CN106011104B - 利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法。本发明提供了蛋白组,将Cas9蛋白氨基酸序列从第不同位点拆分,形成两段蛋白组成蛋白组;本发明的实验证明了,Intein介导的拆分的Ca9系统可以高效的实现基因编辑与基因线路的转录激活调控。本发明提供了运用拆分的Cas9系统结合肿瘤细胞特异性启动子可以进行膀胱癌细胞特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法。
背景技术
基因编辑和基因表达调控是靶向基因治疗领域的关键技术。由RNA引导的CRISPR/Cas9系统自2013年起已经成为基因组编辑的新工具,并且由于其载体构建过程相较于另外两种编辑工具TALE、锌指蛋白更为方便,受到该领域研究者的追捧。CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats成簇的规律间隔短回文重复序列)是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR/Cas系统广泛分布于细菌和古生菌基因组中,是在进化过程中形成的一种适应性免疫系统,可以降解入侵病毒或质粒DNA。在这一系统中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA,诱导细胞利用自身的非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining,NHEJ),引起切割位点的DNA插入或缺失导致目标基因功能失活。
在CRISPR II型系统中,Cas9基因是参与CRISPR免疫系统的唯一必需基因,是目前最常用来工程改造人工核酸酶的系统。其中,Cas9是一个由1409氨基酸组成的多结构域蛋白,含有2个核酸酶结构域,即氨基端的RuvC-like结构域,以及位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链,切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif,PAM)上游3nt处,RuvC-like结构域可以对另一条链进行切割,切割位点位于PAM上游3-8nt处。在crRNA与tracrRNA形成的双链RNA的指导下,Cas9蛋白对靶位点进行切割。为了方便使用,在人工构建的CRISPR/Cas9系统中,将tracrRNA和crRNA融合为一条,称为guide RNA(gRNA)。
另外,可以在核酸酶活性结构域中引入点突变,使Cas9蛋白部分丧失或者完全丧失核酸酶的活性。当Cas9的RuvC或者HNH结构域中引入突变时,Cas9可被改造成为双链DNA切口酶(nickase)nCas9。已有报告利用nCas9与两条不同的gRNA联用可用于较大片段的置换,也可增强编辑的特异性;当RuvC和HNH两个结构域同时引入突变时,Cas9内切活性丧失,成为dCas9(deactivated Cas9),然而dCas9仍能与DNA靶位点结合。当dCas9结合在目的基因的启动子区域或转录起始位点附近区域时,可能由于空间位阻效应阻挡了转录因子或RNA聚合酶与DNA的结合,从而抑制目的基因的转录。另外,dCas9也可以与转录调控作用域融合,成为人工转录因子。例如,dCas9与KRAB转录抑制作用域融合成为dCas9-KRAB,可有效抑制靶基因表达,即CRISPRi(CRISPR interference)技术;dCas9也可与转录激活作用域VP64融合成为dCas9-VP64,可有效激活靶基因表达。
基因拆分技术是建立在蛋白内含肽Intein及其介导的蛋白剪接作用的基础上发展起来的,一般采用将目的基因拆分成两个编码蛋白的基因片段,分别与Intein两个剪接域的基因序列结合,形成融合基因,翻译后形融合蛋白,单独存在不具备蛋白质活性,只有通过Intein介导的蛋白剪接功能,将Intein从前体蛋白中切除,使两个基因片段编码的蛋白序列连接起来,形成一个完整的、有功能的蛋白。
具体而言,Intein是一类介导翻译后蛋白剪接的内部蛋白元件,其作用类似于在RNA加 工过程中被剪除的内含子,位于多肽序列中间,经加工切除后,两端的Extein(蛋白质外显子)连接为成熟的蛋白质分子。其序列显示在两个剪接结合点处存在高度保守的蛋白序列:Intein N末端有一个保守的半胱氨酸或丝氨酸,InteinC末端有保守的组氨酸-天门冬酰胺序列,Extein的C前面往往有胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸作为第一氨基酸残基。这些保守的氨基酸残基直接参与催化融合蛋白的肽键断裂剪切和拆分蛋白之间的肽键连接作用。当InteinC端与InteinN端相遇时,拆分的前体蛋白中的Intein作用域催化一系列反应,将其自身从前体蛋白中移去,并将两侧称为Extein的蛋白片段以正常的肽键连接起来形成成熟蛋白,该过程即为蛋白剪接。
尽管CRISPR/Cas9技术的出现使基因编辑与基因表达调控更易实现,然而Cas9基因编码区约有4kb,加上启动子等其他序列,一个完整的可在细胞内表达的Cas9基因表达单元往往需要5-6kb的大小,然而质粒越大越难转染,影响使用该系统的场景及效率。如果能成功使用基因拆分技术,将Cas9蛋白拆分为两段,利用蛋白剪接机制使其在转染之后融合为完整的蛋白,则可解决转染难度问题,扩大使用范围,提高效率。此外,拆分后的Cas9蛋白可以构成逻辑与门,只有其N端和C端同时表达时才会实现其功能,为逻辑基因线路提供通用元件。除拆分一个种系的Cas9蛋白外,还可以拆分重组不同种系的Cas9蛋白,形成新的Cas9蛋白系统,构建正交的Cas9系统。已有研究人员尝试拆分Cas9蛋白,利用在雷帕霉素诱导下FRB与FKBP形成的异源二聚体使其重组成完整的Cas9蛋白,或者在不加任何作用域的条件下利用gRNA使拆分的Cas9蛋白重组成有活性的Cas9蛋白。然而这两种拆分系统所获得的Cas9基因编辑效率还比较低,需要进一步完善提高重组后Cas9的活性。
膀胱癌是威胁人类健康的杀手之一,特异性识别癌症细胞,进行特异性鉴定、识别、杀伤癌症细胞成为日益普及的生物治疗方法。该类方法一般选择肿瘤特异性的标志物如在其中活性较高的启动子,例如hTRET(人端粒酶逆转录酶)启动子在肿瘤中有较高活性,而在正常细胞中活性较低,hupII(human UroplakinII)启动子在膀胱癌细胞中可以启动相应基因表达,而在其他细胞中则不表达。
发明内容
本发明的目的是利用Cas9蛋白功能作用域的可拆分特性,将一个Cas9基因的编码区域拆分成N端和C端两个片段(Cas9N和Cas9C),分别与蛋白内含子InteinN和InteinC融合,在细胞内由Intein结构域催化蛋白剪切,使其在细胞内重新结合成完整的Cas9蛋白,继而进行基因编辑和基因表达调控。本发明实施例中使用的Cas9蛋白来自化脓链球菌,即为SpCas9。
本发明的一个目的是提供蛋白组,是利用Cas9可拆分的性质,在其柔性位置,将其拆分成两段,本发明实现在Cas9蛋白序列第204、第469、第714以及第1154个氨基酸的位置拆分,该拆分可以在内含肽可变剪接功能下在细胞内重新组成完整的Cas9蛋白。
本发明提供的蛋白组,为如下1)-4)中任一种:
1)由蛋白Cas9N204和蛋白Cas9C204组成;
所述蛋白Cas9N204和所述蛋白Cas9C204是将Cas9蛋白氨基酸序列从第203和204位之间拆分,形成的两段蛋白;
2)由蛋白Cas9N469和蛋白Cas9C469组成;
所述Cas9N469和蛋白Cas9C469是将Cas9蛋白氨基酸序列从第468-469位之间拆分,形成的两段蛋白;
3)由蛋白蛋白Cas9N714和蛋白Cas9C714组成;
所述蛋白Cas9N714和蛋白Cas9C714是将Cas9蛋白氨基酸序列从第713-714位之间拆分,形成的两段蛋白;
4)由蛋白Cas9N1154和蛋白Cas9C1154组成;
所述蛋白Cas9N1154和蛋白Cas9C1154是将Cas9蛋白氨基酸序列从第1153-1154位之间拆分,形成的两段蛋白。
上述蛋白组中,所述Cas9蛋白为SpCas9或dCas9;所述SpCas9的氨基酸序列为序列表中序列2,所述dCas9的氨基酸序列为序列表中序列6。
上述蛋白组中,所述蛋白Cas9N204氨基酸序列为序列表中序列2第1-203位或序列6第1-203位;
所述蛋白Cas9C204氨基酸序列为序列表中序列2第204-1368位或序列6第204-1368位;
所述蛋白Cas9N469氨基酸序列为序列表中序列2第1-468位或序列6第1-468位;
所述蛋白Cas9C469氨基酸序列为序列表中序列2第469-1368位或序列6第469-1368位;
所述蛋白Cas9N714氨基酸序列为序列表中序列2第1-713位或序列6第1-713位;
所述蛋白Cas9C714氨基酸序列为序列表中序列2第714-1368位或序列6第714-1368位;
所述蛋白Cas9N1154氨基酸序列为序列表中序列2第1-1153位或序列6第1-1153位;
所述蛋白Cas9C1154氨基酸序列为序列表中序列2第1154-1368位或序列6第1154-1368位。
本发明的另一个目的是提供融合蛋白组。
本发明提供的融合蛋白组,为如下A)-D)中任一种:
A)由融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N204-InteinN为自N端至C端依次由上述蛋白Cas9N204与InteinN蛋白组成;
所述融合蛋白Cas9C204-InteinC为自N端至C端依次由InteinC蛋白与上述蛋白Cas9C204组成;
所述InteinN蛋白氨基酸序列为序列表中序列4第1-89位;
所述InteinC蛋白氨基酸序列为序列表中序列4第90-126位;
B)由融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白Cas9C469-InteinC组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N469-InteinN为自N端至C端依次由将上述蛋白Cas9N469与所述InteinN蛋白组成;
所述融合蛋白Cas9C469-InteinC为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和上述蛋白Cas9C469组成;
C)由融合蛋白Cas9N714-InteinN和融合蛋白Cas9C714-InteinC组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N714-InteinN为自N端至C端依次由上述蛋白Cas9N714与所述InteinN蛋白融合形成融合蛋白Cas9N469-InteinN;
所述融合蛋白Cas9C714-InteinC为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和权利要求1-3任一中所述蛋白Cas9C714组成;
D)由融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白Cas9C1154-InteinC组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN为自N端至C端依次由上述蛋白Cas9N1154与所述InteinN蛋白组成;
所述融合蛋白Cas9C1154-InteinC为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和上述蛋白Cas9C1154在组成。
本发明的第三个目的是提供融合蛋白组。
本发明提供的融合蛋白组,为如下1)-4)中任一种:
1)由上述融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由上述InteinC蛋白、上述蛋白Cas9C204和功能结构域蛋白组成;
2)由上述融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白Cas9C469-InteinC-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9C469-InteinC-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由上述InteinC蛋白、上述蛋白Cas9C469和功能结构域蛋白组成;
3)由上述融合蛋白Cas9N714-InteinN和融合蛋白Cas9C714-InteinC-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9C714-InteinC-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白、上述蛋白Cas9C714和功能结构域蛋白组成;
4)由上述融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白Cas9C1154-InteinC-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9C1154-InteinC-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和上述蛋白Cas9C1154和功能结构域蛋白组成。
上述融合蛋白组中,所述功能结构域蛋白为调控蛋白,所述调控蛋白具体为VP64蛋白或KRAB蛋白;
所述VP64蛋白氨基酸序列为序列9;
所述KRAB蛋白氨基酸序列为序列10。
本发明第四个目的是提供重组载体组。
本发明提供的重组载体组,为如下1)-8)中任一种:
1)由含有上述蛋白Cas9N204编码基因的重组载体和含有上述蛋白Cas9C204编码基因的重组载体组成;
2)由含有上述蛋白Cas9N469编码基因的重组载体和含有上述蛋白Cas9C469编码基因的重组载体组成;
3)由含有上述蛋白Cas9N714编码基因的重组载体和含有上述蛋白Cas9C714编码基因的重组载体组成;
4)由含有上述蛋白Cas9N1154编码基因的重组载体和含有上述蛋白Cas9C1154编码基因的重组载体组成;
5)由含有上述融合蛋白Cas9N204-InteinN编码基因的重组载体和含有上述融合蛋白InteinC-Cas9C204编码基因的重组载体组成;
6)由含有上述融合蛋白Cas9N469-InteinN编码基因的重组载体和含有上述融合蛋白 InteinC-Cas9C469编码基因的重组载体组成;
7)由表达上述融合蛋白Cas9N714-InteinN编码基因的重组载体和表达上述融合蛋白Cas9C714编码基因的重组载体组成;
8)由表达上述融合蛋白Cas9N1154-InteinN编码基因的重组载体和表达上述融合蛋白InteinC-Cas9C1154编码基因的重组载体组成;
9)由含有上述融合蛋白Cas9N204-InteinN编码基因的重组载体和含有上述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成;
10)由含有上述融合蛋白Cas9N469-InteinN编码基因的重组载体和含有上述融合蛋白InteinC-Cas9C469-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成;
11)由表达上述融合蛋白Cas9N714-InteinN编码基因的重组载体和表达上述融合蛋白InteinC-Cas9C714-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成;
12)由表达上述融合蛋白Cas9N1154-InteinN编码基因的重组载体和表达上述融合蛋白InteinC-Cas9C1154-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成。
上述蛋白组或上述融合蛋白或上述重组载体在基因编辑中的应用也是本发明保护的范围,利用拆分并重组的CRISPR-Cas9系统进行基因表达调控和基因特定靶点的编辑。
上述蛋白组或上述融合蛋白或上述重组载体在靶向定位或基因表达转录激活或基因表达转录抑制中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白组或上述融合蛋白或上述重组载体在制备鉴定膀胱癌细胞产品中的应用也是本发明保护的范围,利用拆分重组的Cas9蛋白系统及膀胱癌细胞特异性的启动子实现特异性的探测膀胱癌细胞。
一种基因编辑的方法,为将靶基因或靶序列与上述蛋白组或是上述融合蛋白中的一个蛋白编码基因融合,导入细胞内实现基因编辑。
所述基因编辑的对象为pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP。
所用的cas9均来源于spcas9。
所用的dcas9均来源于spdcas9。
所述基因表达转录激活为激活TagBFP基因转录;所述功能结构域蛋白为VP64,所述激活TagBFP基因转录是利用VP64激活驱动TagBFP基因表达的TRE启动子活性,开启TagBFP基因表达;
所述基因表达转录抑制为抑制TagBFP基因转录;所述功能结构域蛋白为KRAB,所述抑制TagBFP基因转录是利用KRAB抑制驱动TagBFP基因表达的TRE启动子活性,抑制TagBFP基因表达;
所用的dcas9均来源于spdcas9。
所述鉴定膀胱癌细胞中采用dcas9,其为将膀胱癌细胞特异启动子phupII和癌细胞特异启动子phTRET分别驱动重组载体9)-12)中Cas9N-InteinN编码基因和InteinC-Cas9C-VP64融合蛋白编码基因的表达,使融合蛋白VP64激活TRE启动子,启动TagBEP表达。
本发明的实验证明,本发明利用内含肽的可变剪切机制可以实现Cas9蛋白的拆分重组,降低转染难度,并且高效率的完整基因编辑与基因表达调控。另外,结合肿瘤细胞特异性的启动子,构建逻辑与门,实现肿瘤细胞探测,提高细胞分选的特异性。
本发明则利用Cas9系统可拆分特性,利用HTRET、hupII分别表达Cas9的一端,另外可以利用诱导型的启动子如TRE去表达gRNA,进而可以局部用药dox诱导,相比而言,增加了一层控制单元,可以提供特异性。
附图说明
图1为Cas9蛋白拆分示意图。
图2为利用拆分的Cas9蛋白进行基因编辑的活性检测原理示意图。
图3为实施例1实验一结果图。
图4为利用拆分的失活Cas9蛋白进行基因线路转录激活示意图。
图5为实施例2实验一结果图。
图6为利用拆分的失活Cas9蛋白进行基因线路转录抑制示意图。
图7为实施例2实验二结果图。
图8利用不加Intein的拆分Cas9蛋白进行基因编辑的活性检测原理示意图。
图9为实施例3实验一结果图。
图10为实施例3实验二结果图。
图11为利用拆分的失活Cas9蛋白进行膀胱癌细胞特异性检测原理示意图。
图12为实施例4实验一结果图。
图13为实施例5实验结果图。
图14为利用拆分的dCas9蛋白构建三逻辑与门基因开关示意图。
图15为实施例6实验结果图。
图16为基于可拆分的dCas9蛋白构建shRNA控制的基因开关设计一的示意图
图17为实施例7实验一实验结果图。
图18为基于可拆分的dCas9蛋白构建shRNA控制的基因开关设计二的示意图
图19为实施例7实验二实验结果图。
图20为基于可拆分的dCas9蛋白构建内源microRNA控制的基因开关的示意图
图21为实施例8实验结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
下述实施例中的定量试验,均设置三次重复,结果取平均值。
下面的质粒转染方式:取24孔板,每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞),培养24小时后,更换新的DMEM培养基,然后进行质粒转染。
实施例1、拆分Cas9蛋白组及重组载体组的获得及功能验证
利用Cas9蛋白功能作用域的可拆分特性,将一个Cas9基因的编码区域拆分成N端和C端两个片段(Cas9N和Cas9C),分别与蛋白内含子InteinN和InteinC,在细胞内由Intein结构域催化蛋白剪切,使其在细胞内重新结合成完整的Cas9蛋白,继而进行基因编辑和基因表达调控。
图1为Cas9蛋白拆分示意图,为将Cas9蛋白氨基酸序列从如下至少一种位置拆分得到的不同段氨基酸序列;位置为第203-204位之间、第468-469位之间、第713-714位之间和 第1153-1154之间。
本发明实施例中使用的Cas9蛋白为来自化脓链球菌即hpCas9,其氨基酸序列为序列表中序列2,其编码基因SpCas9的核苷酸序列为序列表中序列1。
SpCas9蛋白按照不同氨基酸位点拆分:
SpCas9N204的氨基酸序列为序列表中序列2第1-203位,其编码基因SpCas9N204的核苷酸序列为序列表序列1第1-609位;
SpCas9C204的氨基酸序列为序列表中序列2第204-1368位,其编码基因SpCas9C204的核苷酸序列为序列表序列1第610-4104位;
SpCas9N469的氨基酸序列为序列表中序列2第1-468位,其编码基因SpCas9N469的核苷酸序列为序列表序列2第1-1404位;
SpCas9C469的氨基酸序列为序列表中序列2第469-1368位,其编码基因SpCas9C469的核苷酸序列为序列表序列1第1415-4104位;
SpCas9N714的氨基酸序列为序列表中序列2第1-713位,其编码基因
SpCas9N714的核苷酸序列为序列表序列1第1-2139位;
SpCas9C714的氨基酸序列为序列表中序列2第714-1368位,其编码基因SpCas9C714的核苷酸序列为序列表序列1第2140-4104位;
SpCas9N1154的氨基酸序列为序列表中序列2第1-1153位,其编码基因SpCas9N1154的核苷酸序列为序列表序列1第1-3459位;
SpCas9C1154的氨基酸序列为序列表中序列2第1154-1368位,其编码基因SpCas9C1154的核苷酸序列为序列表序列1第3460-4104位。
Intein的氨基酸序列为序列表中序列4,其编码基因Intein的核苷酸序列为序列表中序列3;
InteinN的氨基酸序列为序列表中序列4第1-89位,其编码基因InteinN的核苷酸序列为序列表中序列3第1-267位;
InteinC的氨基酸序列为序列表中序列4第90-126位,其编码基因InteinC的核苷酸序列为序列表中序列3第268-378位。
一、重组载体的构建
1)从203-204位拆分Cas9构建重组载体
重组载体pCAG-SpCas9N204-InteinN的核苷酸序列为序列11,其中,序列表中序列11第6081-6957位核苷酸为融合蛋白SpCas9N204-InteinN的编码基因,该载体表达的融合蛋白SpCas9N204-InteinN,其氨基酸序列为序列表中序列12。
融合蛋白SpCas9N204-InteinN从上游起依次由SpCas9N204和InteinN组成。
重组载体pCAG-InteinC-SpCas9C204的核苷酸序列为序列13,其中,序列表中序列13第6077-9686位核苷酸为融合蛋白InteinC-SpCas9C204的编码基因,该载体表达融合蛋白InteinC-SpCas9C204,其氨基酸序列为序列表中序列14。
融合蛋白InteinC-SpCas9C204从上游起依次由InteinC和SpCas9C204组成。
2)从468-469位拆分Cas9构建重组载体
重组载体pCAG-SpCas9N469-InteinN的核苷酸序列为序列15,其中,序列表中序列15第6081-7752位核苷酸为融合蛋白SpCas9N469-InteinN的编码基因,该载体表达融合蛋白SpCas9N469-InteinN,其氨基酸序列为序列表中序列16。
融合蛋白SpCas9N469-InteinN从上游起依次由SpCas9N469和InteinN组成。
重组载体pCAG-InteinC-SpCas9C469的核苷酸序列为序列17,其中,序列表中序列17第6077-8891位核苷酸为融合蛋白InteinC-SpCas9C469的的编码基因,该载体表达融合蛋白InteinC-SpCas9C469,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列18。
融合蛋白InteinC-SpCas9C469从上游起依次由InteinC和SpCas9C469组成。
3)从713-714位拆分Cas9构建重组载体
重组载体pCAG-SpCas9N714-InteinN的核苷酸序列为序列19,其中,序列表中序列19第6081-8487位核苷酸为融合蛋白SpCas9N714-InteinN的编码基因,该载体表达融合蛋白SpCas9N714-InteinN,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列20。
融合蛋白SpCas9N714-InteinN从上游起依次由SpCas9N714和InteinN组成。
重组载体pCAG-InteinC-SpCas9C714的核苷酸序列为序列21,其中,序列表中序列21第6077-8156位核苷酸为融合蛋白InteinC-SpCas9C714的编码基因,该载体表达融合蛋白InteinC-SpCas9C714,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列22。
融合蛋白InteinC-SpCas9C714从上游起依次由InteinC和SpCas9C714组成。
4)从1153-1154位拆分Cas9构建重组载体
重组载体pCAG-SpCas9N1154-InteinN的核苷酸序列为序列23,其中,序列表中序列23第6081-9807位核苷酸为融合蛋白SpCas9N1154-InteinN的编码基因,该载体表达融合蛋白SpCas9N1154-InteinN,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列24。
融合蛋白SpCas9N1154-InteinN从上游起依次由SpCas9N1154和InteinN组成。
重组载体pCAG-InteinC-SpCas9C1154的核苷酸序列为序列25,其中,序列表中序列25第6077-6836位核苷酸为融合蛋白InteinC-SpCas9C1154C的编码基因,该载体表达融合蛋白InteinC-SpCas9C1154C,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列26。
融合蛋白InteinC-SpCas9C1154C从上游起依次由InteinC和SpCas9C1154C组成。
二、可拆分的SpCas9蛋白进行基因编辑的功能验证
pCAG-SpCas9质粒购买自合生基因公司,产品编号HS-CR-0005,启动子为CAG启动子,Cas9为SpCas9,可以进行DNA链切割;
pCAG-tagBFP质粒如序列7,其中4248-4986编码CAG启动子,6008-6770编码TagBFP;
pDT7004质粒如序列8;
pU6-guide RNA,pU6-guide off targetRNA,pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP购买自合生基因公司gRNA活性荧光检测试剂盒,产品编号HS-SR-0001。pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP中间插有终止密码子,并且两段有Cas9/gRNA识别的靶位点,在Cas9和gRNA的作用下,靶点位置的双链DNA被切割形成DSB,细胞通过同源重组效应形成有活性的荧光蛋白。
pCAG-SpCas9N-InteinN质粒、pCAG-SpCas9C-InteinC质粒、pU6-guide RNA质粒、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP质粒、pCAG-tagBFP质粒的作用机理示意图见图2。在CAG启动子的作用下SpCas9N、SpCas9C分别表达,在InteinN和InteinC的可变剪接作用下,形成完整的Cas9蛋白,在guide RNA1的引导下,剪切pEF1a-tEYFP-tgRNA1-tEYFP中gRNA1靶位点,利用非同源末端重组机制,重组成完整的EYFP基因,开启表达,具体如下:
实验组:
将上述1获得的重组载体pCAG-SpCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C204质粒、pU6-guide RNA质粒、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP质粒、pCAG-tagBFP质粒(内参质粒)共转 染入HEK293细胞(Invitrogen公司,目录号11631017,每孔转染质粒各100ng)。
对照组:为验证实验的正确性,设计了多重对照,确认在只有SpCas9C1或者SpCas9N1的情况下,EYFP不会表达,以及在脱靶的RNA作用下EYFP也未表达,并且与未切割的完整的Cas9蛋白调控效果进行对比。具体如下表1。
表1为不同组的质粒转染
表1中的第1组为实验组(split Cas9N+C+gRNA),第2-6组为对照组,其中第2组为脱靶的gRNA(split Cas9N+C+off target gRNA),第3组为完整的Cas9蛋白进行基因编辑(Cas9+gRNA),第4组为完整的Cas9蛋白在脱靶的gRNA指导下进行实验(Cas9+off targetgRNA),第5、6组分别只有拆分的Cas9蛋白的N端(split Cas9N+gRNA)或C端(splitCas9C+gRNA)。pDT7004是空质粒,保障每组转入质粒总量一定。
同样的,按照上面的表1,将pCAG-SpCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C204换成pCAG-SpCas9N469-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C469,pCAG-SpCas9N714-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C714,pCAG-SpCas9N1154-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C1154C,以测试其它三组的基因编辑功能。
将上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测EYFP的荧光强度和TagBFP的荧光强度。其中TagBFP作为内参,用来标定共转染的效率。EYFP荧光相对强度=EYFP的荧光强度/TagBFP的荧光强度。使用EYFP荧光相对强度来衡量拆分Cas9系统的效率流式分析。
结果见图3,
SCas9N1+SCas9C1组为pCAG-SpCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C204、pU6-guide RNA、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP和pCAG-tagBFP转染HEK293细胞;该组中各小组如表1所示;
SCas9N2+SCas9C2组为pCAG-SpCas9N469-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C469、pU6-guide RNA、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP和pCAG-tagBFP转染HEK293细胞;该组中各小组如表1所示;
SCas9N3+SCas9C3组为pCAG-SpCas9N714-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C714、pU6-guide RNA、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP和pCAG-tagBFP转染HEK293细胞;该组中各小组如表1所示;
SCas9N4+SCas9C4组为pCAG-SpCas9N1154-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C1154、pU6-guide RNA、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP和pCAG-tagBFP转染HEK293细胞;该组中各小组如表1所示;
可以看出,拆分的Cas9蛋白在Intein蛋白的可变剪接作用下,可以编辑下游质粒,点亮EYFP,其效率仅次于完整的Cas9蛋白,具体数据如SCas9N1+SCas9C1组拆分Cas9蛋白(split Cas9N+C+gRNA)效率为1.19,仅次于完整的Cas9蛋白(SpCas9+gRNA)1.56,数倍于负对照组的0.20(非完整Cas9蛋白以及脱靶RNA)。SCas9N2+SCas9C2、SCas9N3+SCas9C3、SCas9N4+SCas9C4组结果与此类似。
因此,证明利用拆分的Cas9系统可以有效的进行基因特定位点的切割,从而实现基因编辑的功能。
实施例2、拆分dCas9蛋白组及重组载体组的获得及功能验证
下述实验中用到的拆分Cas9蛋白均为dCas9蛋白,不能进行基因编辑,只能引导VP64(氨基酸序列为序列9)或者KRAB(氨基酸序列为序列10)进行基因表达调控。此外,下述实验组拆分位点是dCas9蛋白第713-714位氨基酸之间位置。
dCas9蛋白氨基酸序列为序列表中序列6,其编码基因dCas9的核苷酸序列为序列表中序列5。
dCas9N氨基酸序列为序列表中序列6第1-713位,其编码基因dCas9N的核苷酸序列为序列表序列5第1-2139位;
dCas9C氨基酸序列为序列表中序列6第714-1368位,其编码基因dCas9C的核苷酸序列为序列表序列5第2140-4104位。
一、可拆分的dCas9蛋白进行基因表达转录激活
1、重组载体的构建
pCAG-dCas9N-InteinN的核苷酸序列为序列27,其中,序列表中序列27第6081-8487位核苷酸为融合蛋白dCas9N-InteinN的编码基因,该载体表达融合蛋白dCas9N-InteinN,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列28;
融合蛋白dCas9N-InteinN从上游起依次由dCas9N和InteinN组成。
pCAG-InteinC-dCas9C-VP64的核苷酸序列为序列29,其中,序列表中序列29第6081-8371位核苷酸为融合蛋白InteinC-dCas9C-VP64编码基因,序列表中序列29第6081-8156位核苷酸为InteinC-dCas9C编码基因,序列29第8202-8371位核苷酸为VP64编码基因,该载体表达融合蛋白InteinC-dCas9C-VP64,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列30;
融合蛋白InteinC-dCas9C-VP64从上游起由InteinC、dCas9C和VP64组成。
2、可拆分的dCas9蛋白进行基因表达转录激活的功能验证
pCAG-dCas9-VP64质粒如序列31,其中第4249-4896位核苷酸编码CAG启动子,第6069-10172位核苷酸编码dCas9蛋白,第10218-10387位核苷酸编码VP64蛋白。
pU6-guide RNA1质粒的核苷酸序列为序列32,其中第72-317位核苷酸编码U6启动子,第322-341为靶向RNA序列20bp。
pTRE-TagBFP质粒的核苷酸序列为序列33,其中第3615-3864位核苷酸编码TRE启动子,第4045-4737编码TagBFP蛋白。
pEF1a-mKate质粒的核苷酸序列为序列34,其中第4250-5023编码pEF1a启动子,第5481-6186位核苷酸编码mKate蛋白。
pEF1a-rtTA质粒的核苷酸序列为序列35,其中第4250-5023编码pEF1a启动子,第5476-6222位核苷酸编码rtTA。
实验组中,拆分重组后的dCas9在gRNA的指导下,将会集中在TRE启动子上游相应的位点,而dCas9融合的VP64可以激活TRE启动子,进而表达TagBEP荧光蛋白,如果只有dCas9N端或者dCas9C端表达,则VP64不会被拖拽到TRE相应的位点,无法激活下游基因的表达。
具体如下:
实验组:将pCAG-dCas9N-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C-VP64质粒、pU6-guide RNA1质粒、pEF1a-mKate质粒(内参质粒)、pTRE-TagBFP质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒各100ng)。
对照组:为验证实验的正确性,设置了利用完整的dCas9蛋白携带VP64和rtTA进行正对照(表2的2组)以及不加gRNA作为负对照(表2的3组)。
表2为不同组的质粒转染
转染48小时后进行流式细胞术分析,检测mKate的荧光强度和TagBFP的荧光强度。其作用机理图见附图4。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。TagBFP荧光相对强度=实验组TagBFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用TagBFP荧光相对强度来衡量拆分Cas9系统进行基因线路转录激活的效率。
转染结果见图5,split dCas9vp64+gRNA为表2中的1组;dCas9VP64+gRNA为表2的2组;split dCas9表2的3组;rtTA+Dox表2的4组;可以看出,在拆分的dCas9蛋白的调控下,TagBFP相对荧光强度为0.17(split dCas9vp64+gRNA),低于完整的失活Cas9蛋白(dCas9VP64+gRNA)的44%以及rtTA+Dox的0.74,但是远高于在没有gRNA时的0.008。
二、可拆分的dCas9蛋白进行基因表达转录抑制
1、重组载体的构建
pCAG-InteinC-dCas9C-KRAB的核苷酸序列为序列36,其中,序列表中第6077-8504位为融合蛋白InteinC-dCas9C-KRAB编码基因,该载体表达融合蛋白InteinC-dCas9C-KRAB,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列37。
融合蛋白InteinC-dCas9C-KRAB从上游起依次由InteinC、dCas9C和KRAB组成。
2、可拆分的dCas9蛋白进行基因表达转录抑制
pCAG-dCas9-KRAB的核苷酸序列为序列38,其中第4253-4894位核苷酸编码CAG启动子,第6069-10172位核苷酸编码dcas9蛋白,第10245-10540位核苷酸编码KRAB。
实验组中,拆分重组后的dCas9在gRNA的指导下,将会集中在TRE启动子上游相应的位点,而dCas9融合的KRAB可以与TRE启动子激活区域结合,抑制rtTA与TRE的结合,阻止TagBFP的表达,如果只有dCas9N端或者dCas9C端表达,则KRAB不会被拖拽到TRE相应的位点,rtTA可以与TRE正常结合,下游基因可以正常表达。
实验组(表3中的2-5组):将pCAG-dCas9N-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C-KRAB质粒、pU6-guide RNA1质粒、pEF1a-mKate质粒、pTRE-TagBFP、pEF1a-rtTA质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒量见表3)。
对照组:表3中的1、6组。
具体转染方案见下表3。
表3为不同质粒转染
转染48小时后进行流式细胞术分析,检测mKate的荧光强度和TagBFP的荧光强度。其作用机理图见图6。KRAB与rtTA竞争性与TRE结合,阻止TagBFP的表达。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。TagBFP荧光相对强度=实验组TagBFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用TagBFP荧光相对强度来衡量拆分Cas9系统进行基因线路转录抑制的抑制效果。
通过调整拆分的dCas9蛋白的量,对比TagBFP荧光相对强度,以及设置不拆分的dCas9蛋白作为正对照。
流式结果见图7,split-dCas9-KRAB 0ng为表3的1组;split-dCas9-KRAB 25ng为表3的2组;split-dCas9-KRAB 50ng为表3的3组;split-dCas9-KRAB 75ng为表3的4组;split-dCas9-KRAB 100ng为表3的5组;dCas9-KRAB 100ng为表3的6组;可以看出,随着拆分的dCas9蛋白量的增加KRAB占据的更多与TRE结合的位点,从而阻止TagBFP的表达,TagBFP荧光相对强度下降,与图7的结果吻合。在同样是100ng的前提下,拆分的dCas9蛋白的TagBFP荧光相对强度为0.15(split-dCas9-KRAB 100ng),略大于完整的dCas9蛋白调控下的0.06(dCas9-KRAB 100ng)。
实施例3、对比不使用Intein介导的拆分Cas9系统与使用Intein介导的拆分Cas系统进行基因编辑
鉴于有文章报道拆分的Cas9蛋白可以在细胞内自动重组,本实施测试在本发明中所选用的SpCas9第714、1154个氨基酸位置拆分进行测试,并与实施例1进行比较。
一.Spcas9的714位点拆分是否使用Intein介导效率对比
1、重组载体的构建
pCAG-SpCas9N714质粒,其核苷酸序列为序列39,其中序列39第4635-6773位核苷酸为蛋白SpCas9N714编码基因,该载体表达蛋白SpCas9N714,该蛋白的氨基酸序列为序列2第1-713位。
pCAG-SpCas9C714质粒,其核苷酸序列为序列40,其中序列40第4638-6599位核苷酸为蛋白SpCas9C714编码基因,该载体表达蛋白SpCas9C714,该蛋白的氨基酸序列为序列2第714-1368位。
2、不使用Intein介导的拆分Cas9系统与使用Intein介导的拆分Cas系统进行基因编辑
实验组:
不使用Intein介导:将实施例1获得的pCAG-SpCas9N714质粒、pCAG-SpCas9C714质粒、pU6-guide RNA质粒、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP质粒、pEF1a-mKate质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒各100ng)转染。
使用Intein介导:将实施例1获得的pCAG-SpCas9N714-InteinN质粒、pCAG-InteinC-SpCas9C714质粒、pU6-guide RNA质粒、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP质粒、pEF1a-mKate质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒各100ng)转染。
对照组:表4中的2-4组,为验证实验的正确性,设置了在脱靶的RNA带领下EYFP未表达,并且与在Intein介导下的Cas9蛋白调控效果进行对比。
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测EYFP的荧光强度和mKate的荧光强度,其作用示意图见图8。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。EYFP荧光相对强度=实验组EYFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用EYFP荧光相对强度来衡量拆分Cas9系统的效率。
具体如下表4。
表4为不同质粒转染
转染结果见图9,无intein介导拆分Cas9714(1组)、无intein介导拆分Cas9714+脱靶RNA(2组)、有intein介导拆分Cas9714(3组)、无intein介导拆分Cas9714+脱靶RNA(4组),可以看出,不加Intein拆分Cas9蛋白系统中EYFP的相对荧光强度为1.67,而Intein介导下的拆分Cas9蛋白系统的EYFP的相对荧光强度为1.96,符合实验预期,可以证明Intein介导下的拆分Cas9系统基因编辑效率更高。
二.Spcas9的1154位点拆分是否使用Intein介导效率对比
1、重组载体的构建
pCAG-SpCas9N1154质粒,其核苷酸序列为序列45,其中序列45第4635-8093位核苷酸为蛋白SpCas9N1154编码基因,该载体表达蛋白SpCas9N1154,该蛋白的氨基酸序列为序列2第1-1153位。
pCAG-SpCas9C1154质粒,其核苷酸序列为序列46,其中序列46第4644-5279位核苷酸为蛋白SpCas9C1154编码基因,该载体表达蛋白SpCas9C1154,该蛋白的氨基酸序列为序列2第1154-1368位。
2、不使用Intein介导的拆分Cas9系统与使用Intein介导的拆分Cas系统进行基因编辑
实验组:
不使用Intein介导:将实施例1获得的pCAG-SpCas9N1154质粒、pCAG-SpCas9C1154质粒、pU6-guide RNA质粒、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP质粒、pEF1a-mKate质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒各100ng)转染。
使用Intein介导:将实施例1获得的pCAG-SpCas9N1154-InteinN质粒、pCAG-InteinC-SpCas9C1154质粒、pU6-guide RNA质粒、pEF1a-tEYFP-tgRNA-tEYFP质粒、pEF1a-mKate质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒各100ng)转染。
对照组:表4中的2-4组,为验证实验的正确性,设置了在脱靶的RNA带领下EYFP未表达,并且与在Intein介导下的Cas9蛋白调控效果进行对比。
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测EYFP的荧光强度和mKate的荧光强度,其作用示意图见图8。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。EYFP荧光相对强度=实验组EYFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用EYFP荧光相对强度来衡量拆分Cas9系统的效率。
具体如下表5。
表5为不同质粒转染
转染结果见图10,无intein介导拆分Cas91154(1组)、无intein介导拆分Cas91154+脱靶RNA(2组)、有intein介导拆分Cas91154(3组)、无intein介导拆分Cas91154+脱靶RNA(4组),可以看出,不加Intein拆分Cas9蛋白系统中EYFP的相对荧光强度为0.16,而Intein介导下的拆分Cas9蛋白系统的EYFP的相对荧光强度为2.00,符合实验预期,可以证明Intein在拆分的cas9系统中的作用,即不能自动重组的拆分cas9系统(1154位点)在Intein的介导下,可以高效的进行基因编辑功能。
实施例4、利用拆分的失活Cas9蛋白进行膀胱癌细胞特异性检测功能验证
1、重组载体的构建
pENTR_L4_hupII_L1,其核苷酸序列为序列41,其中第745-1100编码hupII启动子;
pENTR_L4_hTRET_L1,其核苷酸序列为序列42,其中第705-1160编码hTRET启动子;
phupII-dCas9N-InteinN,其核苷酸序列为序列43,其中第4843-7279编码融合蛋白dCas9N-InteinN编码基因,其中第4284-4637编码启动子hupII,该载体表达融合蛋白dCas9N-InteinN,该融合蛋白的氨基酸序列为序列28。
融合蛋白dCas9N-InteinN从上游起依次由dCas9N和InteinN组成。
phTRET-InteinC-dCas9C-VP64其核苷酸序列为序列44,其中第3421-5715编码融合蛋白InteinC-dCas9C-VP64编码基因,其中第2798-3253编码启动子hTRET,该载体表达融合蛋白InteinC-dCas9C-VP64,该融合蛋白的氨基酸序列为序列30。
2.利用拆分的失活Cas9蛋白进行膀胱癌细胞特异性检测功能验证
TagBFP是一个报告蛋白,可以通过仪器检测其发光强度。在正常细胞中,由于缺少特异性启动子,tre不会启动,TagBFP就不会发光,而膀胱癌细胞系中tre会启动,TagBFP就回表达,会发光。TagBFP也可以替换为其他荧光蛋白。决定癌细胞特异性检测的是选用的hupII和hTRET这两个启动子。利用这两个启动子和拆分的cas9系统构建了特异性检测装置,具体如下:
实验组中,拆分重组后的dCas9在gRNA的指导下,将会集中在TRE启动子上游相应的位点,而dCas9融合的VP64可以激活TRE启动子,进而表达TagBEP荧光蛋白,如果只有dCas9N端或者dCas9C端表达,则VP64不会被拖拽到TRE相应的位点,无法激活下游基因的表达。
具体如下:
实验组:将phupII-dCas9N-InteinN质粒、phTRET-InteinC-dCas9C-VP64质粒、pU6-guide RNA1质粒、pEF1a-mKate质粒(内参质粒)、pTRE-TagBFP质粒共转染入膀胱癌5637细胞系(上海素尔生物科技有限公司产品)(每孔转染质粒各100ng)。
对照组:为验证实验的正确性,设置了只有dCas9N-InteinN或者只有InteinC-dCas9C-VP64的负对照(表6的3组)。
表6为不同组的质粒转染
共转染使用的质粒\加入量(ng) | 1 | 2 | 3 |
phupII-dCas9N-InteinN | 100 | 100 | |
phTRET-InteinC-dCas9C-VP64 | 100 | 100 | |
pU6-guide RNA1 | 100 | 100 | |
pTRE-TagBFP | 100 | 100 | 100 |
pEF1a-mKate | 100 | 100 | 100 |
pDT7004 | 100 | 100 |
转染48小时后进行流式细胞术分析,检测mKate的荧光强度和TagBFP的荧光强度。其作用机理图见附图11。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。TagBFP荧光相对强度=实验组TagBFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用TagBFP荧光相对强度来衡量拆分Cas9系统进行膀胱癌细胞特异性检测的效率。
转染结果见图12,hTRET-InteinC-dCas9C-VP64+hupII-dCas9N-InteinN+gRNA为表5中的1组;hupII-dCas9N-InteinN+gRNA为表5的2组,
hTRET-InteinC-dCas9C-VP64+gRNA为表5的3组;可以看出,在拆分的dCas9蛋白的调控下,TagBFP相对荧光强度为0.78(hTRET-InteinC-dCas9C-VP64+hupII-dCas9N-InteinN+gRNA),远远大于对照组的TagBFP相对荧光强度(不及0.10)。
实施例5、dCas9的204、469、714、1154位点拆分是否使用Intein介导进行基因转录激活的效率对比
1.重组载体的构建
pCAG-dCas9N204,其核苷酸序列为序列49,其中序列49第4635-5243位核苷酸为蛋白dCas9N204编码基因,该载体表达蛋白dCas9N204。
pCAG-dCas9C204-VPR,其核苷酸序列为序列50,其中序列50第4635-9744位核苷酸为蛋白dCas9C204-VPR编码基因,该载体表达蛋白dCas9C204-VPR。
pCAG-dCas9N469,其核苷酸序列为序列51,其中序列51第4635-6038位核苷酸为蛋白dCas9N469编码基因,该载体表达蛋白dCas9N469。
pCAG-dCas9C469-VPR,其核苷酸序列为序列52,其中序列52第4635-8949位核苷酸为蛋白dCas9C469-VPR编码基因,该载体表达蛋白dCas9C469-VPR。
pCAG-dCas9N714,其核苷酸序列为序列53,其中序列53第4635-6774位核苷酸为蛋白dCas9N714编码基因,该载体表达蛋白dCas9N714。
pCAG-dCas9C714-VPR,其核苷酸序列为序列54,其中序列54第4635-8215位核苷酸为蛋白dCas9C714-VPR编码基因,该载体表达蛋白dCas9C714-VPR。
pCAG-dCas9N1154,其核苷酸序列为序列55,其中序列55第4635-8094位核苷酸为蛋白dCas9N1154编码基因,该载体表达蛋白dCas9N1154。
pCAG-dCas9C1154-VPR,其核苷酸序列为序列56,其中序列56第4635-6894位核苷酸为蛋白dCas9C1154-VPR编码基因,该载体表达蛋白dCas9C1154-VPR。
pCAG-dCas9N204-InteinN,其核苷酸序列为序列57,其中序列57第4635-5511位核苷酸为蛋白dCas9N204-InteinN编码基因,该载体表达蛋白dCas9N204-InteinN。
pCAG-InteinC-dCas9C204-VPR,其核苷酸序列为序列58,其中序列58第4635-9855位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C204-VPR编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C204-VPR。
pCAG-dCas9N469-InteinN,其核苷酸序列为序列59,其中序列59第4635-6306位核苷酸为蛋白dCas9N469-InteinN编码基因,该载体表达蛋白dCas9N469-InteinN。
pCAG-InteinC-dCas9C469-VPR,其核苷酸序列为序列60,其中序列60第4635-9060位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C469-VPR编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C469-VPR。
pCAG-dCas9N714-InteinN,其核苷酸序列为序列61,其中序列61第4635-8559位核苷酸为蛋白dCas9N714-InteinN编码基因,该载体表达蛋白dCas9N714-InteinN。
pCAG-InteinC-dCas9C714-VPR,其核苷酸序列为序列62,其中序列62第4635-8325位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C714-VPR编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C714-VPR。
pCAG-dCas9N1154-InteinN,其核苷酸序列为序列63,其中序列63第4635-8360位核苷酸为蛋白dCas9N1154-InteinN编码基因,该载体表达蛋白dCas9N1154-InteinN。
pCAG-InteinC-dCas9C1154-VPR,其核苷酸序列为序列64,其中序列64第4635-7004位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C1154-VPR编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C1154-VPR。
dCas9N204的氨基酸序列为序列表中序列6第1-203位,其编码基因dCas9N204的核苷酸序列为序列表序列5第1-609位;
dCas9C204的氨基酸序列为序列表中序列6第204-1368位,其编码基因dCas9C204的核苷酸序列为序列表序列5第610-4104位;
dCas9N469的氨基酸序列为序列表中序列6第1-468位,其编码基因 dCas9N469的核苷酸序列为序列表序列5第1-1404位;
dCas9C469的氨基酸序列为序列表中序列6第469-1368位,其编码基因dCas9C469的核苷酸序列为序列表序列5第1415-4104位;
dCas9N714的氨基酸序列为序列表中序列6第1-713位,其编码基因dCas9N714的核苷酸序列为序列表序列5第1-2139位;
dCas9C714的氨基酸序列为序列表中序列6第714-1368位,其编码基因dCas9C714的核苷酸序列为序列表序列5第2140-4104位;
dCas9N1154的氨基酸序列为序列表中序列6第1-1153位,其编码基因dCas9N1154的核苷酸序列为序列表序列5第1-3459位;
dCas9C1154的氨基酸序列为序列表中序列6第1154-1368位,其编码基因dCas9C1154的核苷酸序列为序列表序列5第3460-4104位。
2、实验组:
不使用Intein介导:将pCAG-dCas9N204质粒、pCAG-dCas9C204-VPR质粒、pCAG-dCas9N469质粒、pCAG-dCas9C469-VPR质粒、pCAG-dCas9N714质粒、pCAG-dCas9C714-VPR质粒、pCAG-dCas9N1154质粒、pCAG-dCas9C1154-VPR质粒成对与pU6-guide RNA1质粒、pEF1a-mKate质粒(内参质粒)、pTRE-TagBFP质粒共转染入HEK293细胞质粒共转染入HEK293细d胞(每孔转染质粒各100ng)转染。
使用Intein介导:将pCAG-dCas9N204-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C204-VPR质粒、pCAG-dCas9N469-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C469-VPR质粒、pCAG-dCas9N714-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C714-VPR质粒、pCAG-dCas9N1154-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C1154-VPR质粒成对与pU6-guide RNA1质粒、pEF1a-mKate质粒(内参质粒)、pTRE-TagBFP质粒共转染入HEK293细胞质粒共转染入HEK293细胞(每孔转染质粒各100ng)转染。
对照组:为验证实验的正确性,设置了不加dCas9带领下TagBFP未表达的负对照,以及加完整的dCas9的正对照,并且与在Intein介导下的Cas9蛋白调控效果进行对比。
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测TagBFP的荧光强度和mKate的荧光强度。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。TagBFP荧光相对强度=实验组TagBFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用TagBFP荧光相对强度来衡量拆分dCas9系统的效率。具体如下表7。
表7为不同质粒转染
同样的,按照上面的表,将pCAG-dCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC-dCas9C204-VPR换成pCAG-dCas9N469-InteinN、pCAG-InteinC-dCas9C469-VPR,pCAG-dCas9N714-InteinN、pCAG-InteinC-dCas9C714-VPR,pCAG-dCas9N1154-InteinN、pCAG-InteinC-dCas9C1154C-VPR,以测试其它三组在有无Intein介导下的的基因激活效率。
转染结果见图13,可以看出,不加Intein拆分dCas9蛋白系统中TagBFP的相对荧光强度显著弱于Intein介导下的拆分dCas9蛋白系统的TagBFP的相对荧光强度,符合实验预期,可以证明Intein介导下的拆分dCas9系统基因转录激活效率更高。
实施例6、利用拆分的失活dCas9蛋白构建三逻辑与门基因开关
1、下述实验组拆分位点是dCas9蛋白第713-714位氨基酸之间位置和第1153-1154位氨基酸之间位置。
重组载体的构建:
pCAG-dCas9N714,其核苷酸序列为序列53,其中序列53第4635-6774位核苷酸为蛋白dCas9N714编码基因,该载体表达蛋白dCas9N714。
pCAG-dCas9M-InteinN质粒其核苷酸序列为序列65,其中序列65第4635-6222位核苷酸为蛋白dCas9M-InteinN编码基因,该载体表达蛋白dCas9M-InteinN。
pCAG-InteinC-dCas9C1154-Suntag其核苷酸序列为序列66,其中序列66第4635-6200位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C1154-Suntag编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C1154-Suntag。
dCas9N714的氨基酸序列为序列表中序列6第1-713位,其编码基因dCas9N714的核苷酸序列为序列表序列5第1-2139位;
dCas9M的氨基酸序列为序列表中序列6第714-1153位,其编码基因dCas9M的核苷酸序列为序列表序列5第2140-3459位;
dCas9C1154的氨基酸序列为序列表中序列6第1154-1368位,其编码基因dCas9C1154的核苷酸序列为序列表序列5第3460-4104位;
2、实验组
pCAG-ScFv-Vp64质粒的核苷酸序列为序列67,其中序列67第2807-3543位核苷酸编码CAG启动子,第4635–5896位编码ScFv-Vp64蛋白。
将pCAG-dCas9N714质粒、pCAG-dCas9M-InteinN质粒、pCAG-InteinC-dCas9C1154-Suntag质粒、pCAG-ScFv-Vp64、pU6-guide RNA1质粒、pEF1a-mKate质粒(内参质粒)、pTRE-TagBFP、pDT7004质粒共转染入HEK293细胞质粒共转染入HEK293细胞转染。dCas9N714、dCas9M-InteinN、InteinC-dCas9C1154-Suntag会形成dCas9-Suntag然而与gRNA结合并吸引ScFv-Vp64,最终激活TRE-TagBFP。具体示意图见图14。
转染表如表8。表8中的第2、3、4、5、6、7、8组为负对照组,不能形成完整的dCas9。
表8为不同质粒转染
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测TagBFP的荧光强度和mKate的荧光强度。其中mKate作为内参,用来标定共转染的效率。TagBFP荧光相对强度=实验组TagBFP的荧光强度/同组mKate的荧光强度。使用TagBFP荧光相对强度来衡量拆分dCas9系统的效率。
转染结果见图15,可以看出只有在dCas9N、dCas9M、dCas9C同时存在的情况下,下游报告荧光才可以被激活,缺少其中任何一段都不能够激活TagBFP,很好的实现了三逻辑与的功能。
实施例7、基于可拆分的dCas9蛋白构建shRNA控制的基因开关
已有研究表明突变Cas9的PI区域可以使Cas9识别不同的PAM序列,相关研究表明将Cas9氨基酸序列做如下突变:将1135氨基酸天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)、将第1218位氨基酸甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)、将第1335位氨基酸精氨酸(R)突变为谷氨酸(E)、将第1337位氨基酸苏氨酸(T)突变为精氨酸(R),便可以识别NGCG PAM序列,而且不能识别NGGPAM序列,从而做到与野生型Cas9正交。
现对dCas9做上述突变,将1135氨基酸天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)、将第1218位氨基酸甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)、将第1335位氨基酸精氨酸(R)突变为谷氨酸(E)、将第1337位氨基酸苏氨酸(T)突变为精氨酸(R),突变后dCas9蛋白的氨基酸序列见序列表序列48,其对应的核苷酸序列见序列表序列47。
一、
1、重组载体的构建
pUASx5-T9+T9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget^FF4其核苷酸序列为序列68,其中序列68第2278-9244位核苷酸为蛋白InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14。
pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget^FF5其核苷酸序列为序列69,其中序列69第2188-8335位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9。
pCAG-dCas9N714-InteinN,其核苷酸序列为序列61,其中序列61第4635-8559位核苷酸为 蛋白dCas9N714-InteinN编码基因,该载体表达蛋白dCas9N714-InteinN。
dMCas9C(714-1368)的氨基酸序列为序列表中序列48第714-1368位,其编码基因dMCas9C(714-1368)的核苷酸序列为序列表序列47第2140-4104位。
dCas9C(714-1368)的氨基酸序列为序列表中序列6第714-1368位,其编码基因dCas9C(714-1368)的核苷酸序列为序列表序列5第2140-4104位;
dCas9N714的氨基酸序列为序列表中序列6第1-713位,其编码基因dCas9N71的核苷酸序列为序列表序列5第1-2139位;
2.实验组
pCAG-Gal4VP16-2A-TagBFP质粒的核苷酸序列为序列70,其中序列70第4253-4989位核苷酸编码CAG启动子,第6016–7458位编码Gal4VP16-2A-TagBFP蛋白。
pMTRE-EYFP质粒的核苷酸序列为序列71,其中序列71第5685-8621位核苷酸编码MTRE启动子,第2–721位编码EYFP蛋白。
pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒的核苷酸序列为序列72,其中序列72第229–477位核苷酸编码U6启动子,第485–533位编码shRNA-FF5。
pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒的核苷酸序列为序列73,其中序列73第229–477位核苷酸编码U6启动子,第485–533位编码shRNA-FF4。
基于可拆分的dCas9蛋白构建shRNA控制的基因开关示意图见图16,pUASx5-T9+T9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget^FF4,pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget^FF5,受到上游Gal4VP16的诱导进而表达,TALER14和TALER9相互抑制,当加入外源ShRNA-FF5情况下,TALER9受到抑制,进而系统表达出更多的dMCas9C(714-1368)-VPR,与dCas9N结合形成完整的dCas9-VPR在gRNA引导下激活EYFP。当加入外源ShRNA-FF4情况下,TALER14受到抑制,进而系统表达出更多的dCas9C(714-1368)-Krab,与dCas9N结合形成完整的dCas9-Krab在gRNA引导下抑制EYFP。具体转染配比如表9。
表9不同质粒转染
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。其中TagBFP作为内参,用来标定共转染的效率。EYFP荧光相对强度=实验组EYFP的荧光强度/同组TagBFP的荧光强度。
转染结果见图17,可以看出在shRNA-FF5作用下,系统高表达EYFP,而在shRNA-FF4的作用下,系统基本不表达EYFP,符合实验预期。
二、
1、重组载体的构建
pUASx5-T9+T9*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget^FF4其核苷酸序列为序列74,其中序列74第2295-9248位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14。
pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER9-4xTarget^FF5其核苷酸序列为序列75,其中序列75第2262-9635位核苷酸为蛋白InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER9编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER9。
dCas9C(714-1368)的氨基酸序列为序列表中序列6第714-1368位,其编码基因dCas9C(714-1368)的核苷酸序列为序列表序列5第2140-4104位。dMCas9C(714-1368)的氨基酸序列为序列表中序列48第714-1368位,其编码基因dMCas9C(714-1368)的核苷酸序列为序列表序列47第2140-4104位;
2.实验组
pTRE-EYFP质粒的核苷酸序列为序列76,其中序列76第3615-3929位核苷酸编码TRE启动子,第4065–4764位编码EYFP蛋白。
pMTRE-mKate质粒的核苷酸序列为序列77,其中序列77第1859-2195位核苷酸编码MTRE启动子,第2292-2997位编码mKate蛋白。
基于可拆分的dCas9蛋白构建shRNA控制的基因开关示意图见图18,pUASx5-T9+T9*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget^FF4,pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER9-4xTarget^FF5,受到上游Gal4VP16的诱导进而表达,TALER14和TALER9相互抑制,当加入外源ShRNA-FF5情况下,TALER9受到抑制,进而系统表达出更多的dCas9C(714-1368)-VPR,与dCas9N结合形成完整的dCas9-VPR,其识别NGG PAM序列,在gRNA1引导下激活EYFP。当加入外源ShRNA-FF4情况下,TALER14受到抑制,进而系统表达出更多的dMCas9C(714-1368)-VPR,与dCas9N结合形成完整的dMCas9-VPR,其识别NGCG PAM序列,在gRNA引导下激活mKate。具体转染配比如表10。
表10不同质粒转染
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度以及mKate的荧光强度。其中TagBFP作为内参,用来标定共转染的效率。EYFP荧光相对强度=实验组EYFP的荧光强度/同组TagBFP的荧光强度。mKate荧光相对强度=实验组mKate的荧光强度/同组TagBFP的荧光强度。
转染结果见图19,可以看出在shRNA-FF5作用下,系统高表达EYFP,而在shRNA-FF4的作用下,系统高表达mKate,符合我们的实验预期。
实施例8、基于可拆分的dCas9蛋白构建内源microRNA控制的基因开关
1、重组载体的构建
pUASx5-T9+T9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget^T18a其核苷酸序列为序列78,其中序列78第2278-9238位核苷酸为蛋白InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14。
pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget^T21其核苷酸序列为序列79,其中序列79第2188-8334位核苷酸为蛋白InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9编码基因,该载体表达蛋白InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9。
dMCas9C(714-1368)的氨基酸序列为序列表中序列48第714-1368位,其编码基因dMCas9C(714-1368)的核苷酸序列为序列表序列47第2140-4104位。dCas9C(714-1368)的氨基酸序列为序列表中序列6第714-1368位,其编码基因dCas9C(714-1368)的核苷酸序列为序列表序列5第2140-4104位;
2.实验组
在实施例7中基于可拆分的dCas9蛋白构建了由shRNA控制的基因开关,在本实施例中,我们用microRNA21替代ShRNA-FF5,相应的靶点Target^FF5也由T21替代,用microRNA18a替代ShRNA-FF4,相应的靶点Target^FF4也由T18a替代。MicroRNA21在Hela细胞系中高表达,microRNA18a在Hek293细胞中高表达。具体示意图见图20。
pUASx5-T9+T9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget^T18a,pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget^T21,受到上游Gal4VP16的诱导进而表达,TALER14和TALER9相互抑制,当Hela细胞中,microRNA21高表达,TALER9受到抑制,进而系统表达出更多的dMCas9C(714-1368)-VPR,与dCas9N结合形成完整的dCas9-VPR在gRNA引导下激活EYFP。当Hek293细胞中,microRNA18a高表达,TALER14受到抑制,进而系统表达出更多的dCas9C(714-1368)-Krab,与dCas9N结合形成完整的dCas9-Krab在gRNA引导下抑制EYFP。具体转染配比如表11。
表11不同质粒转染
上述各组转染48小时后进行流式细胞术分析,检测TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。其中TagBFP作为内参,用来标定共转染的效率。EYFP荧光相对强度=实验组EYFP的荧光强度/同组TagBFP的荧光强度。
转染结果见图21,可以看出在Hela细胞中,系统高表达EYFP,而在Hek293细胞中,系统基本低表达EYFP,符合的实验预期。
Claims (7)
1.融合蛋白组,为如下A)-C)中任一种:
A)由融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N204-InteinN为自N端至C端依次由蛋白Cas9N204与InteinN蛋白组成;
所述融合蛋白InteinC-Cas9C204为自N端至C端依次由InteinC蛋白与蛋白Cas9C204组成;
所述蛋白Cas9N204和所述蛋白Cas9C204是将Cas9蛋白氨基酸序列从第203-204位之间拆分,形成的两段蛋白;
B)由融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C469组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N469-InteinN为自N端至C端依次由将蛋白Cas9N469与所述InteinN蛋白组成;
所述融合蛋白InteinC-Cas9C469为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和蛋白Cas9C469组成;
所述Cas9N469和蛋白Cas9C469是将Cas9蛋白氨基酸序列从第468-469位之间拆分,形成的两段蛋白;
C) 由融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白InteinC -Cas9C1154组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN为自N端至C端依次由蛋白Cas9N1154与所述InteinN蛋白组成;
所述融合蛋白InteinC -Cas9C1154为自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和蛋白Cas9C1154在组成;
所述蛋白Cas9N1154和蛋白Cas9C1154是将Cas9蛋白氨基酸序列从第1153-1154位之间拆分,形成的两段蛋白;
所述InteinN蛋白氨基酸序列为序列表中序列4第1-89位;
所述InteinC蛋白氨基酸序列为序列表中序列4第90-126位;
所述Cas9蛋白为SpCas9或dCas9;所述SpCas9的氨基酸序列为序列表中序列2,所述dCas9的氨基酸序列为序列表中序列6或序列48。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白组,其特征在于:
所述蛋白Cas9N204氨基酸序列为序列表中序列2第1-203位或序列6第1-203位或序列48第1-203位;
所述蛋白Cas9C204氨基酸序列为序列表中序列2第204-1368位或序列6第204-1368位或序列48第204-1368位;
所述蛋白Cas9N469氨基酸序列为序列表中序列2第1-468位或序列6第1-468位或序列48第1-468位;
所述蛋白Cas9C469氨基酸序列为序列表中序列2第469-1368位或序列6第469-1368位或序列48第469-1368位;
所述蛋白Cas9N1154氨基酸序列为序列表中序列2第1-1153位或序列6第1-1153位或序列48第1-1153位;
所述蛋白Cas9C1154氨基酸序列为序列表中序列2第1154-1368位或序列6第1154-1368位或序列48第1154-1368位。
3.融合蛋白组,为如下1)-3)中任一种:
1) 由权利要求1中的所述融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由权利要求1中的所述InteinC蛋白、权利要求1中所述蛋白Cas9C204和功能结构域蛋白组成;
2) 由权利要求1中的所述融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C469-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白InteinC-Cas9C469-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由权利要求1中的所述InteinC蛋白、权利要求1中所述蛋白Cas9C469和功能结构域蛋白组成;
3) 由权利要求1中的所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白InteinC -Cas9C1154-功能结构域蛋白组成的融合蛋白组;
所述融合蛋白InteinC -Cas9C1154-功能结构域蛋白为自N端至C端依次由权利要求1中所述InteinC蛋白和权利要求1中所述蛋白Cas9C1154和功能结构域蛋白组成;
所述功能结构域蛋白为调控蛋白,所述调控蛋白具体为VP64蛋白或KRAB蛋白。
4.重组载体组,为如下1)-6)中任一种:
1)由含有权利要求1中所述融合蛋白Cas9N204-InteinN编码基因的重组载体和含有权利要求1中所述融合蛋白InteinC-Cas9C204编码基因的重组载体组成;
2)由含有权利要求1中所述融合蛋白Cas9N469-InteinN编码基因的重组载体和含有权利要求1中所述融合蛋白InteinC-Cas9C469编码基因的重组载体组成;
3)由表达权利要求1中所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN编码基因的重组载体和表达权利要求1中所述融合蛋白InteinC-Cas9C1154编码基因的重组载体组成;
4)由含有权利要求3中所述融合蛋白Cas9N204-InteinN编码基因的重组载体和含有权利要求3中所述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成;
5)由含有权利要求3中所述融合蛋白Cas9N469-InteinN编码基因的重组载体和含有权利要求3中所述融合蛋白InteinC- Cas9C469-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成;
6)由表达权利要求3中所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN编码基因的重组载体和表达权利要求3中所述融合蛋白InteinC-Cas9C1154-功能结构域蛋白编码基因的重组载体组成。
5.权利要求1-3任一所述融合蛋白组或权利要求4所述重组载体在基因编辑中的应用;
或权利要求1-3任一所述融合蛋白组或权利要求4所述重组载体在靶向定位或基因表达转录激活或基因表达转录抑制中的应用;
所述应用不用于疾病诊断治疗。
6.权利要求1-3任一所述融合蛋白组或权利要求4所述重组载体在制备鉴定膀胱癌细胞产品中的应用。
7.一种基因编辑的方法,为将靶基因或靶序列与权利要求1-3任一所述融合蛋白组中的一个蛋白编码基因融合,导入细胞内实现基因编辑;
所述方法为非疾病诊断治疗方法。
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Legal Events
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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