CN104894075B - CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用；该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统同时高效地将GFP基因和mCherry基因分别重组到伪狂犬病毒gE基因和TK基因位点，得到gE基因和TK基因的条件性缺失毒株。纯化后，再利用Cre/lox系统将伪狂犬病毒重组毒基因组中的外源GFP和mCherry基因切除，进而快速纯化得到缺失gE/TK双基因缺失的伪狂犬病毒活疫苗。对多基因同时进行操作，将传统方法中多基因敲除的多轮流程，缩减到一轮；同时，CRISPR/Cas9和Cre/lox系统对病毒基因的高效率编辑，将三十代左右的空斑纯化过程，简化到3‑4代，大幅提高了病毒疫苗制备的效率，是有效防控变异伪狂犬病毒更大范围流行和减少重大经济损失的有力保证。
Description
技术领域
本发明涉及预防兽医学领域，具体地指一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用。
背景技术
伪狂犬病毒是α-疱疹病毒成员，基因组由DNA双链组成。伪狂犬病毒能诱发多种家畜和野生动物的急性传染病，引起发热、奇痒、脑脊髓炎等症状[1]。该病毒的天然宿主是猪，且能感染各年龄段猪，是危害我国和世界生猪养殖业最重要的病原之一。疫苗接种是伪狂犬病最有效的防控手段，目前市面上有多种商业化的伪狂犬病毒疫苗——弱毒疫苗、灭活疫苗和多基因缺失活疫苗。其中多基因缺失活疫苗较之其他疫苗更高效更安全，因此得到了更广泛的应用。陈焕春等构建的TK/gG双基因缺失疫苗[2]、郭万柱等构建的TK/gE/gI三基因缺失疫苗[4]，在近二十年来有效控制了伪狂犬病在我国的流行，为提高生猪养殖业的效益做出了巨大贡献。
而近三年来，伪狂犬病又有卷土重来的态势，先后在华北华中多个地区省份继续发生和流行，已有初步的研究表明，与以往毒株相比，新的毒株的抗原性发生变异，且对仔猪有更强的致病力[11,12]。由此可见，伪狂犬病毒的变异也是该病防控工作中需要面临的一大突出问题，因此在研发出能彻底根治伪狂犬病的特效药物之前，建立一种高效快捷的伪狂犬病毒多基因缺失活疫苗的构建方法，是有效防控变异伪狂犬病毒更大范围流行和减少重大经济损失的有力保证。
Cas9蛋白是一种DNA内切酶，能在引导RNA的引导下结合到与引导RNA互补配对的DNA序列位点，并发挥DNA内切活性，切断DNA双链。CRISPR/Cas9系统作为一种高效的基因编辑技术，被science和nature评为2013年科学十大进展之一[10]，但在医疗临床实践和农林业生产等方面，特别是在预防兽医领域还未得到实质应用。目前这项技术在多个物种上都有了相关研究[5,6,7]，而其针对伪狂犬病毒这种与人类经济活动息息相关的高传染性和强致病力的病毒病原，能否发挥多基因敲入的功能，还未有相关报道。
Cre重组酶蛋白同时具有DNA内切酶和重组酶活性，能特异性识别几种34bp的反向重复的lox序列，如loxP、loxN、lox2272等[9]。若同种同向的一对lox片段分别位于目的基因两端，Cre酶可以将成对lox序列之间的目的基因和其中一个lox序列切除[8]。利用这种特性，将一种(或多种)同向成对的lox序列放到一个(或多个)外源筛选基因两端，敲入到病毒的一个(或多个)毒力基因位点，完成目的毒力基因的条件性敲除之后，可以再用Cre重组酶高效切除外源筛选基因得到一个(或多个)基因缺失毒株[3]。然而由于缺乏有力的基因敲入工具，Cre/lox系统作为一种高效的基因敲除工具并没能在病毒疫苗的制备中得到广泛应用。也没有利用Cre/lox系统来一步实现多基因敲除，以制备多基因缺失疫苗的报道。
参考文献
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5、Blackburn P R，Campbell J M，CLARK K J，et al.TheCRISPR system-keepingzebrafish gene targeting fresh[J].Zebrafish，2013，10:116-118.
6、Chang N，Sun C，GaoL，et al.Genome editing with RNAguided Cas9nucleasein zebrafish embryos[J].Cell Research，2013，23:465-472.
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9、Missirlis，P.I.Smailus，D.E.Holt，R.A，et al.A high-throughput screenidentifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacerregion in Cre-mediated recombination[J].BMC Genomics，2006，7:73.
10、Pennisi E.The CRISPR craze[J].Science，2013，341(6148):833-6.
11、Shengke Chang，Xuke Zhang，et.al.Emergence of virulent pseudorabiesvirus infection in Northern China[J].Vet.Sci.(2013),14(3),363-365.
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发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法，包括以下步骤：
1)根据伪狂犬病毒目的基因基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA；再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列；
2)将目的基因的sgRNA双链寡聚核苷酸与线性化的质粒载体连接，转化提取得到目的基因的sgRNA表达载体；
3)靶向伪狂犬病毒目的基因的外源筛选基因同源重组片段的构建；
a、体外扩增伪狂犬病毒目的基因上游同源臂hm1和下游同源臂hm2，纯化；
b、体外扩增外源筛选基因，并将扩增外源筛选基因插入含有同向成对的lox序列的线性化的载体内；
c、PCR体外扩增得到lox-外源筛选基因-lox片段，再进行融合PCR扩增得到hm1-lox-外源筛选基因-lox-hm2片段；
4)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将hm1-lox-外源筛选基因-lox-hm2片段与目的基因的sgRNA表达载体混合转染，得到转染细胞；
5)将转染细胞感染伪狂犬病毒野毒株，得到伪狂犬病毒多基因重组病毒，并纯化。
6)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将Cre/lox系统表达质粒进行转染，得到转染细胞；
7)将转染细胞感染伪狂犬病毒多基因重组病毒，得到伪狂犬病毒多基因缺失病毒，纯化得到伪狂犬病毒多基因缺失疫苗株。
进一步地，所述步骤1)中，sgRNA在目的基因上的靶序列符合5’-GN(20)GG、5’-GN(18)GG、5’-GN(17)GG、5’-N(21)GG、5’-N(20)GG或者5’-N(19)GG的序列排列规则。
再进一步地，所述步骤1)中，设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列在其正向寡核苷酸Forward oligo 5’端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5’端加上AAA，设计得到一对引物：
Forward oligo：5’–CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。
再进一步地，所述步骤步骤3)中，第b小步中，lox序列为34bp的反向重复的lox序列，lox序列为loxP、loxN和lox2272中任意一种。
本发明还提供了一种利用上述方法制备缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株，包括以下步骤：
1)分离和纯化野生型伪狂犬病毒；
2)伪狂犬病毒gE基因和TK基因sgRNA的设计；分别在gE基因和TK基因上选择符合5’-GN(20)GG、5’-GN(18)GG、5’-GN(17)GG、5’-N(21)GG、5’-N(20)GG或者5’-N(19)GG的序列规则的位点；通过BLAST工具比对确定gE-sgRNA(SEQ ID NO.1)和TK-sgRNA(SEQ ID NO.2)的序列；
3)将gE-sgRNA双链寡核苷酸和TK-sgRNA双链寡核苷酸分别连接到Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体中
分别在gE-sgRNA和TK-sgRNA的序列基础上，在正向寡核苷酸Forward oligo 5’端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5’端加上AAA，
设计得到一对单链寡聚核苷酸：
Forward oligo：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’；
分别合成gE-sgRNA双链寡核苷酸和TK-sgRNA双链寡核苷酸；成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链，可连入经Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体(SEQ IDNO.3)中；得到连接产物；
4)将上述连接产物转化感受态细胞，挑选单克隆菌落；DNA测序鉴定阳性克隆；培养阳性克隆并提取质粒，分别得到gE-sgRNA和TK-sgRNA的表达载体；
5)在体外扩增伪狂犬病毒gE基因上游同源臂gEhm1(SEQ ID NO.4)和下游同源臂gEhm2(SEQ ID NO.5)，纯化回收、PCR验证；
6)在体外扩增伪狂犬病毒TK基因上游同源臂TKhm1(SEQ ID NO.6)和下游同源臂TKhm2(SEQ ID NO.7)纯化回收、PCR验证；
7)在体外扩增GFP基因(SEQ ID NO.8)和mCherry基因(SEQ ID NO.9)，纯化回收，PCR验证；
8)将上述得到的GFP基因和mCherry基因分别插入线性化的loxP载体和线性化的loxN载体中，PCR扩增分别得到loxP-GFP-loxP片段和loxN-mCherry-loxN片段；
9)融合PCR扩增分别得到gEhm1-loxP-GFP-loxP-gEhm2(SEQ ID NO.10)和TKhm1-loxN-mCherry-loxN-TKhm2(SEQ ID NO.11)；
10)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将同源重组片段与sgRNA表达载体混合转染；
11)转染细胞孵育完成后，感染伪狂犬病毒野毒株，纯化得到重组伪狂犬病毒；
12)按磷酸钙转染法或脂质体转染法，将上述纯化的重组伪狂犬病毒转染Cre重组酶表达载体，纯化后得到缺失gE基因和TK基因的双缺失伪狂犬病毒毒株，即为伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株。
进一步地，所述步骤10)中，转染量比例为：gEhm1-loxP-GFP-loxP-gEhm2片段、TKhm1-loxN-mCherry-loxN-TKhm2片段、gE-sgRNA载体和TK-sgRNA载体＝0.5︰0.5︰2︰2。
再进一步地，所述伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的基因组序列上敲除gE基因和TK基因，并对应插入一个loxP序列和一个lox序列。
本发明还提供了一种利用伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株预防伪狂犬病毒的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用，该伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的总体流程包括了筛选基因的敲入、重组病毒的纯化，筛选基因的敲除，基因缺失病毒的纯化四个步骤。而传统方法由于技术限制只能进行单基因操作，在多基因缺失疫苗的制备过程中，需要经历多个繁琐的重复流程。而本发明将CRISPR/Cas9高效基因编辑技术与Cre/lox重组系统结合起来，实现一步敲除伪狂犬病毒多个毒力基因以制备伪狂犬病毒的多基因缺失疫苗的方法，与单个基因逐轮敲除的传统方法相比，将多轮“敲入、纯化、敲除、纯化”的流程缩减到一轮；同时，CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统的高效率，也让病毒纯化过程中至少30代左右的空斑筛选，减至3-4代。因此大大缩短了操作步骤和时间，为控制变异毒株的流行爆发争取必要时机，也在很大程度上提高了疫苗商业化生产的效益，同时减少生猪养殖产业的病害损失。
附图说明
图1为基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑制备缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的流程示意图；
图中，A、利用CRISPR/Cas9基因编辑系统同时将GFP基因(绿色荧光蛋白)和mCherry基因(红色荧光蛋白)分别高效重组到伪狂犬病毒gE基因和TK基因位点，得到gE基因和TK基因的条件性缺失毒株；
B、挑斑纯化，得到纯化的伪狂犬病毒重组毒株之后，再利用Cre/lox系统同时将伪狂犬病毒重组毒基因组中的外源GFP基因和mCherry基因高效切除，进而快速纯化得到缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株。
图2为靶向伪狂犬病毒gE基因的sgRNA/Cas9表达载体示意图；
图3为靶向伪狂犬病毒TK基因的sgRNA/Cas9表达载体示意图；
图4为GFP基因连入线性化的loxP载体示意图；
图5为mCherry及基因连入线性化的loxN载体示意图；
图6为验证重组伪狂犬病毒的的示意图；
图7为纯化表达红绿双色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒的荧光显微镜示意图；
图8为PCR鉴定伪狂犬病毒重组毒株的纯化图。
图中，A、PCR扩增鉴定结果显示，此轮纯化之后gE基因全部敲除，而TK基因还有部分没纯化；B、再次挑斑纯化之后，PCR鉴定结果显示TK基因全部敲除，得到gE基因和TK基因条件性敲除的重组病毒。
图9为纯化缺失荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒的荧光显微镜示意图；
图10为PCR扩增鉴定图；
图11为小鼠攻毒试验中各组小鼠存活率示意图。
图12为仔猪攻毒试验中，攻毒之后，双基因编辑病毒疫苗组与对照组每天平均体温趋势对比图。
图13为仔猪攻毒试验中，攻毒之后，双基因编辑病毒疫苗组与对照组的平均日增重对比图。
图14为仔猪攻毒试验中，攻毒之后，双基因编辑病毒疫苗组与对照组的每天血清中的伪狂犬病毒gB蛋白检测对照图。
图15为仔猪攻毒试验中，双基因编辑病毒疫苗组与对照组猪只的存活率对比图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的制备
1、野生型伪狂犬病毒的分离与纯化
2、伪狂犬病毒gE基因和TK基因sgRNA的设计
在gE基因和TK基因上选择5’-GN(20)GG、5’-GN(18)GG、5’-GN(17)GG、5’-N(21)GG、5’-N(20)GG或者5’-N(19)GG的序列位点，通过BLAST工具比对确定，所选的sgRNA靶标序列在病毒基因组中唯一位点，尽量避免脱靶的可能性，gE-sgRNA和TK-sgRNA的序列分别为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2；
3、伪狂犬病毒gE基因和TK基因sgRNA表达载体的构建
分别在gE-sgRNA和TK-sgRNA的序列基础上，在其正向寡核苷酸Forward oligo 5’端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5’端加上AAA，设计单链寡聚核苷酸：
Forward oligo：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’；
分别合成gE-sgRNA双链寡核苷酸和TK-sgRNA双链寡核苷酸；其序列如下：
成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链，可连入经Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体(SEQ ID NO.3)中；得到连接产物；
变性、退火体系如下：
反应程序：
反应体系250倍稀释后，4℃保存备用。
Bbs1酶切线性化U6启动子真核表达载体的酶切体系和反应条件如下：
37℃孵育3～4h。
酶切完成后，琼脂糖凝脂电泳后，BioFluxR胶回收试剂盒回收，溶于30～40μLddH2O中。
将变性退火得到的TK-sgRNA、gE-sgRNA双链寡聚核苷酸，分别与经Bbs1酶切线性化的质粒载体连接。
反应体系如下：
16℃孵育1～3h。
将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)，并涂布氨苄抗性平板(50μg/ml)，并挑取单克隆菌落。
利用U6启动子通用引物(gactatcatatgcttaccgt)，DNA测序鉴定阳性克隆；
37℃摇床培养阳性克隆12～16h，提取质粒，得到gE-sgRNA和TK-sgRNA的表达载体，如图2和图3所示；
4、靶向伪狂犬病毒gE基因和TK基因的外源筛选基因同源重组片段的构建
a)体外扩增伪狂犬病毒gE基因上游同源臂gEhm1和下游同源臂gEhm2，纯化回收序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
反应体系如下：
反应程序：
b)体外扩增伪狂犬病毒TK基因上游同源臂TKhm1和下游同源臂TKhm2，纯化回收序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
反应体系如下：
反应程序：
c)体外扩增GFP基因，纯化回收，序列如SEQ ID NO.8所示；
反应体系如下：
反应程序：
d)体外扩增mCherry基因，纯化回收，序列如SEQ ID NO.9所示；
反应程序：
e)酶切连接将GFP基因连入线性化的loxP载体，如图4所示；
f)酶切连接将mCherry基因连入线性化的loxN载体，如图5所示；
g)PRC体外扩增得到loxP-GFP-loxP片段；
反应条件：
反应程序：
h)PCR体外扩增得到loxN-mCherry-loxN片段；
反应程序：
i)融合PCR扩增得到gEhm1-loxP-GFP-loxP-gEhm2，序列如SEQ ID NO.10所示；融合PCR扩增得到TKhm1-loxN-mCherry-loxN-TKhm2，序列如SEQ ID NO.11所示；
反应条件
反应程序：
5、细胞培养和CRISPR/Cas9系统的转染
a)将293T细胞置于1640培养基进行培养(含胎牛血清10％、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml)；待细胞长满后，胰酶消化、吹散，接种于12孔板，待细胞汇合度到70～80％后进行转染；
b)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将同源重组片段与sgRNA表达载体混合转染，
优选的，转染量比例为：gEhm1-loxP-GFP-loxP-gEhm2片段、TKhm1-loxN-mCherry-loxN-TKhm2片段、gE-sgRNA载体和TK-sgRNA载体＝0.5︰0.5︰2︰2，300μL转染液37℃孵育6～8h；
6、病毒的感染和重组
a)转染细胞孵育完成后，感染伪狂犬病毒野毒株(moi＝0.1、1和10)，300μL病毒液37℃孵育1h后补液；
b)培养18～36h后，在显微镜下观察，出现有红色和绿色两种荧光的细胞病变斑之后，收取细胞液，液氮反复冻融3次，离心后取上清，-80℃保存，如图(6)所示：
gE-sgRNA、TK-sgRNA、gE基因同源重组片段、TK基因同源重组片段共转染293T细胞后，8-12h后接种伪狂犬病毒，18-24h在荧光显微镜下可观察到同时显示绿色荧光(GFP)和红色荧光(mCherry)的细胞病变斑(图D)，红箭头指示细胞病变斑(图C)。
7、重组伪狂犬病毒的纯化
a)将PK-15细胞置于用DMEM培养基中进行培养(含胎牛血清10％、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)；待细胞长满后细胞长满后，胰酶消化、吹散，接种于6孔板。待细胞汇合度到80-90％后，接种初代重组毒；
b)然后按不同稀释梯度接种初代重组毒(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，600μL稀释病毒液37℃孵育1h；
c)孵育完成后吸弃培养液，将2×DMEM(4％胎牛血清，青霉素200U/ml和链霉素200U/ml)与1.6％的低熔点琼脂糖等体积混匀，每孔覆盖2.5～3mL，置于4℃10min使琼脂糖完全凝固后，37℃CO2培养箱培养；
d)48～72h后，在荧光显微镜下观察显绿色和红色两种荧光的噬斑，挑取噬斑融入200μL的DMEM无血清培养基，液氮反复冻融3次后，再接种长满PK细胞的12孔板，扩增病毒，如图(7)所示：
利用琼脂糖培养板，在荧光显微镜下挑取同时显示绿色荧光(GFP)和红色荧光(mCherry)的单克隆细胞空斑(图7D)；
f)80％细胞出现病变之后，收取细胞液，液氮反复冻融3次，继续接种低熔点琼脂糖培养板、挑斑；
8、PCR鉴定重组毒的纯化
挑斑3-4代后，提病毒基因组进行PCR鉴定，根据鉴定结果确定是否继续下一轮纯化，鉴定引物序列如下所示。
具体步骤如下：
a)收获细胞病毒液，冻融3次后，吸取200μL病毒液，加入细胞裂解液(10μL10％SDS，10μL0.1mol/LEDTA，1μL蛋白酶K)，混匀后58℃孵育2h，剩余细胞病毒液置于-80℃保存；
b)用等体积的酚︰氯仿︰异丙醇(25︰24︰1)抽提2次，12000r/min离心10min；
c)上清加3moL/L醋酸钠20μL和无水乙醇500μL，-20℃作用30min；
d)12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗1次，真空干燥；
e)沉淀溶解于30～50μL灭菌ddH2O，作为PCR鉴定反应的模板；
f)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经鉴定伪狂犬病毒gE基因和TK基因都为阴性，而能扩出gEhm和TKhm，表明重组毒已经纯化，用PK-15细胞扩大培养后，-80℃保存，如图(8)所示：
8、Cre/lox系统的转染和双基因缺失毒株的获取
a)用12孔板接种293T细胞，待汇合度至70～80％，按磷酸钙转染法或脂质体转染法转染Cre重组酶表达载体，300μL转染液体系37℃孵育6～8h；
b)吸弃转染液，细胞培养6-12后，按不同MOI接种已纯化的伪狂犬病毒重组毒(moi＝0.1、1或10)，300μL病毒液37℃孵育1h后，培养液补加700μL培养液继续培养；
c)培养24～36h后，Cre重组酶的作用能将GFP基因和mCherry基因从伪狂犬病毒重组毒基因组中切除，在荧光显微镜下能观察到不显绿色荧光(GFP)和红色荧光(mCherry)的细胞病变斑，收取细胞病毒液，液氮反复冻融3次，离心后收上清；
d)按不同稀释梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)在长满PK-15细胞的6孔板接种病毒液，600μL病毒液37℃孵育1h；
e)孵育完成后吸弃培养液，将DMEM(4％胎牛血清，青霉素200U/mL和链霉素200U/mL)与1.6％的低熔点琼脂糖等体积混匀，每孔覆盖2.5～3mL，置于4℃10min使琼脂糖完全凝固后，37℃CO2培养箱培养；
f)48～72h后，在荧光显微镜下观察到不显红色荧光和红色荧光的噬斑，挑取噬斑融入200μL无血清DMEM培养基，液氮反复冻融3次后，再接种长满PK细胞的12孔板，扩增病毒；
g)80％细胞出现病变之后，收取细胞液，液氮反复冻融3次，继续接种低熔点琼脂糖培养板、挑斑；挑斑3～4代后，确定在荧光显微镜下再看不到荧光，提病毒基因组进行PCR鉴定；具体步骤如下：
(1)收获细胞病毒液，冻融3次后，吸取200μL病毒液，加入细胞裂解液(10μL10％SDS，10μL0.1moL/LEDTA，1μL Proteinase K)，混匀后58℃孵育2h。(剩余细胞病毒液置于-80℃保存)；
(2)用等体积的酚︰氯仿︰异丙醇(25︰24︰1)抽提2次，12000r/min离心10min；
(3)上清加3moL/L醋酸钠20μL和无水乙醇500μL，-20℃作用30min；
(4)12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗1次，真空干燥；
(5)沉淀溶解于30～50μL灭菌ddH2O，作为PCR鉴定反应的模板；
(6)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经鉴定伪狂犬病毒gE基因和TK基因都为阴性，而能扩出gEhm和TKhm，表明已纯化得到伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株，用PK-15细胞扩大培养后，-80℃保存，如图(9)所示：
结果显示1号和3号样品gE基因检测引物和TK基因检测引物都没有扩出条带，说明得到gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株。
实施例2伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株PRV-HNX-gE-/TK-动物攻毒试验
1、小鼠攻毒试验
1)试验鼠从武汉市湖北省疾控中心购得5周龄C57小鼠。
2)15只C57试验小鼠分3组，每组5只，分别右大腿皮下注射等体积量DMEM细胞培养液、PRV-HNX病毒液104.7TCID50、PRV-HNX-gE-/TK-疫苗株104.7TCID50，并分别记为DMEM组、PRV-HNX组和PRV-HNX-gE-/TK-组。
3)48～96h后，PRV-HNX组小鼠发病死亡，DMEM组和PRV-HNX-gE-/TK-组小鼠健康存活。
4)14天后，DMEM组和PRV-HNX-gE-/TK-组，左大腿皮下注射104.7TCID50的PRV-HNX。
5)48～96h后，DMEM组小鼠发病死亡，PRV-HNX-gE-/TK-组小鼠健康存活，如图(10)所示。
结果显示：三组小鼠分别注射100ul等体积量DMEM细胞培养液、PRV-HNX病毒液104.7TCID50、PRV-HNX-gE-/TK-疫苗株104.7TCID50，并分别记为DMEM组、PRV-HNX组和PRV-HNX-gE-/TK-组。2～4天后PRV-HNX组小鼠全部发病死亡，DMEM组和PRV-HNX-gE-/TK-组全部存活，两周后，剩余小鼠全部注射100μL等体积量PRV-HNX病毒液104pfu，2～4天后DMEM组小鼠全部发病死亡，PRV-HNX-gE-/TK-组小鼠全部健康存活。此试验，初步表明了PRV-HNX-gE-/TK-的安全性和保护性。
2、仔猪免疫试验1)30日龄左右gB、gE抗体阴性猪16头，8头一组，分别接种PRV-HNX-TK-/gE-和等体积量DMEN，分别记为PRV-HNX-TK-/gE-组和DMEM组。
2)3周(21天)后，进行二次免疫。
3)第22天，108.0/mLTCID50的野毒株(PRV-CW)进行攻毒。
4)免疫后间隔一周采血检测gB，gE抗体，如图11所示，gE抗体全部为阴性，结果未展出。
5)攻毒后每天检测猪只的体温情况，图12所示。
6)攻毒后每天检测猪只日增重情况，如图13所示。
7)免疫时未见猪只出现应激反应，攻毒后第2天，各组均有猪只出现发烧，免疫组持续约6天左右，空白组持续至第8天。
8)第5天开始DMEM组出现猪只死亡以及神经症状，PRV-HNX-TK-/gE-组则无，如图14所示。
9)免疫组(PRV-HNX-TK-/gE-组)发烧持续时间少于空白组(DMEM组)，攻毒后平均日增重与空白组也存在显著差异，并且免疫组未出现猪只死亡的现象，表明新毒株弱毒疫苗的免疫可以很好的对猪只进行保护。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (3)
1.制备缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)分离和纯化野生型伪狂犬病毒；
2)伪狂犬病毒gE基因和TK基因sgRNA的设计；分别在gE基因和TK基因上选择符合5’-GN(20)GG、5’-GN(18)GG、5’-GN(17)GG、5’-N(21)GG、5’-N(20)GG或者5’-N(19)GG的序列规则的位点；通过BLAST工具比对，确定gE-sgRNA序列SEQ ID NO.1和TK-sgRNA序列SEQ IDNO.2；
3)将gE-sgRNA双链寡核苷酸和TK-sgRNA双链寡核苷酸分别连接到Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体中：
分别在gE-sgRNA和TK-sgRNA的序列基础上，在正向寡核苷酸Forward oligo 5’端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5’端加上AAA，
设计得到一对单链寡聚核苷酸：
Forward oligo：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’；
分别合成gE-sgRNA双链寡核苷酸和TK-sgRNA双链寡核苷酸；成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链，可连入经Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体中，其序列为SEQ ID NO.3；得到连接产物；
4)将上述连接产物转化感受态细胞，挑选单克隆菌落；DNA测序鉴定阳性克隆；培养阳性克隆并提取质粒，分别得到gE-sgRNA和TK-sgRNA的表达载体；
5)在体外扩增伪狂犬病毒gE基因上游同源臂gEhm1序列SEQ ID NO.4和下游同源臂gEhm2序列SEQ ID NO.5，纯化回收、PCR验证；
6)在体外扩增伪狂犬病毒TK基因上游同源臂TKhm1序列SEQ ID NO.6和下游同源臂TKhm2序列SEQ ID NO.7纯化回收、PCR验证；
7)在体外扩增GFP基因序列SEQ ID NO.8和mCherry基因序列SEQ ID NO.9，纯化回收，PCR验证；
8)将上述得到的GFP基因和mCherry基因分别插入线性化的loxP载体和线性化的loxN载体中，PCR扩增分别得到loxP-GFP-loxP片段和loxN-mCherry-loxN片段；
9)融合PCR扩增分别得到gEhm1-loxP-GFP-loxP-gEhm2序列SEQ ID NO.10和TKhm1-loxN-mCherry-loxN-TKhm2序列SEQ ID NO.11；
10)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将同源重组片段与sgRNA表达载体混合转染；其中，
转染量比例为：gEhm1-loxP-GFP-loxP-gEhm2片段、TKhm1-loxN-mCherry-loxN-TKhm2片段、gE-sgRNA载体和TK-sgRNA载体＝0.5︰0.5︰2︰2；
11)转染细胞孵育完成后，感染伪狂犬病毒野毒株，纯化得到重组伪狂犬病毒；
12)按磷酸钙转染法或脂质体转染法，将Cre重组酶表达载体转染293T细胞，12h后感染重组伪狂犬病毒得到伪狂犬双基因缺失毒，纯化后得到缺失gE基因和TK基因的双缺少伪狂犬病毒毒株，即伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株。
2.根据权利要求1所述制备缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的方法，其特征在于：所述伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的基因组序列上敲除gE基因和TK基因，并对应插入loxN序列和loxP序列。
3.利用权利要求1所述的方法制备得到的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株在制备预防伪狂犬病毒的药品中的应用。
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