CN106754912B

CN106754912B - 一类定向清除肝细胞中HBVcccDNA的质粒及制剂

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Publication number: CN106754912B
Application number: CN201611030862.4A
Authority: CN
Inventors: 徐宇虹; 房文慧; 彭金良; 刘君
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2036-11-16
Also published as: CN106754912A

Abstract

本发明属于生物大分子药物制剂领域，具体涉及一类定向清除肝细胞中HBV cccDNA的质粒及制剂。本发明通过广泛而深入的研究发现五种全新的CRISPR/Cas系统，可有效清除细胞内的HBVcccDNA，抑制HBV病毒的复制并降低乙肝病毒相关蛋白的表达。进一步地，还制备了一种pH敏感的PEG修饰的阳离子脂质载体，稳定性好、转染效率高，克服了许多阳离子脂质载体的体内不稳定性。将CRISPR/Cas系统与pH敏感的PEG修饰的阳离子脂质载体结合制备了CRISPR/Cas9阳离子脂质载体制剂，可有效抑制HBV急性感染小鼠模型体内的病毒复制、降低抗原表达水平。

Description

一类定向清除肝细胞中HBVcccDNA的质粒及制剂

技术领域

本发明属于生物大分子药物制剂领域，具体涉及一类定向清除肝细胞中HBV ccc的DNA、质粒及制剂。

背景技术

乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的严重危害人类健康的传染性疾病。尽管预防性疫苗已成功使用多年，乙型肝炎仍然为全世界主要的公共卫生问题之一。据统计，目前世界上有大于3.5亿人为慢性HBV感染者，我国现有的HBV感染者为9300万人。约20％～40％的HBV感染者最终会发展为严重的肝脏疾病，例如肝硬化和肝癌。乙肝病毒感染已经成为危害公众健康的重大问题。目前，常用的乙肝抗病毒治疗药物主要为两类：干扰素类和核苷类似物。干扰素主要是通过激活机体的固有免疫和获得性免疫来产生免疫应答以达到清除感染的肝细胞或直接抑制乙肝病毒复制的作用。干扰素本身的抗病毒作用很弱，也不能清除肝细胞核的cccDNA。核苷类似物主要是通过在乙肝前基因组RNA逆转录成为负链DNA的过程中竞争性抑制病毒逆转录酶和DNA聚合酶的活性，从而阻止病毒DNA的复制。由于cccDNA形成于核酸类似物作用之前，所以并不能有效降低cccDNA的产生；核酸类似物的抑制作用是可逆的，患者需要长期服药才能获得较好的抗病毒效果。目前较常用的这两类药物都只能抑制病毒的复制，并不能直接清除病毒复制的模板cccDNA，复发率高，因此当前迫切需要新的方法来抑制乙肝病毒的复制以期达到功能性治愈的效果。

近年来，随着基因编辑技术的兴起，锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)作为基因组编辑的利器也被运用到清除乙肝病毒复制模板cccDNA的研究中。但ZFNs和TALENs系统存在的组装与筛选复杂、构建成本偏高等问题限制了广泛的使用和发展。相比较，CRISPR/Cas9技术具有构建成本更低、构建方法简便、定点切割的准确性更高等优点，在清除乙肝病毒方面具有更大的潜在应用价值。

CRISPR/Cas系统作为细菌和古细菌的一种获得性免疫防御机制，在应对病毒和质粒的不断攻击中具有重大作用。CRISPR/Cas系统是由重复序列、间隔序列、前导序列和Cas核酸酶基因共同构成。CRISPR/Cas系统包括三种不同的类型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas系统是主要分布于细菌中，是最简单的一种CRISPR/Cas系统，其Cas蛋白仅由一种Cas9蛋白组成，不需要复杂的蛋白复合体参与剪切外源DNA过程，因此目前的应用最为广泛。其基因编辑作用机制：首先，细菌通过外源DNA上的原间隔序列毗邻(PAM)元件将其与自身基因组区别；Cas9蛋白复合物靶向切割外源基因组中的原间隔序列，并将其整合到宿主细胞的CRISPR序列的5’端，作为宿主细胞基因组新的第一个间隔序列。其次，当同种噬菌体或质粒再次入侵时，宿主细胞新形成的CRISPR间隔序列迅速响应，在前导序列的启动下迅速转录生成crRNA前体，Cas蛋白复合体在tracrRNA(trans-activating crRNA)的协助下剪切pre-crRNA形成成熟体crRNAs，每个成熟体crRNA均含有一个由单个间隔序列转录后形成的区域，最后形成tracrRNA-crRNA-Cas9复合体，通过PAM序列和碱基互补配对识别并在靶位置剪切外源DNA。这套CRISPR/Cas系统已被证实可在人体细胞内发挥作用，前提只需要在人体细胞内转入可表达Cas9核酸内切酶的质粒和相应的crRNA分子。有研究者的用此RNA介导的DNA切割机制成功地对iPS细胞进行了试验，证明这套技术对这种细胞具有基因破坏作用和定向整合等多种基因组编辑修饰作用。除了能够应用于人体细胞之外，CRISPR/Cas基因组编辑技术还可应用于斑马鱼和细菌等其它物种的细胞，不过其真正应用价值仍需进一步探究。

但目前研究中CRISPR/Cas系统大多通过病毒载体或水动力注射的方式进行转染，缺乏一种安全有效的体内应用制剂。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种一类定向清除肝细胞中HBVcccDNA的质粒及制剂。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种分离的核酸分子，包括单链RNA，所述单链RNA中含有能够在严紧条件下与乙肝病毒cccDNA杂交的核苷酸序列。

优选地，所述乙肝病毒cccDNA来源于人。

优选地，所述单链RNA为sgRNA，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1～5之任一所示。

优选地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:6～10之任一所示。

本发明的第二方面，提供一种CRISPR/Cas9系统，包括CRISPR/Cas9表达载体和前述分离的核酸分子。

所述CRISPR/Cas9系统，在细胞中可转录产生如前所述的分离的核酸分子。

所述CRISPR/Cas9表达载体可选自但不限于pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9载体。

本发明的第三方面，提供了前述CRISPR/Cas9系统用于制备HBV感染治疗药物制剂的用途。

本发明的第四方面，提供了一种HBV感染治疗药物制剂，包括前述CRISPR/Cas9系统和基因输送载体，所述基因输送载体用于将CRISPR/Cas9系统输送至靶部位。

优选地，所述基因输送载体为脂质体。优选地，所述基因输送载体为阳离子脂质体。

所述脂质体的载体材料包括pH响应脂质，所述pH响应脂质的结构式如式I所示。

所述脂质体的载体材料包括阳离子脂质、辅助脂质和pH响应脂质。

所述阳离子脂质可选用但不限于DOTAP【2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵】、N-[1-DOTMA【(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺】、DOGS【精胺-5-羧基-氨基乙酸二十八烷基酰胺】或DC-Chol【双油基双甲基氯化铵、N-(N,N-二甲基胺乙基)胺基甲酰基-胆固醇】等。

所述辅助脂质可选用但不限于DOPE【1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺】、DSPE【二硬脂酰磷脂酰乙醇胺】或胆固醇等。

所述脂质体的载体材料还包括聚乙二醇(PEG)。所述pH响应脂质与聚乙二醇反应可获得PEG化的pH响应脂质。

所述聚乙二醇的分子量范围可以是400～8000Da。

所述聚乙二醇可以是端基为醛基的聚乙二醇。

聚乙二醇的摩尔量为脂质体中总脂质的x％。x可以为0.1～50。

阳离子脂质：辅助脂质：pH响应脂质(摩尔比)＝n/(100-n-m)/m,其中n可以为0.1～100，m可以为0.1～50。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过广泛而深入的研究发现五种全新的CRISPR/Cas系统，可有效降低抑制HBV病毒的复制。进一步地，还制备了一种pH敏感的PEG修饰的阳离子脂质载体，稳定性高、转染效率高，克服了许多阳离子脂质载体的体内不稳定性。将CRISPR/Cas系统与pH敏感的PEG修饰的阳离子脂质载体结合制备了CRISPR/Cas9阳离子脂质载体制剂，可有效抑制HBV急性感染小鼠模型体内的病毒复制、降低抗原表达水平。

附图说明

图1：CRISPR/Cas9系统在乙肝病毒基因组上作用的五个靶点。

图2：sgRNA结构示意图。

图3：CRISPR/Cas9系统载体图谱。

图4：PEG与脂质CA的连接反应示意图。

图5：针对不同靶点的CRISPR/Cas9对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝表面抗原表达的抑制作用。

图6：针对不同靶点的CRISPR/Cas9对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝e抗原表达的抑制作用。

图7：针对不同靶点的CRISPR/Cas9对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝病毒DNA复制的抑制作用。

图8：阳离子脂质核酸类药物制剂在Opti-MEM中的稳定性。

图9：阳离子脂质核酸类药物制剂细胞内吞效果。

图10：阳离子脂质核酸类药物制剂血清中的转染效率比较。

图11：CRISPR/Cas9脂质载体制剂对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制作用。

图12：CRISPR/Cas9脂质载体制剂对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制作用。

图13：CRISPR/Cas9脂质载体制剂对小鼠体内cccDNA的抑制作用。

图14：CRISPR/Cas9脂质载体制剂对小鼠血液中的HBcAg表达的抑制作用。

具体实施方式

一、分离的核酸分子

本发明的分离的核酸分子，包括单链RNA，所述单链RNA中含有能够在严紧条件下与乙肝病毒cccDNA杂交的核苷酸序列。

所述乙肝病毒cccDNA可来源于人。

本发明的优选实施例中，列举了所述单链RNA为sgRNA，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1～5之任一所示。

进一步地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:6～10之任一所示。

二、CRISPR/Cas9系统

本发明的CRISPR/Cas9系统，包括CRISPR/Cas9表达载体和前述分离的核酸分子。所述CRISPR/Cas9系统，在细胞中可转录产生如前所述的分离的核酸分子。

本领域技术人员，可将分离的核酸分子，例如sgRNA克隆至CRISPR/Cas9表达载体上，转染至细胞内后，即可表达所述sgRNA和CAS9。sgRNA和CAS9在细胞内表达后，CAS9和sgRNA组成RNA-protein复合体(RNP)。其中所述gRNA通过RNA-DNA碱基互补配对原则，将此RNP定位到乙肝病毒cccDNA的特定位置，这时，CAS9将发挥其核酸内切酶的特性，在碱基互补配对的位置上对乙肝病毒cccDNA进行切割，形成DNA双链断裂。进而，特异性敲除细胞内乙肝病毒cccDNA。

可采用本领域技术人员所熟知的CRISPR/Cas9表达载体。

本发明的实施例中列举了pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9载体，但并不限于此。

三、CRISPR/Cas9系统的用途

本发明的CRISPR/Cas9系统可用于制备HBV感染治疗药物制剂。

四、HBV感染治疗药物制剂

本发明的HBV感染治疗药物制剂，包括前述CRISPR/Cas9系统和基因输送载体，所述基因输送载体用于将CRISPR/Cas9系统输送至靶部位。

本发明对于基因输送载体并无特别的限制，只要能够将CRISPR/Cas9系统有效输送至靶部位，使其正常发挥作用即可。

例如，所述基因输送载体可以是脂质体。本发明对于脂质体的载体材料及含量并无特别的限制，只要能够将CRISPR/Cas9系统有效输送至靶部位，使其正常发挥作用即可。这些均在本领域技术人员所能知晓的知识范围内。

本发明的实施例中，列举了所述脂质体为阳离子脂质体。

阳离子脂质载体具有结构简单、质量可控、可实现大规模生产等优点。阳离子脂质体通常是由阳离子脂质和辅助脂质一定条件下复合而成，阳离子脂质通过静电作用与带有负电的基因复合，但表面过多的正电荷增加了复合物在血清中的不稳定性，影响其转染的效率。因此，我们对阳离子脂质体表面进行聚乙二醇(PEG)修饰，制备长循环阳离子脂质体。一般的PEG修饰会影响阳离子脂质体的内涵体逃逸过程，导致基因无法有效释放从而降低了转染效率。因此，我们选择使用一种pH敏感的PEG修饰脂质体作为CRISPR/Cas系统的基因输送载体。

所述脂质体的载体材料可包括pH响应脂质，所述pH响应脂质的结构式如式I所示：

其中，R可为胆固醇及其类似物、脂肪酸或磷脂等。

本发明的实施例中列举的pH响应脂质的结构式如式II所示：

进一步地，所述脂质体的载体材料还可包括聚乙二醇(PEG)。所述pH响应脂质可与聚乙二醇反应可获得PEG化的pH响应脂质。

所述聚乙二醇可以是端基为醛基的聚乙二醇。所述pH响应脂质与端基为醛基的PEG反应可获得结构式如式III所示的PEG化的pH响应脂质：

所述聚乙二醇的分子量范围可以是400～8000Da。

本发明对于阳离子脂质体中各原料的含量没有特别限制，只要能够将CRISPR/Cas9系统有效输送至靶部位，使其正常发挥作用即可。这些均在本领域技术人员所能知晓的知识范围内。

一般地，阳离子脂质：辅助脂质：pH响应脂质(摩尔比)＝n/(100-n-m)/m,其中n可以为0.1～100，m可以为0.1～50。

聚乙二醇的摩尔量为脂质体中总脂质的x％。x可以为0.1～50。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 sgRNA序列的设计、合成以及真核表达载体构建

我们选择同时可以针对HBV不同亚型基因组：adw(Genebank ID:AF100309.1)，adw2(Genebank ID:X02763)，adr(Genebank ID:AF411411)，ayw(Genebank ID:V01460.1)作为CRISPR/Cas系统的靶向序列作为CRISPR/Cas系统的靶向序列，根据sgRNA设计原则设计了针对病毒基因组保守区的多条sgRNA。将所得sgRNA与人体基因组序列比对，排除同源性高的sgRNA，最终找到五条全新的sgRNA作用靶点和靶序列(如表1&如图1所示)。

表1

根据选好的靶点序列，我们首先合成了相应的sgRNA插入序列：GN 19，GN 19序列经退火后克隆到线性化的pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9载体中，其中U6启动子启动sgRNA的表达，CMV启动子启动Cas9基因的表达。sgRNA结构如图2所示。载体图谱如图3所示。连接好的CRISPR/Cas9表达载体经DH5α感受态细胞转化、菌落PCR鉴定阳性转化子、基因测序验证后分别命名为sg1、sg2、sg3、sg4、sg5，之后再进行质粒小提及大提以用于后续实验。

具体地，sgRNA1的序列如SEQ ID NO:6所示，具体为：

GN19GGACUUCUCUCAAUUUUCUAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。

sgRNA2的序列如SEQ ID NO:7所示，具体为：GN19GGGUUGCGUCAGCAAACACUUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。

sgRNA3的序列如SEQ ID NO:8所示，具体为：GN19GUCCUUUGUUUACGUCCCGUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。

sgRNA4的序列如SEQ ID NO:9所示，具体为：GN19GCUGUGCCUUGGGUGGCUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。

sgRNA5的序列如SEQ ID NO:10所示，具体为：GN19GGCGAGGGAGUUCUUCUUCUAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。

实施例2

将实施例1中构建好的五种CRISPR/Cas9表达质粒(sg1、sg2、sg3、sg4、sg5)与pHBV1.3质粒共转染SMMC-7721细胞，观察转染后病毒表面抗原、e抗原、乙肝病毒cccDNA的变化，并据此评价五种CRISPR/Cas9系统抑制HBV复制的效果。

(1)细胞转染将pHBV 1.3和CRISPR/Cas9质粒混合后用lipofectamine 2000转染SMMC-7721细胞，pHBV 1.3与pGl3质粒混合作为对照组。转染后培养48h,收集培养液和细胞用于后续测定实验。

(2)乙肝表面抗原和e抗原测定将上述细胞离心，收集细胞上清。用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒及乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒测量上清中的乙肝表面抗原及e抗原。最后用酶标仪双波长读数，波长450/630nm。

针对不同靶点的CRISPR/Cas9对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝表面抗原表达的抑制作用如图5所示。具体地，sg1、sg2、sg3、sg4、sg5对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝表面抗原表达的抑制率分别是56.1％、47.9％、15.3％、23.5％、25.5％。

针对不同靶点的CRISPR/Cas9对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝e抗原表达的抑制作用如图6所示。具体地，sg1、sg2、sg3、sg4、sg5对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝e抗原表达的抑制率分别是38.8％、50.6％、25.9％、40.0％、32.9％。

(3)乙肝病毒DNA水平测定收集转染48h后的SMMC-7721细胞，采用煮沸法提取乙肝病毒DNA，用乙肝病毒核酸荧光定量PCR法测定病毒DNA量。具体实验步骤如下：

a.病毒DNA的提取:采用煮沸法提取乙肝病毒DNA。收集转染48小时后的SMMC-7721细胞，裂解细胞后将混合物1000rpm离心10min，收集上清。取核酸提取液A100μl于0.5mL离心管中，加入上述上清液100μl，振荡混匀后12000rpm离心10min后吸弃上清；加入25μl核酸提取液B，震荡混匀后2000rpm离心，置于100℃沸水浴10min。12000rpm离心后取上清为PCR反应模板。

b.病毒DNA PCR扩增反应:根据待扩增样品数按[PCR反应液A]:[PCR反应液B]:[PCR反应液C]＝13.5:13.5:1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管28μl；在装有PCR反应液的反应管中加入2μl已处理好的样本。

c.病毒DNA荧光定量检测:将装有上述待检测样本的反应管放入荧光定量PCR仪中进行检测，按如下循环条件进行检测：UNG酶反应50℃2min，94℃预变性2min，变性94℃10s，40个循环，60℃30s，4个循环，35℃10s，在60℃时荧光检测，检测通道为530nm(FAM)。

针对不同靶点的CRISPR/Cas9对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝病毒DNA复制的抑制作用如图7所示。具体地，sg1、sg2、sg3、sg4、sg5对共转染pHBV 1.3的SMMC-7721细胞乙肝病毒DNA复制的抑制率分别是46.3％、41.7％、19.4％、29.6％、24.0％。

实施例3阳离子脂质核酸类药物制剂的制备

阳离子脂质以DOTAP为例，核酸类药物以CRISPR/Cas9为例(sg1、sg2、sg3、sg4、sg5)进行制备。

本实施例中用到的pH响应脂质为脂质CA，所述脂质CA为现有技术。所述脂质CA的结构式如式II所示，具体为：

本领域技术人员可采用文献“Controlling HBV Replication in Vivo byIntravenous Administration of Triggered PEGylated siRNA-Nanoparticles”中所报道的方法来制备获得脂质CA。

如图4所示，所述脂质CA与端基为醛基的PEG反应可获得PEG化的脂质CA。所述PEG化的脂质CA的结构式如式III所示，具体为：

(1)制备空白脂质体：按摩尔比例50/40/10取一定量的DOTAP/DOPE/CA脂质储备液于圆底烧瓶中，混匀后减压旋蒸除去有机溶剂，氮气吹干残余。加入1ml的4mM HEPES缓冲液，超声30min，形成带有乳光的脂质体溶液。将上述脂质体溶液加入脂质体挤出仪中过膜10次，得到粒径为50～100nm间的空白脂质体溶液。

(2)按N/P为4/1，CRISPR/Cas9脂质载体制剂中总DNA浓度为200μg/ml取一定量的DNA。用4mM HEPES缓冲液稀释后与上述空白脂质体溶液等体混合，37℃孵育30min，制备得脂质/核酸复合物。

(3)将上述脂质/核酸复合物溶液的PH调制4.0，加入占总脂质摩尔量10％的端基为醛基的PEG2000。混匀，置于恒温震荡仪上4℃反应24h。反应结束后，将溶液的PH恢复至7.4，得到最终的五种CRISPR/Cas9脂质载体制剂(分别记为lipoplex-sg1；lipoplex-sg2；lipoplex-sg3；lipoplex-sg4；lipoplex-sg5)。激光散射，粒度分析仪(PCS)测定，制剂的最终粒径均为180nm左右，Zeta电位均为+10mv左右。

实施例4阳离子脂质核酸类药物制剂的稳定性探究

体内有大量的带有负电荷的血清蛋白，易与带正电荷的阳离子脂质体发生吸附进而形成较大的聚集体而被单核巨噬系统清除。本实验考察了上述阳离子脂质核酸类药物制剂的稳定性。将N/P为4/1的制剂(实施例3所述lipoplex-sg1；lipoplex-sg2；lipoplex-sg3；lipoplex-sg4；lipoplex-sg5)加入opti-MEM中，在37℃下孵育，定时取样测定核酸类药物制剂的粒径变化。其中，lipoplex-sg1的实验结果如图8所示，说明该制剂具有相对较好的稳定性。此外，其他四种制剂也具有同样好的稳定性，在此不再一一列出。

实施例5阳离子脂质核酸类药物制剂的体外细胞内吞效果探究

a.SMMC-7721细胞混悬液接种到24孔板中的载玻片上(4×10^4/孔)，12小时后将罗丹明标记的制剂(实施例3所述lipoplex-sg1；lipoplex-sg2；lipoplex-sg3；lipoplex-sg4；lipoplex-sg5)按1μg/孔加入，孵育4h。

b.用冷的0.01M PBS(PH7.4)润洗细胞3次，停止孵育。

c.在室温下用4％多聚甲醛固定液固定样本15min.用PBS(PH7.4)润洗细胞5min×3次。

d.用Alexa 488标记的WGA染色10min，PBS润洗细胞5min×3次。

e.用DAPI核酸染色液孵育5分钟,PBS润洗细胞5min×3次。

f.滴加少量放荧光淬灭剂，盖上盖破片晾干后置于荧光共聚焦显微镜下，选择合适的激发和发射波长进行观察和拍照。其中，lipoplex-sg1的实验结果如图9所示，其中左上图代表细胞核，左下图代表细胞膜，由上图代表罗丹明标记的制剂，右下图代表细胞核、细胞膜、罗丹明标记的制剂的Merge图，可清晰地观察到罗丹明标记的制剂能够顺利转染进入到SMMC-7721细胞内。其他四种制剂也均能顺利转染进入到SMMC-7721细胞内，在此不再一一列出。

实施例6阳离子脂质核酸类药物制剂的体外细胞转染效果探究

为了考察本发明的阳离子脂质核酸类药物制剂的药物制剂的转染效果，本实验以SMMC-7721细胞为模型，以pGl3为核酸药物，考察N/P为4/1时不同脂质处方的有血清转染效率。具体如下：

a.将对数期细胞用0.25％胰酶消化，加完全培养基终止消化；用全培养基稀释，按1.0×10⁴/孔将细胞悬液接种于96孔板；

b.每孔加入150ul全培养基,轻轻摇晃使细胞均匀分布,培养18-24小时至细胞数量为60％-70％；

c.将复合物以DNA 250ng/孔的量加至培养板，转染4个小时后，换成新的完全培养基继续培养24h；

d.荧光素酶基因转染结果的检测。步骤按照Luciferase Assay System的操作说明测定，使用荧光素酶检测仪检测相对发光值。实验结果如图10所示，充分说明连接好PEG的脂质/基因复合物在血清具有较高的转染效率，原因可能是连接有pH敏感的PEG脂质/基因复合物具有较好的血清稳定性和溶酶体逃逸机制。

实施例7阳离子脂质核酸类药物制剂的体内抑制乙肝病毒效果探究

我们借助高压水动力注射HBV质粒急性感染小鼠为模型，每隔一定时间注射CRISPR/Cas9阳离子脂质载体制剂来探究复合物的体内抗病毒效果。具体实验步骤如下：

通过将6μg pHBV1.3质粒溶于相当于10％小鼠体重的1xPBS中，以高压水动力注射的方式注射到小鼠体内。高压注射结束后三小时，通过小鼠尾静脉注射CRISPR/Cas9阳离子脂质载体制剂(实施例3所述lipoplex-sg1；lipoplex-sg2；lipoplex-sg3；lipoplex-sg4；lipoplex-sg5)，共注射三次，每次间隔12小时。在小鼠最后一次尾静脉注射复合物后，我们选取第二天、第四天和第六天对小鼠进行眼眶取血，每只小鼠每次采血量为200μl，室温静置1h后，进行1000rpm离心15min，吸取血清备用。使用乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒和乙型肝炎e抗原诊断试剂盒测定血清中的抗原水平。

lipoplex-sg1对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制作用如图11所示。具体地，lipoplex-sg1对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制率约为71％(第二天)、70.5％(第四天)。lipoplex-sg2对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制率约为57％(第二天)、63％(第四天)。lipoplex-sg3对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制率约为31％(第二天)、30％(第四天)。lipoplex-sg4对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制率约为38％(第二天)、40％(第四天)。lipoplex-sg5对小鼠血液中的HBsAg表达的抑制率约为47％(第二天)、43％(第四天)。

lipoplex-sg1对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制作用如图12所示。具体地，lipoplex-sg1对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制率约为68％(第二天)、75％(第四天)。lipoplex-sg2对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制率约为65％(第二天)、68％(第四天)。lipoplex-sg3对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制率约为39％(第二天)、38％(第四天)。lipoplex-sg4对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制率约为54％(第二天)、49％(第四天)。lipoplex-sg5对小鼠血液中的HBeAg表达的抑制率约为46％(第二天)、43％(第四天)。

为考察复合物的抗病毒效果，我们于最后一次眼眶取血后处死小鼠，取出肝组织：一部分用来提取并测定其中的cccDNA水平；一部分用石蜡包埋用于乙肝核心抗原的免疫组化分析。

cccDNA水平的测定是取新鲜肝组织用组织DNA提取试剂盒提取总DNA、DNA纯化、除去线性HBV DNA和rcDNA、荧光定量PCR法测定cccDNA含量。具体实验步骤如下：

a.DNA提取:取新鲜肝脏组织进行切割，称取20mg组织用于提取病毒总DNA，提取实验使用组织DNA提取试剂盒，具体步骤参照试剂盒说明书；Nanodrop测定DNA浓度,此时DNA溶液含线性HBV DNA、rcDNA和cccDNA；

b.除去线性HBV DNA和rcDNA:取一定量的上述溶液，加入DpnⅠ内切酶37℃孵育1h，之后加入Plasmid free DNaseⅠ37℃孵育1h，此时得到的溶液仅含有cccDNA；

c.荧光定量PCR法测定cccDNA含量：取20ng已提取的HBV cccDNA模板，加入10μlPCR反应液、0.5μl(20μm/l)正向引物、0.5μl(20μm/l)反向引物、0.1ulTaqman探针，6000rpm离心1min后放入ABI-7000荧光定量PCR仪中，按以下循环条件进行：95℃10min，95℃10s，45个循环，62℃10s，72℃20s，以系列稀释的标准品和阴性对照作为对照同步反应。

lipoplex-sg1对小鼠体内cccDNA的抑制作用如图13所示。具体地，lipoplex-sg1对小鼠体内cccDNA的抑制率为40.5％。此外，其四种制剂lipoplex-sg2、lipoplex-sg3、lipoplex-sg4、lipoplex-sg5对小鼠体内cccDNA的抑制率分别为35％、17％、22％、19％。

乙肝核心抗原的免疫组化实验的具体实验步骤如下：

a.取新鲜肝脏洗净后4％多聚甲醛固定、洗涤后脱水、透明、浸蜡、包埋组织块；

b.取石蜡包埋块切片、展片、烤片后进行石蜡切片染色。

c.将切片脱蜡至水、3％H₂O₂室温处理灭活内源性过氧化物酶、滴加5％BSA封闭、滴加适当稀释的一抗Anti-HbcAg 4℃孵育过夜、滴加聚合HRP标记的二抗37℃孵育30min、DAB显色、苏木精复染。

d.中性树胶封片后荧光显微镜观察。

lipoplex-sg1对小鼠血液中的HBcAg表达的抑制作用如图14所示。可见，lipoplex-sg1能够显著抑制小鼠血液中的HBcAg的表达。此外，其他四种制剂也能够显著抑制小鼠血液中的HBcAg的表达。在此，不再一一列出。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 一类定向清除肝细胞中HBV ccc的DNA、质粒及制剂

<130> 161194

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 靶点1

<400> 1

ggacttctct caattttcta ggg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 靶点2

<400> 2

gggttgcgtc agcaaacact tgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 靶点3

<400> 3

gtcctttgtt tacgtcccgt cgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 靶点4

<400> 4

gctgtgcctt gggtggcttt ggg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 靶点5

<400> 5

ggcgagggag ttcttcttct agg 23

<210> 6

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA1的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 6

gnggacuucu cucaauuuuc uagggguuuu agagcuagaa auagcaaguu aaaauaaggc 60

uaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cu 102

<210> 7

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA2的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 7

gnggguugcg ucagcaaaca cuuggguuuu agagcuagaa auagcaaguu aaaauaaggc 60

uaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cu 102

<210> 8

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA3的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 8

gnguccuuug uuuacguccc gucggguuuu agagcuagaa auagcaaguu aaaauaaggc 60

uaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cu 102

<210> 9

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA4的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 9

gngcugugcc uuggguggcu uuguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60

uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcu 99

<210> 10

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA5的序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 10

gnggcgaggg aguucuucuu cuaggguuuu agagcuagaa auagcaaguu aaaauaaggc 60

uaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cu 102

Claims

1.一种HBV感染治疗药物制剂，包括CRISPR/Cas9系统和基因输送载体，所述基因输送载体用于将CRISPR/Cas9系统输送至靶部位，所述CRISPR/Cas9系统包括

CRISPR/Cas9表达载体和分离的核酸分子，所述分离的核酸分子，包括单链RNA，所述单链RNA中含有能够在严紧条件下与乙肝病毒cccDNA杂交的核苷酸序列，所述单链RNA为sgRNA，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1～5之任一所示，所述基因输送载体为阳离子脂质体，所述阳离子脂质体的载体材料包括阳离子脂质、辅助脂质、聚乙二醇和pH响应脂质,所述pH响应脂质的结构式如式I所示：

其中，R为胆固醇及其类似物、脂肪酸或磷脂。

2.根据权利要求1所述的HBV感染治疗药物制剂，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQID NO:6～10之任一所示。

3.根据权利要求1所述的HBV感染治疗药物制剂，其特征在于，所述阳离子选自DOTAP、DOTMA、DOGS或DC-Chol。

4.根据权利要求1所述的HBV感染治疗药物制剂，其特征在于，所述辅助脂质选自DOPE、DSPE或胆固醇。

5.根据权利要求1所述的HBV感染治疗药物制剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量范围是400～8000Da。

6.根据权利要求1所述的HBV感染治疗药物制剂，其特征在于，所述聚乙二醇的摩尔量为脂质体中总脂质的x％，x为0.1～50。

7.根据权利要求1所述的HBV感染治疗药物制剂，其特征在于，所述阳离子脂质：辅助脂质：pH响应脂质的摩尔比＝n/(100-n-m)/m，其中n为0.1～100，m为0.1～50。