70％、65％、60％、55％或50％。在某些实施方案中，供体序列和靶序列之间的同源性小于50％。可以引入任意数目的中性突变，该中性突变减少或抑制供体序列和靶序列之间(图7B-D)而不是同源区和它们在所靶向的分子上的同源序列之间同源重组事件的数目，但保持供体序列编码功能性多肽的能力。在某些实施方案中，供体包含图4A(SEQID NO:30)、图4B(SEQ ID NO:31)或图14C(SEQ ID NOS:44-46)中所示的序列。在某些实施方案中，至少一个中性突变废除序列特异性核酸酶与供体序列的结合。在某些实施方案中，几个中性突变沿供体序列的长度间隔开，以在供体序列中的任意位置处将连续的未修饰碱基对的数目减少至少于20-100碱基对。
由于供体序列内的突变为中性，供体序列编码在功能上与靶序列编码的多肽基本相似或不可区分的多肽。肽或蛋白质的功能性可以通过本领域公知的方法来评估，如功能测定、酶测定和生物化学测定。供体序列可以在其在靶基因内的位置处取代靶序列而基本上不改变靶基因编码的多肽的功能特性。但是，一旦整合在靶基因中，则随后从靶基因去除供体序列可以导致靶基因编码的多肽的功能的改变、减少或丧失。
在供体构建体内，重组酶识别位点处于供体序列的5’和3’侧翼。这些重组酶识别位点是供体构建体内由随后催化重组酶识别位点处的重组的重组酶识别的核酸序列。序列特异性重组为本领域公知，且包括重组酶介导的侧翼为重组酶识别位点的多核苷酸的序列特异性切割和连接。重组酶识别位点的实例包括loxP(locus of X-over P1)位点(Hoess等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:3398-3401(1982))、frt位点(McLeod,M.,Craft,S.&Broach,J.R.,Molecular and Cellular Biology 6,3357–3367(1986))和rox位点(Sauer,B.和McDermott,J.,Nucleic Acids Res 32,6086–6095(2004))。
5’同源区定位在5’重组酶识别位点的5’或“上游”，且与在其核苷酸背景中处于靶序列侧翼的核酸同源。类似地，3’同源区定位在3’重组酶识别位点的3’或“下游”，且与靶序列侧翼的核酸同源。在一个实施方案中，同源区的长度超过30bp，优选几个kb。例如，同源区的长度可以是50bp、100bp、200bp、300bp、500bp、800bp、1kb、1.1kb、1.5kb、2kb和5kb。在某些实施方案中，5’同源区包含1.1kb，3’同源区包含1kb。同源区可以与靶基因的区域同源，以及(或相反)与靶基因上游或下游的区域同源。在一个实施方案中，同源区与紧邻靶序列的染色体区域同源。例如，在5’同源区的情况下，同源区与其最靠近3’的核苷酸紧邻靶序列的第一(最靠近5’)核苷酸的序列同源。在一个实施方案中，同源区与染色体上并非紧邻靶序列的染色体区域同源。在一些实施方案中，5’和3’同源区各与靶序列侧翼的同源核酸序列95-100％同源。
总结上述成分排列，供体构建体按从5’至3’的顺序包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区。供体构建体可以进一步包含某些提供结构或功能支持的序列，如质粒或其他支持供体构建体的繁殖的载体(例如pUC19载体)的序列。供体构建体还可以可选地包含某些选择标记或报道基因，其中一些可以由重组酶识别位点位于侧翼，用于随后的激活、失活或删除。位于可选的标记或报道基因侧翼的重组酶识别位点可以与位于供体序列侧翼的重组酶识别位点相同或不同。在某些实施方案中，用单类供体构建体来产生条件性敲除等位基因。
与引入供体构建体同时或在引入供体构建体之后，向细胞中引入序列特异性核酸酶。序列特异性核酸酶识别和结合靶序列内的特异性序列，并在靶基因中引入双链断裂。如上文所述，通过至少一个中性突变来修饰供体序列，以减少不产生条件性敲除等位基因的同源重组事件。在某些实施方案中，序列特异性核酸酶仅切割靶基因一次，即在本文所述方法过程中在靶基因中引入单个双链断裂。
序列特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)。ZFN是由DNA结合锌指蛋白结构域和效应核酸酶结构域组成的重组蛋白质。锌指蛋白结构域是例如与识别和结合特异性DNA序列的转录因子相关遍在蛋白质结构域。“指”结构域之一可以由包括与锌复合的不变的组氨酸残基的约三十个氨基酸组成。虽然迄今已鉴定出超过10,000个锌指序列，但已通过锌指结构域中的靶向氨基酸取代产生设计用于识别目的特异性核苷酸序列的新锌指蛋白质来进一步扩展了锌指蛋白质的库。例如，已用噬菌体展示文库来针对希望的序列特异性筛选锌指组合文库(Rebar等,Science 263:671-673(1994)；Jameson等,Biochemistry 33:5689-5695(1994)；Choo等,PNAS91:11163-11167(1994),每篇文献在此以其整体引入)。然后可以将具有希望的序列特异性的锌指蛋白质连接至例如6,824,978中所述的效应核酸酶结构域，如PCT申请公开号WO1995/09233和WO1994018313中所述的FokI，每篇文献在此完整引入作为参考。
序列特异性核酸酶的另一实例包括转录激活剂样效应内切核酸酶(TALEN)，其包含与特异性核苷酸序列结合的TAL效应结构域和催化靶位点处的双链断裂的内切核酸酶结构域。PCT专利申请公开号WO2011072246描述了TALEN的实例及制备和使用的方法，该专利申请在此完整引入作为参考。
可以用于本文所述的方法和组合物的序列特异性核酸酶系统的另一实例包括Cas9/CRISPR系统(Wiedenheft,B.等Nature 482,331–338(2012)；Jinek,M.等Science 337,816–821(2012)；Mali,P.等Science 339,823–826(2013)；Cong,L.等Science 339,819–823(2013))。Cas9/CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统利用RNA指导的DNA结合和靶序列的序列特异性切割。指导RNA(gRNA)包含20个与基因组PAM(原间隔区邻近基序)位点(NNG)上游的的靶基因组DNA序列互补的核苷酸和恒定的RNA支架区。Cas(CRISPR相关)9蛋白质结合gRNA，靶向该gRNA结合的DNA，并在PAM位点上游确定的位置中引入双链断裂。Cas9包含与HNH和RuvC内切核酸酶同源的两个独立的核酸酶结构域，可以通过突变两个结构域中的任一个来将Cas9蛋白质转化为引入单链断裂的切口酶(Cong,L.等Science 339,819-823(2013))。尤其考虑的是，本发明的方法和组合物可以用于Cas9的单链或双链诱导形式，以及其他RNA指导的DNA核酸酶，如其他细菌Cas9样系统。在一些实施方案中，用于本文所述方法的指导RNA按出现的顺序分别是SEQ ID NOS:36-42的那些。本文所述方法和组合物的序列特异性核酸酶可以是改造的、嵌合的，或分离自生物。
序列特异性核酸酶可以以蛋白质的形式或以编码序列特异性核酸酶的核酸(如mRNA或cDNA)的形式引入序列特异性核酸酶。核酸可以例如通过电穿孔、脂质载体、病毒运载体、显微注射和生物射弹作为更大的构建体(如质粒或病毒载体)的部分递送或直接递送。类似地，供体构建体可以通过任意适合用于将核酸引入细胞的方法递送。
不受限于任意具体机制或理论，序列特异性核酸酶在靶序列中引入双链断裂(例如ZFN诱导的DSB；图3A，步骤1)后，链切除产生3’单链染色体末端(图3A，步骤2)。为了起始修复，单链染色体末端通过链侵入退火至存在于供体构建体上的同源区内的互补碱基对(图3A，步骤3)。然后用供体序列作为模板，通过DNA聚合酶介导的链延长来延长3’单链末端。链延长后，延长的链退火至最初的双链断裂的另一侧的单链染色体末端，并通过用延长的链作为模板的DNA合成和连接来完成修复。产生的双链DNA包含侧翼为重组酶识别位点的供体序列(图3A，步骤4)。
双链断裂修复的此合成依赖性链退火模型与这样的观察一致，与内源序列具有很小的同源性或无同源性的外来DNA的非常大的序列(如报道基因)可以精确地插入双链断裂的点。因此，侧翼为重组酶识别位点的供体序列可以通过切除游离染色体末端暴露靶序列周围与供体构建体上的同源区基本同源的区域而整合在双链断裂处(图3A)。同源区可以具有适合用于供体构建体中的取代且在介导上文所述的链退火中有效的任意长度，例如10-5000bp、100-1000bp、500-600bp或537bp的组合长度。因此，这些步骤在靶基因的位点处产生条件性敲除等位基因，即产生与由同源靶基因等位基因产生的表型基本相似或不可区分的表型的包含侧翼为重组酶识别位点的供体序列的等位基因。如果由熟练的技术人员进行的标准检查不能检测到靶基因的潜在等位基因的性质，则两种表型基本相似或不可区分。在一些实施方案中，本文所述的方法产生携带杂合条件性敲除等位基因或纯合条件性敲除等位基因，即条件性敲除等位基因取代了并非全部或全部内源等位基因。
靶基因可以是通过供体构建体靶向来产生该基因的条件性敲除形式的细胞的遗传物质内的任意编码蛋白质(或其片段)的核酸分子。例如，靶基因可以是定位在真核细胞的染色体上的编码未知功能的蛋白质或涉及细胞过程的蛋白质的基因。这类基因可以由一系列外显子和内含子组成。靶序列可以包括靶基因的外显子、内含子(包括人工内含子)或调节序列，或其多种组合。靶序列可以包括整个靶基因。
细胞可以是任意真核细胞，例如动物的分离的细胞，如全能、多能或成体干细胞、合子、或体细胞。在某些实施方案中，用于本文所述方法的细胞是非人动物，如饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如非人灵长类，如猴)、兔、鱼、啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)、两翼昆虫和蠕虫的细胞。在某些实施方案中，用于该方法的细胞是人细胞。本文所述的方法和组合物可以用来靶向任意基因组基因座。本文描述了靶向不同基因座的几个具体实例。在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物可以用来靶向细胞内的一个以上基因组基因座，即用于多重基因靶向。
在本发明的另一具体方面，用本文所述的方法产生条件性敲除动物。为了产生条件性敲除动物，向细胞(如合子或多能干细胞，如胚胎干细胞或诱导型多能干细胞、或成体干细胞)中引入供体构建体和序列特异性核酸酶，以在该细胞中产生至少一个条件性敲除等位基因。用于筛选希望的基因型的方法为本领域公知，且包括例如本文在具体实施例中所述的PCR分析。然后将该细胞引入雌性载体动物，以从该细胞产生例如美国专利号7,13,608中所公开的条件性敲除动物，该专利在此完整引入作为参考。在某些实施方案中，将该细胞扩大至两细胞阶段，引入胚泡，或以其他方式培养或与其他细胞结合，然后引入载体动物。在某些实施方案中，产生的条件性敲除动物在其种系中携带条件性敲除等位基因，使得该条件性敲除等位基因可以传递至以后的世代。
在本发明的另一具体方面，本文所述的方法和组合物可以用来产生敲除等位基因。此方法包括，一旦作为条件性敲除等位基因掺入基因组，即切除、反转或以其他方式抑制侧翼为重组酶识别位点的供体序列的正常表达。通过将特异性识别重组酶识别位点的重组酶引入细胞来将条件性敲除等位基因转化为敲除等位基因。例如，Araki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:160-164(1995)。重组酶是这样的酶，该酶识别间插多核苷酸侧翼的特异性多核苷酸序列(重组酶识别位点)，并催化交互链交换，导致间插多核苷酸的倒位或缺失。本领域技术人员认可选择特异性识别供体构建体内的重组酶识别位点的重组酶用于本文所述的方法的有利效率。
重组酶可以通过任意方法以蛋白质或编码重组酶蛋白质的核苷酸序列的形式引入包含供体构建体的细胞。为了产生敲除动物，使按照上文所述产生的条件性敲除动物与转基因动物杂交，该转基因动物具有编码催化5’和3’重组酶识别位点处的重组的重组酶蛋白质的转基因。携带重组酶转基因的动物的实例为本领域已知，并例如由美国专利号7,135,608公开，该专利在此完整引入作为参考。在一些实施方案中，编码重组酶的转基因处于组织特异性启动子的控制下，使得重组酶仅在这种组织中表达，因此仅在这种组织中产生敲除等位基因。在一些实施方案中，编码重组酶的转基因处于诱导型启动子的控制下，使得可以在特定时间诱导重组酶表达。例如，可以通过四环素或其衍生物之一来控制Tet-On或Tet-Off启动子的活化作用。在一些实施方案中，编码重组酶的转基因仅在发育的某阶段或响应对该动物施用的化合物而表达。适合用于本文公开的方法的重组酶的实例包括任意形式的P1 Cre重组酶、任意形式的FLP重组酶(flippase)和任意形式的Dre重组酶，包括这些重组酶的任意可诱导形式(例如，与激素应答性结构域的融合，如CreERT2和Cre-PR，或四环素调节的重组酶)。
B.示例性组合物
在本发明的另一具体方面，提供用于产生靶基因的条件性敲除等位基因的组合物。这种组合物包括本文所述的含有5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区的供体构建体。该供体序列包含本文所述的具有至少一个中性突变的靶序列。该组合物进一步包含识别靶基因的序列特异性核酸酶。
在某些实施方案中，该序列特异性核酸酶是锌指核酸酶或转录激活剂样效应核酸酶。在某些实施方案中，该重组酶识别位点是loxP位点或frt位点。可选地，该组合物还可以包括本文所述的重组酶。
在本发明的另一方面，包含图4A(SEQ ID NO:30)、图4B(SEQ ID NO:31)或图14C(SEQ ID NOS:44-46)中所示的序列的供体构建体。
在本发明的另一方面，提供包含图14A(SEQ ID NOS:36-42)中所示的序列的指导RNA。
在本发明的另一方面，提供包含含有图4A(SEQ ID NO:30)、图4B(SEQ ID NO:31)或图14C(SEQ ID NOS:44-46)中所示的序列的供体构建体的细胞。此细胞可以分离自通过本文所述的方法产生的动物。
可以通过参考本发明的某些实施方案的以下非限制性实例来进一步理解本发明。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1：Lrp5 ZFN mRNA前核显微注射入C57BL/6N受精卵
靶向小鼠低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)的外显子2的定制eHi-FiZFN对获自Sigma-Aldrich。ZFN包含显著提高其在5'-gacttccagttctccaagggtgctgtgtactggacagat-3'(SEQ ID NO:29)(ZFN切割位点下划线)处引入双链断裂的效率(Doyon,Y.等Nat Meth 8,74–79(2011))的优化的(eHi-Fi)FokI内切核酸酶界面。未观察到显著的潜在脱靶(off-site target)活性。编码ZFN对的信使RNA(mRNA)在使用前保存在-80℃。用mRNA(Sigma-Aldrich)进行前核显微注射，用编码ZFN对的两个质粒进行ES细胞电穿孔。
为了测定内切核酸酶活性，将多种浓度的编码Lrp5 ZFN的mRNA显微注射入C57BL/6N合子的前核(表1)。融化Lrp5 ZFN mRNA(2μg的每种ZFN于5μl中)，并在无RNA酶和DNA酶的显微注射缓冲液(10mMTris和1mM EDTA，PH 8.0)中稀释至50ng/μl。对于ZFN显微注射，将Lrp5 ZFN mRNA稀释至2、3、4或5ng/μl的工作浓度。从在显微注射前一天与C57BL/6N雄性(Charles River)交配的超排卵C57BL/6N雌性获得小鼠合子。用M2培养基收集合子，按标准方法在M2中显微注射(Nagy,A.等,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Third Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA,(2002))，并转入E0.5假孕ICR雌性(Taconic)的输卵管，每只假孕雌性30个胚胎。ICR雌性在胚胎转移手术后饲喂9％高脂肪饮食(Harlan,目录号2019)，直至幼崽断奶。
表1.Lrp5 ZFN mRNA前核显微注射入C57BL/6N受精卵。KO突变体包括具有一个或多个突变体等位基因的小鼠。KO＝敲除。
从尾组织分离来自所得到的幼崽的DNA，并通过PCR扩增和随后的测序来分析，以鉴定大突变和小突变。用Extract-N-Amp组织PCR试剂盒(Sigma,Cat#XNAT2)或用Qiagen DNeasy 96血液和组织试剂盒(QiagenCat#69582)纯化基因座尾DNA。为了测定ZFN介导的突变效率和表征由NHEJ修复引起的突变的类型，进行了3步PCR法。在第一步中，进行使用引物P1和P2的外侧PCR来检测大的缺失或插入。在第二步中，进行使用引物P3和P4的内侧PCR来检测小至中等大小的缺失或插入。在第三步中，进行使用引物P3和P4的内侧PCR反应产物的直接测序来鉴定1至20个碱基对改变。用Sequencher 4.10.1(Gene Codes Corp.)分析单个层析图。如果检测到两条不同径迹，则手动测定各单个等位基因的碱基对要求。通过PCR TOPO亚克隆(Invitrogen,Cat#K4575-J10)进一步分析了来自突变体亚组的等位基因。用M13F和M13R引物测序了每只小鼠的20至24个TOPO克隆。
观察到了活产幼崽的至多63％的突变率(5ng/μl ZFN mRNA)。突变从1至3bp的插入和从单个bp至～100bp的缺失以及一个大的～800bp缺失广泛变化(总结在图1中)。鉴定出携带超过两个等位基因的多重嵌合动物，其可能源自首次细胞分裂后持续的ZFN活性。此外，五只动物为复合突变体，即这些动物携带同一基因的两个独立的突变体等位基因，且检测不到该基因的野生型等位基因，表明单细胞阶段对两条染色体的ZFN活性。
实施例2：通过显微注射序列特异性内切核酸酶直接产生功能性纯合突变体等位基因
LRP5通过作为NORRIN的共同受体而在视网膜血管发育中发挥重要作用。受破坏的NORRIN信号发放导致血管缺陷，其表征为未能在更深层的视网膜中形成毛细血管床，以及血管渗漏(Xia,C.-H.等,HumanMolecular Genetics 17,1605–1612(2008)；Xia,C.-H.,PLoS ONE 5,e11676(2010)；Junge,H.J.等,Cell 139,299–311(2009))。因此，按实施例1中所述产生在Lrp5中具有复合的符合读框和不符合读框的缺失的2月龄小鼠，并检查视网膜血管发育。动物#542是作为对照的嵌合功能性杂合。此动物携带一个野生型等位基因(表现为沉默的小的3bp符合读框的缺失)和具有1bp不符合读框的缺失的等位基因。动物#495包含4bp不符合读框的缺失等位基因和1bp不符合读框的缺失等位基因。动物#519包含29bp不符合读框的缺失等位基因和17bp不符合读框的缺失等位基因。动物#555具有3bp符合读框的缺失等位基因和1bp不符合读框的缺失等位基因且是功能性杂合子。
对于表型分析，通过荧光血管造影术分析了携带Lrp5突变的动物。用氯胺酮/甲苯噻嗪(80mg/kg；7.5mg/kg)的混合物麻醉小鼠，并用1％托品酰胺(Akorn,Inc.)扩张眼。腹膜内注射无菌10％荧光素溶液(100μl,AK-Fluor；Akorn,Inc.)后进行荧光血管造影术。荧光素注射1分钟后用0聚焦和50敏感性的成像设置捕获图像。
对于组织学分析，血管造影后两天处死小鼠，并处理用于组织学。在4％多聚甲醛(PFA)中固定眼，然后解剖视网膜用于全样载片组织学，或在30％蔗糖中冷冻保护过夜，并包埋在OCT Compound(Sakura)中进行冷冻切片。按之前所述(Gerhardt,H.等,J.Cell.Biol.161,1163–1177(2003))进行全样载片和切片的同工凝集素B4染色。对于冷冻切片，去除角膜和晶状体，并在PBS中充分洗涤眼来去除残留的PFA。制备冷冻的12μm切片，基本上按Junge等,Cell 139,299–311(2009)所述染色MECA32(有孔内皮细胞标记PLVAP的抗原)。
三只复合突变体小鼠(495、519和555)和携带一个野生型等位基因的对照杂合突变体小鼠(542)的视网膜表型显示在图2中。携带复合突变的小鼠显示Lrp5无效表型。荧光血管造影术揭示，小鼠542和555未显示明显的新血管缺陷或血管渗漏(图2A)。相反，在Lrp5的两个等位基因中都包含复合的不符合读框的缺失的小鼠495和519显示许多前毛细血管小动脉阻塞(图2A，箭头指向前毛细血管小动脉阻塞的实例)及由整个视网膜内弥散的荧光素信号显示的明显的血管渗漏。对于图2A中的所有图，图2的右下图中的比例尺代表200μm。
同工凝集素染色的全样载片视网膜的共焦投射确认了复合突变体小鼠495和519的Lrp5无效表型。对于每只小鼠，分析了包含全部三个血管层的视网膜的最大深度的投射(图2B)，及源自处于神经纤维层(NFL，图2C)、内网层(IPL，图2D)和外网层(OPL，图2E)中的单个血管层的投射。虽然功能性杂合视网膜(542和555)包含致密、组织良好的三层血管网络，但复合敲除视网膜(495和519)具有密度降低的无规则脉管系统(图2B、C)。此外，542和555在IPL(图2D)和OPL(图2E)中包含正常的毛细血管网络，而复合KO小鼠(495和555)具有IPL中的异常新血管簇(图2D)和OPL中的少数内皮细胞簇(图2E)。对于图2B-E中的所有图，图2的右下图中的比例尺代表100μm。
总的来说，携带具有1bp缺失的功能丧失等位基因和具有3bp符合读框的缺失的功能性等位基因的突变体555显示正常的视网膜表型，而携带4bp和1bp缺失的突变体495及携带两个更大的缺失(17和29bp)的突变体519在表型上纯合无效，具有总结之前已报道的表型(Xia,C.-H.等,Human Molecular Genetics 17,1605–1612(2008))的表型。这些结果证明，序列特异性内切核酸酶的显微注射可以直接产生功能性纯合子(复合突变体)，但不知道这些动物是否在所有细胞中都是复合突变体。
实施例3：通过共显微注射Lrp5外显子2ZFN mRNA和供体构建体来产生条件性敲除等位基因
图3A显示靶向外显子2的用来产生Lrp5的条件性敲除等位基因(Gu,H.,Science 265,103–106(1994))的策略的示意图。ZFN对在Lrp5外显子2中产生双链断裂(中断块箭头所示)。通过供体质粒经链侵入的侵入及供体质粒的5’和3’Lrp5同源区与外显子2的各同源序列5’和3’之间的同源重组来修复断裂。产生的基因座包含侧翼为两个loxP位点的密码子优化的Lrp5外显子2(图1A，底部)。
供体质粒中的5’和3’Lrp5同源区的长度分别为1.1和1kb。密码子修饰(供体1，图4A)和野生型(供体3，图4C)的供体序列由BlueHeron/Origene(Bothell,WA)合成入修饰的pUC19载体中。通过用包含七个沉默突变来废除ZFN识别的合成片段取代300bp MscI-BamHI片段来从供体3产生供体2(图4B)。与供体2和3中的掺入片段相比，供体1中的插入片段方向相反。因此，用相反方向的引物组合进行使用与Lrp5基因座特异性引物组合的结合质粒主链的引物的PCR扩增。除loxP位点外，供体序列对应于小鼠基因组装配NCBI37/mm9 chr.19:3658179-3660815。将环状供体质粒用于所有实验。
向野生型Lrp5外显子2序列中引入沉默突变来产生保持外显子的蛋白质编码潜能但使野生型C57BL/6和供体Lrp5外显子2之间的总体同源性降低至仅78％的密码子优化形式(供体1，图4A；图5)。为了保留正常的RNA剪接，从修饰排除外显子2的前13bp或最后11bp。图5显示三个Lrp5条件性敲除DNA供体的序列比对，排除1.1kb 5’同源区和1kb 3’同源区。用可在http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/获得的比对程序ClustalW2进行比对。供体1(密码子修饰)和供体3(野生型)外显子2之间的总体同源性为311/397＝78％。供体2(仅修饰ZFN结合位点)和供体3外显子2之间的总体同源性为390/397＝98％。LoxP位点表示为大写黑体字母，内含子序列表示为小写字母，外显子2(野生型或修饰)序列表示为大写字母。ZFN结合位点在虚线框内，切割野生型外显子2处的序列下划线。沉默突变在实线框内。
除将ZFN mRNA和供体构建体一起稀释至工作浓度(ZFN mRNA为2.5-5ng/μl，供体构建体为2.5或3ng/μl)外，基本上按实施例1中所述将ZFN mRNA和供体构建体的不同组合共显微注射入C57BL/6N前核(表2)。
表2.Lrp5 ZFN mRNA(mRNA)和CKO供体1质粒的共显微注射。KO突变体包括具有一个或多个突变体等位基因的小鼠。KO＝敲除；CKO＝条件性敲除。a一只小鼠(#95)为假阳性(供体1质粒整合入Lrp5基因座)。b小鼠#140和#155。
分析了从来自所得到的168只幼崽的尾样品分离的DNA来鉴定携带条件性敲除等位基因的小鼠(图3B)。用于分析缺乏(P1-P4)或存在(P5-P12)供体质粒的情况下的突变体的各引物对在图3B中显示。首先，按实验1和2中所述测定了总体ZFN突变频率。通过用5’核酸酶测定(Livak,K.J.,Genet.Anal.14,143–149(1999))测定5’LoxP位点的存在来进行鉴定携带潜在的条件性敲除等位基因的小鼠的初始筛查。简言之，用2XQiagen Type-it Fast SNP Probe PCR主混合物、50-120ng模板DNA、400nM引物和200nM对LoxP位点识别特异的基于荧光锁核酸(LNA)的探针构建20μl反应(Weis,B.,BMC Biotechnol 10,75(2010))。使反应在AppliedBiosystems 7900HT(Life Technologies)中热循环。通过用AppliedBiosystems序列检测软件2.3版(Life Technologies)分析，通过显示多成分和扩增曲线中的荧光演变来确定5'LoxP的存在。然后进行使用引物P5/P6的Lrp5基因座特异性PCR分析来检测对存在于供体1和2二者(而不是用于实施例4的ES细胞实验的供体3)上的密码子修饰的Lrp5外显子2序列特异的5’产物。类似地，进行使用引物P7/P8的PCR来分析3’端。为了验证5’和3’loxP二者的存在，进行了分别使用引物P9/P10和P11/P12的PCR分析，其将仅在Lrp5基因座中存在适当的LoxP序列时产生产物。由于DNA分离自嵌合亚克隆的混合物，观察到了假阳性结果，即甚至在缺乏这类真正的条件性敲除等位基因的情况下，PCR产物也表现为5’-3’侧翼为LoxP位点的Lrp5等位基因阳性。例如，在一个等位基因仅携带5'loxP位点而另一个等位基因仅携带3'loxP位点时，可以产生假阳性结果。为了确认条件性敲除等位基因的存在，与假阳性相反，用引物P5/P8(两条引物都在供体同源臂外侧退火)扩增～2.8kb的Lrp5外显子2PCR产物，用TOPO cloning(Life Technologies)克隆，并充分测序。此分析鉴定出条件性敲除等位基因、仅具有单个loxP位点的等位基因和仅具有供体衍生的外显子2序列(即无loxP位点)的等位基因。通过使用与供体质粒主链特异性引物组合的侧翼引物P5和P8的附加PCR来针对整合的整个供体载体在Lrp5等位基因中的存在分析了通过测序分析鉴定为假阳性的等位基因。用引物P6和P7(供体1和供体2)与供体质粒主链特异性引物(P13-P14)组合测定了随机基因组插入的存在。对于供体3的随机插入，将供体质粒主链特异性引物(P13-P14)与结合供体3的野生型Lrp5序列的引物P15和P16组合使用。所有引物序列和反应条件在表3中显示。所有PCR研究的条件在表7中显示。
通过用定位在同源区外侧的引物获得的克隆PCR产物的完全测序将两只小鼠(#140和#155)确认为携带条件性敲除等位基因。对于两只小鼠，条件性敲除等位基因传递至其后代。除条件性敲除等位基因外，动物#155还具有一个仅具有5'loxP位点的低频率等位基因(不传递至后代)。动物#95为假阳性，因为最初的PCR分析提示条件性敲除等位基因，但详细的分析揭示全长供体质粒整合入Lrp5外显子2。ZFN mRNA和供体DNA的各组合的敲除突变率在从28％至67％的范围内(表2)。
表3.引物核苷酸序列。引物P19：F＝荧光团(荧光素)；Q＝猝灭剂(IowaBlack FQ,Integrated DNA Technologies)；IQ＝内部猝灭剂(ZEN,IntegratedDNA Technologies)。LNA bp下划线。
通过共注射Lrp5 ZFN mRNA和供体1或就野生型序列而言携带七个沉默突变(其废除了ZFN结合和供体的切割)的侧翼为LoxP的密码子优化外显子2供体(供体2，图4B；图5)来重复了小鼠合子中的共注射实验(4.5ng/μl ZFN mRNA和3ng/μl供体DNA)。这些实验的结果总结在表4中。供体1与Lrp5 ZFN mRNA的共注射产生1/12携带条件性敲除等位基因的幼崽(#248，8.3％条件性敲除率)。供体2与Lrp5 ZFN mRNA的共注射产生3/35在Lrp5基因座中携带供体2外显子序列的幼崽(8.6％)。但是，这些幼崽中只有一只随后确认为携带低频率条件性敲除等位基因(#250)。三只动物中的第二只携带仅具有3'loxP位点的等位基因(#274)；最后一只动物(#280)包含一个仅具有供体2外显子序列(无loxP位点)的等位基因和另一个具有完全整合的供体2质粒的等位基因(假阳性)。这些结果表明，与内源Lrp5外显子2序列具有最低序列同源性的供体质粒(供体1，图4A)在产生条件性敲除等位基因上更有效。
表4.Lrp5 ZFN mRNA和CKO供体1或供体2的共显微注射。所有实验都用4.5ng/μl ZFN mRNA和3ng/μl供体质粒DNA进行。总体CKO率对供体1为1/12(8.3％)，对供体2为1/35(2.9％)。a小鼠#243；b小鼠#250；c一只小鼠(#274)携带仅有3'loxP位点的等位基因；d一只小鼠(#280)携带一个仅具有供体2外显子(无loxP位点)的等位基因和一个假阳性等位基因(供体2质粒整合入Lrp5基因座)。
实施例4：通过共电穿孔Lrp5外显子2ZFN和供体质粒来产生条件性敲除等位基因
通过用编码两个Lrp5 ZFN对成分的质粒单独或连同用于显微注射实验的供体质粒、或用未修饰的侧翼为loxP的野生型Lrp5外显子2质粒(供体3)电穿孔来共转染C57BL/6N ES细胞。用已建立的方法(Nagy,A.,Gertsenstein,M.,Vintersten,K.和Behringer,R.Manipulating the MouseEmbryo:A Laboratory Manual,第3版800(Cold Spring HarborLaboratory Press:2002))培养、扩大和电穿孔C2ES细胞(Gertsenstein,M.等,PLoS ONE 5,e11260(2010))。简言之，用含或不含15μg供体质粒的15μg各ZFN质粒电穿孔15x106个细胞。将电穿孔的细胞回收在培养基中，并将系列稀释液接种在10cm平板上的饲养层上。培养细胞7-8天，然后挑取来自每个实验的144个克隆(1.596孔板)，并放入具有饲养细胞的96孔板中进行扩大。接种两天后，将细胞1:2分入新的具有饲养细胞的96孔板中。然后将一个平板保存在-80℃，将另一个平板分入新的仅具有1％明胶而无饲养细胞的96孔板中，用于DNA分析。除过夜裂解ES细胞外，按实施例1中所述分离DNA，基本按Ramírez-Solis,R.等,Anal Biochem201,331–335(1992)所述沉淀DNA，洗涤，并重悬在TE缓冲液中。
表5.编码Lrp5 ZFN对的质粒单独或与CKO供体1、2或3组合电穿孔入C57BL/6N ES细胞。所有实验都用15μg供体DNA和/或15μg各ZFN1和ZFN2进行。a供体1ES克隆#C8；b一个供体2克隆(F5)携带仅具有5'loxP的等位基因和仅具有供体2外显子的等位基因(无loxP位点)，克隆H10携带仅具有3'loxP的等位基因；c两个供体3克隆(E3和E4)携带仅具有5'loxP的等位基因。克隆E3还携带假阳性等位基因(供体3质粒整合)。克隆E4还携带真正的CKO次要等位基因(所测序的240个TOPO克隆中一个为阳性)。ND：未考察；NA：不适用。
DNA分析的结果显示在图3B右侧，结果总结在表5中。用电穿孔在ES细胞中观察到的敲除等位基因的总体频率低于经前核注射在体内获得的频率。来自ES细胞电穿孔实验的遗传改变模式类似于显微注射后观察到的模式。供体1与Lrp5 ZFN质粒的共电穿孔产生所分析的144个克隆中的一个条件性敲除克隆(克隆C8)。供体2与Lrp5 ZFN质粒的共电穿孔产生所分析的144个克隆中携带源自供体的等位基因的两个ES细胞克隆。这些克隆中的一个(H10)仅携带3'loxP位点等位基因；另一个(F5)携带一个仅具有供体2序列的等位基因(无loxP位点)和一个仅具有5'loxP位点的等位基因。供体3(野生型)与Lrp5 ZFN mRNA的共电穿孔产生两个靶向的ES细胞克隆(E3和E4)。二者都包含一个仅具有5'loxP位点的等位基因。此外，E3携带另一源自供体3质粒的整合的等位基因(假阳性)。有趣地，克隆E4还具有非常罕见的两个loxP位点都为阳性的亚克隆(条件性敲除等位基因)，其可能源自之前靶向的等位基因随后的再靶向。这些结果确认，使用与内源外显子具有低同源性的供体在产生条件性敲除等位基因上最有效。表6提供来自显微注射和ES细胞实验的数据的总体摘要。
表6.源自CKO供体质粒的Lrp5等位基因的概览。
实施例5：条件性敲除等位基因的正常基因功能
为了确定获自供体1的条件性敲除等位基因中的沉默突变(图4A；图5)是否影响Lrp5基因的正常功能，使携带一个敲除等位基因(#140)和一个条件性敲除等位基因(#155)的小鼠与用实施例3的ZFN对产生的Lrp5敲除纯合小鼠杂交。年龄匹配的出生后第16天(P16)的对照小鼠(图6A，+/+)源自Lrp5杂合杂交。用于实验的其他小鼠源自Lrp5 KO/KO雌性和Lrp5CKO/+雄性之间的杂交。Lrp5 KO/KO雌性(图6B)是KO/+(图6C，P16)和CKO/KO(图6D，P16)的成体母亲。图6A-D显示用同工凝集素B4(IB4)染色的视网膜全样载片的代表性共焦投射(比例尺：50μm)。对于图6A-D中所示的每个投射，左图显示最大XY投射，右图显示Z投射，Z投射显示神经纤维层(NFL)、内膜层(IPL)和外膜层(OPL)(图6D的右下图上的标记)中的脉管系统。Lrp5无效动物显示XY投射中降低的血管复杂性和深血管层的缺乏(图6B)。在无效背景上携带条件性敲除等位基因的小鼠显示正常的血管表型(图6D)，表明条件性敲除等位基因有功能。图6E显示用IB4、MECA32和DAPI染色的图6A-D中所示的眼的对侧眼的视网膜横切片。纯合敲除小鼠异位表达有孔内皮细胞标记MECA32，而CKO/KO、KO/+和+/+小鼠为MECA32阴性。
总的来说，纯合敲除动物显示上文所述的视网膜表型(图6)，而携带一个敲除等位基因和一个条件性敲除等位基因的小鼠的视网膜表型与野生型小鼠或具有一个敲除等位基因和一个野生性等位基因的小鼠的视网膜表型不可区分(图6)，表明条件性敲除等位基因是功能性等位基因。这些结果一起证明，侧翼为重组酶识别位点的具有中性突变的供体序列可以与序列特异性核酸酶一起用来在体外和体内产生全功能条件性敲除等位基因。
图7显示产生在这些研究中观察到的Lrp5等位基因的可能机制。多个沉默突变(图7A，星号)降低了Lrp5基因组序列和供体1之间的总体同源性。切除染色体末端后，loxP位点外侧100％同源性的大区域中发生链侵入，产生具有两个loxP位点的条件性敲除等位基因。由于loxP位点之间的区域中的同源性有限，loxP位点内侧的交换事件罕见。供体2包含loxP位点之间的100％同源性的较大区域，允许在loxP位点内侧发生链侵入，产生仅具有3'loxP(图7B)、仅具有5'loxP位点(图7C)或无loxP位点(图7D)的等位基因。引物组合P9+P10和P11+P12都产生图7A的事件的PCR产物。引物对P9+P10的使用产生图7C中所示的事件而不是图7B或D中所示的事件的产物。类似地，引物对P11+P12产生图7B中所示的事件而不是图7C或D中所示的事件的产物。引物组合P5+P6和P7+P8产生与loxP状态无关的PCR产物。
表7.用于上述实施例中的PCR反应的条件。
表8.保守取代。
实施例6：使用不同指导RNA的Cas9/CRISPR介导的Lrp5外显子2的诱变
为了确认其他序列特异性内切核酸酶可以用于本文所述的方法和组合物，用Cas9/CRISPR系统产生了Lrp5的修饰等位基因。将Hepa1-6鼠肝癌细胞培养在补充了10％FBS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI中。胰蛋白酶消化和沉淀后，按照厂家的说明用AMAXA Nucleofector Kit V以AMAXA Nucleofector程序T-028(Lonza)用2μg包含hCas9编码cDNA的每种质粒或15μg编码Cas9的mRNA(图14，SEQ ID NO:43)电穿孔106个细胞，并接种入6孔板。通过GFP表达(PMAXGFP)评估核转染(Nucleofection)效率达80-95％。核转染后24小时更换新鲜培养基，核转染后72小时用DNeasy Blood and Tissue kit(Qiagen)收集纯化的基因组DNA。按照厂家的流程(包括polyA加尾反应)用MMESSAGE MMachineT7 Ultra试剂盒(Life Technologies)体外转录HCas9 mRNA。用RNA的标准酚:氯仿提取和沉淀来纯化和浓缩mRNA。
产生了靶向小鼠Lrp5外显子2的三个独特的指导RNA(gRNA)(图14A；Lrp5 gRNA T2、Lrp5gRNA T5和Lrp5gRNA T7；SEQ ID NOS:36-38)。
用编码锌指对的DNA(pZFN1+pZFN2)或用Cas9(+pRK5-hCas9)与靶向Lrp5外显子2的指导RNA(p_gRNA T2、p_gRNA T5或p_gRNA T7)或对照质粒(PMAXGFP)一起共转染NIH/3T3细胞或Hepa1-6细胞。gRNAT7序列与右侧ZFN蛋白结合位点序列的3’端重叠。
为了检测共转染后Lrp5基因座中的突变、指示Cas9介导的切割和修复，基本按照厂家的说明进行了SURVEYOR测定(Transgenomic)。在此测定中，杂交PCR产物。在突变的情况下，杂交复合物包含SURVEYOR核酸酶切割的错配。在此实例中，使用以下参数和LA Taq(Takara)：95℃3分钟；95℃45秒、57℃45秒、70℃2分30秒的35个循环；然后72℃7分钟，用引物P9和P12(SEQ ID NOS:9和12)扩增Lrp5外显子2基因座基因座特异的～2.7kb PCR产物。将三分之一的PCR产物用于SURVEYOR测定。通过1.5％琼脂糖凝胶上的电泳分离所得到的消化产物。通过更短的片段的存在来鉴定核酸酶切割，其指示与野生型退火的突变体等位基因的存在。
靶向小鼠Lrp5外显子2的全部三个指导RNA(gRNA)都有效介导Cas9诱导的突变(图8)。在这些实验中，各gRNA/Cas9配对的活性似乎比ZFN介导的诱变高数倍。从测序来自Lrp5外显子2基因座基因座的2.7kbPCR产物的TOPO克隆等位基因计算突变率。单个序列与野生型的比对确定精确的缺失(上文定量)或插入大小(数据未显示)。用上文所述的引物P9和P12通过PCR来扩增2.7kb基因组区域。用TOPO-TA克隆(Invitrogen)直接克隆PCR产物来捕获所有可能的缺失大小。转化并接种单克隆后，选择克隆，分离质粒DNA，并用引物P20和P21按照Sanger法测序。图9A-B显示Hepa1-6肝癌细胞中gRNA/Cas9突变率(图9A)和缺失大小(图9B)的总结。
实施例7：使用密码子优化的条件性敲除供体载体的Cas9/CRISPR介导介导的基因靶向
用Cas9质粒或mRNA、gRNA和包含密码子优化的外显子序列的Lrp5 CKO供体1共转染Hepa1-6细胞。为了比较，一些细胞用Lrp5 ZFN质粒和供体质粒共转染(图10)。72小时后，用对密码子优化的Lrp5供体外显子特异的引物(P7；SEQ ID NO:7)和对3’同源臂的外侧区域特异的引物(P12；SEQ ID NO:12)通过PCR来分析来自转染细胞的基因组DNA。用以下条件用引物P7和P12进行使用REDExtract-N-Amp PCRReadyMix(Sigma)的PCR反应：95℃3分钟；95℃45秒、63℃45秒、72℃1分30秒的38个循环；然后72℃7分钟。通过1％琼脂糖凝胶上的电泳来分离PCR产物。如上文所述，Lrp5外显子2供体1载体包含含有许多中性突变(从突变排除前13bp和最后11bp)的密码子优化的外显子(CO外显子2)，以及外源侧翼loxP位点。以上PCR使用对CO外显子2序列特异的正向引物和基因组基因座中的同源臂外侧的反向引物，因此仅在供体外显子序列掺入正确的Lrp5基因座时产生PCR产物。gRNA/Cas9的使用以极高的效率在Lrp5基因座处产生供体序列整合，超过使用ZFN系统和相同的供体载体策略时观察到的效率(图10)。
实施例8：Cas9/CRISPR介导的loxP位点的靶向引入
为了确定供体设计策略和Cas9/CRISPR系统是否可以用来在基因组基因座处引入loxP位点，使用一条定位在同源臂外侧的引物和一条锚定在来自供体的5’或3’loxP位点处的引物，通过PCR分析来分析来自按实施例7中所述转染的细胞的基因组DNA。对于5’基因组至5’loxP反应，除加入DMSO至2％的终浓度外，将引物P9和P10(SEQ ID NOS:9和10)用于标准Expand High Fidelity PCR System(Roche)流程。PCR参数如下：95℃ 3分钟；95℃ 45秒、63℃ 45秒、72℃ 1分30秒的45个循环；然后72℃ 7分钟。对于3’loxP至3’基因组反应，按标准REDExtract-N-AmpPCR ReadyMix(Sigma)流程使用引物P11和P12。PCR参数如下：95℃ 3分钟；95℃ 45秒、62.5℃ 45秒、72℃ 1分30秒的40个循环；然后72℃7分钟。通过1％琼脂糖凝胶上的电泳来分离PCR产物。从分离自用两种不同的Lrp5 gRNA中的任一种和CKO供体转染的细胞的样品获得3’loxP位点的PCR产物(图11；p_gRNA T2)。类似地，从分离自用gRNA T7转染的细胞的样品获得5’loxP位点的PCR产物(图11)。因此，图11显示，在Hepa1-6细胞中，Lrp5 gRNA T2/Cas9和Lrp5 gRNA T7/Cas9介导的双链断裂导致用密码子优化的外显子供体载体策略在Lrp5基因座处引入loxP位点。只有用Cas9、gRNA和供体电穿孔的细胞显示Lrp5基因组基因座中的5’(图11，上)和3’(图11，下)loxP位点的迹象。gRNA T7产生更显著的5’loxP存在，而对于ZFN，检测不到整合的loxP位点。在这些使用Hepa1-6细胞的实验中，ZFN样品中可检测到的loxP位点的缺乏和gRNA样品中可检测到的loxP位点的低水平可以解释为细胞系中的低同源重组率及分析所转染的全细胞库而不是克隆亚组的事实这二者。用具有Lrp5 CKO/wt基因型的单个小鼠基因组DNA样品作为阳性对照。这些结果显示，CKO设计策略可以用于体细胞，它有效降低双链断裂与5’和3’loxP位点二者的位置之间不希望的交换事件的频率。总的来说，通过引入RNA指导的核酸酶介导的DNA断裂来靶向特异性基因组基因座，随后用改造的密码子优化的CKO供体序列修复，可以插入loxP位点，从而产生条件性敲除等位基因。
实施例9：Usp10、Nnmt和Notch3基因组基因座的靶向
为了确认可以用本发明的方法靶向其他基因，产生了Usp10、Nnmt和Notch3基因组基因座的供体和gRNA。按实施例6中所述和图12中所示向Hepa1-6细胞中引入这些Cas9/gRNA和供体来在各基因座引入DNA双链断裂，随后用密码子优化的供体作为模板来修复。基本上按上文所述进行SURVEYOR测定。以LA Taq(Takara)用引物P9、P12、P22、P23、P24、P25(分别为SEQ ID NOS:9、12、22、23、24和25)和以下参数扩增Lrp5、Usp10和Notch3基因组基因座特异的大小为2.2-2.7kb的PCR产物：95℃ 3分钟；95℃ 45秒、Ta 45秒(Lrp5＝57℃，Usp10&Notch3＝63℃)、70℃ 2分30秒的35个循环；然后72℃7分钟。按厂家的说明(Transgenomic)分别将1/7、1/3和全部的PCR产物用于SURVEYOR测定。通过1.5％琼脂糖凝胶上的电泳来分离所得到的代表其中野生型和突变体等位基因的链已退火的核酸酶切割的消化产物。
图12和图13显示，与就Lrp5基因座观察到的一样，特异性gRNA/Cas9复合物有效靶向Usp10、Nnmt和Notch3基因组基因座(图12)，且整合了loxP位点(图13)。
实施例10：用RNA指导的序列特异性内切核酸酶和密码子优化的供体产生Lrp5的条件性敲除和敲除等位基因
可以用本文所述的Lrp5特异性gRNA靶向Lrp5基因座来引入侧翼为loxP的密码子优化外显子，从而产生条件性敲除等位基因。随后Cre重组酶蛋白质在包含条件性敲除等位基因的细胞中的表达可以切除侧翼为loxP的外显子，产生敲除等位基因。
表9.引物核苷酸序列。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但该描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确完整引入作为参考。

Claims (30)

1.在包含靶基因的细胞中产生条件性敲除等位基因的方法，所述方法包括步骤：
a.向所述细胞中引入供体构建体，其中供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；和
b.向所述细胞中引入切割所述靶基因内的序列的序列特异性核酸酶，从而在所述细胞中产生条件性敲除等位基因。
2.权利要求1的方法，其中序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。
3.权利要求1的方法，其中序列特异性核酸酶是转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)。
4.权利要求1的方法，其中序列特异性核酸酶是仅切割所述靶基因一次的ZFN二聚体。
5.权利要求1的方法，其中序列特异性核酸酶是RNA指导的核酸酶。
6.权利要求5的方法，其中RNA指导的核酸酶是Cas9。
7.权利要求1的方法，其中序列特异性核酸酶作为蛋白质、mRNA或cDNA引入。
8.权利要求1的方法，其中重组酶识别位点是loxP位点、frt位点或rox位点。
9.权利要求1的方法，其中供体序列包含七个沉默突变。
10.权利要求1的方法，其中供体序列和靶序列之间的序列同源性为98％或更小。
11.权利要求10的方法，其中供体序列和靶序列之间的序列同源性为78％。
12.权利要求1的方法，其中供体构建体包含SEQ ID NO:30、31、44、45或46的序列。
13.权利要求1的方法，其中5’同源区包含至少1.1kb，且其中3’同源区包含至少1kb。
14.权利要求1的方法，其中靶基因选自Lrp5、Usp10、Nnmt和Notch3。
15.权利要求1的方法，其中细胞分离自哺乳动物。
16.权利要求15的方法，其中哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猫、狗、绵羊、马、牛、猴和人。
17.权利要求1的方法，其中细胞是合子或多能干细胞。
18.产生条件性敲除动物的方法，所述方法包括步骤：
a.向包含靶基因的细胞中引入供体构建体，其中供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；
b.向所述细胞中引入序列特异性核酸酶，其中核酸酶切割所述靶基因；和
c.将所述细胞引入载体动物中，以从所述细胞产生所述条件性敲除动物。
19.权利要求18的方法，其中细胞是合子或多能干细胞。
20.产生敲除动物的方法，所述方法包括步骤：
a.向包含靶基因的细胞中引入供体构建体，其中供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；
b.向所述细胞中引入序列特异性核酸酶，其中核酸酶切割所述靶基因；
c.将所述细胞引入载体动物中，以从转染的细胞产生转基因动物；和
d.使所述条件性敲除动物与下述转基因动物交配，所述转基因动物具有编码重组酶蛋白质的转基因，所述重组酶蛋白质催化5’重组酶识别位点和3’重组酶识别位点处的重组。
21.权利要求20的方法，其中细胞是合子或多能干细胞。
22.权利要求20的方法，其中重组酶识别位点是loxP位点，且其中重组酶是Cre重组酶。
23.权利要求20的方法，其中重组酶识别位点是frt位点，且其中重组酶是FLP重组酶。
24.权利要求20的方法，其中重组酶识别位点是rox位点，且其中重组酶是Dre重组酶。
25.权利要求20的方法，其中编码所述重组酶的转基因处于组织特异性启动子或诱导型启动子的控制下。
26.用于产生靶基因的条件性敲除等位基因的组合物，其包含：
a.包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区的供体构建体，其中供体序列包含与所述靶基因的序列相比具有至少一个中性突变的靶序列；和
b.识别所述靶基因的序列特异性核酸酶。
27.权利要求26的组合物，其中序列特异性核酸酶选自ZFN、TALEN和RNA介导的核酸酶。
28.供体构建体，其包含SEQ ID NO:30、31、44、45或46的序列。
29.细胞，其包含权利要求28的供体构建体。
30.非人条件性敲除动物，其按照权利要求18的方法制备。
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