CN111789966B - 组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用 - Google Patents

组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用。本发明从活体水平及蛋白水平研究了H3K4me3对小鼠卵巢卵泡发育的影响，证实了H3K4me3程度提高能够促进小鼠卵巢卵泡发育、抑制小鼠卵泡凋亡、增加小鼠的窝产仔数和产仔窝重；小鼠性成熟前降低H3K4me3程度，能够抑制小鼠血液中GnRH和促性腺激素释放激素LH和FSH的分泌。本发明将为进一步在分子层面探究H3K4me3靶向调控小鼠卵巢卵泡发育关键基因的机制，进而调控卵巢卵泡发育的机制奠定基础。

Description

组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用
技术领域
本发明涉及细胞工程和基因工程领域，特别涉及组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用。
背景技术
卵巢作为母鼠繁育的基础，其主要功能是产生并排出卵子。小鼠卵泡呈圆形泡状，位于卵巢皮质，是卵巢的组成单位，其生长分化是卵巢机能的重要保证。根据卵母细胞及颗粒细胞不同时期的生长状况，可将卵泡分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡及成熟卵泡。因原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡中颗粒细胞分裂迅速，且这三个阶段的卵泡生长发育速度较快，故又被统称为生长卵泡，而三级卵泡和成熟卵泡已经形成卵泡腔，故又被统称为有腔卵泡。
卵泡发育主要经历促性腺激素依赖和促性腺激素不依赖两个时期，腔前卵泡(原始卵泡和初级卵泡)的生长发育并不依赖促性腺激素，主要受生长因子的调控；有腔卵泡(三级卵泡和成熟卵泡)的生长发育则完全依赖促性腺激素(促黄体素(luteinizinghormone,LH)和促卵泡激素(Follicle stimulating hormone,FSH))调控。FSH、LH及雌二醇(Estradiol,E2)能够负反馈作用于下丘脑和垂体，调控促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)的分泌并影响卵泡发育。此外，生理周期前血液中会大量释放FSH来促进卵泡发育、颗粒细胞增殖等，随着卵泡的发育成熟，卵巢开始分泌大量的E2来刺激小鼠发情，并进一步促进雌鼠生殖道的生长发育与形成。LH则可以作用于卵泡促进性激素的分泌，与FSH协同作用促进卵泡成熟、排卵等生理过程，LH还能够促进黄体的生成，并促进黄体分泌E2和孕激素。因此，GnRH、促性腺激素释放激素(FSH和LH)以及E2均对卵巢卵泡发育至关重要。
表观遗传学(Epigenetics)是指DNA序列不改变，但基因的表达水平发生改变，从而引起生命体表型改变，即基因型未变，但生命体表型发生了改变。表观遗传的现象有很多，已知的包含基因组印记、组蛋白修饰、RNA编辑等。从胚胎植入到哺乳动物到达初情期，表观遗传修饰有很大的波动性。H3上4号赖氨酸三甲基化(Tri-methylation of HistoneH3 lysine 4,H3K4me3)是一个负责转录激活的典型染色质标记，H3K4me3结合在基因上的宽度与细胞识别种类相关，H3K4me3分布情况与基因的转录水平相关。目前，H3K4me3对小鼠卵巢卵泡发育的影响还未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用。
所述的组蛋白甲基化H3K4me3升高能够促进小鼠卵巢卵泡发育、抑制小鼠卵泡凋亡、增加小鼠的窝产仔数和产仔窝重。
所述的组蛋白甲基化H3K4me3降低会抑制小鼠卵巢卵泡发育、促使小鼠卵泡凋亡。
所述的组蛋白甲基化H3K4me3的抑制剂优选为BCl-121。
所述的组蛋白甲基化H3K4me3的激动剂优选为PBIT。
所述的BCl-121的最适使用方式为皮下注射浓度为6mM、一次注射量为0.1mL/kg的BCl-121。
所述的PBIT的最适使用方式为皮下注射浓度为6mM、一次注射量为0.1mL/kg的PBIT。
本发明的验证结果如下：
1、小鼠活体实验药物最适使用浓度
为研究小鼠外源性注射H3K4me3抑制剂BCl-121(Inhibitor)和H3K4me3激动剂PBIT(Agonist)的最适使用浓度及作用效果，分别将药物稀释至浓度为2mM、6mM、12mM、18mM、24mM和30mM，一次注射量为0.1mL/kg，小鼠颈部皮下注射。外源性注射药物48h后，Western Blot法检测小鼠卵巢中H3K4me3含量。
小鼠皮下注射H3K4me3抑制剂和激动剂能够改变小鼠体内H3K4me3的程度，且甲基化程度与注射量相关。小鼠颈部皮下注射浓度为6mM、一次注射量为0.1mL/kg的H3K4me3抑制剂BCl-12时能够显著降低小鼠卵巢组织中H3K4me3的含量，小鼠颈部皮下注射浓度为6mM、一次注射量为0.1mL/kg的H3K4me3激动剂PBIT时，能够显著升高小鼠卵巢组织中H3K4me3的含量。
2、H3K4me3影响小鼠血液中性腺轴激素分泌
为研究H3K4me3对小鼠血液中激素含量的影响，使用浓度为6mM的H3K4me3抑制剂BCl-121(Inhibitor)和H3K4me3激动剂PBIT(Agonist)连续21d外源性腹腔注射，一次注射量为0.1mL/kg，ELISA检测小鼠血液中性腺轴激素GnRH、LH、FSH及E2的含量。
抑制小鼠体内H3K4me3程度能够降低42日龄小鼠血液中GnRH的含量。抑制小鼠体内H3K4me3程度能够降低42日龄小鼠血液中LH的含量；49日龄小鼠已经体成熟，H3K4me3程度对小鼠血液中LH的含量无明显影响；抑制小鼠体内H3K4me3程度能够显著降低35日龄和42日龄小鼠血液中FSH的含量；与Inhibitor相比，促进小鼠体内H3K4me3程度能够持续且显著增加小鼠血液中FSH的含量；促进或抑制小鼠体内H3K4me3程度均能够升高35日龄、42日龄和49日龄小鼠血液中E2的含量。综上，在小鼠性成熟前(49日龄前)，降低小鼠体内H3K4me3程度，能够抑制小鼠血液中GnRH和促性腺激素释放激素(LH和FSH)的分泌。
3、H3K4me3程度对H3K4me3蛋白在小鼠卵巢分布的影响
为研究H3K4me3程度对H3K4me3蛋白在小鼠卵巢分布的影响，使用浓度为6mM的H3K4me3抑制剂BCl-121和H3K4me3激动剂PBIT连续21d外源性腹腔注射，一次注射量为0.1mL/kg，免疫组化观察49日龄小鼠卵巢卵泡中H3K4me3分布情况。
小鼠体内H3K4me3程度降低，分布在小鼠卵巢颗粒细胞上的H3K4me3蛋白减少；小鼠体内H3K4me3程度升高，分布在小鼠卵巢颗粒细胞上的H3K4me3蛋白增多。
4、H3K4me3程度对小鼠卵巢发育的影响
为研究H3K4me3对小鼠卵巢发育的影响，使用浓度为6mM的H3K4me3抑制剂BCl-121(Inhibitor)和H3K4me3激动剂PBIT(Agonist)连续21d外源性腹腔注射，一次注射量为0.1mL/kg，HE染色观察35、42和49日龄小鼠卵巢卵泡形态。
小鼠体内H3K4me3程度降低，小鼠性成熟时(49日龄后)有腔卵泡较少；小鼠体内H3K4me3程度升高，小鼠卵巢体积较大，且当小鼠性成熟时(49日龄后)有腔卵泡较多。
5、H3K4me3程度对小鼠卵巢卵泡凋亡的影响
为研究H3K4me3程度对小鼠卵巢卵泡凋亡的影响情况，使用浓度为6mM的H3K4me3抑制剂BCl-121(Inhibitor)和H3K4me3激动剂PBIT(Agonist)连续21d外源性腹腔注射，一次注射量为0.1mL/kg，TUNEL法观察49日龄小鼠卵巢卵泡的凋亡情况。
小鼠体内H3K4me3程度降低，小鼠卵巢中凋亡的卵泡减少；小鼠体内H3K4me3程度升高，小鼠卵巢中凋亡的卵泡增多。
6、H3K4me3程度对小鼠产仔性能的影响
为研究H3K4me3程度对小鼠产仔性能的影响，使用浓度为6mM的H3K4me3抑制剂BCl-121(Inhibitor)和H3K4me3激动剂PBIT(Agonist)连续21d外源性腹腔注射，一次注射量为0.1mL/kg，记录小鼠前三胎的总产仔数及窝产仔重。
与降低小鼠体内H3K4me3程度相比，升高H3K4me3程度能够显著提高小鼠的窝产仔数，且第三胎时H3K4me3能够显著增加母鼠的窝产仔数。与降低小鼠体内H3K4me3程度相比，升高H3K4me3程度能够显著增加小鼠前三胎的产仔窝重，且第三胎时H3K4me3能够显著增加母鼠的产仔窝重。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明验证方案设计周详，结果可靠。为证实H3K4me3对小鼠卵巢功能的影响，本发明从多层次、多角度验证，从活体水平及蛋白水平进行了验证。本发明证实了H3K4me3程度提高能够促进小鼠卵巢卵泡发育、抑制小鼠卵泡凋亡、增加小鼠的窝产仔数和产仔窝重，小鼠性成熟前降低H3K4me3程度，能够抑制小鼠血液中GnRH和促性腺激素释放激素(LH和FSH)的分泌。本发明将为进一步在分子层面探究H3K4me3靶向调控小鼠卵巢卵泡发育关键基因的机制，进而调控卵巢卵泡发育的机制奠定基础。
附图说明
图1为不同浓度Inhibitor和Agonist药物对小鼠卵巢组织中H3K4me3蛋白水平的影响结果图；其中，a为Western Blot检测的蛋白条带；b为Western Blot检测结果的灰度分析图。
图2为ELISA检测小鼠血液中性腺轴激素GnRH、LH、FSH及E2的含量结果图；其中，a为GnRH；b为LH；c为FSH；d为E2。
图3为HE染色观察Inhibitor和Agonist药物对小鼠卵巢卵泡形态影响的照片图。
图4为免疫组化观察注射Inhibitor和Agonist药物后小鼠卵巢卵泡中H3K4me3分布的照片图。
图5为TUNEL免疫荧光技术检测注射Inhibitor和Agonist药物后小鼠卵巢卵泡的凋亡结果照片图。
图6为注射Inhibitor和Agonist药物后小鼠前三胎的总产仔数和窝产仔重统计图；其中，a为前三胎的总产仔数；b为前三胎的窝产仔重。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中的C57BL/J6母鼠购自南方医科大学实验动物中心，C57BL/J6公鼠购自广州迪恩基因技术有限公司。实验过程中小鼠均饲养于华南农业大学动物实验中心。
C57BL/J6小鼠的饲养：自由采食，鼠房环境应当严格控制，温度17.8～26.1℃，相对湿度40％～70％，换气频率为10～15次/小时，光照周期12:12(正常)，光照强度130～325lux(鼠笼中的照度)，噪声25～40分贝。
实施例1
为研究H3K4me3抑制剂(BCl-121，SIGMA，货号SML1817，下文命名为Inhibitor)及H3K4me3激动剂(PBIT，SIGMA，货号SML1058，下文命名为Agonist)小鼠外源性注射的最适使用浓度及作用效果，将36只21～28日龄的C57BL/J6雌性小鼠分为3组(NC组、Inhibitor组及Agonist组)，实验组Inhibitor组和Agonist组，分别使用2mM、6mM、12mM、18mM、24mM和30mM浓度的药物BCl-121和PBIT颈部皮下注射(一次注射量为0.1mL/kg)，对照组NC组，是BCl-121和PBIT药物的溶剂DMSO(广州鼎国生物技术有限公司，货号DH105-9，下文命名为NC)，每个浓度2只小鼠，外源性注射药物48h后屠宰，Western Blot法检测小鼠卵巢中H3K4me3含量。
结果显示，外源性注射Inhibitor或Agonist药物，能够改变小鼠体内H3K4me3的程度，且甲基化程度与注射浓度相关。当药物使用浓度达到18mM时，Inhibitor及Agonist组的部分小鼠出现轻微躁动和抽搐。Inhibitor组药物颈部皮下注射浓度为6mM时，能够显著降低小鼠卵巢组织中H3K4me3的含量(图1a)，Agonist组药物颈部皮下注射浓度为6mM时，能够显著升高小鼠卵巢组织中H3K4me3的含量(图1b)。综合小鼠生理状态及药物对卵巢组织中H3K4me3的含量的影响，后续实验选择6mM为Inhibitor和Agonist药物小鼠活体实验的使用浓度。
检测方法
1)小鼠颈部皮下注射
左手固定小鼠，食指和拇指提起小鼠颈部皮肤，无名指和小拇指固定小鼠的臀部及尾部。常规消毒皮肤的注射部位，将0.5mm注射器90°针头刺入背部皮肤的毛细血管和淋巴管中，轻轻摆动针管，若容易摆动则已经准确刺入皮下，轻轻抽动刺入背部皮肤的针头，若无血液，即可进行皮下注射。小鼠的一次注射量为0.1mL/kg(体重)。注射完毕后，用拇指和食指捏住扎针部位片刻，防止药物外露，轻轻旋转针头后拔出，以防止药液外露。若想判断注射是否成功，可轻轻抽动刺入腹腔的针头，若无血液或肠内容物，即注射成功。
2)Western Blot法检测步骤
(1)细胞总蛋白抽提(使用北京普利莱基因技术有限公司的P1250组织细胞总蛋白抽提试剂盒)：①分别将三个实验组小鼠取卵巢，每10-100mg小鼠卵巢组织剪碎后加入0.5-1mL裂解液，用高速机械12000rpm匀浆器破碎组织。②取0.5mL组织匀浆液转移到1.5mL离心管，弃去剩余的组织匀浆液，随后加入1mL抽提试剂，并充分混匀，室温静置10min，偶尔晃动。③10000g、4℃离心10min，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸除上层液体，随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。④敞开管口，干燥沉淀。
(2)SDS-PAGE：①使用多功能酶标仪波长测定A562，计算各浓度标准蛋白溶液的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程，将步骤(1)干燥沉淀后的蛋白膜进行蛋白定量(使用北京雷根生物技术有限公司的BCA蛋白定量试剂盒)；②样品制备，混合20μg步骤(1)中获得的总蛋白，与5×上样缓冲液按5:1配制，煮沸5min；③制胶点样，跑浓缩胶的电压在60-100V，约30分钟，跑分离胶的电压在100-200V，约60分钟(当溴芬蓝跑至离胶底端1-2cm左右，停止电泳，或根据具体情况调整跑胶电压与时间)；④根据蛋白Marker的分子量标准切下含有目的蛋白的胶条，选择转膜电流300mA，20min；⑤转膜结束后，用TBST轻轻冲洗膜，用5％(m/v)的脱脂奶粉室温封闭1～2h；⑥用TBST轻轻冲洗膜6次，每次5min，用TBST 1:5000稀释一抗Histone H3 tri methyl K4(购自Abcam)，4℃孵育过夜；⑦用TBST轻轻冲洗膜6次，每次5min，1:4000稀释二抗Goat anti-rabbit IgG-HRP(购自SANTA CRUZ)，室温孵育2小时；⑧用TBST轻轻冲洗膜6次，每次5min，用ECL显色试剂盒显色；⑨在暗房中观察荧光的明亮度确定曝光的时间，洗片进行显影和定影，拍照(或扫描)，采用Image Plus软件分析胶片中的蛋白条带。
实施例2
为研究H3K4me3对小鼠血液中性腺轴激素分泌和小鼠卵巢形态的影响，将36只28日龄C57BL/J6雌性小鼠分为3组(NC、Inhibitor及Agonist组)，Inhibitor组和Agonist组使用浓度为6mM的药物BCl-121和PBIT连续21d外源性腹腔注射(一次注射量为0.1mL/kg)，注射后每7d每组屠宰4只小鼠，ELISA检测小鼠血液中性腺轴激素GnRH、E2、LH及FSH的含量，HE染色观察注射药物后小鼠卵巢卵泡的形态。
结果显示，1)抑制小鼠体内H3K4me3程度能够降低的42日龄小鼠血液中GnRH的含量(图2a)；抑制小鼠体内H3K4me3程度能够降低42日龄小鼠血液中LH的含量，49日龄小鼠已经体成熟，H3K4me3程度对小鼠血液中LH的含量无明显影响(图2b)；抑制小鼠体内H3K4me3程度能够显著降低35日龄和42日龄小鼠血液中FSH的含量，与Inhibitor相比，促进小鼠体内H3K4me3程度能够持续且显著增加小鼠血液中FSH的含量(图2c)；促进或抑制小鼠体内H3K4me3程度均能够升高35、42和49日龄小鼠血液中E2的含量(图2d)。综合四种性腺轴激素检测结果，在小鼠性成熟前(49日龄前)，降低小鼠体内H3K4me3程度，能够抑制小鼠血液中GnRH和促性腺激素释放激素(LH和FSH)的分泌。2)小鼠体内H3K4me3程度降低，小鼠性成熟时(49日龄后)有腔卵泡较少；小鼠体内H3K4me3程度升高，小鼠卵巢体积较大，且当小鼠性成熟时(49日龄后)有腔卵泡较多(图3)。因此，可确认H3K4me3促进小鼠卵巢卵泡发育。
检测方法
1)ELISA检测小鼠血液中GnRH的含量
使用ELISA技术检测小鼠血液中GnRH的含量，参照小鼠促性腺激素释放激素(GnRH)ELISA试剂盒(武汉华美，货号CSB-E08152m)操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)眼球采血法收集小鼠血液，用含抗凝剂的采血管(EDTAK2)保存，将样品在4℃下凝结过夜，1000rpm离心15min，立即吸取血清，-20℃或-80℃下储存备用，待检测。
(2)设置标准品孔和样本孔，分别加入50μL标准品和血清样品，空白孔不加。
(3)用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min，弃去液体，在吸水纸上拍干，不用清洗。
(4)每孔中加入100μL 1×Biotin-antibody(1×Biotin-antibody可能出现混浊，可加热至室温，搅拌至溶液看起来均匀)，用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h，每孔加入350μL洗涤液，静置2min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次。
(5)每孔加入100μL的HRP-avidin(1×)，用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h，每孔加入350μL洗涤液，静置2min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次。
(6)每孔加入90μL TMB Substrate，37℃避光孵育15min，随后每孔加入StopSolution 50μL，轻轻晃动平板，确保充分混合。
(7)用酶标仪A450测定OD值。
2)ELISA检测小鼠血液中LH的含量
使用ELISA技术检测小鼠血液中LH的含量，参照小鼠促性腺激素释放激素(LH)ELISA试剂盒(武汉华美，货号CSB-E12770m)操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)眼球采血法收集小鼠血液，用含抗凝剂的采血管(EDTAK2)保存，将样品在4℃下凝结过夜，1000rpm离心15min，立即吸取血清，-20℃或-80℃下储存备用，待检测。
(2)设置标准品孔和样本孔，分别加入50μL标准品和血清样品，空白孔不加。
(3)每孔加入50μL HRP-conjugate，用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h。每孔加入200μL洗涤液，静置2min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次。
(4)每孔加入50μLSubstrate A和50μLSubstrate B，充分混匀。37℃避光孵育15min，随后每孔加入Stop Solution 50μL，轻轻晃动平板，确保充分混合。
(5)用酶标仪A450测定OD值。
3)ELISA检测小鼠血液中FSH的含量
使用ELISA技术检测小鼠血液中FSH的含量，参照武汉华美小鼠促性腺激素释放激素(FSH)ELISA试剂盒(CSB-E06871m)操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)眼球采血法收集小鼠血液，用含抗凝剂的采血管(EDTAK2)保存，将样品在4℃下凝结过夜，在1000rpm离心15min，立即吸取血清，储存在-20℃或-80℃下备用，待检测。
(2)设置标准品孔和样本孔，分别加入50μL标准品或样品，空白孔不加。
(3)每孔加入50μL HRP-conjugate mixed solution，空白孔不加，充分混匀，用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h。每孔加入200μL洗涤液，静置2min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次。
(4)每孔加入50μL Substrate A和50μL Substrate B，充分混匀。37℃避光孵育15min，随后每孔加入Stop Solution 50μL，轻轻晃动平板，确保充分混合。
(5)用酶标仪A450测定OD值。
4)ELISA检测小鼠血液中E2的含量
使用ELISA技术检测小鼠血液中FSH的含量，参照武汉华美小鼠促性腺激素释放激素(E2)ELISA试剂盒(CSB-E05109m)操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)眼球采血法收集小鼠血液，用含抗凝剂的采血管(EDTAK2)保存，将样品在4℃下凝结过夜，在1000rpm离心15min，立即吸取血清，储存在-20℃或-80℃下备用，待检测。
(2)设置标准品孔和样本孔，分别加入50μL标准品或样品，空白孔不加。
(3)每孔加入50μL HRP-conjugate mixed solution，空白孔不加，充分混匀，用封板膜封住反应孔，37℃孵育1h。每孔加入200μL洗涤液，静置2min，弃去液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次。
(4)每孔加入50μL Substrate A和50μL Substrate B，充分混匀。37℃避光孵育15min，随后每孔加入Stop Solution 50μL，轻轻晃动平板，确保充分混合。
(5)用酶标仪A450测定OD值。
5)组织石蜡切片
(1)取材：断头法处死小鼠，迅速取出小鼠的卵巢组织，用生理盐水立即将组织样清洗干净，投入4％的甲醛溶液中，在阴暗处固定，每个小鼠卵巢完整的包埋进一个蜡块中。
(2)脱水：材料经固定后，流水冲洗数小时，乙醇溶液(v/v)浓度梯度脱水(70％乙醇，20min；80％乙醇，20min；95％乙醇，20min；95％乙醇，420min；100％乙醇，20min；100％乙醇，20min)，每次更换乙醇溶液要将组织块用吸水纸吸干，各浓度乙醇溶液脱水时间严格控制，脱水时间过长或过短，会导致切片过软或过硬。
(3)透明：二甲苯Ⅰ溶液(100％的乙醇和二甲苯按照体积比1：1配比)将组织块浸泡20min，二甲苯Ⅱ溶液(100％的乙醇和二甲苯按照体积比1：1配比)将组织样浸泡20min，保证组织块变得透明，若出现雾状，则应重新脱水。
(4)透蜡：将组织块放入二甲苯石蜡混合液20min，透蜡2次，每次20min。
(5)包埋：向包埋盒注入少许热石蜡，待石蜡稍微凝固，用温镊子将组织块切面向下放入包埋盒中央，盖上盖子，注入适量热石蜡。插好标签，将包埋盒移动到冰箱中，数分钟后取下底盒，常温保存包埋好的组织。
(6)切片：切片厚度4-7μm，切片时刀片倾斜角度为4-6度。
(7)制片：摊片水温为45℃，选择无皱褶的组织切片捞出，用涂有甘油蛋白的玻片深入水中，将蜡片移至玻片，拨正位置后放入37℃温箱中30min，烤干后取出备用。
6)小鼠卵巢苏木素与伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色
(1)脱水及透明：将步骤(5)得到的组织切片在60℃恒温箱中烘烤20min，放入二甲苯Ⅰ中脱蜡10min，放入二甲苯Ⅱ中脱蜡10min。依次采用95％(v/v)和75％(v/v)乙醇将二甲苯各清洗5min，最后用蒸馏水清理干净。
(2)苏木素染色：放入苏木素中染色10min。使用自来水冲洗至颜色泛蓝，冲洗15min以上，用显微镜检查至颜色也为蓝色。
(3)伊红染色：再用伊红染色3min。
(4)脱水及透明：用95％(v/v)和100％(v/v)的乙醇依次脱水5min。依次在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡各10min。
(5)制片：取出玻片擦除多余的二甲苯，滴加适量树胶固封并盖片，盖片时用小镊子夹住玻片倾斜放置，缓慢下降玻片，避免产生气泡。
实施例3
为研究H3K4me3程度对H3K4me3蛋白在小鼠卵巢分布和小鼠卵巢卵泡凋亡的影响，将36只21～28日龄的C57BL/J6雌性小鼠分为3组(NC组、Inhibitor组及Agonist组)，Inhibitor组和Agonist组使用浓度为6mM的药物BCl-121和PBIT连续21d外源性腹腔注射(0.1mL/kg)。免疫组化观察49日龄小鼠卵巢卵泡中H3K4me3分布情况，TUNEL免疫荧光技术检测49日龄小鼠卵巢卵泡的凋亡情况。
结果显示，1)小鼠体内H3K4me3程度降低，分布在小鼠卵巢颗粒细胞上的H3K4me3蛋白减少；小鼠体内H3K4me3程度升高，分布在小鼠卵巢颗粒细胞上的H3K4me3蛋白增多(图4)。2)小鼠体内H3K4me3程度降低，小鼠卵巢中凋亡的卵泡减少；小鼠体内H3K4me3程度升高，小鼠卵巢中凋亡的卵泡增多(图5)。H3K4me3抑制小鼠卵巢卵泡凋亡。
检测方法
1)小鼠腹腔注射
左手固定小鼠，食指和拇指提起小鼠颈部皮肤，无名指和小拇指固定小鼠的臀部及尾部，并稍向后拉，使小鼠躯体伸展。无名指将小鼠轻轻顶起来，使小鼠腹部微微向上抬起，小鼠头部略向下倾斜。寻找小鼠大腿腿根及腹中线两端的中点，常规消毒皮肤的注射部位，将0.5mm注射器30°刺入腹腔，顺着皮下推3～5cm，刺入小鼠皮肤的瞬间可以感受到鼠皮的阻力，当阻力消失即可进行腹腔注射。注射完毕后，轻轻旋转针头后拔出，以防止药液外露；若想判断注射是否成功，可轻轻抽动刺入腹腔的针头，若无血液或肠内容物，即注射成功。
2)小鼠卵巢免疫组化
(1)脱水及透明：将实施例2步骤(5)制备的切片置于60℃恒温箱中烘烤20min，放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，放入二甲苯Ⅱ中脱蜡15min。依次在95％(v/v)和75％(v/v)乙醇中各5min清洗，最后用蒸馏水清洗。
(2)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温，再转中低火7min(美的，产品型号MM721NG1-PW)，此过程中应防止缓冲液过度蒸发。自然冷却后将玻片置于1×PBS(0.01M、pH7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)阻断内源性过氧化物酶：将切片放入3％过氧化氢溶液(双氧水:纯水体积比＝1:9)，室温避光孵育25min，将玻片置于1×PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(4)加一抗：在组化圈内滴加3％(v/v)BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加1：1000稀释好的一抗H3K4me3(Abcam，货号ab8580)，切片平放于湿盒内，4℃孵育过夜。
(5)加二抗：将玻片置于1×PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗不同种属的二抗HRP标记山羊抗兔IgG(Servicebio，货号：GB23303)，室温孵育50min。
(6)DAB显色：将玻片置于1×PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，水冲洗切片终止显色。
(7)苏木素复染：苏木素复染细胞核3min左右，水洗，苏木素分化液分化数秒，水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
(8)制片：将组织切片依次放入75％乙醇5min，85％乙醇5min，无水乙醇15min，无水乙醇5min，二甲苯I中5min脱水透明，将切片稍晾干，中性树胶封片。
(9)显微镜镜检：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。
3)小鼠卵巢卵泡凋亡检测
使用TUNEL免疫荧光技术检测小鼠卵巢卵泡凋亡的情况，参照Roche的Tunel试剂盒(货号：11684817910)操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)脱水及透明：将实施例2步骤(5)制备的石蜡组织切片在60℃恒温箱中烘烤20min，依次放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇5min，无水乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，最后用蒸馏水清洗干净。
(2)修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃温箱孵育25min。将玻片置于1×PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于1×PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(4)加试剂1-2：取TUNEL试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)，按体积比1：9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育3h，湿盒内加少量水保持湿度。
(5)DAPI复染细胞核：切片用1×PBS洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
(6)封片：玻片置于1×PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
(7)镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，Roche试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿色。
实施例4
为研究H3K4me3程度对小鼠产仔性能的影响，将9只21～28日龄的C57BL/J6雌性小鼠分为3组(NC组、Inhibitor组及Agonist组)，Inhibitor组和Agonist组使用6mM药物BCl-121和PBIT连续21d外源性腹腔注射(0.1mL/kg)。记录各组小鼠前三胎的总产仔数及窝产仔重。
结果如图6所示，与降低小鼠体内H3K4me3程度相比，升高H3K4me3程度能够显著提高小鼠的窝产仔数，且第三胎时H3K4me3能够显著增加母鼠的窝产仔数(图6a)。与降低小鼠体内H3K4me3程度相比，升高H3K4me3程度能够显著增加小鼠前三胎的产仔窝重，且第三胎时H3K4me3能够显著增加母鼠的产仔窝重(图6b)。因此，升高H3K4me3程度能够增加小鼠的窝产仔数和产仔窝重。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.组蛋白甲基化H3K4me3的激动剂在制备调控小鼠卵巢发育的药物中的应用，其特征在于：
所述的调控为通过升高组蛋白甲基化H3K4me3程度能够增加小鼠的窝产仔数和产仔窝重。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组蛋白甲基化H3K4me3的激动剂为PBIT。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PBIT的使用方式为皮下注射浓度为6 mM、一次注射量为0.1 mL/kg的PBIT。
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