CN108913664B - 一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法 - Google Patents

一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CpG结合蛋白CXXC锌指蛋白1可以抑制细胞增殖。通过CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞A2780细胞中的CFP1蛋白，建立CFP1缺失的卵巢癌细胞系。通过细胞增殖实验证明CFP1缺失可以抑制卵巢癌细胞的增殖；通过克隆形成实验证明CFP1蛋白缺失抑制卵巢癌细胞非锚定性细胞生长;通过流式细胞仪检测发现CFP1基因敲除还影响细胞周期变化;通过免疫印迹检测发现在卵巢癌细胞中CFP1缺失可以显著降低H3K4me3的表达，这表明在卵巢癌细胞中CFP1参与调节组蛋白甲基化。

Description

一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因 的方法
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞CFP1蛋白抑制细胞增殖和软琼脂克隆形成能力，及影响细胞周期。
背景技术
卵巢癌是危害妇女健康最常见的恶性肿瘤之一，其致死率在所有妇科肿瘤中居于首位，卵巢癌发病隐蔽，极易发生侵袭和转移，大部分患者就诊时已处于晚期阶段，因此，卵巢癌患者的5年生存率仅30% 左右。近年来卵巢癌的发病率也逐年增加，各个年龄层的女性都有可能发生卵巢癌，但以45岁到50岁的妇女最为常见。
CpG结合蛋白CXXC锌指蛋白1（CXXC finger protein 1,CFP1)由Cxxc1基因编码，是SET1组蛋白甲基化复合体中的重要亚基，能够识别并结合在基因组中处于非甲基化状态的CpG岛上[16-18]。另一方面，SET复合体介导组蛋白H3的第4位赖氨酸发生3甲基化（H3K4me3)，这种甲基化使染色质结构更加松散，基因更容易转录。因此，CFP1蛋白与SETD1A/B以及SET1复合体其他组成成份相互作用，并将SETD1带到CpG岛上。使这些DNA区域发生更多的H3K4me3，这样在其他转录因子的存在下，基因能够更快速的启动转录，发挥功能，调节干细胞的维持和分化。
发明内容
本发明目的是建立了CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞A2780细胞中CFP1蛋白，并明确了CFP1蛋白缺失可以抑制卵巢癌细胞增殖和克隆形成能力，提供了CFP1蛋白影响卵巢癌细胞增殖的理论依据。
本发明的第一个方面，提供了：
CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法，包括如下步骤：
采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示的gRNA，连接到质粒载体上后，转染至卵巢癌细胞。
在一个实施方式中，所述的质粒载体是PX459。
在一个实施方式中，gRNA在PX459是通过Bbs1酶切连接。
在一个实施方式中，转染过程采用Lip3000脂质体。
在一个实施方式中，卵巢癌细胞是A2780细胞。
本发明的第二个方面，提供了：
由上述方法所得到的CFP1基因被敲除的卵巢癌细胞模型。
本发明的第三个方面，提供了：
用于CRISPR/Cas9基因编辑敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的gRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
本发明的第四个方面，提供了：
上述的针对CFP1基因的gRNA在用于制备抑制卵巢癌细胞的制剂中的用途。
有益效果
通过CRISPR/Cas9基因编辑方法建立了CFP1基因敲除的卵巢癌A2780细胞系，同时证明了CFP1蛋白在卵巢癌细胞增殖中的作用，为筛选卵巢癌基因治疗靶点提供理论上有意义的参考。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9基因编辑敲除Cfp1基因的位点。
图2是免疫印迹检测CFP1蛋白敲除效率比较。
图3 是PCR扩增野生型细胞和基因敲除细胞Cfp1基因,琼脂糖凝胶电泳检测。
图4为细胞增殖实验检测结果表明CFP1蛋白缺失抑制卵巢癌细胞增殖。
图5是克隆形成实验照片。
图6是克隆形成实验细胞数量对比。
图7是CFP1缺失影响卵巢癌细胞周期的比较。
图8是免疫组化方法检测176例不同类型的人卵巢肿瘤组织中CFP1蛋白的表达情况。
图9是免疫荧光检测结果。
图10是免疫印迹检测卵巢癌细胞中Cfp1基因敲除后组蛋白甲基化H3K4me3表达。
具体实施方式
下面结合实施及附图对本发明作进一步详细的描述：
CFP1蛋白在卵巢癌细胞增殖中的作用机制，通过CRISPR/Cas9基因编辑方法建立了Cfp1基因敲除的卵巢癌细胞，应用细胞增殖、克隆形成实验、免疫荧光、免疫组化和免疫印迹实验证明CFP1蛋白缺失可以抑制卵巢癌细胞增殖，影响细胞周期，减少组蛋白的甲基化。
A2780 cells(人卵巢细胞株)从ATCC(Manassas, VA, USA)购买。
Cfp1基因敲除细胞系的建立: 利用CRISPR/cas9设计网站（http://crispr.mit.edu）提供的在线软件在Cfp1基因上分别设计guide RNA序列（如SEQ ID NO.1～4所示），图1显示CRISPR/Cas9基因编辑敲除Cfp1基因的位点，同时在Cfp1基因第二和第三个内含子上设计了Cfp1基因敲除的序列。退火后Bbs1酶切连接到载体PX459中，构建含有不同guide RNA序列的质粒，使用Lip3000脂质体分别转染到卵巢癌A2780细胞，嘌呤霉素筛选3-5天，通过流式细胞分选获得单细胞克隆，免疫印迹方法鉴定Cfp1不同guide RNA的敲除效率，选取敲除效率最好的2-3个细胞克隆用于后续试验。图2是免疫印迹检测CFP1蛋白敲除效率比较，可以看出。图3 是PCR扩增野生型细胞和基因敲除细胞Cfp1基因,琼脂糖凝胶电泳检测，显示Cfp1基因敲除的卵巢癌细胞中没有500bp条带扩增。
Cfp1 gRNA-1-正义链: CACCGAGCGGGACAGCAGTGAGCCC（SEQ ID NO.1）
Cfp1gRNA-1-反义链: AAACGGGCTCACTGCTGTCCCGCTC（SEQ ID NO.2）
Cfp1 gRNA-2-正义链:CACC G GAGGACAGCAAGTCCGAGAA（SEQ ID NO.3）
Cfp1 gRNA-2-反义链:AAAC TTCTCGGACTTGCTGTCCTCC（SEQ ID NO.4）
MTT细胞增殖实验：取对数期的野生型及Cfp1基因敲除的人卵巢癌细胞系A2780，胰酶消化后，以5×10 3 密度接种于96孔板中（平行三复孔），200μl/孔细胞悬液，至于37℃、5%CO2的培养箱中，每个样品准备二份用于时间梯度检测。分别于24小时，48小时时间点各取一组样品，加入20μl浓度为5mg/ml的噻唑蓝溶液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养4小时。培养4小时后，吸走培养基，加入150μl DMSO，微微震荡晃匀。置于酶标仪，490nm波长检测吸光值。图4为细胞增殖实验检测结果表明CFP1缺失抑制卵巢癌细胞增殖。
克隆形成实验检测细胞增殖抑制情况: 取对数期的野生型及Cfp1基因敲除的人卵巢癌细胞系A2780，胰酶消化后，以1×10 3 密度接种于6cm培养皿中（平行三个培养皿），每三天更换新鲜培养基，连续培养2周。弃培养基，1xPBS漂洗细胞，考马斯亮蓝染色，然后吸走考马斯亮蓝染液，1×PBS漂洗3-5次，1min/次。将6cm培养皿倒置，拍照，计数。图5是克隆形成实验细胞照片；图6是克隆形成实验细胞数量对比。克隆形成实验结果表明CFP1缺失抑制卵巢癌细胞克隆形成能力。图7是CFP1缺失影响卵巢癌细胞周期的比较。
免疫组化：石蜡包埋人卵巢肿瘤组织芯片购买于桂林泛谱生物技术有限公司。实验中使用的人卵巢肿瘤组织经嘉兴学院校伦理委员会批准。5μm切片，参照ABC试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)，染色包括以下几个方面：切片经H2O2(0.3%)孵育10 min后，在10%山羊血清中孵育30 min，然后用CFP1抗体，1：200稀释，室温孵育1小时，用PBS洗涤后，用二次抗体孵育30 min。DAB（DAB substrate kit, VectorLaboratories）显色。图8是免疫组化方法检测176例不同类型的人卵巢肿瘤组织中CFP1蛋白的表达情况，发现在正常人卵巢组织中CFP1蛋白低表达，而在多数肿瘤组织中CFP1蛋白均高表达。
细胞免疫荧光：于24孔板中放入灭菌玻片，PBS漂洗3次，接种处于生长对数期的野生型及Cfp1基因敲除的人卵巢癌细胞系A2780细胞，贴壁过夜。将细胞固定在4%的多聚甲醛中室温摇床固定30min，弃固定液，1×PBS洗3次，5min/次；加入5%BSA，室温摇床封闭1h，在室温下用一抗孵育细胞1小时（CFP1， Hsp60 ，Nile Red， GM130， Calnexin），DAPI染核。图9是免疫荧光检测结果。显示Cfp1敲除后卵巢癌细胞线粒体，高尔基体，内质网等细胞器不受影响，CFP1敲除不影响卵巢癌细胞亚细胞结构。
免疫印迹:从野生型及Cfp1基因敲除的人卵巢癌细胞系A2780中提取蛋白质,95℃变性10分钟，经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，在室温下与5%脱脂牛奶中室温摇床上封闭1小时，将一抗用封闭液稀释后4℃过夜孵育。TBST清洗膜，以辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体作为第二抗体(Cell Signaling Technology)为二抗，室温孵育1h，TBST清洗膜。结合抗体通过ECL试剂盒(Amersham, GE Healthcare)显示。检测抗体包括CFP1(Abcam)、H3K4me3、H3k9me3(Abcam )、ERK、和α-tublin（Cell Signaling Technology）。如图10所示，免疫印迹检测卵巢癌细胞中Cfp1基因敲除后组蛋白甲基化H3K4me3表达增加。
序列表
<110> 嘉兴学院
<120> 一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgagcgg gacagcagtg agccc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacgggctc actgctgtcc cgctc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccggagga cagcaagtcc gagaa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacttctcg gacttgctgt cctcc 25

Claims (2)

1.CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示的gRNA，连接到质粒载体上后，转染至卵巢癌细胞；
所述的质粒载体是PX459；
gRNA在PX459是通过BbsⅠ酶切连接；
转染过程采用Lip3000脂质体；
卵巢癌细胞是A2780细胞。
2.权利要求1所述的方法所得到的CFP1基因被敲除的卵巢癌细胞模型。
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